KR101283446B1 - 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자, 그의 제조 방법, 및 그를 이용한 단백질 분리방법 - Google Patents

Abstract

본원은 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자, 그의 제조 방법, 및 상기 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자 및 자석을 이용하여 간단한 공정에 의하여 단백질을 용이하게 분리할 수 있는 방법을 제공한다.

Description

포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자, 그의 제조 방법, 및 그를 이용한 단백질 분리방법{MAGNETIC NANOPARTICLES SURFACE-MODIFIED WITH PHOSPHOCHOLINE, PREPARING METHOD OF THE SAME, AND SEPARATING METHOD OF PROTEIN USING THE SAME}

본원은 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자, 그의 제조 방법, 및 그를 이용한 단백질 분리방법에 관한 것이다.

나노입자는, 그들이 큰 표면적을 가지고 있고, 시료의 작은 부피에 대하여도 표적 분자를 분리하기 위한 높은 용량을 나타내기 때문에, 생물학적 분리에서 장점을 갖는다. 그들 중에, 자성 나노입자(magnetic nanoparticles; MNPs)는, 그들의 이화학적 특성이 영구 자석류를 이용하며 결합된 형태의 분리를 위해 유리하기 때문에, 생물학적 분리를 위해 널리 연구되고 있다. 단백질 단리를 위한 MNPs는 영구 자석류로 인가된 필드(field)에 대하여 즉각적 반응을 나타내고, 용매 중에 높은 분산성과 안정성을 나타내고, 자석에 대한 상기 반응은 단백질 정제 과정 동안 MNP의 취급을 용이하게 한다. 단백질에 대한 비-특이적 결합의 억제는 또한 단백질 정제에 있어서 필수적이고 실험 결과의 신뢰성을 향상시킨다. 친수성 폴리머의 흡착, 폴리머 쉘(shell)의 리간드-유발(ligand-initiated) 성장 및 단백질의 친화성 정제를 포함하여, 결합 특이성을 개선하고 비-특이적 결합을 억제하기 위하여, MNPs의 기능성 물질 접합(conjugation)에 대하여 여러 보고가 있었다. 친화성 정제 물질을 합성하기 위한 표면 분자의 선택은, 표면이 용매 중에 분산성과 안정성, 및 상기 MNP 표면 상에 단백질의 비-특이적 결합을 결정하기 때문에 대단히 중요하다.

C-반응성단백질(C-Reactive Protein)은 혈청 중에 염증의 측정에 사용된 바이오마커(biomarker)이다. CRP는 간에서 생산되는 펜타머릭 단백질이고, 선천성 면역 시스템 반응을 일으키는 병원성 또는 손상된 세포막 중 포스포콜린과 결합한다. 염증(1000-fold 이상)에 대한 혈청 CRP 레벨의 큰 증가 때문에, 건강의 일반적 마커(marker)로서 그것의 사용은 잘 정립되어 왔고, 미래의 관상 동맥 혈관 질병의 지표(indicator)로서 그것의 가능한 역할은 현재 많은 연구적 관심을 제공하고 있다. 복수(ascite) 또는 혈청 중 CRP의 정제를 위한 통상적 방법은, 보통 정제 또는 농축을 위한 추가 단계가 필요하고, 신선한 상태에서 컬럼 수지의 유지가 어려운, p-아미노페닐 포스포콜린-연결된 아가로제로 구성된 친화성 컬럼을 이용을 통하여 이루어지고 있다. 그러나, 인간 혈청으로부터 CRP의 좀더 간단한 추출, 단리 방법이 요구되고 있다.

이에, 본원은 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자, 그의 제조 방법, 및 상기 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자 및 자석을 이용하여 간단한 공정에 의하여 단백질을 용이하게 분리할 수 있는 방법을 제공하고자 한다.

그러나, 본원이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 기술한 과제로 제한되지 않으며, 기술되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본원의 일 측면은, 자성나노입자 및 상기 자성나노입자 표면에 결합된 포스포콜린(Phosphocholine) 기를 가지는 물질을 포함하며, 상기 포스포콜린 기가 표면에 노출되어 있는, 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자를 제공한다.

본원의 다른 측면은, 상기 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자의 제조 방법으로서, 상기 자성나노입자 표면에서 포스포콜린(Phosphocholine) 기를 가지는 단량체를 라디칼 중합 반응시키는 것을 포함하는, 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자의 제조 방법을 제공한다.

본원의 또 다른 측면은, 상기 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자를 C-반응성 단백질을 함유하는 시료 용액에 첨가하여 상기 자성나노입자와 C-반응성 단백질의 복합체(complex)를 형성하는 단계; 상기 복합체를 자석을 이용하여 상기 시료 용액으로부터 분리하는 단계; 및, 상기 분리된 복합체를 해리제(dissociating agent)에 의하여 분해시켜 상기 C-반응성 단백질을 분리하는 단계:를 포함하는, C-반응성 단백질을 분리방법을 제공한다.

본원에 의하여, 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자, 그의 제조 방법, 및 상기 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자 및 자석을 이용하여 간단한 공정에 의하여 단백질을 용이하게 분리할 수 있는 방법이 제공될 수 있다. 상기 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자는 C-반응성 단백질을 간편하고 고순도로 분리하는 데 이용할 수 있어, 기존의 포스포콜린 친화성 수지(phosphocholine affinity resin)를 사용하는 경우보다 간편하며 높은 순도로 C-반응성 단백질을 분리 정제할 수 있다. 또한, 상기 본원에 따른 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자는 정제용 재료로서 보관이 쉽고 반복사용이 가능하다. 이에, 상기 본원에 따른 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자는 혈청으로부터 신속하고 용이하게 고순도로 C-반응성 단백질의 단리시킬 수 있으며, 다른 단백질 정제 분리에도 응용할 수 있다.

도 1은 본원의 일 실시예에 따른 MNPs로 개질된 VPC의 합성에 대한 개략도이다.
도 2는 본원의 일 실시예에 따른 Zetasizer에 의한 입자 크기 분석: (a) MPS-MNP; (b) VPC-MNP 을 나타낸 그래프이다.
도 3은 본원의 일 실시예에 따른 MNPs의 TEM 이미지: (a) MPS-MNP; (b) VPC-MNP 이다.
도 4는 본원의 일 실시예에 따른 MPS-MNPs 및 VPC-MNPs 사이의 CRP 결합능의 비교 그래프이다.
도 5는 본원의 일 실시예에 따른 MPS-MNPs 및 VPC-MNPs 에 대하여 CRP 단독 처리 후의 SDS-PAGE 결과이다.
도 6은 본원의 일 실시예에 따른 MNPs를 이용하여 N-혈청과 CRP를 함께 처리하여 CRP 단리효과를 분석한 SDS-PAGE 결과이다.
도 7은 본원의 일 실시예에 따른 P-혈청 및 탄산 탈수효소의 공동처리 후에, MNPs를 이용한 P-혈청으로부터 CRP의 단리 결과이다.
도 8은 본원의 일 실시예에 따른 MALDI-TOF에 의한 SDS-PAGE 로부터 단백질 밴드의 동정: (a) CRP-스파이크된 N-혈청으로부터 단리된 CRP; (b) P-혈청으로부터의 단리된 CRP 이다.
도 9는 본원의 일 실시예에 따른 VPC의 합성 스킴이다.

이하, 첨부한 도면을 참조하여 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 본원의 구현예 및 실시예를 상세히 설명한다.

그러나 본원은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예 및 실시예에 한정되지 않는다. 그리고 도면에서 본 발명을 명확하게 설명하기 위해서 설명과 관계없는 부분은 생략하였으며, 명세서 전체를 통하여 유사한 부분에 대해서는 유사한 도면 부호를 붙였다.

본원 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 정도의 용어 "약", "실질적으로" 등은 언급된 의미에 고유한 제조 및 물질 허용오차가 제시될 때 그 수치에서 또는 그 수치에 근접한 의미로 사용되고, 본원의 이해를 돕기 위해 정확하거나 절대적인 수치가 언급된 개시 내용을 비양심적인 침해자가 부당하게 이용하는 것을 방지하기 위해 사용된다.

본원의 일 측면은, 자성나노입자 및 상기 자성나노입자 표면에 결합된 포스포콜린(Phosphocholine) 기를 가지는 물질을 포함하며, 상기 포스포콜린 기가 표면에 노출되어 있는, 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자를 제공한다.

예시적 구현예에서, 상기 포스포콜린 기를 가지는 물질은 포스포콜린 기를 가지는 단량체를 자성나노입자 표면에서 라디칼 중합반응시켜 형성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예시적 구현예에서, 상기 포스포콜린 기를 가지는 물질은, 하기 구조식 1을 가지는 포스포콜린 기를 가지는 단량체를 자성나노입자 표면에서 라디칼 중합반응시켜 형성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:

[구조식 1]

포스포콜린-X-R;

상기 식 중, R은 반응기, X는 스페이서 기임.

예시적 구현예에서, 상기 R은 중합 가능기 또는, 상기 자성나노입자 표면과 반응하는 기능기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예시적 구현예에서, 상기 중합 가능기는 비닐, 스티릴, 아크릴로일, 메타크릴로일, 이타코노일, 소르빌 및 디에노일에서 선택된 라디칼 중합 단량체이고, 상기 자성나노입자 표면과 반응하는 기능기는 티올, 디설파이드, 티오에테르, 실란, 트리클로로실릴, 트리메틸실릴, 트리이소프로필실릴 및 카테콜에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예시적 구현예에서, 상기 스페이서 기 X는 알킬기, 아릴기, 아릴알킬기, 올리고에틸렌옥시드, 또는 이들 기의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들어, 상기 알킬은 탄소수 1 내지 50, 또는 탄소수 1 내지 40, 또는 탄소수 1 내지 30, 또는 탄소수 1 내지 20, 또는 탄소수 5 내지 50, 또는 탄소수 5 내지 40, 또는 탄소수 5 내지 30, 또는 탄소수 5 내지 20 을 가지는 것 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들어, 상기 아릴은 탄소수 6 이상을 가지는 방향족탄화수소 고리일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들어, 상기 아릴은 탄소수 6 내지 30, 또는 탄소수 1 내지 20, 또는 탄소수 5 내지 50, 또는 탄소수 5 내지 40, 또는 탄소수 5 내지 30, 또는 탄소수 5 내지 20 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 아릴은 1 내지 5개의 방향족 고리를 갖는 탄소수 6 이상의 시클릭 방향족 탄화수소기, 특히 페닐, 비페닐 또는 나프틸과 같은 모노시클릭 또는 비시클릭기를 가리킨다. 2개 이상의 방향족 고리를 함유하는 경우(비시클릭 등), 아릴기의 방향족 고리는 단일 지점에서 결합되거나 (예를 들어, 비페닐) 또는 융합될 수 있다 (예를 들어, 나프틸, 페난트레닐 등).

예를 들어, 상기 아릴알킬은 상기 정의된 아릴기가 탄소수 1 내지 6의 알킬기에 결합된 것으로서 탄소수 7 내지 13을 가지는 것일 수 있으며, 예를 들어, 페닐메틸, 페닐에틸, 페닐프로필, 페닐부틸, 페닐펜틸, 페닐헥실 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예를 들어, 상기 올리고에틸렌 옥시드 기는 탄소수 2 이상을 가지는 것으로서, 예를 들어, 탄소수 2 내지 50, 또는 탄소수 2 내지 40, 또는 탄소수 2 내지 30, 또는 탄소수 2 내지 20, 또는 탄소수 4 내지 50, 또는 탄소수 4 내지 40, 또는 탄소수 4 내지 30, 또는 탄소수 4 내지 20 을 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구현예에 있어서, 상기 포스포콜린 기를 가지는 단량체는, 아크릴레이트-X-포스포콜린(acrylate-X-phosphocholine), 비닐-X-포스포콜린 (vinyl-X-phosphocholine), 또는, 3(4)-비닐벤질 12-포스포릴콜린도데카노에이트 [3(4)-vinylbenzyl 12-phosphorylcholinedodecanoate(VPC)] 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것일 수 있으며, X는 상기에 정의된 바와 같은 알킬기, 아릴기, 아릴알킬기, 올리고에틸렌옥시드, 또는 이들 기의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예시적 구현예에서, 상기 자성나노입자와 상기 포스포콜린 기를 가지는 물질 사이에 결합된 링커(linker)를 추가 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 링커는 그의 일 말단에 상기 자성나노입자 표면에 결합가능한 기능기 및 다른 말단에 중합 가능기를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예시적 구현예에서, 상기 중합 가능기는 비닐, 스티릴, 아크릴로일, 메타크릴로일, 이타코노일, 소르빌 및 디에노일에서 선택된 라디칼 중합 단량체이고, 상기 자성나노입자 표면과 반응하는 기능기는 실란, 티올, 디설파이드, 티오에테르, 트리클로로실릴, 트리메틸실릴, 트리이소프로필실릴 및 카테콜에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예시적 구현예에서, 상기 링커는 MPS(methacryloxypropyltrimethoxysilane)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예시적 구현예에서, 상기 자성나노입자는 산화철, 망간 및 아연 중 어느 하나 이상이 도핑된 산화철, 코발트 및 니켈로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예시적 구현예에서, 상기 자성나노입자의 직경은 10 nm 내지 50 nm 또는 10 nm 내지 30 nm 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예시적 구현예에서, 상기 자성나노입자는 C-반응성 단백질의 분리용으로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 C-반응성 단백질은 혈액 속에서 관찰되는 단백질 중 하나이다. 상기 C-반응성 단백질은 염증이 존재할 경우 증가하게 되므로, 주로 염증의 마커로서 사용될 수 있다. 상기 C-반응성 단백질의 생리학적인 기능은 C1Q 복합체(항원+항체)를 통하여 보체계를 활성화시키기 위해 죽거나 죽어가는 세포(그리고 박테리아의 일부 타입)의 표면 상에 나타나는 포스코콜린을 묶는 역할을 하며 C-반응성 단백질은 CRP의 수용기를 발현하는 대식세포의 식균작용을 높인다.

본원의 다른 측면은, 상기 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자의 제조 방법으로서, 상기 자성나노입자 표면에서 포스포콜린(Phosphocholine) 기를 가지는 단량체를 라디칼 중합 반응시키는 것을 포함하는, 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자의 제조 방법을 제공한다.

예시적 구현예에서, 상기 포스포콜린 기를 가지는 물질은, 하기 구조식 1을 가지는 포스포콜린 기를 가지는 단량체를 자성나노입자 표면에서 라디칼 중합반응시켜 형성된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다:

[구조식 1]

포스포콜린-X-R;

상기 식 중, R은 반응기, X는 스페이서 기임.

예시적 구현예에서, 상기 R은 중합 가능기 또는, 상기 자성나노입자 표면과 반응하는 기능기일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자에 관한 기재 중 상기 포스포콜린 기를 가지는 단량체에 관한 내용은 상기 본원에 따른 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자의 제조 방법에도 모두 적용되며, 편의 상 중복 기재를 생략한다.

예시적 구현예에서, 상기 자성나노입자와 상기 포스포콜린 기를 가지는 물질 사이에 결합된 링커(linker)를 먼저 결합 시키는 것을 추가 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 링커는 그의 일 말단에 상기 자성나노입자 표면에 결합가능한 기능기 및 다른 말단에 중합 가능기를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예시적 구현예에서, 상기 중합 가능기는 비닐, 스티릴, 아크릴로일, 메타크릴로일, 이타코노일, 소르빌 또는 디에노일에서 선택된 라디칼 중합 단량체이고, 상기 자성나노입자 표면과 반응하는 기능기는 실란, 티올, 디설파이드, 티오에테르, 트리클로로실릴, 트리메틸실릴, 트리이소프로필실릴 및 카테콜에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예시적 구현예에서, 상기 링커는 MPS(methacryloxypropyltrimethoxysilane)를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예시적 구현예에서, 상기 자성나노입자는 산화철, 망간 및 아연 중 어느 하나 이상이 도핑된 산화철, 코발트 및 니켈로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예시적 구현예에서, 상기 자성나노입자의 직경은 10 nm 내지 50 nm, 또는 10 nm 내지 30 nm 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

예시적 구현예에서, 상기 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자의 제조 방법은, 상기 자성나노입자를 포함하는 분산액을 준비하는 단계; 일 말단에 상기 자성나노입자와 반응가능한 기능기 및 다른 말단에 중합 가능기를 가지는 링커를 상기 분산액에 첨가하여 상기 자성나노입자의 표면을 개질하는 단계; 및, 상기 링커에 의해 표면개질된 자성나노입자와 상기 포스포콜린 기를 가지는 단량체를 포함하는 반응 용액을 혼합하여 상기 포스포콜린 기를 가지는 단량체의 반응기 R과 상기 자성나노입자 표면에 결합된 링커의 중합가능기와 라디칼 중합 반응시키는 단계:를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 구현예에 있어서, 상기 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자는 하기와 같이 제조될 수 있다. 구체적으로, 우선, 상기 자성나노입자를 포함하는 안정한 콜로이드 분산액을 올레산(OA) 등과 같은 계면활성제를 사용하여 공침(co-precipitation) 방법에 의해 제조할 수 있다. 상기 과정은 실온 내지 90℃ 의 온도에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 과정은 질소 분위기 하에서 수행될 수 있다. 이어서, 상기 분산된 자성나노입자를 톨루엔과 같은 유기 용매를 이용하여 추출한 후 상기 링커로서 메타크릴옥시프로필트리메톡시실란 (methacryloxypropyltrimethoxysilane; MPS)을 상기 자성나노입자 콜로이드 분산액에 첨가하여 MPS의 메톡시실란기를 통하여 상기 자성나노입자 표면에 상기 MPS가 상기 자성나노입자 표면에 리간드-교환반응에 의하여 결합되도록 한다. 상기 MPS 결합 반응에 있어서 트리에틸아민과 같은 첨가제를 추가 첨가할 수 있다. 상기 MPS 결합 반응은 질소 분위기 하에서 수행될 수 있다. 그 후, 상기 반응 완료 후 에테르 용매를 첨가하여 MPS에 의하여 표면 개질된 자성나노입자를 침전시킨 후 자기력에 의한 분리를 수행하여 건조시킨다. 이어, 상기 분리 건조된 MPS가 표면에 결합된 자성나노입자를 다시 아세톤과 같은 비극성 유기 용매에 재분산시키고 에테르에 의하여 재침전시킨다. 상기 절차는 그래프트되지 않은 MPS 및 대체된 OA 제거하기 위해 5 차례 정도 반복될 수 있다. 이어서, 상기 MPS가 표면에 결합된 자성나노입자 및, 아크릴레이트-X-포스포콜린(acrylate-X-phosphocholine), 비닐-X-포스포콜린(vinyl-X-phosphocholine), 또는, 3(4)-비닐벤질 12-포스포릴콜린도데카노에이트 [3(4)-vinylbenzyl 12-phosphorylcholinedodecanoate(VPC)] 또는 이들의 혼합물 (상기 단량체에 있어서 X는 상기 정의된 바와 같음)과 같은 포스포콜린 기를 가지는 단량체를 포함하는 완충액을 준비하여 반응시킴으로써, 상기 자성나노입자 표면에 결합된 MPS의 말단에 포함된 메타크릴레이트기의 이중 결합을 통하여 상기 포스포콜린 기를 가지는 단량체에 포함된 말단 이중결합의 라디칼 중합 반응을 통하여 상기 포스포콜린 기를 가지는 단량체들로부터 형성되는 중합체를 형성함으로써, 상기 자성나노입자 표면을 포스포콜린으로 개질할 수 있다. 상기 중합 반응은 실온 내지 약 80℃ 에서 상기 중합 반응이 완료되기에 충분한 시간 동안, 예를 들어, 1 시간 이상의 적절한 시간 동안 수행될 수 있다. 또한, 상기 중합 반응 과정은 질소 분위기 하에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자의 직경은 10 nm 내지 50 nm, 또는 10 nm 내지 30 nm 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본원의 또 다른 측면은, 상기 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자를 C-반응성 단백질을 함유하는 시료 용액에 첨가하여 상기 자성나노입자와 C-반응성 단백질의 복합체(complex)를 형성하는 단계; 상기 복합체를 자석을 이용하여 상기 시료 용액으로부터 분리하는 단계; 및, 상기 분리된 복합체를 해리제(dissociating agent)에 의하여 분해시켜 상기 C-반응성 단백질을 분리하는 단계:를 포함하는, C-반응성 단백질을 분리방법을 제공한다.

상기 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자에 관한 내용은 그에 관하여 상술한 내용이 모두 적용될 수 있으며, 편의 상 중복기재를 생략한다.

예시적 구현예에서, 상기 해리제는 EDTA를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구현예에 있어서, 상기 자석에 의하여 분리된 복합체를 EDTA를 포함하는 해리제(dissociating agent)에 의하여 처리함으로써 분해시켜 상기 C-반응성 단백질을 분리할 수 있다. 예를 들어, 상기 자석에 의하여 분리된 복합체를 EDTA를 포함하는 버퍼 용액을 용출액으로서 사용하여 처리함으로써 상기 복합체로부터 상기 C-반응성 단백질을 분리할 수 있으며, 이렇게 분리된 상기 C-반응성 단백질의 농도는 ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) 에 의하여 측정될 수 있고 통상 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 에 의하여 확인될 수 있다. 상기 ELISA와 SDS-PAGE는 당업계에서 통상 사용되는 것으로서 당업자라면 이들을 이용하여 상기 분리된 C-반응성 단백질의 농도를 적의 측정할 수 있다.

상기 본원에 따른 C-반응성 단백질을 분리방법은 상기 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자를 이용하여 단백질 또는 혈청으로부터 C-반응성 단백질을 분리하여 단리시키는데 사용될 수 있다.

이에, 본원에 따른 C-반응성 단백질을 분리방법은 상기 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자(MNP)에 의하여, 임상적 바이오마커인, C-반응성 단백질을 단순한 공정에 의하여 용이하게 분리시킬 수 있다. 또한, 혈청과 같은 복합 매트릭스로부터의 상기 본원에 따른 상기 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자(MNP)를 이용하여 C-반응성 단백질을 빠르고 효율적으로 분리할 수 있으며, 상기 분리된 C-반응성 단백질은 추가 정제 과정 없이 이용하기에 충분한 순도로 단리될 수 있어, 종래 크로마토그래피를 이용한 방법에 비하여 단순하고 신속하게 단백질을 분리할 수 있다.

이하, 본원에 대하여 실시예를 이용하여 좀더 구체적으로 설명하지만, 본원이 이에 제한되는 것은 아니다.

<사용된 물질들>

하기 실시예 등에 있어서 필요한 물질들의 합성을 위해 사용된 모든 화학 물질들은 Sigma-Aldrich 또는 Fluka로부터 구입되었다. 스티렌은 감압 하 증류에 의해 정제되었고, 디비닐벤젠(divinylbenzene; DVB)은 공지된 문헌 절차에 따라 정제되었다. 상기 정제된 스티렌과 DVB는 4℃ 에서 저장되었다. 인산완충식염수(Phosphate buffered saline; PBS, HyClone(R))는 Thermo Scientific Co, Ltd (Rochester, USA) 로부터 구입하였다. 인간 혈장 CRP는 Sigma-Aldrich Co., Ltd. (St. Louis, USA) 로부터 구입하였다. CRP ELISA 키트는 Alpha Diagnostic International(San Antonio, USA)로부터 구입하였다. 인간 CRP-네가티브 혈청(N-혈청) 및 CRP-포지티브 혈청(P-혈청) 샘플은 Cenogenics 사인(Morganville, USA)로부터 구입된 CRPA Latex Test Set의 성분들로부터 이용되었다. SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)을 위한 분자 크기 마커(Prod# 26681) 및 5X 샘플 버퍼(Prod# 39000)는 Thermo Scientific 사로부터 구입되었다. 다른 모든 화학 물질은 분석용 등급(analytical grade)를 가지고 있었고, 구입된 채로 사용한다.

<물질 분석>

하기 실시예 등에 있어서, ¹H NMR 및 ¹³C NMR 스펙트럼은 Bruker NMR 분광계(AVANCE 400)를 이용하여 CDCl₃중에서 수득되었다. FT-IR 스펙트럼은 ThermoNicolet IR 분광계(IR380)로 측정되었다. 전자 분무(electrospray) 이온화 질량 분광법은 Waters Micromass ZQ (MM1) 질량 분광계 상에서 수행되었다. 면역 분석 흡광도는 Thermo 자동 엘리사 리더 (Multiskan EX)를 이용하여 측정되었다. 자성 입자 크기는 Malvern Zetasizer(Nano-ZS)에 의해 분석되었다. Philips X-선 형광 분광계 (XRF, PW2400)는 MNP 표면의 원자 분석을 위해 사용되었다. TEM 분석은 Hitachi 주사 투과 전자 현미경(HD-2300)에 의해 수행되었다. 단백질 분석은 Ettan MALDI-TOF(Amersham Biosciences)을 이용하여 수행되었다. SDS-PAGE 겔의 이미지 분석은 GE Healthcare Image 분석기 (ImageQuant 350)에 의해 수행되었다.

[ 제조예 1]

3(4)- vinylbenzyl 12- phosphorylcholinedodecanoate ( VPC )의 합성

도 9에 따라, VPC는 이전에 본 발명자의 실험실에서 합성되어 본 실시예에 사용되었다. 간략하게, DMF(100 mL) 중 12-하이드록시도데칸산(3.00 g, 13.9 mmol)과 탄산 칼륨(2.30 g, 16.6 mmol)의 혼합물에 3(4)-비닐벤질 염화물(1.96 mL, 13.9 mmol)을 첨가하였다. 상기 혼합물은 24 시간 동안 80℃ 에서 교반되었다. 진공 중 농축 후 그 잔여물은 디클로로메탄으로 희석되었다. 그 유기층은 물로 세정되었고, MgSO₄ 상에서 건조시켰다. 용매를 회전 증발기에 의해 제거하여 미정제 생성물을 수득하였으며, 상기는 헥산/에틸 아세트산(3:1)을 이용하여 용출하여, 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(flash column chromatography)에 의해 정제되어 3.30 g 의 백색 고체 화합물 1(72% 수득률) 을 수득하였다: R _f = 0.48 in hexane/ethyl acetate (2:1); ¹H NMR (CDCl₃) δ (ppm) 7.41 (m, CH₂=CHC ₄ H ₄ CH₂-), 6.72 (dd, J ₁ = 17.6 Hz, J ₂ = 10.8 Hz, CH₂=CHC₄H₄CH₂-), 5.763, 5.761 (dd, J ₁ = 17.6 Hz, J ₂ = 4.0 Hz, CH ₂ =CHC₄H₄CH₂-), 5.269, 5.267 (dd, J ₁ = 10.8 Hz, J ₂ = 4.0 Hz, CH ₂ =CHC₄H₄CH₂-), 5.108, 5.094 (s, =CHC₄H₄ CH ₂ OC(O)-), 3.64 (t, J = 6.4 Hz, -CH₂CH₂ CH ₂ OH), 2.36, 2.35 (t, J = 7.6 Hz, -CH₂OC(O)CH ₂ CH₂-), 1.64 (m, -OC(O)-CH₂ CH ₂ CH₂-, -CH₂ CH ₂ CH₂OH), 1.27 (m, -CH₂ ( CH ₂ ) ₇ CH₂-); ¹³C NMR (CDCl₃) δ (ppm) 173.74, 137.90, 137.52, 136.47, 136.40, 136.35, 135.62, 128.77, 128.47, 127.60, 126.36, 126.05, 126.01, 114.39, 114.30, 65.97, 65.83, 63.11, 34.35, 32.81, 29.56, 29.49, 29.41, 29.24, 29.12, 25.74, 24.96; FT-IR (cm^-1) 3328, 2914, 1728, 1628, 1462; ESI-MS m/z 355 (M + Na⁺) calcd for C₂₁H₃₂O₃Na 355.5.

화합물 1 (1.50 g, 4.51 mmol) 및 트리에틸아민 (2.09 mL, 15.0 mmol)은 디클로로메탄 (20 mL) 중에 용해되었고, 얼음 배스에서 냉각되었고, 그리고 나서 2-클로로-2-oxo-1,3,2-디옥사포스폴란(COP)(0.68 mL, 7.44 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 용액을 얼음 배스 온도에서 1 시간 동안 그리고 실온에서 밤새도록 교반하였다. 진공 중 농축 후 결과로 수득된 잔류물은, 클로로포름으로 희석되었고 유리 필터를 통해 여과되었다. 그 여과액은 진공 주에서 농축되었고, 그 미정제 생성물은 헥산/에틸 아세트산 (1:2)로 용출하며, 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 분리되어, 점성 오일(viscous oily) 의 화합물 2 (44% 수율) 86 g 을 수득하였다: R _f = 0.35 in hexane/ethyl acetate (1:1); ¹H NMR (CDCl₃) δ (ppm) 7.41 (m, CH₂=CH-C ₄ H ₄ -CH₂-), 6.72 (dd, CH₂=CH-C₄H₄-CH₂-), 5.77 (dd, CH ₂ =CHC₄H₄CH₂-), 5.27 (dd, CH ₂ =CHC₄H₄CH₂-), 5.11, 5.10 (s, =CHC₄H₄ CH ₂ OC(O)-), 4.45 (m, -CH₂-OP(O)(O-CH ₂ ) ₂ ), 4.15 (t, J = 6.4 Hz, -CH₂-CH ₂ -OP(O)O-), 2.36, 2.35 (t, J = 7.6 Hz, -CH₂-OC(O)-CH ₂ -CH₂-), 1.64 (m, -OC(O)-CH₂-CH ₂ -CH₂-, -CH₂-CH ₂ -CH₂-OH), 1.25 (m, -CH₂-( CH ₂ ) ₇ -CH₂-).

압력 병(pressure bottle) 내에서, 아세토니트릴(5 mL) 중에 용해된 화합물 2(0.86 g, 1.96 mmol)가 -20℃ 로 냉각되었고, 트리메틸아민(0.55 mL, 5.86 mmol)을 첨가하였다. 상기 반응 혼합물은 60℃ 에서 24 시간 동안 교반되었다. 진공 중 농축 후 얻어진 미정제 생성물은 클로로포름/메탄올/물(65:25:4)을 이용하여 함께 용출하는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피에 의해 용출하여 정제되었다. 상기 용매는 진공 하에서 제거되었다. 그 결과로 수득된 잔류물은 클로로포름 중에 용해되고, 0.22 mm PTFE 필터를 통해 여과되고, 끈적한(sticky) 고체 VPC 0.24 g(25% 수율)를 수득하였다: R _f = 0.12 in chloroform/methanol/water (65:25:4); ¹H NMR (CDCl₃) δ (ppm) 7.40 (m, CH₂=CH-C ₄ H ₄ -CH₂-), 6.71 (dd, J ₁ = 17.6 Hz, J ₂ = 10.8 Hz, CH₂=CHC₄H₄CH₂-), 5.753, 5.751 (dd, J ₁ = 17.6 Hz, J ₂ = 4.0 Hz, CH ₂ =CHC₄H₄CH₂-), 5.258, 5.256 (dd, J ₁ =10.8 Hz, J ₂ = 4.0 Hz, CH ₂ =CHC₄H₄CH₂-), 5.09, 5.08 (s, -CHC₄H₄ CH ₂ OC(O)-), 4.26 (m, -CH ₂ -CH₂-N⁺(CH₃)₃), 3.80 (m, -CH₂-CH₂-CH ₂ -OP, -CH₂-CH ₂ -N⁺(CH₃)₃), 3.42 (s, -CH₂-CH ₂ -N( CH ₃ ) ₃ ), 2.332, 2.325 (t, J = 7.6 Hz, -OC(O)-CH ₂ -CH₂-), 1.58 (m, -OC(O)-CH₂-CH ₂ -CH₂-, -CH₂-CH ₂ -CH₂-OH, 4H), 1.25 (m, -CH₂-( CH ₂ ) ₇ -CH₂-); ¹³C NMR (CDCl₃) δ(ppm) 173.68, 137.87, 137.50, 136.46, 136.39, 136.33, 135.61, 128.77, 128.44, 127.57, 126.35, 126.01, 125.99, 114.39, 114.30, 66.25, 65.95, 65.81, 65.66, 65.60, 59.20, 54.29, 34.32, 31.07, 31.00, 29.70, 29.64, 29.53, 29.49, 29.32, 29.16, 25.92, 24.96. FT-IR (cm^-1) 3367, 2923, 1732, 1483, 1232; ESI-MS m/z 520 (M + Na⁺) calcd for C₂₆H₄₄NO₆PNa 520.3.

[ 실시예 1]

VPC 에 의하여 표면개질된 자성나노입자의 제조

합성 전략은 도 1에 나타내었다. 첫째로, 자성나노입자 (Magnetic NanoParticles, MNPs의 안정한 콜로이드 분산액은 계면활성제로서 올레산(OA)을 사용하여 공침(co-precipitation) 방법에 의해 제조하였다. 둘째로, 메타크릴옥시프로필트리메톡시실란(methacryloxypropyltrimethoxysilane; MPS)은 메타크릴레이트 이중 결합으로 MNPs의 표면을 개질하는데 사용되었다. 상기 MNPs의 표면 위에 MPS의 고정화(immobilization)는 리간드 교환 반응에 의해 수행되어 MPS로 개질된 MNPs(MPS-MNP)를 수득하였다. 마지막으로, 상기 MNPs의 표면으로부터 VPC의 그래프트 중합은 PBS 버퍼 용액 중에서 실시되어 VPC-개질된 MNP(VPC-MNP)를 제조하였다. 상기 MPS로 개질된 MNPs(MPS-MNP)는, 표면 특성과 CRP 결합 활성에 대하여, VPC-개질된 MNP(VPC-MNP)와 비교하기 위해 대조(control) 나노입자로서 사용되었다.

구체적으로, 2.35 g 황산 제1철·7수화물(ferrous sulfate heptahydrate) 및 4.1 g 염화 제2철·6수화물(ferric chloride hexahydrate)이 플라스크 내에 100 mL 탈이온수(deionized water) 중에 용해되었다. 상기 용액은 교반되었고, 실온에서 25 mL 25% (w/w) NH₃H₂O 가 빠르게 첨가되었다. 그리고 나서, 격렬한 교반 하에서, 1 mL OA (올레산)가 천천히 1 시간의 과정으로 80℃ 에서 상기 분산액 내로 적하되었다. 상기 전체 공정은 질소 분위기 하에서 수행되었다. 이러한 MNPs는 유도제(inducer)로서 NaCl을 간단히 첨가함으로써 톨루엔 중으로 추출되었다. 1.22 ml MPS, 0.72 ml 트리에틸아민(TEA), 및 상기 톨루엔 추출물의 OA-코팅된 MNPs는 질소 분위기 하에서 혼합되어 실온에서 8 시간 동안 교반되었다. 개질(modification)이 완료되었을 때, 석유 에테르(petroleum ether)가 상기 개질된 MNPs를 침전시키기 위해 상기 혼합물에 첨가되었고, 자기력 분리(magnetic separation)와 진공 중 건조가 이어졌다. 마지막으로, 상기 MNPs는 아세톤 중으로 재분산되었고 석유 에테르에 의해 재침전되었다. 상기 절차는 그래프트되지 않은 MPS 및 대체된 OA를 제거하기 위해 5 차례 반복되었다. 0.064 g AIBN (2,2'-azobis(2-methylpropionitrile)) 은 먼저 600 ul DMSO에 용해되었고, 2 mM VPC 및 40 mg MPS 로 코팅된 MNPs 를 포함하는 30 ml PBS에 첨가되었다. 그리고 나서 상기 혼합물은 질소 분위기 하에서 37℃ 에서 2 시간 동안 그리고 70℃ 에서 2 시간 동안 배양되었다. 최종적으로, VPC(MNP-VPC)로 코팅된 MNPs는 자기적 방식으로 분리되었다. 상기 MPS 만으로 코팅된 자성 나노입자는 대조(control) 나노입자(MNP-C) 로서 사용되었다.

상기 MNP 표면의 특성 분석

상기 VPC 중 실제 인(P)은 X-선 형광 분광기(Phillip/ WD-XRF PW-2400)에 의해 분석되었다. 상기 조사된 MNPs의 응집된 입자 크기 분포는 광산란 입자 사이즈 분석기(light scattering particle size analyzer, Malvern/Zetasizer Nano-ZS)에 의해 분석되었다. 그 MNPs의 형태 및 독립적 입자 크기는 TEM(Hitachi/HD-2300)에 의해 분석되었다.

DLS 측정에 의해 측정된 MPS-MNP의 직경은 147 nm이고 VPC-MNP의 직경은 143 nm이다(도 2). TEM 사진(도 3)은 DLS에 의한 입자 크기가 MNPs의 응집의 결과인 것을 나타냈다. MPS-MNP의 단일 입자 크기는 13.8 nm이었고, VPC-MNP는 13.6 nm 이었다. VPC-MNP의 형태(morphology)는 MPS-MNP의 원래 상태로부터 거의 변하지 않은 채로 남아 있다. XRF 조사가 VPC-MNP 상에 VPC의 중합을 확인하기 위해 수행되었다. VPC-MNP 중에 인(phosphorus)의 원자 함량은 0.028% 로 분석되었지만, MPS-MNP 에서는 검출되지 않았다(표 1). 이것은 VPC가 성공적으로 MPS에 의해 개질된(modified)) MNPs의 표면에 결합되었다는 것을 의미한다. 그 결과로서, 메타크릴레이트 이중 결합은 MPS-MNP의 표면 상에 고정되었고, 표면 상의 이중 결합으로부터, VPC는 라디컬 중합(VPC-MNP)을 통하여 결합되었다. MNPs는 물 중에 매우 잘 분산되었고, 그들은 외부 자기장 하에서 분리될 수 있다.

CRP 결합 분석 방법

상기와 같이 제조된 VPC-MNP 및 MPS-MNP의 각각 40 mg 이 CRP 결합 분석에 사용되었다. MNP-VPC 및 MNP-C는 2 시간 초음파 처리에 의해, 1 ml 결합 버퍼에 분산시켰다. 적당량의 MNP 기질을 첨가한 후, 얼음 배스에서 30분 동안 온화한 요동과 함께 배양되었다. 상기 MNPs는 자석에 의해 분리되었고 상기 버퍼 용액은 제거되었다. 1 ml PBS가, 실온에서 5분 동안 약하게 요동시켜, 상기 분리된 MNPs에 첨가되었다. 전체 세정 공정을 4 차례 동안 반복하였다. 마지막으로, 용출 버퍼 500 μl을 상기 MNPs에 첨가하였고, 실온에서 20분 동안 배양하였다. ELISA 분석을 위해, 상기 최종 용출액의 10 μl을 이용하였다. 상기 용출액의 잔류물에, 메탄올 480 μl 및 클로로포름 160 μl 을 첨가하고 흔들어 주었다. 추가로 300 μl 물의 상기 용출액에 첨가되었고, 그 전체 용액은 14,000 rpm 에서 5분 동안 마이크로 원심분리 시켰다. 그 상부 상의 작은 양을 남겨두고 상기 상부 상(메탄올/물 혼합물)을 흡수하여 제거하였고; 단백질은 상기 두 액상(liquid phase) 사이에 있었다. 다음에, 메탄올 300 μl 이 상기 혼합물에 첨가되었고, 그 전체 용액은 소용돌이치게 하고 14,000 rpm 에서 30분 동안 원심 분리하였다. 그 상청액(supernatant)은 조심스럽게 제거되었고 그 펠릿(pellet)은 건조하였다. 상기 단백질 펠릿은 통상적인 SDS-PAGE를 수행하기 위해 40 μl 1X SDS-PAGE 시료 버퍼 내에 재현탁되었다.

CRP 단독처리 시 결합 분석

상기 CRP 결합 분석은 40 mg MNPs 를 사용하여 수행되었다. 10 nM 및 20 nM CRP 가 MNPs로 처리되었고, 백그라운드 단백질은 4 회 PBS 세정에 의하여 제거되었다. 그리고 나서, CRP는 10 mM EDTA를 포함하는 용출버퍼에 의해 용리되었다. 상기 마지막 용출액(eluate) 중 CRP 농도는 ELISA에 의해 측정되었고, 통상의 SDS-PAGE에서 확인되었다. 도 4에서, MPS-MNP는 10 nM 및 20 nM 에서 CRP 각각 mg MNP 당 CRP 0 및 0.016 ng 을 흡착한다는 것을 나타낸다. 그러나, VPC-MNP는 같은 농도에서 mg MNP 당 1.15 및 2.9 ng을 흡착할 수 있다. 이것은, MPS-MNP가 CRP를 특이적으로 결합하는 능력을 갖지는 않았지만, VPC-MNP가, 표면 상에 결합된 포스포콜린기에 의해 야기된 특이적 결합능을 가졌다는 것을 의미한다. 도 5는, 20 nM CRP가 처리된 후에 농축된 용출액의 SDS-PAGE를 나타낸다. 통상의 SDS-PAGE가 변성(denaturing) 조건에서 실행되었기 때문에, SDS-PAGE 겔 상의 CRP 조절은 25 kDa에서 위치되었고, VPC-MNP로부터의 마지막 용출액 중 CRP는 대조(control) CRP 의 동일 위치에 나타났다. MPS-MNP 샘플에서, CRP 밴드는 SDS-PAGE에서 발견되지 않다.

인간 혈청으로부터 CRP 단리

먼저, 인간혈청으로부터 CRP 단리 효과를 측정하기 위하여 CRP-네가티브 인간 혈청(N-혈청) 400 μg 및 CRP 2.3 μg (20 nM) 이 혼합되었고 40 mg MPS-MNPs 및 VPC-MNPs에 처리되었다. 그 결합, 세정, 용출 및 농축 공정은 상기 CRP 단독처리시 결합 분석과 같았고, 12% SDS-PAGE는 그 농축된 단백질 시료를 이용하여 수행되었다.

또한, VPC-MNP의 특이적 결합 효과를 확인하기 위해, P-혈청 단백질 2 mg 및 탄산탈수 효소(carbonic anhydrase; CA) 6 μg 이 혼합되었고, 40 mg MPS-MNPs 및 VPC-MNPs 으로 처리되었다. 그 결합, 세정, 용출 및 농축 공정은 상기 CRP 단독처리시 결합 분석과 같았고, 12% SDS-PAGE 는 농축 단백질 시료를 이용하여 수행하였다.)

CRP의 2.3 μg (20 nM) 및 CRP-네가티브 인간 혈청(N-혈청) 단백질의 400 μg 이, CRP 단독처리시 결합 분석과 동일한 방법에 따라, 40 mg MPS-MNP 및 VPC-MNP에 각각 동시 처리(co-treated) 되었다. 최종 용출액은 메탄올/클로로포름에 의해 농축되었고, 그 침전은 연속되는 겔 전기영동을 위해, 40 ml SDS-PAGE 시료 버퍼 중에 재현탁(resuspend) 되었다. 도 6에 도시된 바와 같이, CRP인 것으로 보이는, 24 kDa(사이즈 마커로부터 계산된)에서 하나의 강한 단백질 밴드, 및 약 65 kDa 근처에서 여러 저의 작은 밴드들이 VPC-MNP 레인에서 나타났다. 알부민을 포함할 수 있는, 상기 작은 밴드들은 VPC-MNP에 의해 완전히 제거되지 않았다. 알부민은 인간 혈청 중에 풍부하게 존재하기 때문에, 혈청으로부터 완전히 제거되기 위한 어려운 단백질 중 하나이다(혈청 단백질의 >60%이 알부민이다). 상기 CRP의 밴드 강도는 이미지 분석 소프트웨어(ImageQuant 350)에 의해, VPC-MNP 레인의 전체 밴드 강도의 91% 인 것으로 계산되었다. 그러므로, MNPs에 의한 원-스텝 단백질 단리가 인간 혈청으로부터 >90% 순도로 CRP를 정제할 수 있었다고 볼 수 있다. MPS-MNP는 겔 전기영동에 의해 검출된 임의 결합 단백질을 보여주지 않으며, 이는 MPS 표면이 인간 혈청에서 단백질의 비-특이적 결합에 대하여 저항성을 가진다는 것을 보여준다. 이러한 결과는 양쪽 이온성(zwitterionic) 물질 중 하나로서, 메타크릴레이트 화합물의 비-생물흡착(non-biofouling) 효과에 의해 뒷받침된다.

도 7에 있어서, 상기 CRP 결합은, CRP의 고농도의 도입에 의해 초래된 비-특이적 결합으로부터가 아닌, CRP의 포스포콜린 특이적 결합 때문에 기인되었다. 2 mg CRP-포지티브 혈청(P-혈청) 단백질과 6 mg 탄산 탈수효소(carbonic anhydrase; CA)는 각 MNP의 40 mg 로 처리되었다. 도 7에서, 25 kDa 의 밴드와 67 kDa 근처의 여러 단백질들이 도 6에서와 비슷하게 나타났다. 또한 65 kDa 근처 단백질들은 알부민인 것으로 생각되고 상기 25 kDa 단밸질은 CRP인 것으로 생각된다. 상기 MNPs로 처리된 CA의 양이 그에 대응하는 CRP의 양의 1.3 배였을지라도, 겔 전기영동에서 CA 밴드는 발견되지 않았다. 상기 P-혈청 중 CRP는 단리되어 25 kD의 위치에서 나타났다. 도 7의 또한 VPC-MNP 레인 중 25 kD 단백질과 또한 도 6의 VPC-MNP 레인 중 24 kDa 가 CRP 인지 확인하기 위해, 상기 단백질들은 슬라이스되어, 개질된 돼지 트립신(porcine trypsin)에 의해 소화시켜, 단백질 동정을 위한 MALDI-TOF 에 의해 분석되었다. 검색 프로그램 ProFound 가 펩티드 질량 핑거프린팅(fingerprinting) 의한 단백질 동정에 사용되었다. 상기 질량 분석은 도 6 및 도 7에서 25 kDa 근처의 두 개의 밴드가 동일 단백질이었다는 것을 보여줬고, 상기 스펙트럼은 프로파운드 데이터베이스에서 인간 혈장(human plasma) CRP 과 정확하게 일치되었다(도 8). 결과적으로, CRP는, MNPs에 농도의존적 비-특이적 결합으로부터가 아닌, VPC-MNP에 특이적으로 결합되었다.

SDS - PAGE 겔로부터 단리된 CRP 의 동정

단백질 밴드들은 당업계에 공지된 Shevchenko, A., Wilm, M., Vorm, O., Mann, M. Mass Spectrometric Sequencing of Proteins from Silver-Stained Polyacrylamide Gels. Anaytical Chemistry 68, 850-858. (1996)에 기술된 것과 유사한 방법으로 개질된 돼지 트립신을 이용하여, 젤 중에서 효소적으로 소화(digest) 시켰다. 겔 시편(Gel piece)은 SDS, 염 및 스테인을 제거하기 위해 50% 아세토니트릴로 세척하였고, 건조하여 용매를 제거하고, 그리고 나서, 트립신(8-10ng/μl )로 재수화시켰고, 37℃ 에서 8-10 시간 배양하였다. 상기 단백질 가수분해 반응은 5 ㎕ 0.5% 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)의 첨가에 의해 종결시켰다. 트립틱 펩타이드(tryptic peptide)는 상기 겔 시편의 여러번 추출로부터의 수상과 50% 수성 아세토나이트릴을 조합함으로써 회수되었다. 농축 후, 상기 펩타이드 혼합물은 C18ZipTips (Millipore)을 사용하여 탈염시켰고, 상기 펩타이드는 아세토니트릴의 1-5 ㎕ 에서 용출되었다. 이 용액의 분획(aliquot)을 50% 수성 아세토나이트릴 중 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산의 포화된 용액의 동일 부피와 함께 혼합하였고, 상기 혼합물의 1㎕ 을 표적 플레이트(target plate) 위에 스포팅(spotting) 하였다.

단백질 분석은 Ettan MALDI-TOF (Amersham Biosciences)을 이용하여 수행하였다. 펩티드를 337 nm에서 N₂ 레이저를 이용하여 증발하였고, 지연된 추출 접근을 이용하였다. 그들은 플라이트(flight) 분석의 시간 동안 20Kv 주입 펄스에 의해 가속되었다. 각 스펙트럼은 300 레이저 샷(shot)의 누적 평균이었다. 로케펠러 대학(http://prowl.rockefeller.edu/ prowl-cgi/profound.exe)에 의해 개발된 검색 프로그램 ProFound 가, 펩티드 질량 핑거프링팅에 의해 단백질 동정에 사용하였다. 상기 스펙트럼은 내부 표준으로서 트립신 자동-소화 이온 피크 m/z (842.510, 2211.1046)를 이용하여 보정(calibration) 하였다.

본원에 따라, MNP에 의하여, 임상적 바이오마커인 C-반응성 단백질의 추출 방법을 개발하였다. 혈청과 같은 복합 매트릭스로부터의 포스포콜린 개질된 MNP-계 단백질 추출의 첫 번째 증명은, 이러한 방법이 단백질 정제에서 빠르고 효율적인 방법으로서 향후 사용될 수 있음을 증명한다. 이 방법은, 대량의 MNPs가 이용되는 경우 더 유리하다. 상기 SDS-PAGE 데이터는 상기 단리된 CRP가 추가 정제 과정 없이 이용하기에 충분하다는 것을 확인했다. 상기 VPC-코팅된, MNPs는 다른 백그라운드 단백질을 제거하기 위해 10 mM EDTA를 이용한 CRP의 용출 및 연속되는 아세톤 세정에 의해 재사용될 수 있다. 상기 기술된 본원의 방법은 현재 단백질 정제에서 사용되는 복잡한 크로마토그래픽 방법에 대한 새로운 대체 방법으로서 유용할 수 있다.

상기에서는 본원의 바람직한 구현예 및 실시예를 참조하여 설명하였지만, 해당 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 하기의 특허 청구의 범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (13)

1. 자성나노입자 및 상기 자성나노입자 표면에 결합된 포스포콜린(Phosphocholine) 기를 가지는 단량체를 포함하며, 상기 포스포콜린 기가 표면에 노출되어 있으며, C-반응성 단백질의 분리용으로 사용될 수 있는, 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 포스포콜린 기를 가지는 단량체는, 하기 구조식 1을 가지는 포스포콜린 기를 가지는 단량체를 자성나노입자 표면에서 라디칼 중합반응시켜 형성된 것인, 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자:
   [구조식 1]
   포스포콜린-X-R;
   상기 식 중, R은 반응기, X는 스페이서 기임.
   
3. 제 2 항에 있어서,
   상기 R은 중합 가능기 또는, 상기 자성나노입자 표면과 반응하는 기능기인, 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자.
   
4. 제 3 항에 있어서,
   상기 중합 가능기는 비닐, 스티릴, 아크릴로일, 메타크릴로일, 이타코노일, 소르빌 및 디에노일에서 선택된 라디칼 중합 단량체이고, 상기 자성나노입자 표면과 반응하는 기능기는 티올, 디설파이드, 티오에테르, 실란, 트리클로로실릴, 트리메틸실릴, 트리이소프로필실릴 및 카테콜에서 선택되는 것인, 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자.
   
5. 제 2 항에 있어서,
   상기 스페이서 기 X는 알킬기, 아릴기, 아릴알킬기, 올리고에틸렌옥시드, 또는 이들 기의 조합인, 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자.
   
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 자성나노입자와 상기 포스포콜린 기를 가지는 단량체 사이에 결합된 링커(linker)를 추가 포함하며, 상기 링커는 그의 일 말단에 상기 자성나노입자 표면에 결합가능한 기능기 및 다른 말단에 중합 가능기를 가지는 것인, 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자.
   
7. 제 6 항에 있어서,
   상기 링커는 MPS(methacryloxypropyltrimethoxysilane)를 포함하는 것인, 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자.
   
8. 제 1 항에 있어서,
   상기 자성나노입자는 산화철, 망간 및 아연 중 어느 하나 이상이 도핑된 산화철, 코발트 및 니켈로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 포함하는 것인, 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자.
   
9. 제 1 항에 있어서,
   상기 자성나노입자의 직경은 10 nm 내지 50 nm인, 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자.
   
10. 삭제
11. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자의 제조 방법으로서,
    상기 자성나노입자 표면에서 하기 구조식 1을 가지는 포스포콜린 기를 가지는 단량체를 라디칼 중합 반응시키는 것을 포함하는, 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자의 제조 방법:
    [구조식 1]
    포스포콜린-X-R;
    상기 식 중, R은 반응기, X는 스페이서 기임.
    
12. 제 11 항에 있어서,
    상기 자성나노입자를 포함하는 분산액을 준비하는 단계;
    일 말단에 상기 자성나노입자와 반응가능한 기능기 및 다른 말단에 중합 가능기를 가지는 링커를 상기 분산액에 첨가하여 상기 자성나노입자의 표면을 개질하는 단계; 및
    상기 링커에 의해 표면개질된 자성나노입자와 상기 포스포콜린 기를 가지는 단량체를 포함하는 반응 용액을 혼합하여 상기 포스포콜린 기를 가지는 단량체의 반응기 R과 상기 자성나노입자 표면에 결합된 링커의 중합가능기와 라디칼 중합 반응시키는 단계:
    를 포함하는, 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자의 제조 방법.
    
13. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 따른 포스포콜린에 의해 표면개질된 자성나노입자를 C-반응성 단백질을 함유하는 시료 용액에 첨가하여 상기 자성나노입자와 C-반응성 단백질의 복합체(complex)를 형성하는 단계;
    상기 복합체를 자석을 이용하여 상기 시료 용액으로부터 분리하는 단계; 및
    상기 분리된 복합체를 해리제(dissociating agent)에 의하여 분해시켜 상기 C-반응성 단백질을 분리하는 단계:
    를 포함하는, C-반응성 단백질의 분리방법.

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