KR20070016157A - 핵수용체 기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템에서의돌연변이체 수용체 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 생명공학 또는 유전공학 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 유전자 발현 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 신규한 치환 돌연변이체 수용체 및 핵수용체 기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템에서의 그의 용도 및 유전자 치료, 단백질 및 항체의 대규모 생산, 세포-기초의 고효율 스크리닝 분석, 기능 유전체학 및 유전자이식 생명체에서의 특성 조절과 같은 적용을 위해 숙주 세포에서 유전자 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다.

Description

핵수용체 기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템에서의 돌연변이체 수용체 및 그의 용도{MUTANT RECEPTORS AND THEIR USE IN A NUCLEAR RECEPTOR-BASED INDUCIBLE GENE EXPRESSION SYSTEM}
본 출원은 2004년 4월 30일 출원된 미국 가출원 60/567,294 및 2004년 9월 13일 출원된 미국 가출원 60/609,424에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명은 생명공학 또는 유전공학 분야에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 유전자 발현 분야에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 치환 돌연변이를 포함하는 신규한 핵수용체(nuclear receptor) 및 핵수용체 기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템에서의 그의 용도 및 상기 유도가능한 유전자 발현 시스템을 이용하여 숙주 세포 내에서 유전자 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다
다양한 문헌들이 본 명세서 내에 인용되며, 그 개시된 내용은 전체가 참조문헌으로 포함되어 있다. 그러나, 본 명세서에 인용된 모든 문헌들은 이러한 인용문헌이 본 발명에 대한 "종래 기술"로 이용되는 것을 허용한다는 것으로 해석되어서 는 안된다.
유전공학 분야에서, 유전자 발현의 정확한 조절은 분화(development) 및 다른 생리학적 과정에 대한 연구, 조작 및 조절을 위한 유용한 도구이다. 유전자 발현은 다수의 특정한 단백질-단백질 상호작용을 포함하는 복잡한 생물학적 과정이다. 유전자 발현이 개시되기 위해서는, 단백질 합성의 첫 번째 단계로서 필요한 RNA를 생산하고, 전사 활성자(transcriptional activator)가 유전자 전사를 조절하는 프로모터(promoter)의 근방으로 와야 한다. 전형적으로, 상기 전사 활성자 자체는 유전자의 프로모터 영역에 존재하는 DNA 결합 부위에 결합하는 DNA 결합 도메인(domain)을 적어도 하나 갖고 있는 단백질과 연관되어 있다. 따라서, 유전자 발현이 일어나기 위해서는 DNA 결합 도메인과 상기 DNA 결합 도메인으로부터 일정 거리에 위치하는 트랜스활성(transactivation) 도메인을 포함하는 단백질이 상기 유전자의 프로모터 영역내의 정확한 위치로 와야만 한다.
전통적인 유전자이식(transgenic) 방법은 디자인된 이식유전자(transgene)의 발현을 위해 세포형(cell-type) 특이적 프로모터를 이용한다. 상기 이식유전자를 포함하는 DNA 구조물(construct)은 먼저 숙주 게놈(genome) 내로 도입된다. 전사 활성자에 의해 유발(trigger)되면, 상기 이식유전자의 발현이 주어진 세포형에서 일어난다.
세포 내에서 외래 유전자의 발현을 조절하기 위한 다른 수단은 유도가능한 프로모터를 이용하는 것이다. 이러한 유도가능한 프로모터를 이용하는 예로는 PR1-a 프로모터, 원핵생물 억제자(repressor)-작용자(operator) 시스템, 면역억제 성-이뮤노필린(immunophilin) 시스템, 및 엑디스테로이드(ecdysteroid) 호르몬 수용체 시스템과 같은 고등 진핵생물 전사 활성 시스템을 포함하며, 이들은 아래에 개시되어 있다.
담배 유래의 PR1-a 프로모터는 병원체의 공격에 따른 전신 획득성 저항 반응 과정에서 유도된다. PR1-a는 종종 내인성(endogenous) 물질 및 병원체, UV-B 조사 및 오염물질과 같은 외인성(exogenous) 인자에 반응하기 때문에 그 이용이 제한될 수 있다. 열 충격, 인터페론 및 중금속에 의해 유도되는 프로모터에 기초한 유전자 발현 시스템이 개시되어 있다(Wurn 등, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5414-5418; Arnheiter 등, 1990, Cell 62:51-61; Filmus 등, 1992, Nucleic Acids Research 20:27550-27560). 그러나, 상기 시스템은 한계가 있는데, 그 이유는 비표적 유전자의 발현에도 효과가 나타나기 때문이다. 상기 시스템은 또한 새기 쉽다(leaky).
원핵생물 억제자-작용자 시스템은 세균 억제자 단백질 및 이들이 결합하는 독특한 작용자 DNA 서열을 이용한다. 세균인 대장균 유래의 테트라사이클린("Tet") 및 락토즈("Lac") 억제자-작용자 시스템 모두 유전자 발현을 조절하기 위해 식물 및 동물에서 사용되어 왔다. 상기 Tet 시스템에서는 테트라사이클린이 TetR 억제자 단백질에 결합하여 상기 억제자 단백질을 작용자로부터 떨어지게 하는 구조 변화를 일으키며, 결과적으로 전사가 일어나게 한다. 상기 Lac 시스템에서는 lac 오페론(operon)이 락토즈 또는 이소프로필-b-D-티오갈락토사이드(thiogalactoside)와 같은 합성 유사체의 존재시 반응하여 활성화된다. 불행하 게도, 이러한 시스템의 이용은 그 리간드(ligand), 즉 테트라사이클린 및 락토즈의 불안정한 화학(chemistry), 그들의 독성, 그들의 자연적 존재, 또는 유도 또는 억제를 위해 요구되는 상대적으로 높은 농도로 인해 제한된다. 유사한 이유로, 동물에서 이러한 시스템을 이용하는 것은 제한된다.
FK506, 라파마이신(rapamycin) 및 사이클로스포린(cyclosporine) A와 같은 면역억제성 분자는 FKBP12, 사이클로필린 등의 이뮤노필린(immuinophilin)에 결합할 수 있다. 이러한 정보를 이용하여, FK506을 두 단백질 중 하나에 위치시키거나, 또는 FK506을 한 단백질에 위치시키고 사이클로스포린 A를 다른 단백질에 위치시킴으로써, 간단히 임의의 두 가지 단백질을 함께 가져오기 위한 일반적인 전략이 고안되어 왔다. FK506의 합성 호모다이머(homodimer)(FK1012) 또는 FK506-사이클로스포린의 융합으로 생성된 화합물(FKCsA)은 이후 이들 분자의 다이머화를 유도하기 위해 사용될 수 있다(Spencer 등, 1993, Science 262: 1019-24; Belshaw 등, 1996 Proc Natl Acad Sci USA, 93: 4604-7). FKBP12에 융합된 Gal4 DNA 결합 도메인 및 사이클로필린에 융합된 VP16 활성자 도메인 및 FKCsA 화합물은 Gal4 결합 부위를 포함하는 프로모터의 조절 하에 리포터(reporter) 유전자의 헤테로(hetero)다이머화 및 활성을 보여주기 위해 사용되었다. 불행하게도, 상기 시스템은 원하지 않는 부작용을 가질 수 있는 면역억제제를 포함하며, 따라서 다양한 포유동물 유전자 스위치(switch)에 적용하는데 제한이 있다.
또한, 스테로이드 호르몬 수용체 시스템과 같은 고등 진핵생물 전사 활성 시스템이 도입되고 있다. 스테로이드 호르몬 수용체는 핵수용체 수퍼패밀 리(superfamily)의 멤버(member)이며, 척추동물 및 무척추동물 세포에서 발견된다. 불행하게도, 유전자 발현을 조절하기 위해 상기 수용체를 활성화시키는 스테로이드 화합물을 특히 식물 및 포유동물에서 사용하는 것은 이들이 상기 생명체 내에서 많은 다른 자연적 생물학적 경로에 관여되기 때문에 제한된다. 이러한 어려움을 극복하기 위하여, 대안적(alternative) 시스템이 곤충 엑디손(ecdysone) 수용체(EcR)를 이용하여 개발되었다.
곤충에서의 성장, 탈피, 분화는 상기 엑디손 스테로이드 호르몬(탈피 호르몬) 및 미숙(juvenile) 호르몬에 의해 조절된다(Dhadialla 등, 1998, Annu. Rev. Entomol. 43: 545-569). 곤충 내에서 상기 엑디손에 대한 분자 표적은 적어도 엑디손 수용체(EcR) 및 울트라스피라클(ultraspiracle) 단백질(USP)로 구성되어 있다. EcR은 서명(signature) DNA 및 리간드 결합 도메인, 및 활성 도메인에 의해 특징되는 핵 스테로이드 수용체 수퍼패밀리의 멤버이다(Koelle 등, 1991, Cell, 67:59-77). EcR 수용체는 포나스테론(ponasterone) A 및 무리스테론(muristerone) A와 같은 다수의 엑디스테로이드 화합물에 반응한다. 최근, 상업적으로 입수가능한 살충제로서 롬 앤드 하스사(Rohm and Haas Company)에서 전세계적으로 판매하고 있는 테부페노자이드(tebufenozide) 및 메톡시페노자이드(methoxyfenozide)를 포함하는 엑디스테로이드 작용제(agonist) 활성을 갖는 비스테로이드 화합물이 개시되어 있다(국제 특허 출원 PCT/EP96/00686 및 미국 특허 5,530,028 참조). 이들 유사체는 다른 생명체에 대해 예외적으로 안정한 프로필(profile)을 갖는다.
상기 곤충 엑디손 수용체(EcR)는 포유동물 RXR의 곤충 동족체인 울트라스피 라클(USP)과 헤테로다이머화되고, 엑디스테로이드 및 엑디손 수용체 반응 인자에 결합하며, 엑디손 반응성 유전자의 전사를 활성화시킨다(Riddiford 등, 2000). 상기 EcR/USP/리간드 복합체는 곤충의 분화 및 재생산 과정에서 중요한 역할을 한다. 상기 EcR은 스테로이드 호르몬 수용체 수퍼패밀리의 멤버이며, 5개의 모듈(mulular) 도메인인 A/B(트랜스활성), C(DNA 결합, 헤테로다이머화), D(힌지(hinge), 헤테로다이머화), E(리간드 결합, 헤테로다이머화 및 트랜스활성) 및 F(트랜스활성) 도메인을 갖고 있다. A/B, C 및 E와 같은 이들 도메인 중 일부는 다른 단백질에 융합되는 경우에도 그들의 활성을 유지한다.
엄격하게 조절되는 유도가능한 유전자 발현 시스템 또는 "유전자 스위치"는 유전자 치료, 세포 내에서의 대규모 단백질 합성, 세포에 기초한 고효율 스크리닝(screening) 분석, 기능 유전체학(genomics) 및 유전자이식 식물 및 동물에서의 특성(trait) 조절과 같은 다양한 분야의 적용에 유용하다.
EcR-기초의 유전자 스위치의 첫 번째 버전(version)은 초파리(Drosophila melanogaster) EcR(DmEcR) 및 쥐(Mus musculus) RXR(MmRXR)을 이용하였고, 엑디스테로이드, 포나스테론 A의 존재 하에 상기 수용체가 포유동물 세포주 및 유전자이식 마우스에서 리포터 유전자를 트랜스활성화 시킨다는 것을 보여주었다(Christopherson 등, 1992; No 등, 1996). 이후, 슈르 등은 비-엑디스테로이드 엑디손 작용제인 테부페노자이드가 포유동물 세포에서 외인성 헤테로다이머 파트너(partner)의 존재 하에 누에나방(Bombyx mori) EcR(BmEcR)을 통해 리포터 유전자의 활성을 고 레벨(level)로 유도한다는 것을 보였다(Suhr 등, 1998).
국제 특허 출원 PCT/US97/05330(WO97/38117) 및 PCT/US99/08381(WO99/58155)은, 외인성 유전자 및 엑디손 반응 인자를 포함하는 DNA 구조물이, 리간드 존재 하 및 선택적으로는 사일런트(silent) 파트너로 작용할 수 있는 수용체의 존재 하에 엑디손 수용체 인자에 결합하여 유전자 발현을 유도할 수 있는 엑디손 수용체를 포함하는 제2 DNA 구조물에 의해 활성화되는, 외인성 유전자의 발현을 조절하기 위한 방법을 개시하고 있다. 상기 선택된 엑디손 수용체는 초파리로부터 분리되었다. 전형적으로, 이러한 시스템은 최적의 활성을 제공하기 위해 사일런트 파트너, 바람직하게는 레티노이드(retinoid) X 수용체(RXR)의 존재를 필요로 한다. 포유동물 세포에서, 곤충 엑디손 수용체(EcR)는 레티노이드 X 수용체(RXR)와 헤테로다이머되며, 리간드 의존적 방식으로 표적 유전자의 발현을 조절한다. 국제 특허 출원 PCT/US98/14215(WO99/02683)는 누에나방으로부터 분리된 엑디손 수용체가 외인성 다이머 파트너의 필요없이 포유동물 시스템에서 기능을 한다는 것을 개시하고 있다.
미국 특허 6,265,173 B1은 유전자 발현 시스템에 사용하기 위하여 상기 수용체의 다양한 스테로이드/티로이드(thyroid) 수퍼패밀리 멤버가 초파리 울트라스피라클 수용체(USP) 또는 적어도 USP의 다이머화 도메인을 포함하는 그의 절편에 결합할 수 있음을 개시하고 있다. 미국 특허 5,880,333은 상기 트랜스활성 도메인 및 DNA 결합 도메인이 두 가지 다른 교잡(hybrid) 단백질 상에 위치하고 있는 식물에서 사용된 초파리 EcR 및 울트라스피라클(USP) 헤테로다이머 시스템을 개시하고 있다. 불행하게도, 상기 USP-기초의 시스템은 동물 세포에서 구성 분(constitutive)이며, 리포터 유전자 발현의 조절에는 효과적이지 않다.
이들 각각의 경우에, 트랜스활성 도메인 및 DNA 결합 도메인(국제 특허 출원 PCT/US98/14215에 있는 자연형 EcR 또는 국제 특허 출원 PCT/US97/05330에 있는 변형 EcR)은 단일 분자 내로 삽입되며, 다른 헤테로다이머 파트너인 USP 또는 RXR은 이들의 자연형 상태로 사용되었다.
상술한 EcR-기초의 유전자 조절 시스템의 결점은 리간드 부재시의 상당한 배경(background) 활성과 상기 시스템을 식물 및 동물 모두에 적용할 수 없다는 것을 포함한다(미국 특허 5,880,333 참조). 따라서, 종래 기술에서는 식물 및 동물 모두에서 외인성 유전자의 발현을 정확하게 조절하기 위하여, 개선된 EcR-기초의 시스템이 요구되고 있다. 이러한 개선된 시스템은 유전자 치료, 단백질 및 항체의 대규모 생산, 세포-기초의 고효율 스크리닝 분석, 기능 유전체학 및 유전자이식 동물에서의 특성 조절과 같은 분야의 적용에 유용할 것이다. 유전자 치료와 같은 특정한 분야의 적용을 위해서는, 합성 비-엑디스테로이드 리간드에는 잘 반응하고, 동시에 자연형 엑디스테로이드에는 민감하지 않은 유도가능한 유전자 발현 시스템을 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 간단하고, 치밀(compact)하며, 상대적으로 저렴한 리간드에 의존적이고, 즉시 적용가능하며, 숙주에 대한 독성이 낮은 개선된 시스템이 생물학적 시스템을 조절하기 위해 유용하다는 것이 판명될 것이다.
이전에, 본 발명자들은 트랜스활성 및 DNA 결합 도메인을 서로 다른 두 가지 단백질 상에 위치시킴으로써 이들이 서로 떨어져 있는 엑디손 수용체-기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템이, 리간드의 부재시 배경 활성을 상당히 감소시키고 리 간드의 존재시 배경에 비해 활성을 현저하게 증가시킨다는 것을 개시한 바 있다(계류중인 출원 PCT/US01/09050, 그 전체가 본 명세서에 참조문헌으로 포함됨). 상기 두 가지-교잡 시스템(two-hybrid system)은 상기 PCT/US97/05330 및 PCT/US98/14215 출원에 개시된 두 가지 시스템에 비해 현저하게 개선된 유도가능한 유전자 발현 조절 시스템이다. 상기 두 가지-교잡 시스템은, 한쌍의 트랜스작용성 단백질이 상기 DNA 결합 도메인에 대해 상기 전사 활성 도메인을 보다 바람직한 위치로 가져와서, 상기 DNA 결합 도메인이 유전자 상의 DNA 결합 위치에 결합할 때 상기 트랜스활성 도메인이 더욱 효과적으로 상기 프로모터를 활성화시키는 능력을 이용한다(예를 들면, 미국 특허 5,283,173 참조). 간략하게, 상기 두 가지-교잡 유전자 발현 시스템은 두 가지 유전자 발현 카세트(cassette)를 포함한다; 첫 번째는 핵수용체 폴리펩티드와 융합된 DNA 결합 도메인을 코딩하고, 두 번째는 다른 핵수용체 폴리펩티드에 융합된 트랜스활성 도메인을 코딩한다. 리간드의 존재시, 상기 첫 번째 폴리펩티드와 두 번째 폴리펩티드의 상호작용은 상기 DNA 결합 도메인을 상기 트랜스활성 도메인에 효과적으로 묶도록 한다. 상기 DNA 결합 및 트랜스활성 도메인은 두 가지 다른 분자 상에 있기 때문에, 리간드 부재시의 배경 활성은 매우 감소된다.
또한, 두 가지-교잡 시스템은 예를 들면 포나스테론 A("PonA") 또는 무리스테론 A("MurA")와 같은 엑디스테로이드 리간드와 비교할 때, 비-엑디스테로이드 리간드 예를 들면 디아실히드라진(diacylhydrazine)에 대한 개선된 민감성을 제공한다. 즉, 엑디스테로이드와 비교할 때, 상기 비-엑디스테로이드 리간드는 더 낮은 농도에서 더 높은 활성을 제공한다. 아울러, EcR 유전자 스위치에 기초한 트랜스활성은 종종 세포주 의존적이기 때문에, 각 적용시에 최대 트랜스활성 능력을 얻기 위해 스위치 시스템을 맞추는 것이 더 쉽다. 아울러, 상기 두 가지-교잡 시스템은, 비변형 RXR이 스위치 파트너로 사용될 때 종종 일어나는 RXR의 과발현에 의해 일어나는 몇 가지 부작용을 방지한다. 바람직한 두 가지-교잡 시스템에서, EcR 또는 RXR의 자연형 DNA 결합 및 트랜스활성 도메인은 제거되며, 결과적으로 상기 교잡 분자들이 세포 내에 존재하는 다른 스테로이드 호르몬 수용체와 상호작용할 기회가 줄어들게 되어 부작용이 감소하게 된다.
상기 EcR은 핵수용체 수퍼패밀리의 멤버이며, 서브패밀리(subfamily) 1, 그룹 H(이하, "그룹 H 핵수용체"라 함)로 분류된다. 각 그룹의 멤버들은 40-60%의 E(리간드 결합) 도메인 아미노산 동질성(homology)을 갖고 있다(Laudet 등, A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Subfamily, 1999; Cell 97: 161-163). 상기 엑디손 수용체에 더하여, 상기 핵수용체 서브패밀리 1, 그룹 H의 다른 멤버로는 유비쿼터스(ubiquitous) 수용체(UR), 오르판(Orphan) 수용체 1(OR-1), 스테로이드 호르몬 핵수용체 1(NER-1), RXR 상호작용성 단백질-15(RIP-15), 간 x 수용체β(LXRβ), 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질(RLD-1), 간 x 수용체(LXR), 간 x 수용체α(LXRα), 파네소이드(farnesoid) x 수용체(FXR), 수용체 상호작용성 단백질 14(RIP-14), 및 파네솔(farnesol) 수용체(HRR-1)를 포함한다.
리간드 결합 또는 리간드 특이성이 변형되어 있는 개선된 그룹 H 핵수용체- 기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템을 개발하기 위하여, 본 발명자들은 상기 리간드 결합 도메인(LBD) 내에 치환된 아미노산 잔기를 포함하는 치환 돌연변이체 EcR을 제조하였다. EcR LBD에 대한 엑디스테로이드 및 비-엑디스테로이드의 결합을 매개하는 결정적인(critical) 잔기를 예측하기 위하여 동질성 모델링 및 도킹(docking) 접근법이 사용되었다. 상기 치환 돌연변이체 EcR은 리간드 결합 및 트랜스활성 분석으로 평가하였다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 본 발명자들의 신규한 치환 돌연변이 핵수용체 및 핵수용체-기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템에서의 그의 용도는, 리간드 민감성 및 트랜스활성의 정도를 적용시에 따라 원하는 대로 선택할 수 있고, 원핵생물 및 진핵생물 숙주 세포 모두에서 개선된 유도가능한 유전자 발현 시스템을 제공한다.
본 발명자들은 본 명세서에서 상기 리간드 민감성 및 그룹 H 핵수용체의 유도 정도에 영향을 미치는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인에 대한 리간드의 결합에 관여하는 아미노산 잔기의 치환 돌연변이(이하, "치환 돌연변이체"라 함)를 포함하는 그룹 H 핵수용체의 제조와, 상기 치환 돌연변이체 핵수용체가 유전자 발현을 조절하는 방법에서 유용하다는 점을 개시한다.
구체적으로, 본 발명자들은 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 신규한 핵수용체-기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템을 개발하였다. 본 발명자들은 이러한 치환 돌연변이 효과가 리간드 결합 활성 또는 리간드 민감성을 증가 또는 감소시킬 수 있고, 상기 리간드가 엑디스테로이드 또는 비-엑디스테로이드에 특이적일 수 있음을 보였다. 따라서, 본 발명자들의 발명은 숙주 세포 내에서 원하는 유전자의 발현을 조절하기에 유용한 그룹 H 핵수용체-기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템을 제공한다. 특히 바람직한 구현예에서, 본 발명자들의 발명은 엑디스테로이드 리간드 또는 비-엑디스테로이드 리간드의 어느 한쪽에만 반응하는 엑디손 수용체-기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템을 제공한다. 아울러, 본 발명은 또한 엑디손 수용체-기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템에 반응하는 개선된 비-엑디스테로이드 리간드를 제공한다. 따라서, 본 발명자들의 신규한 유도가능한 유전자 발현 시스템 및 숙주 세포에서의 유전자 발현을 조절하는 방법에서의 그의 용도는 현재 이용되는 유도가능한 발현 시스템의 한계를 극복하며, 능숙한 당업자에게 유전자 발현을 조절하기 위한 효과적인 수단을 제공한다.
본 발명은 유전자 발현 레벨의 조절이 요구되는 유전자 치료, 단백질 및 항체의 대규모 생산, 세포-기초의 고효율 스크리닝 분석, 오쏘고날(orthogonal) 리간드 스크리닝 분석, 기능 유전체학, 단백질체학(proteomics), 대사체학(metabolomics), 및 유전자이식 생명체에서의 특성 조절과 같은 분야의 적용에 유용하다. 본 발명자들의 발명의 이점은 유전자 발현을 조절하고 사용자의 요구에 적합한 발현 레벨을 맞춤하는 방법을 제공한다는 것이다.
정의
본 명세서에서는 다수의 용어와 약자가 사용된다. 아래와 같은 정의가 제공되며, 본 발명의 범위 및 실행을 이해하는데 유용할 것이다.
특정한 구현예에서, "약" 또는 "대략"이란 용어는 주어진 값 또는 범위의 20% 이내, 바람직하게는 10% 이내, 보다 바람직하게는 5% 이내, 더욱 더 바람직하게는 1% 이내를 의미한다.
"실질적으로 제거된(substantially free)"이란 용어는, "A"를 포함하는 조성물(이때, "A"는 단일 단백질, DNA 분자, 벡터, 재조합 숙주 세포, 등)은 상기 조성물 내의 단백질, DNA, 벡터의 적어도 약 75 중량%가 "A"일 때 "B"(이때, "B"는 하나 이상의 오염 단백질, DNA 분자, 벡터, 등)가 실질적으로 제거된 것임을 의미한다. 바람직하게는, "A"는 상기 조성물 내 A+B 종의 적어도 약 90 중량%, 가장 바람직하게는 적어도 약 99 중량%를 포함한다. 또한, 실질적으로 오염이 제거된 조성물은 원하는 종의 활성과 특성을 갖는 단일한 분자량의 종만을 포함한다.
본 발명의 목적을 위한 "단리된(isolated)"이란 용어는 그 원래 환경(자연적으로 존재하는 환경)으로부터 제거된 생물학적 물질(핵산 또는 단백질)을 나타낸다. 예를 들면, 자연 상태에서 식물 및 동물 내에 존재하는 폴리뉴클레오티드(polynucleotide)는 단리된 것이 아니지만, 자연적으로 존재하는 인접한 핵산에서 분리된 동일한 폴리뉴클레오티드는 "단리된" 것으로 간주된다. "정제된(purified)"이란 용어는 다른 화합물의 존재를 배제하는 절대적인 정제를 나타내는 형태로 물질이 존재하는 것을 요구하지는 않는다. 이는 다소 상대적인 정의이다.
폴리뉴클레오티드는 적어도 한 등급(order)의 크기, 바람직하게는 2 또는 3 및 바람직하게는 4 또는 5 등급의 크기로 출발 물질 또는 자연 물질의 정제 후에는 "정제된" 상태이다.
"핵산"은 공유적으로 연결된 뉴클레오티드라 불리는 서브유닛(subunit)을 포함하는 고분자 화합물이다. 핵산은 폴리리보핵산(RNA) 및 폴리데옥시리보핵산(DNA)을 포함하며, 이들 모두는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있다. DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 플라스미드 DNA, 합성 DNA, 반(semi)-합성 DNA를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. DNA는 선형, 원형 또는 수퍼코일(supercoil) 형태일 수 있다.
"핵산 분자"는 리보뉴클레오시드(아데노신, 구아노신, 유리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오시드(데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자")의 인산 에스테르 고분자 형태, 또는 포스포로티오에이트(phosphorothioate) 및 티오에스테르와 같은 그의 임의의 포스포에스테르 유사체를 의미하며, 단일가닥 형태 또는 이중가닥 나선이다. 이중가닥 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 사슬이 가능하다. 핵산 분자, 특히 DNA 또는 RNA 분자란 용어는 분자의 1차 및 2차 구조만을 의미하며, 임의의 특정한 3차원 형태에 한정되는 것은 아니다. 따라서, 상기 용어는 특히 선형 또는 원형 DNA 분자(예를 들면, 제한효소(restriction enzyme) 절편), 플라스미드 및 염색체에서 발견되는 이중가닥 DNA를 포함한다. 특정한 이중가닥 DNA 분자의 구조를 논함에 있어서, 서열은 본 명세서에서 비-전사된 DNA 가닥(즉, mRNA와 동일한 서열을 갖는 가닥)을 따라 5'에서 3' 방향으로만 서열을 나타내는 통상의 관례에 따라 개시될 수 있다. "재조합 DNA 분자"는 분자 생물학적 조작을 거친 DNA 분자이다.
"절편"이란 용어는 참고(reference) 핵산에 비해 길이가 줄어들고, 공통 부분에 대해 상기 참고 핵산과 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본 발명에 따른 이러한 핵산 절편은 더 큰 뉴클레오티드 내에 구성원이 되어 적절하게 포함될 수 있다. 이러한 절편은 본 발명에 따른 핵산의 적어도 6, 8, 9, 10, 12, 15, 18, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 30, 39, 40, 42, 45, 48, 50, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 70, 75, 78, 80, 90, 100, 105, 120, 135, 150, 200, 300, 500, 720, 900, 1000 또는 1500개의 연속하는 뉴클레오티드 길이 범위의 올리고뉴클레오티드를 포함하거나, 다른 한편으로는 구성된다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "단리된 핵산 절편"은 단일 또는 이중가닥의 RNA 또는 DNA 고분자이며, 선택적으로는 합성, 비-자연형 또는 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함한다. DNA 고분자 형태의 단리된 핵산 절편은 하나 이상의 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA 조각(segment)을 포함할 수 있다.
"유전자"는 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드의 조립(assembly)을 의미하며, cDNA 및 게놈 DNA 핵산을 포함한다. 또한, "유전자"는 특정한 단백질 또는 폴리펩티드를 발현하는 핵산 절편을 의미하며, 상기 코딩 서열을 선행하는(5' 비-코딩 서열) 및 뒤따르는(3' 비-코딩 서열) 조절 서열을 포함한다. "자연형 유전자"는 그 자신의 조절 서열과 함께 자연에서 발견되는 유전자를 의미한다. "키메라(chimera) 유전자"는 자연형 유전자가 아닌 임의의 유전자를 의미하며, 자연에서 함께 발견되지 않는 조절 및/또는 코딩 서열을 포함한다. 따라서, 키메라 유전자는 다른 공급원(source)으로부터 유래되는 조절 서열 및 코딩 서열을 포함하거나, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되지만 자연에서 발견되는 것과 다른 방식으로 배열된 조절 서열 및 코딩 서열을 포함할 수 있다. 키메라 유전자는 다른 공급원으로부터 유래되는 코딩 서열 및/또는 다른 공급원으로부터 유래되는 조절 서열을 포함할 수 있다. "내인성 유전자"는 생명체의 게놈 내의 자연적 위치에 존재하는 자연형 유전자를 의미한다. "외래" 유전자 또는 "이형(heterologous)" 유전자는 정상적으로 숙주 생명체 내에서는 발견되지 않으며, 유전자 전달에 의해 상기 숙주 생명체 내로 도입되는 유전자를 의미한다. 외래 유전자는 비-자연 생명체, 또는 키메라 유전자 내로 삽입된 자연형 유전자를 포함할 수 있다. "이식유전자"는 형질전환 절차에 의해 게놈 내로 도입된 유전자이다.
"이형" DNA는 정상적으로 세포, 또는 상기 세포의 염색체 부위 내에 위치하지 않는 DNA를 의미한다. 바람직하게는, 상기 이형 DNA는 상기 세포에 대해 외래인 유전자를 포함한다.
"게놈"이란 용어는 염색체뿐만 아니라 미토콘드리아, 엽록체 및 바이러스 DNA 또는 RNA를 포함한다.
핵산 분자는, 단일가닥 형태의 핵산 분자가 적당한 온도 및 용액 이온 강도 조건 하에서 다른 핵산 분자와 어닐링(annealing)할 수 있을 때, cDNA, 게놈 DNA 또는 RNA와 같은 다른 핵산 분자와 "교잡가능하다"(Sambrook 등, 1989, 아래 참조). 교잡 및 세척 조건은 잘 공지되어 있으며, 샘브룩 등의 책(Sambrook, J., Fritsch, E.F. 및 Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989)), 특히 제11장 및 그 안의 표 11.1에 예시되어 있다(그 전체가 본 명세서에 참조로 포함됨). 온도 및 이온 강도 조건은 상기 교잡의 스트린전시(stringency)를 결정한다.
스트린전시 조건은 연관성이 먼 생명체 유래의 동족 서열과 같은 적당히 유사한 절편, 또는 매우 연관된 생명체 유래의 기능성 효소를 복제하는 유전자와 같은 매우 유사한 절편을 스크리닝하기 위해 조정될 수 있다. 동족 핵산의 예비 스크리닝을 위하여, 55℃의 Tm에 상당하는 낮은 스트린전시 교잡 조건, 예를 들면 5x SSC, 0.1% SDS, 0.25% 밀크, 및 포름아미드(formamide) 부재; 또는 30% 포름아미드, 5x SSC, 0.5% SDS가 사용될 수 있다. 적당한 스트린전시 교잡 조건은 더 높은 Tm, 예를 들면 40% 포름아미드, 5x 또는 6x SCC에 대응한다. 높은 스트린전시 교잡 조건은 더 높은 Tm, 예를 들면 50% 포름아미드, 5x 또는 6x SCC에 대응한다.
교잡은, 비록 교잡의 스트린전시에 따라 염기간의 미스매치(mismatch)가 허용될 수도 있지만, 상기 두 가지 핵산이 상보적인 서열을 포함하는 것이 요구된다. "상보적"이란 용어는 서로 교잡할 수 있는 뉴클레오티드 염기 사이의 관계를 설명하기 위해 사용된다. 예를 들면, DNA에 있어서, 아데노신은 티민과 상보적이며, 시토신은 구아닌과 상보적이다. 따라서, 본 발명은 또한 본 명세서에서 개시되거나 또는 사용된 완전한 서열에 상보적인 단리된 핵산 절편뿐만 아니라, 실질적으로 유사한 핵산 서열도 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 55℃ Tm에서의 교잡 단계를 포함하는 교잡 조건을 도입하고, 상술한 조건을 이용함으로써 검출된다. 바람직한 구현예에서, 상기 Tm은 60℃이다; 보다 바람직한 구현예에서, 상기 Tm은 63℃이다; 더욱 더 바람직한 구현예에서, 상기 Tm은 65℃이다.
또한, 교잡후 세척이 스트린전시 조건을 결정한다. 한 세트(set)의 바람직한 조건은 6X SSC, 0.5% SDS로 시작하여 실온에서 15분간으로부터 세척하고, 이후 2X SSC, 0.5% SDS로 45℃에서 30분간 반복한 후, 다시 0.2X SSC, 0.5% SDS로 50℃에서 30분간 2회 세척하는 일련의 세척을 이용한다. 보다 바람직한 세트의 스트린전시 조건은 더 높은 온도를 이용하는데, 이때 0.2X SSC, 0.5% SDS에서 수행하는 최종 2회의 30분간 세척 온도가 60℃로 증가하는 것을 제외하고는 상기와 동일한 세척을 수행한다. 다른 바람직한 세트의 높은 스트린전시 조건은 0.1X SSC, 0.1% SDS를 이용하여 65℃에서 최종 2회 세척을 이용한다. 교잡은, 비록 교잡의 스트린전시에 따라 염기간의 미스매치가 허용될 수도 있지만, 상기 두 가지 핵산이 상보적인 서열을 포함하는 것이 요구된다.
핵산 혼성화를 위한 적절한 스트린전시는 핵산의 길이 및 상보성의 정도에 의존하며, 다양한 방법들이 해당 분야에 알려져 있다. 2개의 뉴클레오티드 서열간의 유사성 또는 동질성의 정도가 커짐에 따라, 이러한 서열을 갖는 핵산의 혼성화를 위한 Tm의 값도 커진다. 핵산 혼성화의 상대적 안정성(더 높은 Tm에 대응됨)은 다음 순서대로 감소한다: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. 100개 이상의 길이를 갖는 뉴클레오티드를 혼성화시키기 위해, Tm을 계산하기 위한 계산식이 도출되었다(Sambrook 등, supra, 9.50-0.51 참조). 더 짧은 핵산, 즉 올리고뉴클레오티드와 혼성화시키기 위해, 미스매치의 위치가 더욱 중요해지며, 올리고뉴클레오티드의 길이는 그의 특이성을 결정한다(Sambrook 등, supra, 11.7-11.8 참조).
본 발명의 특정한 구현예에서, 폴리뉴클레오티드는 500 mM 이하의 염 조건과 적어도 37℃ 온도에서의 혼성화 단계 및 적어도 63℃의 2XSSPE에서의 세척 단계를 포함하는 혼성화 조건을 사용함으로써 검출된다. 바람직한 구현예에서, 상기 혼성화 조건은 혼성화 단계를 위해 200 mM 이하의 염 조건 및 적어도 37℃의 온도를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 혼성화 조건은 혼성화 단계 및 세척 단계 모두를 위해 2XSSPE 및 63℃의 온도를 포함한다.
한 구현예에서, 혼성화가능한 핵산의 길이는 적어도 약 10개 뉴클레오티드이다. 바람직하게는, 혼성화가능한 핵산의 적어도 길이는 적어도 약 15개 뉴클레오티드이고; 보다 바람직하게는 적어도 약 20개 뉴클레오티드이며; 가장 바람직하게는 적어도 30 뉴클레오티드이다. 아울러, 당업자는 프로브(probe)의 길이와 같은 인자에 따라 필요한 정도로 조절될 수 있는 온도 및 세척 용액 염 농도를 인식할 수 있을 것이다.
"프로브"란 용어는 상보적인 단일 가닥 표적 핵산과 염기쌍을 이루어 이중가닥 분자를 형성할 수 있는 단일-가닥 핵산 분자를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 "올리고뉴클레오티드"란 용어는 일반적으로 적어도 18개의 뉴클레오티드로 이루어지고, 게놈 DNA 분자, cDNA 분자, 플라스미드 DNA 또는 mRNA 분자와 혼성화가능한 핵산을 의미한다. 올리고뉴클레오티드는 예를 들어 32P-뉴클레오티드 또는 바이오틴(biotin)과 같은 표지자가 공유결합되어 있는 뉴클레오티드로 표지될 수 있다. 표지된 올리고뉴클레오티드는 프로브로 사용되어 핵산의 존재를 검출할 수 있다. 올리고뉴클레오티드(이의 하나 또는 모두는 표지될 수 있음)는 PCR 프라이머로서 사용되어, 핵산의 전체 길이 또는 단편을 클로닝하거나 핵산의 존재를 검출할 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드는 DNA 분자와 삼중나선을 형성하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 합성으로 제조될 수 있으며, 바람직하게는 핵산 합성기 상에서 제조될 수 있다. 따라서, 올리고뉴클레오티드는 티오에스테르 결합 등과 같은 비-자연적으로 생성되는 포스포에스테르 상동성 결합으로 제조될 수 있다.
"프라이머"는 표적 핵산 서열과 혼성화하여, 적당한 조건하에서 DNA 합성의 개시 포인트로 제공될 수 있는 이중 가닥 핵산 부위를 형성할 수 있다. 이러한 프라이머들은 폴리머라제 연쇄 반응(polymerase chain reaction)에 사용될 수 있다.
"폴리머라제 연쇄 반응"은 약자로 PCR이며, 특정한 핵산 서열을 효소적으로 증폭하는 시험관내 방법을 의미한다. PCR은 다음의 3가지 단계를 포함하는 온도 순환(cycle)의 반복적 연속을 포함한다: 표적 분자의 가닥을 분리하는 주형 핵산의 열변성 단계, 단일 가닥 PCR 올리고뉴클레오티드 프라이머를 주형 핵산에 어닐링시키는 단계, DNA 폴리머라제에 의한 어닐링된 프라이머의 길이 연장 단계. PCR은 정량적 또는 반-정량적 조건하에서, 표적 분자의 존재를 검출하여 핵산의 스타팅 풀(starting pool) 내에서 표적 분자의 상대적 양을 결정하는 수단을 제공한다.
"역전사(reverse transcription)-폴리머라제 연쇄 반응"은 약자로 RT-PCR이며, RNA 분자 또는 분자들로부터 표적 cDNA 분자 또는 분자들을 효소적으로 제조한 뒤, 상술한 바와 같은 표적 cDNA 분자 또는 분자들 내에서 특정 핵산 서열 또는 서열들을 효소적으로 증폭하는 시험관내 방법을 의미한다. 또한, RT-PCR은 정량적 또는 반-정량적 조건하에서 표적 분자의 존재를 검출하여 핵산의 스타팅 풀 내에서 표적 분자의 상대적 양을 결정하는 수단을 제공한다.
DNA "코딩 서열"은 적당한 조절 서열의 조절하에 위치할 때 시험관내 또는 생체내에서 세포 내의 폴리펩티드로 번역되고 전사되는 이중-가닥 DNA 서열이다. "적당한 조절 서열"은 코딩 서열의 상류(5' 비-코딩 서열), 또는 하류(3' 비-코딩 서열)에 위치한 뉴클레오티드 서열을 가리키며, 전사, RNA 가공(processing) 또는 안정성, 또는 관련된 코딩 서열의 번역에 영향을 미친다. 조절 서열은 프로모터, 번역 리더 서열(translation leader sequence), 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 가공 위치, 효과자(effector) 결합 위치 및 스템-루프(stem-loop) 구조를 포함할 수 있다. 코딩 서열의 경계는 5'(아미노) 말단에 있는 개시 코돈 및 3'(카르복시) 말단에 있는 번역 중지 코돈에 의해 결정될 수 있다. 코딩 서열은 원핵생물 서열, mRNA로부터의 cDNA, 게놈 DNA 서열 및 모든 합성 DNA 서열을 포함할 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 코딩 서열이 진핵생물 세포 내에서 발현되기 위해서는, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종료 서열이 코딩 서열에 대해 3'에 위치해야 한다.
"개방 판독 프레임(open reading frame)"은 약자로 ORF이며, 번역 시작 신호 또는 ATG 또는 AUG와 같은 개시 코돈, 및 종료 코돈을 포함하는 DNA, cDNA 또는 RNA인 핵산 서열의 길이를 의미하며, 잠재적으로는 폴리펩티드 서열로 번역될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "헤드-투-헤드(head-to-head)"란 용어는 서로 관련이 있는 두개의 폴리뉴클레오티드 서열의 방향을 묘사한다. 한 폴리뉴클레오티드 코딩 가닥의 5' 말단이 다른 폴리뉴클레오티드 코딩 가닥의 5' 말단에 접할 때, 두 개의 폴리뉴클레오티드는 헤드-투-헤드 방향으로 위치되며, 이로 인해 각 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 다른 폴리뉴클레오티드의 5' 말단으로부터 진행된다. "헤드-투-헤드"란 용어는 약자로 (5')-to-(5')가 될 수 있으며, 기호 (←→) 또는 (3'←5' 5'→3')로 표시될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "테일-투-테일(tail-to-tail)"이란 용어는 서로 관련이 있는 두 개의 폴리뉴클레오티드 서열의 방향을 묘사한다. 한 폴리뉴클레오티드 코딩 가닥의 3' 말단이 다른 폴리뉴클레오티드 코딩 가닥의 3' 말단에 접할 때, 두 개의 폴리뉴클레오티드는 테일-투-테일 방향으로 위치되며, 이로 인해 각 폴리뉴클레오티드의 전사 방향이 다른 폴리뉴클레오티드 쪽으로 진행된다. "테일-투-테일"이란 용어는 약자로 (3')-to-(3')가 될 수 있으며, 기호 (→←) 또는 (5'→3'3'←5')로 표시될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "헤드-투-테일"이란 용어는 서로 관련이 있는 두 개의 폴리뉴클레오티드 서열의 방향을 묘사한다. 한 폴리뉴클레오티드 코딩 가닥의 5' 말단이 다른 폴리뉴클레오티드 코딩 가닥의 3' 말단에 접할 때, 두 개의 폴리뉴클레오티드는 헤드-투-테일 방향으로 위치되며, 이로 인해 각 폴리뉴클레오티드의 전사 방향은 다른 폴리뉴클레오티드의 방향과 동일한 방향으로 진행된다. "헤드-투-테일"이란 용어는 약자로 (5')-to-(3')가 될 수 있으며, 기호 (→→) 또는 (5'→3'5'→3')로 표시될 수 있다.
"하류(downstream)"란 용어는 참고 뉴클레오티드 서열에 대해 3'에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 특히, 하류 뉴클레오티드 서열은 전사의 시작점 이후의 서열과 관련이 있다. 예를 들어, 유전자의 번역 개시 코돈(codon)은 전사 시작 위치의 하류에 위치한다.
"상류(upstream)"란 용어는 참고 뉴클레오티드 서열에 대해 5'에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 특히, 상류 뉴클레오티드 서열은 코딩 서열의 5' 부위 또는 전사의 시작점 상에 위치하는 서열과 관련이 있다. 예를 들어, 대부분의 프로모터는 전사 시작 위치의 상류에 위치한다.
"제한 엔도뉴클레아제(endonuclease)" 및 "제한효소"는 이중 가닥 DNA 내의 특정한 뉴클레오티드 서열에 결합하여 절단하는 효소를 의미한다.
"동질성 재조합(homologous recombination)"은 외래 DNA 서열의 다른 DNA 분자로의 삽입, 예컨대 염색체 내의 벡터 삽입을 의미한다. 바람직하게는, 벡터는 동질성 재조합을 위해 특정 염색체 위치를 표적으로 한다. 특정 동질성 재조합을 위해, 벡터는 상보적 결합과 염색체 내로의 벡터의 삽입을 가능하게 하기 위한 염색체의 서열에 대해 동질성을 갖는 충분히 긴 영역을 포함할 것이다. 동질성 부위가 길어질수록, 서열 유사성의 정도가 커져 동질성 재조합의 효율을 증가시킬 것이다.
해당 분야에 공지된 몇 가지 방법이 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 증폭시키는데 사용될 수 있다. 일단 적당한 숙주 시스템 및 성장 조건이 확립되면, 재조합 발현 벡터가 증폭되어 다량으로 제조될 수 있다. 본 명세서에서 개시된 바와 같이, 발현 벡터는 하기 벡터 또는 이의 변형체를 포함하여 사용될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다: 백신 바이러스 또는 아데노바이러스와 같은 인간 또는 동물 바이러스; 배큘로바이러스(baculovirus)와 같은 곤충 바이러스; 효모 벡터; 박테리오파지(bacteriophage) 벡터(예를 들면, 람다), 및 플라스미드 및 코스미드(cosmid) DNA 벡터.
"벡터"는 핵산을 숙주 세포로 클로닝 및/또는 전달하는 모든 수단이다. 벡터는 다른 DNA 조각이 부착되어 부착된 조각의 복제를 유발할 수 있는 복제단위(replicon)가 될 수 있다. "복제단위"는 생체 내에서 DNA 복제의 자동적 단위로 작용하는, 즉 그 자신의 조절하에 복제할 수 있는 모든 유전자 요소(예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)이다. "벡터"라는 용어는 시험관내, 생체 밖 또는 생체 내에서 핵산을 세포로 도입시키기 위한 바이러스 및 비-바이러스 수단을 포함한다. 해당 분야에 공지된 수 많은 벡터가 핵산을 조작하고 반응 요소 및 프로모터를 유전자에 결합시키는 등에 사용될 수 있다. 예를 들면, 가능한 벡터는 플라스미드 또는 변형된 바이러스, 예를 들면 람다 변형체와 같은 박테리오 파지, 또는 pBR322와 같은 플라스미드 또는 pUC 플라스미드 변형체, 또는 블루스크립트(Bluescript) 벡터를 포함한다. 예를 들면, 반응 요소에 대응하는 DNA 단편의 삽입 및 적당한 벡터로의 프로모터의 삽입은, 상보적 점착성(cohesive) 말단을 갖는 선택된 벡터로 적당한 DNA 단편을 접합(ligation)시킴으로써 수행될 수 있다. 선택적으로, DNA 분자의 말단은 효소적으로 변형될 수 있거나, 특정 부위는 뉴클레오티드 서열(링커)을 DNA 말단에 접합시킴으로써 생성될 수 있다. 이러한 벡터는 세포 게놈에 마커를 결합시킨 세포를 선별하기 위해 제공되는 선별가능 마커 유전자를 포함하도록 조작될 수 있다. 이러한 마커는 마커에 의해 코딩된 단백질을 발현하고 이에 결합하는 숙주 세포를 확인 및/또는 선별 가능하게 한다.
바이러스 벡터, 구체적으로 레트로바이러스 벡터는 세포 뿐만 아니라 살아있는 동물 피검자에 광범위한 유전자 전달을 적용하는데 사용되었다. 바이러스 벡터는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 레트로바이러스, 아데노-연관 바이러스, 폭스(pox), 배큘로바이러스, 백신, 헤르페스 심플렉스, 엡스타인-바(Epstein-Barr), 아데노바이러스, 제미니바이러스(geminivirus) 및 콜리모바이러스(caulimovirus) 벡터를 포함한다. 비-바이러스 벡터는 플라스미드, 리포좀, 전기적 저항의 리피드(사이토펙신), DNA-단백질 복합체 및 바이오폴리머를 포함한다. 또한, 핵산에 덧붙여, 벡터는 하나 이상의 조절 부위 및/또는 핵산 전달 결과(조직으로의 전달, 발현의 기간, 등)를 선별, 측정 및 모니터링하는데 유용한 선별가능 마커를 포함할 수 있다.
"플라스미드"란 용어는 세포의 중심 대사 부분이 아닌 유전자를 종종 이동시키고 환형의 이중-가닥 DNA 분자 형태를 갖는 추가 염색체 요소를 의미한다. 이런 요소는 모든 원천으로부터 유발된, 자동 복제 서열, 게놈 삽입 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열, 선형, 환형 또는 수퍼코일의 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA이며, 수 개의 뉴클레오티드 서열은 적당한 3' 비번역된 서열과 함께 선별된 유전자 생산물을 위한 프로모터 단편 및 DNA 서열을 세포에 도입 가능한 특정 구조에 재조합되거나 결합된다.
"클로닝 벡터"는 핵산, 바람직하게는 연속적으로 복제하는 DNA의 단위 길이인 "복제단위"이며, 다른 핵산 조각이 결합할 수 있는 플라스미드, 파지 또는 코스미드와 같은 복제 원점을 포함하여, 부착된 조각의 복제를 유발한다. 클로닝 벡터는 한가지 세포 타입에서 복제가능하고 다른 ("셔틀 벡터")에서 발현가능할 수 있다.
벡터는 해당 분야에 공지된 방법, 예를 들어, 전달감염(transfection), 전기천공법(electroporation), 미세주입, 형질도입, 세포 융합, DEAE 덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전, 리포펙션(라이소자임 융합), 유전자 총의 사용 또는 DNA 벡터 전달기(예를 들면, Wu 등, 1992, J. Biol. Chem. 267:963-967; Wu 및 Wu, 1988, J. Biol. Chem. 263: 14621-14624; 및 Hartmut 등, 1990년 3월 15일에 출원된 캐나다 특허 출원 2,012,311 참조)에 의해 원하는 숙주 세포에 전달될 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 리포펙션에 의해 생체 내로 전달될 수 있다. 과거에는, 시험관 내에서 핵산을 캡슐화하고 전달감염시키기 위해 리포좀의 사용이 증가하였다. 리포좀-매개성 전달감염에 의한 어려움과 위험을 제한하기 위해 디자인된 합성 양이온성 지질은 마커를 코딩하는 유전자를 생체 내로 전달감염시키기 위한 리포좀을 제조하는데 사용될 수 있다(Felgner 등, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:7413; Mackey, 등, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:8027-8031; 및 Ulmer 등, 1993, Science 259:1745-1748). 양이온성 지질의 사용은 음전하 핵산의 캡슐화를 촉진시킬 수 있으며, 양전하 세포막과의 융합을 촉진시킬 수 있다(Felgner 및 Ringold, 1989, Science 337:387-388). 특히 유용한 지질 화합물 및 핵산 전달용 조성물은 국제특허공보 WO95/18863, WO96/17823 및 미국특허 5,459,127에 개시되어 있다. 생체내 특정 기관으로 외래 유전자를 전달하기 위해 리포펙션을 사용하는 것은 특별한 이점이 있다. 특정 세포로의 리포좀의 분자 표적은 이로운 한 구역을 나타낸다. 특정 세포 타입으로의 직접 전달감염이 췌장, 간, 신장 및 뇌와 같은 세포 이형성을 갖는 조직내에서 특히 바람직하다는 사실은 명백하다. 지질은 표적 목적용 다른 분자에 화학적으로 결합될 수 있다(Mackey, 등, 1988, supra). 표적 펩티드, 예를 들어 호르몬 또는 신경전달물질, 항체와 같은 단백질, 또는 비-펩티드 분자는 화학적으로 리포좀에 결합될 수 있다.
또한, 다른 분자들은 생체 내에서 양이온성 올리고펩티드(예를 들면, WO 95/21931), DNA 결합 단백질로부터 유도된 펩티드(예를 들면, WO 96/25508), 또는 양이온성 폴리머(예를 들면, WO 95/21931)의 전달감염을 촉진시키는데 유용하다.
또한, 생체내에서 네이키드(naked) DNA 플라스미드와 같은 벡터를 도입하는 것도 가능하다(예를 들면, 미국 특허 5,693,622, 5,589,466 및 5,580,859). 또한, 수용체-매개성 DNA 전달 접근법이 사용될 수 있다(Curiel 등, 1992, Hum. Gene Ther. 3:147-154; 및 Wu 및 Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432).
"전달감염"이란 용어는 세포에 의한 외래 또는 이형 RNA 또는 DNA의 흡수(uptake)를 의미한다. 외래 또는 이형 RNA 또는 DNA에 의해 세포가 "전달감염"되면, 이러한 RNA 또는 DNA는 세포 내로 도입된다. 외래 또는 이형 RNA 또는 DNA에 의해 세포가 "형질전환"되면, 전달감염된 RNA 또는 DNA는 형태학적 변화를 유발한다. 형질전환 RNA 또는 DNA는 세포의 게놈을 구성하는 염색체 DNA로 (공유결합으로 연결되어) 삽입될 수 있다.
"형질전환"은 숙주 생물체의 게놈으로 핵산 단편을 전달하여 유전적으로 안정한 유전을 유발하는 것을 지칭한다. 형질전환된 핵산 단편을 포함하는 숙주 생물체는 "유전자이식된" 또는 "재조합" 또는 "형질전환된" 생물체로 지칭된다.
"유전자 영역"이란 용어는 핵산 분자 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 뉴클레오티드 서열의 부분을 의미한다.
아울러, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 그 증폭 또는 발현이 요청되는 숙주 세포 내의 복제를 위한 하나 이상의 기원(origin), 마커 또는 선별가능 마커를 포함할 수 있다.
"선별가능 마커"란 용어는 확인 인자를 의미하고, 일반적으로는 항생제 또는 화학적 저항 유전자이며, 마커 유전자의 기능, 즉 항생제에 대한 내성, 제초제에 대한 내성, 비색계 마커, 효소, 형광 마커 등에 따라 선별될 수 있으며, 이러한 기능은 관심있는 유전자의 유전을 추적 및/또는 관심있는 핵산을 유전시키는 세포 또는 생물체를 확인하는데 사용된다. 해당 분야에서 공지 및 사용되는 선별가능 마커 유전자는 암피실린(ampicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 젠타마이신(gentamycin), 카나마이신(kanamycin), 하이그로마이신(hygromycin), 비아라포스(bialaphos) 제초제, 술폰아미드(sulfonamide) 등에 대해 내성을 제공하는 유전자들; 및 안토시아닌(anthocyanin) 조절 유전자, 이소펜타닐 트랜스퍼라제(isopentanyl transferase) 유전자 등과 같은 표현형 마커로서 사용되는 유전자를 포함한다.
"리포터 유전자"란 용어는 리포터 유전자의 기능에 따라 확인할 수 있는 확인 인자를 코딩하는 핵산을 의미하고, 이때 상기 기능은 관심있는 핵산의 유전을 추적하고, 관심있는 핵산을 유전시키는 세포 또는 생물체를 확인하고, 및/또는 유도된 유전자 발현 또는 전사를 측정하는데 사용된다. 해당 분야에서 공지 및 사용되는 리포터 유전자의 예로는 루시퍼라제(luciferase, Luc), 녹색 형광 단백질(green fluorescence protein, GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(CAT), β-갈락토시다제(LacZ), β-글루쿠로니다제(Gus) 등을 포함한다. 선별가능 마커 유전자는 리포터 유전자로 간주될 수도 있다.
"프로모터"는 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 조절할 수 있는 DNA 서열을 의미한다. 일반적으로 코딩 서열은 프로모터 서열에 대해 3'에 위치한다. 프로모터는 원래 유전자로부터 그 전체가 전체적으로 유도되거나, 자연에서 발견되는 다른 프로모터로부터 유도된 다른 요소로 구성되거나, 또는 합성 DNA 조각을 포함할 수 있다. 다른 프로모터가 다른 조직 또는 세포 타입, 또는 다른 진화 단계, 또는 다른 환경적 또는 생리적 조건에 반응하는 유전자의 발현을 지시할 수 있다는 사실은 당업자에게 있어서 자명하다. 대부분의 시간에 대부분의 세포 타입에서 유전자의 발현을 유발하는 프로모터는 통상적으로 "구성분 프로모터"로 일컬어진다. 특정 세포타입에서 유전자의 발현을 유발하는 프로모터는 통상적으로 "세포-특이적 프로모터" 또는 "조직-특이적 프로모터"로 일컬어진다. 특정 진화 단계 또는 세포 분화 단계에서 유전자의 발현을 유발하는 프로모터는 통상적으로 "진화적으로-특이적 프로모터" 또는 "세포 분화-특이적 프로모터"로 일컬어진다. 프로모터를 유발하는 제제, 생물학적 분자, 화학물질, 리간드, 빛 등으로 세포에 노출시키거나 처리한 뒤에 유전자의 발현을 유도하고 유발하는 프로모터는 통상적으로 "유도성 프로모터" 또는 "조절가능 프로모터"라고 일컬어진다. 대부분의 경우 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정해지지 않았기 때문에, 다른 길이의 DNA 단편은 상동적인 프로모터 활성을 가질 것이라는 사실이 인식되고 있다.
"프로모터 서열"은 세포 내에서 RNA 폴리머라제와 결합하고 하류(3' 방향) 코딩 서열의 전사를 개시할 수 있는 DNA 조절 부위이다. 본 발명을 확인하기 위한 수단으로서, 프로모터 서열은 전사 개시 위치에 의해 그 3' 말단을 경계로 하여, 검출가능한 상기 배경 레벨로 전사를 개시하는데 필요한 최소 개수의 염기 또는 요소를 포함하도록 상류(5' 방향)까지 확장된다. 프로모터 서열 내에는 전사 개시 위치(간편하게는 예를 들어 뉴클레아제 S1과 매핑함으로써 확인됨) 뿐만 아니라 RNA 폴리머라제의 결합에 필수적인 단백질 결합 도메인(보존적 서열)이 발견될 것이다.
RNA 폴리머라제가 코딩 서열을 mRNA로 전사시킬 때, 코딩 서열은 세포 내에 있는 전사 및 번역 조절 서열의 "조절하에" 트랜스-RNA 스플라이싱(splicing)되고(만약 코딩 서열이 인트론을 포함한다면), 코딩 서열에 의해 코딩된 단백질로 번역된다.
"전사 및 번역 조절 서열"은 숙주 세포 내에 있는 코딩 서열의 발현을 제공하는 프로모터, 인핸서(enhancer), 터미네이터(terminator) 등과 같은 DNA 조절 서열이다. 진핵생물 세포에서, 폴리아데닐화 서열은 조절 서열이다.
"반응 요소"라는 용어는 첫번째 키메라 유전자의 DNA-결합 도메인과 상호작용함으로써 유도되는 프로모터 상에 반응성을 제공하는 하나 이상의 시스(cis)-작용성 DNA 요소를 의미한다. 상기 DNA 요소는 그 서열 내에서 앞뒤역순상동서열(palindromic, 완전 또는 불완전)이 되거나 수 많은 뉴클레오티드에 의해 분리되는 서열 모티프(motif) 또는 절반 위치(half site)로 구성될 수 있다. 상기 절반 위치는 유사하거나 동일할 수 있으며, 정방향 또는 역방향으로 반복되거나, 또는 단일한 절반 위치 또는 일렬로 인접한 절반 위치의 멀티머(multimer)로 정열될 수 있다. 반응 요소는 반응 요소가 삽입되는 세포 또는 생물체의 특징에 따라 다른 생물체로부터 분리된 최소 프로모터를 포함할 수 있다. 첫 번째 교잡 단백질의 DNA 결합 도메인은 리간드의 존재 또는 부재하에 반응 요소의 DNA 서열에 결합하며, 상기 반응 요소의 조절하에 하류 유전자(들)의 전사를 개시하거나 억제한다. 자연형 엑디손 수용체의 반응 요소에 대한 DNA 서열의 예는 하기를 포함한다: RRGG/TTCANTGAC/ACYY(Cherbas L., 등, (1991), Genes Dev. 5, 120-131 참조); AGGTCAN(n)AGGTCA, 이때 N(n)은 하나 이상의 스페이서(spacer) 뉴클레오티드가 될 수 있음(D'Avino PP., 등, (1995), Mol. Cell. Endocrinol, 113, 1-9 참조); 및 GGGTTGAATGAATTT(Antoniewski C., 등, (1994), Mol. Cell. Biol. 14, 4465-4474 참조).
"기능적으로 연결된(operably linked)"이란 용어는 단일 핵산 단편 상에 핵산 서열이 결합하여 한가지 기능이 다른 것에 의해 영향을 받는 것을 의미한다. 예를 들어, 프로모터는 코딩 서열의 발현에 영향을 줄 수 있을 때(즉, 코딩 서열이 프로모터의 전사적 조절하에 있을 때) 코딩 서열과 기능적으로 연결된다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 방향으로 조절 서열에 기능적으로 연결될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "발현"이란 용어는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드로부터 유발된 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정한 축적을 의미한다. 또한, 발현은 mRNA의 단백질 또는 폴리펩티드로의 번역을 의미한다.
"카세트", "발현 카세트" 및 "유전자 발현 카세트"라는 용어는 특정 절단 위치에 있는 핵산 또는 폴리뉴클레오티드로 삽입될 수 있고, 동질성 재조합에 의해 삽입될 수 있는 DNA 조각을 의미한다. DNA 조각은 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 카세트 및 절단 위치는 전사 및 번역을 위한 적당한 판독 프레임 내 카세트를 삽입하기 용이하도록 디자인된다. "형질전환 카세트"는 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 폴리뉴클레오티드에 추가로 특정 숙주 세포의 형질전환을 유발하는 요소를 포함하는 특정 벡터를 의미한다. 또한, 본 발명의 카세트, 발현 카세트, 유전자 발현 카세트 및 형질전환 카세트는 숙주세포 내의 관심있는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 향상시키게 하는 요소를 포함할 수도 있다. 이러한 요소는, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 프로모터, 최소 프로모터, 인핸서, 반응 요소, 터미네이터 서열, 폴리아데닐화 서열 등을 포함한다.
본 발명의 목적을 위하여, "유전자 스위치"라는 용어는 프로모터와 연관된 반응 요소 및 EcR계 시스템의 조합을 의미하며, 이는 하나 이상의 리간드의 존재 하에 반응 요소 및 프로모터가 결합되는 유전자의 발현을 변화시킨다.
"조절(modulate)"이란 용어는 핵산 또는 유전자 발현을 유발, 감소 또는 억제시켜 각각의 단백질 또는 폴리펩티드 생산을 유발, 감소 또는 억제시키는 것을 의미한다.
본 발명에 따른 플라스미드 또는 벡터는 세포 내 유전자의 발현을 유발하기 위해 적당한 적어도 1개의 프로모터를 추가로 포함할 수 있다. "발현 벡터"라는 용어는 숙주로 형질전환된 후 삽입된 핵산 서열의 발현이 가능하도록 디자인된 벡터, 플라스미드 또는 운반체를 의미한다. 일반적으로, 클로닝된 유전자, 즉 삽입된 핵산 서열은 프로모터, 최소 프로모터, 인핸서 등과 같은 조절 요소의 조절 하에 위치한다. 바람직한 숙주 세포에 있는 핵산의 발현을 유발하는데 유용한 개시 조절 부위 또는 프로모터는 수없이 많으며 당업자에게 자명하다. 실질적으로, 이러한 유전자를 유발할 수 있는 모든 프로모터는 본 발명에 적합하며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 바이러스 프로모터, 세균 프로모터, 동물 프로모터, 포유동물 프로모터, 합성 프로모터, 구성 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 진화 특이적 프로모터, 유도성 프로모터, 빛 조절된 프로모터; CYC1 , HIS3 , GAL1 , GAL4 , GAL10 , ADH1 , PGK , PH05 , GAPDH , ADC1 , TRP1 , URA3 , LEU2, ENO , TPI, 알칼라인 포스파타제 프로모터(사카로마이세스의 발현에 유용); AOX1 프로모터(피키아의 발현에 유용); β-락타마제(lactamse), lac , ara , tet , trp , lPL , lPR , T7 , tac 및 trc 프로모터(대장균의 발현에 유용); 빛 조절된-, 종자 특이적-, 꽃가루 특이적-, 난소 특이적-, 발병기전 또는 질병 연관된-, 콜리플라워(cauliflower) 모자이크 바이러스 35S, CMV 35S 최소, 카사바 베인(cassava vein) 모자이크 바이러스(CsVMV), 클로로필 a/b 결합 단백질, 리불로스(ribulose) 1,5-비스포스페이트 카르복실라제, 슈트(shoot)-특이적, 뿌리 특이적, 키티나제(chitinase), 스트레스 유도성, 쌀 퉁그로 바실리폼 바이러스(rice tungro bacilliform virus), 식물 수퍼-프로모터, 감자 루이신 아미노펩티다제, 나이트레이트 리덕타제, 만노핀 신타제(mannopine synthase), 노팔린(nopaline) 신타제, 유비퀴틴(ubiquitin), 제인(zein) 단백질 및 안토시아닌 프로모터(식물 세포에서의 발현에 유용); 해당 분야에 공지된 동물 및 포유동물 프로모터, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 SV40 초기 (SV40e) 프로모터 부위, 루스 사코마 바이러스(RSV)의 3' 긴 말단 반복(LTR)에 포함된 프로모터, 아데노바이러스(Ad)의 E1A 또는 주요 후기 프로모터(MLP) 유전자의 프로모터, 사이토메갈로바이러스(CMV) 초기 프로모터, 헤르페스 심플렉스 바이러스 (HSV) 티미딘 키나제(TK) 프로모터, 배큘로바이러스 IE1 프로모터, 연장 인자 1 알파(EF1) 프로모터, 포스포글리세레이트 키나아제(PGK) 프로모터, 유비퀴틴(Ubc) 프로모터, 알부민 프로모터, 마우스 메탈로티오네인(metallothionein)-L 프로모터 및 전사 조절 부위의 조절 서열, 유비쿼터스 프로모터(HPRT, 비멘틴(vimentin), α-액틴, 튜불린 등), 중간 필라멘트 프로모터(데스민, 뉴로필라멘트, 케라틴, GFAP 등), (MDR, CFTR 또는 인자 VIII 타입 등의) 치료학적 유전자 프로모터, 발병기전(pathogenesis) 또는 질병 관련-프로모터 및 조직 특이적이고 형질전환 동물에 사용된 췌장 꽈리 세포에서 활성인 엘라스타제 I 유전자 조절 부위와 같은 프로모터를 포함; 췌장 베타 세포에서 활성인 인슐린 유전자 조절 부위, 림프 세포에서 활성인 면역글로불린 유전자 조절 부위, 고환, 유방, 림프 및 비만 세포에서 활성인 마우스 유방 종양 바이러스 조절 부위, 간에서 활성인 알파-피토단백질(fetoprotein) 유전자 조절 부위, 간에서 활성인 알파 1-안티트립신 유전자 조절 부위, 골수 세포에서 활성인 베타-글로빈(globin) 유전자 조절 부위, 뇌의 올리고덴드로사이트(oligodendrocyte) 세포에서 활성인 마이엘린(myeline) 염기성 단백질 유전자 조절 부위, 골격 근육에서 활성인 마이오신 경쇄-2 유전자 조절 부위 및 시상하부에서 활성인 고나도트로핀 분비 호르몬 유전자 조절 부위, 피루베이트 키나아제 프로모터, 빌린(villin) 프로모터, 지방산 결합 장관 단백질 프로모터, 민무늬근육 세포 α-액틴 프로모터 등을 포함한다. 아울러, 이러한 발현 서열은 인핸서 또는 조절 서열 등의 첨가에 의해 변형될 수 있다.
본 발명의 구현예에 사용될 수 있는 인핸서는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스(CMV) 인핸서, 연장 인자 I(EF1) 인핸서, 효모 인핸서, 바이러스 유전자 인핸서 등을 포함한다.
종료(termination) 조절 부위, 즉 터미네이터 또는 폴리아데닐화 서열은 바람직한 숙주에 대해 자연적인 다양한 유전자로부터 도출될 수 있다. 선택적으로, 종료 위치는 불필요할 수 있지만 포함되는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 종료 조절 부위는 합성 서열, 합성 폴리아데닐화 신호, SV40 후기 폴리아데닐화 신호, SV40 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬(BGH) 폴리아데닐화 신호, 바이러스 터미네이터 서열 등을 포함하거나 이로부터 도출될 수 있다.
"3' 비-코딩 서열" 또는 3' 비번역 부위(UTR)"라는 용어는 코딩 서열의 하류(3')에 위치한 DNA 서열을 의미하며, 폴리아데닐화[폴리(A)] 인식 서열 및 mRNA 가공 또는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 조절 신호를 코딩하는 다른 서열을 포함할 수 있다. 일반적으로 폴리아데닐화 신호는 mRNA 전구체의 3' 말단에서의 폴리아데닐산 트랙의 첨가에 영향을 미치는 것으로 특정된다.
"조절 부위"는 이차 핵산 서열의 발현을 조절하는 핵산 서열을 의미한다. 조절 부위는 특정 핵산(동질성 부위)을 발현하기 위해 자연적으로 필요한 서열을 포함할 수 있거나, 다른 단백질 또는 심지어 합성 단백질(이형 부위)을 발현하기 위해 필요한 다른 기원의 서열을 포함할 수 있다. 특히, 상기 서열은 원핵세포, 진핵세포 또는 바이러스 유전자의 서열이거나, 또는 특이적 또는 비-특이적 방법 및 유도성 또는 비-유도성 방법으로 유전자의 전사를 촉진하거나 억제하는 도출된 서열이 될 수 있다. 조절 부위는 복제 원점, RNA 스플라이싱 위치, 프로모터, 인핸서, 전사적 종말 서열 및 표적 세포의 분비 과정에 폴리펩티드를 지시하는 신호 서열을 포함한다.
"이형 공급원"으로부터의 조절 부위는 발현된 핵산과 자연적으로 연관되지 않는 조절 부위이다. 이형 조절 부위는 다른 종으로부터의 조절 부위, 다른 유전자로부터의 조절 부위, 교잡 조절 서열, 및 자연에서는 도출되지 않지만 당업자에 의해 디자인될 수 있는 조절 서열을 포함한다.
"RNA 전사체(transcript)"는 DNA 서열의 RNA 폴리머라제-촉매된 전사로부터의 결과 생산물을 의미한다. RNA 전사체가 DNA 서열의 완전한 상보적 복사물(copy) 일 때, 이는 일차 전사체로 일컬어지거나, 또는 일차 전사체의 후-전사적 가공으로부터 도출된 RNA 서열이 될 수 있고, 이는 성숙 RNA로 일컬어진다. "전령 RNA(messenger RNA, mRNA)"는 인트론이 없고 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA를 의미한다. "cDNA"는 mRNA와 상보적이고 이로부터 도출되는 이중-가닥 DNA를 의미한다. "센스" RNA는 mRNA를 포함하고 세포에 의해 단백질로 번역될 수 있는 RNA 전사체를 의미한다. "안티센스 RNA"는 표적 일차 전사체의 전부 또는 일부에 상보적이고 표적 유전자의 발현을 차단하는 RNA 전사체를 의미한다. 안티센스 RNA의 상보성은 특정 유전자 전사체, 즉 5' 비-코딩 서열, 3' 비-코딩 서열 또는 코딩 서열의 임의의 부분과 관계된다. "기능적 RNA"는 안티센스 RNA, 리보자임 RNA 또는 번역되지는 않지만 세포의 가공에 영향을 주는 다른 RNA를 의미한다.
"폴리펩티드"는 공유결합된 아미노산 잔기로 구성된 폴리머성 화합물이다. 아미노산은 다음의 일반식을 갖는다:
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아미노산은 측쇄 R에 기초하여 7개의 그룹으로 분류된다: (1) 지방족 측쇄, (2) 하이드록시(OH) 그룹을 포함하는 측쇄, (3) 황 원자를 포함하는 측쇄, (4) 산성 또는 아미드 그룹을 포함하는 측쇄, (5) 염기 그룹을 포함하는 측쇄, (6) 방향족 고리를 포함하는 측쇄, (7) 프롤린, 측쇄가 아미노 그룹에 결합된 이미노산. 본 발명의 폴리펩티드는 적어도 약 14개의 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다.
"단백질"은 살아있는 세포에서 구조적 또는 기능적 역할을 수행하는 폴리펩티드이다.
"단리된 폴리펩티드" 또는 "단리된 단백질"은 정상적으로 자연 상태에서 관련되어 있는 화합물이 실질적으로 없는 폴리펩티드 또는 단백질이다(예를 들면, 다른 단백질 또는 폴리펩티드, 핵산, 카보하이드레이트, 지질). "단리된"은 다른 화합물과의 인공적 또는 합성 혼합물, 또는 예를 들어 불완전한 정제, 안정제의 추가 또는 약제학적으로 허용가능한 제형으로 조제하기 때문에 존재할 수 있는 생물학적 활성에 영향을 주지 않는 불순물의 존재를 제외하는 것을 의미하지는 않는다.
"치환 돌연변이 폴리펩티드" 또는 "치환 돌연변이"는 (1) 야생형 또는 자연 발생 폴리펩티드와 비교하여 적어도 1개의 다른 아미노산을 가진 야생형 또는 자연 발생 아미노산의 치환을 포함하는 돌연변이 폴리펩티드를 의미하는 것으로 이해될 수 있을 것이다. 치환 돌연변이 폴리펩티드는 오직 1개의 (1) 야생형 또는 자연 발생 아미노산 치환을 포함할 수 있으며, "점 돌연변이" 또는 "단일 점 돌연변이" 폴리펩티드로 일컬어 질 수 있다. 선택적으로, 치환 돌연변이 폴리펩티드는 야생형 또는 자연 발생 폴리펩티드와 비교하여 둘 이상의 아미노산을 가진 2개 이상의 야생형 또는 자연 발생 아미노산의 치환을 포함할 수 있다. 본 발명에 따르면, 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드는 야생형 또는 자연 발생 그룹 H 핵 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드와 비교할 때 다른 아미노산을 가진 적어도 1개의 야생형 또는 자연 발생 아미노산의 치환을 포함한다.
치환 돌연변이 폴리펩티드는 2개 이상의 야생형 또는 자연 발생 아미노산의 치환을 포함하며, 상기 치환은 치환에 대해 결실된 등가 개수의 야생형 또는 자연 발생 아미노산-즉, 2개의 비-야생형 또는 비-자연 발생 아미노산과 교환된 2개의 야생형 또는 자연 발생 아미노산-, 또는 치환에 대해 결실된 비등가 개수의 야생형 아미노산-즉, 1개의 비-야생형 아미노산과 교환된 2개의 야생형 아미노산(치환+결실 돌연변이), 또는 3개의 비-야생형 아미노산과 교환된 2개의 야생형 아미노산(치환+삽입 돌연변이)-을 포함할 수 있다. 치환 돌연변이체는 참고 폴리펩티드 서열 내에서 교체된 아미노산 잔기 및 번호와 새롭게 치환된 아미노산 잔기를 표시하기 위해 약자 명명 시스템을 사용해 기술될 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 20번째(20th) 아미노산 잔기가 치환된 치환 돌연변이는 "x20z"로 약칭될 수 있으며, 여기서 "x"는 치환된 아미노산이고, "20"은 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기 위치 또는 번호이며, "z"는 새롭게 치환된 아미노산이다. 따라서, "E20A" 또는 "Glu20Ala"로 교환가능하게 약칭되는 치환 돌연변이체는 상기 돌연변이체가 폴리펩티드의 20번째 위치에 있는 글루탐산(해당 분야에서 통상적으로 "E" 또는 "Glu"로 약칭됨) 대신에 알라닌 잔기(해당 분야에서 통상적으로 "A" 또는 "Ala"로 약칭됨)를 포함하는 것을 나타낸다. 돌연변이 또는 돌연변이체는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 치환, 결실, 삽입 또는 이의 조합을 포함하는 모든 변화일 수 있다.
치환 돌연변이는 해당 분야에 공지된 모든 돌연변이유발 기술에 의해 수행될 수 있으며, 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만, 생체 내 위치-유도 돌연변이유발(site-directed mutagenesis, Hutchinson, C., 등, 1978, J. Biol. Chem. 253: 6551; Zoller 및 Smith, 1984, DNA 3: 479-488; Oliphant 등, 1986, Gene 44: 177; Hutchinson 등, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 710), TAB® 링커(Pharmacia)의 사용, 제한효소 절단/단편 결실 및 치환, PCR-매개된/올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이유발 등을 포함한다. PCR-기초의 기술은 위치-유도 돌연변이유발에 바람직하다(Higuchi, 1989, "Using PCR to Engineer DNA", in PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification, H. Erlich, ed., Stockton Press, Chapter 6, pp, 61-70 참조).
본 발명에 따른 "단편"은 참고 폴리펩티드보다 아미노산 서열이 짧으며, 참고 폴리펩티드, 동일 아미노산 서열을 가진 전체 부분을 포함하는 폴리펩티드를 의미하는 것으로 이해될 수 있다. 이러한 단편은, 적당하다면, 그의 부분이 되는 더 큰 폴리펩티드에 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드 단편은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 25, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 240 또는 300개 길이의 아미노산을 가질 수 있다.
폴리펩티드 또는 단백질의 "변이체"는 폴리펩티드 또는 단백질로부터 도출된 모든 상동체, 단편, 유도체, 또는 돌연변이체이며, 폴리펩티드 또는 단백질의 적어도 1개의 생물학적 특징을 보유한다. 폴리펩티드 또는 단백질의 다른 변이체는 자연계에 존재할 수 있다. 이들 변이체들은 단백질을 코딩하는 구조 유전자의 뉴클레오티드 서열의 차이에 의해 특정화되는 대립 변이(allelic variation)이거나, 또는 구별적(differential) 스플라이싱 또는 후-번역 변형을 포함할 수 있다. 능숙한 당업자라면 단일 또는 복수 개의 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 교환을 가진 변이체를 제조할 수 있다. 이러한 변이체는 그중에서도 특히 1) 하나 이상의 아미노산 잔기가 보존적(conservative) 또는 비-보존적 아미노산과 치환된 변이체, 2) 하나 이상의 아미노산이 폴리펩티드 또는 단백질에 첨가된 변이체, 3) 하나 이상의 아미노산이 치환 그룹을 포함하는 변이체, 및 4) 폴리펩티드 또는 단백질이 혈청 알부민과 같은 다른 폴리펩티드와 융합된 변이체를 포함한다. 유전자적(억제, 결실, 돌연변이 등), 화학적, 및 효소적 기술을 포함하는 이러한 변이체의 수득 기술은 해당 분야의 보통 기술을 가진 사람에게 잘 알려져 있다. 변이체 폴리펩티드는 적어도 약 14개의 아미노산을 포함하는 것이 바람직하다.
"이형 단백질"은 세포에서 자연적으로 생성되지 않은 단백질을 의미한다.
"성숙 단백질"은 후-번역적으로 가공된 폴리펩티드를 의미한다; 즉, 이 중 하나는 일차 번역 생산물에 존재하는 모든 프리펩티드 또는 프로펩티드가 제거되어 있다. "전구체" 단백질은 mRNA 번역의 일차 생성물을 의미한다; 즉, 프리(pre)펩티드 및 프로(pro)펩티드가 여전히 존재한다. 프리펩티드 및 프로펩티드는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 세포간 위치화 신호일 수 있다.
"신호 펩티드"란 용어는 분비된 성숙 단백질에 선행하는 아미노 말단 폴리펩티드를 의미한다. 신호 펩티드는 성숙 단백질로부터 절단되므로, 성숙 단백질에는 존재하지 않는다. 신호 펩티드는 세포막을 통과하는 분비된 단백질의 지시 및 전위(translocation) 기능을 갖는다. 또한, 신호 펩티드는 신호 단백질로 일컬어진다.
"신호 서열"은 세포 표면에 발현되는 단백질의 코딩 서열의 시작에 포함된다. 이 서열은 신호 펩티드, 성숙 폴리펩티드로의 N-말단을 코딩하여 숙주 세포가 폴리펩티드를 전위시키도록 지시한다. "전위 신호 서열"이란 용어는 본 명세서에서 신호 서열을 분리하는 것으로 일컬어진다. 전위 신호 서열은 진핵세포 및 원핵세포에 대해 자연적인 다양한 단백질과 연관되는 것으로 확인될 수 있으며, 상기 생물체 모두에서 기능을 한다.
"동질성"이란 용어는 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 2개의 폴리펩티드 모이어티(moiety) 간의 동일성 비율을 의미한다. 하나의 모이어티로부터 다른 모이어티로의 서열간 대응은 해당 분야에 공지된 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들어, 동질성은 서열 정보를 정렬하고 손쉽게 이용가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 2개의 폴리펩티드 분자간의 서열 정보를 직접 비교함으로써 결정될 수 있다. 선택적으로, 동질성은 동질성 부위 사이에 안정한 이중체를 형성하는 조건하에 폴리뉴클레오티드를 혼성화하고, 그후 단일-가닥-특이적 뉴클레아제(들)로 절단하고 절단된 단편의 크기를 확인함으로써 결정될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 문법적 형태 및 변형된 철자의 용어 "동족형(homologous)"은 수퍼패밀리(예를 들면, 면역글로불린 수퍼패밀리)로부터의 단백질을 포함하는 "공통 진화적 기원"을 갖는 단백질과 다른 종으로부터의 동족형 단백질(예를 들면, 마이오신 경쇄 등) 간의 관계를 의미한다(Reeck 등, 1987, Cell 50:667). 이러한 단백질(및 이의 코딩 유전자)은 높은 서열 유사 정도에 의해 영향을 받는 것처럼 서열 동질성을 갖는다. 그러나, 공통의 사용 및 일시적 적용에서, "높게"와 같은 단어가 결합될 때, 용어 "동족형(homologous)"은 서열 유사성을 일컫을 수 있으며, 공통의 진화적 기원은 아니다.
따라서, 모든 문법적 형태의 용어 "서열 유사성"은 공통의 진화적 기원을 공유하거나 공유하지 않는 핵산 또는 단백질의 아미노산 서열 간의 동일성 또는 상응성 정도를 의미한다(Reeck 등, 1987, Cell 50:667 참조).
바람직한 구현예에서, 2개의 DNA 서열은 적어도 약 50%(바람직하게는 적어도 약 75%, 보다 바람직하게는 적어도 약 "90 또는 95%)의 뉴클레오티드가 정해진 길이의 DNA 서열과 일치될 때, "실질적으로 동족형"이거나 또는 "실질적으로 유사하다". 실질적으로 동족형인 서열은 서열 데이터 은행에서 이용가능한 표준 소프트웨어를 이용하여 서열을 비교하거나, 또는 특정 시스템에 대해 정해진 바와 같은 엄격한 조건하에서의 서던 혼성화 실험을 수행함으로써 확인될 수 있다. 적절한 혼성화 조건을 정의하는 것은 해당 분야의 기술 범위이다. Sambrook 등, 1989, supra. 참조.
본 명세서에서 사용된, "실질적으로 유사한"은 하나 이상의 뉴클레오티드 염기의 변화가 하나 이상의 아미노산의 치환을 유발하지만, DNA 서열에 의해 코딩된 단백질의 기능적 특성에는 영향을 주지 않는 핵산 단편을 의미한다. 또한, "실질적으로 유사한"은 하나 이상의 뉴클레오티드 염기가 핵산 단편의 기능에 영향을 주지 않아 안티센스 또는 동시-억제 기술에 의한 유전자 발현의 변화를 유발하는 핵산 단편을 의미한다. 또한, "실질적으로 유사한"은 유발되는 전사체의 기능적 특징에 실질적으로 영향을 주지 않는 하나 이상의 뉴클레오티드 염기의 결실 또는 삽입과 같은 본 발명의 핵산 단편의 변형을 의미한다. 따라서, 본 발명은 특정한 예시적 서열 이상을 포함하는 것으로 이해된다. 제안된 각 변형은, 코딩된 생산물의 생물학적 활성 유지를 결정하는 것과 같이, 일상적인 기술을 갖는 당업자에게 잘 알려져 있다.
아울러, 당업자라면 본 발명에 의해 달성되는 실질적으로 유사한 서열이, 엄격한 조건(0.1X SSC, 0.1% SDS, 65℃, 그리고 2X SSC, 0.1% SDS로 세척한 뒤, 0.1X SSC, 0.1% SDS로 세척) 하에서, 본 명세서에 예시된 서열로 혼성화하기 위한 능력에 의해 결정된다는 사실을 인식할 수 있다. 본 발명의 실질적으로 유사한 핵산 단편은 그 DNA 서열이 본 명세서에 공지된 핵산 단편의 DNA 서열과 적어도 70% 동일하다. 바람직하게는, 본 발명의 실질적으로 유사한 핵산 단편은 그 DNA 서열이 본 명세서에 공지된 핵산 단편의 DNA 서열과 적어도 80% 동일하다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 실질적으로 유사한 핵산 단편은 그 DNA 서열이 본 명세서에 공지된 핵산 단편의 DNA 서열과 적어도 90% 동일하다. 보다 더 바람직하게는, 핵산 단편은 그 DNA 서열이 본 명세서에 공지된 핵산 단편의 DNA 서열과 적어도 95% 동일하다.
두개의 아미노산 서열은 40% 이상의 아미노산이 동일하거나 또는 60% 이상이 유사(기능적으로 동일한)할 때 "실질적으로 동족형" 이거나 또는 "실질적으로 유사하다". 바람직하게는, 유사하거나 동족형인 서열은 예를 들어 GCG(Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) 파일업 프로그램(pileup program)을 이용한 정렬에 의해 확인된다.
본 명세서에서 "~에 상응하는"이란 용어는 정확한 위치가 유사성 또는 동족형이 측정되는 분자와 동일하거나 다른 것을 의미한다. 핵산 또는 아미노산 서열의 정렬은 공간을 포함할 수도 있다. 따라서, 용어 "~에 상응하는"은 서열 유사성을 의미하는 것이지, 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드 염기의 수를 의미하는 것은 아니다.
아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 "실질적인 부분"은 당업자에 의한 매뉴얼 서열 평가 또는 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool;Altschul, S. F., 등, (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ 참조)와 같은 알고리즘을 이용한 컴퓨터-자동화된 서열 비교 및 확인을 사용하여 폴리펩티드 또는 유전자를 추정 확인하기 위하여, 펩티드의 아미노산 서열 또는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 충분한 양으로 포함한다. 일반적으로, 10개 이상의 연속된 아미노산 또는 30개 이상의 뉴클레오티드 서열은 공지된 단백질 또는 유전자에 대해 동족형인 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 추정 확인하기 위해 필요하다. 아울러, 뉴클레오티드 서열에 대해, 20-30개의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 유전자 특이적 뉴클레오티드 프로브는 서열-의존성 유전자 확인 방법(예를 들면, 서던 혼성화) 및 분리(예를 들면, 세균 콜로니(colony) 또는 박테리오파지 플라그(plaque)의 인 시투(in situ) 혼성화)에서 사용될 수 있다. 게다가, 12-15개 염기의 짧은 올리고뉴클레오티드는 프라이머를 포함하는 특정 핵산 단편을 얻기 위해 PCR에서 증폭 프라이머로서 사용될 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열의 "실질적 부분"은 서열을 포함하는 핵산 단편을 특이적으로 확인 및/또는 분리하기 위해 충분한 서열을 포함한다.
"퍼센트 동일성(percent identity)"이란 용어는 해당 분야에서 공지된 바와 같이, 서열 비교에 의해 결정되는 것처럼, 둘 이상의 폴리펩티드 서열 또는 둘 이상의 폴리뉴클레오티드 서열 사이의 관계이다. 해당 분야에서, "동일성"은 서열 스트링(string) 간의 매치에 의해 결정될 수 있는 경우와 같이, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열 간의 서열 상관성 정도를 의미한다. "동일성" 및 "유사성"은 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 하기 문헌에 개시된 공지된 방법에 의해 손쉽게 계산될 수 있다: Computational Molecular Biology(Lesk, A.M., ed.) Oxford University Press, New York (1988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D.W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., 및 Griffin, H.G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); 및 Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. 및 Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991). 동일성을 확인하는 바람직한 방법은 테스트된 서열 간을 가장 잘 매치시키기 위해 디자인된다. 동일성 및 유사성을 결정하는 방법은 통상적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 정리되어 있다. 서열 정렬 및 퍼센트 동일성 계산은 LASERGENE 바이오인포메틱스 컴퓨팅 수트(DNASTAR Inc., Madison, WI)의 Megalign 프로그램을 이용해 수행될 수 있다. 서열의 복합 정렬은 디폴트 파라미터(default parameter, GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10)를 이용한 클러스탈(Clustal) 정렬 방법(Higgins 및 Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153)을 사용하여 수행될 수 있다. 클러스탈 방법을 이용한 페어와이즈(pairwise) 정렬의 디폴트 파라미터는 선택될 수 있다: KTUPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 및 DIAGONALS SAVED=5.
"서열 분석 소프트웨어"란 용어는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 분석에 유용한 모든 컴퓨터 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 의미한다. "서열 분석 소프트웨어"는 상업적으로 이용가능하거나 자유롭게 개발될 수 있다. 전형적인 서열 분석 소프트웨어는 반드시 이에 한정되는 것은 아니지만 GCG 수트(suite) 프로그램(Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTN, BLASTX(Altschul 등, J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990), 및 DNASTAR(DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI53715 USA)를 포함한다. 본 발명의 문맥 내에서, 서열 분석 소프트웨어가 분석을 위해 사용되면, 분석의 결과는 달리 표시되지 않는 한 참고 프로그램의 "디폴트 값"에 기초할 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용된 "디폴트 값"은 처음 시작할 때 소프트웨어에 원래 로딩된 모든 값 또는 파라미터 세트를 의미할 것이다.
"합성 유전자"는 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 빌딩 블록으로부터 조립될 수 있다. 이러한 빌딩 블록은 접합 및 어닐링되어 유전자 조각을 형성하며, 그후 효소적으로 조립되어 전체 유전자를 구성한다. "화학적으로 합성된"은 DNA 서열과 관련되는 바와 같이, 생체 내에 조립된 구성 뉴클레오티드를 의미한다. 수동 DNA 화학적 합성은 잘 정립된 방법에 의해 달성될 수 있으며, 또는 자동화된 화학적 합성은 상업적으로 이용가능한 다수의 기계중 하나를 이용해 수행될 수 있다. 따라서, 유전자는 뉴클레오티드 서열의 최적화에 기초하여 최적의 유전자 발현용으로 재단되어 숙주 세포의 코돈 치우침(bias)에 영향을 줄 수 있다. 당업자라면, 코돈 사용이 숙주에 의해 편향된 이들 코돈쪽으로 치우치는 경우, 성공적인 유전자 발현의 가능성을 평가한다. 바람직한 코돈의 결정은 서열 정보가 이용가능한 숙주 세포로부터 도출된 유전자 조사에 기초할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, 둘 이상의 개별적으로 작동가능한 유전자 조절 시스템은, 1) 선택된 농도에서, 각각의 리간드에 의해 주어진 각 시스템의 조정이, 이 시스템의 유전자의 발현을 증폭하는데 있어서 측정가능할 정도의 변화를 유발하고, 2) 실제 조정의 동시성 또는 연속성과는 관계없이, 변화가, 세포, 조직 또는 생물체에서 동시에 작동가능한 모든 다른 시스템의 발현에서의 변화보다 통계학적으로 유의적인 차이를 나타낼 때 "오쏘고날"로 불린다. 바람직하게는, 각 개별적인 작동가능 유전자 조절 시스템의 조정은 세포, 조직 또는 생물체에 있는 모든 다른 작동가능 시스템보다 적어도 2배 이상의 유전자 발현 변화에 영향을 준다. 보다 바람직하게는, 이 변화는 적어도 5배 이상이다. 보다 더 바람직하게는, 이 변화는 적어도 10배 이상이다. 보다 더 바람직하게는, 이 변화는 적어도 100배 이상이다. 가장 바람직하게는, 이 변화는 적어도 500배 이상이다. 이상적으로는, 선택된 농도에서의 각 리간드에 의한 주어진 각 시스템의 조정은 그 시스템의 유전자 발현의 강도에 측정가능한 정도의 변화를 주며, 세포, 조직 또는 생물체에 있는 모든 다른 작동가능한 시스템의 발현에는 측정가능한 정도의 변화를 주지 않는다. 이러한 경우, 다중 유도성 유전자 조절 시스템은 "완전한 오쏘고날"로 불린다. 본 발명은 그 전체가 본 명세서에 참조로 포함되어 있는 동시-계류중인 미국 출원 09/965,697에 개시되어 있는 바와 같이 오쏘고날 리간드 및 오쏘고날 수용체-기초의 유전자 발현 시스템을 조사하기 위해 유용하다.
본 발명의 유전자 발현 조절 시스템
본 발명자들은 본 명세서에서 엑디손 수용체-기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템에서의 리간드의 민감성 및 유도 크기에 영향을 미치는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인에 대한 리간드의 결합에 관여하는 아미노산 잔기들을 동정하였다. 본 발명자들은 본 명세서에서 상기 결정적(critical) 잔기에서의 치환 돌연변이(이하, "치환 돌연변이체"라 함)를 포함하는 그룹 H 핵수용체의 구축을 개시하며, 상기 치환 돌연변이체 핵수용체가 유전자 발현의 조절 방법에서 유용하다는 점을 설명한다. 본 명세서에서 제공된 바와 같이, 본 발명자들의 신규한 치환 돌연변이체 핵수용체 및 핵수용체-기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템에서의 그의 용도는 리간드 민감성 및 트랜스활성의 크기가 적용 분야에 의존하여 원하는 대로 선택될 수 있는 원핵생물 및 진핵생물 숙주 세포 모두에서 개선된 유도가능한 유전자 발현 시스템을 제공한다.
따라서, 본 발명은 신규한 치환 돌연변이체 그룹 H 핵수용체 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드, 상기 돌연변이 그룹 H 핵수용체 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하는 핵수용체-기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템, 및 상기 핵수용체-기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템을 이용하여 숙주 세포 내에서 유전자의 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에서 발현될 수 있는 하나 이상의 유전자 발현 카세트(cassette)를 포함하는 유전자 발현 조절 시스템에 관한 것이다. 바람직하게는, 치환 돌연변이를 포함하는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체, 유비쿼터스 수용체, 오르판(orphan) 수용체 1, NER-1, 스테로이드 호르몬 핵수용체 1, 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15, 간 X 수용체β, 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질, 간 X 수용체, 간 X 수용체α, 파네소이드(farnesoid) X 수용체, 수용체 상호작용 단백질 14, 및 파네솔 수용체로부터 유래된다. 보다 바람직하게는, 치환 돌연변이를 포함하는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체 유래이다.
특정한 구현예에서, 상기 유전자 발현 조절 시스템은 트랜스활성 도메인, 그 발현이 조절되는 유전자와 연관되어 있는 반응 요소(element)를 인식하는 DNA-결합 도메인, 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 상기 유전자 발현 조절 시스템은 ⅰ) 상기 제1 유전자 발현 카세트의 코딩된 폴리펩티드의 DNA-결합 도메인에 의해 인식되는 반응 요소; ⅱ) 상기 제1 유전자 발현 카세트의 코딩된 폴리펩티드의 트랜스활성 도메인에 의해 활성화되는 프로모터; 및 ⅲ) 그 발현이 조절되는 유전자를 포함하는 제2 유전자 발현 카세트를 추가로 포함할 수 있다.
다른 특정한 구현예에서, 상기 유전자 발현 조절 시스템은 1) 트랜스활성 도메인, 그 발현이 조절되는 유전자와 연관되어 있는 반응 요소를 인식하는 DNA-결합 도메인, 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 2) 척추동물 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인, 무척추동물 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인, 울트라스피라클 단백질 리간드 결합 도메인, 및 제1 폴리펩티드 절편이 척추동물 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인, 무척추동물 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인, 또는 울트라스피라클 단백질 리간드 결합 도메인 유래이고, 제2 폴리펩티드 절편이 다른 척추동물 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인, 무척추동물 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인, 또는 울트라스피라클 단백질 리간드 결합 도메인 유래인 두 가지 폴리펩티드 절편을 포함하는 키메라 리간드 결합 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 제2 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함한다. 상기 유전자 발현 조절 시스템은 ⅰ) 상기 제1 유전자 발현 카세트의 코딩된 폴리펩티드의 DNA-결합 도메인에 의해 인식되는 반응 요소; ⅱ) 상기 제1 유전자 발현 카세트의 코딩된 폴리펩티드의 트랜스활성 도메인에 의해 활성화되는 프로모터; 및 ⅲ) 그 발현이 조절되는 유전자를 포함하는 제2 유전자 발현 카세트를 추가로 포함할 수 있다.
특정한 구현예에서, 상기 유전자 발현 조절 시스템은, 그 발현이 조절되는 유전자와 연관되어 있는 반응 인자를 인식하는 DNA-결합 도메인 및 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 유전자 발현 카세트, 및 트랜스활성 도메인 및 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 유전자 발현 카세트를 포함하며, 이때 상기 핵수용체 리간드 결합 도메인 중 하나는 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인이다. 바람직한 구현예에서, 상기 제1 폴리펩티드는 실질적으로 트랜스활성 도메인이 제거되며, 제2 폴리펩티드는 실질적으로 DNA 결합 도메인이 제거된다. 본 발명의 목적을 위하여, "실질적으로 제거된"은 문제의 단백질이 활성화 또는 결합 활성을 제공하기에 충분한 정도의 문제의 도메인 서열을 포함하고 있지 않음을 의미한다. 상기 유전자 발현 조절 시스템은 ⅰ) 상기 제1 유전자 발현 카세트의 제1 폴리펩티드의 DNA-결합 도메인에 의해 인식되는 반응 요소; ⅱ) 상기 제2 유전자 발현 카세트의 제2 폴리펩티드의 트랜스활성 도메인에 의해 활성화되는 프로모터; 및 ⅲ) 그 발현이 조절되는 유전자를 포함하는 제3 유전자 발현 카세트를 추가로 포함할 수 있다.
단지 하나의 핵수용체 리간드 결합 도메인만이 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 리간드 결합 도메인이라면, 다른 핵수용체 결합 도메인은 상기 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 결합 도메인과 다이머(dimer)를 형성하는 임의의 다른 핵수용체 유래일 수 있다. 예를 들면, 치환 돌연변이를 포함하는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인이 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인일 때, 다른 핵수용체 리간드 결합 도메인("파트너")은 엑디손 수용체, 척추동물 레티노이드 X 수용체(RXR), 무척추동물 RXR, 울트라스피라클 단백질(USP), 또는 척추동물 RXR, 무척추동물 RXR 및 RXR(그 전체가 본 명세서에서 참조로 포함되어 있는 동시-계류중인 출원 PCT/US01/09050, US60/294,814 및 US 60/294,819 참조)로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 두 가지 다른 핵수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드 절편을 포함하는 키메라 핵수용체 유래일 수 있다. 상기 "파트너" 핵수용체 리간드 결합 도메인은 절단(truncation) 돌연변이, 결실(deletion) 돌연변이, 치환 돌연변이, 또는 다른 변형을 추가로 포함할 수 있다.
바람직하게는, 상기 척추동물 RXR 리간드 결합 도메인은 인간(Homo sapiens), 마우스(Mus musculus), 래트(Rattus norvegicus), 닭(Gallus gallus), 돼지(Sus scrofa domestica), 개구리(Xenopus laevis), 제브라피쉬(Danio rerio), 멍게(Polyandrocarpa misakiensis), 또는 해파리(Tripedalia cysophora) RXR 유래이다.
바람직하게는, 상기 무척추동물 RXR 리간드 결합 도메인은 메뚜기(Locusta migratoria) RXR 폴리펩티드("LmRXR"), 진드기(ixodid tick, Amblyomma americanum) RXR 동족체(homolog) 1("AmaRXR1"), 진드기 RXR 동족체 2("AmaRXR2"), 꽃발게(fiddler crab, Celuca pugilator) RXR 동족체("CpRXR"), 딱정벌레(Tenebrio molitor) RXR 동족체("TmRXR"), 꿀벌(Apis mellifera) RXR 동족체("AmRXR"), 진디(aphid, Myzus persicae) RXR 동족체("MpRXR"), 또는 비-쌍시류(dipteran)/비-인시류(lepidopteran) RXR 동족체 유래이다.
바람직하게는, 상기 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 척추동물 종의 RXR 폴리펩티드 절편, 무척추동물 종의 RXR 폴리펩티드 절편, 비-쌍시류/비-인시류 무척추동물 종의 RXR 동족체 폴리펩티드 절편으로 구성된 군으로부터 선택되는 적어도 두 가지 폴리펩티드 절편을 포함한다. 본 발명에서 사용하기 위한 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 두 가지 다른 종의 RXR 폴리펩티드 절편을 포함할 수 있으며, 상기 종이 동일한 경우에는 둘 이상의 폴리펩티드 절편은 상기 종의 RXR 폴리펩티드 절편의 둘 이상의 다른 아형(isoform) 유래일 수 있다.
바람직한 구현예에서, 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 하나의 척추동물 종의 RXR 폴리펩티드 절편 및 하나의 무척추동물 종의 RXR 폴리펩티드 절편을 포함한다.
보다 바람직한 구현예에서, 상기 키메라 RXR 리간드 결합 도메인은 적어도 하나의 척추동물 종의 RXR 폴리펩티드 절편 및 하나의 비-쌍시류/비-인시류 무척추동물 종의 RXR 동족체 폴리펩티드 절편을 포함한다.
특정한 구현예에서, 그 발현이 조절되는 유전자는 상기 숙주 세포에 대한 동족형 유전자이다. 다른 특정한 구현예에서, 그 발현이 조절되는 유전자는 상기 숙주 세포에 대한 이형(heterologous) 유전자이다.
후술한 바와 같이, 본 발명에서 사용되기 위한 상기 리간드는, 상기 핵수용체(들)의 리간드 결합 도메인과 결합하고, 이것이 다시 유전자와 연관되어 있는 상기 반응 요소에 결합할 때, 상기 유전자의 발현을 외부에서 일시적으로 조절하기 위한 수단을 제공한다. 상기 결합 메카니즘(mechanism) 또는 본 발명의 다양한 성분이 서로 결합하는 순서, 즉 예를 들면 리간드 대 리간드 결합 도메인, DNA-결합 도메인 대 반응 요소, 트랜스활성 도메인 대 프로모터 등은 결정적이지 않다.
특정한 실시예에서, 그룹 H 핵수용체의 리간드 결합 도메인 및 그의 핵수용체 리간드 결합 도메인 파트너에 대한 상기 리간드의 결합은 상기 유전자의 발현 또는 억제를 가능하게 한다. 상기 메카니즘은 상기 그룹 H 핵수용체(GHNR) 또는 그의 파트너에 대한 리간드 결합 가능성, 및 결과적으로 형성되는 활성 호모다이머 복합체(예를 들면, GHNR+GHNR 또는 파트너+파트너)를 배제하지는 않는다. 바람직하게는, 하나 이상의 상기 수용체 도메인은 교잡 유전자 스위치를 생성하도록 다양하다. 전형적으로, 하나 이상의 세 가지 도메인, 즉 DBD, LBD, 및 트랜스활성 도메인은, 상기 교잡 유전자 및 결과물인 교잡 단백질이 트랜스활성화 활성, 상기 리간드의 상보적 결합, 및 특정 반응 요소의 인식에 대해 선택된 숙주 세포 또는 생명체에서 최적화되도록 다른 도메인 공급원(source)과는 다른 공급원으로부터 선택될 수 있다. 아울러, 상기 반응 요소 자체는 변형되거나, 또는 효모 유래의 GAL-4 단백질(Sadowski 등, 1988, Nature, 335:563-564 참조) 또는 대장균 유래의 LexA 단백질(Brent 및 Ptashne, 1985, Cell, 43: 729-736), 또는 교잡 수용체를 수용하기 위해 상기 특정한 상호작용을 위해 디자인, 변형 및 선택된 단백질(예를 들면, Kim 등, 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 3616-3620 참조)과의 표적화된 상호작용에 대해 특이적인 합성 반응 요소와 같은 다른 DNA 결합 단백질 도메인에 대한 반응 요소로 치환될 수 있다. 두 가지-교잡 시스템의 다른 이점은, 이들이 원하는 최종 결과에 따라 상기 유전자 발현을 조절하기 위해 사용되는 프로모터를 선택할 수 있도록 한다는 점이다. 이러한 이중 조절은 특히 세포독성(cytotoxic) 단백질이 생산되는 유전자 치료 분야에서 특히 중요할 수 있는데, 그 이유는 발현 시간뿐만 아니라 발현이 일어나는 세포 모두가 조절될 수 있기 때문이다. 적당한 프로모터에 기능적으로 연결된 유전자가 상기 대상의 세포 내로 도입될 때, 외인성 유전자의 발현은 본 발명의 시스템의 존재에 의해 조절될 수 있다. 프로모터는 지속적으로 또는 유도가능하게 조절될 수 있거나, 또는 조직 특이적(즉, 특정한 형의 세포에서만 발현됨)이거나 또는 상기 생명체의 특정한 발단 단계에 특이적일 수 있다.
상기 엑디손 수용체는 핵수용체 수퍼패밀리의 멤버이며, 서브패밀리 1, 그룹 H(이하, "그룹 H 핵수용체"라 함)로 분류된다. 각 그룹의 멤버들은 상기 E(리간드 결합) 도메인과 40-60% 아미노산 동질성을 공유한다(Laudet 등, A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Subfamily, 1999; Cell 97: 161-163). 상기 엑디손 수용체에 더하여, 상기 핵수용체 서브패밀리 1, 그룹 H의 다른 멤버로는 유비쿼터스 수용체(UR), 오르판 수용체 1(OR-1), 스테로이드 호르몬 핵수용체 1(NER-1), 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15(RIP-15), 간 X 수용체β(LXRβ), 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질(RLD-1), 간 X 수용체(LXR), 간 X 수용체α(LXRα), 파네소이드 X 수용체(FXR), 수용체 상호작용 단백질 14(RIP-14), 및 파네솔 수용체(HRR-1)를 포함한다.
본 발명자들은 CfEcR 동질성 모델을 개발하였고, 엑디스테로이드 및 비-엑디스테로이드에 대한 결합에 관여하는 결정적 잔기를 동정하기 위하여 상기 동질성 모델을 공지된 키로노머스 테탄스(Chironomous tetans) 엑디손 수용체("CtEcR") 동질성 모델(Wurtz 등, 2000)과 함께 사용하였다. 합성 비-엑디스테로이드인 디아실히드라진은 높은 친화성으로 인시류 EcR에 결합하고, 상기 곤충에서 미발달(precocious) 불완전 탈피를 유도하며(Wing 등, 1988), 이들 화합물 중 몇몇은 현재 살충제로 시판되고 있다. 상기 EcR의 리간드 결합 캐비티(cavity) 또는 "포켓"은 20-하이드록시엑디손(20E)과 같은 엑디스테로이드의 긴 백본(backbone) 구조에 적합하도록 진화되어 왔다. 상기 디아실히드라진은 엑디스테로이드에 비해 치밀한 구조를 가지며, 상기 EcR 결합 포켓의 아래 부분만을 점유한다. 이것은 엑디스테로이드와는 접촉하지만 비스아실히드라진과 같은 비-엑디스테로이드와는 접촉하지 않는 결합 포켓의 상부 부분에 몇 개의 결정적 잔기를 남겨 둔다. 본 발명자들은 본 명세서에서 상기 결합 포켓 잔기에서의 치환 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 엑디손 수용체의 구축을 개시하며, 변형된 리간드 결합 및 트랜스활성 특성을 갖는 몇 가지 클래스(class)의 치환 돌연변이체 엑디손 수용체를 동정하였다.
엑디손 수용체와 다른 그룹 H 핵수용체의 밀접한 연관성을 감안할 때, 본 발명자들이 동정한 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인 치환 돌연변이는 또한 그 리간드 결합 또는 리간드 민감성을 변형시키기 위해 다른 그룹 H 핵수용체의 리간드 결합 도메인의 상동성(analogous) 위치 내로 도입될 때에도 작용할 것으로 기대된다. 본 분야의 능숙한 당업자는 서열 분석, 동질성 모델을 통한 상기 결합 포켓의 분석 및 결합 분석과 같은 일상적인 종래의 방법을 이용한 서열 및 기능에 의해 상동성 아미노산 위치를 동정할 수 있다. 본 발명자들의 신규한 치환 돌연변이체 그룹 H 핵수용체 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는, 유전자 치료, 숙주 세포에서 관심 있는 단백질의 발현, 유전자이식 생명체의 생산 및 세포에 기초한 분석을 포함하는 다양한 적용분야를 위한 핵수용체-기초의 유도가능한 유전자 조절 시스템에서 유용하다.
특히, 본 발명자들은 본 명세서에서 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 신규한 유전자 발현 조절 시스템을 개시하고 있다. 상기 유전자 발현 시스템은 상기 트랜스활성 도메인, DNA-결합 도메인 및 리간드 결합 도메인이 하나의 코딩된 폴리펩티드 상에 있는 "단일-스위치"-기초의 유전자 발현 시스템일 수 있다. 다른 한편으로, 상기 유전자 발현 조절 시스템은 상기 트랜스활성 도메인 및 DNA-결합 도메인이 다르게 코딩된 2개의 폴리펩티드 상에 위치하는 "이중 스위치"- 또는 "두 가지-교잡"-기초의 유전자 발현 조절 시스템일 수 있다. 본 발명자들은 치환 돌연변이된 핵수용체가 원핵생물 및 진핵생물 세포 모두에서 리간드 결합 활성 및/또는 리간드 특이성을 변형시키기 위해 핵수용체-기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템의 성분으로 사용될 수 있음을 처음으로 보였다. 본 명세서에서 개시한 바와 같이, 본 발명자들의 발견은 예측할 수 없을 뿐만 아니라 놀라운 것이다.
본 발명의 엑디손 수용체-기초의 유전자 발현 조절 시스템은 헤테로다이머 또는 호모다이머일 수 있다. 기능적인 EcR 복합체는 일반적으로 다양한 곤충으로부터 얻은 엑디손 수용체 단백질, 및 울트라스피라클(SUP) 단백질 또는 USP의 척추동물 동족체, 레티노이드 X 수용체 단백질의 두 가지 스테로이드 수용체 패밀리 멤버로 구성되는 헤테로다이머 단백질 복합체를 의미한다(Yao 등, 1993, Nature 366; 476-479; Yao 등, 1992, Cell 71: 63-72). 그러나, 상기 복합체는 또한 후술하는 바와 같이 호모다이머일 수도 있다. 상기 기능성 엑디스테로이드 수용체 복합체는 또한 이뮤노필린과 같은 추가 단백질(들)을 포함할 수 있다. 또한, 전사 인자로 알려져 있는 스테로이드 수용체 패밀리 단백질의 추가 멤버(예를 들면, DHR38 또는 betaFTZ -1)가 EcR, USP, 및/또는 RXR에 대한 리간드 의존적 또는 비의존적 파트너가 될 수 있다. 아울러, 일반적으로 공동활성자(coactivator)(또한, 어댑터(adapter) 또는 매개자(mediator)로도 알려짐)로 알려져 있는 단백질과 같은 다른 공동인자(cofactor)가 요구될 수도 있다. 상기 단백질들은 DNA에 서열-특이적으로 결합하지는 않으며, 기초(basal) 전사에도 관여하지 않는다. 이들은 활성자의 DNA-결합을 촉진하거나, 크로마틴(chromatin) 구조에 영향을 미치거나, 또는 활성자-개시(initiation) 복합체 상호작용을 매개하는 것을 포함하는 다양한 메카니즘을 통해 전사 활성에 영향을 미칠 수 있다. 상기 공동활성자의 예로는 RIP140, TIF1, RAP46/Bag-1, ARA70, SRC-1/NCoA-1, TIF2/GRIP/NCoA-2, ACTR/AIB1/RAC3/pCIP 뿐만 아니라 무차별(promiscuous) 공동활성자 C 반응 요소 B 결합 단백질, CBP/p300을 포함한다(리뷰를 위해서는 Glass 등, Curr. Opin. Cell Biol. 9: 222-232, 1997 참조). 또한, 일반적으로 공동억제자(corepressor)(또한 억제자, 침묵자(silencer), 또는 침묵 매개자로도 알려져 있음)로 알려져 있는 단백질 공동인자가 리간드의 부재시 전사 활성을 효과적으로 억제하기 위해 요구될 수 있다. 상기 공동억제자는 리간드 비결합 엑디손 수용체와 상호작용하여 상기 반응 요소에서 활성을 침묵시킬 수 있다. 현재의 증거는 리간드의 결합은 상기 수용체의 형태(conformation)를 변화시키고, 이것은 결과적으로 공동억제자를 방출시켜 상기에서 개시한 공동활성자를 소집하여 그 침묵 활성을 없앤다는 것을 제시한다. 공동억제자의 예로는 N-CoR 및 SMRT를 포함한다(리뷰를 위해서는 Horwitz 등, Mol Endocrinol. 10: 1167-1177, 1996 참조). 상기 공동인자는 상기 세포 또는 생명체 내부의 내인성이거나, 또는 조절되거나 또는 조절되지 않은 방식으로 발현되는 이식유전자와 같이 외부에서 추가될 수 있다. 또한, 상기 엑디손 수용체 단백질인 USP 또는 RXR의 호모다이머 복합체는 어떤 환경 하에서 기능적일 수 있다.
전형적으로 상기 엑디손 수용체 복합체는 상기 핵수용체 수퍼패밀리의 멤버인 단백질을 포함하며, 모든 멤버는 일반적으로 아미노-말단 트랜스활성 도메인, DNA 결합 도메인("DBD"), 및 상기 DBD와 힌지(hinge) 영역에 의해 분리되는 리간드 결합 도메인("LBD)의 존재에 의해 특정된다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이, "DNA 결합 도메인"이란 용어는, 상기 DNA 결합 도메인이 특정한 반응 요소와 연관되어 기능을 하는 한, DNA 결합 단백질의 최소 폴리펩티드 서열부터 전체 길이의 DNA 결합 단백질까지를 포함한다. 또한, 상기 핵수용체 수퍼패밀리의 멤버는 4 또는 5개 도메인의 존재에 의해 특정된다: A/B, C, D, E 및 어떤 멤버 F(미국 특허 4,981,784 및 Evans, Science 240: 889-895, 1988 참조). 상기 "A/B" 도메인은 상기 트랜스활성 도메인에 대응하고, "C"는 상기 DNA 결합 도메인에 대응하며, "D"는 상기 힌지 영역에 대응하고, "E"는 상기 리간드 결합 도메인에 대응한다. 또한, 상기 패밀리의 어떤 멤버는 "F"에 대응하는 LBD의 카르복시-말단 상에 다른 트랜스활성 도메인을 가질 수도 있다.
상기 DBD는 그 사이에 엑티손 반응 요소에 특이성을 부여하는 P-박스 및 D-박스의 두 가지 아미노산 모티프(motif)가 있는 2개의 시스테인 징크 핑거(zinc finger)의 존재에 의해 특정된다. 상기 도메인은 자연형이거나, 변형되거나, 또는 이형 수용체 단백질의 다른 도메인의 키메라일 수 있다. 또한, 상기 EcR 수용체는 상기 스테로이드 수용체 패밀리의 서브셋(subset)과 같이 헤테로다이머화 특성에 관여하는 다소 덜-정의된 영역을 갖고 있다. 핵수용체의 도메인은 자연 상태에서 모듈(module)을 가지므로, 상기 LBD, DBD 및 트랜스활성 도메인은 상호교환될 수 있다. 유전자 스위치 시스템은 상기 엑디손 수용체 복합체 유래의 성분들을 포함하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 상기 공지된 시스템에서는 EcR이 사용될 때마다 자연형 또는 변형된 DNA 결합 도메인 및 트랜스활성 도메인이 동일한 분자 상에 연관되어 있다. USP 또는 RXR은 전형적으로 침묵 파트너로 사용된다. 본 발명자들은 이전에 DNA 결합 도메인 및 트랜스활성 도메인이 동일한 분자 상에 있을 때 리간드 부재시의 배경 활성이 높고, DNA 결합 도메인 및 트랜스활성 도메인이 다른 분자 상에 있을 때, 즉 각각 헤테로다이머 또는 호모다이머 복합체의 두 가지 파트너 상에 있을 때 상기 활성이 급격하게 감소된다는 것을 보였다(PCT/US01/09050 참조).
본 발명의 유전자 발현 카세트
본 발명의 신규한 핵수용체-기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템은 숙주 세포에서 발현될 수 있는 적어도 하나의 유전자 발현 카세트를 포함하며, 상기 유전자 발현 카세트는 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 따라서, 본 발명자들의 발명은 또한 본 발명의 유전자 발현 시스템에서 사용하기 위한 신규한 유전자 발현 카세트를 제공한다.
특정한 구현예에서, 숙주 세포에서 발현될 수 있는 상기 유전자 발현 카세트는 1) 트랜스활성 도메인, DNA-결합 도메인, 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 2) DNA-결합 도메인 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 및 3) 트랜스활성 도메인 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
다른 특정한 구현예에서, 본 발명은 숙주 세포에서 발현될 수 있는 유전자 발현 카세트를 제공하며, 상기 유전자 발현 카세트는 1) 트랜스활성 도메인, DNA-결합 도메인, 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 교잡 폴리펩티드; 2) DNA-결합 도메인 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 교잡 폴리펩티드; 및 3) 트랜스활성 도메인 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 교잡 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 교잡 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 발명에 따른 교잡 폴리펩티드는 적어도 두 가지 폴리펩티드 절편을 포함하며, 각 폴리펩티드 절편은 다른 공급원, 즉 다른 폴리펩티드, 다른 핵수용체, 다른 종 등으로부터 유래된다. 본 발명에 따른 상기 교잡 폴리펩티드는 적어도 두 가지 폴리펩티드 도메인을 포함할 수 있으며, 각 폴리펩티드 도메인은 다른 공급원으로부터 유래된다.
특정한 구현예에서, 치환 돌연변이를 포함하는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체, 유비쿼터스 수용체, 오르판 수용체 1, NER-1, 스테로이드 호르몬 핵수용체 1, 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15, 간 X 수용체β, 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질, 간 X 수용체, 간 X 수용체α, 파네소이드 X 수용체, 수용체 상호작용 단백질 14, 및 파네솔 수용체로부터 유래된다. 바람직한 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체 유래이다.
따라서, 본 발명은 또한 1) 트랜스활성 도메인, DNA-결합 도메인, 및 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 2) DNA-결합 도메인 및 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 및 3) 트랜스활성 도메인 및 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 유전자 발현 카세트를 제공한다. 바람직하게는, 상기 유전자 발현 카세트는 1) 트랜스활성 도메인, DNA-결합 도메인, 및 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 교잡 폴리펩티드; 2) DNA-결합 도메인 및 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 교잡 폴리펩티드; 및 3) 트랜스활성 도메인 및 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 교잡 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 교잡 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 상기 코딩된 교잡 폴리펩티드는 적어도 두 가지 폴리펩티드 절편을 포함하고, 각 폴리펩티드 절편은 다른 공급원으로부터 유래된다.
상기 엑디손 수용체(EcR) 리간드 결합 도메인(LBD)은 바람직하게는 절지동물 강(class)으로부터 선택되는 무척추동물 EcR 유래일 수 있다. 바람직하게는, 상기 EcR은 인시목(Lepidopteran) EcR, 쌍시류(Dipteran) EcR, 메뚜기목(Orthopteran) EcR, 동시류(Homopteran) EcR 및 반시목(Hemipteran) EcR로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 본 발명에서 사용되기 위한 상기 EcR 리간드 결합 도메인은 가문비나무좀벌레(spruce budworm, Choristoneura fumiferana) EcR("CfEcR"), 딱정벌레(beetle, Tenebrio molitor) EcR("TmECR"), 박각시나방(Manduca sexta) EcR("MsEcR"), Heliothies virescens EcR("HvEcR"), 깔따구(midge, Chironomus tentans) EcR("CtEcR"), 누에나방(Bombyx mori) EcR("BmEcR"), 스퀸팅 부쉬 브라운(squinting bush brown, Bicyclus anynana) EcR("BanEcR"), 버크아이(buckeye, Junonia coenia) EcR("JcEcR"), 초파리(Drosophila melanogaster) EcR("DmEcR"), 모기(Aedes aegypti) EcR("AaEcR"), 검정파리(blowfly, Lucilia capitata)("LcEcR"), 검정파리(Lucilia cuprina) EcR("LucEcR"), 검정파리(Calliphora vicinia) EcR("CvEcR"), 지중해 초파리(Ceratitis capitata) EcR("CcEcR"), 메뚜기(Locusta migratoria) EcR("LmEcR"), 진딧물(Myzus persicae) EcR("MpEcR"), 농게(celuca pugilator) EcR("CpEcR"), 진드기(Amblyomma americanum) EcR("AmaEcR"), 가루이(whitefly, Bamecia argentifoli) EcR("BaEcR") 또는 매미충(leafhopper, Nephotetix cincticeps) EcR("NcEcR")로부터 유래된다. 보다 바람직하게는, 상기 LBD는 CfEcR, DmEcR, 또는 AmaEcR 유래이다.
특정한 구현예에서, 상기 LBD는 절단된 EcR 폴리펩티드 유래이다. 상기 EcR 폴리펩티드는 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 205, 210, 215, 220, 225, 230, 235, 240, 245, 250, 255, 260 또는 265개 아미노산이 결실된 결과이다. 바람직하게는, 상기 절단된 EcR 폴리펩티드는 적어도 부분적인 폴리펩티드 도메인이 결실된 결과이다. 보다 바람직하게는, 상기 절단된 EcR 폴리펩티드는 적어도 전체 폴리펩티드 도메인이 결실된 결과이다. 특정한 구현예에서, 상기 절단된 EcR 폴리펩티드는 적어도 A/B-도메인, C-도메인, D-도메인, F-도메인, A/B/C-도메인, A/B/1/2/-C-도메인, A/B/C/D-도메인, A/B/C/D/F-도메인, A/B/F-도메인, A/B/C/F-도메인, 부분적인 E 도메인, 또는 부분적인 F 도메인이 결실된 결과이다. 몇 가지 완전한 및/또는 부분적인 도메인 결실의 조합이 또한 수행될 수 있다.
특정한 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 1) 서열번호 1의 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219, 223, 234, 또는 238 아미노산 잔기, 2) 서열번호 1의 96 및 119 아미노산 잔기, 3) 서열번호 1의 110 및 128 아미노산 잔기, 4) 서열번호 1의 52 및 110 아미노산 잔기, 5) 서열번호 1의 107, 110 및 127 아미노산 잔기, 또는 6) 서열번호 1의 52, 107 및 127 아미노산 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 다른 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 서열번호 1의 107 및 127 아미노산 잔기의 치환 및 259 아미노산 잔기의 삽입을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 바람직한 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체 유래이다.
다른 특정한 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 1) 서열번호 1의 48 아미노산 잔기에 대해 동등한(equivalent) 또는 상동성 위치에서의 아스파라긴, 아르기닌, 티로신, 트립토판, 루이신 또는 리신 잔기의 치환, 2) 서열번호 1의 51 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 메티오닌, 아스파라긴 또는 루이신 잔기의 치환, 3) 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신, 프롤린, 메티오닌, 아르기닌, 트립토판, 글리신, 글루타민 또는 글루탐산 잔기의 치환, 4) 서열번호 1의 54 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트립토판 또는 트레오닌의 치환, 5) 서열번호 1의 92 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신 또는 글루탐산의 치환, 6) 서열번호 1의 95 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 히스티딘, 메티오닌 또는 트립토판 잔기의 치환, 7) 서열번호 1의 96 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신, 세린, 글루탐산 또는 트립토판 잔기의 치환, 8) 서열번호 1의 109 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트립토판, 프롤린, 루이신, 메티오닌 또는 아스파라긴 잔기의 치환, 9) 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산, 트립토판 또는 아스파라긴 잔기의 치환, 10) 서열번호 1의 119 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌의 치환, 11) 서열번호 1의 120 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트립토판 또는 메티오닌의 치환, 12) 서열번호 1의 125 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산, 프롤린, 루이신, 시스테인, 트립토판, 글리신, 이소루이신, 아스파라긴, 세린, 발린 또는 아르기닌의 치환, 13) 서열번호 1의 128 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌의 치환, 14) 서열번호 1의 132 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 메티오닌, 아스파라긴, 글루탐산 또는 발린의 치환, 15) 서열번호 1의 219 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 알라닌, 리신, 트립토판 또는 티로신 잔기의 치환, 16) 서열번호 1의 223 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 리신, 아르기닌 또는 티로신 잔기의 치환, 17) 서열번호 1의 234 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 메티오닌, 아르기닌, 트립토판 또는 이소루이신의 치환, 18) 서열번호 1의 238 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린, 글루탐산, 루이신, 메티오닌 또는 티로신의 치환, 19) 서열번호 1의 119 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌 잔기 및 서열번호 1의 96 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트레오닌의 치환, 20) 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기 및 서열번호 1의 128 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌 잔기의 치환, 21) 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 발린 잔기 및 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기의 치환, 22) 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신 잔기, 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기 및 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기의 치환, 또는 23) 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신, 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 및 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 발린의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 다른 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신 잔기의 치환, 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기의 치환 및 서열번호 1의 259 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글리신 잔기의 삽입을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 바람직한 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체 유래이다.
특정한 구현예에서, 치환 돌연변이를 포함하는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 서열번호 1의 F48Y, F48W, F48L, F48N, F48R, F48K, I51M, I51N, I51L, T52M, T52V, T52L, T52E, T52P, T52R, T52W, T52G, T52Q, M54W, M54T, M92L, M92E, R95H, R95M, R95W, V96L, V96W, V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M, F109N, A110E, A110N, A110W, N119F, Y120W, Y120M, M125P, M125R, M125E, M125L, M125C, M125W, M125G, M125I, M125N, M125S, M125V, V128F, L132M, L132N, L132V, L132E, M219K, M219W, M219Y, M219A, L223K, L223R, L223Y, L234M, L234I, L234R, L234W, W238P, W238E, W238Y, W238M, W238L, N119F/V96T, V128F/A110P, T52V/A110P, V107I/Y127E/T52V, 및 V107I/Y127E/A110P 치환 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택되는 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인이다. 다른 특정한 구현예에서, 치환 돌연변이를 포함하는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 서열번호 1의 V107I/Y127E 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함하는 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인으로서, 서열번호 1의 G259 삽입 돌연변이(V107I/Y127E/G259)를 추가로 포함한다.
다른 특정한 구현예에서, 치환 돌연변이를 포함하는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은, 500 mM 이하의 염 및 적어도 37℃에서의 교잡 단계, 및 2XSSPE로 적어도 63℃에서의 세척 단계를 포함하는 교잡 조건 하에서, 서열번호 1의 F48Y, F48W, F48L, F48N, F48R, F48K, I51M, I51N, I51L, T52M, T52V, T52L, T52E, T52P, T52R, T52W, T52G, T52Q, M54W, M54T, M92L, M92E, R95H, R95M, R95W, V96L, V96W, V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M, F109N, A110E, A110N, A110W, N119F, Y120W, Y120M, M125P, M125R, M125E, M125L, M125C, M125W, M125G, M125I, M125N, M125S, M125V, V128F, L132M, L132N, L132V, L132E, M219K, M219W, M219Y, M219A, L223K, L223R, L223Y, L234M, L234I, L234R, L234W, W238P, W238E, W238Y, W238M, W238L, N119F/V96T, V128F/A110P, T52V/A110P, V107I/Y127E/T52V, 및 V107I/Y127E/A110P로 구성된 군으로부터 선택되는 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 교잡하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드이다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 교잡 조건은 상기 교잡 및 세척 단계 모두에 대해 2XSSPE 및 63℃를 포함한다.
다른 특정한 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 1) 서열번호 1의 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219, 223, 234, 또는 238 아미노산 잔기, 2) 서열번호 1의 96 및 119 아미노산 잔기, 3) 서열번호 1의 110 및 128 아미노산 잔기, 4) 서열번호 1의 52 및 110 아미노산 잔기, 5) 서열번호 1의 107, 110 및 127 아미노산 잔기, 또는 6) 서열번호 1의 52, 107 및 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 치환 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 서열번호 1의 107 및 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 치환 돌연변이 및 259 아미노산 잔기에서의 삽입을 일으키는 치환 돌연변이를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체 유래이다.
바람직하게는, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 1) 서열번호 1의 48 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아스파라긴, 아르기닌, 티로신, 트립토판, 루이신 또는 리신 잔기의 치환, 2) 서열번호 1의 51 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 메티오닌, 아스파라긴 또는 루이신 잔기의 치환, 3) 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신, 프롤린, 메티오닌, 아르기닌, 트립토판, 글리신, 글루타민 또는 글루탐산 잔기의 치환, 4) 서열번호 1의 54 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트립토판 또는 트레오닌의 치환, 5) 서열번호 1의 92 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신 또는 글루탐산의 치환, 6) 서열번호 1의 95 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 히스티딘, 메티오닌 또는 트립토판 잔기의 치환, 7) 서열번호 1의 96 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신, 세린, 글루탐산 또는 트립토판 잔기의 치환, 8) 서열번호 1의 109 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트립토판, 프롤린, 루이신, 메티오닌 또는 아스파라긴 잔기의 치환, 9) 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산, 트립토판 또는 아스파라긴 잔기의 치환, 10) 서열번호 1의 119 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌의 치환, 11) 서열번호 1의 120 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트립토판 또는 메티오닌의 치환, 12) 서열번호 1의 125 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산, 프롤린, 루이신, 시스테인, 트립토판, 글리신, 이소루이신, 아스파라긴, 세린, 발린 또는 아르기닌의 치환, 13) 서열번호 1의 128 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌의 치환, 14) 서열번호 1의 132 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 메티오닌, 아스파라긴, 글루탐산 또는 발린의 치환, 15) 서열번호 1의 219 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 알라닌, 리신, 트립토판 또는 티로신 잔기의 치환, 16) 서열번호 1의 223 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 리신, 아르기닌 또는 티로신 잔기의 치환, 17) 서열번호 1의 234 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 메티오닌, 아르기닌, 트립토판 또는 이소루이신의 치환, 18) 서열번호 1의 238 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린, 글루탐산, 루이신, 메티오닌 또는 티로신의 치환, 19) 서열번호 1의 119 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌 잔기 및 서열번호 1의 96 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트레오닌의 치환, 20) 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기 및 서열번호 1의 128 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌 잔기의 치환, 21) 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 발린 잔기 및 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기의 치환, 22) 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신 잔기, 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기 및 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기의 치환, 또는 23) 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신, 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 및 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 발린의 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신 잔기의 치환, 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기의 치환 및 서열번호 1의 259 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글리신 잔기의 삽입을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체 유래이다.
특정한 구현예에서, 치환 돌연변이를 포함하는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드이며, 상기 치환 돌연변이는 서열번호 1의 F48Y, F48W, F48L, F48N, F48R, F48K, I51M, I51N, I51L, T52M, T52V, T52L, T52E, T52P, T52R, T52W, T52G, T52Q, M54W, M54T, M92L, M92E, R95H, R95M, R95W, V96L, V96W, V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M, F109N, A110E, A110N, A110W, N119F, Y120W, Y120M, M125P, M125R, M125E, M125L, M125C, M125W, M125G, M125I, M125N, M125S, M125V, V128F, L132M, L132N, L132V, L132E, M219K, M219W, M219Y, M219A, L223K, L223R, L223Y, L234M, L234I, L234R, L234W, W238P, W238E, W238Y, W238M, W238L, N119F/V96T, T52V/A110P, V128F/A110P, V107I/Y127E/T52V, 및 V107I/Y127E/A110P 치환 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 특정한 구현예에서, 치환 돌연변이를 포함하는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 서열번호 1의 V107I/Y127E 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드로서, 서열번호 1의 G259 삽입 돌연변이(V107I/Y127E/G259)를 추가로 포함한다.
상기 DNA 결합 도메인은 합성 및 키메라 DNA 결합 도메인, 또는 상동체(analog), 그의 조합 또는 변형을 포함하는 공지된 반응 요소를 갖는 임의의 DNA 결합 도메인일 수 있다. 바람직하게는, 상기 DBD는 GAL4 DBD, 렉스(Lex)A DVD, 전사 인자 DBD, 그룹 H 핵수용체 멤버 DBD, 스테로이드/티로이드 호르몬 핵수용체 수퍼패밀리 멤버 DBD, 또는 세균 LacZ DBD 이다. 보다 바람직하게는, 상기 DBD는 EcR DBD(서열번호 4(폴리뉴클레오티드) 또는 서열번호 5(폴리펩티드)), GAL4 DBD(서열번호 6(폴리뉴클레오티드) 또는 서열번호 7(폴리펩티드)), 또는 lexA DBD(서열번호 8(폴리뉴클레오티드) 또는 서열번호 9(폴리펩티드))이다.
상기 트랜스활성 도메인("AD" 또는 "TA"라 약칭함)은 임의의 그룹 H 핵수용체 멤버 AD, 스테로이드/티로이드 호르몬 핵수용체 AD, 합성 또는 키메라 AD, 폴리글루타민 AD, 염기성 또는 산성 아미노산 AD, VP16 AD, GAL4 AD, NF-κB AD, BP64 AD, B42 산성 활성 도메인(B42AD), p65 트랜스활성 도메인(p65AD), 또는 그의 상동체, 조합, 또는 변형일 수 있다. 특정한 구현예에서, 상기 AD는 합성 또는 키메라 AD이거나, 또는 EcR, 글루코코르티코이드(glucocorticoid) 수용체, VP16, GAL4, NF-κB, 또는 B42 산성 활성 도메인 AD 로부터 얻어진다. 바람직하게는, 상기 AD는 EcR AD(서열번호 10(폴리뉴클레오티드) 또는 서열번호 11(폴리펩티드)), VP16 AD(서열번호 12(뉴클레오티드) 또는 서열번호 13(폴리펩티드)), B42 AD(서열번호 14(폴리뉴클레오티드) 또는 서열번호 15(폴리펩티드)), 또는 p65 AD(서열번호 16(폴리뉴클레오티드) 또는 서열번호 17(폴리펩티드))이다.
특정한 구현예에서, 상기 유전자 발현 카세트는 1) 서열번호 4, 서열번호 6 또는 서열번호 8의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 DNA-결합 도메인, 또는 2) 서열번호 10, 서열번호 12, 서열번호 14 또는 서열번호 16의 핵산 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 트랜스활성 도메인 중 어느 하나; 및 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 교잡 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직하게는, 치환 돌연변이를 포함하는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인이다.
다른 특정한 구현예에서, 상기 유전자 발현 카세트는 1) 서열번호 5, 서열번호 7 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 DNA-결합 도메인, 또는 2) 서열번호 11, 서열번호 13, 서열번호 15, 또는 서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 트랜스활성 도메인 중 어느 하나; 및 본 발명에 따른 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 교잡 폴리펩티드를 코딩한다. 바람직하게는, 치환 돌연변이를 포함하는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 본 발명에 따른 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인이다.
또한, 본 발명은 ⅰ) DNA 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 의해 인식되는 도메인을 포함하는 반응 요소; ⅱ) 트랜스활성 도메인을 포함하는 폴리펩티드에 의해 활성화되는 프로모터; 및 ⅲ) 그 발현이 조절되는 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트를 제공한다.
상기 반응 요소("RE")는 공지된 DNA 결합 도메인 또는 상동체, 그의 조합 또는 변형을 갖는 임의의 반응 요소일 수 있다. 본 발명에서는 하나의 RE가 도입될 수도 있고, 또는 동일한 RE의 다중(multiple) 카피(copy)이거나 또는 둘 이상의 다른 RE인 다중 RE가 사용될 수도 있다. 특정한 구현예에서, 상기 RE는 GAL4 유래의 RE("GLA4RE"), LexA RE, 그룹 H 핵수용체 RE, 스테로이드/티로이드 호르몬 핵수용체 RE, 또는 합성 DNA 결합 도메인을 인식하는 합성 RE이다. 바람직하게는, 상기 RE는 서열번호 18의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 엑디손 반응 인자(EcRE), 서열번호 19의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 GAL4RE, 또는 서열번호 20의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 LexA RE(오페론(operon), "op")("2XLexPopRE")이다.
본 발명에 따른 스테로이드/티로이드 호르몬 핵수용체 DNA 결합 도메인, 활성 도메인 또는 반응 요소는, 티로이드 호르몬 수용체α(TRα), 티로이드 수용체 1(c-erbA-1), 티로이드 호르몬 수용체β(TRβ), 레티노산(retinoic acid) 수용체α(RARα), 레티노산 수용체β(RARβ, HAP), 레티노산 수용체γ(RARγ), 레티노산 수용체 감마-유사(RARD), 퍼옥시좀(peroxisome) 증식자(proliferator)-활성형 수용체α(PPARα), 퍼옥시좀 증식자-활성형 수용체β(PPARβ), 퍼옥시좀 증식자-활성형 수용체δ(PPARδ, NUC-1), 퍼옥시좀 증식자-활성자 연관 수용체(FFAR), 퍼옥시좀 증식자-활성형 수용체γ(PPARγ), 티로이드 호르몬 수용체α의 비-코딩 가닥에 의해 코딩되는 오르판 수용체(REVERBα), v-erb A 연관 수용체(EAR-1), v-erb 연관 수용체(EAR-1A), γ), 티로이드 호르몬 수용체β의 비-코딩 가닥에 의해 코딩되는 오르판 수용체(REVERBβ), v-erb 연관 수용체(EAR-1β), 오르판 핵수용체 BD73(BD73), rev-erbA-연관 수용체(RVR), 징크 핑거 단백질 126(HZF2), 엑디손-유도가능한 단백질 E75(E75), 엑디손-유도가능한 단백질 E78(E78), 드로소필라 수용체 78(DR-78), 레티노이드-연관 오르판 수용체α(RORα), 레티노이드 Z 수용체α(RZRα), 레티노이드 연관 오르판 수용체β(RORβ), 레티노이드 Z 수용체β(RZRβ), 레티노이드-연관 오르판 수용체γ(RORγ), 레티노이드 Z 수용체γ(RZRγ), 레티노이드-연관 오르판 수용체(TOR), 호르몬 수용체 3(HR-3), 드로소필라 호르몬 수용체 3(DHR-3), 만두카(Manduca) 호르몬 수용체(MHR-3), 갈레리아(Galleria) 호르몬 수용체 3(GHR-3), C. 엘레간스(elegans) 핵수용체 3(CNR-3), 코리스토네우라(Chopristoneura) 호르몬 수용체 3(CHR-3), C. 엘레간스 핵수용체 14(CNR-14), 엑디손 수용체(ECR), 유비쿼터스 수용체(UR), 오르판 핵수용체(OR-1), NER-1, 수용체-상호작용성 단백질 15(RIP-15), 간 X 수용체β(LXRβ), 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질(RLD-1), 간 X 수용체(LXR), 간 X 수용체α(LXRα), 파네소이드 X 수용체(FXR), 수용체-상호작용성 단백질 14(RIP-14), HRR-1, 비타민 D 수용체(VDR), 오르판 핵수용체(ONR-1), 프레그네인(pregnane) X 수용체(PXR), 스테로이드 및 제노바이오틱(xenobiotic) 수용체(SXR), 벤조에이트(benzoate) X 수용체(BXR), 핵수용체(MB-67), 구성분 안드로스테인(androstane) 수용체 1(CAR-1), 구성분 안드로스테인 수용체α(CARα), 구성분 안드로스테인 수용체 2(CAR-2), 구성분 안드로스테인 수용체β(CARβ), 드로소필라 호르몬 수용체 96(DHR-96), 핵 호르몬 수용체 1(NHR-1), 간세포(hepatocyte) 핵 인자 4(HNF-4), 간세포 핵 인자 4G(HNF-4G), 간세포 핵 인자 4B(NHF-4B), 간세포 핵 인자 4D(HNF-4D, DHNF-4), 레티노이드 X 수용체α(RXRα), 레티노이드 X 수용체β(RXRβ), H-2 영역 Ⅱ 결합 단백질(H-2RⅡBP), 핵수용체 공동-조절자-1(RcoR-1), 레티노이드 X 수용체γ(RXRγ), 울트라스피라클(USP), 2C1 핵수용체, 코리온(chorion)(인자 1(CF-1), 테스티큘라(testicular) 수용체 2(TR-2), 테스티큘라 수용체 2-11(TR2-11), 테스티큘라 수용체 4(TR4), TAK-1, 드로소필라 호르몬 수용체(DHR78), 테일레스(Tailless)(TLL), 테일레스 동족체(TLX), XTLL, 닭 오브알부민(ovalbumin) 상류 프로모터 전사 인자 I(COUP-TFI), 닭 오브알부민 상류 프로모터 전사 인자 A(COUP-TFA), EAR-3, SVP-44, 닭 오브알부민 상류 프로모터 전사 인자 Ⅱ(COUP-TFⅡ), 닭 오브알부민 상류 프로모터 전사 인자 B(COUP-TFB), ARP-1, SVP-40, SVP, 닭 오브알부민 상류 프로모터 전사 인자 Ⅲ(Coup-TFⅢ), 닭 오브알부민 상류 프로모터 전사 인자 G(COUP-TFG), SVP-46, EAR-2, 에스트로겐 수용체α(ERα), 에스트로겐 수용체β(ERβ), 에스트로겐 연관 수용체 1(ERR1), 에스트로겐 연관 수용체α(ERRα), 에스트로겐 연관 수용체 2(ERR2), 에스트로겐 연관 수용체β(ERRβ), 글루코코르티코이드 수용체(GR), 미네랄로코르티코이드 수용체(MR), 프로게스테론 수용체(PR), 안드로젠 수용체(AR), 신경 성장 인자 유도성 유전자 B(NGFI-B), Nur-77과 유사한 핵수용체(TRS), N10, 오르판 수용체(NUR-77), 인간 초기 반응 유전자(NAK-1), Nurr 연관 인자 1(NURR-1), 인간 초기-즉시 반응 유전자(NOT), 재생성 간 핵수용체 1(RNR-1), 혈액생성 징크 핑거 3(HZF-3), Nur 연관 단백질-1(TINOR), 핵 오르판 수용체 1(NOR-1), NOR1 연관 수용체(MINOR), 드로소필라 호르몬 수용체 38(DHR-38), C. 엘레간스 핵수용체 8(CNR-8), C48D5, 스테로이도젠(steroidogenic) 인자 1(SF1), 엔도제핀(endozepine)-유사 펩티드(ELP), 푸쉬 타라주(fushi tarazu) 인자 1(FTZ-F1), 아드레날(adrenal) 4 결합 단백질(AD4BP), 간 수용체 동족체(LRH-1), Ftz-F1-=연관 오르판 수용체 A(xFFrA), Ftz-F1-연관 오르판 수용체 B(XFFrB), LRH-1과 연관된 핵수용체(FFLR), LRH-1과 연관된 핵수용체(PHR), 페토(feto)단백질 전사 인자(FTF), 생식 세포(germ cell) 핵 인자(GCNFM), 레티노이드 수용체-연관 테스티스(testis)-연관 수용체(RTR), 너프(knirps, KNI), 너프 연관(KNRL), 태아 생식선(embryonic gonad)(EGON), 리간드 의존성 핵수용체에 대한 드로소필라 유전자(EAGLE), 트리토락스(trithorax)와 유사한 핵수용체(ODR7), 트리토락스, 투여량 민감성 성 역전 아드레날 히포플라시아 콘제니타(adrenal hypoplasia congenita) 결정적 영역 염색체 X 유전자(DAX-1), 아드레날 히포플라시아 콘제니타 및 히포고나도트로픽(hypogonadotropic) 성선기능저하증(hypogonadism)(AHCH), 및 짧은 헤테로다이머 파트너(SHP)로 구성된 군으로부터 선택되는 스테로이드/티로이드 호르몬 핵수용체로부터 얻어질 수 있다.
본 발명의 목적을 위하여, 핵수용체 및 그룹 H 핵수용체는 또한 합성 및 키메라 핵수용체 및 그룹 H 핵수용체 및 그의 동족체를 포함한다.
본 발명자들의 유전자 발현 카세트에서 사용되기 위한 관심있는 유전자는 내인성 유전자 또는 외인성 유전자일 수 있다. 원하는 유전자 또는 단백질에 대한 핵산 또는 아미노산 서열 정보는, 예를 들면 GENBANK, EMBL, Swiss-Prot, 및 PIR과 같은 많은 공개적으로 접근가능한 데이터베이스 중 하나, 또는 많은 생물학 관련 논문 발표물 내에 위치할 수 있다. 따라서, 해당 분야에 능숙한 사람들은 실질적으로 모든 공지된 유전자에 대한 핵산 서열 정보에 접근한다. 이러한 정보는 이후 본 명세서에서 개시된 본 발명자들의 방법에서 사용되는 상기 유전자 발현 카세트의 내부에 관심있는 유전자를 삽입시키기 위한 바람직한 구축물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명자들의 유전자 발현 카세트에서 사용되기 위한 관심있는 유전자의 예로는, 단일클론 항체, 프로테아제(protease), 사이토카인(cytokine), 인터페론, 인슐린, 에리트로포이에틴(erythropoietin), 응고 인자, 다른 혈액 인자 또는 성분, 유전자 치료용 바이러스 벡터, 백신용 바이러스, 약재 발굴용 표적, 기능 유전체학, 및 단백질체학 분석 및 적용 등과 같이, 건강상태, 질환, 질병, 기능장애, 유전자 결함을 치료하기 위해 사용될 수 있는 치료학적으로 바람직한 폴리펩티드 또는 생산물(product)을 코딩하는 유전자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드
본 발명의 상기 신규한 핵수용체-기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템은 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 유전자 발현 카세트를 포함한다. 상기 유전자 발현 카세트, 그가 포함하는 폴리뉴클레오티드, 및 그가 코딩하는 폴리펩티드는 숙주 세포에서 유전자의 발현을 조절하기 위한 핵수용체-기초의 유전자 발현 시스템의 성분으로서 유용하다.
따라서, 본 발명은 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
특정한 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 1) 서열번호 1의 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219, 223, 234, 또는 238 아미노산 잔기, 2) 서열번호 1의 96 및 119 아미노산 잔기, 3) 서열번호 1의 110 및 128 아미노산 잔기, 4) 서열번호 1의 52 및 110 아미노산 잔기, 5) 서열번호 1의 107, 110 및 127 아미노산 잔기, 또는 6) 서열번호 1의 52, 107 및 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아미노산 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 다른 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 서열번호 1의 107 및 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아미노산 잔기의 치환 및 259 아미노산 잔기의 삽입을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 바람직한 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체 유래이다.
다른 특정한 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 1) 서열번호 1의 48 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아스파라긴, 아르기닌, 티로신, 트립토판, 루이신 또는 리신 잔기의 치환, 2) 서열번호 1의 51 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 메티오닌, 아스파라긴 또는 루이신 잔기의 치환, 3) 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신, 프롤린, 메티오닌, 아르기닌, 트립토판, 글리신, 글루타민 또는 글루탐산 잔기의 치환, 4) 서열번호 1의 54 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트립토판 또는 트레오닌의 치환, 5) 서열번호 1의 92 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신 또는 글루탐산의 치환, 6) 서열번호 1의 95 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 히스티딘, 메티오닌 또는 트립토판 잔기의 치환, 7) 서열번호 1의 96 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신, 세린, 글루탐산 또는 트립토판 잔기의 치환, 8) 서열번호 1의 109 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트립토판, 프롤린, 루이신, 메티오닌 또는 아스파라긴 잔기의 치환, 9) 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산, 트립토판 또는 아스파라긴 잔기의 치환, 10) 서열번호 1의 119 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌의 치환, 11) 서열번호 1의 120 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트립토판 또는 메티오닌의 치환, 12) 서열번호 1의 125 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산, 프롤린, 루이신, 시스테인, 트립토판, 글리신, 이소루이신, 아스파라긴, 세린, 발린 또는 아르기닌의 치환, 13) 서열번호 1의 128 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌의 치환, 14) 서열번호 1의 132 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 메티오닌, 아스파라긴, 글루탐산 또는 발린의 치환, 15) 서열번호 1의 219 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 알라닌, 리신, 트립토판 또는 티로신 잔기의 치환, 16) 서열번호 1의 223 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 리신, 아르기닌 또는 티로신 잔기의 치환, 17) 서열번호 1의 234 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 메티오닌, 아르기닌, 트립토판 또는 이소루이신의 치환, 18) 서열번호 1의 238 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린, 글루탐산, 루이신, 메티오닌 또는 티로신의 치환, 19) 서열번호 1의 119 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌 잔기 및 서열번호 1의 96 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트레오닌의 치환, 20) 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 및 서열번호 1의 128 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌의 치환, 21) 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 발린 잔기 및 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기의 치환, 22) 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신, 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 및 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린의 치환, 또는 23) 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신, 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 및 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 발린의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 다른 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신 잔기의 치환, 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기의 치환 및 서열번호 1의 259 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글리신 잔기의 삽입을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된다. 바람직한 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체 유래이다.
특정한 구현예에서, 치환 돌연변이를 포함하는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 서열번호 1의 F48Y, F48W, F48L, F48N, F48R, F48K, I51M, I51N, I51L, T52M, T52V, T52L, T52E, T52P, T52R, T52W, T52G, T52Q, M54W, M54T, M92L, M92E, R95H, R95M, R95W, V96L, V96W, V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M, F109N, A110E, A110N, A110W, N119F, Y120W, Y120M, M125P, M125R, M125E, M125L, M125C, M125W, M125G, M125I, M125N, M125S, M125V, V128F, L132M, L132N, L132V, L132E, M219K, M219W, M219Y, M219A, L223K, L223R, L223Y, L234M, L234I, L234R, L234W, W238P, W238E, W238Y, W238M, W238L, N119F/V96T, V128F/A110P, T52V/A110P, V107I/Y127E/T52V, 및 V107I/Y127E/A110P 치환 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택되는 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인이다. 다른 특정한 구현예에서, 치환 돌연변이를 포함하는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 서열번호 1의 V107I/Y127E 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함하는 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인으로서, 서열번호 1의 G259 삽입 돌연변이(V107I/Y127E/G259)를 추가로 포함한다.
다른 특정한 구현예에서, 치환 돌연변이를 포함하는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은, 500 mM 이하의 염 및 적어도 37℃에서의 교잡 단계, 및 2XSSPE로 적어도 63℃에서의 세척 단계를 포함하는 교잡 조건 하에서, 서열번호 1의 F48Y, F48W, F48L, F48N, F48R, F48K, I51M, I51N, I51L, T52M, T52V, T52L, T52E, T52P, T52R, T52W, T52G, T52Q, M54W, M54T, M92L, M92E, R95H, R95M, R95W, V96L, V96W, V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M, F109N, A110E, A110N, A110W, N119F, Y120W, Y120M, M125P, M125R, M125E, M125L, M125C, M125W, M125G, M125I, M125N, M125S, M125V, V128F, L132M, L132N, L132V, L132E, M219K, M219W, M219Y, M219A, L223K, L223R, L223Y, L234M, L234I, L234R, L234W, W238P, W238E, W238Y, W238M, W238L, N119F/V96T, V128F/A110P, T52V/A110P, V107I/Y127E/T52V, 및 V107I/Y127E/A110P로 구성된 군으로부터 선택되는 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드와 교잡하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인이다. 다른 바람직한 구현예에서, 상기 교잡 조건은 상기 교잡 및 세척 단계 모두에 대해 2XSSPE 및 63℃를 포함한다.
또한, 본 발명은 1) 본 발명에 따른 트랜스활성 도메인, DNA-결합 도메인, 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 2) 본 발명에 따른 DNA-결합 도메인 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드; 및 3) 본 발명에 따른 트랜스활성 도메인 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
특정한 구현예에서, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 1) 본 발명에 따른 트랜스활성 도메인, DNA-결합 도메인, 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 교잡 폴리펩티드; 2) 본 발명에 따른 DNA-결합 도메인 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 교잡 폴리펩티드; 및 3) 본 발명에 따른 트랜스활성 도메인 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 교잡 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 교잡 폴리펩티드를 코딩한다.
또한, 본 발명은 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 상기 치환 돌연변이는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인의 리간드 결합 활성 또는 리간드 민감성에 영향을 미친다.
다른 특정한 구현예에서, 본 발명은 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 상기 치환 돌연변이는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인의 비-엑디스테로이드 디아실히드라진 결합 활성 또는 비-엑디스테로이드 디아실히드라진 민감성을 감소시킨다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 120, 125, 219, 223, 234 또는 238 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아미노산 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 1) 서열번호 1의 48 또는 109 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아스파리긴 잔기의 치환, 2) 서열번호 1의 51, 92, 96 또는 238 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신 잔기의 치환, 3) 서열번호 1의 52, 92, 96, 125 또는 238 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기의 치환, 4) 서열번호 1의 54, 95, 96, 120, 219 또는 234 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트립토판 잔기의 치환, 5) 서열번호 1의 51, 52, 120, 234 또는 238 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 메티오닌 잔기의 치환, 6) 서열번호 1의 219 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 알라닌 잔기의 치환, 7) 서열번호 1의 48, 219 또는 223 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 리신 잔기의 치환, 8) 서열번호 1의 234 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신, 아르기닌 또는 트립토판 잔기의 치환, 9) 서열번호 1의 219 또는 238 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 티로신 잔기의 치환, 10) 서열번호 1의 125 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 발린 잔기의 치환, 11) 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글리신 또는 글루타민 잔기의 치환, 또는 12) 서열번호 1의 52 또는 223 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아르기닌 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 F48N, F48K, I51L, I51M, T52E, T52M, T52R, T52G, T52Q, M54W, M92L, M92E, R95W, V96W, V96E, V96L, F109N, Y120M, Y120W, M125E, M125V, M219A, M219K, M219W, M219Y, L223K, L223R, L234M, L234I, L234R, L234W, W238E, W238Y, W238L 또는 W238M의 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다.
아울러, 본 발명은 또한 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 상기 치환 돌연변이는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인의 리간드 결합 활성 또는 리간드 민감성을 향상시킨다.
특정한 구현예에서, 본 발명은 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 상기 치환 돌연변이는 일반적으로 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인의 엑디스테로이드 결합 활성 또는 엑디스테로이드 민감성을 향상시킨다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 1) 서열번호 1의 96 아미노산 잔기 또는 2) 서열번호 1의 96 및 119 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아미노산 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 1) 서열번호 1의 96 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 세린 잔기의 치환, 2) 서열번호 1의 96 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트레오닌 잔기 및 서열번호 1의 119 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 V96T 또는 N119F/V96T 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다.
다른 특정한 구현예에서, 본 발명은 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 상기 치환 돌연변이는 일반적으로 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인의 비-엑디스테로이드 디아실히드라진 결합 활성 또는 비-엑디스테로이드 디아실히드라진 민감성을 향상시킨다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 1) 서열번호 1의 48, 52, 54, 109, 110, 125, 132 또는 223 아미노산 잔기 또는 2) 서열번호 1의 52 및 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아미노산 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 단리된 폴리노클레오티드는 1) 서열번호 1의 48 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 티로신, 트립토판, 아르기닌 또는 루이신 잔기의 치환, 2) 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신 잔기의 치환, 3) 서열번호 1의 54 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트레오닌 잔기의 치환, 4) 서열번호 1의 109 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 메티오닌 잔기의 치환, 5) 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린, 글루탐산 또는 아스파라긴 잔기의 치환, 6) 서열번호 1의 125 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신, 아스파라긴 또는 글리신 잔기의 치환, 7) 서열번호 1의 132 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기의 치환, 8) 서열번호 1의 223 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 티로신 잔기의 치환 또는 9) 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 발린 잔기 및 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 F48Y, F48W, F48L, F48R, T52L, M54T, F109M, A110P, A110E, A110N, M125I, M125G, M125N, L132E, L223Y 또는 T52V/A110P의 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다.
다른 특정한 구현예에서, 본 발명은 치환 돌연변이를 포한하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 상기 치환 돌연변이는 일반적으로 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인의 비-엑디스테로이드 디아실히드라진 및 비-엑디스테로이드 테트라히드로퀴놀린(tetrahydroquinoline) 결합 활성 또는 비-엑디스테로이드 디아실히드라진 및 비-엑디스테로이드 테트라히드로퀴놀린 민감성을 향상시킨다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 1) 서열번호 1의 107 및 127 아미노산 잔기 또는 2) 서열번호 1의 107, 110 및 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 1) 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신 잔기 및 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기의 치환 또는 2) 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신 잔기, 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기의 치환 및 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 V107I/Y127E 또는 V107I/Y127E/A110P의 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다.
다른 특정한 구현예에서, 본 발명은 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 상기 치환 돌연변이는 일반적으로 상기 그룹 H 리간드 결합 도메인의 엑디스테로이드 결합 활성 또는 엑디스테로이드 민감성 및 비-엑디스테로이드 다이실히드라진 결합 활성 또는 비-엑디스테로이드 디아실히드라진 민감성을 향상시킨다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 1) 서열번호 1의 109, 132 아미노산 잔기 또는 W238P, 2) 서열번호 1의 52, 107 및 127 아미노산 잔기 또는 3) 서열번호 1의 107 및 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아미노산 잔기의 치환, 및 서열번호 1의 259 아미노산 잔기의 삽입을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 1) 서열번호 1의 109 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트립토판 잔기의 치환, 2) 서열번호 1의 132 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 발린 또는 메티오닌 잔기의 치환, 3) 서열번호 1의 238 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기의 치환, 4) 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신 잔기, 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기 및 서열번호 1의 132 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 발린 잔기의 치환 또는 5) 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신 잔기, 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기의 치환 및 서열번호 1의 259 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글리신 잔기의 삽입을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 F109W, L132M, L132V, W238P, V107I/Y127E/T52V 또는 V107I/Y127E/259G의 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 추가로 서열번호 1의 G259 삽입 돌연변이를 포함하는 서열번호 1의 V107I/Y127E 치환 돌연변이(V107I/Y127E/G259)를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다.
다른 특정한 구현예에서, 본 발명은 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 상기 치환 돌연변이는 일반적으로 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인의 비-엑디스테로이드 테트로히드로퀴놀린 결합 활성 또는 비-엑디스테로이드 테트라히드로퀴놀린 민감성을 향상시킨다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 110 또는 128 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아미노산 잔기의 치환 또는 서열번호 1의 110 및 128 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아미노산 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 1) 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트립토판 잔기의 치환, 2) 서열번호 1의 128 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌 잔기의 치환 또는 3) 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기 및 서열번호 1의 128 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 A110W, V128F 또는 V128F/A110P 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다.
다른 특정한 구현예에서, 본 발명은 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 상기 치환 돌연변이는 비-엑디스테로이드 디아실히드라진 리간드들에 구별되게(differentially) 반응한다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 52, 95, 109, 125 또는 132 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아미노산 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 1) 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기의 치환, 2) 서열번호 1의 95 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 히스티딘 또는 메티오닌 잔기의 치환, 3) 서열번호 1의 109 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신 잔기의 치환, 4) 서열번호 1의 125 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신, 트립토판, 아르기닌, 시스테인 또는 프롤린 잔기의 치환 또는 5) 서열번호 1의 132 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 메티오닌 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 T52P, T52W, R95H, R95M, F109L, M125L, M125W, M125R, M125C, M125P 또는 L132M 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다.
다른 특정한 구현예에서, 본 발명은 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드에 관한 것으로서, 상기 치환 돌연변이는 비-엑디스테로이드 디아실히드라진 리간드에 구별되게 반응한다. 보다 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 1) 서열번호 1의 48 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 리신 또는 아르기닌 잔기의 치환, 2) 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글리신, 글루타민, 메티오닌, 아르기닌 또는 트립토판 잔기의 치환, 3) 서열번호 1의 125 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신, 글리신, 아스파라긴, 세린 또는 발린 잔기의 치환, 4) 서열번호 1의 132 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기의 치환, 5) 서열번호 1의 219 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 리신, 트립토판 또는 티로신 잔기의 치환, 6) 서열번호 1의 223 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아르기닌 또는 티로신 잔기의 치환 또는 7) 서열번호 1의 238 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신 또는 메티오닌 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 서열번호 1의 F48K, F48R, T52G, T52Q, T52M, T52R, T52W, M125I, M125G, M125N, M125S, M125V, L132E, M219K, M219W, M219Y, L223R, L223Y, W238L 또는 W238M 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다.
아울러, 본 발명은 전사 조절 요소에 기능적으로 연결되어 있는, 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다. 바람직하게는, 치환 돌연변이를 포함하는 핵수용체 리간드 결합 도메인을 코딩하는 상기 폴리뉴클레오티드는 발현 용인(competent) 숙주 세포에서의 상기 핵수용체 리간드 결합 도메인의 발현을 허용하는 발현 조절 서열과 기능적으로 연결되어 있다. 상기 발현 조절 서열은 발현을 하고자 하는 숙주 세포에서 기능을 하는 프로모터를 포함할 수 있다. 상기 벡터는 플라스미드(plasmid) DNA 분자 또는 바이러스 벡터일 수 있다. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-연관 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 백시니아(vaccinia) 바이러스를 포함한다. 본 발명은 또한 상기에서 개시한 치환 돌연변이를 포함하는 핵수용체 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 그 게놈 내에 포함하는 복제 결함(replication defective) 재조합 바이러스에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은 또한 이러한 발현 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포에 관한 것으로서, 그 전사 조절 인자는 상기 숙주 세포에서 기능을 한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다.
본 발명의 폴리펩티드
본 발명의 상기 신규한 핵수용체-기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템은 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 적어도 하나의 유전자 발현 카세트를 포함한다. 따라서, 본 발명은 또한 본 발명에 따른 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
다른 특정한 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 1) 서열번호 1의 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219, 223, 234, 또는 238 아미노산 잔기, 2) 서열번호 1의 96 및 119 아미노산 잔기, 3) 서열번호 1의 110 및 128 아미노산 잔기, 4) 서열번호 1의 52 및 110 아미노산 잔기, 5) 서열번호 1의 107, 110 및 127 아미노산 잔기, 또는 6) 서열번호 1의 52, 107 및 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 치환 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 서열번호 1의 107 및 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 치환 돌연변이 및 259 아미노산 잔기에서의 삽입을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체 유래이다.
바람직하게는, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 1) 서열번호 1의 48 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아스파라긴, 아르기닌, 티로신, 트립토판, 루이신 또는 리신 잔기의 치환, 2) 서열번호 1의 51 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 메티오닌, 아스파라긴 또는 루이신 잔기의 치환, 3) 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신, 프롤린, 메티오닌, 아르기닌, 트립토판, 글리신, 글루타민 또는 글루탐산 잔기의 치환, 4) 서열번호 1의 54 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트립토판 또는 트레오닌의 치환, 5) 서열번호 1의 92 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신 또는 글루탐산의 치환, 6) 서열번호 1의 95 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 히스티딘, 메티오닌 또는 트립토판 잔기의 치환, 7) 서열번호 1의 96 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신, 세린, 글루탐산 또는 트립토판 잔기의 치환, 8) 서열번호 1의 109 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트립토판, 프롤린, 루이신, 메티오닌 또는 아스파라긴 잔기의 치환, 9) 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산, 트립토판 또는 아스파라긴 잔기의 치환, 10) 서열번호 1의 119 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌의 치환, 11) 서열번호 1의 120 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트립토판 또는 메티오닌의 치환, 12) 서열번호 1의 125 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산, 프롤린, 루이신, 시스테인, 트립토판, 글리신, 이소루이신, 아스파라긴, 세린, 발린 또는 아르기닌의 치환, 13) 서열번호 1의 128 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌의 치환, 14) 서열번호 1의 132 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 메티오닌, 아스파라긴, 글루탐산 또는 발린의 치환, 15) 서열번호 1의 219 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 알라닌, 리신, 트립토판 또는 티로신 잔기의 치환, 16) 서열번호 1의 223 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 리신, 아르기닌 또는 티로신 잔기의 치환, 17) 서열번호 1의 234 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 메티오닌, 아르기닌, 트립토판 또는 이소루이신의 치환, 18) 서열번호 1의 238 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린, 글루탐산, 루이신, 메티오닌 또는 티로신의 치환, 19) 서열번호 1의 119 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌 잔기 및 서열번호 1의 96 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트레오닌의 치환, 20) 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기 및 서열번호 1의 128 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌 잔기의 치환, 21) 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 발린 잔기 및 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기의 치환, 22) 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신 잔기, 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기 및 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기의 치환, 또는 23) 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신, 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 및 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 발린의 치환을 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신 잔기의 치환, 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기의 치환 및 서열번호 1의 259 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글리신 잔기의 삽입을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체 유래이다.
특정한 구현예에서, 치환 돌연변이를 포함하는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드이며, 상기 치환 돌연변이는 서열번호 1의 F48Y, F48W, F48L, F48N, F48R, F48K, I51M, I51N, I51L, T52M, T52V, T52L, T52E, T52P, T52R, T52W, T52G, T52Q, M54W, M54T, M92L, M92E, R95H, R95M, R95W, V96L, V96W, V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M, F109N, A110E, A110N, A110W, N119F, Y120W, Y120M, M125P, M125R, M125E, M125L, M125C, M125W, M125G, M125I, M125N, M125S, M125V, V128F, L132M, L132N, L132V, L132E, M219K, M219W, M219Y, M219A, L223K, L223R, L223Y, L234M, L234I, L234R, L234W, W238P, W238E, W238Y, W238M, W238L, N119F/V96T, V128F/A110P, T52V/A110P, V107I/Y127E/T52V, 및 V107I/Y127E/A110P 치환 돌연변이로 구성된 군으로부터 선택된다. 다른 구현예에서, 치환 돌연변이를 포함하는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 서열번호 1의 V107I/Y127E 치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인 폴리펩티드로서, 서열번호 1의 G259 삽입 돌연변이(V107I/Y127E/G259)를 추가로 포함한다.
또한, 본 발명은 1) 본 발명에 따른 트랜스활성 도메인, DNA-결합 도메인, 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드; 2) 본 발명에 따른 DNA-결합 도메인 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드; 및 3) 본 발명에 따른 트랜스활성 도메인 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 단리된 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체 유래이다.
또한, 본 발명은 1) 본 발명에 따른 트랜스활성 도메인, DNA-결합 도메인, 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 단리된 교잡 폴리펩티드; 2) 본 발명에 따른 DNA-결합 도메인 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 단리된 교잡 폴리펩티드; 및 3) 본 발명에 따른 트랜스활성 도메인 및 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 단리된 교잡 폴리펩티드로 구성된 군으로부터 선택되는 단리된 교잡 폴리펩티드를 제공한다. 바람직한 구현예에서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체 유래이다.
또한, 본 발명은 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인의 리간드 결합 활성 또는 리간드 민감성에 영향을 미치는 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드를 제공한다.
특히, 본 발명은 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인의 리간드 결합 활성 또는 리간드 민감성을 감소시키는 치환 돌연변이를 포함하는 리간드 결합 도메인을 포함하는 단리된 그룹 H 핵수용체 폴리펩티드에 관한 것이다.
다른 특정한 구현예에서, 본 발명은 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인의 비-엑디스테로이드 디아실히드라진 결합 활성 또는 비-엑디스테로이드 디아실히드라진 민감성을 감소시키는 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 서열번호 1의 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 120, 125, 219, 223, 234 또는 238 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 1) 서열번호 1의 48 또는 109 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아스파리긴 잔기의 치환, 2) 서열번호 1의 51, 92, 96 또는 238 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신 잔기의 치환, 3) 서열번호 1의 52, 92, 96, 125 또는 238 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기의 치환, 4) 서열번호 1의 54, 95, 96, 120, 219 또는 234 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트립토판 잔기의 치환, 5) 서열번호 1의 51, 52, 120, 234 또는 238 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 메티오닌 잔기의 치환, 6) 서열번호 1의 219 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 알라닌 잔기의 치환, 7) 서열번호 1의 48, 219 또는 223 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 리신 잔기의 치환, 8) 서열번호 1의 234 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신, 아르기닌 또는 트립토판 잔기의 치환, 9) 서열번호 1의 219 또는 238 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 티로신 잔기의 치환, 10) 서열번호 1의 52 또는 223 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아르기닌 잔기의 치환, 11) 서열번호 1의 125 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 발린 잔기의 치환, 또는 12) 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글리신 또는 글루타민 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 서열번호 1의 F48N, I51L, I51M, T52E, T52M, T52R, T52G, T52Q, M54W, M92L, M92E, R95W, V96W, V96E, V96L, F109N, Y120M, Y120W, M125E, M125V, M219A, M219K, M219W, M219Y, L223K, L223R, L234M, L234I, L234W, L234R, W238E, W238L, W238M 또는 W238Y의 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다.
아울러, 본 발명은 또한 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인의 리간드 결합 활성 또는 리간드 민감성을 향상시키는 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다.
특정한 구현예에서, 본 발명은 일반적으로 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인의 엑디스테로이드 결합 활성 또는 엑디스테로이드 민감성을 향상시키는 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 1) 서열번호 1의 96 아미노산 잔기 또는 2) 서열번호 1의 96 및 119 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아미노산 잔기의 치환을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 1) 서열번호 1의 96 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 세린 잔기의 치환, 2) 서열번호 1의 96 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트레오닌 잔기 및 서열번호 1의 119 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 서열번호 1의 V96T 또는 N119F/V96T 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다.
다른 특정한 구현예에서, 본 발명은 일반적으로 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인의 디아실히드라진 결합 활성 또는 디아실히드라진 민감성을 향상시키는 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 1) 서열번호 1의 48, 52, 54, 109, 110, 125, 132 또는 223 아미노산 잔기 또는 2) 서열번호 1의 52 및 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아미노산 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 단리된 펩티드는 1) 서열번호 1의 48 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 티로신, 트립토판, 아르기닌 또는 루이신 잔기의 치환, 2) 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신 잔기의 치환, 3) 서열번호 1의 54 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트레오닌 잔기의 치환, 4) 서열번호 1의 109 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 메티오닌 잔기의 치환, 5) 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린, 글루탐산 또는 아스파라긴 잔기의 치환, 6) 서열번호 1의 125 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신, 아스파라긴 또는 글리신 잔기의 치환, 7) 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 발린 잔기, 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기의 치환, 8) 서열번호 1의 132 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기의 치환 또는 9) 서열번호 1의 223 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 티로신 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 서열번호 1의 F48Y, F48W, F48L, F48R, T52L, M54T, F109M, A110P, A110E, A110N, M125I, M125G, M125N, L132E, L223Y 또는 T52V/A110P의 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다.
다른 특정한 구현예에서, 본 발명은 일반적으로 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인의 엑디스테로이드 결합 활성 또는 엑디스테로이드 민감성 및 비-엑디스테로이드 디아실히드라진 결합 활성 또는 비-엑디스테로이드 디아실히드라진 민감성 모두를 향상시키는 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 1) 서열번호 1의 109, 132 아미노산 잔기 또는 W238P, 2) 서열번호 1의 52, 107 및 127 아미노산 잔기 또는 3) 서열번호 1의 107 및 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아미노산 잔기의 치환, 및 서열번호 1의 259 아미노산 잔기의 삽입을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 1) 서열번호 1의 109 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트립토판 잔기의 치환, 2) 서열번호 1의 132 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 발린 또는 메티오닌 잔기의 치환, 3) 서열번호 1의 238 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기의 치환, 4) 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신 잔기, 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기 및 서열번호 1의 132 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 발린 잔기의 치환 또는 5) 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신 잔기, 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기의 치환 및 서열번호 1의 259 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글리신 잔기의 삽입을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 서열번호 1의 F109W, L132M, L132V, W238P 또는 V107I/Y127E/T52V의 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 상기 단리된 폴리펩티드는 서열번호 1의 V107I/Y127E 치환 돌연변이(V107I/Y127E/G259)를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함하며, 추가로 서열번호 1의 G259 삽입 돌연변이를 포함한다.
다른 특정한 구현예에서, 본 발명은 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것으로서, 상기 치환 돌연변이는 일반적으로 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인의 디아실히드라진 및 테트라히드로퀴놀린 결합 활성 또는 디아실히드라진 및 테트라히드로퀴놀린 민감성을 향상시킨다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 1) 서열번호 1의 107 및 127 아미노산 잔기 또는 2) 서열번호 1의 107, 110 및 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 잔기의 치환을 일으키는 치환 돌연변이를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 1) 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신 잔기 및 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기의 치환 또는 2) 서열번호 1의 107 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신 잔기, 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기의 치환 및 서열번호 1의 127 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 서열번호 1의 V107I/Y127E 또는 V107I/Y127E/A110P의 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다.
다른 특정한 구현예에서, 본 발명은 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것으로서, 상기 치환 돌연변이는 일반적으로 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인의 비-엑디스테로이드 테트라히드로퀴놀린 결합 활성 또는 비-엑디스테로이드 테트라히드로퀴놀린 민감성을 향상시킨다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 1) 서열번호 1의 110 또는 128 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아미노산 잔기 또는 2) 서열번호 1의 110 및 128 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아미노산 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 1) 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 트립토판 잔기, 2) 서열번호 1의 128 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌 잔기 또는 3) 서열번호 1의 110 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기 및 서열번호 1의 128 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 페닐알라닌 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 서열번호 1의 A110W, V128F 또는 V128F/A110P 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다.
다른 바람직한 구현예에서, 본 발명은 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것으로서, 상기 치환 돌연변이는 비-엑디스테로이드 디아실히드라진 리간드에 구별되게 반응한다. 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 서열번호 1의 52, 95, 109, 125 또는 132 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아미노산 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 1) 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 프롤린 잔기의 치환, 2) 서열번호 1의 95 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 히스티딘 또는 메티오닌 잔기의 치환, 3) 서열번호 1의 109 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신 잔기의 치환, 4) 서열번호 1의 125 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신, 트립토판, 아르기닌, 시스테인 또는 프롤린 잔기의 치환 또는 5) 서열번호 1의 132 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 메티오닌 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 서열번호 1의 T52P, R95H, R95M, F109L, M125L, M125W, M125R, M125C, M125P 또는 L132M 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다.
다른 특정한 구현예에서, 본 발명은 치환 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드에 관한 것으로서, 상기 치환 돌연변이는 비-엑디스테로이드 디아실히드라진 리간드에 구별되게 반응한다. 보다 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 1) 서열번호 1의 48 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 리신 또는 아르기닌 잔기의 치환, 2) 서열번호 1의 52 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글리신, 글루타민, 메티오닌, 아르기닌 또는 트립토판 잔기의 치환, 3) 서열번호 1의 125 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 이소루이신, 글리신, 아스파라긴, 세린 또는 발린 잔기의 치환, 4) 서열번호 1의 132 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 글루탐산 잔기의 치환, 5) 서열번호 1의 219 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 리신, 트립토판 또는 티로신 잔기의 치환, 6) 서열번호 1의 223 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 아르기닌 또는 티로신 잔기의 치환 또는 7) 서열번호 1의 238 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에서의 루이신 또는 메티오닌 잔기의 치환을 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다. 보다 더 바람직하게는, 상기 단리된 폴리펩티드는 서열번호 1의 F48K, F48R, T52G, T52Q, T52M, T52R, T52W, M125I, M125G, M125N, M125S, M125V, L132E, M219K, M219W, M219Y, L223R, L223Y, W238L 또는 W238M 치환 돌연변이를 일으키는 코돈 돌연변이를 포함한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 단리된 폴리펩티드를 포함하는 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 유전자 발현 조절 방법
본 발명자들의 발명은 또한 본 발명에 따른 유전자 발현 조절 시스템을 이용하여 숙주 세포에서 유전자 발현을 조절하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명자들의 발명은 1) 본 발명에 따른 유전자 발현 조절 시스템을 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 2) 상기 숙주 세포에 리간드를 도입하는 단계를 포함하는 숙주 세포에서 유전자 발현을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 조절되는 유전자는 ⅰ) 상기 유전자 발현 시스템의 DNA 결합 도메인에 의해 인식되는 도메인을 포함하는 반응 요소; ⅱ) 상기 유전자 발현 시스템의 트랜스활성 도메인에 의해 활성화되는 프로모터; 및 ⅲ) 그 발현이 조절되는 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트의 성분이며, 상기 숙주 세포 내로 상기 리간드가 도입되면 상기 유전자의 발현이 조절된다.
또한, 본 발명은 1) 본 발명에 따른 유전자 발현 조절 시스템을 상기 숙주 세포에 도입하는 단계; 2) 본 발명에 따른 유전자 발현 카세트를 상기 숙주 세포에 도입하는 단계로서, 상기 유전자 발현 카세트는 ⅰ)상기 유전자 발현 시스템 유래의 DNA 결합 도메인에 의해 인식되는 도메인을 포함하는 반응 요소; ⅱ) 상기 유전자 발현 시스템의 트랜스활성 도메인에 의해 활성화되는 프로모터; 및 ⅲ) 그 발현이 조절되는 유전자를 포함하며; 및 3) 상기 숙주 세포에 리간드를 도입하는 단계를 포함하는 숙주 세포에서 유전자의 발현을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 숙주 세포 내로 상기 리간드가 도입되면 상기 유전자의 발현이 조절된다.
본 발명자들의 발명은 또한 상기 유전자 발현 조절 시스템의 제1 교잡 폴리펩티드 유래의 DNA 결합 도메인이 결합하는 도메인을 포함하는 반응 요소; 상기 유전자 발현 조절 시스템의 제2 교잡 폴리펩티드의 트랜스활성 도메인에 의해 활성화되는 프로모터; 및 그 발현이 조절되는 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트를 포함하는 주 세포에서 유전자의 발현을 조절하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 1) 본 발명에 따른 유전자 발현 조절 시스템을 상기 숙주 세포에 도입하는 단계; 및 2) 상기 숙주 세포에 리간드를 도입하는 단계를 포함하고, 상기 숙주 세포 내로 상기 리간드가 도입되면 상기 유전자의 발현이 조절된다.
본 발명자들의 방법을 이용하여 숙주 세포에서 발현하기 위한 관심있는 유전자는 내인성 유전자 또는 외인성 유전자일 수 있다. 원하는 유전자 또는 단백질에 대한 핵산 또는 아미노산 서열 정보는, 예를 들면 GENBANK, EMBL, Swiss-Prot, 및 PIR과 같은 많은 공개적으로 접근가능한 데이터베이스 중 하나, 또는 많은 생물학 관련 논문 발표물 내에 위치할 수 있다. 따라서, 해당 분야에 능숙한 사람들은 실질적으로 모든 공지된 유전자에 대한 핵산 서열 정보에 접근한다. 이러한 정보는 이후 본 명세서에서 개시된 본 발명자들의 방법에서 사용되는 상기 유전자 발현 카세트의 내부에 관심있는 유전자를 삽입시키기 위한 바람직한 구축물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명자들의 방법을 이용하여 숙주 세포에서 발현하기 위한 관심있는 유전자의 예로는, 백신, 효소 유사 알파-아밀라제, 파이타제(phytase), 글루칸스(glucanes), 자일라제(xylase) 및 자일라나제(xylanase)와 같은 식물에서 생산된 항원, 곤충, 선충류(nematode), 진균류, 세균, 바이러스에 대해 저항성을 갖는 유전자, 비생물적 스트레스, 기능식품(nutraceutical), 조제약(pharmaceutical), 비타민, 아미노산 함량, 제초제 저항성, 추위, 가뭄, 및 열 내성을 변형시키는 유전자, 산업 생산물, 오일, 단백질, 탄수화물, 항산화제, 수컷 불임 식물(mail sterile plant), 꽃, 연료, 다른 출력 형질(output trait), 단일클론 항체, 프로테아제, 사이토카인, 인터페론, 인슐린, 에리트로포이에틴, 응고 인자, 다른 혈액 인자 또는 성분, 유전자 치료용 바이러스 벡터, 백신용 바이러스, 약재 발굴용 표적, 기능 유전체학, 및 단백질체학 분석 및 적용 등과 같이, 건강상태, 질환, 질병, 기능장애, 유전자 결함을 치료하기 위해 사용될 수 있는 치료학적으로 바람직한 폴리펩티드 또는 생산물을 코딩하는 유전자를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
허용가능한 리간드는, 본 발명에 따른 상기 유전자 발현 시스템의 DNA 결합 도메인이 리간드의 존재 하에 상기 반응 요소에 결합할 때 상기 유전자 발현의 활성화 또는 억제를 일으킬 때, 유전자의 발현을 조절하는 임의의 것이다. 바람직한 리간드는 엑디손, 20-히드록시엑디손, 포나스테론 A, 무리스테론 A, 등과 같은 엑디스테로이드, 9-시스-레티노산, 레티노산의 합성 상동체, 미국 특허 6,013,836; 5,117,057; 5,530,028; 5,378,726; 및 미국 특허 출원 10/775,883 및 10/787,906에 개시된 것과 같은 N,N'-디아실히드라진; 유럽 출원 461,809에 개시된 것과 같은 디벤조일알킬(dibenzoylalkyl) 시아노히드라진; 미국 특허 5,225,443에 개시된 것과 같은 N-알킬-N,N'-디아로일히드라진(diaroylhydrazine); 유럽 출원 234,994에 개시된 것과 같은 N-아실-N-알킬카르보닐히드라진; 미국 특허 4,985,461에 개시된 것과 같은 N-아로일-N-알킬-N'-아로일히드라진; 국제 출원 PCT/US03/00915에 개시된 것과 같은 테트라히드로퀴놀린을 포함하고, 이들 각각은 본 명세서에 참조로 포함되어 있으며, 다른 유사한 물질로는 3,5-디-tert-부틸-4-히드록시-N-이소부틸-벤즈아미드(benzamide), 8-O-아세틸하르파기드(acetylharpagide), 옥시스테롤, 22(R) 히드록시콜레스테롤, 24(S) 히드록시콜레스테롤, 25-에폭시콜레스테롤, T0901317, 5-알파-6-알파-에폭시콜레스테롤-3-설페이트(ECHS), 7-케토폴레스테롤-3-설페이트, 파네솔, 담즙산, 1,1-비포스포네이트 에스테르, 미숙 호르몬 Ⅲ 등을 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명자들의 유전자의 발현을 조절하는 방법에서 사용되기 위한 리간드는 하기 식의 화합물이다:
Figure 112006088387352-PCT00002
상기에서, E는 분지된 (C4-C12)알킬 또는 3차(tertiary) 탄소를 포함하는 분지된 (C4-C12)알케닐 또는 3차 탄소를 포함하는 시아노(C3-C12)알킬이고;
R1은 H, Me, Et, i-Pr, F, 포밀(formyl), CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, CoCH, 1-프로피닐(propynyl), 2-프로피닐, 비닐, OH, OMe, OEt, 사이클로프로필, CF2CF3, CH=CHCN, 알릴(allyl), 아지도(azido), SCN, 또는 SCHF2 이고;
R2는 H, Me, Et, N-Pr, i-Pr, 포밀, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, CoCH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe2, NEt2, SMe, SEt, SOCF3, OCF2CF2H, COEt, 사이클로프로필, CF2CF3, CH=CHCN, 알릴, 아지도, OCF3, OCHF2, O-i-Pr, SCN, SCHF2, SOMe, NH-CN, 또는 R3과 결합되고, R2 및 R3이 부착되는 상기 페닐 탄소는 에틸렌디옥시, 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디히드로퓨릴(dihydrofuryl) 고리, 또는 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디히드로피릴(dihydropyryl) 고리를 형성하며;
R3은 H, Et, 또는 R2와 결합되고, R2 및 R3이 부착되는 상기 페닐 탄소는 에틸렌디옥시, 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디히드로퓨릴 고리, 또는 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디히드로피릴 고리를 형성하며;
R4, R5 및 R6은 독립적으로 H, Me, Et, F, Cl, Br, 포밀, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CN, CoCH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OMe, OEt, SMe, 또는 세트(set)이다.
다른 바람직한 구현예에서, 유전자의 발현을 조절하는 본 발명자들의 방법에서 사용되기 위한 리간드는 하기 식의 화합물이다;
Figure 112006088387352-PCT00003
상기에서, R1 내지 R4는 다음과 같다.
Figure 112006088387352-PCT00004
다른 바람직한 구현예에서, 유전자의 발현을 조절하는 본 발명자들의 방법에서 사용되기 위한 리간드는 하기 식의 화합물이다;
Figure 112006088387352-PCT00005
상기에서, R1 내지 R6 및 E는 다음과 같다.
Figure 112006088387352-PCT00006
추가 바람직한 구현예에서, 유전자의 발현을 조절하는 본 발명자들의 방법에서 사용되기 위한 리간드는 하기 식의 화합물이다;
Figure 112006088387352-PCT00007
상기에서, R1 내지 R3은 다음과 같다.
Figure 112006088387352-PCT00008
다른 바람직한 구현예에서, 유전자의 발현을 조절하는 본 발명자들의 방법에서 사용되기 위한 리간드는 엑디손, 20-히드록시엑디손, 포나스테론 A, 무리스테론 A, 옥시스테롤, 22(R) 히드록시콜레스테롤, 24(S) 히드록시콜레스테롤, 25-에폭시콜레스테롤, T0901317, 5-알파-6-알파-에폭시콜레스테롤-3-설페이트(ECHS), 7-케토폴레스테롤-3-설페이트, 파네솔, 담즙산, 1,1-비포스포네이트 에스테르, 미숙 호르몬 Ⅲ이다.
다른 바람직한 구현예에서, 유전자의 발현을 조절하기 위한 본 발명자들의 상기 방법에서 논의된 제1 리간드에 더하여 제2 리간드가 사용될 수 있다. 바람직하게는, 상기 제2 리간드는 9-시스-레티노산 또는 레티노산의 합성 상동체이다.
본 발명의 숙주 세포 및 비-인간 생명체
상기에서 개시한 바와 같이, 본 발명의 상기 유전자 발현 조절 시스템은 숙주 세포에서 유전자 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 유전자이식 숙주 세포에서의 발현은 관심있는 다양한 유전자의 발현에 유용할 수 있다. 본 발명자들의 발명은 원핵생물 및 진핵생물 숙주 세포에서 유전자 발현의 조절을 제공한다. 유전자이식 숙주 세포에서의 발현은, 백신, 효소 유사 알파-아밀라제, 파이타제, 글루칸스, 자일라제 및 자일라나제와 같은 식물에서 생산된 항원, 곤충, 선충류, 진균류, 세균, 바이러스에 대해 저항성을 갖는 유전자, 비생물적 스트레스, 기능식품, 조제약, 비타민, 아미노산 함량, 제초제 저항성, 추위, 가뭄, 및 열 내성을 변형시키는 유전자, 산업 생산물, 오일, 단백질, 탄수화물, 항산화제, 수컷 불임 식물, 꽃, 연료, 다른 출력 형질, 치료 폴리펩티드, 경로 중간체(pathway intermediate)를 포함하고 이에 한정되지는 않는 관심있는 다양한 폴리펩티드의 발현; 상기 숙주를 이용하여 지금까지는 가능하지 않은 새로운 생산물을 합성하기 위한 상기 숙주에 이미 존재하는 경로의 조절; 기능 유전체학 분석, 바이오치료(biotherapeutic) 단백질 생산, 단백질체학 분석, 등에 유용하다. 추가적으로, 상기 유전자 생산물은 상기 숙주에 더 높은 성장 수율을 부여하거나, 또는 이용될 수 있는 다른 성장 모드(mode)를 제공하기 위해 유용할 수 있다.
따라서, 본 발명자들의 발명은 본 발명에 따른 유전자 발현 시스템을 포함하는 단리된 숙주 세포를 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 유전자 발현 카세트를 포함하는 단리된 숙주 세포를 제공한다. 또한, 본 발명자들의 발명은 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 포함하는 단리된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명은 또한 본 발명에 따른 발현 벡터로 전달감염된 숙주 세포에 관한 것이다. 상기 숙주 세포는 세균 세포, 진균 세포, 선충 세포, 곤충 세포, 물고기 세포, 식물 세포, 조류 세포, 동물 세포, 또는 포유동물 세포일 수 있다. 또 다른 구현예에서, 본 발명은 치환 돌연변이를 포함하는 핵수용체 리간드 결합 도메인을 제조하기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기에서 개시한 숙주 세포를 치환 돌연변이를 포함하는 상기 핵수용체 리간드 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 발현을 허용하는 조건 하에 배양 배지에서 배양하는 단계; 및 상기 배지로부터 치환 돌연변이를 포함하는 상기 핵수용체 리간드 결합 도메인을 단리하는 단계를 포함한다.
특정한 구현예에서, 상기 단리된 숙주 세포는 무척추동물 숙주 세포 또는 척추동물 숙주 세포이다. 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 세균 세포, 진균 세포, 효모 세포, 선충 세포, 곤충 세포, 물고기 세포, 식물 세포, 조류 세포, 동물 세포, 및 포유동물 세포로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 숙주 세포는 효모 세포, 선충 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 제브라피쉬(zebrafish) 세포, 닭 세포, 햄스터 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 토끼 세포, 고양이 세포, 개 세포, 소(bovine) 세포, 염소 세포, 젖소(cow) 세포, 돼지 세포, 말 세포, 양 세포, 유인원 세포, 원숭이 세포, 침팬지 세포, 또는 인간 세포이다. 바람직한 숙주 세포의 예로는 아스퍼질러스(Aspergillus), 트리코더마(Trichoderma), 사카로마이세스(Saccharomyces), 피키아(Pichia), 칸디다(Candida), 한세눌라(Hansenula)와 같은 진균류 또는 효모 종, 또는 시네코시스티스(Synechocystis), 시네코코쿠스(Synechococcus), 살모넬라(Salmonella), 바실러스(Bacillus), 아시네토박터(Acinetobacter), 로도코쿠스(Rhodococcus), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 에스케리치아(Escherichia), 슈도모나스(Pseudomonas), 메틸로모나스(Methylomonas), 메틸로박터(Methylobacter), 알칼리진스(Alcaligenes), 시네코시스티스(Synechocystis), 아나배나(Anabaena), 티오바실러스(Thiobacillus), 메타노박테리움(Methanobacterium) 및 클레브시엘라(Klebsiella) 속(genera)의 것과 같은 세균 종; 사과, 애기장대(Arabidopsis), 바즈라(bajra), 바나나, 보리, 강낭콩(bean), 무(beet), 블랙그람(blackgram), 병아리콩(chickpea), 칠리, 오이, 가지, 잠두(favabean), 옥수수, 멜론, 기장(millet), 녹두, 귀리, 오크라(okra), 개기장(panicum), 파파야, 땅콩, 완두, 고추, 피죤피(pigeonpea), 파인애플, 팥(Phaseolus), 감자, 호박, 쌀, 수수, 콩, 스쿼시(squash), 사탕수수, 사탕무(sugarbeet), 해바라기, 고구마, 녹차, 토마토, 담배, 수박, 및 밀로 구성된 군으로부터 선택되는 식물 종; 동물; 및 포유동물 숙주 세포를 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.
특정한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 사카로마이세스, 피키아, 칸디다 숙주 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 효모 세포이다.
다른 특정한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 캐노르하브두스 엘레간스(Caenorhabdus elegans) 선충 세포이다.
다른 특정한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 곤충 세포이다.
다른 특정한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 사과, 애기장대, 바즈라, 바나나, 보리, 강낭콩, 무, 블랙그람, 병아리콩, 칠리, 오이, 가지, 잠두, 옥수수, 멜론, 기장, 녹두, 귀리, 오크라, 개기장, 파파야, 땅콩, 완두, 고추, 피죤피, 파인애플, 팥, 감자, 호박, 쌀, 수수, 콩, 스쿼시, 사탕수수, 사탕무, 해바라기, 고구마, 녹차, 토마토, 담배, 수박, 및 밀 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 식물 세포이다.
다른 구현예에서, 상기 숙주 세포는 제브라피쉬 세포이다.
다른 특정한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 닭 세포이다.
다른 특정한 구현예에서, 상기 숙주 세포는 햄스터 세포, 마우스 세포, 래트 세포, 토끼 세포, 고양이 세포, 개 세포, 소 세포, 염소 세포, 젖소 세포, 돼지 세포, 말 세포, 양 세포, 원숭이 세포, 침팬지 세포, 및 인간 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 포유동물 세포이다.
숙주 세포 형질전환은 기술 분야에서 잘 알려져 있으며, 전기천공법, 바이러스 감염, 플라스미드/벡터 전달감염, 비-바이러스 벡터 매개성 전달감염, 아그로박테리움-매개성 형질전환, 입자 포격(particle bombardment), 등을 포함하는 다양한 방법에 의해 달성될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 원하는 유전자 산물의 발현은 적당한 조건 하에서 형질전환된 숙주 세포를 배양하는 단계 및 상기 형질전환된 유전자의 발현을 유도하는 단계를 포함한다. 원핵생물 및 진핵생물에서의 배양 조건 및 유전자 발현 프로토콜(protocol)은 기술 분야에서 잘 알려져 있다(실시예의 일반적인 방법 부분 참조). 세포는 수확(harvest)될 수 있고, 유전자 생산물은 상기 유전자 생산물에 특이적인 프로토콜에 따라 단리될 수 있다.
아울러, 숙주 세포는 삽입된 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하거나, 또는 그 폴리펩티드 생산물을 원하는 특정한 방식으로 변형 및 가공(process)하도록 선택될 수 있다. 다른 숙주 세포는 단백질의 번역 및 번역후 처리 및 변형(예를 들면, 글리코실화, (예컨대, 신호 서열의) 절단)을 위한 독특허가 특징적인 메카니즘을 갖고 있다. 적당한 세포주 및 숙주 시스템이 발현된 상기 외래 단백질의 원하는 변형 및 가공을 보증하도록 선택될 수 있다. 예를 들면, 세균 시스템에서의 발현은 비-글리코실화된 코어(core) 단백질 생산물을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 세균에서 발현된 폴리펩티드는 올바르게 접혀지지 않을 수 있다. 효모에서의 발현은 글리코실화된 생산물을 제조할 수 있다. 진핵생물 세포에서의 발현은 이형 단백질의 "자연형" 글리코실화 및 접힘 가능성을 증가시킬 수 있다. 아울러, 포유동물 세포에서의 발현은 폴리펩티드 활성을 재구성 또는 구성하기 위한 도구를 제공할 수 있다. 아울러, 다른 벡터/숙주 발현 시스템은 단백질 가수분해적 절단과 같은 가공 반응에 다른 정도로 영향을 미칠 수 있다.
본 발명자들의 발명은 또한 본 발명에 따른 단리된 숙주 세포를 포함하는 비-인간 생명체에 관한 것이다. 특정한 구현예에서, 상기 비-인간 생명체는 원핵생물 생명체 또는 진핵생물 생명체이다. 다른 특정한 구현예에서, 상기 비-인간 생명체는 무척추동물 생명체 또는 척추동물 생명체이다.
바람직하게는, 상기 비-인간 생명체는 세균, 진균, 효모, 선충, 곤충, 물고기, 식물, 새, 동물, 및 포유동물로 구성된 군으로부터 선택된다. 보다 바람직하게는, 상기 비-인간 생명체는 효모, 선충, 곤충, 식물, 제브라피쉬, 닭, 햄스터, 마우스, 래트, 토끼, 고양이, 개, 소, 염소, 젖소, 돼지, 말, 양, 유인원, 원숭이, 또는 침팬지이다.
특정한 구현예에서, 상기 비-인간 생명체는 사카로마이세스, 피키아, 및 칸디다로 구성된 군으로부터 선택되는 효모이다.
다른 특정한 구현예에서, 상기 비-인간 생명체는 캐노르하브두스 엘레간스 선충이다.
다른 특정한 구현예에서, 상기 비-인간 생명체는 사과, 애기장대, 바즈라, 바나나, 보리, 강낭콩, 무, 블랙그람, 병아리콩, 칠리, 오이, 가지, 잠두, 옥수수, 멜론, 기장, 녹두, 귀리, 오크라, 개기장, 파파야, 땅콩, 완두, 고추, 피죤피, 파인애플, 팥, 감자, 호박, 쌀, 수수, 콩, 스쿼시, 사탕수수, 사탕무, 해바라기, 고구마, 녹차, 토마토, 담배, 수박, 및 밀로 구성된 군으로부터 선택된다.
유전자 발현/전사의 측정
본 발명의 본 발명자들의 방법의 한 유용한 측정(measurement)은, RNA, 바람직하게는 mRNA 종의 동정 및 대량(abundance)을 포함하는 세포의 전사 상태이다. 이러한 측정은 몇 가지 존재하는 임의의 유전자 발현 기술에 의해 cDNA 대량을 측정함으로써 편리하게 수행된다.
핵산 배열(array) 기술은 구별되는 mRNA 발현을 결정하기 위한 유용한 기술이다. 이러한 기술은 예를 들면 올리고뉴클레오티드 칩 및 DNA 마이크로배열을 포함한다. 상기 기술은, 고형 지지체에 고정되어 프로브와 교잡하는, 세포, 조직, 또는 전체 생명체로부터 추출되어 cDNA로 변환된 총 mRNA 풀(pool)로부터 준비된 다른 유전자 또는 cDNA에 대응하는 DNA 절편 또는 올리고뉴클레오티드에 의존한다. 올리고뉴클레오티드 칩은 포토리쏘그래피(photolithography) 기술을 이용하여 기질 상에 합성된 올리고뉴클레오티드의 배열이다. 칩은 1,700개 유전자까지 분석할 수 있도록 제조되고 있다. DNA 마이크로배열은 DNA 샘플, 전형적으로는 PCR 생산물의 배열이며, 현미경 슬라이드 상에 로봇을 이용하여 프린트된다. 각 유전자는 전체 또는 부분-길이의 표적 DNA 서열에 의해 분석된다. 10,000 유전자에 달하는 마이크로배열이 현재 상업적으로 일상적으로 제조된다. 상기 두 가지 기술의 1차적인 차이점은 올리고뉴클레오티드 칩은 전형적으로 짧은 DNA 분자의 절편화를 허용하는 25-mer 올리고뉴클레오티드를 이용하는 반면, 대략 1,000 염기쌍에 달하는 마이크로배열의 더 큰 DNA 표적은 복잡한 DNA 혼합물의 절편화에 더 큰 민감성을 제공할 수 있다.
본 발명의 본 발명자들의 방법의 다른 유용한 측정은 해당 분야에 잘 알려진 방법을 이용하여 세포에 존재하는 구성 단백질 종의 대량을 측정함으로써 세포의 번역 단계를 결정하는 것이다.
다양한 생리학적 기능과 연관되어 있는 유전자의 동정을 원하는 곳에서는, 세포 성장, 아폽토시스(apoptosis), 노화(senescence), 분화, 부착, 특정한 분자에 결합, 다른 세포에 결합, 세포 구조(cellular organization), 기관 형성, 세포 내 운반, 운반 촉진, 에너지 전환, 대사, 근육발생, 신경발생, 및/또는 조혈작용과 같은 기능의 변화가 측정되는 분석이 도입될 수 있다.
아울러, 선택된 마커(marker) 또는 리포터(reporter) 유전자의 발현은 본 발명자들의 발명을 이용한 유전자 발현 조절을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
유전자 발현의 생산물을 검출하기 위한 다른 방법은 해당 분야에서 잘 공지되어 있으며, 서던 블롯(Southern blot, DNA 검출), 도트(dot) 또는 슬롯(slot) 블롯(DNA, RNA), 노던(Northern) 블롯(RNA), RT-PCR(RNA), 웨스턴(Western) 블롯(폴리펩티드 검출), 및 엘리자(ELISA, 폴리펩티드) 분석을 포함한다. 덜 선호되지만, 표지된(labeled) 단백질이 그가 교잡하는 특정한 핵산 서열을 검출하기 위해 사용될 수 있다.
어떤 경우에 있어서, 핵산 서열의 양을 증폭하는 것이 필요하다. 이것은 예를 들면 폴리머라제 연쇄 반응("PCR"), 리가제 연쇄 반응("LCR"), 가닥 교체 증폭("SDA"), 전사-기초의 증폭, 등을 포함하는 하나 이상 다수의 적당한 방법을 이용하여 수행될 수 있다. PCR은, 예를 들면 핵산 샘플이 열에 안정한 DNA 폴리머라제 존재 하의 교잡 조건 하에서, 한쌍의 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께, 한 프라이머가 검출하고자 하는 특정한 서열의 한 가닥(주형)에 교잡하도록 처리되는 공지된 기술에 따라 수행된다. 상기 프라이머는 이와 교잡하는 특정한 서열의 각 주형 가닥과 충분히 상보적이다. 각 프라이머의 연장 생산물이 합성되며, 이것은 그가 교잡하는 상기 핵산 주형 가닥에 대해 상보적이다. 각 프라이머로부터 합성된 상기 연장 생산물은 또한 동일한 프라이머를 이용한 연장 생산물의 추가 합성을 위한 주형으로 사용될 수 있다. 연장 생산물 합성을 충분한 수만큼 반복함으로써, 상기 샘플은 검출하고자 하는 서열 또는 서열들이 존재하는지 여부를 평가하기 위해 상술한 바대로 분석될 수 있다.
리간드 스크리닝 분석
또한, 본 발명은 핵수용체 리간드 결합 도메인을 후보(candidate) 분자와 접촉시키고 상기 리간드의 존재 하에 리포터 유전자 활성을 검출함으로써 세포에서 치환 돌연변이를 포함하는 핵수용체 리간드 결합 도메인의 트랜스활성을 유도 또는 억제하는 화합물을 위한 스크리닝 방법에 관한 것이다. 후보 분자는 상기 핵수용체 리간드 결합 도메인의 작용제 또는 길항제(antagonist)일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 상기 핵수용체 리간드 결합 도메인은 세포에서 폴리뉴클레오티드로부터 발현되며, 상기 트랜스활성 활성(즉, 리포터 유전자의 발현 또는 억제) 또는 화합물 결합 활성이 측정된다.
따라서, 핵수용체 리간드 결합 도메인의 구조에 기초한 작용제 및 길항제의 이성적인 디자인(rational design)에 더하여, 본 발명은 해당 기술 분야에 공지되어 있는 다양한 스크리닝 방법을 이용하여 핵수용체 리간드 결합 도메인의 특정한 리간드를 동정하기 위한 다른 방법을 숙고한다.
해당 기술 분야에 공지되어 있는 임의의 스크리닝 기술이 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인의 작용제 또는 길항제를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 핵수용체-기초의 유전자 발현 시스템을 포함하는 적당한 세포주는 유도가능 또는 억제가능한 프로모터와 기능적으로 연결되어 있는 마커 유전자를 코딩하는 유전자 발현 카세트와 함께 전달감염될 수 있다. 이후, 상기 전달감염된 세포는 후보 작용제 또는 길항제 화합물을 포함하는 테스트 용액에 노출되고, 마커 유전자의 발현 또는 억제에 대해 분석된다. 상기 테스트 용액에 노출되지 않은 대조군 세포에 비해 마커 유전자가 더 많이 발현되는 것은 상기 테스트 용액 내에 작용제 화합물이 존재한다는 것을 의미한다. 반대로, 상기 테스트 용액에 노출되지 않은 대조군 세포에 비해 마커 유전자가 더 적게 발현되는 것은 상기 테스트 용액 내에 길항제 화합물이 존재한다는 것을 의미한다.
본 발명은 생체내에서 본 발명에 따른 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인에 결합하여 작용제 또는 길항제로 작용하는 자연형 리간드의 스크리닝 뿐만 아니라 작은 분자 리간드 또는 리간드 동족물 및 유사물(mimics)에 대한 스크리닝을 숙고한다. 예를 들면, 자연 생산물 라이브러리(library)는, 핵수용체-기초의 유전자 발현 시스템 활성의 작용제 또는 길항제로 작용하는 분자를 위해 본 발명의 분석을 사용하여 스크리닝될 수 있다.
길항제의 동정 및 스크리닝은 예를 들면, X-선 결정학(crystallography), 중성자 회절, 핵자기공명 스펙트럼, 및 구조 결정을 위한 다른 기술을 이용하여 상기 단백질의 구조 특성을 결정함으로써 추가로 촉진된다. 상기 기술은 작용제 및 길항제를 이성적으로 디자인 및 동정하는 것을 제공한다.
다른 접근은 큰 라이브러리를 제조하기 위한 재조합 박테리오파지를 사용한다. "파지 방법"(Scott 및 Smith, Science 249: 386-390, 1990; Cwirla 등, Proc, Natl. Acad. Sci., 87: 6378-6382, 1990; Devlin 등, Science, 249: 404-406, 1990)을 이용함으로써, 매우 큰 라이브러리가 구축될 수 있다(106-108 화학적 실체(chemical entity)). 두 번째 접근은 1차적으로 화학적 방법을 이용하며, 게이센 방법(Geysen 등, Molecular Immunology 23: 709-715, 1986; Geysen 등, J. Immunologic Method 102: 259-274, 1987) 및 포도르 등의 방법(Fodor 등, Science 251: 767-773, 1991)이 그 예이다. 푸르카 등(Furka 등, 14th International Congress of Biochemistry, Volume 5, 초록 FR:013, 1988; Furka, Int. J. Peptide Protein Res. 37: 487-493, 1991), 하우톤(Houghton, 미국 특허 4,631,211, 1986년 12월 등록) 및 루터 등(Rutter 등, 미국 특허 5,010,175, 1991년 4월 23일 등록)은 작용제 또는 길항제로 테스트될 수 있는 펩티드 혼합물의 제조 방법을 개시하고 있다.
다른 측면에서, 합성 라이브러리(Needels 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10700-4, 1993; Ohlmeyer 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 10922-10926, 1993; Lam 등, 국제 특허 공개 WO 92/00252; Kocis 등, 국제 특허 공개 WO 94/28028, 각각은 그 전체가 참조로서 본 명세서에 포함됨) 등이 본 발명에 따른 후보 리간드를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
상기 스크리닝은 본 발명에 따른 핵수용체 리간드 결합 도메인을 발현하는 재조합 세포를 이용하거나, 또는 다른 한편으로 상술한 바와 같이 예를 들면 재조합적으로 생산된 정제된 단백질을 이용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 표지된 가용성 핵수용체 리간드 결합 도메인은 전술한 참고문헌에서 개시되어 있는 바와 같이 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다.
한 구현예에서, 본 발명에 따른 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 직접 표지될 수 있다. 다른 구현예에서, 관심있는 분자, 예를 들면 고형상 지지체에 부착된 분자에 대한 본 발명의 핵수용체 리간드 결합 도메인의 결합을 검출하기 위해 표지된 2차 시약(reagent)이 사용될 수 있다. 결합은 효소 표지에 의한 발색단(chromophore)의 인 시투 형성에 의해 검출될 수 있다. 적당한 효소는 알칼린 포스파타제(alkaline phosphatase) 및 양고추냉이 퍼옥시다제(horseradish peroxidase)를 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 추가 구현예에서, 관심있는 다른 억셉터(acceptor) 분자 상에 두 가지 효소 표지를 갖는 두 가지 발색성 기질을 이용한 2색 분석이 사용될 수 있다. 교차반응성 및 단일 반응성 리간드가 2색 분석에 의해 동정될 수 있다.
본 발명에 사용되기 위한 다른 표지로는 착색된 라텍스 비드(latex bead), 자석 비드, 형광 표지(예를 들면, FITC(fluorescene isothiocyanate), PE(phycoerythrin), TR(Texas red), 로다민(rhodamine), 자유 또는 킬레이트화 란타나이드(lanthanide) 계열의 염, 특히 Eu3 +, 즉 소수의 형광물질(fluorophore)), 화학발광(chemiluminescent) 분자, 방사성동위원소, 또는 자기공명영상 표지를 포함한다. 2색 분석은 다른 파장을 방사하는 2 이상의 착색된 라텍스 비드 또는 형광물질을 이용하여 수행될 수 있다. 표지된 분자 또는 세포는 시각적으로 검출되거나, 또는 기계적/광학적 수단에 의해 검출될 수 있다. 기계적/광학적 수단은 FACS와 유사한 혈광 활성화 분류(fluorescence activated sorting) 및 미세조작 제거 수단(micromanipulator removal means)을 포함한다.
본 발명은 본 발명의 예시로서 제공된 하기 비-제한적 실시예를 참조로 하여 보다 잘 이해될 수 있다.
본 발명자들은 CfEcR 동질성 모델을 개발하였고, 엑디스테로이드 및 비-엑디스테로이드에 대한 결합에 관여하는 결정적 잔기를 동정하기 위하여 상기 동질성 모델을 공지된 키로노머스 테탄스 엑디손 수용체("CtEcR") 동질성 모델(Wurtz 등, 2000)과 함께 사용하였다. 합성 비-스테로이드인 디아실히드라진은 높은 친화성으로 인시류 EcR에 결합하고, 상기 곤충에서 미발달 불완전 탈피를 유도하며(Wing 등, 1988), 이들 화합물 중 몇몇은 현재 살충제로 시판되고 있다. 상기 EcR의 리간드 결합 캐비티는 20E와 같은 엑디스테로이드의 긴 백본 구조에 적합하도록 진화되어 왔다. 상기 디아실히드라진은 엑디스테로이드에 비해 치밀한 구조를 가지며, 상기 EcR 결합 포켓의 아래 부분만을 점유한다. 이것은 엑디스테로이드와는 접촉하지만 디아실히드라진과 같은 비-엑디스테로이드와는 접촉하지 않는 결합 포켓의 상부 부분에 몇 개의 결정적 잔기를 남겨 둔다. 본 발명자들은 엑디스테로이드 및/또는 비-엑디스테로이드와 접촉하는 잔기의 치환 돌연변이를 만들었고, 리간드 결합에 미치는 돌연변이의 영향을 결정하였다. 본 발명자들은 본 명세서에서 이들 잔기 중 몇 가지에서의 치환 돌연변이를 개시하고, 그 결합 및 트랜스활성 특성에 기초하여 치환 돌연변이체의 몇 가지 클래스를 동정하였다. 본 발명자들의 신규한 치환 돌연변이된 핵수용체 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드는 유전자 치료, 숙주 세포에서의 관심있는 단백질의 발현, 유전자이식 생명체의 제조 및 세포-기초의 분석을 포함하는 다양한 적용 분야를 위한 핵수용체-기초의 유도가능한 유전자 조절 시스템에서 유용하다.
일반적인 방법
본 명세서에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 그 기술 분야에서 잘 공지되어 있으며, 샘브룩 등(Sambrook, J., Fritsch, E.F. 및 Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)(Maniatis)) 및 T.J. 실하비 등(T.J. Silhavy, M.L. Bennan, 및 L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. (1984)) 및 오수벨 등(Ausubel, F.M. 등, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987))에 개시되어 있다.
세균 배양의 유지 및 성장을 위해 적합한 물질 및 방법은 그 기술 분양에서 잘 알려져 있다. 하기 실시예에서 사용되기 위해 적합한 기술은 '일반 세균학을 위한 방법 매뉴얼'(Phillipp Gerhardt, R.G.E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg 및 G. Briggs Phillips, eds, American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994)) 또는 토마스 D. 브록의 '생명공학; 산업 미생물학 교과서'(Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, Second Edition, Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA (1989))에서 발견될 수 있다. 숙주 세포의 성장 및 유지를 위해 사용된 모든 시약, 제한효소 및 물질은 달리 특정하지 않는 한 알드리치 화학사(Milwaukee, WI), DIFCO 실험실(Detroit, MI), GIBCO/BRL(Gaithersburg, MD), 또는 시그마 화학사(St. Louis, MO)에서 구입하였다.
유전자 서열의 조작(manipulation)은 유전학 컴퓨터 그룹사(Genetics Computer Group Inc., Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group(GCG), Madison, WI)에서 구입할 수 있는 한 벌의 프로그램을 이용하여 달성될 수 있다. 상기 GCG 프로그램 "파일업(Pileup)"이 사용되는 경우, 12의 갭 창조 디폴트 값(gap creation default value) 및 4의 갭 연장 디폴트 값이 사용될 수 있다. 상기 CGC "갭" 또는 "베스트핏(Bestfit)" 프로그램이 사용되는 경우, 50의 디폴트 갭 창조 페널티(penalty) 및 3의 디폴트 갭 연장 페널티가 사용될 수 있다. 상기 또는 임의의 다른 GCG 프로그램에서 GCG 프로그램 파라미터가 적합하지 않은 모든 경우에 있어서, 디폴트 값이 사용될 수 있다.
약자의 의미는 다음과 같다: "h"는 시간을 의미하고, "min"은 분을 의미하며, "sec"는 초를 의미하고, "d"는 일을 의미하며, "㎕"는 마이크로리터를 의미하고, "㎖"는 밀리리터를 의미하며, "ℓ"는 리터를 의미하고, "μM"은 마이크로몰을 의미하며, "mM"은 밀리몰을 의미하고, "㎍"은 마이크로그램을 의미하며, "㎎"은 밀 리그램을 의미하고, "A"는 아데닌 또는 아데노신을 의미하며, "T"는 티민 또는 티미딘을 의미하고, "G"는 구아닌 또는 구아노신을 의미하며, "C"는 시티딘 또는 시토신을 의미하고, "x g"는 시간 중력을 의미하며, "nt"는 뉴클레오티드를 의미하고, "aa"는 아미노산을 의미하며, "bp"는 염기쌍을 의미하고, "kb"는 킬로염기를 의미하며, "k"는 킬로를 의미하고, "μ"는 마이크로를 의미하며, "℃"는 섭씨를 의미한다.
실시예 1
본 실시예는 핵수용체-기초의 유도가능한 유전자 발현 시스템에서 사용되기 위한 본 발명의 신규한 치환 돌연변이체 그룹 H 핵수용체 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함하는 몇 가지 유전자 발현 카세트의 구축에 대해 개시한다. 본 발명자들은 가문비나무 애벌레(spruce budworm)인 코리스토네우라 퓨니페라나 EcR("CfEcR")에 기초한 유전자 발현 카세트를 구축하였다. 제조된 수용체 구조물은 EcR 또는 호모 사피엔스 RXRβ-LmRXR 중 하나의 리간드 결합 도메인; GAL4 DNA 결합 도메인(DBD) 또는 VP16 트랜스활성 도메인(AD)을 포함한다. 리포터 구조물은 상기 Gal4 DBD가 결합하는 GAL4 반응 요소를 포함하는 합성 프로모터 구조물에 기능적으로 연결되어 있는 리포터 유전자 루시퍼라제를 포함한다. 하기 실시예 2-5에서 개시되어 있는 바와 같이 상기 수용체 및 리포터 구조물의 다양한 조합이 포유동물 세포 내로 동시 전달감염(cotransfect)되었다.
유전자 발현 카세트: 엑디손 수용체-기초의 유전자 발현 카세트(스위치)는 그 기술 분야에서 입수할 수 있는 표준 클로닝 방법을 이용하여 다음과 같이 구축하였다. 아래는 본 명세서에서 개시된 실시예에서 사용된 각 스위치의 제조 및 조성에 대한 간단한 설명이다.
1.1 - GAL4CfEcR - DEF / VP16 -β RXREF - LmRXREF : 가문비나무 애벌레인 코리스토네우라 퓨니페라나 EcR("CfEcR-DEF"; 서열번호 21) 유래의 야생형 D, E 및 F 도메인이 GAL4 DNA 결합 도메인("Gal4DNABD" 또는 "Gal4DBD"; 서열번호 6)과 융합되었고, CMV 프로모터(서열번호 2)의 조절 하에 놓여졌다. 호모 사피엔스 RXRβ 유래 EF 도메인("HsRXRβ-EF"; 서열번호 3의 1-465 뉴클레오티드)의 나선 1 내지 8 및 로쿠스타 미그라토리아 울트라스피라클 단백질("LmRXR-EF"; 서열번호 23의 403-630 뉴클레오티드) EF 도메인의 나선 9 내지 12가 VP16 유래 트랜스활성 도메인("VP16AD"; 서열번호 12)에 융합되었고, SV40e 프로모터(서열번호 22)의 조절 하에 놓여졌다. 5개의 보존적 GAL4 반응 요소 결합 부위("5XGAL4RE"; 서열번호 19를 포함하는 GAL4RE를 5 카피 포함함)가 합성 TATA 최소 프로모터(서열번호 24)와 융합되었고, 상기 루시퍼라제 리포터 유전자(서열번호 25)의 상류에 놓여졌다.
1.21 - GAL4 /돌연변이체 CfEcR - DEF / VP16 -β RXREF - Lm RXREF : 상기 구조물은 야생형 CfEcR-DEF가 하기 표 1로부터 선택된 치환 돌연변이를 포함하는 리간드 결합 도메인을 포함하는 돌연변이체 CfEcR-DEF로 교체된 것을 제외하고는 상기 스위치 1.1에서와 동일한 방식으로 제조되었다.
[표 1] 코리스토네우라 퓨미페라나 엑디손 수용체("CfEcR") 리간드 결합 도메인(LBD)의 치환 돌연변이체
Figure 112006088387352-PCT00009
Figure 112006088387352-PCT00010
Figure 112006088387352-PCT00011
치환 돌연변이를 포함하는 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인의 구축:
EcR 리간드 결합을 변형시키기 위한 노력으로, 분자 모델링 분석에 기초하여 리간드 결합에 있어서 중요하다고 예측된 상기 EcR 리간드 결합 도메인 내의 잔기들이 3가지 다른 강의 생명체 유래의 EcR에서 돌연변이 되었다. 표 1은 엑디스테로이드 및 비-엑디스테로이드 결합의 변형을 위해 돌연변이되고 또한 조사된 CfEcR(인시류 EcR)의 리간드 결합 도메인 내부의 아미노산 잔기를 나타낸다.
표 1에 나열된 개개의 아미노산 치환 돌연변이는 PCR 매개성 위치-유도 돌연 변이유발에 의해 EcR cDNA 내에 구축되었다. 많은 단일 점 돌연변이가 만들어진데 더하여, 두 가지 다른 이중 점 돌연변이체 CfEcR 또한 만들어졌다: 첫 번째는 V128F 및 A110P 치환(V128F/A110P) 모두를 포함하고, 두 번째는 N119F 및 V96T 치환(N119F/V96T) 모두를 포함한다. 3가지 다른 삼중 점 돌연변이체 CfEcR 또한 만들어졌다: 첫 번째는 V107I, Y127E 및 A110P 치환(V107I/Y127E/A110P)을 포함하고, 두 번째는 V107I, Y127E 및 T52V 치환(V107I/Y127E/T52V)을 포함하며, 세 번째는 V107I 및 Y127E 치환과 글리신(G) 삽입(V107I/Y127E/259G)(서열번호 1)을 포함한다.
PCR 위치-유도 돌연변이유발은 퀵체인지(Quickchange) 표적-유도 돌연변이유발 키트(Stratagene, La Jolla, CA)를 이용하여 수행하였고, 반응 조건 및 순환 파라미터는 아래와 같다. PCR 위치-유도 돌연변이유발은 1x 반응 버퍼(제조사에 의해 공급됨), 50 ng의 dsDNA 주형, 125 ng의 전방 프라이머(FP), 125 ng의 후방 상보적 프라이머(RCP), 및 1 ㎕의 dNTP 혼합물(제조사에 의해 공급됨)을 이용하여 50 ㎕의 최종 반응 부피에서 수행되었다. 각 EcR 돌연변이체를 제조하기 위해 사용된 상기 전방 프라이머 및 후방 상보적 프라이머는 표 2에 나타나 있다. 사용된 순환 파라미터는 95℃에서 30초간 변성(denaturing)을 1회 순환한 후, 95℃에서 30초간 변성, 55℃에서 1분간 어닐링 및 68℃에서 22분간 연장(extending)을 16회 순환한 것으로 구성되어 있다.
[표 2] 치환 돌연변이체 CfEcR 리간드 결합 도메인 구축을 위한 PCR 프라이머
Figure 112006088387352-PCT00012
Figure 112006088387352-PCT00013
Figure 112006088387352-PCT00014
Figure 112006088387352-PCT00015
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Figure 112006088387352-PCT00017
Figure 112006088387352-PCT00018
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이후, 결과물인 상기 돌연변이체 EcR 리간드 결합 도메인을 코딩하는 PCR 핵산 생산물은 각각 상기 실시예 1.2에서 개시한 바와 같이 GAL4 DNA 결합 도메인에 융합되었다. 상기 GAL4/돌연변이체 EcR 수용체 구조물들은 이들을 다양한 리간드의 존재 하에 VP16/βRXREF-LmRXREF 및 pFRLuc와 함께 NIH3T3 세포에 전달감염시킴으로써 활성을 검사하였다.
상기 Gal4-CfEcR-DEF(VYG) 돌연변이체는 PCR에 의해 EcR 치환 돌연변이체 V107I/Y127E(CfEcR(VY))의 C-말단에 여분의 글리신을 삽입시킴으로써 제조되었다. 필수적으로, 이것은 2 단계로 수행되었다: CfEcR-DEF(VYG)의 PCR-증폭 및 GAL4-CfEcR DEF(VY)pBIND 1-9 벡터 내의 CfEcR(VY)를 PCR-증폭된 CfEcR-DEF(VYG)로 치 환. 상기 CfEcR-DEF 영역(여분의 글리신을 포함)은 주형인 GAL4-CfEcR DEF(VY)pBIND 1-9 벡터 및 하기 PCR 프라이머를 사용하여 증폭되었다:
Figure 112006088387352-PCT00020
상기 PCR 생산물은 단리되었고, Not I(3' 말단에서 절단; 3' PCR 프라이머 내에 포함됨) 및 Xma I(5' 말단에서 절단; 5' PCR 프라이머 내에 존재함)을 이용하여 소화되었다. 상기 생산물은 하기 방식으로 제조된 벡터에 접합되었다: GAL4-CfEcR DEF(VY) pBIND 1-9는 Xma I 및 Not I으로 소화되었다(상기 소화는 벡터로부터 CfEcR-DEF(VY)를 제거함). 상기 절편은 1% 아가로즈 젤(agarose gel) 상에서 분리되었고, 더 느리게 이동하는 벡터 DNA를 정제하였다. 상술한 바와 같이 상기 벡터 및 CfEcR-DEF(VYG) 절편을 접합시킨 후, 상기 접합 반응은 세균 내로 형질전환되었다. 상기에서 설명한 프라이머를 이용한 콜로니 PCR에 의해 양성(positive) 콜로니를 선별하였다. 상기 선별된 클론 내의 VYG 돌연변이는 시퀀싱(sequencing)에 의해 확인되었다.
실시예 2
본 실시예는 엑디스테로이드 리간드에 대한 반응에서 증가된 활성을 나타내는 엑디스테로이드 반응성 CfEcR 리간드 결합 도메인 치환 돌연변이체의 동정에 대해 개시한다. 상기 CfEcR에서 엑디스테로이드 리간드 활성을 증가시키는 치환 돌 연변이를 동정하기 위한 노력으로, 본 발명자들은 엑디스테로이드 결합에 결정적일 것으로 예측된 아미노산 잔기를 돌연변이시켰고, PCR-매개성 위치-유도 돌연변이유발 키트를 이용하여 상기 실시예 1에 개시된 바와 같이 GAL4/돌연변이체 CFEcR-DEF cDNA 유전자 발현 카세트를 생성하였다. 상기 실시예에서 약술한 다양한 스위치 구조물에 대응하는 돌연변이 및 야생형 cDNA를 만들었고, 아래에 개시한 바와 같은 GAL4-작동성(driven) 루시퍼라제 리포터 분석으로 검사하였다.
전달감염 : DNA는 아래와 같이 마우스 NIH3T3 세포(ATCC) 내로 전달감염시켰다. 세포를 수확하였고, 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함하는 50㎕의 성장 배지에서 웰당 2,500 세포로 96-웰 플레이트에 접종하였다. 24시간 후, 상기 세포는 디메틸술폭시드(DMSO, 대조군) 또는 리간드의 DMSO 용액을 포함하는 35 ㎕의 혈청-부재(free) 성장 배지로 처리되었다. 이후, 상기 세포는 수퍼펙트(SuperfectTM, Qiagen Inc.) 전달감염 시약을 이용하여 전달감염되었다. 각각의 웰에 대해, 0.625 ㎕의 수퍼펙트가 14.2 ㎕의 혈청-부재 성장 배지와 혼합되었다. 0.16 ㎍의 리포터 구조물 및 0.04 ㎍의 각 리포터 구조물이 상기 전달감염 시약 혼합물에 첨가되었다. 전달감염 혼합물의 내용물은 볼텍스 믹서(vortex mixer)에서 혼합되었고, 실온에서 30분간 방치되었다. 배양이 끝날 때, 15 ㎕의 전달감염 혼합물을 상기 세포에 첨가하였다. 상기 세포는 5% FBS에서 37℃, 5% CO2로 48시간동안 유지되었다.
리간드 : 엑디스테로이드 리간드인 포나스테론 A 및 20-히드록시엑디손은 시 그마 화학사 및 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 구입하였다. 비-엑디스테로이드 디아실히드라진 리간드인 N-(2-에틸-3-메톡시벤조일)-N'-(3,5-디메틸벤조일)-N'-tert-부틸히드라진(RG-102240, GS®-E 리간드)은 롬 앤드 하스사에서 합성된 안정한 합성 엑디스테로이드 리간드이다. 비-엑디스테로이드 디아실히드라진 리간드인 RG-101691, RG-102362, RG-115840, RG-115853, RG-115855, RG-115859 및 RG-115898은 로진사(RheoGene Inc.)에 의해 합성되었다. 상기 RG-101691, RG-102362, RG-115840, RG-115859 및 RG-115898의 합성은 아래에 개시되어 있다. 상기 RG-115853 및 RG-115855의 합성은 함께 계류중인 미국 특허 출원 10/775,883에 개시되어 있다. 비-엑디스테로이드 테트라히드로퀴놀린 리간드인 RG-120499 및 RG-120500은 로진사에 의해 합성되었으며, 함께 계류중인 미국 특허 출원 10/460,820에 개시되어 있다. 모든 리간드는 DMSO에 용해되었다.
리간드 합성:
3,5-디메틸-벤조산 N- tert -부틸- N' -(3-에틸-2- 메틸 - 벤조일 )- 히드라자이드(RG-101691)의 제조
Figure 112006088387352-PCT00021
3-아미노-2-메틸벤조산(6.16 g)은 농축된 HBr 내에서 30분간 환류(reflux) 가열되었다. 상기 혼합물은 0℃로 냉각되었고, 0℃에서 NaNO2 용액(5.6 ㎖ H2O 내에서 2.8 g)으로 처리되었다. 결과물인 디아조니움염 용액은 3.2 ㎖의 농축된 HBr 내에서 예열된(60-70℃) CuBr 용액(3.8 g)으로 천천히 첨가되었다. 첨가 후, 상기 혼합물을 실온에서 밤새 저어주고 여과하였다. 회수된 여과 케이크(filter cake)은 먼저 물로 세척한 후 10% HCl로 세척하였고, 공기중에서 건조시켜 밝은 보라색 분말 고형물인 6.93 g의 3-브로모-2-메틸벤조산을 생성하였다. 상기 물질은 에틸 아세테이트에 용해되었고, 5% HCl로 2회 세척된 후, Na2SO4에 대해 건조되었고, 먼저 실온에서, 이후 냉동 하에서 4:1 헥산:에틸 아세테이트로부터 재결정화되었다. 1H NMR (DMSO, 200 MHz), δ(ppm): 7.72(dd, 2H), 7.2(t, 1H), 2.5(s, 3h).
Figure 112006088387352-PCT00022
3-브로모-2-메틸벤조산(7.03 g, 32.7 mmol)은 10 ㎖의 SOCl2(98 mmol) 및 한 방울의 DMF에서 3시간동안 환류되었다. 과량의 SOCl2는 진공 속에서(in vacuo) 제거되었다. 그 잔기는 20 ㎖의 CH2Cl2에 용해되었고, 20 ㎖의 CH2Cl2 내에서 얼음-냉각된 2-아미노-2-메틸-프로판-1-올 용액(8.74 g, 9.36 ㎖)에 첨가되었다. 그 혼합물은 실온에서 18시간동안 저어주었고, 용매는 진공 속에서 제거하여 오일성 잔기만을 남겨 놓았다. SOCl2(7.4 ㎖, 100 ㎖, 3 eq.)는 한 시간에 걸쳐 상기 잔기에 첨가되었고, 그 혼합물은 추가로 30분간 저어준 후 150 ㎖의 에테르에 부었다. 오일성 비혼합 상(immiscible phase)이 형성되었고, 에테르는 버렸다. 상기 오일은 100 ㎖의 20% NaOH와 혼합되었고, 3 x 150 ㎖ 부분의 에테르로 추출되었다. 상기 에테르 추출물을 모았고, MgSO4에 대해 건조하였으며, 용매를 진공 속에서 제거하여 노란색 오일을 생성하였다. 4:1 헥산:에테르를 용리제(eluant)로 사용한 실리카겔 상의 크로마토그래피로 4.87 g의 2-(3-브로모-2-메틸-페닐)-4,4-디메틸-4,5-디히드로-옥사졸을 무색 오일로 생성하였다. (Rf=0.25(4:1 헥산:에테르). 1H NMR (CDCl3, 200 MHz), δ(ppm): 7.62(m, 2H), 7.1(t, 1H), 4.1(s, 2H), 2.6(s, 3H), 1.4(s, 6H).
Figure 112006088387352-PCT00023
2-(3-브로모-2-메틸-페닐)-4,4-디메틸-4,5-디히드로-옥사졸(3.4 g, 12.7 mmol)은 자석 휘젓기, 온도계 및 환류 콘덴서(condenser)가 장착된 100 ㎖의 둥근 바닥 플라스크에서 질소 공기 하에 30 ㎖의 에틸 에테르에 용해되었다. Ni(dppp)Cl2(100 ㎎)를 첨가하였고, 그 혼합물은 얼음조(ice bath)에서 0℃로 냉각되었다. 에틸 마그네슘 브로마이드(5.5 ㎖, 에테르에서 3 M)를 첨가하였고, 그 반응 혼합물을 0℃에서 30분, 실온에서 2.5 시간, 및 최종적으로 환류에서 2시간동안 저어주었다. 이후, 상기 혼합물은 0℃로 냉각되었고, 포화된 수성 NH4Cl로 퀀치(quench)되었다. 그 유기물층(organic layer)을 제거하였고, 수층(aqueous layer)을 에테르로 추출하였다. 상기 유기물층을 모았고, MgSO4에 대해 건조시켰 다. 용매를 진공 속에서 제거하여 ca. 5% 오리지날 아릴 브로마이드를 포함하는 2.84 g의 2-(3-에틸-2-메틸-페닐)-4,4-디메틸-4,5-디히드로-옥사졸을 생성하였다. 1H NMR (CDCl3, 200 MHz), δ(ppm): 7.5(d, 2H), 7.2(m, 2H), 4.1(s, 2H), 2.7(m, 2H), 2.45(s, 3H), 1.4(s, 6H), 1.2(t, 3H), RF=0.25(4:1 헥산:에테르). 상기 옥사졸린을 100 ㎖의 6 N HCl에 부유시켰고, 격렬하게 휘저어 5시간동안 환류시켰다. 상기 혼합물을 실온까지 냉각시켜 3-에틸-2-메틸-벤조산이 결정화되었다: 1.74 g, m.p. 96-98℃, 1H NMR (CDCl3, 200 MHz), δ(ppm): 7.85(d, 1H), 7.4(d, 1H), 7.22(t, 1H), 2.7(q, 2H), 2.6(s, 3H), 1.21(t, 3H). 상기 수상(aqueous phase)을 에테르로 추출함으로써 추가로 110 ㎎을 회수하였다.
Figure 112006088387352-PCT00024
3-에틸-2-메틸-벤조산(0.517 g)을 한 방울의 DMF가 포함된 3 ㎖의 티오닐 클로라이드에서 수 시간동안 환류시켰다. 티오닐 클로라이드는 진공 속에서 제거되어 0.89 g(4.48 mmol)의 3-에틸-2-메틸-벤조일 클로라이드가 생성되었다. 상기 산 클로라이드는 5 ㎖의 CH2Cl2에 용해되었고, 천천히, 동시에 5 ㎖의 수성 NaOH(0.30 g, 7.5 mmol)과는 별개로 -5℃로 미리냉각된 10 ㎖의 CH2Cl2에 용해되어 있는 3,5-디메틸-벤조산 N-tert-부틸-히드라지드(0.96 g, 4.36 mmol) 용액에 첨가되었다. 첨가되는 동안, 온도는 5℃ 이하로 유지하였다. 상기 혼합물을 천천히 실온까지 따뜻하게 하였고, 밤새 저어주었다. 상기 유기물층을 제거하였고, 수층을 CH2Cl2로 추출하였다. 상기 유기 추출물을 모으고, 건조한 후, 용매를 진공 속에서 제거하여 1.5 g의 조(crude) 생산물을 얻었다. 상기 잔기는 환류 하에서 100 ㎖의 헥산으로 추출되었고, 뜨거운 추출물은 오일성 잔기로부터 옮겨져 실온까지 냉각되어, 3,5-디메틸-벤조산 N-tert-부틸-N'-(3-에틸-2-메틸-벤조일)-히드라지드가 결정화되었다(0.56 g, m.p. 167-169℃). 1H NMR (CDCl3, 200 MHz), δ(ppm): 7.43(s, 1H), 7.18(m, 1H), 7.1(s, 2H), 7.03(s, 1H), 7.0(m, 1H), 6.35(d, 1H), 2.58(q, 2H), 2.3(s, 6H), 1.95(s, 3H), 1.6(s, 9H), 1.15(t, 3H). 상기 오일성 잔기를 용해 및 결정화하여 덜 정제된 물질인 0.21 g의 2차 산물을 생성하였다.
3,5-디메틸-벤조산 N- tert -부틸- N' -(3-이소프로필-2- 메틸 - 벤조일 )- 히드라지드(RG-102362)의 제조
Figure 112006088387352-PCT00025
자석 휘젓기가 장착되고 질소 공기 하에 유지된 건조 3-목(neck) 250 ㎖ 둥근 바닥 플라스크에 5.0 g의 2-(3-브로모-2-메틸-페닐)-4,4-디메틸-4,5-디히드로-옥사졸, 60 ㎖의 무수(anhydrous) THF, 및 100 ㎎의 Ni(dppp)Cl2를 채웠다. 그 혼 합물을 15℃로 냉각시켰고, 이소프로필 마그네슘 클로라이드(11 ㎖, 에틸 에테르에서 2 M)를 첨가하였다. 부드러운(mild) 발열반응이 일어났으며, 그 혼합물은 약간 어두어졌다. 상기 반응은 실온에서 밤새 저어주었으며, 이 시점에서 1H NMR은 50% 완료되었음을 나타내었다. ca 75 ㎎의 Ni(dppp)Cl2를 첨가하고 3시간동안 환류시켜 반응이 추가로 진행되지 않았다. 상기 혼합물을 15℃로 냉각시켰고, 추가로 13 ㎖의 이소프로필 마그네슘 클로라이드(에틸 에테르에서 2 M)와 100 ㎎의 니켈 촉매를 첨가하였으며, 상기 혼합물을 실온에서 밤새 저어주었다. 상기 혼합물을 포화된 수성 NH4Cl로 퀀치시켰고, 유기물층을 제거하였으며, 수층을 추출하였고, 상기 유기물 상을 모은 후 건조시켰다. 용매를 진공 속에서 제거하여 노란색 오일인 3.84 g의 조 생산물을 생성하였다. 4:1 헥산:에테르를 용리제로 사용한 실리카겔 상의 칼럼 크로마토그래피로 0.79 g의 2-(3-이소프로필-2-메틸-페닐)-4,4-디메틸-4,5-디히드로-옥사졸을 무색 오일로 생성하였다. 1H NMR (CDCl3, 200 MHz), δ(ppm): 7.5(d, 1H), 7.37(d, 1H), 7.22(t, 1H), 4.13(s, 2H), 3.23(m, 1H), 2.5(s, 3H), 1.45(s, 6H), 1.22(d, 6H). 상기 옥사졸린을 34 ㎖의 6 N HCl에 부유시켰고, 오일조에서 6시간동안 환류시켰다. 상기 혼합물을 냉각시켰고 CH2Cl2로 추출하였다. 상기 추출물을 Na2SO4에 대해 건조시켰고, 증발시켜, 다음 단계를 위해 알맞게 정제된 0.76 g의 3-이소프로필-2-메틸-벤조산을 생성하였다. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz), β(ppm): 7.8(d, 1H), 7.48(d, 1H), 7.3(t, 1H), 3.3(m, 1H), 2.55(s, 3H), 1.2(d, 6H).
Figure 112006088387352-PCT00026
3-이소프로필-2-메틸-벤조산(0.75 g)을 한 방울의 DMA를 포함하는 ca. 3 ㎖의 티오닐 클로라이드에서 수 시간동안 환류시켰고, 티오닐 클로라이드를 진공 속에서 제거시켜 3-이소프로필-2-메틸-벤조일 클로라이드를 생성하였다. 상기 산 클로라이드는 5 ㎖의 CH2Cl2에 용해되었고, 천천히, 동시에 5 ㎖의 수성 NaOH(0.265 g, 6.6 mmol)과는 별개로 -5℃로 미리냉각된 10 ㎖의 CH2Cl2에 용해되어 있는 3,5-디메틸-벤조산 N-tert-부틸-히드라지드(0.973 g, 4.4 mmol) 용액에 첨가되었다. 첨가되는 동안, 온도는 5℃ 이하로 유지하였다. 상기 혼합물을 천천히 실온까지 따뜻하게 하였고, 밤새 저어주었다. 상기 유기물층을 제거하였고, 수층을 CH2Cl2로 추출하였다. 상기 유기 추출물을 모으고, 건조한 후, 용매를 진공 속에서 제거하여 1.61 g의 조 생산물을 얻었다. 상기 물질은 4:1 헥산:에틸 아세테이트를 용리제로 사용하여 실리카겔 상에서 크로마토그래피되었고, 순차적으로 1:1 헥산:에테르로부터 빻아졌으며, 60℃, 진공 오븐에서 에테르를 힘들게 제거하여 3,5-디메틸-벤조산 N-tert-부틸-N'-(3-이소프로필-2-메틸-벤조일)-히드라지드가 생성되었다(0.35 g, m.p. 182.5℃). 1H NMR (CDCl3, 200 MHz), δ(ppm): 7.6(s, 1H), 7.25(d, 1H), 7.1(s, 2H), 7.05(s, 1H), 7.0(m, 1H), 6.3(d, 1H), 3.1(m, 1H), 2.3(s, 6H), 1.95(s, 3H), 1.6(s, 9H), 1.18(m, 6H).
3,5-디메틸-벤조산 N' -(5-에틸-2,3- 디히드로 -벤조[1,4] 디옥신 ( dioxine )-6-카르보닐)-N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-히드라지드( RG -115858)의 제조
Figure 112006088387352-PCT00027
2.38 g(18 mmol)의 t-부틸 카르바제이트(carbazate)를 250 ㎖의 둥근 바닥 플라스크에서 50 ㎖의 CH2Cl2에 용해시켰고, 0℃로 냉각하였다. 수성 K2CO3 용액을 준비하였고(4.15 g K2CO3/35 ㎖ H2O), 상기 반응 혼합물에 첨가하여 다시 0℃로 냉각시켰다. 3.63 g(16 mmol)의 5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르보닐 클로라이드는 40 ㎖의 CH2Cl2에 용해되었고, 분리용 깔때기로부터 15분간 한방울씩 첨가되었다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 3일간 저어주었다. 상기 반응 혼합물은 CH2Cl2 및 H2O와 함께 분리용 깔때기로 전달되었다. 상기 물상은 CH2Cl2로 철저하게 추출되었다. 이후, 상기 CH2Cl2 추출물은 0.5 N HCl로 추출, 건조 및 증발되었다. 상기 잔기는 진공 오븐에서 추가로 건조되어 5.15 g의 황갈색(tan)의 고형 N'-(5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르보닐)-히드라진 카르복시산 tert-부틸 에스테르를 생성하였다. TLC(1:1 에틸 에세테이트:헥산)에서는 Rf=0.43의 단일한 스폿(spot)이 나타났고, NMR은 매우 정제된 산물을 나타내었다: 1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ(ppm): 7.5(br, 1H), 7.0(br, 1H), 6.75(d, 2H), 4.28(br, 4H), 2.76(m, 2H), 1.5(s, 9H), 1.18(t, 3H).
Figure 112006088387352-PCT00028
5.15 g(16 mmol)의 N'-(5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르보닐)-히드라진 카르복시산 tert-부틸 에스테르는 200 ㎖의 둥근 바닥 플라스크에 첨가되었다. 약 20 ㎖의 트리플루오로아세트산이 첨가되었고, 상기 반응 혼합물은 실온에서 24시간동안 휘저어졌다. 이후, 약 40 ㎖의 물이 첨가되었고, 이후 냉각된 10% NaOH/H2O를 산이 중화될 때까지(pH ~14) 천천히 저으면서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물은 분리용 깔때기로 전달되었고, 부드럽게 흔들어줌으로써 에틸 아세테이트와 함께 추출되었다(주의: 가스 발생). 상기 에틸 아세테이트 추출물은 건조 및 증발되어, 5.51 g의 희미한 점성의 노란 반고형물을 생성하였다. 이후, 상기 물질을 50℃ 진공 오븐에서 약 1시간동안 놓아 두어 4.62 g의 5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르복시산 히드라지드를 생성하였다. 상기 t-Boc 절단은 순수한 트리풀루오로아세트산을 이용할 때 가장 잘 달성된다: 부속(adjunctive) 용매를 사용하면 수율이 항상 훨씬 낮았다. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ(ppm): 7.0(br, 1H), 6.83(m, 1H), 6.71(m, 1H), 4.28(br s, 4H), 2.76(m, 2H), 1.6(br, 2H), 1.17(t, 3H).
Figure 112006088387352-PCT00029
1.12 g(5.1 mmol)의 5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르복시산 히드라지드, 1.37 g(12 mmol)의 2,2-디메틸 펜타논-3, 30 ㎖의 에탄올, 및 20 방울의 빙초산이 6시간동안 환류되었고, 인 시투로 사용된 5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르복시산(1-에틸-2,2-디메틸-프로필렌)-히드라지드를 생성하였다. 상기 냉각된 반응 혼합물에 3 ㎖의 빙초산 및 0.63 g(10 mmol)의 NaCNBH3이 첨가되었다. 상기 반응은 실온에서 24시간동안 휘저어졌다. 25 ㎖의 물이 첨가되었고, 회전 증발기에서 대부분의 알콜이 제거되었다. 이후, 상기 반응 혼합물이 염기성이 될 때까지 10% NaOH/H2O가 첨가되었다. 상기 생산물은 에틸 아세테이트로 추출되었고, 이후 건조 및 증발되어 1.61 g의 잔사가 생성되었다. 실리카겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 25% 에틸 아세테이트/헥산으로 용출되어 정제된 5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르복시산 N'-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-히드라지드가 얻어졌다(ca. 0.77 g)(TLC: Rf=0.53, 1:1 에틸 아세테이트: 헥산). 1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ(ppm): 7.1(br s, 1H), 6.8(d, 1H), 6.7(d, 1H), 4.27(m, 4H), 2.8(m, 2H), 2.4(m, 1H), 1.7(m, 1H), 1.3(m, 1H), 1.2(t, 3H), 1.15(t, 3H), 0.97(s, 9H).
Figure 112006088387352-PCT00030
0.214 g(0.70 mmol)의 5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르복시산 N'-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-히드라지드, 151 ㎎(0.9 mmol)의 3,5-디메틸벤조일 클로라이드, 7 ㎖의 25% K2CO3/H2O 및 7 ㎖의 CH2Cl2가 20 ㎖의 바이알(vial)에 첨가되었고, 실온에서 24시간동안 휘저어졌다. 상기 반응 혼합물은 분리용 깔때기로 전달되었고, 희석된 NaHCO3 및 CH2Cl2가 첨가되었다. 상기 CH2Cl2 층이 분리되었고, 물층은 CH2Cl2로 2회 추출되었다. 상기 CH2Cl2 추출물은 MgSO4에 대해 건조되었고, 증발되어, 0.59 g의 흰색 잔기가 생성되었다. 칼럼 크로마토그래피에 의한 정제 및 15 ㎖의 20% 에틸 아세테이트/헥산을 이용한 용출로 약 350 ㎎의 3,5-디메틸-벤조산 N'-(5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르보닐)-N-(1-에틸-2,2-디메틸-프로필)-히드라진이 생성되었다(TLC: Rf=0.56에 의해 95% 순도, 1:1 에틸 아세테이트:헥산). 1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ(ppm): 7.05(s, 1H), 7.0(s, 2H), 6.6(d, 1H), 6.27(d, 1H), 4.65(d, 1H), 4.25(s, 4H), 2.9(m, 1H), 2.3(s, 6H), 2.0(m, 1H), 1.55-1.7(m, 2H), 1.25(m, 3H), 0.9-1.2(3s, 9H), 0.9(t, 3H).
3,5- 디메톡시 -4- 메틸 -벤조산 N-(1- tert -부틸-3,4,4- 트리메틸 - 펜트 -2- 에닐 ( enyl ))- N' -(5-에틸-2,3-디히드로- 벤조[1,4]디옥신 -6-카르보닐)- 히드라지드(RG11 5898)의 제조
Figure 112006088387352-PCT00031
2.38 g(18 mmol)의 t-부틸 카르바제이트를 250 ㎖의 둥근 바닥 플라스크에서 50 ㎖의 CH2Cl2에 용해시켰고, 0℃로 냉각하였다. 수성 K2CO3 용액을 준비하였고(4.15 g K2CO3/35 ㎖ H2O), 상기 반응 혼합물에 첨가하여 다시 0℃로 냉각시켰다. 3.63 g(16 mmol)의 5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르보닐 클로라이드는 40 ㎖의 CH2Cl2에 용해되었고, 분리용 깔때기로부터 15분간 한방울씩 첨가되었다. 상기 반응 혼합물을 실온에서 3일간 저어주었다. 상기 반응 혼합물은 CH2Cl2 및 H2O와 함께 분리용 깔때기로 전달되었다. 상기 물상은 CH2Cl2로 철저하게 추출되었다. 이후, 상기 CH2Cl2 추출물은 0.5 N HCl로 추출, 건조 및 증발되었다. 상기 잔기는 진공 오븐에서 추가로 건조되어 5.15 g의 황갈색의 고형 N'-(5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르보닐)-히드라진 카르복시산 tert-부틸 에스테르를 생성하였다. TLC(1:1 에틸 에세테이트:헥산)에서는 Rf=0.43의 단일한 스폿이 나타났고, NMR은 매우 정제된 산물을 나타내었다: 1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ(ppm): 7.5(br, 1H), 7.0(br, 1H), 6.75(d, 2H), 4.28(br, 4H), 2.76(m, 2H), 1.5(s, 9H), 1.18(t, 3H).
Figure 112006088387352-PCT00032
5.15 g(16 mmol)의 N'-(5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르보닐)-히드라진 카르복시산 tert-부틸 에스테르는 200 ㎖의 둥근 바닥 플라스크에 첨가되었다. 약 20 ㎖의 트리플루오로아세트산이 첨가되었고, 상기 반응 혼합물은 실온에서 24시간동안 휘저어졌다. 이후, 약 40 ㎖의 물이 첨가되었고, 냉각된 10% NaOH/H2O를 산이 중화될 때까지(pH ~14) 천천히 저으면서 첨가하였다. 상기 반응 혼합물은 분리용 깔때기로 전달되었고, 부드럽게 흔들어줌으로써 에틸 아세테이트와 함께 추출되었다(주의: 가스 발생). 상기 에틸 아세테이트 추출물은 건조 및 증발되어, 5.51 g의 희미한 점성의 노란 반고형물을 생성하였다. 이후, 상기 물질을 50℃ 진공 오븐에서 약 1시간동안 놓아 두어 4.62 g의 5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르복시산 히드라지드를 생성하였다. 상기 t-Boc 절단은 순수한 트리풀루오로아세트산을 이용할 때 가장 잘 달성된다: 부속 용매를 사용하면 수율이 항상 훨씬 낮았다. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ(ppm): 7.0(br, 1H), 6.83(m, 1H), 6.71(m, 1H), 4.28(br s, 4H), 2.76(m, 2H), 1.6(br, 2H), 1.17(t, 3H).
Figure 112006088387352-PCT00033
2,2,5,6,6-펜타메틸-헵트-4-엔-3-온(one)(1.48 g, 8.1 mmol)이 n-부틸 알 콜(20 ㎖)에 용해되었다. 이후, 5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1·,4]디옥신-6-카르복시산 히드라지드(1.80 g, 8.1 mmol) 및 10 방울의 빙초산이 첨가되었다. 상기 반응 혼합물은 20시간동안 환류되었고(완전한 반응을 위해 필요함), TLC에 의해 모니터되었다. 중간체(intermediate)인 5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르복시산(1-tert-부틸-3,4,4-트리메틸-펜트-2-에닐리덴(enylidene))-히드라지드 용액에 1.8 ㎖의 빙초산 및 1.02 g(16.2 mmol)의 나트륨 시아노보로히드라이드(cyanoborohydride)가 첨가되었다. 상기 반응은 3시간동안 환류되었다. 상기 반응은 냉각되었고, 50 ㎖의 물 및 상기 반응이 염기성(pH=ca. 14)이 될 때까지 10% 수성 NaOH가 첨가되었다. 대부분의 알콜은 회전 증발기에서 제거되었고, 상기 잔기는 EtOAc로 추출되었다. 상기 수성 추출물은 건조 및 일정한 무게로 농축되어 4 g의 점성 물질을 생성하였다. 2.3 g의 정제된 5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르복시산 N'-(1-tert-부틸-3,4,4-트리메틸-펜트-2-에닐)-히드라지드가 실리카겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 얻어졌다(노란색 오일, n-헥산 내의 25% EtOAc에서 Rf=0.30, 수율 73%). 1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ(ppm): 7.42(br, 1H), 6.80(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.71(d,J=8.4 Hz, 1H), 6.17(br, 1H), 5.30(dd,J=0.8, 10 Hz, 1H), 4.33-4.29(m, 4H), 3.68(d,J=10 Hz, 1H), 2.80(m, 2H), 1.72(s, 3H), 1.21(s, 3H), 1.12(s, 9H), 1.05(S, 9H).
Figure 112006088387352-PCT00034
5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르복시산 N'-(1-tert-부틸-3,4,4-트리메틸-펜트-2-에닐)-히드라지드(150 ㎎, 0.39 mmol) 및 3,5-디메톡시-4-메틸벤조일 클로라이드(83 ㎎, 0.39 mmol)가 5 ㎖의 CH2Cl2에 용해되었다. 5 ㎖의 25% K2CO3이 첨가되었고, 상기 반응 혼합물은 실온에서 밤새 휘저어졌다. 상기 반응은 TLC에 의해 모니터되었다. 상기 상들은 분리되었고, 조작을 돕기 위하여 CH2Cl2 및/또는 물이 필요시 추가로 첨가되었다. 상기 CH2Cl2 층은 건조되었고, 용매가 진공에서 제거되어 210 ㎎의 조 생산물을 제공하였다. 상기 물질은 실리카겔 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제되었고, 헥산 내의 10-25% 에틸 아세테이트의 단계적 농도구배(gradient)로 용출되어 3,5-디메톡시-4-메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-3,4,4-트리메틸-펜트-2-에닐)-N'-(5-에틸-2,3-디히드로-벤조[1,4]디옥신-6-카르보닐)-히드라지드 RG115898을 생성하였다(83 ㎎, n-헥산 내의 25% 에틸 아세테이트에서 Rf=0.19, 수율 38%). 1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ(ppm): 10.19(s, 1H), 6.75(d,J=8.0 Hz, 1H), 6.69(s, 2H), 6.61(d,J=8.0 Hz, 1H), 5.43(d,J=10.0 Hz, 1H), 5.41(d, 14.4 Hz, 1H), 4.30-4.20(m, 4H), 3.80(s, 6H), 2.21-2.15(m, 1H), 2.01(s, 3H), 1.81(m, 1H), 1.76-1.64(m, 1H), 1.06(s, 9H), 1.00(s, 9H), 0.70(t,J=7.6 Hz, 3H).
3,5-디메틸-벤조산 N-(1- tert -부틸- 펜틸 )- N' -(4-에틸- 벤조일 )- 히드라지드(RG-115840)의 제조
Figure 112006088387352-PCT00035
2,2-디메틸-헵탄-3-올(0.23 mol)이 자석 휘저음 막대를 갖는 500 ㎖ 둥근 바닥 플라스크에서 350 ㎖의 CH2Cl2에 용해되었다. 상기 플라스크는 얼음으로 부분적으로 냉각되었다. 76.6 g(0.355 mol)의 피리디니움 클로로코로메이트(pyridinium chlorochromate)가 격렬하게 휘저으면서 첨가되었다. 상기 반응은 검게 변했고, 약간 데워졌다. 상기 반응 혼합물은 실온에서 24시간동안 휘저어졌다. 상기 용액은 검은 슬러지(sludge)로부터 옮겨져서, 헥산으로 헹구어졌다. 상기 유기 추출물은 모아져서 실리카겔 상에서 직접 크로마토그래피되었다(주의: 단지 실리카만이 상기 환원된 비-반응성 크롬 화합물을 포획 및 제거하는 것으로 나타났다). 상기 생산물인 2,2-디메틸-헵탄-3-온은 CH2Cl2/헥산 및 순차적인 10% 에틸 아세테이트/헥산 분획 내에서 용출되었고, 29.19 g의 산물을 88% 수율로 생성하였다. 1H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ(ppm): 2.48(t, 2H), 1.54(m, 2H), 1.28(m, 2H), 1.13(s, 9H), 0.90(m, 3H).
4-에틸-벤조산 N' -(1- tert -부틸- 펜틸 )- 히드라지드의 제조
Figure 112006088387352-PCT00036
4-에틸-벤조산 히드라지드(1.64 g, 10 mmol)가 12.5 ㎖의 메탄올에 용해되었다. 이후, 한방울의 초산이 첨가되었고, 다시 1.55 g의 2,2-디메틸-헵탄-3-온이 첨가되었다. 상기 혼합물은 실온에서 수일동안 휘저어졌고, 이때 2.1 ㎖의 초산 및 667 ㎎의 NaBH3CN이 첨가되었다. ca. 7시간동안 휘저은 후, 상기 메탄올은 진공 속에서 제거되었다. 상기 잔여 생산물은 ca. 20 ㎖의 물로 희석되었고, 메틸렌 클로라이드로 추출되었다. 상기 추출물은 MgSO4에 대해 건조되었고, 고형물로부터 여과되었으며, 용매는 진공 속에서 제거되어 1.8 g의 조 생산물을 제공하였다. 상기 물질은 100% 헥산-100% 에틸 에테르 농도구배로 용출되어 실리카겔 상에서 칼럼 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 4-에틸-벤조산 N'-(1-tert-부틸-펜틸)-히드라지드는 45% 수율(1.32 g)로 회수되었다.
Figure 112006088387352-PCT00037
4-에틸-벤조산 N'-(1-tert-부틸-펜틸)-히드라지드(145.2 ㎎, 0.5 mmol)가 5 ㎖의 메틸렌 클로라이드에 용해되었고, 1.5 mmol PS-NMM(804 ㎎, a-SO2NH(CH2)3-모르폴린(morpholine) 분획화된 폴리스티렌 수지, Argonaut Technologies, San Carlos, CA에서 구입가능함)이 첨가되었다. 상기 혼합물은 3 ㎖의 메틸렌 클로라이드로 희석되어 저을 수 있는 현탁액이 생성되었다. 3,5-디메틸벤조일 클로라이드(0.5 mmol, 74 ㎖)가 첨가되었고, 상기 혼합물은 밤새 휘저어졌다. 다음날, 1 mmol(775 ㎎)의 AP-NCO 수지(이소시아네이트-기능화된 수지, Argonaut Technologies, San Carlos, CA에서 구입가능함) 및 1 mmol(401.6 ㎎)의 AP-트리스아민(폴리스티렌-CH2NHCH2CH2NH(CH2CH2NH2)2 수지, Argonaut Technologies, San Carlos, CA에서 구입가능함)이 3 ㎖의 메틸렌 클로라이드와 함께 첨가되어 잔여 출발 물질을 제거하였다. 상기 혼합물은 4시간동안 휘저어졌고, 상기 수지는 여과되었으며, 상기 여과물은 건조되어, TLC 분석에 의해 한 스폿만이 나타난 191 ㎎의 조 생산물을 제공하였다. 상기 물질은 100% 헥산-100% 에틸 에테르의 농도구배를 사용하여 실리카겔 상에서 플래쉬(flash) 크로마토그래피에 의해 정제되었다. 수울: 50 ㎎(ca. 23%) 3.5-디메틸-벤조산 N-(1-tert-부틸-펜틸)-N'-(4-에틸-벤조일)-히드라지드. 1H NMR (CDCl3, 400 MHz)δ(ppm): 7.8+7.5(br/br, 1H), 7.4-6.9(m, 7H), 4.7+3.6(m/m, 1H), 2.65(m, 2H), 2.38+2.28(s/s, 6H), 1.9+1.75(br, 2H), 1.4-1.2(br,m, 7H)1.1(br s, 9H), 0.95(br s, 3H).
리포터 분석: 리간드 첨가 후 40시간에 세포를 수확하였다. 125 ㎕의 수동(passive) 용해 버퍼(프로메가사(Promega Corporation)의 듀얼-루시퍼라제TM 리포터 분석 시스템의 일부)가 24웰 플레이트의 각 웰에 첨가되었다. 상기 플레이트는 회전 진탕기(shaker)에 15분간 놓아두었다. 20 ㎕의 용해물이 분석되었다. 루시퍼라제 활성은 프로메가사의 듀얼-루시퍼라제TM 리포터 분석 시스템을 이용하여 제조사의 지침에 따라 측정되었다. 배수 유도(fold induction, FI) 활성은 리간드 처리된 세포의 상대 광 단위(relative light unit, "RLU")를 DMSO 처리된 세포(비처리된 대조군)로 나눔으로써 계산되었다.
실시예 3
본 실시예는 일반적으로 엑디스테로이드에 반응을 하고, 엑디스테로이드에 대한 반응에서 증가된 활성을 나타내는 CfEcR 리간드 결합 도메인 치환 돌연변이체의 동정에 대해 개시한다. 엑디스테로이드 활성을 증가시키는 CfEcR 내의 치환 돌연변이를 동정하기 위한 노력으로, 본 발명자들은 아미노산 잔기들을 돌연변이시켰고, PCR-매개성 부위-유도 돌연변이유발 키트를 이용하여 상기 실시예 1에 개시된 바와 같이 GAL4/돌연변이체 CfEcR-DEF cDNA 유전자 발현 카세트를 생성하였다. 상기 실시예 1.1 및 1.2에서 개시한 다양한 스위치 구조물에 대응하는 돌연변이 및 야생형 cDNA를 제조하였고, 실시예 2에 개시된 바와 같이 GAL4-작동성 루시퍼라제 리포터 분석을 검사하였다.
치환되었을 때 엑디스테로이드 리간드에 대한 반응에서 증가된 활성을 나타내는 돌연변이체 엑디손 수용체를 생산하는 특정한 아미노산 잔기들이 동정되었다. 서열번호 1의 119 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환이 상기 돌연변이된 CfEcR- DEF 수용체의 활성에 미치는 영향이 표 3a에 Gal4/야생형 CfEcR-DEF(WT) 스위치 활성에 대한 배수 증가로 나타나 있다. 서열번호 1의 96 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 및 96 및 119 아미노산 잔기에서의 이중 아미노산 치환이 상기 돌연변이된 CfEcR-DEF 수용체의 활성에 미치는 영향이 표 3b에 EC50 및 상대적 최대 배수 유도로 나타나 있다. EC50은 세 가지-파라미터 논리학(logistic) 모델을 이용한 도스(dose) 반응 데이터로부터 계산되었다. 상대적 Max FI는 임의의 농도에서 관찰된 GS®-E 리간드(RG-102240; 3,5-디메틸-벤조산 N-tert-부틸-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라지드)의 최대 배수 유도에 대한 임의의 농도에서 관찰된 테스트 리간드(본 발명의 구현예)의 최대 배수 유도로 결정하였다.
[표 3a] 증가된 엑디스테로이드 활성을 보이는 CfEcR-DEF 돌연변이체
Figure 112006088387352-PCT00038
[표 3b] 증가된 엑디스테로이드 활성을 보이는 CfEcR-DEF 돌연변이체
Figure 112006088387352-PCT00039
표 3a 및 표 3b에 나타난 바와 같이, 엑디스테로이드의 활성은 상기 CfEcR 리간드 결합 도메인이 서열번호 1의 96 또는 119 아미노산 잔기에서 돌연변이 되거나, 및 서열번호 1의 96 및 119 아미노산 잔기에 이중 돌연변이 되었을 때 현저하게 증가되었으며, 이는 상기 잔기들이 CfEcR의 리간드 결합 포켓 내의 중요한 잔기들임을 의미한다.
실시예 4
본 실시예는 일반적으로 비-엑디스테로이드 디아실히드라진에 반응을 하고, 디아실히드라진 리간드에 대한 반응에서 증가된 활성을 나타내는 또 다른 CfEcR 리간드 결합 도메인 치환 돌연변이체의 동정에 대해 개시한다. 디아실히드라진 리간드 활성을 증가시키는 CfEcR 내의 치환 돌연변이를 동정하기 위한 노력으로, 본 발명자들은 엑디스테로이드 결합에 있어서 결정적일 것으로 예측되는 아미노산 잔기들을 돌연변이시켰고, PCR-매개성 부위-유도 돌연변이유발 키트를 이용하여 상기 실시예 1에 개시된 바와 같이 GAL4/돌연변이체 CfEcR-DEF cDNA 유전자 발현 카세트 를 생성하였다. 상기 실시예 1.1 및 1.2에서 개시한 다양한 스위치 구조물에 대응하는 돌연변이 및 야생형 cDNA를 제조하였고, 실시예 2에 개시된 바와 같이 GAL4-작동성 루시퍼라제 리포터 분석을 검사하였다.
치환되었을 때 비-엑디스테로이드 디아실히드라진 리간드에 대한 반응에서 증가된 활성을 나타내는 돌연변이체 엑디손 수용체를 생산하는 특정한 아미노산 잔기들이 동정되었다. 서열번호 1의 48, 52, 54, 109, 110, 125, 132 및 223 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 및 서열번호 1의 52 및 110 아미노산 잔기에서의 이중 아미노산 치환이 상기 돌연변이된 CfEcR-DEF 수용체의 활성에 미치는 영향이 표 4a 및 표 4b에 EC50 및 상대적 최대 배수 유도로 나타나 있다. EC50은 세 가지-파라미터 논리학 모델을 이용한 도스 반응 데이터로부터 계산되었다. 상대적 Max FI는 임의의 농도에서 관찰된 GS®-E 리간드(3,5-디메틸-벤조산 N-tert-부틸-N'-(2-에틸-3-메톡시-벤조일)-히드라지드)의 최대 배수 유도에 대한 임의의 농도에서 관찰된 테스트 리간드(본 발명의 구현예)의 최대 배수 유도로 결정하였다.
[표 4a] 증가된 디아실히드라진 리간드 활성을 보이는 CfEcR 돌연변이체
Figure 112006088387352-PCT00040
[표 4b] 증가된 디아실히드라진 리간드 활성을 보이는 CfEcR 돌연변이체
Figure 112006088387352-PCT00041
표 4a 및 표 4b에 나타난 바와 같이, 디아실히드라진의 활성은 상기 CfEcR 리간드 결합 도메인이 서열번호 1의 48, 52, 54, 109, 110, 125, 132 및 223 아미노산 잔기에서 돌연변이 되거나, 및 서열번호 1의 52 및 110 아미노산 잔기에 이중 돌연변이 되었을 때 현저하게 증가되었으며, 이는 상기 잔기들이 CfEcR의 리간드 결합 포켓 내의 중요한 잔기들임을 의미한다.
실시예 5
본 실시예는 일반적으로 디아실히드라진 및 엑디스테로이드에 반응을 하고, 디아실히드라진 리간드 및 엑디스테로이드에 대한 반응에서 증가된 활성을 나타내는 또 다른 CfEcR 리간드 결합 도메인 치환 돌연변이체의 동정에 대해 개시한다. 디아실히드라진 리간드 활성 및 엑디스테로이드 리간드 활성을 증가시키는 CfEcR 내의 치환 돌연변이를 동정하기 위한 노력으로, 본 발명자들은 아미노산 잔기들을 돌연변이시켰고, PCR-매개성 부위-유도 돌연변이유발 키트를 이용하여 상기 실시예 1에 개시된 바와 같이 GAL4/돌연변이체 CfEcR-DEF cDNA 유전자 발현 카세트를 생성하였다. 상기 실시예 1.1 및 1.2에서 개시한 다양한 스위치 구조물에 대응하는 돌연변이 및 야생형 cDNA를 제조하였고, 실시예 2에 개시된 바와 같이 GAL4-작동성 루시퍼라제 리포터 분석을 검사하였다. 서열번호 1의 109, 132, 238 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 또는 서열번호 1의 52, 107 및 127 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 및 서열번호 1의 말단 잔기에서의 글리신의 추가가 상기 돌연변이된 CfEcR-DEF 수용체의 활성에 미치는 영향이 표 5에 나타나 있다.
[표 5] 증가된 디아실히드라진 및 엑디스테로이드 활성을 보이는 CfEcR 돌연변이체
Figure 112006088387352-PCT00042
표 5에 나타난 바와 같이, 디아실히드라진 및 엑디스테로이드 활성은 모두 상기 CfEcR 리간드 결합 도메인이 48, 51, 52, 54, 96, 120, 125, 128, 132, 234 및 238 아미노산 잔기에서 돌연변이 되었을 때 증가되었으며, 이는 상기 잔기들이 CfEcR의 리간드 결합 포켓 내의 중요한 잔기들임을 의미한다.
실시예 6
본 실시예는 일반적으로 디아실히드라진 및 테트라히드로퀴놀린에 반응을 하고, 디아실히드라진 및 테트라히드로퀴놀린 리간드에 대한 반응에서 증가된 활성을 나타내는 또 다른 CfEcR 리간드 결합 도메인 치환 돌연변이체의 동정에 대해 개시한다. 디아실히드라진 리간드 활성 및 테트라히드로퀴놀린 리간드 활성을 증가시키는 CfEcR 내의 치환 돌연변이를 동정하기 위한 노력으로, 본 발명자들은 예측되 는 아미노산 잔기들을 돌연변이시켰고, PCR-매개성 부위-유도 돌연변이유발 키트를 이용하여 상기 실시예 1에 개시된 바와 같이 GAL4/돌연변이체 CfEcR-DEF cDNA 유전자 발현 카세트를 생성하였다. 상기 실시예 1.1 및 1.2에서 개시한 다양한 스위치 구조물에 대응하는 돌연변이 및 야생형 cDNA를 제조하였고, 실시예 2에 개시된 바와 같이 GAL4-작동성 루시퍼라제 리포터 분석을 검사하였다. 서열번호 1의 107, 110 및 127 아미노산 잔기에서의 삼중 돌연변이 및 서열번호 1의 110 및 127에서의 이중 돌연변이가 상기 돌연변이된 CfEcR-DEF 수용체의 활성에 미치는 영향이 표 6에 나타나 있다.
[표 6] 증가된 디아실히드라진 및 테트라히드로퀴놀린 활성을 보애는 CfEcR 돌연변이체
Figure 112006088387352-PCT00043
표 6에 나타난 바와 같이, 비-엑디스테로이드인 디아실히드라진 및 테트라히드로퀴놀린 활성은 모두 상기 CfEcR 리간드 결합 도메인이 107, 110 및 127, 및 107 및 127 아미노산 잔기에서 돌연변이 되었을 때 증가되었으며, 이는 상기 잔기들이 CfEcR의 리간드 결합 포켓 내의 중요한 잔기들임을 의미한다.
실시예 7
표 7은 상기 디아실히드라진 GSTM-E 리간드가 DMSO 대조군에 대하여 다양한 농도에서 다양한 CfEcR 돌연변이체의 최대 배수 유도에 미치는 영향을 나타내고 있다.
[표 7]
Figure 112006088387352-PCT00044
실시예 8
본 실시예는 디아실히드라진 리간드에 대한 반응에서 감소된 활성을 나타내는 또 다른 CfEcR 리간드 결합 도메인 치환 돌연변이체의 동정에 대해 개시한다. 디아실히드라진 리간드 활성을 감소시키는 CfEcR 내의 치환 돌연변이를 동정하기 위한 노력으로, 본 발명자들은 디아실히드라진 결합에 있어서 결정적일 것으로 예측되는 아미노산 잔기들을 돌연변이시켰고, PCR-매개성 부위-유도 돌연변이유발 키트를 이용하여 상기 실시예 1에 개시된 바와 같이 GAL4/돌연변이체 CfEcR-DEF cDNA 유전자 발현 카세트를 생성하였다. 상기 실시예 1.1 및 1.2에서 개시한 다양한 스위치 구조물에 대응하는 돌연변이 및 야생형 cDNA를 제조하였고, 실시예 2에 개시된 바와 같이 GAL4-작동성 루시퍼라제 리포터 분석을 검사하였다. 서열번호 1의 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 120, 125, 219, 223, 234 또는 238 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환이 상기 돌연변이된 CfEcR-DEF 수용체의 활성에 미치는 영향이 표 8a 및 표 8b에 나타나 있다.
[표 8a] 감소된 디아실히드라진 활성을 보이는 CfEcR 돌연변이체
Figure 112006088387352-PCT00045
Figure 112006088387352-PCT00046
[표 8b] 감소된 디아실히드라진 활성을 보이는 CfEcR 돌연변이체
Figure 112006088387352-PCT00047
표 8a 및 표 8b에 나타난 바와 같이, 디아실히드라진의 활성은 상기 CfEcR 리간드 결합 도메인이 서열번호 1의 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 120, 125, 219, 223, 234 또는 238 아미노산 잔기에서 돌연변이 되었을 때 현저하게 감소되었으며, 이는 상기 잔기들이 CfEcR의 리간드 결합 포켓 내의 중요한 잔기들임을 의미한다.
실시예 9
본 실시예는 일반적으로 테트라히드로퀴놀린에 반응을 하고, 테트라히드로퀴놀린 리간드에 대한 반응에서 증가된 활성을 나타내는 또 다른 CfEcR 리간드 결합 도메인 치환 돌연변이체의 동정에 대해 개시한다. 테트라히드로퀴놀린 리간드 활성을 증가시키는 CfEcR 내의 치환 돌연변이를 동정하기 위한 노력으로, 본 발명자들은 아미노산 잔기들을 돌연변이시켰고, PCR-매개성 부위-유도 돌연변이유발 키트를 이용하여 상기 실시예 1에 개시된 바와 같이 GAL4/돌연변이체 CfEcR-DEF cDNA 유전자 발현 카세트를 생성하였다. 상기 실시예 1.1 및 1.2에서 개시한 다양한 스위치 구조물에 대응하는 돌연변이 및 야생형 cDNA를 제조하였고, 실시예 2에 개시된 바와 같이 GAL4-작동성 루시퍼라제 리포터 분석을 검사하였다. 서열번호 1의 110 또는 127 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환 또는 서열번호 1의 110 및 128 아미노산 잔기에서의 이중 아미노산 치환이 상기 돌연변이된 CfEcR-DEF 수용체의 활성에 미치는 영향이 표 9에 나타나 있다.
[표 9] 증가된 테트라히드로퀴놀린 활성을 보이는 CfEcR 돌연변이체
Figure 112006088387352-PCT00048
표 9에 나타난 바와 같이, 테트라히드로퀴놀린의 활성은 상기 CfEcR 리간드 결합 도메인이 서열번호 1의 110 또는 128 아미노산 잔기에서 돌연변이 되거나, 또는 서열번호 1의 110 및 128 아미노산 잔기에서 이중 돌연변이 되었을 때 현저하게 증가되었으며, 이는 상기 잔기들이 CfEcR의 리간드 결합 포켓 내의 중요한 잔기들임을 의미한다.
실시예 10
본 실시예는 디아실히드라진 리간드에 구별되게 반응하는 또 다른 CfEcR 리간드 결합 도메인 치환 돌연변이체의 동정에 대해 개시한다. 상기 돌연변이체는 디아실히드라진 활성을 일반적으로 감소시킨다; 그러나, 이들은 특정한 디아실히드라진 리간드에 대해 선별적으로 반응한다. 상기 CfEcR 내의 치환 돌연변이를 동정하기 위한 노력으로, 본 발명자들은 특정한 아미노산 잔기들을 돌연변이시켰고, PCR-매개성 부위-유도 돌연변이유발 키트를 이용하여 상기 실시예 1에 개시된 바와 같이 GAL4/돌연변이체 CfEcR-DEF cDNA 유전자 발현 카세트를 생성하였다. 상기 실 시예 1.1 및 1.2에서 개시한 다양한 스위치 구조물에 대응하는 돌연변이 및 야생형 cDNA를 제조하였고, 실시예 2에 개시된 바와 같이 GAL4-작동성 루시퍼라제 리포터 분석을 검사하였다. 서열번호 1의 52, 95, 109, 125 또는 132 아미노산 잔기에서의 아미노산 치환이 상기 돌연변이된 CfEcR-DEF 수용체의 활성에 미치는 영향이 표 10a 및 표 10b에 나타나 있다.
[표 10a] 감소된 디아실히드라진 활성 및 디아실히드라진 RG-115855에 대한 반응에서 증가된 활성을 보이는 CfEcR 돌연변이체
Figure 112006088387352-PCT00049
[표 10b] 감소된 RG-102240 디아실히드라진 활성 및 다른 디아실히드라진에 대한 반응에서 증가된 활성을 보이는 CfEcR 돌연변이체
Figure 112006088387352-PCT00050
표 10a 및 표 10b에 나타난 바와 같이, 디아실히드라진의 활성은 상기 CfEcR 리간드 결합 도메인이 서열번호 1의 52, 95, 109, 125 또는 132 아미노산 잔기에서 돌연변이 되었을 때 구별되게 영향을 받았으며, 이는 상기 잔기들이 CfEcR의 리간드 결합 포켓 내의 중요한 잔기들임을 의미한다.
본 발명은 본 명세서에서 개시된 상기 특정한 구현예들에 의해 그 범위가 제한되지 않는다. 실제로, 본 명세서에서 개시된 것에 더하여 전술한 상세한 설명 및 첨부된 도면으로부터 본 발명을 다양하게 변형할 수 있다는 것은 해당 분야에 능숙한 당업자에게 자명할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구의 범위 내에 들어가는 것으로 간주된다.
아울러, 핵산 또는 폴리펩티드에 있어서 모든 염기 크기 또는 아미노산 크기, 및 모든 분자량 또는 분자 질량값(mass value)은 근사값이며, 설명을 위해 제공된 것임이 이해될 것이다.
<110> RheoGene, Inc. Palli, Subba Reddy Kumar, Mohan <120> Mutant Receptors and Their Use in a Nuclear Receptor-Based Inducible Gene Expression System <130> 2006-HP-1035 <150> US 60/567,294 <151> 2004-04-30 <150> US Not yet assigned (A01508-US) <151> 2005-04-29 <150> US 60/609,424 <151> 2004-09-13 <160> 176 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 259 <212> PRT <213> Choristoneura fumiferana <400> 1 Leu Thr Ala Asn Gln Gln Phe Leu Ile Ala Arg Leu Ile Trp Tyr Gln 1 5 10 15 Asp Gly Tyr Glu Gln Pro Ser Asp Glu Asp Leu Lys Arg Ile Thr Gln 20 25 30 Thr Trp Gln Gln Ala Asp Asp Glu Asn Glu Glu Ser Asp Thr Pro Phe 35 40 45 Arg Gln Ile Thr Glu Met Thr Ile Leu Thr Val Gln Leu Ile Val Glu 50 55 60 Phe Ala Lys Gly Leu Pro Gly Phe Ala Lys Ile Ser Gln Pro Asp Gln 65 70 75 80 Ile Thr Leu Leu Lys Ala Cys Ser Ser Glu Val Met Met Leu Arg Val 85 90 95 Ala Arg Arg Tyr Asp Ala Ala Ser Asp Ser Val Leu Phe Ala Asn Asn 100 105 110 Gln Ala Tyr Thr Arg Asp Asn Tyr Arg Lys Ala Gly Met Ala Tyr Val 115 120 125 Ile Glu Asp Leu Leu His Phe Cys Arg Cys Met Tyr Ser Met Ala Leu 130 135 140 Asp Asn Ile His Tyr Ala Leu Leu Thr Ala Val Val Ile Phe Ser Asp 145 150 155 160 Arg Pro Gly Leu Glu Gln Pro Gln Leu Val Glu Glu Ile Gln Arg Tyr 165 170 175 Tyr Leu Asn Thr Leu Arg Ile Tyr Ile Leu Asn Gln Leu Ser Gly Ser 180 185 190 Ala Arg Ser Ser Val Ile Tyr Gly Lys Ile Leu Ser Ile Leu Ser Glu 195 200 205 Leu Arg Thr Leu Gly Met Gln Asn Ser Asn Met Cys Ile Ser Leu Lys 210 215 220 Leu Lys Asn Arg Lys Leu Pro Pro Phe Leu Glu Glu Ile Trp Asp Val 225 230 235 240 Ala Asp Met Ser His Thr Gln Pro Pro Pro Ile Leu Glu Ser Pro Thr 245 250 255 Asn Leu Gly <210> 2 <211> 1022 <212> DNA <213> Cytomegalovirus <400> 2 tcaatattgg ccattagcca tattattcat tggttatata gcataaatca atattggcta 60 ttggccattg catacgttgt atctatatca taatatgtac atttatattg gctcatgtcc 120 aatatgaccg ccatgttggc attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 180 gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 240 gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 300 agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gagtatttac ggtaaactgc 360 ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtccg ccccctattg acgtcaatga 420 cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttacgggact ttcctacttg 480 gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatggtg atgcggtttt ggcagtacac 540 caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc ccattgacgt 600 caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc gtaacaactg 660 cgatcgcccg ccccgttgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga ggtctatata 720 agcagagctc gtttagtgaa ccgtcagatc actagaagct ttattgcggt agtttatcac 780 agttaaattg ctaacgcagt cagtgcttct gacacaacag tctcgaactt aagctgcagt 840 gactctctta aggtagcctt gcagaagttg gtcgtgaggc actgggcagg taagtatcaa 900 ggttacaaga caggtttaag gagaccaata gaaactgggc ttgtcgagac agagaagact 960 cttgcgtttc tgataggcac ctattggtct tactgacatc cactttgcct ttctctccac 1020 ag 1022 <210> 3 <211> 720 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gcccccgagg agatgcctgt ggacaggatc ctggaggcag agcttgctgt ggaacagaag 60 agtgaccagg gcgttgaggg tcctggggga accgggggta gcggcagcag cccaaatgac 120 cctgtgacta acatctgtca ggcagctgac aaacagctat tcacgcttgt tgagtgggcg 180 aagaggatcc cacacttttc ctccttgcct ctggatgatc aggtcatatt gctgcgggca 240 ggctggaatg aactcctcat tgcctccttt tcacaccgat ccattgatgt tcgagatggc 300 atcctccttg ccacaggtct tcacgtgcac cgcaactcag cccattcagc aggagtagga 360 gccatctttg atcgggtgct gacagagcta gtgtccaaaa tgcgtgacat gaggatggac 420 aagacagagc ttggctgcct gagggcaatc attctgttta atccagatgc caagggcctc 480 tccaacccta gtgaggtgga ggtcctgcgg gagaaagtgt atgcatcact ggagacctac 540 tgcaaacaga agtaccctga gcagcaggga cggtttgcca agctgctgct acgtcttcct 600 gccctccggt ccattggcct taagtgtcta gagcatctgt ttttcttcaa gctcattggt 660 gacaccccca tcgacacctt cctcatggag atgcttgagg ctccccatca actggcctga 720 720 <210> 4 <211> 198 <212> DNA <213> Choristoneura fumiferana <400> 4 tgtctggtat gcggggacag agcctccgga taccactaca atgcgctcac gtgtgaaggg 60 tgtaaagggt tcttcagacg gagtgttacc aaaaatgcgg tttatatttg taaattcggt 120 cacgcttgcg aaatggacat gtacatgcga cggaaatgcc aggagtgccg cctgaagaag 180 tgcttagctg taggcatg 198 <210> 5 <211> 66 <212> PRT <213> Choristoneura fumiferana <400> 5 Cys Leu Val Cys Gly Asp Arg Ala Ser Gly Tyr His Tyr Asn Ala Leu 1 5 10 15 Thr Cys Glu Gly Cys Lys Gly Phe Phe Arg Arg Ser Val Thr Lys Asn 20 25 30 Ala Val Tyr Ile Cys Lys Phe Gly His Ala Cys Glu Met Asp Met Tyr 35 40 45 Met Arg Arg Lys Cys Gln Glu Cys Arg Leu Lys Lys Cys Leu Ala Val 50 55 60 Gly Met 65 <210> 6 <211> 441 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 6 atgaagctac tgtcttctat cgaacaagca tgcgatattt gccgacttaa aaagctcaag 60 tgctccaaag aaaaaccgaa gtgcgccaag tgtctgaaga acaactggga gtgtcgctac 120 tctcccaaaa ccaaaaggtc tccgctgact agggcacatc tgacagaagt ggaatcaagg 180 ctagaaagac tggaacagct atttctactg atttttcctc gagaagacct tgacatgatt 240 ttgaaaatgg attctttaca ggatataaaa gcattgttaa caggattatt tgtacaagat 300 aatgtgaata aagatgccgt cacagataga ttggcttcag tggagactga tatgcctcta 360 acattgagac agcatagaat aagtgcgaca tcatcatcgg aagagagtag taacaaaggt 420 caaagacagt tgactgtatc g 441 <210> 7 <211> 147 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 7 Met Lys Leu Leu Ser Ser Ile Glu Gln Ala Cys Asp Ile Cys Arg Leu 1 5 10 15 Lys Lys Leu Lys Cys Ser Lys Glu Lys Pro Lys Cys Ala Lys Cys Leu 20 25 30 Lys Asn Asn Trp Glu Cys Arg Tyr Ser Pro Lys Thr Lys Arg Ser Pro 35 40 45 Leu Thr Arg Ala His Leu Thr Glu Val Glu Ser Arg Leu Glu Arg Leu 50 55 60 Glu Gln Leu Phe Leu Leu Ile Phe Pro Arg Glu Asp Leu Asp Met Ile 65 70 75 80 Leu Lys Met Asp Ser Leu Gln Asp Ile Lys Ala Leu Leu Thr Gly Leu 85 90 95 Phe Val Gln Asp Asn Val Asn Lys Asp Ala Val Thr Asp Arg Leu Ala 100 105 110 Ser Val Glu Thr Asp Met Pro Leu Thr Leu Arg Gln His Arg Ile Ser 115 120 125 Ala Thr Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ser Asn Lys Gly Gln Arg Gln Leu 130 135 140 Thr Val Ser 145 <210> 8 <211> 606 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 8 atgaaagcgt taacggccag gcaacaagag gtgtttgatc tcatccgtga tcacatcagc 60 cagacaggta tgccgccgac gcgtgcggaa atcgcgcagc gtttggggtt ccgttcccca 120 aacgcggctg aagaacatct gaaggcgctg gcacgcaaag gcgttattga aattgtttcc 180 ggcgcatcac gcgggattcg tctgttgcag gaagaggaag aagggttgcc gctggtaggt 240 cgtgtggctg ccggtgaacc acttctggcg caacagcata ttgaaggtca ttatcaggtc 300 gatccttcct tattcaagcc gaatgctgat ttcctgctgc gcgtcagcgg gatgtcgatg 360 aaagatatcg gcattatgga tggtgacttg ctggcagtgc ataaaactca ggatgtacgt 420 aacggtcagg tcgttgtcgc acgtattgat gacgaagtta ccgttaagcg cctgaaaaaa 480 cagggcaata aagtcgaact gttgccagaa aatagcgagt ttaaaccaat tgtcgtagat 540 cttcgtcagc agagcttcac cattgaaggg ctggcggttg gggttattcg caacggcgac 600 tggctg 606 <210> 9 <211> 202 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 9 Met Lys Ala Leu Thr Ala Arg Gln Gln Glu Val Phe Asp Leu Ile Arg 1 5 10 15 Asp His Ile Ser Gln Thr Gly Met Pro Pro Thr Arg Ala Glu Ile Ala 20 25 30 Gln Arg Leu Gly Phe Arg Ser Pro Asn Ala Ala Glu Glu His Leu Lys 35 40 45 Ala Leu Ala Arg Lys Gly Val Ile Glu Ile Val Ser Gly Ala Ser Arg 50 55 60 Gly Ile Arg Leu Leu Gln Glu Glu Glu Glu Gly Leu Pro Leu Val Gly 65 70 75 80 Arg Val Ala Ala Gly Glu Pro Leu Leu Ala Gln Gln His Ile Glu Gly 85 90 95 His Tyr Gln Val Asp Pro Ser Leu Phe Lys Pro Asn Ala Asp Phe Leu 100 105 110 Leu Arg Val Ser Gly Met Ser Met Lys Asp Ile Gly Ile Met Asp Gly 115 120 125 Asp Leu Leu Ala Val His Lys Thr Gln Asp Val Arg Asn Gly Gln Val 130 135 140 Val Val Ala Arg Ile Asp Asp Glu Val Thr Val Lys Arg Leu Lys Lys 145 150 155 160 Gln Gly Asn Lys Val Glu Leu Leu Pro Glu Asn Ser Glu Phe Lys Pro 165 170 175 Ile Val Val Asp Leu Arg Gln Gln Ser Phe Thr Ile Glu Gly Leu Ala 180 185 190 Val Gly Val Ile Arg Asn Gly Asp Trp Leu 195 200 <210> 10 <211> 420 <212> DNA <213> Choristoneura fumiferana <400> 10 atgagacgcc gctggtccaa caacgggggc ttccagacgc tgcgaatgct cgaggagagc 60 tcgtccgaag tgacgtcgtc ctcagctctg ggtctgccgg ccgcgatggt tatgtctccg 120 gagtcgctcg cctcgccaga gtacggcggg ctcgagctct ggggatacga cgatgggttg 180 tcatacaaca cggcgcagtc cttgctgggc aatacttgca cgatgcagca gcagcaacag 240 acgcagccgc tgccgtcgat gccgttgcct atgccgccga ccacgccgaa gtctgaaaac 300 gagtctattt cctcaggccg 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<221> misc_feature <222> (22)..(24) <223> n is a, c, g, or t <400> 134 gaagtgcagt agatcctcga tnnngtaggc catgccagcc 40 <210> 135 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 135 gcctacgtca tcgaggatat gctgcacttc tgccgg 36 <210> 136 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 136 ccggcagaag tgcagcatat cctcgatgac gtaggc 36 <210> 137 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 137 gcctacgtca tcgaggataa cctgcacttc tgccgg 36 <210> 138 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 138 ccggcagaag tgcaggttat cctcgatgac gtaggc 36 <210> 139 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 139 cgtcatcgag gatgtactgc acttctgccg 30 <210> 140 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 140 cggcagaagt gcagtacatc ctcgatgacg 30 <210> 141 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 141 gcctacgtca tcgaggatga actgcacttc tgcc 34 <210> 142 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 142 ggcagaagtg cagttcatcc tcgatgacgt aggc 34 <210> 143 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 143 gcatgcaaaa ctccaacaag tgcatctccc tcaag 35 <210> 144 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 144 cttgagggag atgcacttgt tggagttttg catgc 35 <210> 145 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 145 gcatgcaaaa ctccaactgg tgcatctccc tcaagct 37 <210> 146 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 146 agcttgaggg agatgcacca gttggagttt tgcatgc 37 <210> 147 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 147 ctcggcatgc aaaactccaa ctattgcatc tccctcaagc tcaag 45 <210> 148 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 148 cttgagcttg agggagatgc aatagttgga gttttgcatg ccgag 45 <210> 149 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 149 catgcaaaac tccaacgcgt gcatctccct caag 34 <210> 150 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 150 cttgagggag atgcacgcgt tggagttttg catg 34 <210> 151 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 151 ctccaacatg tgcatctcca agaagctcaa gaacag 36 <210> 152 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 152 ctgttcttga gcttcttgga gatgcacatg ttggag 36 <210> 153 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 153 ctccaacatg tgcatctccc gcaagctcaa gaacag 36 <210> 154 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 154 ctgttcttga gcttgcggga gatgcacatg ttggag 36 <210> 155 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 155 ctccaacatg tgcatctcct acaagctcaa gaacag 36 <210> 156 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 156 ctgttcttga gcttgtagga gatgcacatg ttggag 36 <210> 157 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 157 gctgccgcct ttcatggagg agatctggga tg 32 <210> 158 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 158 catcccagat ctcctccatg aaaggcggca gc 32 <210> 159 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 159 gctgccgcct ttcattgagg agatctggga tgtg 34 <210> 160 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 160 cacatcccag atctcctcaa tgaaaggcgg cagc 34 <210> 161 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 161 ctgccgcctt tccgagagga gatctgggat g 31 <210> 162 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 162 catcccagat ctcctctcgg aaaggcggca g 31 <210> 163 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 163 gctgccgcct ttctgggagg agatctggga tgtg 34 <210> 164 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 164 cacatcccag atctcctccc agaaaggcgg cagc 34 <210> 165 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 165 ctcgaggaga tcccggatgt ggcaggacat g 31 <210> 166 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 166 catgtcctgc cacatccggg atctcctcga g 31 <210> 167 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 167 cctcgaggag atcgaggatg tggcaggaca tg 32 <210> 168 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 168 catgtcctgc cacatcctcg atctcctcga gg 32 <210> 169 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 169 ctcgaggaga tcttggatgt ggcaggacat g 31 <210> 170 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 170 catgtcctgc cacatccaag atctcctcga g 31 <210> 171 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 171 cctcgaggag atcatggatg tggcaggaca tgtc 34 <210> 172 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 172 gacatgtcct gccacatcca tgatctcctc gagg 34 <210> 173 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 173 cctcgaggag atctacgatg tggcaggaca tgtc 34 <210> 174 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 174 gacatgtcct gccacatcgt agatctcctc gagg 34 <210> 175 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 175 ggaattcccg gggatccggc ctgagtgcgt agtaccc 37 <210> 176 <211> 46 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 176 ctctctgcgg ccgcctatcc gagattcgtg ggggactcga ggatag 46

Claims (21)

  1. 숙주 세포에서 발현될 수 있는 유전자 발현 카세트를 포함하는 유전자 발현 조절 시스템으로서, 상기 유전자 발현 카세트는 ⅰ) 트랜스활성 도메인; ⅱ) 그 발현이 조절되는 유전자와 연관되어 있는 반응 요소를 인식하는 DNA-결합 도메인; 및 ⅲ) 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하며,
    상기 돌연변이는 1) 서열번호 1의 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219, 223, 234 및 238 중 적어도 하나, 2) 서열번호 1의 96 및 119 모두, 3) 서열번호 1의 110 및 128 모두, 4) 서열번호 1의 52 및 110 모두, 5) 서열번호 1의 107, 110 및 127 모두, 6) 서열번호 1의 52, 107 및 127 모두, 및 7) 서열번호 1의 107, 127 및 259 모두, 또는 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에 있는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 척추동물 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인, 무척추동물 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인, 울트라스피라클 단백질 리간드 결합 도메인, 및 제1 폴리펩티드 절편이 척추동물 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인, 무척추동물 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인, 또는 울트라스피라클 단백질 리간드 결합 도메인 유래이고, 제2 폴리펩티드 절편이 다른 척추동물 레 티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인, 무척추동물 레티노이드 X 수용체 리간드 결합 도메인, 또는 울트라스피라클 단백질 리간드 결합 도메인 유래인 두 가지 폴리펩티드 절편을 포함하는 키메라 리간드 결합 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 제2 핵수용체 리간드 결합 도메인을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절 시스템.
  3. 1) ⅰ) 그 발현이 조절되는 유전자와 연관되어 있는 반응 요소를 인식하는 DNA-결합 도메인; 및 ⅱ) 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 제1 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에서 발현될 수 있는 제1 유전자 발현 카세트; 및
    2) ⅰ) 트랜스활성 도메인; 및 ⅱ) 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 제2 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 숙주 세포에서 발현될 수 있는 제2 유전자 발현 카세트를 포함하는 유전자 발현 조절 시스템으로서,
    상기 핵수용체 리간드 결합 도메인 중 하나는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인이고, 상기 돌연변이는 1) 서열번호 1의 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219, 223, 234 및 238 중 적어도 하나, 2) 서열번호 1의 96 및 119 모두, 3) 서열번호 1의 110 및 128 모두, 4) 서열번호 1의 52 및 110 모두, 5) 서열번호 1의 107, 110 및 127 세 개 모두, 6) 서열번호 1의 52, 107 및 127 세 개 모두, 및 7) 서열번호 1의 107, 127 및 259 세 개 모두, 또는 이의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택 되는 아미노산 잔기에 대해 동등한 또는 상동성 위치에 있는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절 시스템.
  4. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체, 유비쿼터스 수용체, 오르판 수용체 1, NER-1, 스테로이드 호르몬 핵수용체 1, 레티노이드 X 수용체 상호작용 단백질-15, 간 X 수용체β, 스테로이드 호르몬 수용체 유사 단백질, 간 X 수용체, 간 X 수용체α, 파네소이드 X 수용체, 수용체 상호작용 단백질 14, 및 파네솔 수용체로 구성된 군으로부터 선택되는 그룹 H 핵수용체 유래인 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절 시스템.
  5. 제4항에 있어서, 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 적어도 하나의 아미노산 잔기의 돌연변이를 일으키는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되고, 상기 아미노산 잔기는 1) 서열번호 1의 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219, 223, 234 및 238 아미노산 잔기 중 적어도 하나, 2) 서열번호 1의 96 및 119 아미노산 잔기 모두, 3) 서열번호 1의 110 및 128 아미노산 잔기 모두, 4) 서열번호 1의 52 및 110 아미노산 잔기 모두, 5) 서열번호 1의 107, 110 및 127 아미노산 잔기 세 개 모두, 6) 서열번호 1의 52, 107 및 127 아미노산 잔기 세 개 모두, 또는 7) 서열번호 1의 107, 127 및 259 아미노산 잔기 세 개 모두, 또는 이의 임의의 조합에 대해 동등한 또는 상동성 위치에 있는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절 시스템.
  6. 제5항에 있어서, 치환 돌연변이를 포함하는 상기 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인은 엑디손 수용체 리간드 결합 도메인인 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절 시스템.
  7. 제6항에 있어서, 상기 돌연변이는 서열번호 1의 F48Y, F48W, F48L, F48N, F48R, F48K, I51M, I51N, I51L, T52M, T52V, T52L, T52E, T52P, T52R, T52W, T52G, T52Q, M54W, M54T, M92L, M92E, R95H, R95M, R95W, V96L, V96W, V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M, F109N, A110E, A110N, A110W, N119F, Y120W, Y120M, M125P, M125R, M125E, M125L, M125C, M125W, M125G, M125I, M125N, M125S, M125V, V128F, L132M, L132N, L132V, L132E, M219K, M219W, M219Y, M219A, L223K, L223R, L223Y, L234M, L234I, L234R, L234W, W238P, W238E, W238Y, W238M, W238L, N119F/V96T, V128F/A110P, T52V/A110P, V107I/Y127E/T52V, V107I/Y127E/G259 및 V107I/Y127E/A110P로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절 시스템.
  8. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 DNA-결합 도메인은 엑디손 수용체 DNA-결합 도메인, GAL4 DNA-결합 도메인, 및 LexA DNA-결합 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절 시스템.
  9. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 트랜스활성 도메인은 엑디손 수용체 트랜스활성 도메인, VP16 트랜스활성 도메인, B42 산성 활성자 트랜스활성 도메인, 및 p65 트랜스활성 도메인으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 유전자 발현 조절 시스템.
  10. 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드로서, 상기 단리된 폴리뉴클레오티드는 1) 서열번호 1의 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219, 223, 234 및 238 아미노산 잔기 중 적어도 하나, 2) 서열번호 1의 96 및 119 아미노산 잔기 모두, 3) 서열번호 1의 110 및 128 아미노산 잔기 모두, 4) 서열번호 1의 52 및 110 아미노산 잔기 모두, 5) 서열번호 1의 107, 110 및 127 아미노산 잔기 세 개 모두, 6) 서열번호 1의 52, 107 및 127 아미노산 잔기 세 개 모두, 또는 7) 서열번호 1의 107, 127 및 259 아미노산 잔기 세 개 모두, 또는 이의 임의의 조합에 대해 동등한 또는 상동성 위치에 있는 아미노산 잔기의 적어도 하나의 돌연변이를 일으키는 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  11. 제10항에 있어서, 상기 돌연변이는 서열번호 1의 F48Y, F48W, F48L, F48N, F48R, F48K, I51M, I51N, I51L, T52M, T52V, T52L, T52E, T52P, T52R, T52W, T52G, T52Q, M54W, M54T, M92L, M92E, R95H, R95M, R95W, V96L, V96W, V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M, F109N, A110E, A110N, A110W, N119F, Y120W, Y120M, M125P, M125R, M125E, M125L, M125C, M125W, M125G, M125I, M125N, M125S, M125V, V128F, L132M, L132N, L132V, L132E, M219K, M219W, M219Y, M219A, L223K, L223R, L223Y, L234M, L234I, L234R, L234W, W238P, W238E, W238Y, W238M, W238L, N119F/V96T, V128F/A110P, T52V/A110P, V107I/Y127E/T52V, V107I/Y127E/G259 및 V107I/Y127E/A110P로 구성된 군으로부터 선택되는 돌연변이를 일으키는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  12. 전사 조절 인자와 기능적으로 연결되어 있는 제10항의 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
  13. 제12항의 발현 벡터를 포함하는 단리된 숙주 세포로서, 상기 전사 조절 인자가 상기 숙주 세포에서 기능을 하는 것을 특징으로 하는 단리된 숙주 세포.
  14. 제10항에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 단리된 폴리펩티드.
  15. 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 그룹 H 핵수용체 리간드 결합 도메인을 포함하는 단리된 폴리펩티드로서, 상기 돌연변이는 1) 서열번호 1의 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219, 223, 234 및 238 아미 노산 잔기 중 적어도 하나, 2) 서열번호 1의 96 및 119 아미노산 잔기 모두, 3) 서열번호 1의 110 및 128 아미노산 잔기 모두, 4) 서열번호 1의 52 및 110 아미노산 잔기 모두, 5) 서열번호 1의 107, 110 및 127 아미노산 잔기 세 개 모두, 6) 서열번호 1의 52, 107 및 127 아미노산 잔기 세 개 모두, 또는 7) 서열번호 1의 107, 127 및 259 아미노산 잔기 세 개 모두, 또는 이의 임의의 조합에 대해 동등한 또는 상동성 위치에 있는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 돌연변이는 서열번호 1의 F48Y, F48W, F48L, F48N, F48R, F48K, I51M, I51N, I51L, T52M, T52V, T52L, T52E, T52P, T52R, T52W, T52G, T52Q, M54W, M54T, M92L, M92E, R95H, R95M, R95W, V96L, V96W, V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M, F109N, A110E, A110N, A110W, N119F, Y120W, Y120M, M125P, M125R, M125E, M125L, M125C, M125W, M125G, M125I, M125N, M125S, M125V, V128F, L132M, L132N, L132V, L132E, M219K, M219W, M219Y, M219A, L223K, L223R, L223Y, L234M, L234I, L234R, L234W, W238P, W238E, W238Y, W238M, W238L, N119F/V96T, V128F/A110P, T52V/A110P, V107I/Y127E/T52V, V107I/Y127E/G259 및 V107I/Y127E/A110P로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 단리된 폴리펩티드.
  17. 1) 제1항 또는 제3항에 따른 유전자 발현 조절 시스템을 숙주 세포 내로 도입하는 단계; 및 2) 상기 숙주 세포에 리간드를 도입하는 단계를 포함하는 숙주 세 포에서 유전자의 발현을 조절하는 방법으로서,
    상기 조절되는 유전자는 ⅰ) 상기 DNA-결합 도메인에 의해 인식되는 반응 요소; ⅱ) 상기 트랜스활성 도메인에 의해 활성화되는 프로모터; 및 ⅲ) 그 발현이 조절되는 유전자를 포함하는 유전자 발현 카세트의 성분인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 상기 리간드는
    1) 하기 식의 화합물:
    Figure 112006088387352-PCT00051
    상기에서, E는 분지된 (C4-C12)알킬 또는 3차 탄소를 포함하는 분지된 (C4-C12)알케닐 또는 3차 탄소를 포함하는 시아노(C3-C12)알킬이고;
    R1은 H, Me, Et, i-Pr, F, 포밀, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, CoCH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OH, OMe, OEt, 사이클로프로필, CF2CF3, CH=CHCN, 알릴, 아지도(azido), SCN, 또는 SCHF2 이고;
    R2는 H, Me, Et, N-Pr, i-Pr, 포밀, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, CoCH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe2, NEt2, SMe, SEt, SOCF3, OCF2CF2H, COEt, 사이클로프로필, CF2CF3, CH=CHCN, 알릴, 아지도, OCF3, OCHF2, O-i-Pr, SCN, SCHF2, SOMe, NH-CN, 또는 R3과 결합되고, R2 및 R3이 부착되는 상기 페닐 탄소는 에틸렌디옥시, 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디히드로퓨릴 고리, 또는 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디히드로피릴 고리를 형성하며;
    R3은 H, Et, 또는 R2와 결합되고, R2 및 R3이 부착되는 상기 페닐 탄소는 에틸렌디옥시, 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디히드로퓨릴 고리, 또는 페닐 탄소에 인접한 산소를 갖는 디히드로피릴 고리를 형성하며;
    R4, R5 및 R6은 독립적으로 H, Me, Et, F, Cl, Br, 포밀, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CN, CoCH, 1-프로피닐, 2-프로피닐, 비닐, OMe, OEt, SMe, 또는 세트(set)이다;
    2) 하기 식의 화합물:
    Figure 112006088387352-PCT00052
    상기에서, R1은 CH2CH3, CH3, 또는 CH3이고;
    R2는 OCH3, CH2CH3 또는 i-Pr이고; 및
    R3 및 R4는 CH3이다;
    3) 하기 식의 화합물:
    Figure 112006088387352-PCT00053
    상기에서, R1 및 R2는 F이고; 및
    R3는 3-F-4-CH3-Ph 또는 3-CH3-4-F-Ph이다; 및
    4) 엑디손, 20-히드록시엑디손, 포나스테론 A, 무리스테론 A, 옥시스테롤, 22(R) 히드록시콜레스테롤, 24(S) 히드록시콜레스테롤, 25-에폭시콜레스테롤, T0901317, 5-알파-6-알파-에폭시콜레스테롤-3-설페이트, 7-케토폴레스테롤-3-설페이트, 파네솔, 담즙산, 1,1-비포스포네이트 에스테르, 또는 미숙 호르몬 Ⅲ
    로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 숙주 세포에 제2 리간드를 도입하는 단계를 추가로 포함하며, 상기 제2 리간드는 9-시스-레티노산 또는 레티노산의 합성 상동체인 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제1항 또는 제3항에 따른 유전자 발현 조절 시스템을 포함하는 단리된 숙주 세포.
  21. 제20항의 숙주 세포를 포함하는 비-인간 생명체.
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