BRPI0510498B1 - Sistema de modulação da expressão de genes, vetor de expressão, célula hospedeira e organismo não humano, bem como método de modulação da expressão de gene em célula hospedeira - Google Patents

Abstract

sistema de modulação da expressão de genes; polinucleotídeo isolado que codifica um domínio de ligação a ligante de receptor nuclear do grupo h compreendendo pelo menos uma mutação; vetor de expressão; célula hospedeira isolada; polipeptídio isolado que compreende um domínio de ligação a ligante do receptor nuclear do grupo h que compreende pelo menos uma mutação; método para a modulação da expressão de um gene em uma célula hospedeira; célula hospedeira isolada; e organismo não humano. a presente invenção refere-se à área da biotecnologia ou da engenharia genética. especificamente, esta invenção se refere à área da expressão genética. mais especificamente, a invenção em questão se refere a receptores mutantes por substituição inusitados e ao uso dos mesmos em um sistema de expressão genética induzível com base no receptor nuclear e a métodos de modulação da expressão genética em uma célula hospedeira para aplicações tais como terapia genética, produção de proteínas e anticorpos em larga escala,ensaios de peneiramento de produção ultra-alta baseada em célula, genômicos funcionais e regulagem das peculiaridades dos organismos transgênicos.

Description

(54) Título: SISTEMA DE MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE GENES, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA E ORGANISMO NÃO HUMANO, BEM COMO MÉTODO DE MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE GENE EM CÉLULA HOSPEDEIRA (51) Int.CI.: C07K 14/47; C07K 19/00; C12N 1/00; C12N 5/02; C12N 5/10; C12N 15/12; C12N 15/62; C12N 15/63 (30) Prioridade Unionista: 13/09/2004 US 60/609,424, 29/04/2005 US 11/118,855, 30/04/2004 US 60/567,294 (73) Titular(es): INTREXON CORPORATION (72) Inventor(es): SUBBA REDDY PALLI; MOHAN BASAVARAJU KUMAR

1/207 “SISTEMA DE MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE GENES, VETOR DE EXPRESSÃO, CÉLULA HOSPEDEIRA E ORGANISMO NÃO HUMANO, BEM COMO MÉTODO DE MODULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE GENE EM CÉLULA HOSPEDEIRA” [001] O presente pedido reivindica a prioridade do pedido provisório N° U.S. 60/567.294, depositado em 30 de abril de 2004 e do pedido provisório N° U.S. 60/609.424, depositado em 13 de setembro de 2004.

CAMPO DA INVENÇÃO [002] A presente invenção refere-se à área da biotecnologia ou engenharia genética. Especificamente, esta invenção se refere à área da expressão dos genes. Mais especificamente, se refere, esta invenção, a receptores nucleares inusitados, que compreendem uma mutação por substituição e seu uso em um sistema de expressão de genes induzíveis, com base no receptor nuclear, e a métodos que modulam a expressão de um gene dentro de uma célula hospedeira, utilizando este sistema de expressão genética passível de indução.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [003] Citam-se inúmeras publicações no presente, cujas descrições encontram-se aqui incorporadas integralmente. No entanto, a citação de qualquer referência em questão, não

Petição 870170062693, de 25/08/2017, pág. 15/23 deve ser interpretada como se tal referência estivesse disponibilizada na seção Técnica Anterior do presente pedido.

i.

Na área da engenharia genética, o controle preciso da expressão do gene é uma ferramenta valiosa no estudo, manipulação e controle do desenvolvimento e demais processos fisiológicos. A expressão genética é um processo biológico complexo, que envolve inúmeras interações específicas de proteína com proteína. A fim de disparar a expressão do gene, de tal modo que o mesmo produza o RNA necessário, como uma primeira etapa na síntese protéica, um ativador transcricional deve ser levado próximo a um promotor que controle a transcrição genética. Tipicamente, o ativador transcricional por si só é associado a uma proteína que tenha ao menos um domínio de ligação do DNA, que se una aos sítios de ligação do DNA presentes nas regiões do promotor de genes. Nesse sentido, para que ocorra a expressão do gene, uma proteína que compreenda o domínio ligante do DNA e um domínio de transativação situados a uma distância apropriada do domínio ligante do DNA deve ser colocada na posição correta na região do promotor do gene.

A abordagem transgênica tradicional utiliza um promotor específico do tipo célula para acionar a expressão da transgene designada. Uma construção de DNA que contém o transgene é primeiramente incorporada dentro de um genoma hospedeiro. Quando ativada por um ativador transcricional, a expressão do transgene ocorre de um determinado tipo de célula.

•η k '

Outro meio para regular a expressão de genes estranhos nas células, dá-se através de produtores induzíveis. Exemplos do uso de tais promotores induzíveis englobam o promotor PRla, sistemas repressor-operador procarióticos, sistemas imunossupressores-imunofilínicos, e sistema de ativação da transcrição eucariótica mais altos, tais como os sistemas hormonais ecdiesteróides e estão descritos abaixo.

O promotor PRl-a oriundo do tabaco é induzido durante a resposta da resistência adquirida sistêmica após o acometimento de um ataque patogênico. O uso do PRl-a pode ser limitado porque muitas das vezes ele responde a materiais endógenos e a fatores externos, tais como patógenos, radiação por UV-B e poluentes. Foram descritos sistemas de regulação genética baseados nos promotores induzidos por choque térmico, pelo Interferon e metais pesados (Wurn et al., 1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83: 5414-5418; Amheiter et al. , 1990, Cell 62:51-61; Filmus et al., 1992, Nucleic Acids Research 20:27550-27560). Contudo, esses sistemas apresentam limitações decorrentes de seus efeitos sobre a expressão de genes não almejados. Esses sistemas também apresentam imperfeições.

O sistema repressor-operador procariótico utiliza proteínas repressoras bacterianas e as únicas seqüências de DNA operadoras âs quais elas se ligam. Ambos os sistemas repressores-operadores de tetraciclina (Tet), como a lactose (Lac) provenientes da bactéria Escherichia coli foram utilizados em plantas e em animais para controlarem a expressão genética. No sistema tet, a tetraciclina se une à proteína repressora TetR, resultando em uma alteração conformacional que libera a proteína repressora da operadora, que, por sua vez, permite que ocorra a transcrição. No sistema Lac, a operadora Lac é responsável pela presença da lactose, ou do análogo sintético, tal como isopropila-b-Dtiogalactosídio. Infelizmente, o uso de tais sistemas restringe-se pela instabilidade da química nos ligantes, isto ê, a tetraciclina e a lactose, a toxidade das mesmas, sua presença natural ou níveis relativamente elevados requeridos na indução ou na repressão. Por razões similares, a utilidade de tais sistemas em animais é limitada.

As moléculas imunossupressoras, tais como a FK506, rapamicina e ciclosporina A podem unir-se às imunofilinas FKBP12, à ciclofilina, etc. Quando se utiliza esta informação, delineia-se uma estratégia geral para unir quaisquer das duas proteínas simplesmente colocando a FK506 em cada uma das duas proteínas ou colocando-se a FK506 em uma e a ciclosporina A em outra. Um homodímero sintético A do FK506 (FK1012), ou um composto resultante da fusão da FK506ciclosporina (FKCsA) pode, então, ser usado para induzir a dimerização dessas moléculas (Spencer et a., 1993, Science 262: 1019-24; Belshaw et al. , 1996 Proc Natl Acad Sci US A 93: 4604-7) . O domínio de ligação do DNA Gal4 fusionado na

FKBP12 e no domínio ativador VP16 fusionado com a ciclofilina, e com o composto FKCsA foram usados para demonstrar a heterodimerização e a ativação de um gene repórter mediante o controle de um promotor que contém sítios ligantes Gal4. Infelizmente, esse sistema inclui os imunossupressantes que possuem efeitos colaterais indesejados e, nesse sentido, limita seu uso em várias aplicações de comutação genética em mamíferos.

Empregaram-se, também, os sistemas de ativação de transcrição eucariótica mais elevados, tais como os sistemas receptores de hormônio esteróides. Os receptores de hormônios esteróides são membros da superfamília receptora nuclear e são encontrados nas células dos vertebrados e dos invertebrados. Infelizmente, o uso de compostos esteroidais, que ativam os receptores para a regulagem da expressão genética, particularmente em plantas e mamíferos, é limitado devido ao envolvimento dos mesmos em muitos outros caminhos biológicos em tais organismos. A fim de superar tais dificuldades, desenvolveu-se um sistema alternativo, que utiliza receptores ecdisona de inseto.

O crescimento, a muda e o desenvolvimento em insetos são regulados pelo hormônio esteróide ecdisona (hormônio da muda) e pelo hormônio juvenil (Dhadialla, et al. , 1998, Annu Rev. Entomol. 43:545-569). O alvo molecular para a ecdisona em insetos consiste em pelo menos no receptor ecdisona (EcR) e na proteína do ultraspiracle (USP). EcR é um membro da família do super receptor esteróide nuclear que se caracteriza pela assinatura DNA e pelos domínios de ligação do ligante, e um domínio de ativação (Koelle et al. , 1991, Cell, 67:59-77) . Os receptores EcR são responsáveis por inúmeros compostos ecdiesteroidais, tais como a ponasterona A e o muristerona A. Recentemente, descreveram-se compostos não-esteroidais /0 com atividade agonista ecdiesteróide, incluindo-se nesses, os tebufenozidas e os metoxifenozidas de inseticidas disponíveis comercialmente, que são comercializados em âmbito mundial pela empresa Rohm and Haas Company (vide o Pedido de Patente Internacional N- PCT/EP96/00686 e a Patente US 5.530.028). Ambos esses análogos apresentam perfis excepcionalmente seguros em relação a outros organismos.

O receptor ecdisona de inseto (EcR) heterodimeriza-se com o Ultraspiracle (USP), o homólogo de inseto em mamíferos RXR, e une elementos de resposta do receptor ecdiesteróides e ecdisona e ativa a transcrição dos genes responsivos ao ecdisona (Riddford et al. , 2000) . Os complexos EcR/USP/ligantes desempenham papéis importantes durante o desenvolvimento e a reprodução do inseto. O EcR é um membro da superfamília do receptor de hormônio esteróide e possui cinco domínios modulares, A/B (transativação), C (ligação de DNA, heterodimerização)), D (Articulação, heterodimerização), E (junção de ligante, heterodimerização e transativação e domínios F (transativação). Alguns desses domínios, tais como o A/B, C e E retêm sua função quando são fusionados a outras proteínas.

Os sistemas de expressão genética passíveis de indução estritamente regulados ou comutadores genéticos são úteis para várias aplicações, tais como terapia genética, produção em larga escala de proteínas em células, ensaios de peneiramento altamente produzidos com base em célula, genômicos funcionais e regulagem de traços em plantas e animais transgênicos.

A primeira versão do comutador genético baseado em EcR utilizou a Drosophila melanogaster EcR (DmEcR) e o Mus musculus RXR (MmRXR) e demonstrou esses receptores na presença da ecdisona, ponasteronaA, genes repórteres transativados em linhas celulares de mamíferos e camundongos transgênicos (Christopherson et al., 1992; No et al., 1996). Em seguida, Suhr et al., 1998 mostrou que o agonista ecdisona não-ecdiesteróide, o tebufenozida, induziram elevados níveis de transativação de genes repórteres em células de mamíferos através do Bombyx morí EcR BmEcR), na ausência do companheiro heterodimérico exógeno.

Os Pedidos Internacionais de Patente N— PCT/US97/ 05330 (WO 97/38117) e PCT/US99/08381 (WO 99/58155), revelam métodos de modulação da expressão de um gene exógeno, no qual uma construção de DNA, que compreende o gene exógeno e um elemento de resposta ecdisona é ativada por meio de uma segunda construção de DNA, que compreende um receptor ecdisona que, na presença de um ligante para aquele receptor capaz de agir como um companheiro silencioso, une-se ao elemento de resposta do ecdisona a fim de induzir a expressão genética. O receptor ecdisona escolhido foi isolado da Drosophila melanogaster. Tipicamente, tais sistemas requerem a presença do companheiro silencioso, de preferência, o receptor X retinóide RXRO, a fim de fornecer uma ótima ativação. Nas células de mamíferos, o receptor ecdisona de inseto (EcR) heterodimeriza-se com o receptor X retinóide (RXR) e regula a expressão dos genes alvo de forma dependente do ligante. O Pedido Internacional de Patente N² PCT/US98/ /oi

14215 (WO 99/02683) revela que o receptor ecdisona isolado do Bombyx morí, conhecido como o bicho-da-seda, é funcional nos sistemas de mamíferos, sem que se faça necessário um companheiro de dímero exógeno.

A Patente N² U.S. 6.265.173 BI revela que vários membros da superfamília esteróide/tiróide de receptores podem combinar-se com o receptor ultraspiracle da Drosophila melanogaster (USP) ou fragmentos da mesma, compreendendo ao menos o domínio da dimerização de USP para uso em um sistema de expressão do gene. A Patente N² U.S. 5.880.333 revela uma Drosophila melanogaster EcR e o sistema heterodímero ultraspiracle (USP) usado em plantas, no qual o domínio da transativação e o domínio de ligação do DNA ficam posicionados sobre duas proteínas híbridas diferentes. Infelizmente, esses sistemas baseados em USP são constitutivos em células animais e, portanto, não são eficazes para regular a expressão do gene repórter.

Em cada um desses casos, o domínio da transativação e o domínio ligante do DNA (tanto o EcR nativo como no Pedido Internacional de Patente N² PCT/US98/14215, ou no Pedido Internacional de Patente N² PCT/US97/05330), foram incorporados formando uma única molécula e os demais companheiros heterodiméricos, tanto o USP como o RXR foram usados em seus estados nativos.

Os inconvenientes dos sistemas de regulagem do gene com base do EcR supra descrito abrangem uma atividade antecedente considerável na ausência de ligantes e a nãoaplicabilidade desses sistemas para uso tanto em plantas como /0 em animais (vide Patente N² U.S. 5.880.333). Nesse sentido, existe uma necessidade na técnica em torno de sistemas baseados em EcR aperfeiçoados que modulem precisamente a expressão de genes exógenos tanto em plantas como em animais. Tais sistemas aperfeiçoados seriam utilizáveis em aplicações tais como na terapia genética, produção em larga escala de proteínas e anticorpos, ensaios de peneiramento de elevada produção com base em células, genômicos funcionais e regulagem de traços em animais transgênicos. Em determinadas aplicações, tais como a terapia genética, é possível que se queira obter um sistema de expressa genética induzivel que responda bem aos ligantes não-ecdiesteróides e no mesmo seja insensível aos ecdiesteróides naturais. Por conseguinte, os sistemas aperfeiçoados e simples, compactos dependentes de ligantes e que não são muito caros, são fáceis de serem encontrados e têm alto teor de toxicidade ao hospedeiro provariam ser úteis para regular os sistemas biológicos.

Os Depositantes demonstraram, primeiramente, que um sistema de expressão genética induzivel baseado no receptor de ecdisona, no qual a transativação e os domínios de ligação do DNA ficavam separados um do outro, ao colocálos em duas proteínas diferentes, resulta numa atividade antecedente enormemente reduzida na ausência de um ligante e aumentada de forma significativa em relação à antecedente na presença de um ligante (pedido pendente PCT/US01/09050, ora incorporado integralmente no presente à guisa de referência). Este sistema bi-híbrido consiste em um sistema de modulação da expressão genética induzivel significativa-mente aperfei/0 çoado em comparação com os dois sistemas revelados nos pedidos PCT/US97/05330 e PCT/US98/14215. O sistema bihíbrido explora a capacidade que tem um par de proteínas interatuantes de tornar o domínio da ativação da transcrição uma posição mais favorável ao domínio ligante de DNA, tal como quando o domínio ligante de DNA unia-se ao sítio do ligante de DNA sobre o gene, o domínio de transati-vação ativava de forma mais eficaz o promotor (vide, por exemplo, a Patente N² U.S. 5.283.173) . Em suma, o sistema de expressão genética bi-híbrido compreende dois cassetes de expressão genética; o primeiro codifica um domínio ligante de DNA fusionado com um polipeptídio do receptor nuclear, e o segundo codifica um domínio de transativação fusionado com um polipeptídio diferente do receptor nuclear. Na presença do ligante, a interação do primeiro polipeptídio com o segundo polipeptídio amarra o domínio do ligante de DNA ao domínio de transativação. Uma vez que o ligante do DNA e os dominós de transativação residem em duas moléculas diferentes, a atividade antecedente na ausência de ligante fica bastante reduzida.

Um sistema bi-híbrido proporciona, ainda, maior sensibilidade aos ligantes não-ecdiesteroidais, por exemplo, diacilidrazinas, em comparação com os ligantes ecdiesteroidais, por exemplo, pona-esterona a (PonA) ou muri-esterona A (MurA). Ou seja, quando se compara aos ecdiesteróides, os ligantes não-ecdiesteroidais proporcionam atividade ultra elevada em baixa concentração. Ademais, desde que a transativação baseada nas comutações genéticas EcR. dependa muitas /Γ vezes da linha celular, fica mais fácil individualizar os sistemas de comutação para obter máxima capacidade de transativação para cada aplicação. Além do mais, o sistema bi-híbrido impede alguns efeitos colaterais devido à expressão excessiva de RXR que ocorre muitas vezes quando o RXR inalterado é usado como um companheiro comutador. Em um sistema bi-híbrido preferido, a ligação de DNA nativa e os domínios da transativação de EcR ou RXR são eliminados e, como resultado, essas moléculas híbridas têm menos chance de interagir com os demais receptores do hormônio esteróide presente na célula que resulta na redução dos efeitos colaterais.

O EcR é um membro da superfamilia do receptor nuclear e classifica-se na subfamília 1, grupo H (ora designado como os receptores nucleares do Grupo H) . Os membros de cada grupo compartilham de 40-60% da identidade do aminoácido no domínio (união do ligante) E (Laudet et al. , A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor

Subfamily,	1999 ;	Cell 97	: 161-163)	Além	do	receptor
ecdisona,	outros	membros	desta	subfamília	de	receptor
nuclear 1,	grupo	H incluem	: receptor	ubíquo	(UR) ,	receptor
Orphan 1	(OR-1),	receptor	nuclear	de	hormônio esteróide 1

(NER-1), proteína-15 interatuante RXR (RIP-15), vivente x receptor β (LXR3), proteína do tipo receptor hormonal esteróide (RLD-1), vivente x receptor (LXR), vivente x receptor ot, (LXRot) , farnesóide x receptor (FXR) , proteína interatuante de receptor 14 (RIP-14), e receptor farnesol (HRR-1).

Para desenvolver um sistema de expressão genética induzível baseado em receptor nuclear do Grupo H, no qual a ligação do ligante ou a especificidade do ligante seja modificada, os Depositantes criaram o mutante de substituição EcRs, que compreende resíduos de aminoácidos substituídos no domínio de ligação do ligante (LBD). Uma abordagem de modelação e protocolo foi utilizada: para prognosticar resíduos cruciais que mediam a ligação de ecdiesteróides e não-ecdiesteróides para o LBD do EcR. Esses Ecrs mutantes de substituição foram avaliados na ligação de ligante e nos ensaios de transativação. Como ora apresentado, os novos receptores nucleares do mutante de; substituição dos Depositantes e seus uso em um sistema de expressão genética induzível baseado em receptor nuclear fornecem um sistema de expressão genética induzível aperfeiçoada tantos em células hospedeiras procarióticas como eucarióticas, nas quais a sensibilidade do ligante e a magnitude da transativação podem ser escolhidas, como se desejar, dependendo da aplicação.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os Depositantes descrevem no presente a construção dos receptores nucleares do Grupo H, que· compreende mutações de substituição (ora designadas como mutantes de substituição) em resíduos de aminoácidos, que; ficam envolvidos na ligação do ligante ao domínio de ligação do ligante receptor nuclear do Grupo H, que afeta a sensibilidade do ligante e a magnitude de indução do receptor nuclear do Grupo H, junto com a demonstração de que esses receptores nucleares mutantes /7 de substituição são úteis nos métodos de modulação da expressão genética.

Os Depositantes desenvolveram, especificamente, um sistema inusitado de expressão genética induzivel com base no receptor nuclear, que compreende o domínio de ligação do ligante do receptor nuclear do Grupo H, que compreende uma mutação de substituição. Os Depositantes mostraram que os efeitos de uma mutação de substituição desta natureza pode aumentar ou diminuir a atividade dè ligação do ligante ou a sensibilidade do ligante e o ligante pode ser específico de ecdiesteróide ou não-ecdiesteróide. Por conseguinte, a invenção dos Depositantes proporciona um sistema de expressão genética induzivel com base no receptor nuclear útil para modular a expressão de um gene de interesse em uma célula hospedeira. Em uma modalidade particularmente desejável, a invenção dos Depositantes proporciona um sistema de expressão genética induzivel com base no receptor ecdisona, que responde unicamente aos ligantes ecdiesteroidais ou aos ligantes não-ecdiesteroidais. Além disso, a presente invenção proporciona ainda um sistema de expressão genética induzivel com base no receptor ecdisona responsivo ao ligante nãoecdiesteroidal aperfeiçoado. Portanto, o sistema inusitado de expressão genética induzivel dos Depositantes e seu uso em métodos de modulação da expressão genética em uma célula hospedeira superam as limitações dos atuais sistemas de expressão disponíveis e proporciona ao versado nessas técnicas um meio eficaz de controlar a expressão genética.

A presente invenção é útil em aplicações tais como a terapia genética, produção de proteínas e anticorpos em larga escala, ensaios de peneiramento em elevada produção baseada em célula, ensaios de peneiramento de ligante ortogonal, genômicos, proteômicos, metabolômicos funcionais e regulagem das peculiaridades dos organismos transgênicos, quando se fizer desejável o controle dos níveis de expressão genética. A vantagem da invenção dos Depositantes é que a mesma propicia um meio para regular a expressão genética e individualizar os níveis da expressão personalizando-os aos requisitos do usuário.

DEFINIÇÕES

Nesta exposição, usam-se inúmeros termos e abreviações. São apresentadas as definições a seguir, que devem ser úteis no entendimento do âmbito e prática da presente invenção.

Em uma modalidade específica, o termo cerca de ou aproximadamente significa limites de até 20%, de preferência de até 10%, mais preferivelmente de até 5% e, ainda mais preferivelmente, de até 1% para um dado valor ou faixa.

termo substancialmente livre significa que uma composição compreendendo A (em que A é uma única proteína, molécula de DNA, vetor, célula hospedeira recombinante ou outro) é substancialmente livre de B (em que B compreende uma ou mais proteínas, moléculas de DNA, vetores e outros contaminantes) , quando pelo menos cerca de 75% em peso das proteínas, DNA, vetores (dependendo da /'Ι categoria de espécies a que pertencem A e B) na composição são de A. De preferência, A compreende pelo menos cerca de 90% em peso das espécies A + B na composição, mais preferivelmente pelo menos cerca de 99% em peso. Também se prefere que uma composição que seja substancialmente livre de contaminação contenha apenas uma espécie de peso molecular único com a atividade ou característica da espécie de interesse.

O termo isolado, para fins da presente invenção, designa um material biológico (ácido nucléico ou proteína) que tenha sido removido de seu ambiente original (o ambiente em que está naturalmente presente) . Por exemplo, um polinucleotídeo presente no estado natural em uma planta ou um animal não está isolado; entretanto, o mesmo polinucleotídeo separado dos ácidos nucléicos adjacentes em que está naturalmente presente é considerado isolado. O termo purificado não requer que o material esteja presente em uma forma que exiba pureza absoluta, excluindo a presença de outros compostos. É, ao invés, uma definição relativa.

Um polinucleotídeo está no estado purificado após a purificação do material de partida ou do material natural em pelo menos uma ordem de magnitude, de preferência 2 ou 3 e, de preferência, 4 ou 5 ordens de magnitude.

Um ácido nucléico é um composto polimérico composto por subunidades covalentemente ligadas chamadas de nucleotídeos. Ácido nucléico inclui ácido polirribonucleíco (RNA) e ácido polidesoxirribonucleíco (DNA), ambos podendo ser de fita simples ou fita dupla. DNA inclui, mas não se ο+Ο limita a, cDNA, DNA genômico, DNA de plasmideos, DNA sintético e DNA semi-sintético. O DNA pode ser linear, circular ou superespiralado.

Uma molécula de ácido nucléico se refere à forma polimérica de éster fosfato de ribonucleosídeos (adenosina, guanosina, uridina ou citidina; moléculas de RNA) ou desoxirribonucleosídeos (desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxitimidina ou desoxicitidina; moléculas de DNA) ou a quaisquer análogos de fosfoéster desses, como fosforotioatos e tioésteres, em forma de fita simples ou de hélice em fita dupla. São possíveis hélices de DNA-DNA, DNA-RNA e RNA-RNA de fita dupla. O termo molécula de ácido nucléico e, em particular, molécula de DNA ou RNA, se refere apenas às estruturas primária e secundária da molécula e não se limita a qualquer forma terciária em particular. Assim, esse termo inclui DNA de fita dupla encontrado, entre outros, em moléculas de DNA lineares ou circulares (por exemplo, fragmentos de restrição), plasmideos e cromossomos. Na discussão da estrutura de moléculas de DNA de fita dupla particulares, as seqüências podem ser aqui descritas de acordo com a convenção normal de dar apenas a seqüência na direção 5' para 3' ao longo da fita não transcrita de DNA (isto é, a fita com a seqüência homóloga ao mRNA) . Uma molécula de DNA recombinante é uma molécula de DNA que tenha sofrido uma manipulação biológica molecular.

O termo fragmento deve ser entendido como significando uma seqüência de nucleotídeos de comprimento reduzido com relação ao ácido nucléico de referência e oC/ι compreendendo, na parte comum, uma seqüência de nucleotídeos idêntica ao ácido nucleico de referência. Esse fragmento de ácido nucleico de acordo com a invenção pode ser, quando apropriado, incluído em um polinucleotídeo maior do qual seja um constituinte. Esses fragmentos compreendem ou, alternativamente, consistem em oligonucleotídeos de comprimento variando de pelo menos 6, 8, 9, 10, 12, 15, 18,

20,	21, 22,	23,	24,	25,	30, 39, 40,	42,	45, 48, 50, 51, 54,
57,	60, 63,	6 6 ,	70,	75,	78, 80, 90,	100,	105, 120, 135, 150,
200,	300,	500,	720,	900, 1.000	ou	1.500 nucleotídeos
consecutivos	de	um ácido	nucléico de	acordo com a invenção.

Conforme aqui usado, um fragmento de ácido nucleico isolado é um polímero de RNA ou DNA que seja de fita simples ou dupla, opcionalmente contendo bases nucleotídicas sintéticas, não naturais ou alteradas. Um fragmento de ácido nucleico isolado na forma de um polímero de DNA pode ser composto por um ou mais segmentos de cDNA, DNA genômico ou DNA sintético.

Um gene se refere a uma montagem de nucleotídeos que codifique um polipeptídio e inclui ácidos nucléicos de cDNA e DNA genômico. Gene também se refere a um fragmento de ácido nucléico que expresse uma proteína ou polipeptídio específico, incluindo seqüências reguladoras precedente (seqüências não codificadoras 5') e seguindo (seqüências não codificadoras 3') a seqüência codificadora. Gene nativo se refere a um gene conforme encontrado na natureza com suas próprias seqüências reguladoras. Gene quimérico se refere a qualquer gene que não seja um gene nativo, compreendendo ,Ί Q seqüências reguladoras e/ou codificadoras que não sejam encontradas juntas na natureza. Portanto, um gene quimérico pode compreender seqüências reguladoras e seqüências codificadoras que sejam derivadas de diferentes fontes, ou seqüências reguladoras e seqüências codificadoras derivadas da mesma fonte, mas dispostas de maneira diferente da encontrada na natureza. Um gene quimérico pode compreender seqüências codificadoras derivadas de diferentes fontes e/ou seqüências reguladoras derivadas de diferentes fontes. Gene endógeno se refere a um gene nativo em sua localização natural no genoma de um organismo. Um gene estranho ou gene heterólogo se refere a um gene normalmente não encontrado no organismo hospedeiro, mas que tenha sido introduzido no organismo hospedeiro por transferência de gene. Genes estranhos podem compreender genes nativos inseridos em um organismo não nativo ou genes quiméricos. Um transgene é um gene que tenha sido introduzido no genoma por um procedimento de transformação.

DNA heterólogo se refere a DNA não localizado naturalmente na célula ou em um sítio cromossômico da célula. De preferência, o DNA heterólogo inclui um gene estranho à célula.

O termo genoma inclui DNA ou RNA cromossômico, assim como mitocondrial, cloroplástico e viral.

Uma molécula de ácido nucléico é hibridizável com outra molécula de ácido nucléico, como um cDNA, DNA genômico ou RNA, quando a forma de fita simples da molécula de ácido nucléico pode se anelar a outra molécula de ácido nucleico sob as condições apropriadas de temperatura e força iônica da solução (veja Sambrook et al., 1989 infra). As condições de hibridização e lavagem são bem conhecidas e estão exemplificadas em Sambrook, J. , Fritshc, E. F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor (1989), particularmente o Capítulo 11 e a Tabela 11.1 (inteiramente incorporados aqui por referência). As condições de temperatura e força iônica determinam o rigor da hibridização.

Condições rigorosas podem ser ajustadas para triar fragmentos moderadamente similares, como seqüências homólogas de organismos distantemente relacionados, a fragmentos altamente similares, como genes que dupliquem enzimas funcionais de organismos intimamente relacionados. Para uma triagem preliminar de ácidos nucléicos homólogos, podem-se usar condições de hibridização de baixo rigor, correspondentes a uma T_m de 55°, por exemplo, 5x SSC, 0,1% de SDS, 0,25% de leite e nenhuma formamida; ou 30% de formamida, 5x SSC, 0,5% de SDS. Condições de hibridização de rigor moderado correspondente a uma T_m mais elevada, por exemplo, 40% de formamida, com 5x ou 6x SCC. Condições de hibridização de elevado rigor correspondente à T_m mais alta, por exemplo, 50% de formamida, 5x ou 6x SCC.

A hibridização requer que os dois ácidos nucléicos contenham seqüências complementares se bem que, dependendo do rigor da hibridização, são possíveis combinações inadequadas entre as bases. O termo complementar é usado para

Jj descrever a relação entre as bases nucleotídeas que são capazes de uma hibridização uma com a outra. Por exemplo, em relação ao DNA, a adenosina é complementar à timina e a citosina é complementar â guanina. Em conformidade com isso, a presente invenção também inclui fragmentos isolados de ácido nucléico que são complementares em relação às seqüências completas, conforme revelado ou usado na presente invenção, bem como suas seqüências de ácido nucléico substancialmente similares.

Em uma incorporação específica da invenção, os polinucleotídeos são detectados pela aplicação de condições de hibridização que compreendem uma etapa de T_m de 55°C e utilizando condições conforme estabelecido acima. Em uma incorporação preferencial, a T_m é de 60 °C; em uma incorporação mais preferencial, a T_m é de 63 °C e em uma incorporação até mais preferencial, a T_m é de 65°C.

As lavagens pós-hibridização também determinam as condições de rigor. Um conjunto de condições preferidas usa uma série de lavagens iniciando com 6X SSC, 0,5% SDS, a temperatura ambiente, por 15 minutos (min), e então repetida com 2X SSC, 0,5% SDS a 45°C por 30 minutos, e depois repetida por duas vezes com 0,2X SSC, 0,5% SDS a 50°C por 30 minutos. Um conjunto mais preferido de condições de rigor usa temperaturas superiores nas quais as lavagens são idênticas àquelas acima, exceto quanto à temperatura das duas lavagens finais de 30 min em 0,2X SSC, 0,5% SDS, que foi aumentada para 60°C. Um outro conjunto preferido de condições altamente rigorosas usa duas lavagens finais em οΖ)

0,IX SSC, 0,1% SDS a 65°C. A hibridização requer que os dois ácidos nucléicos compreendam seqüências complementares, se bem que, dependendo do rigor da hibridização, são possíveis combinações inadequadas entre as bases.

O rigor apropriado para a hibridização de ácidos nucléicos depende do comprimento dos ácidos nucléicos e o grau de complementação, variáveis bem conhecidas na ciência. Quanto mais elevado o grau de similaridade ou homologia entre as duas seqüências nucleotideas, mais elevado o valor da T_m para híbridos de ácidos nucléicos que contêm tais seqüências. A estabilidade relativa (que corresponde a uma T_m mais elevada) de hibridizações de ácido nucléico decresce na seguinte ordem: RNA:RNA, DNA:RNA, DNA:DNA. Para híbridos de comprimento superior a 100 nucleotídeos, foram derivadas as equações para calcular a T_m (veja Sambrook et al, supra, 9,50-0,51). Para a hibridização com ácidos nucléicos mais curtos, por exemplo, os oligonucleotídeos, a posição de combinações inadequadas torna-se mais importante e o comprimento do oligonucleotídeo determina sua especificidade (veja Sambrook et al, supra, 11,7-11,8).

Em uma incorporação específica da invenção, os polinucleotídeos são detectados pela aplicação de condições de hibridização que compreende uma etapa de hibridização em menos de 500 mM de sal e, pelo menos, 37 graus Celsius, e uma etapa de lavagem em 2XSSPE a, pelo menos, 63 graus Celsius. Em uma incorporação preferida, as condições de hibridização compreendem menos de 200 mM de sal e, pelo menos, 37 graus Celsius para a etapa de hibridização. Em uma ; Ο oéÜ·-⁵ incorporação mais preferida, as condições de hibridização compreendem 2XSSPE e 63 graus Celsius para ambas as etapas de hibridização e de lavagem.

Em uma incorporação, o comprimento para um ácido nucléico hibridizável é de, pelo menos, 10 nucleotídeos. De preferência, um comprimento mínimo para um ácido nucléico hibridizável é de, pelo menos, 15 nucleotídeos; mais preferencialmente de, pelo menos, 20 nucleotídeos; e mais preferencialmente o comprimento é de, pelo menos, 30 nucleotídeos. Além disso, o cientista habilitado irá reconhecer que a temperatura e a concentração de sal da solução de lavagem pode ser ajustada de acordo com a necessidade a fatores tais como o comprimento de uma amostra (probe).

O termo amostra refere-se a uma molécula de ácido nucléico de fita simples que pode parear com base com um ácido nucléico complementar alvo de fita simples para formar uma molécula de fita dupla.

Conforme usado no presente documento, o termo oligonucleotídeo refere-se a um ácido nucléico, geralmente de, pelo menos, 18 nucleotídeos, que é hibridizável com uma molécula DNA genômica, uma molécula cDNA, um DNA de plasmídeos ou uma molécula mRNA. Os oligonucleotídeos podem ser rotulados, por exemplo, com ³²P-nucleotídeos ou nucleotídeos aos quais um rótulo, tal como a biotina, foi covalentemente conjugado. Um oligonucleotídeo rotulado pode ser usado como amostra para detectar a presença de um ácido nucléico. Os oligonucleotídeos (um ou ambos que podem ser rotulados) podem ser usados como iniciadores PCR, quer para αό Γ a clonagem de um comprimento total ou um fragmento de ácido nucleico ou para detectar a presença de um ácido nucleico. Um oligonucleotídeo também pode ser usado para formar uma hélice tripla com uma molécula de DNA. Geralmente, os oligonucleotídeos são sintetícamente preparados, de preferência em um sintetizador de ácido nucléico. Em conformidade com isso, os oligonucleotídeos podem ser preparados com ligações análogas fosfoéster que não ocorrem naturalmente, tais como ligações tioéster etc.

Um iniciador que um oligonucleotídeo que hibridiza em relação a uma seqüência de ácido nucléico alvo para criar um região de ácido nucléico de fita dupla que pode servir como um ponto de iniciação para a síntese de DNA sob condições adequadas. Tais iniciadores podem ser usados em uma reação de cadeira de polimerase.

Uma reação em cadeia de polimerase é abreviado como PCR e significa um método in vitro de amplificação por meio de enzimas de seqüências específicas de ácido nucléico. A PCR envolve séries repetitivas de ciclos de temperatura, com cada ciclo compreendendo três estágios: desnaturação do modelo de ácido nucléico para separar as fitas da molécula alvo, anelamento de um iniciador de oligonucleotídeo PCR de fita simples a um modelo de ácido nucléico e alongamento do(s) iniciador(es) anelados por polimerase DNA. A PCR proporciona os meios para detectar a presença de uma molécula alvo e, sob condições quantitativas ou semiquantitativas, para determinar a quantidade relativa da molécula alvo dentro do agregado inicial de ácidos nucléicos.

A reação em cadeia de polimerase por transcrição reversa é abreviada como RT-PCR e significa o método in vitro para produzir por meio de enzimas uma molécula cDNA alvo ou moléculas a partir de uma molécula ou moléculas RNA, seguida por uma amplificação enzimática de uma seqüência específica de ácido nucléico ou seqüências dentro da molécula ou moléculas cDNA alvo conforme descritas acima. A

RT-PCR também proporciona um meio para detectar a presença de uma molécula alvo e, sob condições quantitativas ou semiquantitativas, para determinar a quantidade relativa da molécula alvo dentro do agregado inicial de ácidos nucléicos.

Uma seqüência de codificação DNA é uma seqüência de DNA de fita dupla que foi transcrita e traduzida in vitro ou in vivo para um polipeptídio em uma célula quando colocado sob o controle de seqüências reguladoras apropriadas. Seqüências reguladoras adequadas referem-se a seqüências nucleotídeas localizadas à montante (seqüências não codificadoras 5'), dentro, ou à jusante (seqüências não codificadoras 3') de uma seqüência de codificação, a qual influencia a transcrição, processamento ou estabilidade RNA, ou tradução da seqüência de codificação associada. As seqüências reguladoras podem incluir promotores, seqüências-líder de tradução, íntrons, seqüências de reconhecimento de poliadenilação, local de processamento RNA, sítio efetor de ligação e estrutura em grampo (stem-loop). Os limites da seqüência de codificação são determinados por um códon inicial no 5' (amino)-terminal e um códon final de tradução no 3' (carboxila) -terminal . Uma seqüência de codificação pode incluir, mas não está limitada a, seqüências procarióticas, cDNA a partir de mRDA, seqüências DNA genômicas e até seqüências sintéticas de DNA. Se as seqüências de codificação têm a finalidade de expressar uma célula eucariótica, um sinal de poliadenilação e uma seqüência terminal de transcrição geralmente estarão localizadas em 3' em relação à seqüência de codificação.

Fase aberta de leitura é abreviada como ORF e quer dizer o comprimento da seqüência de ácido nucléico, quer de DNA, cDNA ou RNA, que compreende um sinal inicial de tradução ou um códon de iniciação, tal como um ATG ou AUG e um códon terminal e pode ser potencialmente traduzida em uma seqüência polipeptidea.

O termo head-to-head é usado no presente documento para descrever a orientação de duas seqüências de polinucleotídeos, uma em relação à outra. Dois polinucleotídeos estão posicionados em uma orientação head-to-head quando a extremidade 5' da fita de codificação de um polinucleotídeo está adjacente à extremidade 5' da fita de codificação do outro polinucleotídeo, sendo que a direção da transcrição de cada polinucleotídeo segue em direção oposta da extremidade 5' do outro polinucleotídeo. O termo headto-head pode ser abreviado (5')-para-(5') e também pode ser indicado pelos símbolos (<— —>} ou (3'<— 5' 5' —> 3').

O termo tail-to-tail é usado no presente documento para descrever a orientação de duas seqüências de polinucleotídeos, uma em relação à outra. Dois polinucleotídeos estão posicionados em uma orientação de tail-to-tail quando a extremidade 3' da fita de codificação de um polinucleotídeo está adjacente à extremidade 3' da fita de codificação do outro polinucleotídeo, sendo que a direção da transcrição de cada polinucleotídeo segue em direção ao outro polinucleotídeo. 0 termo tail-to-tail pode ser abreviado por (3')-para-(3') e também pode ser indicado pelos símbolos (—> <—) ou (5'—> 3' 3' <— 5') .

O termo head-to-tail ê usado no presente documento para descrever a orientação de duas seqüências de polinucleotídeos em relação um ao outro. Dois polinucleotídeos estão posicionados em uma orientação de head-to-tail quando a extremidade 5' da fita de codificação de um polinucleotídeo está adjacente à extremidade 3' da fita de codificação do outro polinucleotídeo, sendo que a direção da transcrição de cada polinucleotídeo segue na mesma direção como aquela do outro polinucleotídeo. O termo head-to-tail pode ser abreviado (5')-para-(3') e também pode ser indicado pelos símbolos (—> —>) ou (5'—>3' 5'—>3').

O termo à jusante refere-se a uma seqüência de nucleotídeos que está localizada 3' em relação a seqüência de nucleotídeos de referência. Em particular, as seqüências de nucleotídeos à jusante geralmente referem-se a seqüências que seguem o ponto de partida da transcrição. Por exemplo, o códon de iniciação da tradução de um gene está localizado à jusante do local inicial da transcrição.

O termo à montante refere-se a uma seqüência de nucleotídeos que está localizada 5' em relação a seqüência de nucleotídeos de referência. Em particular, as seqüências

J/ de nucleotídeos montantes geralmente referem-se a seqüências que estão localizadas no lado 5' de uma seqüência de codificação ou ponto de partida de uma transcrição. Por exemplo, a maioria dos promotores está localizado à montante do local inicial da transcrição.

Os termos endonuclease de restrição e enzima de restrição referem-se a uma enzima que liga e corta dentro de uma seqüência específica de nucleotídeos dentro de um DNA de fita dupla.

Recombinação homóloga refere-se à inserção de uma seqüência estranha de DNA em uma outra molécula de DNA, por exemplo, a inserção de um vetor em um cromossoma. De preferência, o alvo do vetor é um local de cromossomas para recombinação homóloga. Para uma recombinação homóloga específica, o vetor conterá regiões suficientemente longas de homologia em relação a seqüências dos cromossomas para permitir a ligação complementar e incorporação do vetor no cromossoma. Regiões mais longas da homologia e graus superiores de similaridade de seqüências podem elevar a eficácia da recombinação homóloga.

De acordo com a invenção, diversos métodos conhecidos na ciência podem ser utilizados para propagar um polinucleotideo. Uma vez estabelecido um sistema hospedeiro e condições de crescimento, os vetores de expressão de recombinação podem ser propagados e preparados em quantidade. Conforme descrito na presente invenção, os vetores de expressão que podem ser usados incluem, mas não estão limitados, aos seguintes vetores e seus derivados: vírus

ÔZ humanos ou animais tais como vírus de vacinas ou adenovirus;

vírus de insetos tais como os baculovírus; vetores de leveduras; vetores bacteriófagos (por exemplo, lambda) e vetores plasmídeos e cosmídeos de DNA, para citar somente alguns.

Um vetor é qualquer meio para a clonagem de e/ou transferência de um ácido nucléico em uma célula hospedeira. Um vetor pode ser uma replicação para o qual um outro segmento de DNA pode ser adicionado de maneira a efetuar a replicação de um segmento adicionado. Uma replicação é qualquer elemento genético (por exemplo, plasmídeo, fago, cosmídeo, cromossoma, vírus) que funciona como com uma unidade autônoma de uma replicação de DNA in vivo, por exemplo, com capacidade de replicação sob seu próprio controle. O termo vetor inclui ambos, os virais e não virais, e quer dizer para introduzir um ácido nucléico em uma célula in vitro, in vivo ou ex vivo. Um grande número de vetores conhecidos na ciência pode ser usado para manipular ácidos nucléicos, incorporar elementos de resposta e promotores nos genes etc. Possíveis vetores incluem, por exemplo, plasmídeos ou vírus modificados inclusive, por exemplo, bacteriófagos tais como os derivados de lambda, ou plasmídeos tais como pBR322 ou derivados de plasmídeos pUC ou o vetor Bluescript. Por exemplo, a inserção de fragmentos de DNA, correspondentes aos elementos de resposta e promotores em um vetor apropriado, pode ser efetuada com êxito pela ligação de fragmentos apropriados de DNA em um vetor escolhido que tenha terminais de coesão complementares.

Alternativamente, as extremidades das moléculas de DNA podem ser modificadas por enzimas e qualquer local pode ser produzido pela ligação de seqüências nucleotideas (conectores) nos terminais de DNA. Tais vetores pode ser manipulados por engenharia genética para conter genes marcadores seletíveis que providenciam a seleção de células que tenham incorporado o marcador no genoma celular. Tais marcadores permitem a identificação e/ou seleção de células hospedeiras que incorporam e expressam as proteínas codificadas pelo marcador.

Vetores virais, e particularmente vetores retrovirais, tem sido utilizados em uma grande variedade de aplicações de transmissão de genes em células, bem como em espécies animais vivas. Os vetores virais que podem ser usados incluem, sem estar limitados, retrovirus, vírus adeno-associados, doenças eruptivas, baculovírus, vacinas, herpes simples, Epstein-Barr, adenovírus, geminivírus e vetores de caulimovírus. Os vetores não virais incluem plasmídeos, lipossomas, lipídios eletricamente carregados (citofectinas), complexos de proteína-DNA e biopolímeros. Além de um ácido nucléico, um vetor pode conter uma ou mais regiões reguladoras, e/ou marcadores seletíveis úteis na seleção, na medição e no monitoramento de resultados de transferências de ácido nucléico (transferência para quais tecidos, duração da expressão etc.).

O termo plasmídeo refere-se a um elemento extra do cromossoma que freqüentemente porta um gene que não faz parte do metabolismo central da célula e, usualmente, na forma de moléculas circulares de fita dupla de DNA. Tais elementos podem ser seqüências de replicação autônoma, seqüências de integração de genoma, seqüências fago ou nucleotídeas, lineares, circulares ou super-espiraladas ou de DNA ou RNA de fita simples ou dupla, derivadas de qualquer origem na qual uma série de seqüências nucleotídeas tenham sido ligadas ou recombinadas em uma única estrutura que tem a capacidade de introduzir um fragmento promotor e uma seqüência de DNA para um produto de gene selecionado juntamente com uma seqüência apropriada 3' não traduzida em uma célula.

Um vetor de clonagem é uma replicação, que é uma unidade de comprimento de um ácido nucléico, de preferência DNA, que replica seqüencialmente e que contém uma origem de replicação, tal como um plasmídeo, fago ou cosmídeo, ao qual um outro segmento de ácido nucléico pode ser ligado de modo a realizar a replicação do segmento ligado. Os vetores de clonagem podem ter a capacidade de replicação em um tipo de célula e expressão em uma outra (vetor transportador).

Os vetores podem ser introduzidos nas células hospedeiras desejadas por métodos conhecidos na ciência, por exemplo, transfecção, eletroporação, microinjeção, fusão de célula, dextrano DEAE, precipitação por fosfato de cálcio, lipofecção (fusão de lisossomas), uso de pistola de gene, ou um transportador de vetor de DNA (veja, por exemplo, Wu et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 963-967; Wu e Wu, 1988,

J.Biol. Chem. 263: 14621-14624 e Hartmut et al. , Pedido de

Patente Canadense n° 2.012.311, registrada em 15 de março de 1990) .

Um polinucleotídeo de acordo com a invenção também pode ser introduzido in vivo por lipofecção. Durante a última década houve um uso acrescente de lipossomas para o encapsulamento e transfecção de ácidos nucléicos in vivo. Os lipídios catiônicos sintéticos, designados para limitar as dificuldades e riscos encontrados com a transfecção mediada por lipossomas, podem ser usados para preparar lipossomas para uma transfecção in vivo de um gene de codificação de um marcador (Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 84: 7413; Mackey et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sei.

U.S.A. 85: 8027-8031; e Ulmer et al., 1993, Science 259: 1745-1748) . O uso de lipídios catiônicos pode promover o encapsulamento de ácidos nucléicos negativamente carregados e também promover a fusão com membranas celulares negativamente carregadas (Felgner e Ringold, 1989, Science 337: 387388). Compostos de lipídios e composições particularmente úteis para a transferência de ácidos nucléicos estão descritos na International Patent Publications WO95/18863 e WO96/17823 e na Patente dos EUA n° 5.459.127. O uso da lipofecção para introduzir genes exógenos em órgãos específicos in vivo apresentam determinadas vantagens práticas. O alvo molecular de lipossomas em direção a células específicas representa uma área de benefício. Fica nítido que a transfecção direcionada para tipos de células em particular seria particularmente preferido em um tecido com heterogeneidade celular, tal como o pâncreas, o fígado, os rins e o cérebro. Os lipídios podem ser quimicamente pareados com outras moléculas com o propósito de alvo (Mackey et al. , 1988, supra) . Peptídeos tomados como alvo, por exemplo, hormônios ou neuro-transmissores, e proteínas tais como anticorpos, ou moléculas não peptídias, podem ser pareadas quimicamente com lipossomas.

Outras moléculas também são úteis para facilitar a transfecção de um ácido nucléico in vivo, tal como um oligopeptídeo catiônico (por exemplo, WO 95/21931), peptídeos derivados a partir de proteínas de ligação DNA (por exemplo, WO 96/25508), ou um polímero catiônico (por exemplo, WO 95/21931).

Também é possível introduzir um vetor in vivo como um plasmídeo de um puro DNA (veja Patentes dos EUA 5.693.622, 5.589.466 e 5.580.859). As abordagens de transmissão de DNA mediado por receptor também podem ser usadas (Curiel et al., 1992, Hum. Gene Ther. 3: 147-154; e Wu e Wu, 1987, J. Biol.

Chem. 262: 4429-4432).

O termo transfecção quer dizer a tomada de RNA ou DNA exógeno ou heterólogo por uma célula. Uma célula foi transfeccionada por um RNA ou DNA exógeno ou heterólogo quando tal RNA ou DNA foi introduzido dentro da célula. Uma célula foi transformada por um RNA ou DNA exógeno ou heterólogo quando o RNA ou DNA transfeccionado efetua uma troca fenotípica. O RNA ou DNA transformador pode ser integrado (ligado covalentemente) em DNA cromossomal formando o genoma da célula.

Ό

A transformação refere-se à transferência de um fragmento de ácido nucléico para um genoma de um organismo hospedeiro, resultando em herança geneticamente estável. Os organismos hospedeiros que contém os fragmentos de ácido nucléico transformados são referidos como organismos transgênicos, recombinantes ou transformados.

O termo região genética refere-se a uma região de uma molécula de ácido nucléico ou uma seqüência nucleotídea que compreende um gene de codificação de um polipeptídeo .

Além disso, o vetor recombinante que compreende um polinucleotídeo de acordo com a invenção pode incluir uma ou mais origens para replicação em hospedeiros celulares nos quais a sua amplificação ou sua expressão é procurada, marcadores ou marcadores seletíveis.

O termo marcador seletível significa um fator de identificação, usualmente um antibiótico ou gene de resistência química que pode ser selecionado para efeito baseado no marcador de gene, por exemplo, resistência a um antibiótico, resistência a um herbicida, marcadores colorimétricos, enzimas, marcadores fluorescentes e semelhantes, onde o efeito é usado para rastrear a herança de um ácido nucléico de interesse e/ou identificar uma célula ou organismo que tenha herdado o ácido nucléico de interesse. Exemplos de genes marcadores seletíveis conhecidos e usados na ciência abrangem: genes que estabelecem resistência à ampicilina, streptomicina, gentamicina, canamicina, higromicina, herbicida bialaphos, sulfonamida e semelhantes; e genes que são usados como marcadores fenótipos, por exemplo, genes reguladores de antocianina, gene de transferase de isopentanila e semelhantes.

O termo gene repórter quer dizer um acido nucléico codificando um fator de identificação que está habilitado a ser identificado com base no efeito de repórter do gene, onde o efeito é usado para rastrear a herança de um ácido nucléico de interesse, para identificar uma célula ou organismo que tenha herdado o ácido nucléico de interesse, e/ou para medir a expressão do gene de indução ou transcrição. Exemplos dos genes repórter conhecidos e usados na ciência incluem: luciferase (Luc), proteína fluorescente verde (GFP), acetiltransferase de cloranfenicol (CAT), βgalactosidase (LacZ), β-glucoronidase (Gus) e semelhantes. Os genes marcadores seletíveis também podem ser considerados genes repórter.

Promotor refere-se a uma seqüência de DNA com capacidade de controlar a expressão de uma seqüência de codificação ou RNA funcional. Em geral, uma seqüência de codificação está localizada 3' em relação a uma seqüência promotora. Os promotores podem ser derivados em sua integralidade a partir de um gene nativo, ou ser compostos de diferentes elementos derivados a partir de diferentes promotores encontrados na natureza, ou até contêm segmentos de DNA sintéticos. É da compreensão daqueles habilitados na ciência que diferentes promotores podem indicar a expressão de um gene em diferentes tecidos ou tipos de células, ou em diferentes estágios de desenvolvimento, ou em resposta a

3^C/ diferentes ambientes ou condições fisiológicas. Os promotores que fazem com que um gene seja expresso na maioria dos tipos de células na maior parte das vezes comumente são referidos como promotores constitutivos . Os promotores que fazem com que um gene seja expresso em um tipo de célula específica são, comumente, referidos como promotores de células específicas ou promotores de tecidos específicos. Os promotores que fazem com que um gene seja expresso em um estágio específico de desenvolvimento ou diferenciação de célula são, comumente, referidos como promotores específicos de desenvolvimento ou promotores específicos de diferenciação de células. Os promotores que são induzidos e fazem com que um gene seja expresso seguindo a exposição ou tratamento da célula com um agente, molécula biológica, substância química, ligação, luz ou semelhante que induz o promotor são, comumente, referidos como promotores indutores ou promotores reguláveis. Além disso, reconhece-se que, já que na maioria dos casos os limites exatos das seqüências reguladoras não foram completamente definidos, os fragmentos de DNA de diferentes comprimentos podem ter atividade promotor idêntico.

Uma seqüência promotora é uma região reguladora de DNA com capacidade de ligação da RNA-polimerase em uma célula e iniciação da transcrição de uma seqüência de codificação à jusante (direção '3). Para propósitos de definição da presente invenção, a seqüência promotora está ligada a seu terminal 3' pelo local de iniciação da transcrição e se estende à montante (direção '5) para incluir ο mínimo número de bases ou elementos necessários para iniciar a transcrição a níveis detectáveis acima do plano de fundo. Dentro da seqüência promotora será encontrado um local da iniciação da transcrição (convencionalmente definida, por exemplo, por mapeamento com nuclease Sl), bem como os domínios de ligação da proteína (seqüências consensus) responsáveis pela ligação da RNA-polimerase.

Uma seqüência de codificação está sob controle de seqüências de controle de transcrição e de tradução em uma célula quando a RNA-polimerase transcreve a seqüência de codificação em mRNA, que é então trans-RNA entrelaçada (se a seqüência de codificação contém íntrons) e traduzida para a proteína codificada pela seqüência de codificação.

Seqüências de controle de transcrição e de tradução são seqüências reguladoras de DNA, tais como as promotoras, as intensificadoras, as terminadoras e semelhantes, que promovem a expressão de uma seqüência de codificação em uma célula hospedeira. Em células eucarióticas, os sinais de poliadenilação são seqüências controladoras.

O termo elemento resposta quer dizer um ou mais elementos DNA cis-atuantes que conferem receptividade sob uma interação mediada através do promotor com os domínios de ligação-DNA do primeiro gene quimérico. Este elemento-DNA pode ser palindrômico (perfeito ou imperfeito) em sua seqüência ou composto de seqüenciadores (sequence motifs) ou metades (half sites) separadas por um número variável de nucleotídeos. As metades podem ser similares ou idênticos e organizados como repetições diretas ou invertidas ou como

7/ uma simples metade ou poliméricos de metades em fila. O elemento resposta pode compreender um promotor mínimo isolado dos diferentes organismos dependendo da natureza da célula ou organismo no qual o elemento resposta será incorporado. O domínio de ligação DNA da primeira proteína híbrida liga-se, na presença ou ausência de um ligante, â seqüência de DNA de um elemento resposta para iniciar ou suprimir a transcrição do(s) gene(s) à jusante sob a regulamentação deste elemento resposta. Exemplos de seqüências de DNA para elementos resposta do receptor ecdisona natural incluem: RRGG/TTCANTGAC/ACYY (veja Cherbas, L. et al., (1991), Genes Dev. 5, 120-131); AGGTCAN_(n)AGGTCA, onde N(_a) pode ser um ou mais nucleotídeos espaçadores (veja D'Avino PP. et al. , (1995), Mol. Cell . Endocrinol, 113, 19); e GGGTTGAATTT (veja Antoniewski C. et al. , (1994). Mol. Cell Biol. 14, 4465-4474).

O termo ligação operável refere-se à associação de seqüências de ácido nucléico em um fragmento simples de ácido nucléico de modo que a função de um não é afetada pelo outro. Por exemplo, um promotor é ligado de modo operável com uma seqüência de codificação quando é capaz de afetar a expressão dessa seqüência de codificação (por exemplo, que a seqüência de codificação está sob o controle de transcrição do promotor). As seqüências de codificação podem ser ligadas de modo operável às seqüências reguladoras na orientação sense e antísense.

O termo expressão, conforme usado no presente documento, refere-se à transcrição e acumulação estável de sense (mRNA) ou antisense RNA derivados a partir do ácido nucleico ou polinucleotideo. A expressão também pode referir-se à tradução de mRNA em proteína ou polipeptídeo.

Os termos cassete, cassete de expressão e cassete de expressão de gene referem-se a um segmento de DNA que pode ser inserido em um ácido nucléico ou polinucleotídeo em locais específicos de restrição ou por recombinação homóloga. O segmento de DNA compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo de interesse, e a cassete e os locais de restrição são designados para assegurar a inserção do cassete na moldura apropriada de leitura para transcrição e tradução. Cassete de transformação refere-se a um vetor específico compreendendo um polinucleotideo que facilita a transformação de uma célula hospedeira particular. Cassetes, cassetes de expressão, cassetes de expressão de gene e cassetes de transformação da invenção também podem compreender elementos que permitem reforçar a expressão de um polinucleotideo codificando um polipeptídeo de interesse em uma célula hospedeira. Estes elementos podem incluir, mas não estão limitados, aos de: um promotor, um promotor mínimo, um reforçador, um elemento resposta, uma seqüência terminadora, uma seqüência de poliadenilação e semelhantes.

Para propósitos desta invenção, o termo troca de genes (gene switch) refere-se ã combinação de um elemento resposta associado a um promotor; e um sistema baseado-EcR, o qual na presença de um ou' mais ligantes, adapta a expressão de um gene no qual o elemento de resposta e o promotor são incorporados.

Os termos adaptar ou adapta quer dizer induzir, reduzir ou inibir um ácido nucléico ou expressão de gene, resultando na respectiva indução, redução ou inibição da produção da proteína ou polipeptídeo.

Os plasmídeos ou vetores de acordo com a invenção podem ainda compreender, pelo menos, um promotor adequado para conduzir a expressão de um gene para um célula hospedeira. O termo vetor de expressão significa um vetor, plasmídeo ou veículo designado para possibilitar a expressão de uma seqüência de ácido nucléico a seguir da transformação na hospedeira. O gene clonado, isto é, a seqüência de ácido nucléico inserida, normalmente, é colocada sob controle dos elementos de controle tais como um promotor, um promotor mínimo, um reforçador ou semelhante. As regiões de controle de iniciação ou promotores, que são úteis para conduzir a expressão de um ácido nucléico na célula hospedeira desejada, são numerosas e familiares àqueles especializados na ciência. Virtualmente, qualquer promotor com capacidade de conduzir estes genes é adequado para a presente invenção incluindo, mas não limitada a: promotores virais, promotores bacterianos, promotores animais, promotores mamíferos, promotores sintéticos, promotores constitutivos, promotores específicos de tecidos, promotores específicos de desenvolvimento, promotores indutores, promotores regulados pela luz; CYC1, HIS3, GAL4 , GAL10, ADH1, PKG, PH05, GAPDH, ADC1, TRP1, URA3, LEU2, ENO, TPI, promotores de fosfatase alcalina (úteis para expressão em Saccharomyces}; promotor AOX1, (útil para a expressão em Pichia) ; promotores de β40 lactamase, lac, ara, tet, trp, 1PL, 1PR, T7, tac e trc (úteis para expressão em Escherichia coli); vírus regulado pela luz, vírus específico de sementes, vírus específico de pólen, virus específicos de ovário, vírus de patogênese ou relacionados a doenças, vírus mosaico 35S da couve-flor, CMV 35S mínimo, vírus de mosaico da veia cassava (CsVMV), proteína de ligação a/b da clorofila, ribulose 1,5bisfosfato carboxilase, shoot-específica, específica de raiz, quitinase, indutível por stress, vrice tungro bacilliform vírus, super-promotor de plantas, leucina aminopeptidase da batata, redutase de nitrato, sintase de manopine, sintase de nopaline, ubiquitina, proteína zein e promotores da antocianina (útil para expressão em células de plantas); promotores conhecidos de células animais e de mamíferos conhecidos na ciência incluem, mas não estão limitadas a, a região promotora da SV40 precoce (SV40e), ao promotor contido no vírus do sarcoma de Rous na repetição do terminal longo '3 (RSV), o promotor do EIA ou (MLP) do genes do adenovirus (Ad) , o promotor citomegalovirus (CMV) , o promotor do vírus de herpes simples (HSV) da timidina quinase (TK), um promotor do baculovirus IE1, um promotor do fator de alongamento 1 alfa (EF1) , um promotor da fosfoglicerato quinase (PGK), um promotor da ubiquitina (Ubc), um promotor da albumina, as seqüências reguladoras do promotor metalotioneína-L do camundongo e regiões de controle de transcrição, os promotores ubíquos (HPRT, vimentina, α-actina, tubulina e semelhantes, os promotores dos filamentos intermediários (desmina, neurofi-lamentos, queratina, GFAP e semelhantes), os promotores dos genes terapêuticos (do MDR, CFTR ou tipo de fator VII e semelhantes), patogêneses ou doenças relacionadas aos promotores e promotores que exibem uma especificidade de tecido e tem sido utilizadas em animais transgênicos, tais como a região de controle do gene elastase I que é ativo nas células pancreáticas acínares; região de controle de gene de insulina ativa em células pancreáticas beta, região de controle de gene de imunoglobulina ativa em células linfóides, região de controle de vírus de tumor de mamífero camundongo ativo em tecido testicular, mama, células linfóides e mastócitos; gene da albumina, regiões de controle Apo AI e Apo AII ativas no fígado, região de controle do gene alfa-fetoproteína ativo no fígado, região de controle do gene alfa 1-antitripsina ativo no fígado, região de controle do gene beta-globina ativo em células mielóides, região de controle do gene da proteína mielina básica ativo nas células oligodentrócitas no cérebro, região de controle do gene miosina leve do cadeis-2 ativo em músculos esqueléticos e região de controle do gene gonadotrópico ativo no hipotálamo, promotor da piruvate quinase, promotor da vilina, promotor do ácido graxo ligado à proteína intestinal, promotor da célula β-actina do músculo liso e semelhantes. Além disso, estas seqüências de expressão podem ser modificadas pela adição de seqüências reforçadoras ou reguladoras e semelhantes.

As reforçadoras que podem ser usadas em incorporações incluem, mas não estão limitadas a: reforçadora SV40,

QC reforçadora (CMV) do citomegalovirus, reforçadora (EF1) do fator de alongamento 1, reforçadoras de leveduras, reforçadoras de gene viral e semelhantes.

As regiões de controle terminais, por exemplo, seqüências terminais ou de poliadenilação também podem ser derivadas a partir de vários genes nativos até os hospedeiros preferidos. Opcionalmente, um local terminal pode ser desnecessário, no entanto, é mais preferido se for incluído. Em uma incorporação preferida da invenção, a região de controle terminal pode ser composta ou ser derivada a partir de uma seqüência sintética, um sinal de poliadenilação sintética, um sinal de poliadenilação SV 40 tardio, um sinal de poliadenilação SV40, um sinal de poliadenilação de hormônio de crescimento bovino (BHG), seqüências virais terminais ou semelhantes.

Os termos seqüências não codificadoras 3' ou região não traduzida 3' (UTR) referem-se a seqüências localizadas â jusante (3') de uma seqüência de codificação e podem conter seqüências de reconhecimento de poliadenilação [poli(A)] e outras seqüências de codificação reguladoras de sinais com capacidade de afetar o processamento mRNA ou a expressão do gene. O sinal de poliadenilação, normalmente, é caracterizado por afetar a adição de tratos de ácido poliadenílico em relação à extremidade 3' do precursor mRNA.

Região reguladora quer dizer uma seqüência de ácido nucléico que regula a expressão de uma segunda seqüência de ácido nucléico. Uma região reguladora pode incluir seqüências que são naturalmente responsáveis pela ¢9 expressão de um ácido nucléico em particular (uma região homóloga) ou pode incluir seqüências de uma origem diferente que são responsáveis pela expressão de diferentes proteínas ou até de proteínas sintéticas (uma região heteróloga). Em particular, as seqüências podem ser seqüências de genes procarióticos, eucarióticos ou virais ou seqüências derivadas que estimulam ou reprimem a transcrição de um gene de uma maneira específica ou não específica e em uma maneira indutiva ou não indutiva. As regiões reguladoras incluem origens de replicação, locais de junções de RNA, promotores, reforçadores, seqüências terminais de transcrição e seqüências de sinais que conduzem o polipeptídeo para as vias de secreção da célula alvo.

Uma região reguladora de uma origem heteróloga é uma região reguladora que não está naturalmente associada com o ácido nucléico expresso. Incluídas entre as regiões reguladoras heterólogas estão as regiões heterólogas a partir de uma espécie diferente, regiões reguladoras de um gene diferente, seqüências reguladoras híbridas e seqüências reguladoras que não ocorrem na natureza mas que são projetadas por alguém que tem habilidade usual na ciência.

A transcrição RNA refere-se ao produto resultante da transcrição catalizada-RNA polimerase de uma seqüência de DNA. Quando a transcrição é uma cópia complementar perfeita da seqüência de DNA, é referida como sendo a transcrição primária e é referida como sendo um RNA maduro. O RNA mensageiro (mRNA) refere-se a um RNA que está sem íntrons e pode ser traduzido em proteínas pela célula. O cDNA refere-se a um DNA de fita dupla que é complementar e derivado de mRNA. RNA sense refere-se a uma transcrição de RNA que inclui o mRNA e assim pode ser traduzido em proteínas pela célula. RNA antisense refere-se a uma transcrição de RNA que é complementar a toda ou parte de uma transcrição primária alvo ou mRNA e que bloqueia a expressão de um gene alvo. A complementaridade de um RNA antisense pode ser qualquer parte da transcrição específica do gene, isto é, na seqüência 5' não codif icadora, na seqüência 3' não codificadora ou na seqüência de codificação. O RNA funcional refere-se ao RNA antisense, RNA ribozima ou outro RNA que não está traduzido não obstante tem um efeito sobre os processos celulares.

Um polipeptídeo é um composto polimérico formado de resíduos de aminoácidos covalentemente ligados. Os aminoácidos tem a seguinte estrutura geral:

H

R —C —COOH

NH₂

Os aminoácidos são classificados em sete grupos com base na cadeia lateral R: (1) cadeias laterais alifáticas, (2) cadeias laterais contendo um grupo hidroxila (OH), (3) cadeias laterais contendo átomos de súlfur, (4) cadeias laterais contendo um grupo acídico ou amina, (5) cadeias laterais contendo um grupo de bases, (6) cadeias laterais contendo um anel aromático e (7) prolina, um ácido imino no qual a cadeia lateral é ligada ao grupo amina. Um polipeptídeo da invenção, de preferência, contém, pelo menos, cerca de 14 aminoácidos.

Uma proteína é um polipeptídeo que desempenha um papel estrutural ou funcional na célula viva.

Um polipeptídeo isolado ou proteína isolada é um polipeptídeo ou uma proteína que está substancialmente livre destes compostos que normalmente estão associados com os mesmos em seu estado natural (por exemplo, outras proteínas ou polipeptídeos, ácidos nucléicos, carboidratos, lipídios). Isolado não quer dizer excluir misturas artificiais ou sintéticas com outros compostos, ou a presença de impurezas que não interferem com a atividade biológica e que possam estar presentes, por exemplo, devido à purificação incompleta, a adição de conservantes ou compostos farmaceuticamente aceitáveis na preparação.

Um polipeptídeo mutante de substituição ou um mutante de substituição deve ser entendido como significando um polipeptídeo mutante contendo uma substituição de, pelo menos, um (1) aminoácido do tipo selvagem ou que ocorra naturalmente por um aminoácido diferente em relação ao polipeptídeo do tipo selvagem ou que ocorre naturalmente. Um polipeptídeo mutante de substituição pode compreender somente um (1) aminoácido do tipo selvagem ou que ocorra naturalmente de substituição e pode ser referido como um polipeptídeo mutante pontual ou um mutante pontual simples. Alternativamente, um polipeptídeo mutante de substituição pode conter a substituição de dois (2) ou mais aminoácidos do tipo selvagem ou que ocorram naturalmente por ou mais aminoácidos relativos aos polipeptídeos do tipo selvagem ou que ocorram naturalmente. De acordo com a invenção, um polipeptídeo de domínio de ligação do ligante receptor do grupo nuclear H, compreendendo uma mutação de substituição que compreende uma substituição de, pelo menos, um (1) aminoácido do tipo selvagem ou que ocorra naturalmente por um aminoácido diferente relativo ao polipeptídeo de domínio de ligação do ligante receptor do grupo H nuclear do tipo selvagem ou que ocorra naturalmente .

Enquanto que a substituição do polipeptídeo mutante compreende uma substituição de dois (2) ou mais aminoácidos do tipo selvagem ou que ocorram naturalmente, esta substituição pode compreender um número equivalente de aminoácidos do tipo selvagem ou que ocorram naturalmente excluídos pela substituição, por exemplo, de 2 aminoácidos do tipo selvagem ou que ocorram naturalmente substituídos por 2 aminoácidos do tipo não selvagem ou do tipo que não ocorra naturalmente, ou um número equivalente de aminoácidos do tipo selvagem excluídos para a substituição, por exemplo, 2 aminoácidos do tipo selvagem substituídos por 1 aminoácido do tipo não selvagem (uma substituição + mutação de exclusão) , ou 2 aminoácidos do tipo selvagem substituídos por 3 aminoácidos do tipo não selvagem (1 substituição + mutação de inserção). Os mutantes de substituição podem ser descritos usando um sistema de nomenclatura abreviada para indicar o resíduo de aminoácido e o número substituído dentro da seqüência de polipeptídeos de referência e o novo resíduo de aminoácido substituído. Por exemplo, um mutante de substituição no qual o vigésimo (20°) resíduo de aminoácido de um polipeptídeo for substituído pode ser abreviado como x20z, onde x é o aminoácido a ser reposto, 20 é a posição ou o número do resíduo de aminoácido dentro do polipeptídeo, e z é o novo aminoácido substituído. Em conseqüência disso, um intercâmbio de um mutante de substituição pode ser abreviado como E20A ou Glu20Ala indica que o mutante compreende um resíduo de alanina (comumente abreviado na ciência como A ou Ala) no lugar do ácido glutâmico (comumente abreviado na ciência como E ou Glu) na posição 20 do polipeptídeo. Um mutante ou uma mutação pode ser qualquer troca, inclusive, mas não limitada, a substituições, exclusões, inserções ou qualquer combinação dos mesmos.

Uma mutação de substituição pode ser efetuada por qualquer técnico de mutagênese com conhecimento na ciência, inclusive mas não limitado, à mutagênese in vitro sítiodirigida (Hutchinson, C. et al. , 1978, J. Biol. Chem. 253:

6551; Zoller e Smith, 1984, DNA 3: 479-488; Oliphant et al.,

1986, Gene 44: 177; Hutchinson et al. , 1986, Proc. Natl.

®

Acad. Sci. USA. 83: 710), uso de linkers TAB (Pharmacia), restrição da digestão da endonuclease/exclusão de fragmento e substituição, mutagênese oligonucleotídeo-dirigida/PCRmediada e semelhantes (veja Higuchi, 1989, Using PCR to Engineer DNA, em PCR Technology: Princípios e aplicações para amplificação de DNA, H. Erlich, ed. , Stockton Press, capítulo 6, p. 61-70).

Um fragmento de um polipeptídeo, de acordo com a invenção, será entendido como significando um polipeptídeo cuja seqüência de aminoácido é mais curta que àquela do polipeptídeo de referência e que compreende, sobre toda a porção com estes polipeptídeos de referência, uma seqüência idêntica de aminoácidos. Tais fragmentos podem, quando for apropriado, ser incluídos em um polipeptídeo maior do qual os mesmos são parte. Tais fragmentos de polipeptídeo, de acordo com a invenção, podem ter um comprimento de, pelo menos, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,

20, 21, 22, 25, 26, 30, 35, 40, 45, 50, 100, 200, 240 ou 300 aminoácidos.

Uma variante de um polipeptídeo ou uma proteína é qualquer análogo, fragmento, derivado, mutante que é derivado a partir de um polipeptídeo ou uma proteína e que retém, pelo menos, uma propriedade biológica do polipeptídeo ou proteína. Podem existir diferentes variantes de polipeptídeos ou proteínas na natureza. Estas variantes podem ser variações alélicas caracterizadas por diferenças nas seqüências de nucleotídeos da codificação estrutural do gene para a proteína ou podem envolver entrelaçamentos (splicing) diferenciais ou modificação pós-tradução. O cientista habilitado pode produzir variantes que tem substituições, exclusões, adições ou reposições com aminoácidos simples ou múltiplos. Estas variantes podem incluir, inter alia: (a) variantes nas quais um ou mais resíduos de aminoácidos são substituídos por aminoácidos conservadores ou nãoconservadores, (b) variantes nas quais um ou mais

PÒ aminoácidos são adicionados ao polipeptídeo ou proteína, (c) variantes nas quais um ou mais aminoácidos incluem um grupo substituinte e (d) variantes nas quais o polipeptídeo ou proteína é amalgamada com outro polipeptídeo tal como a albumina do soro. As ítécnicas para obter essas variantes incluem técnicas genéticas (supressões, exclusões, mutações etc) , químicas e enzimáticas e são conhecidas para pessoas normalmente habilitadàs na ciência. Uma variante de polipeptídeo, de preferência, contém, pelo menos, cerca de aminoácidos.

Uma proteína heteróloga refere-se a uma proteína não naturalmente produzida na célula.

Uma proteína madura refere-se a um polipeptídeo processado após a tradução; por exemplo, um a partir do qual tenham sido removidoé quaisquer pré- ou propeptídeos presentes no produto de tradução primária. Proteína precursora refere-se ao produto primário de tradução de mRNA, por exemplo, comí pré- e propeptídeos ainda presentes. Pré- e propeptídeos pódem ser, mas não estão limitados a, sinais de localização intracelular.

termo sinal de peptídeo refere-se a um polipeptídeo terminal amino precedente à proteína madura secretada. O sinal de peptídeo é clivado da mesma a partir e por isso não está presente na proteína madura. O sinal de peptídeos tem a função; de direcionar e translocar proteínas secretadas através das membranas da célula. O sinal de peptídeo também é referido como o sinal de proteína.

O sinal de seqüência está incluído no inicio da seqüência de codificação de uma proteína para ser expressa na superfície de uma célula. Esta seqüência codifica o sinal de peptídeo, o N-terminal para o polipeptídeo maduro, que direciona a célula hospedeira para translocar o polipeptídeo. 0 termo seqüência do sinal de translocação é usado no presente documento para referir-se a esta espécie de seqüência de sinal. As seqüências de sinal de translocação podem ser encontradas associadas com uma variedade de proteínas nativas para eucariotes e procariótis e, freqüentemente, são funcionais em ambos os tipos de organismos.

O termo homologia refere-se ao percentual de identidade entre dois polinucleotídeos ou duas metades de polinucleotídeos. A correspondência entre a seqüência de uma metade em relação à outra pode ser determinada por técnicas conhecidas na ciência. Por exemplo, a homologia pode ser determinada por uma comparação direta das informações da seqüência entre duas moléculas de polipeptídeos pelo alinhamento das informações da seqüência e usando programas prontamente disponíveis de computador. Alternativamente, a homologia pode ser determinada por hibridização de polinucelotídeos sob condições que formem duplas estáveis entre regiões homólogas, seguidas por digestão com nuclease(s) específica(s) de fita simples e determinações de dimensão dos fragmentos digeridos.

Conforme usado no presente documento, o termo homólogo em todas as suas formas gramaticais e variações de pronúncia refere-se ao relacionamento entre proteínas que

Sí possuem uma origem evolucionária comum, incluindo proteínas de superfamílias (por exemplo, a superfamília das imunoglobulinas) e as proteínas homólogas de diferentes espécies (por exemplo, cadeia de luz de miosina etc.) (Reeck et al. , 1987, Cell 50: 667). Tais proteínas (e seus genes de codificação) tem seqüências homólogas, conforme refletido pela seu alto grau de similaridade de freqüência. No entanto, no uso comum e na aplicação de momento, o termo homólogo, quando modificado com um advérbio tal como altamente pode referir-se à similaridade de seqüência e não à origem evolucionária comum.

De acordo com isso, o termo similaridade de seqüência em todas as suas formas gramaticais refere-se ao grau de identidade ou correspondência entre seqüências de ácido nucléico ou de aminoácidos de proteínas que podem ou podem não compartilhar uma origem evolucionária comum (veja Reeck et al., 1987, Cell 50: 667).

Em uma incorporação específica, duas seqüências de DNA são substancialmente homólogas ou substancialmente similares quando, pelo menos, cerca de 50% (de preferência, pelo menos, 75% e, mais preferível, pelo menos, cerca de 90 ou 95%) de nucleotídeos igualam-se no comprimento definido da seqüência de DNA. As seqüências que são substancialmente homólogas podem ser identificadas pela comparação das seqüências usando um software padrão disponível nos bancos de dados de seqüência, ou em um experimento de hibridização Southern, por exemplo, condições de rigor conforme definidas para tal sistema em particular. A definição de condições apropriadas de hibridização está na habilidade da ciência. Veja, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra.

Conforme usado no presente documento, substancialmente similar refere-se a fragmentos de ácido nucléico onde as trocas em uma ou mais bases de nucleotídeos resultam em substituição de um ou mais aminoãcidos, mas não afeta as propriedades funcionais da proteína codificada pela seqüência de DNA. Substancialmente similar também referese a fragmentos de ácido nucléico onde as modificações em uma ou mais bases de nucleotídeos não afetam a capacidade de o fragmento de ácido nucléico mediar a alteração da expressão do gene pela tecnologia antisense ou co-supressão. Substancialmente similar também refere-se a modificações de fragmentos de ácido nucléico da presente invenção tais como a exclusão ou inserção de uma ou mais bases de nucleotídeos que não afetam substancialmente as propriedades funcionais da transcrição resultante. Por isso entende-se que a invenção abrange mais do que as seqüências exemplares específicas. Cada uma das modificações propostas está bem inserida da habilidade da rotina da ciência, conforme é a determinação da retenção de atividades biológicas dos produtos codificados.

Não obstante, o cientista habilitado reconhece que seqüências substancialmente similares abrangidas por esta invenção também são definidas pela sua capacidade de hibridizar, sob condições rigorosas (O,1X SSC, 0,1% SDS, 65% e lavadas com 2X SSC, 0,1% SDS seguido de 0, IX SSC, 0,1% SDS), com as seqüências exemplificadas na presente invenção.

5?

Fragmentos substancialmente similares de ácido nucléico da presente invenção são aqueles fragmentos de ácido nucléico cujas seqüências de DNA são, pelo menos, 70% idênticas à seqüência dos fragmentos de ácido nucléico relatados no presente documento. Os fragmentos de ácido nucléico substancialmente preferidos da presente invenção são aqueles fragmentos de ácido nucléico cujas seqüências de DNA são, pelo menos, 80% idênticas à seqüência de DNA dos fragmentos de ácido nucléico relatadas no presente documento. Os fragmentos de ácido nucléico mais preferidos são aqueles fragmentos de ácido nucléico cujas seqüências de DNA são, pelo menos, 90% idênticas à seqüência de DNA dos fragmentos de ácido nucléico relatadas no presente documento. Os fragmentos de ácido nucléico até mais preferidos são aqueles fragmentos de ácido nucléico cujas seqüências de DNA são, pelo menos, 95% idênticas à seqüência de DNA dos fragmentos de ácido nucléico relatadas no presente documento.

Duas seqüências de aminoácidos são substancialmente homólogas ou substancialmente similares quando mais de cerca de 40% dos aminoácidos são idênticos, ou mais de 60% são similares (funcionalmente idênticos). De preferência, as seqüências similares ou homólogas são identificadas pelo alinhamento usado, por exemplo, o programa de acumulação GCG (Genetic Computer Group, Program Manual for the GcG Package, versão 7, Madison, Wisconsin).

O termo correspondente a é usado no presente documento para referir-se a seqüências similares ou homólogas, quer a posição exata seja idêntica ou diferente da molécula

ST para a qual a similaridade ou homologia é medida. Um alinhamento de uma seqüência de ácido nucléico ou aminoácido pode incluir espaços. Assim, o termo correspondente a refere-se à similaridade de seqüência, e não a enumeração dos resíduos de aminoácido ou bases nucleotideas.

Uma porção substancial de uma seqüência de aminoácido ou nucleotídeo compreende suficientes seqüências de aminoácido de um polipeptídio ou nucleotídeo de um gene para supostamente identificar que o polipeptídeo ou gene, quer por avaliação manual da seqüência por uma pessoa habilitada na ciência ou quer por uma comparação de seqüência automática por computador e identificação dos algoritmos usados tais como BLAST (Basic Local Alignment Search Tool, Altschul, S.F. et al. , (1993) J. Mol. Biol. 215: 403-410; veja também www.ncbi. Nlm.nih.gov/BLAST/). Em geral, uma seqüência de dez ou mais aminoãcidos contíguos ou trinta ou mais nucleotídeos são necessários para supostamente identificar uma seqüência de polinucleotídeos ou ácido nucléico como homólogos a uma proteína ou gene conhecido. Não obstante, com relação às seqüências de nucleotídeos, podem ser usadas amostras oligonucleotideas específicas de gene compostas de 20-30 nucleotídeos contíguos em métodos de identificação de gene dependentes de seqüências (por exemplo, hibridização Southern) e isolamento (por exemplo, hibridização in situ de colônias bacterianas ou placas bacteriófagas). Além disso, podem ser usados oligonucleotídeos curtos de 12-15 bases como iniciadores de amplificação em PCR com a finalidade de obter fragmentos de ácido nucléico em particular compreendendo os iniciadores. Em conformidade com isso, uma porção substancial de uma seqüência de nucleotídeos compreende o suficiente da seqüência para identificar especificamente e/ou isolar um fragmento de ácido nucléico compreendendo a seqüência.

O termo percentual de identidade, conforme conhecido na ciência, é a relação entre duas ou mais seqüências de polinucleotídeos, conforme determinado pela comparação das seqüências. Na ciência, identidade também quer dizer o grau de relação da seqüência entre seqüências de polipeptídeos e polinucleotídeos, seja qual for o caso, conforme determinado pela compatibilidade entre fitas de tais seqüências. Identidade e similaridade podem ser prontamente calculadas por métodos conhecidos, inclusive, mas não limitado, àqueles descritos em: Computational Molecular Biology (Lesk, A.M. , ed.) Oxford University Press, New York (a988); Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D.W., ed.) Academic Press, New York (1993); Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A.M., e Griffin, H.G., eds.) Humana Press, New Jersey (1994); Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., ed.) Academic Press (1987); e Sequence Analysis Primer (Gribskov, M. e Devereux, J., eds.) Stockton Press, New York (1991) . Os métodos preferidos para determinar a identidade são projetados para fornecer a melhor compatibilidade entre as seqüências testadas. Os métodos para determinar a identidade e similaridade são codificados em programas de computador disponíveis ao público. Os alinhamentos de seqüências e

CU cálculos de percentual de identidade podem ser efetuados usando o programa Megalign do grupo de computação de bioinformática LASERGENE (DNASTAR Inc., Madison, WI) . Os alinhamentos múltiplos podem ser efetuados usando o método de alinhamento Clistal (Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5: 151-153) com os parâmetros básicos (GAP PENALTY=10, GAP LENGTH PENALTY=10). Os parâmetros básicos para alinhamentos pareados usando o método Clustal podem ser selecionados:

KTYPLE 1, GAP PENALTY=3, WINDOW=5 E DIAGONAL SAVED=5.

O termo software de análise de seqüência referese a qualquer algoritmo de programa de computador ou software que é útil para a análise de seqüências de nucleotídeos ou aminoácidos. O software de análise de seqüência pode ser adquirido comercialmente ou desenvolvido de forma independente. Um típico software de análise de seqüência irá incluir, mas não está limitado, ao grupo GCG de programas (Wisconsin Package Version 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, WI), BLASTP, BLASTIN, BLSTIX (Alatschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990) e DNASTAR (DNASTAR, Inc. 1228 S. Park St. Madison, WI 53715 USA) . Dentro do contexto desta aplicação ficará entendido que onde for usado um software de análise de seqüências para

a análise, que <	ds resultados	da	análise	serão	com	base	em
valores básicos	do programa	em	referência, a	não	ser	que
de outro modo	especificado.	Conforme	usado	no	presente

documento, valores básicos irão significar qualquer conjunto de valores de parâmetros, que foram originalmente armazenados no software quando primeiramente inicializado.

G{

Os genes sintéticos podem ser montados a partir de blocos de construção de oligonucleotídeo que são sintetizados quimicamente utilizando procedimentos conhecidos para aqueles versados na técnica. Estes blocos de construção são ligados e anelados para formar segmentos de genes que são então montados de forma enzimãtica para construir todo o gene. Quimicamente sintetizado, conforme referido a uma seqüência de DNA, significa que os nucleotídeos de componente foram montados in vitro. As sínteses químicas manuais de DNA podem ser realizas utilizando procedimentos bem estabelecidos, ou as sínteses químicas automáticas podem ser realizas utilizando uma entre diversas máquinas comercialmente disponíveis. Conseqüentemente, os genes podem ser talhados para expressão de gene ótima baseada na otimização da seqüência de nucleotídeo para refletir o códon bias da célula hospedeira. O profissional versado avalia a probabilidade de expressão de gene bem sucedida se o uso de códon é inclinado em direção àqueles códons favorecidos pelo hospedeiro. A determinação de códons preferidos pode ser baseada em um levantamento de genes derivados da célula hospedeira onde a informação de seqüência se encontra disponível.

Como usado no presente documento, dois ou mais sistemas de genes operáveis de forma individual são ditos para serem ortogonais quando: a) a modulação de cada um dos sistemas dados por seus respectivos ligantes, em uma concentração escolhida, resulta em uma alteração mensurável na magnitude de expressão do gene deste sistema, e b) a

Γ ,1 alteração é estatisticamente diferente de forma significativa da alteração na expressão de todos os outros sistemas operáveis de forma simultânea na célula, tecido, ou organismo, independente da simultânea ou seqüencialidade da modulação real. De preferência, a modulação de cada sistema de regulação de gene operãvel de forma individual efetua uma alteração na expressão de gene pelo menos 2 dobras maior do que todos os outros sistemas operáveis na célula, tecido ou organismo. Mais preferencialmente, a alteração é pelo menos 5 dobras maior. Ainda mais preferencialmente, a alteração é pelo menos 10 dobras maior. Ainda mais preferencialmente, a alteração é pelo menos 100 dobras maior. Ainda mais preferencialmente, a alteração é pelo menos 500 dobras maior. De forma ideal, a modulação de cada um dos dados sistemas através de seu ligante respectivo em uma concentração escolhida resulta em uma alteração mensurável na magnitude da expressão do gene deste sistema e nenhuma uma alteração mensurável na expressão de todos os outros sistemas operáveis na célula, tecido ou organismo. Em tais casos o sistema de regulação de gene múltiplo indutor é dito para ser totalmente ortogonal. A presente invenção pe útil para procurar sistemas de expressão baseados em ligantes ortogonais ou receptores ortogonais tais como aqueles descritos no pedido U.S co-pendente Número 09/965.697, que é incorporada no presente documento por referência em sua totalidade.

Gò

SISTEMA DE MODULAÇÃO DE EXPRESSÃO DE GENE Os requerentes identificaram no presente documento resíduos de aminoácidos que estão envolvidos na ligação de ligantes a um domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que afeta a sensibilidade e a magnitude de ligante de indução em um sistema de expressão de gene indutor baseado em ecdisone. Os requerentes descrevem no presente documento a construção de receptores nucleares do Grupo H que compreende mutações de substituição (referidas no presente como mutantes de substituição) nestes resíduos

críticos	e	a demonstração que estes	receptores	nucleares
mutantes	de	substituição	são úteis em	métodos de	expressão
de gene	de	modulação.	Como apresentado aqui,	os novos

receptores nucleares mutantes de substituição dos requerentes e seu uso em um sistema de expressão de gene indutor baseado em receptor nuclear proporcionam um sistema de expressão de gene indutor aperfeiçoado, tanto nas células hospedeiras procarióticas como nas eucarióticas, onde a sensibilidade e magnitude de ligante de transativação podem ser selecionadas conforme desejado, dependendo da aplicação.

Desta maneira, a presente invenção refere-se a novos polinucleotídeos e polipeptídeos de receptor nuclear do Grupo H de mutante de substituição, um sistema de expressão de gene indutor baseado em receptor nuclear que compreende tais polinucleotídeos e polipeptídeos de receptor nuclear do Grupo H alterado, e métodos para modular a expressão de um gene dentro de uma célula hospedeira que

G7 utiliza tal sistema de expressão de gene indutor baseado em receptor nuclear.

Em particular, a presente invenção refere-se a um sistema de modulação de expressão de gene que compreende pelo menos um cassete de expressão de gene que é capaz de ser expresso em uma célula hospedeira que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende um domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição. De preferência, o domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição é proveniente de um receptor de ecdisona, um receptor ubíquo, um receptor órfão 1, um NER-1, um receptor nuclear de hormônio esteróide, um receptor X retinóide que interage com proteína-15, um receptor X de fígado β, uma proteína tipo receptor de hormônio esteróide, um receptor X de fígado, um receptor X de fígado a, um receptor X farnesóide, um receptor que interage com proteína 14 e um receptor farnesol. Mais preferencialmente, o domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição é proveniente de um receptor ecdisona.

Em uma modalidade específica, o sistema de modulação de expressão de gene compreende um cassete de expressão de gene que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende um domínio de transativação, um domínio de ligação de DNA que reconhece um elemento de resposta associado com um gene cuja expressão deve ser modulada; e um domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição. O sistema de modulação de expressão de gene pode compreender adicionalmente um segundo cassete de expressão de gene que compreende: i) um elemento de resposta reconhecido pelo domínio de ligação de DNA do polipeptídeo codificado do primeiro cassete de expressão de gene; ii) um promotor que ativado através do domínio de transativação do polipeptídeo codificado do primeiro cassete de expressão de gene; iii) um gene cuja expressão deve ser modulada.

	Em	outra modalidade	específica, o	sistema	de
modulação	de	expressão de gene	compreende um	cassete	de
expressão	de	gene que compreende	: a) um polinucleotideo	que
codifica	um	polipeptídeo que	compreende um	domínio	de

transativação, um domínio de ligação de DNA que reconhece um elemento de resposta associado com um gene cuja expressão deve ser modulada; e um domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição, e b) um segundo domínio de ligação de ligante de receptor nuclear selecionado a partir do grupo que consiste de um domínio de ligação de ligante de receptor de retinóide X de vertebrado, um domínio de ligação de ligante de receptor de retinóide X de invertebrado, domínio de ligação de ligante de proteína ultraespiráculo e um domínio de ligação de ligante quimérico que compreende dois fragmentos de polipeptídeo, onde o primeiro fragmento de polipeptídeo é proveniente de um domínio de ligação de ligante de receptor de retinóide X de vertebrado, um domínio de ligação (2:

de ligante de receptor de retinóide X de invertebrado, ou um domínio de ligação de ligante de proteína de ultraespirãculo, e o segundo fragmento de polipeptídeo é proveniente de um domínio de ligação de ligante de receptor de retinóide X de vertebrado diferente, domínio de ligação de ligante de receptor de retinóide X de invertebrado ou um domínio de ligação de ligante de proteína de ultraespiráculo. O sistema de modulação de expressão de gene pode compreender adicionalmente um segundo cassete de expressão de gene que compreende: i) um elemento de resposta reconhecido pelo domínio de ligação de DNA do polipeptídeo codificado do primeiro cassete de expressão de gene; ii) um promotor que é ativado através do domínio de transativação do polipeptídeo codificado do primeiro cassete de expressão de gene; e iii) um gene cuja expressão deve ser modulada.

Em outra modalidade específica, o sistema de modulação de expressão de gene compreende um primeiro cassete de expressão de gene que compreende um polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídeo que compreende um domínio de ligação de DNA que reconhece um elemento de resposta associado com um gene cuja expressão deve ser modulada e um

domínio	de ligação de ligante de	receptor	nuclear, e	um
segundo	cassete de expressão de	gene que	compreende	um
domínio	de transativação e um domínio de ligação de ligante
de receptor nuclear, onde um dos	domínios	de ligação	de
ligante	de receptor nuclear é um	domínio	de ligação	de
ligante	de receptor nuclear do Grupo H que	compreende	uma
mutação	de substituição. Em uma	modalidade	preferida,	o

primeiro polipeptídeo fica livre de forma substancial de um domínio de transativação e o segundo polipeptídeo fica livre de forma substancial de um domínio de ligação de DNA. Para os propósitos da invenção, livre de forma substancial significa que a proteína em questão não contém uma seqüência suficiente do domínio em questão para proporcionar a atividade de ativação ou ligação. O sistema de modulação de expressão de gene pode compreender adicionalmente um terceiro cassete de expressão de gene que compreende: i) um elemento de resposta reconhecido pelo domínio de ligação de DNA do primeiro polipeptídeo do primeiro cassete de expressão de gene, ii) um promotor que é ativado através do domínio de transativação do segundo polipeptídeo do segundo cassete de expressão de gene, e iii) um gene cuja expressão deve ser modulada.

Quando somente um domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H compreende uma mutação de substituição, o outro domínio de ligação de ligante de receptor pode ocorrer a partir de qualquer outro receptor que forme um dímero com o domínio de ligação de ligante do Grupo H que compreende a mutação de substituição. Por exemplo, quando o domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição for um domínio de ligação de ligante de receptor de ecdisona que compreende uma mutação de substituição, o outro domínio de ligação de ligante de receptor nuclear (parceiro) pode ocorrer a partir de um receptor de ecdisona, receptor de retinóide X de vertebrado (RXR), um RXR de invertebrado, uma õj· proteína de ultraespiráculo (USP), ou um receptor nuclear quimérico que compreende pelo menos dois fragmentos de polipeptídeo de domínio de ligação de ligante de receptor nuclear diferentes selecionados a partir do grupo que consiste de um RXR de vertebrado, RXR de invertebrado e um RXR (ver pedidos co-pendentes PCT/US01/09050, US 60/294.814 e US 60/294.819, incorporadas no presente documento por referência em sua totalidade). O domínio de ligação de ligante de receptor nuclear parceiro pode compreender adicionalmente uma mutação de truncamento, uma mutação de anulação, uma mutação de substituição ou outra modificação.

Preferencialmente, o domínio de ligação de ligante de RXR de vertebrado é proveniente de um RXR de humano Homo sapiens, camundongo Mus musculus, rato Rattus norvegicus, galinha Gallus gallus, porco Sus scrofa domestica, sapo Xenopus laevis, peixe zebra Danio rerio, tunicado Polyandrocarpa misakíensis ou peixe geléia Tripedalia cysophora.

Preferencialmente, o domínio de ligação de ligante de RXR de invertebrado é proveniente de um polipeptídeo de RXR de gafanhoto Locusta migratória (LmRXR) , um RXR de carrapato isodídeo Amblyomma americanum homólogo 1 (AmaRXRl), um RXR de carrapato isodídeo Amblyomma americanum homólogo 2 (AmaRXR2), um RXR de caranguejo violinista Celuca pugilator homólogo (CpRXR), um RXR de besouro Tenebrio molitor homólogo (TmRXR), um RXR de abelha comum Apis mellifera homóloga (AmRXR), um RXR de afideo Myzus persicae homólogo (MpRXR) , ou RXR de não díptero/não lepidóptero homólogo.

Preferencialmente, o domínio de ligação de ligante de RXR quimérico compreende pelo menos dois fragmentos de polipeptídeo selecionados a partir do grupo que consiste de um fragmento de polipeptídeo de RXR de espécies de vertebrados, um fragmento de polipeptídeo de RXR de espécies de invertebrados e, um fragmento de polipeptídeo de RXR de espécies de invertebrados não dípteros/não lepidópteros homólogo. Um domínio de ligação de ligante de RXR quimérico para uso na presente invenção pode compreender pelo menos dois fragmentos de polipeptídeo de RXR de espécies diferentes, ou quando a espécie for a mesma, os dois ou mais fragmentos de polipeptídeo podem ocorrer a partir de duas ou mais isoformas diferentes do fragmento de polipeptídeo de RXR de espécies.

Em uma modalidade preferida, o domínio de ligação de ligante de RXR quimérico compreende pelo menos um fragmento de polipeptídeo de RXR de espécies de vertebrados e um fragmento de polipeptídeo de RXR de espécies de invertebrados. Em uma modalidade mais preferida, o domínio de ligação de ligante de RXR quimérico compreende pelo menos um fragmento de polipeptídeo de RXR de espécies de vertebrados e um fragmento de polipeptídeo de RXR de espécies de invertebrados não dípteros/não lepidópteros homólogos.

Em uma modalidade específica, o gene cuja expressão deve ser modulada é um gene homólogo com relação à célula hospedeira. Em outra modalidade específica, o gene cuja expressão deve ser modulada é um gene heterólogo com relação à célula hospedeira

Os ligantes para uso na presente invenção, conforme descrito acima, quando combinados com o domínio de ligação de ligante do receptor(es) nuclear(es), que sucessivamente está ligado ao elemento de resposta conectado a um gene, proporciona o meio para a regulação temporal externa da expressão do gene. O mecanismo de ligação ou a ordem em que diversos componentes desta invenção se ligam uns nos outros, ou seja, por exemplo, domínio de ligação de ligante a ligante, domínio de ligação de DNA ao elemento de resposta, domínio de transativação para promotor, etc, não é crítico.

	Em um exemplo específico,	a ligação do ligante ao
domínio	de ligação de ligante de	um receptor nuclear do
Grupo H	e seu domínio de ligação	de ligante de receptor

nuclear parceiro permite a expressão ou supressão do gene. Este mecanismo não exclui o potencial para ligação de ligante do receptor nuclear do Grupo H (GHNR) ou seu parceiro, e a formação resultante dos complexos homodímeros ativos (por exemplo, GHNR + GHNR ou parceiro + parceiro) . Preferencialmente, um ou mais domínios de receptor são variados o que produz uma comutação de gene híbrido. Tipicamente, um ou mais dos três domínios, domínio de DBD, de LBD e de transativação, podem ser escolhido a partir de uma fonte diferente da fonte de outros domínios, de modo que os genes híbridos e as proteínas híbridas resultantes sejam otimizadas na célula ou organismo hospedeiro escolhido para

Ίί a atividade de transativação, ligação complementar do ligante e o reconhecimento de um elemento de resposta específico. Ademais, o próprio elemento de resposta pode ser modificado ou substituído por elementos de resposta para outros domínios de proteína de ligação de DNA, tal como a proteína GAL-4 a partir da levedura (ver Sadowski, et. Al. (1988), Nature, 335:563-564) ou a proteína LexA a partir de Escherichia coli (ver Brent e Ptashne (1985), Cell, 43:729736) , ou elementos de resposta sintéticos específicos para interações marcadas com proteínas designadas , modificadas e selecionadas para tais interações específicas (ver, por exemplo, Kim et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:3 616-3620) para acomodar receptores híbridos. Outra vantagem dos sistemas de dois híbridos é que eles permitem a escolha de um promotor usado para conduzir a expressão de gene de acordo com um resultado final desejado. Tal controle duplo pode ser particularmente importante nas áreas de terapia de gene, especialmente quando as proteínas citotóxicas são produzidas, porque tanto o tempo de expressão, assim como as células onde ocorre a expressão, podem ser controladas. Quando os genes conectados de forma operável a um promotor adequado, são introduzidos dentro das células do indivíduo, a expressão dos genes exógenos é controlada através da presença do sistema da invenção. Os promotores podem ser regulados de forma constitutiva ou indutiva ou podem ser específicos para tecido (ou seja, expressos somente em um tipo particular de células) ou específico para certos estágios de desenvolvimento do organismo.

O receptor de ecdisona é um membro da superfamília de receptor nuclear e classificado dentro da subfamília 1, grupo H (referido no presente documento como receptores nucleares do Grupo H) . Os membros de cada grupo compartilham de 40-60% de identidade de aminoácido no domínio E (ligação de ligante) (Laudet et al. , A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Subfamily, 1999; Cell 97:161-163). Além do receptor de ecdisona, outros membros desta subfamília receptora 1, grupo H incluem: , receptor ubíquo (UR), receptor órfão 1 (OR-1); receptor nuclear de hormônio esteróide (NER-1), receptor de retinóide X que interage com proteína-15 (RIP-15), receptor X de fígado β (LXRp), proteína tipo receptor de hormônio esteróide (RDL1), receptor X de fígado (LXR), receptor X de fígado (LXRa), receptor X farnesóide (FXR), um receptor que interage com proteína 14 (RIP-14) e um receptor farnesol (HRR-1).

Os requerentes desenvolveram um modelo homológico CfEcR e utilizaram este modelo homológico junto com um modelo homológico de receptor de ecdisona Chironomous tetans (CtEcR) publicado (Wurtz et al., 2000) para identificar resíduos críticos envolvidos na ligação de ecdisteróides e não ecdisteróides. Os não ecdisteróides sintéticos, diacilidrazinas, foram mostrados para ligar EcRs de lepidóptero com alta afinidade e induzir a fusão incompleta precoce nestes insetos (Wing et al. , 1988) e alguns destes compostos são comumente comercializados como inseticidas. A cavidade de ligação de ligante ou bolsa de EcRs evoluiu para se encaixar ao longo de estruturas da coluna vertebral de

Τ7 ecdisteróides, tal como 20-hidroxiecdisone (20E). As diacilidrazinas possuem uma estrutura compacta comparada aos ecdisteróides e ocupam somente a parte inferior da bolsa de ligação de EcR. Estes liberam um pouco de resíduo critico na parte superior da bolsa de ligação que entra em contato com os ecdisteróides mas não entra em contato com não ecdisteróides, tais como bisacilidrazinas. Os requerentes descrevem no presente documento a construção de receptores de ecdisonas mutantes que compreende uma mutação de substituição nestes resíduos de bolsa de ligação e identificaram diversas classes de receptores de ecdisona mutante de substituição com características de ligação de ligante e transativação modificadas.

Dado o relacionamento próximo do receptor de ecdisona com os outros receptores nucleares do Grupo H, os Requerentes identificaram que se espera que as mutações de substituição de domínio de ligação de ligante de receptor de ecdisona identificado também funcionem quando introduzidas na posição análoga dos domínios de ligação de ligante de outros receptores nucleares do Grupo H para modificar sua ligação de ligante ou sensibilidade de ligante. Alguém versado na técnica pode identificar as posições de aminoácidos análogas por seqüência e funcionar utilizando métodos rotineiros na técnica, tais como análises de seqüência, análise da bolsa de ligação através de analises de ligação e modelagem por homologia. Os novos polipeptídeos e polinucleotídeos de receptor nuclear do Grupo H alterados por substituição dos Requerentes são úteis em um sistema de vç modulação de gene indutor baseado em receptor nuclear para diversas aplicações que incluem terapia de gene, expressão de proteínas de interesse em células hospedeiras, produção de organismos transgênicos e análises baseadas em células.

Em particular, os Requerentes descrevem no presente documento um novo sistema de modulação de expressão de gene que compreende um domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição. Este sistema de expressão de gene pode ser um sistema de expressão de gene baseado em comutação única, onde o domínio de transativação, o domínio de ligação de DNA e o domínio de ligação de ligante ficam em um polipeptídeo codificado.

Alternativamente, o sistema de modulação de expressão de gene pode ser um sistema de modulação de expressão de gene baseado em duas comutações ou dois híbridos, onde o domínio de transativação e o domínio de ligação de DNA se situam em dois polipeptídeos codificados diferentes. Os Requerentes demonstraram primeiro que um receptor alterado por substituição pode ser usado como um componente de um sistema de modulação de gene indutor baseado em receptor nuclear para modificar a atividade de ligação de ligante e/ou especificidade de ligante tanto nas células procarióticas como nas células eucarióticas. Como discutido no presente documento, as descobertas dos Requerentes são tanto inesperadas como surpreendentes.

Um sistema de modulação de gene baseado em receptor de ecdisona da presente invenção pode ser tanto / J heterodimérico ou homodimérico. Um complexo de EcR geralmente funcional se refere a um complexo de proteína heterodimérica que consiste de dois membros da família receptora de esteróide, uma proteína receptora de ecdisona obtida a partir de diversos insetos, e uma proteína de ultraespiráculo (USP) ou vertebrado homólogo de USP, receptor de retinóide X de proteína (ver Yao, et al. (1993) Nature 366:476-479; Yao, et al. (1992) Cell 71:63-72).

Entretanto, o complexo pode também ser um homodímero como detalhado abaixo. O complexo de receptor de ecdisona também pode incluir proteína(s) adicional tal como imunofilinas. Os membros adicionais da família receptora de esteróide de proteínas, conhecidos como fatores transcricionais (tal como DHR38 ou betaFTZ-1), também podem ser parceiros dependentes ou independentes de ligantes para EcR, USP e/ou RXR. Adicionalmente, outros co-fatores podem ser requeridos, tais como proteínas geralmente conhecidas co-ativadoras (também chamadas de adaptadoras ou mediadoras). Estas proteínas não se ligam especificamente em seqüência ao DNA e não estão envolvidas em transcrição basal. Elas podem exercer seus efeitos sobre a ativação de transcrição através de diversos mecanismos, que incluem a simulação ligação de DNA de ativadores, ao afetar a estrutura de cromatina ou ao mediar interações complexas de ativador-iniciação. Os exemplos de tais co-ativadores incluem RIP140, TIF1, RAP46/Bag-1, ARA70, SRC-l/NCoA-1, TIF2/GRIP/NCoA-2, ACTR/AIBl/RAC3/pCIP, assim como a proteína de ligação B de elemento de resposta C de co-ativador geral, CBP/p300 (para revisão ver Glass et al. ,

7C

Curr. Opin, Cell Biol. 9:222-232, 1997). Também, os cofatores de proteína geralmente conhecidos como co-repressores (também conhecidos como repressores, silenciadores ou mediadores de silêncio) podem ser requeridos para inibir a ativação transcricional na ausência de ligante. Estes corepressores podem interagir com o receptor de ecdisona não ligado para silenciar a atividade no elemento de resposta. As evidencias atuais sugerem que a ligação de ligantes altera a conformação do receptor, que resulta na liberação do co-repressor e o recrutamento dos co-ativadores descritos acima, deste modo abolindo sua atividade de silenciamento. Os exemplos de co-repressores incluem N-CoR e SMRT (para revisão, ver Horwitz et al. Mol Endocrinol 10: 1167-1177, 1996). Estes co-fatores podem tanto ser endógenos dentro da célula ou organismo, como podem ser adicionados de forma exógena à medida que os transgenes são expressos tanto de uma maneira regulada como não regulada. Os complexos de homodímero da proteína de receptor de ecdisona, USP, ou RXR também podem ser funcionais sob algumas circunstâncias.

O complexo de receptor de ecdisona inclui tipicamente proteínas que são membros da superfamília de receptores nucleares, onde todos os membros são geralmente caracterizados pela presença de um domínio de transativação amino-terminal, um domínio de ligação de DNA (DBD) , e um domínio de ligação de ligante (LBL) separado do DBD por uma região de articulação. Como usado no presente documento, o termo domínio de ligação de DNA compreende uma seqüência de polipeptídeo mínima de uma proteína de ligação de DNA, até o comprimento total de um proteína de ligação de DNA, à medida que o domínio de ligação de DNA funciona para se associar com um elemento de resposta particular. Os membros da superfamília de receptores nucleares também são caracterizados pela presença de quatro ou cinco domínios: A/B, C, D, E, e em alguns membros F (ver a patente US 4.981.784 e Evans, Science 240:889-895 (1988). O domínio A/B corresponde ao domínio de transativação, C corresponde ao domínio de ligação de DNA, D corresponde à região de articulação, e E corresponde ao domínio de ligação de ligante. Alguns membros da família também podem possuir outro domínio de transativação na lateral carbóxi-terminal do LBD correspondente à F.

O DBD é caracterizado pela presença de dois dedos de zinco cisteína entre os quais dois são motivos de aminoãcidos, P-box e D-box, que conferem especificidade aos elementos de resposta de ecdisone. Estes domínios podem ser nativos, modificados ou quimeras de domínios diferentes de proteínas receptoras heterólogas. O receptor de EcR, tipo um subconjunto da família receptora de esteróide, também possui regiões menos definidas responsáveis por propriedades de heterodimerização. Devido ao fato dos domínios de receptores nucleares serem modulares na natureza, os domínios de LBL, DBD e transativação podem ser trocados. Os sistemas de comutação de gene conhecidos incorporam componentes a partir do complexo receptor de ecdisona. Entretanto, nestes sistemas conhecidos, quando o EcR é usado, este é associado com domínios de ligação de DNA modificados ou nativos e domínios de transativação na mesma molécula. 0 USP e RXR são tipicamente usados como parceiros de silencio. Os requerentes mostram que quando os domínios de ligação de DNA e os domínios de transativação estão na mesma molécula a atividade de base na ausência de ligante pe elevada e que tal atividade é drasticamente reduzida quando os domínios de ligação de DNA e os domínios de transativação estão em moléculas diferentes, ou seja, em cada um dos dois parceiros de um complexo heterodimérico ou homodimérico (ver PCT/US01/09050).

CASSETES DE EXPRESSÃO DE GENE DA INVENÇÃO

O novo sistema de expressão de gene indutor baseado em receptor nuclear da invenção compreende pelo menos um cassete de expressão de gene que é capaz de ser expresso em uma célula hospedeira, onde o cassete de expressão de gene compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende um domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição. Desta maneira, a invenção dos Requerentes também proporciona novos cassetes de expressão de gene para uso no sistema de expressão de gene da invenção.

Em uma modalidade específica, o cassete de expressão de gene que é capaz de ser expresso em uma célula hospedeira compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste de: a) um polipeptídeo que compreende um domínio de transativação, um domínio de ligação de DNA e um domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição; b)um polipeptídeo que compreende um domínio de ligação de DNA e um domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição; e c)um polipeptídeo que compreende um domínio de transativação e um domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição.

Em outra modalidade específica, a presente invenção proporciona um cassete de expressão de gene que é capaz de ser expresso em uma célula hospedeira, onde o cassete de expressão de gene compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo híbrido selecionado a partir do grupo que consiste de: a) um polipeptídeo híbrido que compreende um domínio de transativação, domínio de ligação de DNA e um domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição; b)um polipeptídeo híbrido que compreende um domínio de ligação de DNA e um domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição; e c) um polipeptídeo híbrido que compreende um domínio de transativação e um domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição. Um polipeptídeo híbrido, de acordo com a invenção, compreende pelo menos dois fragmentos de polipeptídeo, onde cada fragmento de polipeptídeo é proveniente de uma fonte diferente, isto é, um polipeptídeo diferente, um receptor nuclear diferente, uma espécie diferente, etc. O polipeptídeo híbrido, de acordo com a invenção, pode compreender pelo menos dois domínios de polipeptídeo, onde cada domínio de polipeptídeo é proveniente de uma fonte diferente de uma fonte diferente.

Em uma modalidade específica, o domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição que é proveniente de um receptor de ecdisona, um receptor ubíquo, um receptor órfão 1, um NER-1, um receptor nuclear de hormônio esteróide 1, um receptor de retinóide X que interage com proteína-15, um receptor X de fígado β, uma proteína tipo receptor de hormônio esteróide, um receptor X de fígado a, um receptor X de farnesóide, receptor que interage com proteína 14 e um receptor farnesol. Em uma modalidade preferida, o domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H é proveniente de um receptor de ecdisona.

Desta maneira, a presente invenção também proporciona um cassete de expressão de gene compreende um polinucleotideo que codifica um polipeptídeo selecionado a partir do grupo que consiste de: a) um polipeptídeo que compreende um domínio de transativação, domínio de ligação de DNA e um domínio de ligação de ligante de receptor de ecdisona que compreende uma mutação de substituição; b)um polipeptídeo que compreende um domínio de ligação de DNA e um domínio de ligação de ligante de receptor de ecdisona que compreende uma mutação de substituição; e c) um polipeptídeo que compreende um domínio de transativação e um domínio de ligação de ligante de receptor de ecdisona que compreende uma mutação de substituição. Preferencialmente, o cassete de $1 expressão de gene compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo híbrido selecionado a partir do grupo que consiste de: a)um polipeptídeo híbrido que compreende um domínio de transativação, um domínio de ligação de DNA e um domínio de ligação de ligante de receptor de ecdisona que compreende uma mutação de substituição; b)um polipeptídeo híbrido que compreende um domínio de ligação de DNA e um domínio de ligação de ligante de receptor de ecdisona que compreende uma mutação de substituição; e c) um polipeptídeo híbrido que compreende um domínio de transativação e um domínio de ligação de ligante de receptor de ecdisona que compreende uma mutação de substituição; onde o polipeptídeo híbrido codificado compreende pelo menos dos fragmentos de polipeptídeo, onde cada fragmento de polipeptídeo é proveniente de uma fonte diferente.

O domínio de ligação de ligante (LBD) de receptor de ecdisona (EcR) pode ser de um EcR de invertebrado, preferencialmente selecionado a partir de uma classe de EcR de Artrópode. Preferencialmente o EcR é selecionado a partir do grupo que consiste de um EcR de Lepidóptero, um EcR de Díptero, um EcR de ortóptero, um EcR de homóptero e um EcR de hemíptero. Mais preferencialmente, domínio de ligação de ligante de EcR para uso na presente invenção é proveniente de uma larva EcR de Choristoneura fumiferana (CfEcR), um EcR de besouro Tenebrio molitor (TmEcR), um EcR de Manduca sexta (MsEcR) , um EcR de Heliothies virescens (HvEcR) , um EcR de mosquito Chironomus tentans (CtEcR), um bicho da seda Bombyx mori (BmEcR), uma borboleta Bicyclus anynana (BanEcR), um castanheiro-da-índia Junonia coenia (JcEcR), um EcR de mosca de fruta Drosophila melanogaster (DmEcR), um EcR de mosquito Aedes aegypti (AaEcR), uma moscavarejeira Lucilia capitata (LcEcR), uma mosca-varejeira Lucilia cuprina (LuEcR), um EcR de mosca-varejeira Calliphora vicinia (CvEcR), um EcR de mosca de fruta do Mediterrâneo Ceratitis capitata (CcEcR), um EcR de gafanhoto Locusta migratória (LmEcR), e um EcR de afideo Myzus persicae (MpEcR), um EcR de caranguejo violinista Celuca pugilator (CpEcR), um EcR de isodídeo Amblyomma americanum (AmaEcR) ou um EcR de cigarra Nephotetix cincticeps (NcEcR). Mais preferencialmente, o LBD é proveniente de um CfEcR, um DmEcR ou um AmaEcR.

Em uma modalidade específica, o LBD é proveniente de um polipeptídeo de EcR truncado. O truncamento de polipeptídeo de EcR resulta em uma anulação de pelo menos 1,

2, 3	, 4,	5, 10, 15,	20,	25, 30, 35	, 40,	45,	50, 55	, 60,	65,
70,	75,	80, 85, 90,	95,	100, 105,	110,	115,	120,	125,	130,
135,	140	, 145, 150,	155,	160, 165,	170 ,	175,	180,	185,	190,
195,	200	, 205, 210,	215,	220, 230,	235,	240,	245,	250,	255,

260 ou 265 aminoácidos. Preferencialmente, o truncamento de polipeptídeo de EcR resulta em uma anulação de pelo menos um domínio de polipeptídeo parcial. Mais preferencialmente, o truncamento de polipeptídeo de EcR resulta em uma anulação de pelo menos um domínio de polipeptídeo total. Em uma modalidade específica, o truncamento de polipeptídeo de EcR resulta em uma anulação de pelo menos um domínio A/B, um domínio C, um domínio D, um domínio F, domínios A/B/C, domínios A/B/l/2, domínios A/B/C/D, domínios A/B/C/D/F, domínios A/B/F, domínios A/B/C/F, um domínio E parcial ou um domínio F. Uma combinação de diversas anulações de domínio completo e/ou parcial também pode ser realizada.

Em uma modalidade específica, domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H é codificado por um polinucleotideo que compreende uma mutação de códon que

resulta em	uma	substituição	de:	a) resíduo de	aminoácido	48,
51, 52, 54	, 92,	95, 96, 109	, 110, 119, 120,	125, 128, 132,
219, 223,	234	ou 238 de	SEQ	ID NO: 1,	b)resíduos	de
aminoácido	96	e 119 de	SEQ	ID NO: 1,	c)resíduos	de
aminoácido	110	e 128 de	SEQ	ID NO: 1,	d)resíduos	de
aminoácido	52	e 110 de	SEQ	ID NO: 1,	e)resíduos	de
aminoácido	107,	110 e 127 de	: SEQ	ID NO: 1, ou	f) resíduos	de
aminoácido	52,	107 e 127	de	SEQ ID NO:	1. Em outra
modalidade,	o	domínio de (	ligação de ligante de receptor

nuclear do Grupo H é codificado por um polinucleotideo que compreende mutações de códon que resultam em uma substituição de resíduos de aminoácido 107 e 127 e inserção de aminoácido 259 de SEQ ID NO: 1.

Em uma modalidade preferida, o domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H é proveniente do receptor de ecdisona.

Em outra modalidade específica, o domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H é codificado por um polinucleotídeo que compreende uma mutação de códon que resulta em uma substituição de: a) um resíduo de asparagina, arginina, tirosina, triptófano, leucina ou

R?

u ^!

Usina em uma posição equivalente ou análoga a um resíduo de aminoácido 48 de SEQ ID NO: 1, b) um resíduo de metionina, asparagina ou leucina em uma posição equivalente ou análoga a um resíduo de aminoácido 51 de SEQ ID NO: 1, c) um resíduo de leucina, prolina, metionina, arginina, triptófano, glicina, glutamina ou acido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1, d) um triptófano ou treonina em posição equivalente ou análoga ao aminoácido 54 de SEQ ID NO: 1, e) uma leucina ou acido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 92 de SEQ ID NO: 1, f) um resíduo de histidina, metionina ou triptófano em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 95 de SEQ ID NO: 1, g) um resíduo de leucina, serina, ácido glutâmico ou triptófano em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de aminoácido 96 de SEQ ID NO: 1, h) um triptófano, prolina, leucina, metionina ou aspargina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 109 de SEQ ID NO: 1, i) um resíduo de ácido glutâmico, triptófano ou asparagina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1, j) uma fenilalamina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 119 de SEQ ID NO: 1, k) um triptófano ou metionina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 12 0 de SEQ ID NO: 1, 1) um ácido glutâmico, prolina, leucina, cistina, triptófano, glicina, isoleucina, asparagina, serina, valina, ou arginina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 125 de SEQ ID NO: 1, m) uma fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 12 8 de SEQ ID NO: 1, n) uma metionina, asparagina, ácido glutâmico, ou valina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 132 de SEQ ID NO: 1, o) um resíduo de alanina, lisina, triptófano ou tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de aminoácido 219 de SEQ ID NO: 1, p) um resíduo de lisina, arginina ou tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 223 de SEQ ID NO: 1, q) uma metionina, arginina, triptófano ou isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 234 de SEQ ID NO: 1, r) uma prolina, ácido glutâmico, leucina, metionina ou tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 238 de SEQ ID NO: 1, s) um resíduo de fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 119 de SEQ ID NO: 1 e uma treonina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 96 de SEQ ID NO: 1, t) um resíduo de prolina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1 e um resíduo de fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 128 de SEQ ID NO: 1, u) um resíduo de valina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1 e um resíduo de pralina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1, v) um resíduo de isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 127 de SEQ ID NO: 1 e um resíduo de prolina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1, ou w) uma isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, um ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 12 7 de SEQ ID NO: 1 e uma valina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H é codificado por um polinucleotídeo que compreende mutações de códon que resultam na substituição de um resíduo de isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 127 de SEQ ID NO: 1 e inserção de um resíduo de glicina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 259 de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade preferida, o domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H é proveniente de receptor de ecdisona.

Em uma modalidade preferida, o domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição é um domínio de ligação de ligante de receptor de ecdisona que compreende uma mutação de substituição codificada por um polinucleotídeo que compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição selecionada a partir do grupo que resulta de

mutação de substituição	F48Y,	F48W,	F48L,	F48N,	F48R,	F48K,
I51M, I51N, I51L, T52M,	T52V,	T52L,	T52E,	T52P,	T52R,	T52W,
T52G, T52Q, M54W, M54T,	M92L,	M92E,	R95H,	R95M,	R95W,	V96L,

V96W, V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M, F109N, A110E,

A110N, A110W, N119F, Y120W, Y120M, M125P, M125R, M125E,

M125L, M125C, M125W, M125G, M125I, M125N, MI25S, M125V,

CH ύ r

V128F, L132M, L132N, L132V, L132E, M219K, M219W, M219Y,

M219A, L223K, L223R, L223Y, L234M, L234I, L234R, L234W,

W238P, W238E, W238Y, W238M, W238L, N119F/V96T, V128F/A110P,

T52V/A110P, V107I/Y127E/T52V, e V107I/Y127E/A110P de SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade específica, o domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição é um domínio de ligação de ligante de receptor de ecdisona que compreende uma mutação de substituição codificada por um polinucleotídeo que compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição V107I/Y127E de SEQ ID NO: 1, que compreende adicionalmente a mutação de inserção G259 de SEQ ID NO: 1 (V1071/Y127E/G259) .

Em outra modalidade específica, o domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição é um domínio de ligação de ligante de receptor de ecdisona que compreende uma mutação de substituição codificada por um polinucleotídeo que forma híbridos para um polinucleotídeo que compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição selecionada a partir do grupo que consiste de F48Y, F48W, F48L, F48N, F48R, F48K, I51M, I51N, I51L, T52M, T52V,

T52L, T52E, T52P, T52R, T52W, T52G, T52Q, M54W, M54T, M92L,

M92E, R95H, R95M, R95W, V96L, V96W, V96S, V96E, F109W,

F109P,	F109L,	F109M,	F109N,	A110E,	A110N,	A110W,	N119F,
Y120W,	Y120M,	M125P,	M125R,	M125E,	M125L,	M125C,	M125W,
M125G,	M125I,	M125N,	M125S,	M125V,	V128F,	L132M,	L132N,
L132V,	L132E,	M219K,	M219W,	M219Y,	M219A,	L223K,	L223R,

Já

L223Y, L234M, L234I, L234R, L234W, W238P, W238E, W238Y,

W238M, W238L, N119F/V96T, V128F/A110P, T52V/A110P, V107I/Y127E/T52V, e V107I/Y127E/A110P de SEQ ID NO: 1 sob condições de hibridização que compreendem uma etapa de hibridização com menos de 500 mM de sal e pelo menos a 37 graus Celsius, e uma etapa de lavagem de 2XSSPE a pelo menos 63 graus Celsius. Em uma modalidade preferida, as condições de hibridização compreendem menos de 200 mM de sal e pelo menos 37 graus Celsius para a etapa de hibridização. Em outra modalidade preferida, as condições de hibridização compreendem 2XSSPE e pelo menos 63 graus Celsius, tanto pata a etapa de hibridização como para a etapa de lavagem.

Em outra modalidade específica, o domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição em uma posição equivalente ou análoga a: a) resíduo de aminoãcido 48, 51,

52, 54, 92, 95, 96, 109, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219,

223, 234, ou 238 de SEQ ID NO: 1, b) resíduos de aminoácido e 119 de SEQ ID NO: 1, c) resíduos de aminoãcido 110 e 128 de SEQ ID NO: 1, d) resíduos de aminoácido 52 e 110 de SEQ ID NO: 1, e) resíduos de aminoãcido 107, 110 e 127 de SEQ ID NO: 1, ou f) resíduos de aminoácido 52, 107 e 127 de SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, o domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H compreende mutações de substituição que resultam em mutação de substituição em uma posição equivalente ou análoga aos resíduos de aminoácido 107 e 127 e a inserção de resíduos de aminoãcido 259 de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade preferida, o domínio ϋ !

de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H é proveniente de um receptor de ecdisona.

Preferencialmente, o domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H compreende uma substituição de: a) asparagina, arginina, tirosina, triptófano, leucina ou lisina em uma posição equivalente ou análoga a um resíduo de aminoácido 48 de SEQ ID NO: 1, b) um resíduo de metionina, asparagina ou leucina em uma posição equivalente ou análoga a um resíduo de aminoácido 51 de SEQ ID NO: 1, c) um resíduo de leucina, prolina, metionina, arginina, triptófano, glicina, glutamina ou ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1, d) um resíduo de triptófano ou treonina em posição

equivalente	ou	análoga	ao	aminoácido	54	de SEQ ID NO	: 1, e)
um resíduo	de	leucina	ou	acido glutâmico em uma	posição
equivalente	ou	análoga	ao	aminoácido	92	de SEQ ID NO	: 1, f)
um resíduo	de	histidina,	metionina	ou	triptófano	em uma

posição equivalente ou análoga ao aminoácido 95 de SEQ ID NO: 1, g) um resíduo de leucina, serina, ácido glutâmico ou triptófano em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de aminoácido 96 de SEQ ID NO: 1, h) um triptófano, prolina, leucina, metionina ou aspargina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 109 de SEQ ID NO: 1, i) um resíduo de ácido glutâmico, triptófano ou asparagina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1, j) um resíduo de fenilalamina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 119 de SEQ ID NO: 1, k) um resíduo de triptófano ou metionina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 120 de SEQ ID NO: 1, 1) um resíduo de ácido glutâmico, prolina, leucina, cistina, triptófano, glicina, isoleucina, asparagina, serina, valina, ou arginina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 125 de SEQ ID NO: 1, m) um resíduo de fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 128 de SEQ ID NO: 1, n) um resíduo de metionina, asparagina, ácido glutâmico, ou valina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 132 de SEQ ID NO: 1, o) um resíduo de alanina, lisina, triptófano ou tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de aminoácido 219 de SEQ ID NO: 1, p) um resíduo de lisina, arginina ou tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 223 de SEQ ID NO: 1, q) um resíduo de metionina, arginina, triptófano ou isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 234 de SEQ ID NO: 1, r) um resíduo de prolina, ácido glutâmico, leucina, metionina ou tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 238 de SEQ ID NO: 1, s) um resíduo de fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 119 de SEQ ID NO: 1 e um resíduo de treonina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 96 de SEQ ID NO: 1, t) um resíduo de prolina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1 e um resíduo de fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 128 de SEQ ID NO: 1, u) um resíduo de valina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1 e um resíduo de pralina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1, v) um resíduo de isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 127 de SEQ ID NO: 1 e um resíduo de prolina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 110 de SEQ ID NO: 1, ou w) uma isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 127 de SEQ ID NO: 1 e um resíduo de vaiina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 52 de SEQ ID NO: 1. Em outra modalidade, o domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H compreende uma substituição de um resíduo de isoleucina uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 107 de SEQ ID NO: 1, um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 127 de SEQ ID NO: 1 e a inserção de um resíduo de glicina em uma posição equivalente ou análoga ao aminoácido 259 de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade preferida, o domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H é proveniente de um receptor de ecdisona.

Em outra modalidade específica, o domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição é um polipeptídeo de domínio de ligação de ligante de receptor de ecdisona que compreende uma mutação de substituição, onde a mutação de substituição é selecionada a partir do grupo que consiste de

F48Y, F48W, F48L, F48N, F48R, F48K, I51M, I51N, I51L, T52M,

T52V, T52L, T52E, T52P, T52R, T52W, T52G, T52Q, M54W, M54T,

M92L,	M92E, R95H, R95M,	R95W,	V96L, V96W, V96S	, V96E,	F109W,
F109P,	F109L, F109M,	F109N,	A110E, A110N,	A110W,	N119F,
Y120W,	Y120M, M125P,	M125R,	M125E, M125L,	M125C,	M125W,
M125G,	M125I, M125N,	M125S,	M125V, V128F,	L132M,	L132N,
L132V,	L132E, M219K,	M219W,	M219Y, M219A,	L223K,	L223R,
L223Y,	L234M, L234I,	L234R,	L234W, W238P,	W238E,	W238Y,

W238M, W238L, N119F/V96T, V128F/A110P, T52V/A110P, V107I/

Y127E/T52V, e V107I/Y127E/A110P de SEQ ID NO: 1. Em outra

modalidade específica, o domínio	de ligação	de	ligante	de
receptor nuclear do Grupo H que	compreende	uma	mutação	de
substituição é um polipeptídeo	de domínio	de	ligação	de
ligante de receptor de ecdisona	que compreende	mutação	de
substituição V107I/Y127E de SEQ	ID NO : 1,	que	compreende

adicionalmente a mutação de inserção G259 de SEQ ID NO: 1 (V107I/Y127E/G259) .

O domínio de ligação de DNA pode ser qualquer domínio de ligação de DNA com um elemento de resposta conhecido, que inclui domínios de ligação de DNA sintéticos e quiméricos, ou análogos, combinações ou modificações destes. Preferencialmente, o DBD é um DBD de GAL4 , um DBD de LexA, um DBD de fator de transcrição, um DBD de membro de receptor nuclear do Grupo H, um DBD de membro de superfamília de receptor nuclear de hormônio esteróide/tiróide ou um DBD de Lac. Mais preferencialmente, o DBD é um DBD de EcR [SEQ ID NO: 4 (polinucleotídeo) ou SEQ ID NO: 5 (polipeptídeo)], um DBD de GAL4 [SEQ ID NO: 6 (polinucleotídeo) ou SEQ ID NO: 7 (polipeptídeo), ou um DBD de LexA [(SEQ ID NO: 8 (polinucleotídeo) ou SEQ ID NO: 9 (polipeptídeo)].

Ο

7Ò

Ο domínio de transativação (abreviado como AD ou TA) pode ser de qualquer AD de membro de receptor nuclear do grupo H, AD de receptor nuclear de hormônio esteróide/ tiróide, um AD sintético ou quimérico, AD de poliglutamina, AD de aminoácido básico ou ácido, um AD de VP16, um AD de GAL4,, um AD de NF-kB, um AD de BP64, um domínio de ativação ácida B42 (ADB42), um domínio de transativação de p65 (ADp65), ou um análogo,combinação ou modificação destes. Em uma modalidade específica, o AD é um AD sintético ou quimérico, ou é obtido a partir de um AD de domínio de ativação ácida EcR, receptor de glucocorticóide, VP16, GAL4, NF-kB ou B42. Preferencialmente, o AD é um AD de EcR [SEQ ID NO: 10 (polinucleotídeo) ou SEQ ID NO: 11 (polipeptídeo)], um AD VP16 [SEQ ID NO: 12 (polinucleotídeo) ou SEQ ID NO: 13 (polipeptídeo)], um AD B42 [SEQ ID NO: 14 (polinucleotídeo) ou SEQ ID NO: 15 (polipeptídeo)] , ou AD p65 [SEQ ID NO: 16 (polinucleotídeo) ou SEQ ID NO: 17 (polipeptídeo)].

Em uma modalidade específica, o cassete de expressão de gene codifica um polipeptídeo híbrido que compreende tanto, a) um domínio de ligação de DNA codificado por um polipeptídeo que compreende uma seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 ou SEQ ID NO: 8, como, b) um domínio de transativação codificado por um polinucleotídeo que compreende uma seqüência de ácido nucléico de SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 ou SEQ ID NO: 16; e um domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição que compreende uma mutação de substituição codificada por um polinucleotídeo, de acordo com a invenção. Preferencialmente, o domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição é um domínio de ligação de ligante de receptor de ecdisona codificado por um polinucleotídeo, de acordo com a invenção.

Em outra modalidade específica, o cassete de expressão de gene codifica um polipeptídeo híbrido que compreende tanto, a) um domínio de ligação de DNA que compreende uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO-, 7 ou SEQ ID NO: 9, como, b) um domínio de transativação que compreende uma seqüência de aminoácido de SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 ou SEQ ID NO: 17; e um domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição, de acordo com a invenção. Preferencialmente, o domínio de ligação de ligante de receptor nuclear do Grupo H que compreende uma mutação de substituição é um domínio de ligação de ligante de receptor de ecdisona compreende uma mutação de substituição, de acordo com a invenção.

A presente invenção também proporciona um cassete de expressão de gene que compreende: i) um elemento de resposta que compreende um domínio reconhecido por um polipeptídeo que compreende um domínio de ligação de DNA; ii) um promotor que ativado através de um polipeptídeo que compreende um domínio de transativação; iii) um gene cuja expressão deve ser modulada.

7'S

O elemento de resposta (RE) pode ser qualquer elemento de resposta com um domínio de DNA conhecido, ou análogo, combinação ou modificação destes. Um único RE ou múltiplos REs pode ser empregado, tanto múltiplas cópias do mesmo RE, como dois ou mais REs diferentes podem ser usados na presente invenção. Em uma modalidade, o RE é um RE de GAL4 (GAL4RE), LexA, um RE de receptor nuclear do Grupo H, um RE de receptor nuclear de hormônio esteróide/tireóide, ou um RE sintético que reconhece um domínio de ligação de DNA sintético. Preferencialmente, o RE é um elemento de resposta de ecdisona (EcRE) que compreende uma seqüência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 18, um GAL4RE que compreende uma seqüência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 19, ou um RE LexA (operon op) que compreende uma seqüência de polinucleotídeo de SEQ ID NO: 20 (2XLexAopRE).

Um domínio de ligação de DNA de receptor nuclear de hormônio esteróide/tireóide, um domínio de ativação ou elemento de resposta, de acordo com a invenção podem ser obtidos a partir de um receptor nuclear de hormônio esteróide/tireóide selecionado a partir do grupo que consiste de receptor de hormônio tireóide α (TRa), receptor de tireóide 1 (c-erbA-1), receptor de hormônio tireóide β (ΤΡβ) , receptor de ácido retinóico OC (RARa) , receptor de ácido retinóico β (ΡΑΡβ, HAP), receptor de ácido retinóico γ (RARy) , receptor de ácido retinóico tipo gama (RARD) , receptor ativado por proliferador de peroxisomo α (PPARa) , receptor ativado por proliferador de peroxisomo β (ΡΡΑΡβ), receptor ativado por proliferador de peroxisomo Ô (PPARÔ, tf

NUC-1), receptor relacionado com ativador de proliferador de peroxisomo (FFAR), receptor ativado por proliferador de peroxisomo γ (PPARy) , receptor órfão codificado por filamento não codificado de receptor de hormônio tireóide α (REVERBOt) , receptor relacionado com v-erb A (EAR-1) , receptor relacionado com v-erb (EAR-1A), receptor órfão codificado por filamento não codificado de receptor de hormônio tireóide β (REVERBp), receptor relacionado com verb (EAR-ΐβ), receptor nuclear órfão BD73 (BD73), receptor relacionado com v-erbA (RVR) , proteína de dedo de zinco 126 (HZF2), proteína indutora por ecdisona E75 (E75), proteína indutora por ecdisona E78 (E78), receptor de Drosófila 78 (DR-78), receptor órfão relacionado com retinóide oc (ROROt) , receptor Z de retinóide oc (RZRa) , receptor órfão relacionado com retinóide β (ΒΟΒβ) , receptor Z de retinóide β (ΒΖΒβ) , receptor órfão relacionado com retinóide γ (RORy) , receptor Z de retinóide γ (RZRy) , receptor órfão relacionado com retinóide (TOR), receptor de hormônio 3 (HR-3), receptor de hormônio Drosophila 3 (DHR-3), receptor de hormônio Manduca (MHR-3), receptor de hormônio Galleria 3 (GHR-3), receptor nuclear C. elegans 3 (CNR-3), receptor de hormônio

Choristoneura 3 (CHR-3), receptor nuclear C. elegans 14 (CNR-14), receptor de ecdisona (ECR), receptor ubíquo (UR) , receptor nuclear órfão (OR-1), NER-1, receptor de interação proteína 15 (RIP-15) , receptor X de fígado β (ΙΙΧΉβ) , receptor de proteína tipo hormônio esteróide (RLD-1) , receptor X de fígado (LXR) , receptor X de fígado α (LXRa) , receptor X de farnesóide (FXR), receptor de proteína de interação de 14 (RIP-14), HRR-1, receptor de vitamina D (VDR), receptor nuclear órfão (ONR-1), receptor X de pregnano (PXR), receptor esteróide e xenobiótico (SXR), receptor X de benzoato (BXR), receptor nuclear (MB-67), receptor androstano constitutivo 1 (CAR-1), receptor androstano constitutivo tt (CARoc) , receptor androstano constitutivo 2 (CAR-2), receptor androstano constitutivo β (ΟΑΡβ), receptor de hormônio Drosophila 96 (DHR-96), receptor de hormônio nuclear 1 (NHR-1), fator nuclear de hepatócito 4 (HNF-4), fator nuclear de hepatócito 4G (HNF4G), fator nuclear de hepatócito 4B (HNF-4B), fator nuclear de hepatócito 4D (HNF-4D, DHNF-4), receptor X retinóide α (RXROí) , receptor X retinóide β (ΗΧΗβ) , proteína de ligação II de região H-2 (H-2IIBP), co-regulador de receptor nuclear 1 (RCoR-1) , receptor X de retinóide γ (RXRy) , Ultraespiráculo (USP), receptor nuclear 2C1, fator de córion 1 (CF-1), receptor testicular 2 (TR-2), receptor testicular 2-11 (TR2-11), receptor testicular 4 (TR4), TAK-1, receptor de hormônio Drosophila (DHR78), Sem Cauda (TLL), homólogo sem cauda (TLX), XTLL, fator de transcrição de promotor a montante de ovalbumina de galinha A (COUP-TFA), EAR-3, SVP44, fator de transcrição de promotor a montante de ovalbumina de galinha II (COUP-TFII), fator de transcrição de promotor a montante de ovalbumina de galinha B (COUPTFB), ARP-1, SVP-40, SVP, , fator de transcrição de promotor a montante de ovalbumina de galinha III (COUP-TFIII), fator de transcrição de promotor a montante de ovalbumina de galinha G (COUP-TFG) , SVP-46, EAR-2, receptor de estrogênio α (ERa), receptor de estrogênio β (ER3), receptor relacionado com estrogênio 1 (ERR1), receptor relacionado com estrogênio a (ERRa), receptor relacionado com estrogênio 2 (ERR2), receptor relacionado com estrogênio β (ΕΗΗβ), receptor de glucocorticóide (GR) , receptor mineralocorticóide (MR) , receptor de progesterona (PR) receptor de andrógeno (AR) , gene induzido por fator de crescimento de nervo B (NGFI-B), receptor nuclear similar ao Nur-77, N10, Receptor Órfão (NUR-77), gene humano de resposta antecipada imediata (NOT), receptor nuclear de fígado de regeneração 1 (RNR-1), dedo de zinco hematopoiético 3 (HZF-3), proteína relacionada a Nur 1 (TINOR), receptor órfão nuclear 1 (NOR-1), receptor relacionado com N0R1 (MINOR), receptor de hormônio Drosophila 38 (DHR-38), receptor nuclear C. elegans 8 (CNR-8), fator esteroidogênico 1 (SF1), peptídeo tipo endozepina (ELP), fator fushi tarazu 1 (FTZ-F1), proteína de ligação adrenal 4 (AD4BP), receptor de fígado homólogo (LH-1), receptor órfão A relacionado com Ftz-Fl (xFFrA), receptor órfão B relacionado com Ftz-Fl (xFFrB), receptor nuclear relacionado com LRH-1 (FFLR), receptor nuclear relacionado com LRH-1 (PHR), fator de transcrição de fetoproteína (FTF), fator nuclear de célula de germe (GCNFM), receptor associado a testículo relacionado com receptor de retinóide (RTR), mandíbula knirps (KNI), mandíbula knirps relacionados (KNRL), gônada Embriônica (EGON), gene Drosophila para receptor nuclear dependente de ligante (EAGLE), receptor nuclear similar ao tritorax (ODR7), Tritorax, gene do cromossomo X de região crítica congênita de hipoplasia adrenal de reversão de sexo sensível à dosagem DAX-1), hipoplasia adrenal congênita e hipogonadismo hipogonadotrópico (AHCH), e parceiro de heterodímero curto (SHP). Para os propósitos desta invenção, os receptores nucleares e receptores nucleares do Grupo H também incluem receptores nucleares sintéticos e quiméricos e receptores nucleares do Grupo H e seus homólogos.

Os genes de interesse para uso nos cassetes de expressão de gene dos Requerentes podem ser genes endógenos ou genes heterólogos A informação de seqüência de ácido nucléico e aminoácido para um gene ou proteína desejada pode estar situada em uma ou muitas bases de dados de acesso publico, por exemplo, GenBANK, EMBL, Swiss-Prot, e PIR ou em muitas publicações de jornais relacionados com biologia. Desta maneira, aqueles versados na técnica tem acesso à informação de seqüência de ácido nucléico para genes conhecidos de forma virtual. Tal informação pode então ser usada para elaborar as construções desejadas para a inserção do gene de interesse dentro do cassete de expressão de gene usado nos métodos dos Requerentes descritos no presente documento.

Os exemplos de genes de interesse para uso nos cassetes de expressão de gene dos Requerentes incluem, mas não limitados a: genes que codifiquem polipeptídeos ou produtos desejáveis de forma terapêutica que podem ser usados para tratar uma condição, uma doença, uma disfunção, um defeito genético, tais como anticorpos monoclonais, enzimas, proteases, citocinas, interferons, insulina, fatores

Ajo de coagulação e outros fatores ou componentes de sangue, vetores virais para terapia de gene,vírus para vacinas, alvos para descoberta de drogas, Genômicas Funcionais e análises e aplicações proteômicas, e similares.

POLINUCLEOTÍDIOS DA INVENÇÃO novo sistema de expressão de gene induzido com base em receptor nuclear da invenção compreende pelo menos um cassete de expressão de gene que compreende um polinucleotídeo que codifica o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende a mutação de substituição. Os referidos cassetes de expressão de gene, os polinucleotídeos que os mesmos compreendem, e os polipeptídeos que os mesmos codificam são úteis como os componentes de um sistema de expressão de gene com base em receptor nuclear para modular a expressão de um gene dentro de uma célula hospedeira.

Assim, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo isolado que codifica um domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição. Os referidos cassetes de expressão de gene, os polinucleotídeos que os mesmos compreendem, e os polipeptídeos que os mesmos codificam são úteis como os componentes de um sistema de expressão de gene com base em receptor nuclear para modular a expressão de um gene dentro de uma célula hospedeira.

Assim, a presente invenção proporciona um polinucleotídeo isolado que codifica um domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma /!Ο1 mutação de substituição.

Em uma modalidade específica, o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H é codificado por um polinucleotídeo que compreende uma mutação de códon que resulta na substituição de um resíduo de amino ácido em uma posição equivalente ou análoga a a) resíduo de amino ácido 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 110, 119, 120, 125, 128,

132, 219, 223, 234, ou 238 of SEQ ID NO: 1, b) resíduos de amino ácidos 96 e 119 de SEQ ID NO.: 1, c) resíduos de amino

ácidos	110 e	s 128	de	SEQ	ID NO . : 1,	d)	resíduos	de	amino
ácidos	52 e	110	de	SEQ	ID NO. : 1,	e)	resíduos	de	amino
ácidos	107,	110 e	127 de	SEQ ID NO. :	1,	ou f) resíduos de
amino	ácidos	52,	107	e 127 de SEQ ID	NO.	. : 1. Em	uma	outra

modalidade, o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H é codificado por um polinucleotídeo que compreende mutações de códon que resultam na substituição de resíduos de amino ácidos em posições equivalentes ou análogas aos resíduos de amino ácidos 107 e 127, e na inserção do amino ácido 259 da SEQ ID NO. : 1. Em uma modalidade preferida, o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H é proveniente de um receptor de ecdisona.

Em uma outra modalidade específica, o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H é codificado por um polinucleotídeo que compreende uma mutação de códon que resulta na substituição de a) um resíduo de asparagina, arginina, tirosina, triptófano, leucina ou lisina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 48 /92 de SEQ ID NO.: 1, b) um resíduo de metionina, asparagina ou leucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 51 de SEQ ID NO.: 1, c) um resíduo de leucina, prolina, metionina, arginina, triptofano, glicina, glutamina ou ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52 de SEQ ID NO.: 1, d) um triptofano ou treonina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 54 de SEQ ID NO. : 1, e) uma leucina ou ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 92 de SEQ ID NO. : 1, f) um resíduo de histidina, metionina ou triptofano em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 95 de SEQ ID NO.: 1, g) um resíduo de leucina, serina, ácido glutâmico ou triptofano em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 96 de SEQ ID NO.: 1, h) um triptofano, prolina, leucina, metionina ou asparagina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 109 de SEQ ID NO. : 1, i) um resíduo de ácido glutâmico, triptofano ou asparagina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 110 de SEQ ID NO. : 1, j) uma fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 119 de SEQ ID NO. : 1, k) um triptofano ou metionina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 120 de SEQ ID NO.: 1, 1) um ácido glutâmico, prolina, leucina, cisteína, triptofano, glicina, isoleucina, asparagina, serina, valina ou arginina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 125 de SEQ ID NO. : 1, m) uma fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao /ο 3 resíduo de amino ácido 128 de SEQ ID NO.: 1, n) uma metionina, asparagina, ácido glutâmico ou valina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 132 de SEQ ID NO.: 1, o) um resíduo de alanina, lisina, triptofano ou tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 219 de SEQ ID NO.: 1, p) um resíduo de lisina, arginina ou tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 223 de SEQ ID NO.: 1, q) uma metionina, arginina, triptofano ou isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 234 de SEQ ID NO. : 1, r) uma prolina, ácido glutâmico, leucina, metionina ou tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 238 de SEQ ID NO.: 1, s) uma fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 119 de SEQ ID NO. : 1, e uma treonina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 96 de SEQ ID NO. : 1, t) uma prolina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 110 de SEQ ID NO. : 1, e uma fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 128 de SEQ ID NO. : 1, u) um resíduo de valina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52 de SEQ ID NO.: 1, e um resíduo de prolina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 110 de SEQ ID NO. : 1, v) uma isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 107 de SEQ ID NO. : 1, um ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 127 de SEQ ID NO. : 1, e uma prolina

100 em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 110 de SEQ ID NO. : 1, ou w) uma isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 107 de SEQ ID NO. : 1, uma ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 127 de SEQ ID NO. : 1, e uma valina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52 de SEQ ID NO. : 1. Em uma outra modalidade, o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H é codificado por um polinucleotídeo que compreende mutações de códon que resultam em substituição de um resíduo de isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 107 de SEQ ID NO.: 1, um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 127 de SEQ ID NO. : 1, e uma inserção de um resíduo de glicina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 259 de SEQ ID NO.: 1. Em uma outra modalidade preferida, o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H é proveniente de um receptor ecdisona.

Em uma outra modalidade específica, o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H compreende uma mutação de substituição codificada por um polinucleotídeo que compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição selecionada a partir do grupo que

consiste em	mutação de	substituição	F48Y,	F48W,	F48L,	F48N,
F48R, F48K,	151M, 151N,	151L, T52M,	T52V,	T52L,	T52E,	T52P,
T52R, T52W,	T52G, T52Q,	M54W, M54T,	M92L,	M92E,	R95H,	R95M,

R95W, V96L, V96W, V96S, V96E, F109W, F109P, F109L, F109M,

Μ

101

F109N,	A110E,	A110N,	A110W,	N119F,	Y120W,	Y120M,	M125P,
M125R,	M125E,	M125L,	M125C,	M125W,	M125G,	M125I,	M125N,
M125S,	M125V,	V128F,	L132M,	L132N,	L132V,	L132E,	M219K,
M219W,	M219Y,	M219A,	L223K,	L223R,	L223Y,	L234M,	L234I,

L234R, L234W, W238P, W238E, W238Y, W238M, W238L, N119F/V96T, V128F/A110P, T52V/A110P, V107I/Y127E/T52V, e V107I/Y127E/ Α110Ρ de SEQ ID NO. : 1. Em uma outra modalidade, o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H compreende uma mutação de substituição codificada por um polinucleotídeo que compreende uma mutação de códon que resulta na mutação de substituição V107I/Y127E da SEQ ID NO. 1, que adicionalmente compreende a mutação de inserção G259 da SEQ ID NO.: 1 (V107I/Y127E/G259).

Em uma outra modalidade específica, o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H compreende uma mutação de substituição é um domínio de ligação de ligante receptor de ecdisona que compreende uma mutação de substituição codificada por um polinucleotídeo que hibridiza a um polinucleotídeo que compreende uma mutação de códon que resulta na mutação de substituição selecionada a partir do grupo que consiste em F48Y, F48W, F48L, F48N, F48R,

F48K,151M, 15 IN, 151L, T52M, T52V, T52L, T52E, T52P, T52R,

T52W, T52G, T52Q, M54W, M54T, M92L, M92E, R95H, R95M, R95W,

V96L, V96W, V96S, V96E, F109W, F109P,	F109L,	F109M,	F109N,
A110E,	A110N,	A110W,	N119F,	Y120W,	Ύ120Μ,	M125P,	M125R,
M125E,	M125L,	M125C,	M125W,	M125G,	M125I,	M125N,	M125S,
M125V,	V128F,	L132M,	L132N,	L132V,	L132E,	M219K,	M219W,
M219Y,	M219A,	L223K,	L223R,	L223Y,	L234M,	L234I,	L234R,

IOC

102

L234W, W238P, W238E, W238Y, W238M, W238L, N119F/V96T, V128F/A110P, T52V/A110P, V107I/Y127E/T52V, e V107I/Y127E/ A110P de SEQ ID NO: 1 sob as condições de hibridização que compreendem a etapa de hibridização que é um sal inferior a 500 nM e pelo menos 37 graus Celsius, e uma etapa de lavagem em 2XSSPE em pelo menos 63 graus Celsius. Em uma modalidade preferida, as condições de hibridização compreendem um sal de menos de 200 nM e pelo menos 37 graus Celsius para a etapa de hibridização. Em uma outra modalidade preferida, as condições de hibridização compreendem 2XSSPE em pelo menos 63 graus Celsius tanto para as etapas de hibridização como de lavagem.

A presente invenção proporciona também um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo selecionado a partir de um grupo que consiste em a) um polipeptídeo que compreende um domínio de transativação, um domínio de ligação a DNA, e um domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição de acordo com a invenção; e c) um polipeptídeo que compreende um domínio de transativação e um domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição de acordo com a presente invenção.

Em uma modalidade específica, o polinucleotídeo isolado codifica um polipeptídeo híbrido selecionado a partir do grupo que consiste em a) um polipeptídeo híbrido que compreende um domínio de transativação, um domínio de ligação a DNA, e um domínio de ligação do ligante receptor

103 nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição de acordo com a invenção; e c) um polipeptídeo híbrido que compreende um domínio de transativação e um domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição de acordo com a presente invenção.

A presente invenção se refere também a um polinucleotídeo isolado que codifica um domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição, onde a mutação de substituição afeta a atividade de ligação do ligante ou a sensibilidade do ligante do domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H.

Em uma outra modalidade específica, a presente invenção se refere a um polinucleotídeo isolado que codifica o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição, onde a mutação de substituição reduz a atividade de ligação diacilidrazina não ecdisteróide ou a sensibilidade diacilidrazina não ecdisteróide do domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H. De forma preferida, o polinucleotídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma substituição de um resíduo de amino ácido em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 120, 125, 219, 223, 234 ou 238 de SEQ ID NO: 1. De forma mais preferida, o polinucleotídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma substituição de a) um resíduo de asparagina em uma posição

104 equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 48 ou 109 de SEQ ID NO. : 1, b) um resíduo de leucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 51, 92, 96 ou 238 de SEQ ID NO.: 1, c) um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52, 92, 96, 125 ou 238 de SEQ ID NO. : 1, d) um resíduo de triptofano em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 54, 95, 96, 120, 219 ou 234 de SEQ ID NO.: 1,

e) um resíduo de metionina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 51, 52, 120, 234 ou 238 de SEQ ID NO.: 1, f) um resíduo de alanina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 219 de SEQ ID NO.: 1; g) um resíduo de lisina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 48, 219 ou 223 de SEQ ID NO.: 1, h) um resíduo de isoleucina, arginina ou triptofano em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 234 de SEQ ID NO. : 1, i) um resíduo de tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 219 ou 238 de SEQ ID NO.: 1, j) um resíduo de valina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 125 de SEQ ID NO. : 1, k) um resíduo de glicina ou glutamina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52 de SEQ ID NO.: 1, ou 1) um resíduo de arginina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52 ou 223 de SEQ ID NO. : 1. De forma ainda mais preferida, o polinucleotídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de F48N, F48K, 151L, 151M, T52E, T52M, T52R, T52G, T52Q,

Μ

105

M54W, M92L, M92E, R95W, V96W, V96E, V96L, F109N, Y120M,

Y120W, M125E, M125V, M219A, M219K, M219W, M219Y, L223K,

L223R, L234M, L234I, L234R, L234W, W238E, W238Y, W238L ou

W238M de SEQ ID NO: 1.

Ademais, a presente invenção se refere também a um polinucleotídeo isolado que codifica o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição, onde a mutação de substituição aumenta a atividade de ligação do ligante ou a sensibilidade do ligante do domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H.

Em uma modalidade específica, a presente invenção se refere a um polinucleotídeo isolado que codifica um domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição, onde a mutação de substituição em geral aumenta a atividade de ligação ecdisteróide ou a sensibilidade ecdisteróide do domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H. De forma preferida, o polinucleotídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de um resíduo de amino ácido em uma posição equivalente ou análoga a a) um resíduo de amino ácido 96 de SEQ ID NO. : 1 ou b) resíduos de amino ácidos 96 e 119 de SEQ ID NO.: 1. De forma preferida, o polinucleotídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma substituição de a) um resíduo de serina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 96 de SEQ ID NO.: 1 ou b) um resíduo de treonina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo 96 de SEQ // D

106

ID NO. : 1 e um resíduo de fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo 119 de SEQ ID NO.: 1. De forma ainda mais preferida, o polinucleotídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de V96T ou N119F/V96T de SEQ ID NO.: 1.

Em uma outra modalidade específica, a presente invenção se refere a um polinucleotídeo isolado que codifica um domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição, onde a mutação de substituição em geral aumenta a atividade de ligação de diacilidrazina não ecdisteróide ou a sensibilidade de diacilidrazina não ecdisteróide do domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H. De forma preferida, o polinucleotídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma substituição de resíduo de amino ácido em uma posição equivalente ou análoga a a) um resíduo de amino ácido 48, 52, 54, 109, 110, 125, 132 ou 223 de SEQ ID NO: 1 ou b) resíduos de amino ácido 52 e 110 de SEQ ID NO.: 1. De forma mais preferida, o polinucleotídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de a) um resíduo de tirosina, triptofano, arginina ou leucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 48 de SEQ ID NO.: 1, b) um resíduo de leucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52 de SEQ ID NO. : 1, c) um resíduo de treonina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 54 de SEQ ID NO.: 1, d) um resíduo de metionina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 109

107 /// de SEQ ID NO.: 1, e) um resíduo de prolina, ácido glutâmico ou asparagina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 110 de SEQ ID NO. : 1, f) um resíduo de isoleucina, asparagina ou glicina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 125 de SEQ ID NO.: 1, g) um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 132 de SEQ ID NO.: 1, h) um resíduo de tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 223 de SEQ ID NO. : 1, ou i) um resíduo de valina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52 de SEQ ID NO.: 1, e um resíduo de prolina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 110 de SEQ ID NO.: 1. De forma ainda mais preferida, o polinucleotídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de F48Y, F48W, F48L, F48R, T52L, M54T, F109M, A110P, A110E, A110N, M125I, M125G, M125N, L132E, L223Y ou T52V/A110P de SEQ ID NO: 1.

Em uma outra modalidade específica, a presente invenção se refere a um polinucleotídeo isolado que codifica um domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição, onde a mutação de substituição em geral aumenta a atividade de ligação de diacilidrazina não ecdisteróide e de tetraidroquinolina não ecdisteróide ou sensibilidade de diacilidrazina não ecdisteróide e tetraidroquinolina não ecdisteróide do domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H. De forma preferida, o polinucleotídeo isolado compreende uma mutação .//2

108 de códon que resulta em uma mutação de substituição de a) resíduos de amino ácido em uma posição equivalente ou análoga aos resíduos de amino ácidos 107 e 127 da SEQ ID NO. : 1 ou b) resíduos de amino ácidos 107, 110 e 127 de SEQ ID NO.: 1. De forma ainda mais preferida, o polinucleotideo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de a) um resíduo de isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 107 de SEQ ID NO. : 1 e um resíduo de ácido glutâmico a uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 127 de SEQ ID NO. : 1 ou b) um resíduo de isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido de SEQ ID NO.: 1, um resíduo de prolina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 110 de SEQ ID NO. : 1 e um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 127 de SEQ ID NO.: 1. De forma mais preferida, o polinucleotideo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de V107I/Y127E ou V107I/Y127E/A110P de SEQ ID NO: 1.

Em uma outra modalidade específica, a presente invenção se refere a um polinucleotideo isolado que codifica um domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição, onde a mutação de substituição em geral aumenta a atividade de ligação de ecdisteróide ou a sensibilidade ecdisteróide e a atividade de ligação diacilidrazina não ecdisteróide ou sensibilidade de diacilidrazina não ecdisteróide do domínio de ligação do

109 hò ligante receptor nuclear de Grupo H. De forma preferida, o polinucleotídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma substituição de um resíduo de amino ácido em uma posição equivalente ou análoga a a) um resíduo de amino ácido 109, 132 ou W238P de SEQ ID NO.: 1, b) resíduos de amino ácido 52, 107 e 127 de SEQ ID NO. : 1, ou c) resíduos de amino ácido 107 e 127 de SEQ ID NO. : 1, e a inserção de amino ácido 259 de SEQ ID NO.: 1. De forma mais preferida, o polinucleotídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de a) um resíduo de triptófano em uma posição equivalente ou análoga resíduo de amino ácido 109 de SEQ ID NO.: 1, b) um resíduo de valina ou metionina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 132 de SEQ ID NO. : 1, c) um resíduo de prolina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 238 de SEQ ID NO.: 1, d) um resíduo de isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 107 de SEQ ID NO. : 1, um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 127 de SEQ ID NO. : 1, e um resíduo de valina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 132 de SEQ ID NO.: 1 ou e) um resíduo de isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 107 de SEQ ID NO. : 1, um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao amino ácido 127 de SEQ ID NO.: 1 e a inserção de um resíduo de glicina em uma posição equivalente ou análoga ao amino ácido 259 de SEQ ID NO.: 1.

De forma ainda mais preferida, o polinucleotídeo isolado //V

110 compreende um códon de mutaçao que resulta em uma mutação de substituição de F109W, L132M, L132V, W238P, V107I/Y127E/T52V ou V107I/Y127E/259G de SEQ ID NO: 1. Em uma outra modalidade, o polinucleotídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de V107I/Y127E de SEQ ID NO.: 1 que adicionalmente compreende a mutação de inserção G259 de SEQ ID NO.: 1 (V107I/Y127E/G259).

Em uma outra modalidade específica, a presente invenção se refere a um polinucleotídeo isolado que codifica um domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição, onde a mutação de substituição em geral aumenta a atividade de ligação de tetraidroquinolina não ecdisteróide ou sensibilidade de tetraidroquinolina não ecdisteróide do domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H. De forma preferida, o polinucleotídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de a) resíduo de amino ácido em uma posição equivalente ou análoga aos resíduos de amino ácidos 110 ou 128 da SEQ ID NO. : 1 ou b) resíduos de amino ácidos 107, e 128 de SEQ ID NO. : 1. De forma ainda mais preferida, o polinucleotídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de a) um resíduo de triptofano em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 110 de SEQ ID NO. : 1, b) um resíduo de fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 128 de SEQ ID NO.: 1, ou c) um resíduo de prolina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 110 de SEQ

111

ID NO.: 1 e um resíduo de fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 128 de SEQ ID NO.: 1. De forma mais preferida, o polinucleotídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de A110W, V128F ou V128F/A110P de SEQ ID NO: 1.

Em uma outra modalidade específica, a presente invenção se refere a um polinucleotídeo isolado que codifica um domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição, onde a mutação de substituição responde de forma diferente aos ligantes diacilidrazina não ecdisteróides. De forma preferida, o polinucleotídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma substituição de um resíduo de amino ácido em uma posição equivalente ou análoga aos resíduos de amino ácidos 52, 95, 109, 125 ou 132 de SEQ ID NO. : 1. De forma mais preferida, o polinucleotídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de a) um resíduo de prolina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52 de SEQ ID NO. : 1, um resíduo de histidina ou metionina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 95 de SEQ ID NO.: 1, c) um resíduo de leucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 109 de SEQ ID NO. : 1, d) um resíduo de leucina, triptofano, arginina, cisteína ou prolina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 125 de SEQ ID NO. : 1 ou e) um resíduo de metionina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo

112 hQ de amino ácido 132 de SEQ ID NO. : 1. De forma ainda mais preferida, o polinucleotídeo isolado compreende um mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição T52P, T52W, R95H, R95M, F109L, M125L, M125W, M125R, M125C, M125P ou L132M de SEQ ID NO: 1.

Em uma outra modalidade específica, a presente invenção se refere a um polinucleotídeo isolado que codifica domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição, onde a mutação de substituição responde de forma diferente aos ligantes diacilidrazina não ecdisteróide. De forma mais preferida, o polinucleotídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma substituição de a) um resíduo de lisina ou arginina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 48 de SEQ ID NO.: 1, b) um resíduo de glicina, glutamina, metionina, arginina ou triptofano em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52 de SEQ ID NO.: 1, c) um resíduo de isoleucina, glicina asparagina, serina ou valina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 125 de SEQ ID NO. : 1, d) um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 132 de SEQ ID NO.: 1, e) um resíduo de lisina, triptofano ou tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 219 de SEQ ID NO. : 1,

f) um resíduo de arginina ou tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 223 de SEQ ID NO.: 1, ou g) um resíduo de leucina ou metionina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 238

113 de SEQ ID NO.: 1. De forma ainda mais preferida, o polinucleotídeo isolado compreende um mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de F48K, F48R, T52G, T52Q, T52M, T52R, T52W, M125I, M125G, M125N, M125S, M125V,

L132E, M219K, M219W, M219Y, L223R, L223Y, W238L ou W238M de

SEQ ID NO: 1.

Adicionalmente, a presente invenção se refere a um vetor de expressão que compreende um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção, operativamente ligado a um elemento de transcrição regulador. De forma preferida, o polinucleotídeo que codifica um domínio de ligação do ligante receptor nuclear que compreende uma mutação de substituição é operativamente ligado com uma seqüência de controle de expressão que permite a expressão de um domínio de ligação do ligante receptor nuclear em célula hospedeira de expressão competente. A seqüência de controle de expressão pode compreender um promotor que é funcional em uma célula hospedeira na qual se deseja a expressão. O vetor pode ser uma molécula de DNA de plasmídeo ou um vetor viral. Vetores virais preferidos incluem os retrovírus, adenovirus, vírus adeno-associados, vírus da herpes, e vírus da vaccinia. A presente invenção se refere adicionalmente ao vírus recombinante de replicação defeituosa que compreende em seu genoma, um polinucleotídeo que codifica um domínio de ligação do ligante receptor nuclear que compreende uma mutação de substituição como acima descrito. Assim, a presente invenção também se refere a uma célula hospedeira isolada que compreende um referido vetor de expressão, onde

114 ο elemento de transcrição regulador é operacional na célula hospedeira.

A presente invenção se refere também a um polipeptídeo isolado codificado por um polinucleotídeo de acordo com a presente invenção.

POLIPEPTÍDEOS DA INVENÇÃO

O novo sistema de expressão de gene induzido com base em receptor nuclear da invenção compreende pelo menos um cassete de expressão de gene que compreende um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo que compreende o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende a mutação de substituição. Assim, a presente invenção proporciona também um polipeptídeo isolado que compreende um domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição de acordo com a presente invenção.

Em uma outra modalidade específica, o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H compreende uma mutação de substituição em uma posição equivalente ou análoga a a) resíduos de amino ácidos 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 110, 119, 120, 125, 128, 132, 219, 223, 234, ou

238 de SEQ ID NO: 1, b) resíduos de amino ácidos 96 e 119 de seqil, c) resíduos de amino ácidos 110 e 128 de SEQ ID NO.:

1, d) resíduos de	amino ácidos 52 e	110	de	SEQ	ID	NO. :	1,	e)
resíduos de amino	ácidos 107, 110 e	127	de	SEQ	ID	NO. :	1,	f)
resíduos de amino	ácidos 52, 107 e	127	de	SEQ	ID	NO. :	1 .	Em

uma outra modalidade, o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H compreende uma mutação de subs115 // /' tituição em uma posição equivalente ou análoga aos resíduos de amino ácidos 107 e 127, e a inserção do amino ácido 259 de SEQ ID NO.: 1. Em uma modalidade preferida, o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H é proveniente de um receptor ecdisona.

De forma preferida, o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H compreende uma substituição de a) um resíduo de asparagina, arginina, tirosina, triptofano, leucina ou lisina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 48 de SEQ ID NO.: 1, b) um resíduo de metionina, asparagina ou leucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 51 de SEQ ID NO.: 1, c) um resíduo de leucina, prolina, metionina, arginina, triptofano, glicina, glutamina ou ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52 de SEQ ID NO.: 1, d) um triptofano ou treonina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 54 de SEQ ID NO. : 1, e) uma leucina ou ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 92 de SEQ ID NO. ·. 1, f) um resíduo de histidina, metionina ou triptofano em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 95 de SEQ ID NO.: 1, g) um resíduo de leucina, serina, ácido glutâmico ou triptofano em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 96 de SEQ ID NO.: 1, h) um triptofano, prolina, leucina, metionina ou asparagina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 109 de SEQ ID NO. : 1, i) um resíduo de ácido glutâmico, triptofano ou asparagina

116 em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 110 de SEQ ID NO.: 1, j) uma fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 119 de SEQ ID NO. : 1, k) um triptófano ou metionina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 120 de SEQ ID NO.: 1, 1) um ácido glutâmico, prolina, leucina, cisteína, triptófano, glicina, isoleucina, asparagina, serina, valina ou arginina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 125 de SEQ ID NO. : 1, m) uma fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 128 de SEQ ID NO. : 1, n) uma metionina, asparagina, ácido glutâmico ou valina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 132 de SEQ ID NO.: 1, o) um resíduo de alanina, lisina, triptófano ou tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 219 de SEQ ID NO. : 1, p) um resíduo de lisina, arginina ou tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 223 de SEQ ID NO.: 1, q) uma metionina, arginina, triptófano ou isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 234 de SEQ ID NO. : 1, r) uma prolina, ácido glutâmico, leucina, metionina ou tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 238 de SEQ ID NO.: 1, s) uma fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 119 de SEQ ID NO. : 1, e uma treonina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 96 de SEQ ID NO.: 1, t) uma prolina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino

117 ácido 110 de SEQ ID NO. : 1, e uma fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 128 de SEQ ID NO. : 1, u) um resíduo de valina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52 de SEQ ID NO.: 1, e um resíduo de prolina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 110 de SEQ ID NO.: 1, v) uma isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 107 de SEQ ID NO. : 1, um ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 127 de SEQ ID NO.: 1, e uma prolina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 110 de SEQ ID NO. : 1, ou w) uma isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 107 de SEQ ID NO.: 1, um ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 127 de SEQ ID NO.: 1, e uma valina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52 de SEQ ID NO. : 1. Em uma outra modalidade, o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H compreende uma substituição de um resíduo de isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 107 de SEQ ID NO. : 1, um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 127 de SEQ ID NO. : 1, e uma inserção de um resíduo de glicina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 259 de SEQ ID NO.: 1. Em uma outra modalidade preferida, o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H é proveniente de um receptor ecdisona.

118

Em uma outra modalidade específica, o domínio de ligação do ligante receptor nuclear de Grupo H compreende uma mutação de substituição é um polipeptídeo de domínio de ligação do ligante receptor ecdisona que compreende uma mutação de substituição, onde a mutação de substituição

selecionada	a partir do	grupo que	consiste em	mutação de
substituição	F48Y, F48W,	F48L, F48N,	F48R, F48K,	151M, 15IN,
151L, T52M,	T52V, T52L,	T52E, T52P,	T52R, T52W,	T52G, T52Q,
M54W, M54T,	M92L, M92E,	R95H, R95M,	R95W, V96L,	V96W, V96S,

V96E,	F109W,	F109P,	F109L,	F109M,	F109N,	A110E,	A110N,
A110W,	N119F,	Y120W,	Y120M,	M125P,	M125R,	M125E,	M125L,
M125C,	M125W,	M125G,	M125I,	M125N,	M125S,	M125V,	V128F,
L132M,	L132N,	L132V,	L132E,	M219K,	M219W,	M219Y,	M219A,
L223K,	L223R,	L223Y,	L234M,	L234I,	L234R,	L234W,	W238P,

W238E, W238Y, W238M, W238L, N119F/V96T, V128F/A110P, T52V/A110P, V107I/Y127E/T52V, e V107I/Y127E/A110P de SEQ ID NO. : 1. Em uma outra modalidade, o domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição é um polipeptídeo de domínio de ligação de ligante receptor de ecdisona que compreende uma mutação de substituição de V107I/Y127E de SEQ ID NO.: 1, que adicionalmente compreende uma mutação de inserção G259 de

SEQ ID NO.: 1 (V107I/Y127E/G259).

A presente invenção proporciona também um polipeptídeo isolado a partir do grupo que consiste em a) um polipeptídeo isolado que compreende um domínio de transativação, um domínio de ligação de DNA, e um domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H que

119

Uò compreende uma mutação de substituição de acordo com a presente invenção; b) um polipeptídeo isolado que compreende um domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição de acordo com a presente invenção; e c) um polipeptídeo isolado que compreende um domínio de transativação, e um domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade preferida, o domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H é proveniente de um receptor ecdisona.

A presente invenção proporciona também um polipeptídeo híbrido isolado selecionado a partir do grupo que consiste em a) um polipeptídeo híbrido isolado que compreende um domínio de transativação, um domínio de ligação a DNA, e um domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição de acordo com a presente invenção; b) um polipeptídeo híbrido isolado que compreende um domínio de ligação a DNA e um domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição de acordo com a presente invenção; e c) um polipeptídeo híbrido isolado que compreende um domínio de transativação e um domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição de acordo com a presente invenção. Em uma modalidade preferida, o domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H é proveniente de um receptor ecdisona.

120

A presente invenção proporciona também um polipeptídeo isolado que compreende um domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H'que compreende uma mutação de substituição que afeta a atividade de ligação do ligante ou a sensibilidade do ligante do domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H.

Em particular, a presente invenção se refere a um polipeptídeo receptor nuclear de Grupo H isolado que compreende um domínio de ligação de ligante que compreende uma mutação de substituição que reduz a atividade de ligação do ligante ou a sensibilidade do ligante do domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H.

Em uma outra modalidade específica, a presente invenção se refere a um polipeptídeo isolado que compreende um domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição que reduz a atividade de ligação de diacilidrazina não ecdisteróide ou a sensibilidade de diacilidrazina não ecdisteróide do domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H. De forma preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma substituição de um resíduo de amino ácido em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 125, 219, 23, 234 ou 238 de SEQ ID NO.: 1. De forma mais preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma substituição de a) um resíduo de asparagina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 48 ou 109 de SEQ ID NO.: 1, b) um resíduo de leucina em uma posição equivalente ou análoga ao

121 resíduo de amino ácido 51, 92, 96 ou 238 de SEQ ID NO.: 1, c) um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52, 92, 96, 125 ou 238 de SEQ ID NO.: 1, d) um resíduo de triptofano em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 54, 95, 96, 120 ou 219 de SEQ ID NO. : 1, e) um resíduo de metionina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido

51, 52, 120, 234 ou 238 de SEQ ID NO.: 1, f) um resíduo de alanina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 219 de SEQ ID NO.: 1, g) um resíduo de lisina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 48, 219 ou 223 de SEQ ID NO. : 1, h) um resíduo de isoleucina, arginina ou triptofano em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 234 de SEQ ID NO. : 1, i) um resíduo de tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 219 ou 238 de SEQ ID NO.: 1, j) um resíduo de arginina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52 ou 233 de SEQ ID NO. : 1, k) um resíduo de valina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 125 de SEQ ID NO.: 1 ou 1) um resíduo de glicina ou glutamina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52 de SEQ ID NO.: 1. De forma ainda mais preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de F48N, F48N, I51L, I51M, T52E, T52M, T52R, T52G, T52Q, M54W, M92L, M92E, R95W, V96W, V96E,

V96L, F109N, Y120M, Y120W, M125E, M125V, M219A, M219K,

M219W, M219Y, L223K, L223R, L234M, L234I, L234W, L234R,

122

W238E, W238L, W238M ou W238Y de SEQ ID NO:. 1.

Ademais, a presente invenção se refere a um polipeptídeo isolado que compreende um domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição que aumenta a atividade de ligação do ligante ou a sensibilidade do ligante do domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H.

Em uma modalidade específica, a presente invenção se refere a um polipeptídeo isolado que compreende um domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição que em geral aumenta a atividade de ligação ecdisteróide ou a sensibilidade ecdisteróide do domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H. De forma preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma substituição de um resíduo de amino ácido em uma posição equivalente ou análoga a a) um resíduo de amino ácido 96 de SEQ ID NO. : 1 ou b) resíduos de amino ácido 96 e 119 de SEQ ID NO.: 1. De forma mais preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma substituição de a) um resíduo de serina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 96 de SEQ ID NO. : 1 ou b) um resíduo de treonina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 96 de SEQ ID NO.: 1 e um resíduo de fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 119 de seqil. De forma ainda mais preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição V96T ou N119F/V96T de SEQ ID NO.: 1.

123 / V!

k/7

Em uma outra modalidade específica, a presente invenção se refere a um polipeptídeo isolado que compreende um domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição que em geral aumenta a atividade de ligação de diacilidrazina ou a sensibilidade de diacilidrazina do domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H. De forma preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma substituição de resíduo de amino ácido em uma posição equivalente ou análoga a) um resíduo de amino ácido 48, 52, 54, 109, 110, 125, 132 ou 223 de seqil ou b) resíduos de amino ácido 52 e 110 de SEQ ID NO.: 1. De forma mais preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma substituição de a) um resíduo de tirosina, triptofano, arginina ou leucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 48 de SEQ ID NO.: 1, b) um resíduo de leucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52 de SEQ ID NO. : 1, d) um resíduo de treonina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 54 de SEQ ID NO.: 1, e) um resíduo de metionina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 109 de SEQ ID NO.: 1, f) um resíduo de prolina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 110 de SEQ ID NO.: 1, g) um resíduo de isoleucina, glicina ou asparagina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 125 de SEQ ID NO.: 1, h) um resíduo de valina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52 de SEQ ID NO. : 1 e um resíduo de prolina em uma

124 posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 110 de SEQ ID NO. : 1, i) um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 132 de SEQ ID NO. : 1, ou j) um resíduo de tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 223 de SEQ ID NO.: 1. De forma ainda mais preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de F48Y, F48W, F48L,

F48R, T52L, M54T, F109M, A110P, A110E, A110N, M125I, M125G,

L132N, L223Y ou T52V/A110P de SEQ ID NO.: 1.

Em uma outra modalidade específica, a presente invenção se refere a um polipeptídeo isolado que compreende um domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição que em geral aumenta tanto a atividade de ligação ecdisteróide ou sensibilidade ecdisteróide como a atividade de ligação de diacilidrazina não ecdisteróide ou a sensibilidade de diacilidrazina não ecdisteróide do domínio de ligação de ligante de Grupo H. De forma preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma substituição no resíduo de amino ácido em uma posição equivalente ou análoga a a) um resíduo de amino ácido 109, 132 ou W238P de SEQ ID NO.: 1, b)

resíduos de amino ácidos 52, 107 e	127	de	SEQ	ID	NO. :	1 ou
c) resíduos de amino ácidos 107 e	127	de	SEQ	ID	NO. :	1, e
uma inserção de amino ácido 259 de	SEQ	ID	NO.	: 1	. De	forma
mais preferida, o polipeptídeo	isolado	compreende	uma

mutação de substituição que resulta em uma substituição de a) um resíduo de triptofano em uma posição equivalente ou

125 /79 análoga ao resíduo de amino ácido 109 de SEQ ID NO.: 1, b) um resíduo de valina ou metionina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 132 de SEQ ID NO.: 1, c) um resíduo de prolina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 23 8 de SEQ ID NO. : 1, d) um resíduo de isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 107 de SEQ ID NO. : 1, um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 12 7 de SEQ ID NO. : 1 e um resíduo de valina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 132 de SEQ ID NO.: 1 ou e) um resíduo de isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 107 de SEQ ID NO.: 1, um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 12 7 de SEQ ID NO. : 1 e uma inserção de um resíduo de glicina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 259 de SEQ ID NO.: 1. De forma ainda mais preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de F109W, L132M, L132V, W238P ou V107I/Y127E/ T52V de SEQ ID NO.: 1. Em uma outra modalidade, o polipeptídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de V107I/Y127E de SEQ ID NO.: 1, que adicionalmente compreende uma mutação de inserção G259 de SEQ ID NO.: 1 9V107I/Y127E/G259).

Em uma outra modalidade específica, a presente invenção se refere a um polipeptídeo isolado que compreende um domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H

126 que compreende uma mutação de substituição, onde a mutação de substituição em geral aumenta a atividade de ligação de diacilidrazina e tetraidroquinolina ou a sensibilidade de diacilidrazina ou tetraidroquinolina do domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H. De forma preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma mutação de substituição que resulta em uma substituição de a) resíduos de amino ácidos em uma posição equivalente ou análoga aos resíduos de amino ácidos 107 e 127 de SEQ ID NO. : 1 ou b) resíduos de amino ácidos 107, 110 e 127 de SEQ ID NO.: 1. De forma mais preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma substituição de a) um resíduo de isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 107 de SEQ ID NO.: 1 e um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 127 de SEQ ID NO.: 1 ou b) um resíduo de isoleucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 107 de SEQ ID NO. : 1, um resíduo de prolina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 110 de SEQ ID NO. : 1 e um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 127 de SEQ ID NO. : 1. De forma ainda mais preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de V107I/Y127E ou V107I/Y127E/A110P de SEQ ID NO.: 1.

Em uma outra modalidade específica, a presente invenção se refere a um polipeptídeo isolado que compreende um domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H

127

que compreende uma mutação de substituição, onde a mutação de substituição em geral aumenta a atividade de ligação de tetraidroquinolina não ecdisteróide ou a sensibilidade de tetraidroquinolina não ecdisteróide do domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H. De forma preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma substituição de amino ácido de a) um resíduo de amino ácido em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 110 ou 128 de SEQ ID NO. : 1 ou b) resíduos de amino ácidos em uma posição equivalente ou análoga aos resíduos de amino ácidos 110 e 128 de SEQ ID NO.: 1. De forma preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma substituição de a) um resíduo de triptofano em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 110 de SEQ ID NO. : 1, b) um resíduo de fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 128 de SEQ ID NO.: 1 ou c) um resíduo de prolina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 110 de SEQ ID NO.: 1 e um resíduo de fenilalanina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 128 de SEQ ID NO.: 1. De forma ainda mais preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta na mutação de substituição A110W, V128F ou V128F/A110P de SEQ ID NO.: 1.

Em uma outra modalidade específica, a presente invenção se refere a um polipeptídeo isolado que compreende um domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H que compreende uma mutação de substituição, onde a mutação

128 /32 de substituição responde de forma diferente a ligantes de diacilidrazina não ecdisteróide. De forma preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma substituição de resíduo de amino ácido em uma posição equivalente ou análoga aos resíduos de amino ácidos 52, 95, 109, 125 ou 132 de SEQ ID NO. : 1. De forma mais preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma substituição de a) um resíduo de prolina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52 de SEQ ID NO. : 1, b) um resíduo de histidina ou metionina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 95 de SEQ ID NO.: 1, c) um resíduo de leucina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 109 de SEQ ID NO.: 1, d) um resíduo de leucina, triptófano, arginina, cisteína ou prolina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 125 de SEQ ID NO. : 1 ou e) um resíduo de metionina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 132 de SEQ ID NO. : 1. De forma ainda mais preferida, De forma mais preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição T52P, R95A, R95M, F109L, M125L, M125W, M125R, M125C, M125P ou L132M de

SEQ ID NO.: 1.

Em uma outra modalidade específica, a presente invenção se refere a um polipeptídeo isolado que compreende um domínio de ligação de ligante receptor nuclear de Grupo H compreendendo uma mutação de substituição, onde a mutação de substituição responde de forma diferente a ligantes diacili/33

129 drazina não ecdisteróide. De forma mais preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma substituição de a) um resíduo de lisina ou arginina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 48 de SEQ ID NO.: 1, b) um resíduo de glicina, glutamina, metionina, arginina ou triptofano em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 52 de SEQ ID NO.: 1, c) um resíduo de isoleucina, glicina, asparagina, serina ou valina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 125 de SEQ ID NO. : 1, d) um resíduo de ácido glutâmico em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 132 de SEQ ID NO.: 1, e) um resíduo de lisina, triptofano ou tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 219 de SEQ ID NO.: 1, f) um resíduo de arginina ou tirosina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 223 de SEQ ID NO. : 1, ou g) um resíduo de leucina ou metionina em uma posição equivalente ou análoga ao resíduo de amino ácido 238 de SEQ ID NO.: 1. De forma ainda mais preferida, o polipeptídeo isolado compreende uma mutação de códon que resulta em uma mutação de substituição de F48K, F48R, T52G,

T52Q, 752M, T52R, T52W, M125I, M125G, M125N, M125S, M125V,

L132E, M219K, M219W, M219Y, L223R, L223Y, W238L ou W238M de

SEQ ID NO.: 1.

A presente invenção se refere também a composições que compreendem um polipeptídeo isolado de acordo com a presente invenção.

130

MÉTODO DE MODULAÇÃO DE EXPRESSÃO DE GENE DA INVENÇÃO

A invenção do requerente também se refere a métodos de modulação de expressão de gene em uma célula hospedeira que utiliza o sistema de modulação de expressão de gene de acordo com a presente invenção. Especificamente, a invenção do requerente proporciona um método de modulação de expressão de um gene em uma célula hospedeira que compreende as etapas de: a) introduzir uma célula hospedeira um sistema de modulação de expressão de gene de acordo com a presente invenção; e b) introduzir na célula hospedeira um ligante; onde o gene a ser modulado é um componente de um cassete de expressão de gene que compreende: i) um elemento de resposta que compreende um domínio reconhecido pelo domínio de ligação de DNA do sistema de expressão de gene; ii) um promotor que é ativado pelo domínio de transativação do sistema de expressão de gene; e iii) um gene cuja expressão deve ser modulada, com o que com a introdução do ligante na célula hospedeira, a expressão do gene é modulada.

A presente invenção proporciona também um método de modulação da expressão de gene em uma célula hospedeira que compreende as etapas de: a) introduzir na célula hospedeira um sistema de modulação de expressão de gene de acordo com a presente invenção; b) introduzir na célula hospedeira um cassete de expressão de gene de acordo com a presente invenção, com o que o cassete de expressão de gene compreende i) um elemento de resposta que compreende um domínio reconhecido pelo domínio de ligação a DNA a partir

6)

131 do sistema de expressão de gene; ii) um promotor que é ativado pelo domínio de transativação do sistema de expressão de gene; e iii) um gene cuja expressão deve ser modulada; e c) introduzir na célula hospedeira um ligante, com o que com a introdução do ligante na célula hospedeira, a expressão do gene é modulada.

A invenção do requerente proporciona também um método de modulação de expressão de gene em uma célula hospedeira que compreende um cassete de expressão de gene que compreende um elemento de resposta que compreende um domínio ao qual o domínio de ligação de DNA proveniente do primeiro polipeptídeo híbrido do sistema de modulação de expressão de gene se liga; um promotor que é ativado pelo domínio de transativação do segundo polipeptídeo híbrido do sistema de modulação de expressão de gene; e um gene cuja expressão deve ser modulada; onde o método compreende as etapas de: a) introduzir na célula hospedeira um sistema de modulação de expressão de gene de acordo com a presente invenção; b) introduzir na célula hospedeira um ligante; com o que a introdução do ligante na célula hospedeira, a expressão do gene é modulada.

Os genes de interesse para a expressão em uma célula hospedeira usando os métodos do requerente podem ser genes endógenos ou genes heterólogos. Informação de seqüência de ácido nucléico ou de amino ácido para um gene ou proteína desejada pode ser localizada em um das muitas bases de dados de acesso público, por exemplo, GENEBANK, EMBL, Swiss-Prot e PIR, ou em diversas das publicações de jornais relacionados

132 /5C a biologia. Assim, aqueles versados na técnica pode então ter acesso às informações de seqüência de ácido nucléico para de fato todos os genes conhecidos. As referidas informações podem então ser usadas para construir os construtores desejados para a inserção do gene de interesse dentro dos cassetes de expressão de gene usados nos métodos do requerente acima descritos.

Exemplos de genes de interesse para a expressão em uma célula hospedeira utilizando os métodos do requerente incluem, mas não são limitados a: antígenos produzidos em plantas como vacinas, enzimas tais como alfa-amilase, fitase, glucanas, xilase e xilanase, genes para a resistência contra insetos, nematódeos, fungos, bactérias, vírus, e tensões abióticas, nutracêuticos, farmacêuticos, vitaminas, genes para a modificação de um teor de amino ácidos, resistência herbicida, tolerância a frio, aridez e calor, produtos industriais, óleos, proteínas, carboidratos, antioxidantes, plantas macho estéreis, flores, combustíveis, outros traços de saída, genes que codificam polipeptídeos terapeuticamente desejáveis que codificam genes ou produtos que podem ser usados para tratar uma condição, uma doença, uma desordem, uma disfunção, um defeito genético, tal como anticorpos monoclonais, enzimas, proteases, citocinas, interferons, insulina, eritropoietina, fatores de coagulação, outros fatores ou componentes sanguíneos, vetores virais para terapia de gene, vírus para vacinas, alvos para descobrimento de drogas, genômicos funcionais e análises proteômicas e aplicações e semelhantes.

133

Ligantes aceitáveis são quaisquer um que modulam a expressão do gene quando se liga ao domínio de ligação de DNA do sistema de expressão de gene de acordo com a presente invenção ao elemento de resposta na presença do ligante, resulta na ativação ou na supressão dos genes. Ligantes preferidos incluem ecdisteróide tal como ecdisona, 20hidroxiecdisona, ponasterona A, muristerona A, e semelhante, ácido 9-cis-retinóico, análogos sintéticos de ácido retinóico, N,N'-diacilidrazinas tais como aquelas descritas nas patentes U.S. Nos. 6.013.836; 5.117.057; 5.530.028; 5.378.726 e pedidos de patentes U.S. Nos. 10/775.883 e 10/787.906; dibenzoilalquil cianoidrazinas tais como aquelas descritas no pedido europeu 461.809; N-alquil-N,N'diaroilidrazinas tais como aquelas descritas na patente U.S. de No. 5.225.443; N-acil-N-alquilcarbonilidrazinas tais como aquelas descritas no Pedido de Patente Européia No. 234.994; N-aroil-N-alquil-N'-aroilidrazinas tais como aquelas descritas na patente U.S. No. 4.985.461; tetraidroquinolinas tais como aquelas descritas No pedido internacional No. PCT/US03/00915; cada uma das quais se encontra aqui incorporada por referência e outros materiais similares incluindo 3,5-di-terc-butil-4-hidroxi-N-isobutil-benzamida, 8-O-acetilarpagida, oxiesterõis, 22(R) hidroxicolesterol, 24 (S) hidroxicolesterol, 25-epoxicolesterol, TO9O1317, 5-alfa-6alfa-epoxicolesterol-3-sulfato (ECHS), 7-cetocolesterol-3sulfato, farnesol, ácidos biliares, ésteres 1,1-bifosfonato, hormônio Juvenil III, e semelhante.

Em uma modalidade preferida, o ligante para uso no

134 /0/ método do requerente de modulação de expressão de gene é um composto de fórmula:

R⁴

Onde:

E é uma alquila (C₄-Ci₂) ramificado ou alquenila (C4-C12) ramificado que contém um carbono terciário ou uma alquil (C3-C12) ciano contendo um carbono terciário;

R¹ é H, Me, Et, i-Pr, F, formila, CF₃, CHF₂, CHC1₂, CH₂F, CH₂C1, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C°CH, 1-propinila, 2propinila, vinila, OH, OMe, OEt, ciclopropil, CF₂CF₃, CH=CHCN, alila, azido, SCN, ou SCHF₂;

R² é H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, formila, CF₃, CHF₂, CHC1₂, CH₂F, CH₂C1, CH₂OH, CH₂OMe, CH₂CN, CN, C°CH, 1propinila, 2-propinila, vinila, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, On-Pr, OAc, NMe₂, NEt₂, SMe, SEt, SOCF₃, OCF₂CF₂H, COEt, ciclopropila, CF₂CF₃, CH=CHCN, alila, azido, OCF₃, OCHF₂, Oi-Pr, SCN, SCHF₂, SOMe, NH-CN, ou ligado com R³ e os carbonos fenila aos quais R² e R³ são ligados para formar um etilenodióxi, um anel diidrofurila com o oxigênio adjacente ao carbono fenila, ou um anel diidropirila com o oxigênio adjacente ao carbono fenila;

R³ é H, Et, ou unido com R² e os carbonos fenila aos quais R² e R³ são ligados para formar um etilenodióxi, um anel diidrofurila com o oxigênio adjacente ao carbono fenila, ou um anel diidropropila, com o oxigênio adjacente

135

ao carbono fenila;

R⁴, R⁵, e R⁶ são independentemente H, Me, Et, F,

Cl, Br, formila, CF₃, CHF₂, CHC1₂, CH₂F, CH₂C1, CH₂OH, CN, C°CH, 1-propinila, 2-propinila, vinila, OMe, OEt, SMe, ou

Set.

Em uma outra modalidade preferida, o ligante para emprego no método do Depositante, de modulação da expressão genética é um composto de fórmula:

onde:

	RI	R2	R3	R4
1	-CH2CH3	-och3	-ch3	-ch3
2	-ch3	-ch2ch3	-ch3	-ch3
3	-ch3	-i-Pr	-ch3	-ch3

Em uma outra modalidade preferida o ligante para emprego no método do Depositante de modulação da expressão genética é um composto de fórmula:

R2

136 onde :

	RI	R2	R3	R4	R5	R6	E
1	-CH2CH3	-OCH2CH2O	-och3	-ch3	-och3	-CH(CH2CH3) tBu
2	H	H	-CH2CH3	-ch3	H	-ch3	-CH(nBu)tBu
3	-CH2CH3	-OCH2CH2O	-och3	-ch3	-och3	-CH(tBu) CH=C (CH3) tBu

Numa modalidade preferida adicional, o ligante para emprego no método do Depositante de modulação da expressão genética e um composto de fórmula:

onde:

	RI	R2	R3
1	F	F	3-F-4-CH3-Ph-
2	F	F	3-CH3-4-F-Ph

Em uma outra modalidade preferida o ligante para emprego no método do Depositante de modulação da expressão genética é um ecdisona, 20-hidroxiedcisona, ponasterona A, muristerona A, um oxiesterol, um 22(R)hidroxicolesterol,

24(S) hidroxicolesterol, 25-epoxicolesterol, T0901317, 5alfa-6-alfa 3-sulfato de epoxicolesterol (ECHS), 3-sulfato de 7-cetocolesterol, farmesol, ácidos da bile, ésteres de 1,1-bifosfonato ou hormônio III juvenil

137 eh

Em uma outra modalidade preferida um segundo ligante pode ser empregado além do primeiro ligante acima exposto η o método do Depositante de modulação da expressão genética. Preferivelmente, este segundo ligante é ácido 9cis-retinóico ou um análogo sintético do ácido retinóico.

CÉLULAS HOSPEDEIRAS E ORGANISMOS NÃO HUMANOS DA INVENÇÃO

Como acima descrito, o sistema de modulação da expressão genética da presente invenção pode ser empregado para modular a expressão genética numa célula hospedeira. A expressão em células hospedeiras transgênicas pode ser útil para expressão de vários genes de interesse. A invenção do Depositante propicia a modulação da expressão genética em células hospedeiras procarióticas e eucarióticas. A expressão em células hospedeiras transgênicas é de utilidade para expressão de vários polipeptídeos de interesse, incluindo sem limitação a antígenos produzidos nas plantas como vacinas, alfa-amilase similar a enzimas, fitase, glucanos, xilase e xilanase, genes para resistência contra insetos, nematódeos, fungos, bactérias, vírus e estresses abióticos, antígenos, nutracêuticos, farmacêuticos, vitaminas, genes para modificar o teor de aminoácido, resistência à herbicidas, frio, seca, e tolerância térmica, produtos industriais, óleos, proteínas, carboidratos, antioxidantes, plantas estéreis masculinas, flores, combustíveis outros traços peculiares de produção, polipeptídeos terapêuticos, intermediários de trajeto; para a modulação dos passos já existentes no hospedeiro para a síntese de novos produtos, até o presente, sem possibilidade de uso do hospedeiro,

138 ensaios à base de célula ensaios genômicos funcionais, produção de proteína bioterapêutica, ensaios, proteômicos, e similar. Adicionalmente, os produtos genéticos podem ser úteis para conferir maiores rendimentos de desenvolvimento do hospedeiro ou para permitir a utilização de um modo de crescimento alternativo.

Assim, a invenção do Depositante propicia uma célula hospedeira isolada compreendendo um sistema de expressão genética de acordo com a invenção. A presente invenção também proporciona uma célula hospedeira isolada compreendendo um cassete de expressão genética de acordo com a invenção. A invenção do Depositante também proporciona uma célula hospedeira isolada compreendendo um polipeptídeo ou um polipeptídeo de acordo com a invenção. A presente invenção também se refere a uma célula hospedeira transfectada com um vetor de expressão de acordo com a invenção. A célula hospedeira pode ser uma célula bacteriana, uma célula de fungo, uma célula de nematódeo, uma célula de inserto, uma célula de peixe, uma célula de planta, uma célula de avícola, uma célula de animal, ou uma célula de mamífero. Em ainda uma outra modalidade, a invenção refere-se a um método para produzir um domínio de ligação ao ligante do receptor nuclear compreendendo uma mutação de substituição, onde o método compreende a cultura da célula hospedeira conforme descrito supra em meio de cultura sob condições que permitem a expressão de um polinucleotídeo codificando o domínio de ligação ao ligante do receptor nuclear compreendendo uma mutação de substituição, e isolar o domínio de ligação ao

139

ligante do receptor nuclear compreendendo uma mutação de substituição da cultura.

Numa modalidade específica, a célula hospedeira isolada é uma célula hospedeira procariótica ou uma célula hospedeira eucariótica. Numa outra modalidade, a célula hospedeira isolada, é uma célula hospedeira de invertebrado, ou uma célula hospedeira de vertebrado. Preferivelmente, a célula hospedeira é selecionada do grupo consistindo de uma célula bacteriana, uma célula de fungo, uma célula de levedura, uma célula de nematódeo, uma célula de inseto, uma célula de peixe, uma célula de planta, uma célula de avícola, uma célula de animal, e uma célula de mamífero. Mais preferivelmente, a célula hospedeira é uma célula de levedura, uma célula de nematódeo, uma célula de inseto, uma célula de planta, ima célula de feixe zebra, uma célula de galinha, uma célula de hamster, uma célula de camundongo, uma célula de rato, uma célula de coelho, uma célula de gato, uma célula de cão, uma célula de boi, uma célula de cabra, uma célula de vaca, uma célula de porco, uma célula de cavalo, uma célula de ovelha, uma célula de símio, uma célula de macaco, uma célula de chimpanzé, ou uma célula humana. Exemplos de células hospedeiras preferidas incluem, sem limitação, a células de fungo ou de levedura, tais como Aspergillus, Trichoderma, Saccharomyces, Pichia, Cândida, Hansenula, ou espécies bacterianas tais como as dos gêneros Synechocystis, Synechococcus, Salmonella, Bacillus, Acinetohacter, Rhodococcus, Spreptomyces, Escherichia, pseudomonas, Methylomonas, Methylohacter, Alcaligenes,

140 w

Synechocystis, Anabaena, Thiobacillus, Methanobacterium e Klebsiella; espécies de planta selecionadas do grupo consistindo de uma maçã, Arabidopsis, (bajra), banana, cevada, feijão, beterraba, broto de feijão, grão-de-bico, pimenta, pepino, berinj.ela, vagem, milho, melão, painço, brotos de feijão, aveia, quiabo, Panicum, papaia, amendoim, ervilha, pimentão, (ervilha-de-pombo), abacaxi, Phaseolus, batata, abóbora, arroz, sorgo, soja, abóbora, cana-deaçúcar, beterraba, girassol, batata doce, chá, tomate, tabaco, melancia, e trigo; animal; e células hospedeiras de mamíferos.

Numa modalidade específica, a célula hospedeira é uma célula de levedura selecionada do grupo consistindo de uma célula hospedeira de Saccaromyces, de Pichia e Cândida.

Numa outra modalidade especifica, a célula hospedeira é uma célula de nematódeo, Caenorhabdus elegans.

Numa outra modalidade, específica a célula hospedeira é uma célula de inserto.

Numa outra modalidade específica, a célula hospedeira é uma célula de planta selecionada do grupo consistindo de Arabidopsis, (bajra), banana, cevada, feijão, beterraba, broto de feijão, grão-de-bico, pimenta, pepino, berinjela, vagem, milho, melão, painço, broto de feijão, aveia, quiabo, Panicum, papaia, amendoim, ervilha, pimentão, (ervilha-depombo) , abacaxi, Phaseolus, batata, abóbora, arroz, sorgo, soja, abóbora, cana-de-açúcar, beterraba, girassol, batata doce, chã, tomate, tabaco, melancia, e célula de trigo.

141

Numa outra modalidade específica a célula hospedeira é uma célula de peixe-zebra.

Numa outra modalidade específica, a célula hospedeira e uma célula de galinha.

Numa outra modalidade a célula, hospedeira é uma célula de mamífero selecionada do grupo consistindo de uma célula de uma célula de hamster, uma célula de camundongo, uma célula de rato, uma célula de coelho, uma célula de gato, uma célula de cão, uma célula de boi, uma célula de cabra, uma célula de vaca, uma célula de porco, uma célula de cavalo, uma célula de ovelha, uma célula de símio, uma célula de macaco, uma célula de chimpanzé, e uma célula humana.

A transformação da célula hospedeira é bem conhecida na técnica e pode ser conseguida por uma série de métodos incluindo, sem limitação, a eletroporação, infecção viral, transfecção plasmídeo/vetor, transfecção mediada por vetor não viral, transformação mediada por Agrobacterium, bombardeamento de partícula, e similar. A expressão dos desejados produtos genéticos, envolve a cultura das células hospedeiras transformada sob condições adequadas e indução da expressão do gene transformado. Condições de cultura e protocolos de expressão genética em células procariontes e eucariontes são do conhecimento da técnica (ver Métodos Gerais parágrafo dos Exemplos). As células podem ser coletadas e os produtos genéticos isolados de acordo com protocolos específicos para o produto genético.

142

NC

Alem disso, uma célula hospedeira pode ser escolhida, para modular a expressão do polinucleotídeo inserido, ou modificar e processar o produto de polipeptídeo num modo específico desejado.

Diferentes células hospedeiras têm características e mecanismos específicos para processamento e modificação traducional e pós-traducional (por exemplo, glicosilação, divagem, (por exemplo, uma seqüência de sinal) de proteínas. Linhas de célula adequadas ou sistemas hospedeiros podem ser escolhidos para garantir a modificação e processamento desejados da proteína estranha expressada. Por exemplo, a expressão num sistema bacteriano pode ser empregada para produzir um produto de proteína de núcleo não glicosilado. Contudo, um polipeptídeo expressado numa bactéria pode não ser adequadamente dobrado. A expressão em levedura pode produzir um produto glicosilado. A expressão em células eucarióticas pode aumentar a probabilidade da glicosilação nativa e dobragem de uma proteína heteróloga.

Além disso, a expressão em células de mamífero pode providenciar uma ferramenta para reconstituição ou constituição da atividade polipetídica. Além disso, diferentes sistemas de expressão vetor/hospedeiro pode afetar reações de processamento tais como clivagens proteolíticas, a uma diferente extensão.

A invenção do depositante também se refere a um organismo não humano compreendendo uma célula hospedeira isolada de acordo com a invenção. Numa modalidade específica o organismo não humano é um organismo procariótico ou um

143 organismo eucariótico. Numa outra modalidade específica, o organismo não humano é um organismo de invertebrado ou um organismo de vertebrado.

Preferivelmente, o organismo não humano é selecionado do grupo consistindo de uma bactéria, um fungo, uma levedura, um nematódeo, um inseto, um peixe, uma planta, um pássaro, um animal, e um mamífero. Mais preferivelmente, o organismo não humano é uma levedura, um nematódeo, um inseto, uma planta, um peixe-zebra, uma alinha, um hamster, um camundongo, um rato, um coelho, um gato, um cão, um boi, uma cabra, uma vaca, um porco, um cavalo, uma ovelha, um macaco ou um chimpanzé.

Numa modalidade específica o organismo não humano é uma levedura selecionada do grupo consistindo de Saccharomyces, Pichia e Candida.

Numa outra modalidade específica, o organismo não humano, é um nematódeo de Caenorhabdus elegans.

Numa outra modalidade específica, o organismo não humano é uma planta selecionados do grupo consistindo de uma maçã, Arabidopsis, (bajra), banana, cevada, feijão, beterraba, broto de feijão, grão-de-bico, pimenta, pepino, berinjela, favas, milho, melão, painço, brotos de feijão, aveia, quiabo, Panicum, papaia, amendoim, ervilha, pimentão, (ervilha-de-pombo), abacaxi, Phaseolus, batata, abóbora, arroz, sorgo, soja, abóbora, cana-de-açúcar, beterraba, girassol, batata doce, chá, tomate, tabaco, melancia, e trigo;

144

Numa outra modalidade específica o organismo não humano é um camundongo Mus musculus.

MEDIÇÃO DA EXPRESSÃO/TRANSCRIÇÃO GENÉTICA

Uma medição útil do método do Depositante da invenção trata-se do estado transcricional do estado da célula, incluindo a identidade e abundancia de RNA, preferivelmente espécies mRNA. Tais medições são convenientemente realizadas, medindo-se o conteúdo de cDNA por meio de quaisquer tecnologias de expressão genéticas existentes.

Tecnologia de arranjo de ácido nucléico é uma técnica útil para determinar a expressa de mRNa diferencial. Tal tecnologia inclui, por exemplo, chips de oligonucleotídeo e microarranjo de DNA. Essas técnicas se valem de fragmentos de DNA ou oligonucleotídeos que correspondem a diferentes genes ou cDNAs que são imobilizados num suporte sólido e hibridizados em sondas preparadas de grupamento de mRNa total extraídos das células tecidos ou organismos totais e convertidos em cDNA. Chips de oligonucleotídeo são arranjos de oligonucleotídeos sintetizados num substrato usando técnicas fotolitográficas. Chips foram produzidos para analisar até 1700 genes. Microarranj os de DNA são arranjos de amostras de DNA, tipicamente produtos da PCR que são impressos por robotização numa lamina de microscópio. Cada gene é analisado por uma seqüência de dNa alvo de comprimento total ou parcial. Microarranjos com até 10.000 genes são agora rotineiramente preparados comercialmente. A diferença primária entre essas duas técnicas reside no fato de que os chips de oligonucleotídeo utilizam tipicamente,

145

Ah oligonucleotídeo de 25-mer, que permitem fracionamento de moléculas de DNA curtas, enquanto os alvos de microarranjos de DNA maiores, de aproximadamente 1000 pares de base, podem proporcionar mais sensibilidade no fracionamento de misturas de DNA complexas.

Uma outra medida útil do método do Depositante da invenção, trata-se de determinar o estado de tradução da célula medindo-se a abundancia de espécies protéicas constituintes, presentes na célula, usando processos do conhecimento da técnica.

Onde a identificação dos genes associada com várias funções fisiológicas for desejada, pode-se empregar um ensaio, em que sal medidas as alterações em funções tais como crescimento celular, apoptose, senescência, diferenciação, adesão, ligação moléculas específicas, ligação a uma outra célula, organização celular, organogênese, transporte intracelular, facilitação de transporte, conversão de energia, metabolismo, miogênese, neurogênese, e/ou hematopoese.

Além disso, o marcador selecionável ou expressão do gene reporte podem ser usados para medir a modulação da expressão genética usando a invenção do Depositante.

Outros métodos para detectar os produtos da expressão genética são do conhecimento da técnica e incluem Southern blots (detecção de DNA), manchamento por ponto ou ranhura (DNA, RNA), northern blots (RNA, RT-PCR (RNA), western blots detecção de polipeptídeo) e análises de (polipeptídeo) ELISA). Embora seja menos preferido, proteínas

146 rotuladas podem ser empregadas para detectar uma dada seqüência de ácido nucléico para a qual, elas hibridizam.

Em alguns casos, faz-se necessário ampliar a quantidade de uma seqüência de ácido nucléico. Isto pode ser

5. realizado usando um ou mais de uma série de métodos adequados, incluindo, por exemplo, reação em cadeia da polimerase (PCR), reação em cadeia de ligase (LCR), amplificação de deslocamento de fita (SDA), amplificação à base de transcrição, e similar. PCR é realizado de acordo com técnicas conhecidas em que, por exemplo, uma amostra de ácido nucléico é tratada na presença de uma polimerase de DNA estável ao calor, sob condições de hibridização, com um par de primes de oligonucleotídeo, sendo que um iniciador hibridiza para uma fita (matriz) da seqüência específica para detecção. Os iniciadores são suficientemente complementares para cada fita da matriz da seqüência especifica para hibridizar com ela. Um produto de extensão de cada iniciador é sintetizado e é complementar à fita da matiz de ácido nucléico para a qual ele hibridiza. O produto de extensão sintetizada de cada iniciador também pode se prestar como uma matriz para a síntese ulterior de produtos de extensão usando os mesmos iniciadores. Seguinte a um número suficiente de turnos de síntese dos produtos de extensão, a amostra pode ser analisada conforme descrito acima, a fim de avaliar se a seqüência ou seqüências para detecção estão presentes.

147 /S7

ENSAIOS DE SELEÇÃO DO LIGANTE

A presente invenção também é pertinente a métodos de seleção para um composto que induz ou reprime a transativação de um domínio de ligação ao ligante do receptor nuclear, compreendendo uma mutação de substituição numa célula mediante contato de um domínio de ligação ao ligante do receptor nuclear com uma molécula candidato e detectar a atividade do gene repórter na presença do ligante. Compostos candidatos podem ser ou agonistas ou antagonistas do domínio de ligação ao ligante do receptor nuclear. Numa modalidade preferida, o domínio de ligação ao ligante do receptor nuclear é expressão de um polinucleotídeo na célula e a atividade de transativação (ou seja, expressão ou repressão de um gene reporte) ou atividade de ligação ao compreendendo é medida.

Portanto, além do desenho racional de agonistas e antagonistas baseados na estrutura de um domínio de ligação ao ligante do receptor nuclear, a presente invenção considera um método alternativo para identificação de ligantes específicos de um domínio de ligação ao ligante do receptor nuclear usando vários ensaios de seleção do conhecimento da técnica.

Qualquer técnica de seleção conhecida pode ser usada para selecionar agonistas ou antagonistas de domínio de ligação ao ligante do receptor nuclear do Grupo H. Por exemplo, uma linha de célula adequada compreendendo um sistema de expressão de gene com base no receptor nuclear, de acordo com a invenção pode ser transfectada com um

148 cassete de expressão genético codificando um gene marcador, operativamente ligado a um promotor indutor ou repressor. As células transfectadas são então, expostas a uma solução de teste, compreendendo um composto agonista ou antagonista candidato, e a seguir ensaiadas para expressão ou repressão do gene marcador. A presença de mais expressão do gene marcador em relação às células de controle não expostas à solução de testes é uma indicação da presença de um composto agonista na solução de teste. De modo inverso, a presença de menos expressão do gene marcador em relação a células de controle, não expostas à solução de teste, é uma indicação da presença de um composto antagonista na solução de teste.

A presente invenção considera seleções para ligantes de molécula pequena ou análogos de ligante e imitadores, bem como seleções para ligantes naturais que ligam-se, e agonizam ou antagonizam um domínio de ligação ao ligante do receptor nuclear do Grupo H de acordo com a invenção in vivo. Por exemplo, bibliotecas de produtos naturais podem ser selecionadas com o uso de ensaios da invenção para moléculas que agonizam ou antagonizam a atividade do sistema de expressão genética com base no receptor nuclear.

A identificação e seleção de antagonistas é ainda facilitada por determinação de aspectos característicos estruturais da proteína, por exemplo, usando cristalografia de raios-X, difração de nêutrons, espectrometria de ressonância magnética nuclear, e outras técnicas para determinação estrutural. Essas técnicas proporcionam o desenho razoável ou identificação dos agonistas e antagonistas.

149 /35

Uma outra abordagem utiliza bacteriófago recombinante para produzir grandes bibliotecas. Usando o método fago (Scott and Smith, 1990 Science 249:386-390 (1990);

Cwirla, et al., Proc, Natl. Acad. Sci, 87: 6378-6382 (1990);

Devlin et al., Science 249:404-406 (1990)', podem ser construídas bibliotecas muito grandes (entidades químicas de 10⁶-10⁸) . Uma segunda abordagem utiliza, principalmente, métodos químicos, dos quais o método Geysen (Geysen et al. , Molecular Immunology 23:709-715 (1986); Geysen et al., J.

Immunologic Method 102:259-274 (1987) e o método de Fodor et al. , {Science 251: 767-773 (1991) são exemplos. Furka et al., (14° International Congress of Biochemistry, Volume 5,

Abstract FR:013 (1988); Jurka, Int. J. Peptide Protein Res.

37:487-493 (1991)], Houghton [Patente U.S. n° 4.631.211, concedida em dezembro/1986] e Rutter et al. , [Patente U.S. n° 5.010.175, concedida em 23 de abril de 1991] descreve me'todos para produzir uma mistura de peptídeos, que podem ser testados como agonistas ou antagonistas.

Em um outro aspecto, bibliotecas sintéticas [Needels et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90:10700-4 (1993):

Ohlmeyer et al. , Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 10922-10926 (1993); Lam et al., International Patent Publication N° WO 92/00252; Kocis et al. , International Patent Publication n° WO 9428028, cada um dos quais estando ora incorporado por referencia ao presente, em sua totalidade], e similares, podem ser usados para selecionar ligantes candidatos de acordo com a presente invenção.

150 /W

A seleção pode ser realizada com células recombinantes que expressam um domínio de ligação ao ligante do receptor nuclear de acordo com a invenção, ou alternativamente, usando proteínas purificadas, por exemplo, produzidas recombinantemente, como descrito supra. Por exemplo, domínios de ligação ao ligante do receptor nuclear solúvel, rotulados, podem ser usados para selecionar bibliotecas, como descrito nas referências precedentes.

Em uma modalidade, um domínio de ligação ao ligante do receptor nuclear do Grupo H de acordo com a invenção pode ser diretamente rotulado. Em uma outra modalidade, um reagente secundário rotulado pode ser empregado para detectar a ligação de um domínio de ligação ao ligante do receptor nuclear da invenção a uma molécula de interesse, por exemplo, uma molécula ligada a um suporte de fase sólida. A ligação pode ser detectada por formação in si tu de um cromóforo por um rótulo enzimãtico. Enzimas adequadas incluem, sem limitação, fosfatase alcalina, e peroxidase de rábano de cavalo. Numa modalidade adicional, um ensaio de duas cores usando dois substratos cromogênicos com dois rótulos enzimáticos em diferentes moléculas do receptor de interesse, pode ser empregado. Ligantes de reação cruzada e de reação simples podem ser identificados com um ensaio bicolor.

Outros rótulos para uso na invenção incluem contas de látex colorido, contas magnéticas, rótulos fluorescentes (por exemplo, isotiocianato de fluoresceno (FITC), ficoeritrina (PE) Texas vermelho (TR), rodamina, sais da série dos

151 /sr lantanídeos livres ou quelados, especialmente Eu⁺⁺⁺, para nomear uns poucos fluoróforos), moléculas quimiluminescentes, radioisótopos, ou rótulos de imageamento de ressonância magnética. Ensaios bicolores podem ser realizados com duas ou mais contas de látex colorido, ou fluoróforos que emitem em diferentes comprimentos de onda. Moléculas rotulada sou células podem ser detectadas visualmente ou por meios mecânicos/ópticos. Meios mecânicos/ópticos incluem sortimento fluorescente ativado, ou seja análogos de FACS, e meios de remoção por micromanipulador.

A presente invenção pode ser melhor entendida por referência aos Exemplos não limitantes a seguir, que são providos para exemplificar a invenção.

EXEMPLOS

Os depositantes desenvolveram um modelo com homologia a CfEcR e usaram este modelo de homologia, juntamente com um modelo de homologia (CtEcR) ao receptor ecdisona de Chironomous tetans (Wurtz et al., 2000) para identificar resíduos críticos envolvidos na ligação a ecdiesteróides e não ecdiesteróides. As diacilidrazinas sintéticas não esteróides, demonstraram ligar EcRs de lepidópteros com alta afinidade e induzir muda precoce incompleta nesses insetos (Wing et al. , 1988) e vários desses compostos são atualmente comercializados como inseticidas. A cavidade de ligação ao ligante de EcRs evoluiu para adequar-se a longas estruturas de cadeia central de ecdiesteróides tais como 20E. As diacilidrazinas têm uma estrutura compacta comparado a ecdiesteróides e ocupam

152 /2Q apenas a parte de fundo do bolso de ligação a EcR. Isto deixa uns poucos resíduos críticos no topo do bolso de ligação que faz contato com ecdiesteróides, mas não com não ecdiesteróides, tais como diacilidrazinas. Os Depositantes fizeram mutações de substituição dos resíduos que fazem contato com ecdiesteróides e/ou não ecdiesteróides e determinaram o efeito mutacional na ligação ao ligante. Os Depositantes descrevem aqui, mutações de substituição em vários desses resíduos e identificaram várias classes de receptores mutantes de substituição com base em sua ligação e características de transativação. Polinucleotídeos e polipeptídeos novos do receptor nuclear que passaram por mutação de substituição do Depositante são úteis num sistema de modulação genética indutivo com base no receptor nuclear para várias aplicações, incluindo terapia genética, expressão de proteínas de interesse em células hospedeiras, produção de organismos transgênicos e ensaios com base em células.

MÉTODOS GERAIS

DNA recombinante padrão e técnicas de clonagem molecular aqui empregados são do conhecimento da técnica e estão descritos por Sambrook, J. Fritsch, E.F. e Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, N.Y (1989) (Maniatis) e por T.J. Silhavy, M.L. Benna, e L. W. Enquist. Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y (1984) e por Ausubel, F. M. et al. , Current Protocols in Molecular Biology Greene Publishing Assoe e Wiley-Interscience (1987).

153 /Q

Materiais e métodos adequados para manutenção e crescimento de culturas bacterianas são do conhecimento da técnica. Técnicas adequadas para emprego nos exemplos a seguir, podem ser encontrados em Manual of Methods for General Baceriology (Phillipp Gerhardt, R.G. E. Murray, Ralph N. Costilow, Eugene W. Nester, Willis A. Wood, Noel R. Krieg and G. Briggs, Phillips, eds), American Society for Microbiology, Washington, DC. (1994)) ou por Thomas D. Brock em Biotechnology: Ά Texbook of Industrial Microbiology, Segunda Edição, Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA (1989). Todos os reagentes, enzimas de restrição e materiais empregados para o crescimento e manutenção das células hospedeiras foram obtidos de Aldrich Chemicals (Milwaukee WI) DIFCO Laboratories (Detroit, MI), GIBCO/BRL (Gaithersburg, MD) ou Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) a menos que de outro modo especificado.

A manipulação das seqüências genéticas pode ser realizada usando o quadro de programas disponível de Genetics Computer Group Inc. (Wisconsin Package versão 9.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison WI). Onde for usado o programa GCG Pileup o valor de default de criação de folga 12, e o valor de default de extensão de folga de 4 pode ser empregado. Onde for usado o programa CGC Gap ou Bestfit a penalidade de criação de gap de default de 5 0 e a penalidade de extensão de folga de default de 3 pode ser empregado. Em qualquer caso, onde os parâmetros de programa GCG não estão prontos, nesses ou em qualquer outro programa

GCG, podem ser usados os valores de default.

154 /S5

O significado das abreviações é como a seguir: h significa hora(s), min significa minuto(s), sec significa segundo(s), d significa dia(s), gL significa microlitro(s), mL significa mililitro(s), L significa litro (s), μΜ significa micromolar, mM milimolar, ''gg significa micrograma(s), mg miligrama(s), A significa adenina ou adenosina, T significa timina ou timidina, G significa guanina ou significa significa guanosina, significa citidina ou citosina, x significa gravidade em X, nt significa nucleotídeo(s), aa significa aminoácido(s), bpsignifica par(es) de base, kb significa quilobase(s), k significa quilo, μ significa micro, e °C significa graus Celsius.

EXEMPLO 1

Este Exemplo descreve a construção de vários cassetes de expressão genética compreendendo novos polinucleotídeos e polipeptídeo do receptor nuclear do Grupo H de mutação por substituição da invenção para emprego num sistema de expressão genética indutor com base no receptor nuclear. Os Depositantes construíram cassetes de expressão genética com base num rebento de abeto (gênero Abies) Choristoneura fumiferana EcR (CfEcR). Os construtores do receptor preparado compreendem um domínio de ligação ao ligante de, ou um EcR ou uma quimera de Homo sapiens RXRP~ LmRXR; e um domínio de ligação a DNA de GAL4 (DBD) ou um domínio de transativação a VP16 (AD). Os construtores repórter incluem o gene repórter luciferase operativamente ligado a um construtor do promotor sintético, compreendendo

155 /69 um elemento de resposta a GAL4 para o qual o DBD de Gal4 se liga. Varias combinações desses receptores e construtores reportes foram co-transfectados em células de mamífero conforme descrito nos Exemplos 2-5 infra.

Cassetes de Expressão Genética:

Cassetes de expressão genética com base no receptor ecdisona (desvios) foram construídos como a seguir, usando métodos de clonagem padrão disponíveis na técnica. A seguir tem-se uma descrição resumida da preparação e composição de cada desvio usado nos Exemplos aqui descritos.

1.1- GAL4CfEcR-DEF/VP16-pRXREF-LmRXREF: Os domínios D, E e F do tipo selvagem de rebento de abeto Choristoneura fumiferana EcR (CfEcR-DEF; SEQ ID NO: 21) foram fundidos ao domínio de ligação de DNA de GAL4 (Gal4DNABD ou Gal4DBD; SEQ ID NO: 6) e colocados sob controle de um promotor de CMV (SEQ ID NO: 2) . Hélices 1 até 8 dos domínios EF de Homo sapiens RXRp (HsRXRP-Ef, nucleotídeos 1-465 da SEQ ID NO: 3) e hélices 9 até 12 dos domínios EF de Locusta migratória Proteína Ultraspiracle (LmRXR-EF; nucleotídeos 403-630 da SEQ ID NO: 23) foram fundidos ao domínio de transativação de VP16 (VP16AD, SEQ ID NO: 12) e colocados sob o controle de um promotor SV40e (SEQ ID NO: 22) . Cinco sítios de ligação ao elemento de resposta GAL4 de consenso (5XGAL4RE , compreendendo 5 cópias de um GAL4RE compreendendo a SEQ ID NO: 19) foram fundidos a um promotor mínimo de TATA sintético (SEQ ID NO: 24) e colocados a montante do gene repórter luciferase (SEQ ID NO: 25).

156

1.2 - GAL4/mutanteCfEcR-DEF/VP16-pRXREF-LmRXREF: Este construtor foi preparado do mesmo modo como no desvio 1.1 acima, exceto que CfEcR-DEF do tipo selvagem foi substituído com o mutante CfEcR-DEF compreendendo um domínio de ligação ao ligante compreendendo uma mutação de substituição selecionada da Tabela 1 abaixo.

Tabela 1

Mutantes de Substituição do Domínio de Ligação ao Ligante (LBD) do Receptor Ecdisona de Choristoneura fumiferana 10 (CfEcR)

Mutação LBD de CfEcR	Substituição de aminoácido WT em Mutante Resultante	Aminoácido correspondente em comprimento total de CfEcR (SEQ ID NO: 26)
F48Y	Fenilalanina (F) em Tirosina (Y)	331
F48W	Fenilalanina (F) em Triptofano (W)	331
F48L	Fenilalanina (F) em Leucina (L)	331
F48N	Fenilalanina (F) em Asparagina (N)	331
F48R	Fenilalanina (F) em Arginina (R)	331
F48K	Fenilalanina (F) em Lisina (K)	331
I51N	Isoleucina (I) em Asparagina (N)	334
151L	Isoleucina (I) em Leucina (L)	334
I51M	Isoleucina (I) em Metionina (M)	334
T52M	Treonina (T) em Metionina (M)	335
T52R	Treonina (T) em Arginina ®	335
T52W	Treonina (T) em Triptofano (W)	335
T52G	Treonina (T) em Glicina (G)	335
T52Q	Treonina (T) em Glutamina (Q)	335
T52E	Treonina (T) em Ácido Glutâmico (E)	335
T52P	Treonina (T) em Prolina (P)	335
M54W	Metionina (M) em Triptofano (W)	337
M54T	Metionina (M) em Treonina (T)	337
M92L	Metionina (M) em Leucina (L)	375
M92E	Metionina (M) em Ácido Glutâmico (E)	375

157 /α

R95H	Arginina(R) em Histidina (H)	378
R95M	Arginina (R)em Metionina (M)	378
R95W	Arginina ® em Triptofano (W)	378
V96L	Valina (V) em Leucina (L)	379
V96	valina (V) em Triptofano (W)	379
V96S	Valina (V) em Serina (S)	379
V96E	Valina (V) em Ácido glutâmico (E)	379
V107I	VAlina (V) em Isoleucina (I)	390
F109L	Fenilalanina (F) em Leucina (L)	392
F109P	Fenilalanina (F) em Prolina (P)	392
F109W	Fenilalanina (F) em Triptofano (W)	392
F109M	Fenilalanina (F) em Metionina (M)	392
F109N	Fenilalanina (F) em Asparagina 9N)	392
Α110Ε	Alanina (A) em Ácido glutamático (E)	393
Α110Ν	Alanina (A) em Asparagina (N)	393
A110W	Alanina (A) em Triptofano (W)	393
N119F	Asparagina (N) em Fenilalanina (F)	402
Y120W	Tirosina (Y) em Triptofano (W)	403
Y120M	Tirosina 9Y) em Metionina 9M)	403
M125E	Metionina (M) em Ácido glutâmico (E)	408
M125P	Metionina (M) em Prolina (P)	408
M125R	Metionina (M) em Arginina ®	408
M125L	Metionina (M) em Leucina (L)	408
M125C	Metionina (M) em Cisteína (C)	408
M125W	Metionina (M) em Triptofano (W)	408
M125G	Metionina (M) em Glicina (G)	408
M125I	Metionina (M) em Isoleucina (I)	408
M125N	Metionina 9M) em Asparagina (N)	408
M125S	Metionina (M) em Serina (N)	408
M125V	Metionina (M) em Valina (V)	408
V127F	Valina (V) em Fenilalanina (F)	411
L132M	Leucina (L) em Metionina (M)	415
L132N	Leucina (L) em Asparagina (N)	415
L132V	Leucina (L) em Valina (V)	415
L132E	Leucina (L) em Ácido glutâmico (E)	415
R175E	Arginina ® em Ácido glutâmico (E)	458
M219K	Metionina (M) em Lisina (K)	502

158

M219W	Metionina (M) em Triptofano (W)	502
M219Y	Metionina (M) em Tirosina (Y)	502
M219A	Metionina (M) em Alanina (A)	502
L223K	Leucina (L) em Lisina (K)	506
L223R	Leucina (L) em Arginina ®	506
L223Y	Leucina (L) em Tirosina (Y)	506
L234M	Leucina (L) em Metionina (M)	517
L234I	Leucina (L) em Isoleucina (I)	517
L234R	Leucina (L) em Arginina (R)	517
L234W	Leucina (L) em Triptofano (W)	517
W238P	Triptofano (W) em Prolina (P)	521
W23 8E	Triptofano (W) em Ácido glutâmico (E)	521
W238Y	Triptofano (W) em Tirosina (Y)	521
W238L	Triptofano (W) em Leucina (L)	521
W238M	Triptofano (W) em Metionina (M)	521
mutante duplo T52V e A110P	Treonina (T) em Valina (V) e Alanina (A) em Prolina (P), respectivamente	335 e 393, respectivamente
mutante duplo N119F e V96T	Asparagina (N) em Fenilalanina (F) e Valina (V) em Treonina (T), respectivamente,	402 e 379, respectivamente
mutante duplo V128F e A110P	Valina (V) em Fenilalanina (F) e Alanina (A) em Prolina (P), respectivamente	411 e 393, respectivamente
mutante triplo T52V, V107X e R175E	Treonina (T) em Valina (V), Valina (V) em Isoleucina (I) e Arginina (R) em Ácido glutâmico (E), respectivamente	335, 390 e 458 respectivamente
mutante triplo T52A, V107I e R175E	Treonina (T) em Alanina (A), Valina (V) em Isoleucina (I) e Arginina (R)em Ácido glutâmico (E), respectivamente	335, 390 e 458 respectivamente,
mutante triplo V96A, V107I e R175E	Valina (V) em Alanina (A), Valina (V) em Isoleucina (I) e Arginina (R) em Ácido glutâmico (E), respectivamente	379, 390 e 458, respectivamente
mutante triplo V96T, V107I e R175E	Valina (V) em Treonina (T), Valina (V) em Isoleucina 91) e Arginina (R) em Ácido glutâmico (E), respectivamente	379, 390 e 458 respectivamente
mutante triplo V107I, Υ127Ξ e A110P	Valina (V) em Isoleucina (I), Tirosina (Y) em Ácido glutâmico (E) e Alanina (A) em Prolina (P) , respectivamente	390, 410 e 393 respectivamente

159 /g3

mutante triplo V107I, Y127E e R175E	Valina (V) em Isoleucina (I) , Tirosina (Y) em Ácido glutâmico (E) e Arginina (R) em Ácido glutâmico (Ξ), respectivamente	390, 410 e 458 respectivamente
mutante triplo V107I, A110P e R175E	Valina (V) em Isoleucina 91) , Alanina (A) em Prolina (P) e Arginina (R) em Ácido Glutâmico (R), respectivamente	390, 393 e 458, respectivamente
mutante triplo V107I, Y127E, T52V	Valina (V) em Isoleucina 91), Tirosina (Y) em Ácido Glutâmico (E) e Treonina (T) em Valina (V)	390, 410 e 335 respectivamente
V107X/Y127E/G	Valina (V) em Isoleucina (I), Tirosina (Y) em Ácido glutâmico (E) e Glicina, respectivamente	390, 410 e 542 respectivamente

Construção dos Domínios de Ligação ao Ligante do Receptor

Ecdisona Compreendendo uma Mutação de Substituição

Num esforço para modificar a ligação ao ligante EcR, resíduos dentro dos domínios de ligação ao ligante EcR que foram previstos como importantes para ligação ao ligante, com base numa análise de modelagem molecular, foram mutacionados em EcRs de três diferentes classes de organis-mos. A tabela 1 indica os resíduos de aminoácidos dentro do domínio de ligação ao ligante de CfEcR (Lepidopteran EcR) (SEQ ID

NO: 1) que sofreram mutação e examinados para modificação de ligação a ecdiesteróides e não ecdiesteróides.

Cada uma das mutações de substituição de aminoácido relacionadas na Tabela 1 foi construída num cDNA de EcR por mutagênese direcionada ao sítio mediada por PCR.

Além das muitas mutações de ponto por mutação únicas feitas, dois CfEcRs mutantes por ponto duplo diferentes, também foram produzidos: um compreendendo tanto as substituições V128F e A110P (V128F/A110P) e um segundo compreendendo tanto substituições N119F como V96T (N119F/V96T). Três diferentes

160

CfEcRs mutantes por ponto triplo diferentes também foram produzidos: um compreendendo as substituições V107I, Y127E e A110P (V107I/Y127E/A110P) o segundo compreendendo as substituições V107I, Y127E e T52V (V107I/Y127E/T52V) e o terceiro compreendendo as substituições V 1071 E Y127E e uma inserção (G) glicina (V107I/Y127E/259G) (SEQ ID NO: 1).

Realizou-se a mutagênese direcionada ao sítio por PCR usando o kit de mutagênese direcionada ao sítio Quikchange (Stratagene, La Jolla, CA) usando as condições de reação e parâmetros de ciclagem como a seguir. Realizou-se a mutagênese direcionada ao sítio por PCR usando tampão de reação IX (fornecido pelo fabricante), 50 ng de matriz de

DNAds, 125 ng de iniciador dianteiro (FP), 125 ng de iniciador complementar reverso (RCP) e 1 6L de mistura dNTP (fornecida pelo fabricante) num volume de reação final de 50 qL. O iniciador dianteiro e iniciador complementar reverso usados para produzir cada mutante Ecr estão apresentados na Tabela 2. Os parâmetros de ciclagem usados consistiam de um ciclo de desnaturação a 95°C por 30 segundos, seguido por 16 ciclos de desnaturação a 95°C por 30 segundos, anelamento a 55°C por 1 minuto e extensão a 68°C por 22 minutos.

Tabela 2

Iniciadores da PCR para Substituição da Construção do

Domínio de Ligação ao Ligante CfEcR Mutante

Mutante	Iniciador (SEQ ID NO:)	SEQÜÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO DO INICIADOR (5' a 3' )
F48Y	FP (SEQ ID NO:27)	gtcggacactccctaccgccagatcacag
F48Y	FP (SEQ ID NO:28)	ctgtgatctggcggtagggagtgtccgac

161

F48W	FP (SEQ ID NO:29)	gtcggacactccctggcgccagatcacagag
F48W	FP (SEQ ID NO:30)	ctctgtgatctggcgccagggagtgtccgac
F48L	FP (SEQ ID NO-.31)	gtcggacactcccttgcgccagatcacag
F48L	FP (SEQ ID NO:32)	ctgtgatctggcgcaagggagtgtccgac
F48N	FP (SEQ ID NO:33)	gaggctgacactcccaaccgccagatcacagag
F48N	FP (SEQ ID NO:34)	ctctgtgatctggcggttgggagtgtcagcctc
F48R	FP (SEQ ID NO:35)	gtcggacactccccgccgccagatcacag
F48R	FP (SEQ ID NO:36)	ctgtgatctggcggcggggagtgtccgac
F48K	FP (SEQ ID NO:37)	gtcggacactcccaagcgccagatcacag
F48K	FP (SEQ ID NO:38)	ctgtgatctggcgcttgggagtgtccgac
151Ν	FP (SEQ ID NO:39)	ctcccttccgccagaacacagagatgactatc
151Ν	RCP (SEQ ID NO:40)	gatagtcatctctgtgttctggcggaaggag
151L	FP (SEQ IDNO: 41)	ctcccttccgccagctcacagagatgac
151L	RCP (SEQ ID NO: 42)	gtcatctctgtgagctggcggaagggag
151Μ	FP (SEQ ID NO: 43)	cactcccttccgccagatgacagagatgac
151Μ	RCP (SEQ ID NO: 44)	gtcatctctgtcatctggcggaagggagtg
Τ52Μ	FP (SEQ ID NO: 4S)	cccttccgccagatcatggagatgactatcctcac
Τ52Μ	RCP (SEQ ID NO: 46)	gtgaggatagtcatctccatgatctggcggaaggg
T52R	FP (SEQ ID NO: 47)	cttccgccagatcagagagatgactatcctcac
T52R	RCP (SEQ ID NO: 48)	gtgaggatagtcatctctctgatctggcggaag
T52W	FP (SEQ ID NO: 49)	ctcccttccgccagatctgggagatgactatcctcac
T52W	RCP (SEQ ID NO: 50)	gtgaggatagtcatctcccagatctggcggaagggag
T52L	FP (SEQ ID NO: 51)	cccttccgccagatcctagagatgactatcctcac
T52L	RCP (SEQ ID NO: 52)	gtgaggatagtcatctctaggatctggcggaaggg
Τ52Ε	FP (SEQ ID NO: 53)	ctcccttccgccagatcgaggagatgactatcctcac

162

GG

T52E	RCP (SEQ ID NO: 54)	gtgaggatagtcatctcctcgatctggcggaagggag
T52P	(SEQ	FP IDNO:	55)	cttccgccagatcccagagatgactatcctc
T52P	(SEQ	RCP ID NO:	56)	gaggatagtcatctctgggatctggcggaag
T52G	(SEQ	FP ID NO:	57)	cttccgccagatcggagagatgactatcctcac
T52G	(SEQ	RCP ID NO:	58)	gtgaggatagtcatctctccgatctggcggaag
T52Q	(SEQ	FP ID NO:	59)	cttccgccagatccaagagatgactatcctcac
T52Q	(SEQ	RCP ID NO:	60)	gtgaggatagtcatctcttggatctggcggaag
T52V	(SEQ	FP ID NO:	61)	cccttccgccagatcgtagagatgactatcctcac
T52V	(SEQ	RCP ID NO:	62)	gtgaggatagtcatctctacgatctggcggaaggg
M54W	(SEQ	FP ID NO:	63)	cgccagatcacagagtggactatcctcacggtc
M54W	(SEQ	RCP ID NO:	64)	gaccgtgaggatagtccactctgtgatctggcg
M54T	(SEQ	FP ID NO:	65)	ccagatcacagagacgactatcctcacggtc
M54T	(SEQ	RCP ID NO:	66)	gaccgtgaggatagtcgtctctgtgatctgg
M92L	(SEQ	FP ID NO:	67)	gctcaagtgaggtactgatgctccgagtcg
M92L	(SEQ	RCP ID NO:	68)	cgactcggagcatcagtacctcacttgagc
M92E	(SEQ	FP ID NO:	69)	gctcaagtgaggtagagatgctccgagtcgcg
M92E	(SEQ	RCP ID NO:	70)	cgcgactcggagcatctctacctcacttgagc
R95H	(SEO	FP ID NO:	71)	gaggtaatgatgctccacgtcgcgcgacgatac
R95H	(SEQ	RCP ID NO:	72)	gtatcgtcgcgcgacgtggagcatcattacctc
R95M	(SEQ	FP ID NO:	73)	gtgaggtaatgatgctcatggtcgcgcgacgatacgatg
R95M	(SEQ	RCP ID NO:	74)	catcgtatcgtcgcgcgaccatgagcatcattacctcac
R95W	(SEO	FP ID NO:	75)	gtgaggtaatgatgctctgggtcgcgcgacgatacg
R95W	(SEQ	RCP ID NO:	76)	cgtatcgtcgcgcgacccagagcatcattacctcac
V96L	(SEQ	FP ID NO:	77)	gtaatgatgctccgactcgcgcgacgatac

163

V96L	(SEQ	RCP ID NO:	78)	gtatcgtcgcgcgagtcggagcatcattac
V96W	(SEQ	FP ID NO:	79)	gaggtaatgatgctccgatgggcgcgacgatacgatg
V96W	(SEQ	RCP ID NO:	80)	catcgtatcgtcgcgcccatcggagcatcattacctc
V96S	(SEO	FP ID NO:	81)	ggtaatgatgctccgatccgcgcgacgatacg
V96S	(SEQ	RCP ID NO:	82)	cgtatcgtcgcgcggatcggagcatcattacc
V96E	(SEQ	FP ID NO:	83)	ggtaatgatgctccgagaggcgcgacgatacg
V96E	(SEQ	RCP ID NO:	84)	cgtatcgtcgcgcctctcggagcatcattacc
V96T	(SEQ	FP ID NO:	85)	ggtaatgatgctccgaaccgcgcgacgatacg
V96T	(SEQ	RCP ID NO:	86)	cgtatcgtcgcgcggttcggagcatcattacc
V107I	(SEO	FP ID NO:	87)	gcggcctcagacagtattctgttcgcgaac
V107I	(SEQ	RCP ID NO:	88)	gttcgcgaacagaatactgtctgaggccgc
F109W	(SEO	FP ID NO:	89)	ctcagacagtgttctgtgggcgaacaaccaagcg
F109W	(SEQ	RCP ID NO:	90)	cgcttggttgttcgcccacagaacactgtctgag
F1O9P	(SEQ	FP ID NO:	91)	ctcagacagtgttctgcccgcgaacaaccaagc
F109P	(SEQ	RCP ID NO:	92)	gcttggttgttcgcgggcagaacactgtctgag
F109L	(SEO	FP ID NO:	93)	cagacagtgttctgttggcgaacaaccaagcg
F109L	(SEQ	RCP ID NO:	94)	cgcttggttgttcgccaacagaacactgtctg
F109M	(SEQ	FP ID NO:	95)	cctcagacagtgtlctgatggcgaacaaccaagcg
F109M	(SEQ	RCP ID NO:	96)	cgcttggtlgttcgccatcagaacactgtctgagg
F109N	(SEQ	RCP ID NO:	97)	cctcagacagtgttctgaacgcgaacaaccaagcg
F109N	(SEO	FP ID NO:	98)	cgcttggttgttcgcgttcagaacactgtctgagg

RCP

A110P (SEQ ID NO- 99) ^ca9acagtgttctgttcccgaacaaccaagcg FP

A110P _{(gEQ id NQ ioQ)} cgcttggttgttcgggaacagaacactgtctg

A110E

RCP (SEQ ID NO: 101)

gacagtgttctgttcgagaacaaccaagcgtacac

164 /Gr

A110E	(SEQ	FP ID NO:	102)	gtgtacgcttggttgttctcgaacagaacactgtc
A110N	(SEQ	RCP ID NO:	103)	cagacagtgttctgttcaacaacaaccaagcgtacactcgcg
A11ON	(SEQ	FP ID NO:	104)	cgcgagtgtacgcttggttgttgttgaacagaacactgtctg
A11OW	(SEQ	RCP ID NO:	105)	cagacagtgttctgttctggaacaaccaagcgtacactc
A110W	(SEQ	FP ID NO:	106)	gagtgtacgcttggttgttccagaacagaacactgtctg
N119N	(SEQ	RCP ID NO:	107)	gcgtacactcgcgacnnntaccgcaaggctggcatgg
N119N	(SEQ	RCP ID NO:	108)	ccatgccagccttgcggtannngtcgcgagtgtacgc
Y120W	(SEQ	FP ID NO:	109)	cactcgcgacaactggcgcaaggctggcatg
Y120W	(SEQ	RCP ID NO:	110)	catgccagccttgcgccagttgtcgcgagtg
Y120M	(SEQ	FP ID NO:	111)	cactcgcgacaacatgcgcaaggctggcatggcc
Y120M	(SEQ	RCP ID NO:	112)	ggccatgccagccttgcgcatgttgtcgcgagtg
M125P	(SEQ	FP ID NO	113)	caaggctggcccggcctacgtcatcgag
M125P	(SEQ	RCP ID NO	114)	ctcgatgacgtaggccgggccagccttg
M125R	(SEQ	FP ID NO:	115)	caaggctggcagggcctacgtcatcg
M125R	(SEQ	RCP ID NO	116)	cgatgacgtaggccctgccagccttg
M125E	(SEQ	FP ID NO	117)	gcaaggctggcgaggcctacgtcatcgag
M125E	(SEQ	RCP ID NO:	118)	ctcgatgacgtaggcctcgccagccttgc
M125L	(SEQ	FP ID NO:	119)	caaggctggcctggcctacgtcatcg
M125L	(SEQ	RCP ID NO·	120)	cgatgacgtaggccaggccagccttg
M125C	(SEQ	FP ID NO	121)	ccgcaaggctggctgcgcctacgtcatcgagg
M125C	(SEQ	RCP ID NO·	122)	cctcgatgacgtaggcgcagccagccttgcgg
M125G	(SEQ	FP ID NO:	123)	ccgcaaggctggcggggcctacgtcatcg
M125G	(SEQ	RCP ID NO:	124)	cgatgacgtaggccccgccagccttgcgg
M1251	(SEQ	FP ID NO:	125)	ccgcaaggctggcatagcctacgtcatcg

165 !G^cí

M1251	RCP (SEQ 11) NO:126)	cgatgacgtaggctatgccagccttgcgg
M125V	FP (SEQ 11) NO:127)	gcaaggctggcgtggcctacgtcatcg
M125V	RCP (SEQ ID NO:128)	cgatgacgtaggccacgccagccttgc
M125W	FP (SEQ ID NO:129	gcaaggctggctgggcctacgtcatcgag
M125W	RCP (SEQ ID NO:130)	ctcgatgacgtaggcccagccagccttgc
Y127E	FP (SEQ ID NO:131)	caaggctggcatggccgaggtcatcgagg
Y127E	RCP (SEQ ID NO:132)	cctcgatgacctcggccatgccagccttg
V128F	FP (SEQ ID NO:133)	ggctggcatggcctacnnnatcgaggatctactgcacttc
V128F	RCP (SEQ ID NO:134)	gaagt	gcagtagatcctcgatnnngtaggccatgccagcc
L132M	FP (SEQ ID NO:135)	gccta	cgtcatcgaggatatgctgcacttctgccgg
L132M	RCP (SEQ ID NO:136)	ccggc	agaagtgcagcatatcctcgatgacgtaggc
L132N	FP (SEQ ID NO:137)	gccta	cgtcatcgaggataacctgcacttctgccgg
L132N	RCP (SEQ ID NO:138)	ccggc	agaagtgcaggttatcctcgatgacgtaggc
L132V	FP (SEQ ID NO:139)	cgtca	tcgaggatgtactgcacttctgccg
L132V	RCP (SEQ ID NO:140)	cggca	gaagtgcagtacatcctcgatgacg
L132E	FP (SEQ ID NO:141)	gccta	cgtcatcgaggatgaactgcacttctgcc
L132E	RCP (SEQ ID NO:142)	ggcac	aagtgcagttcatcctcgatgacgtaggc
M219K	FP (SEQ ID NO:143)	gcatc	caaaactccaacaagtgcatctccctcaag
M219K	RCP (SEQ ID NO:144)	cttga	gggagatgcacttgttggagttttgcatgc
M219W	FP (SEQ ID NO:145)	gcatc	caaaactccaactggtgcatctccctcaagct
M219W	RCP (SEQ ID NO:146)	agctt	gagggagatgcaccagttggagttttgcatgc
M219Y	FP (SEQ ID NO:147)	ctcgg	catgcaaaactccaactattgcatctccctcaagctcaag
M219Y	RCP (SEQ ID NO:148)	cttga	gcttgagggagatgcaatagttggagttttgcatgccgag
M219A	FP (SEQ ID NO:149)	catgc	aaaactccaacgcgtgcatctccctcaag
M219A	RCP (SEQ ID NO:150)	cttga	gggagatgcacgcgttggagttttgcatg

166 /20

L223K	FP (SEQ ID NO:151)	ctccaacatgtgcatctccaagaagctcaagaacag
L223K	RCP (SEQ ID NO:152)	ctgttcttgagcttcttggagatgcacatgttggag
L223R	FP (SEQ ID NO:153)	ctccaacatgtgcatctcccgcaagctcaagaacag
L223R	RCP (SEQ ID NO:154)	ctgttcttgagcttgcgggagatgcacatgttggag
L223Y	FP (SEQ ID NO:155)	ctccaacatgtgcatctcctacaagctcaagaacag
L223Y	RCP (SEQ ID NO:156)	ctgttcttgagcttgtaggagatgcacatgttggag
L234M	FP (SEQ ID NO:157)	gctgccgcctttcatggaggagatctgggatg
L234M	RCP (SEQ ID NO:158)	catcccagatctcctccatgaaaggcggcagc
L234I	FP (SEQ ID NO:159)	gctgccgcctttcattgaggagatctgggatgtg
L234I	RCP (SEQ ID NO:160)	cacatcccagatctcctcaatgaaaggcggcagc
L234R	FP (SEQ ID NO:161)	ctgccgcctttccgagaggagatctgggatg
L234R	RCP (SEQ ID NO:162)	catcccagatctcctctcggaaaggcggcag
L234W	FP (SEQ ID NO:163)	gctgccgcctttctgggaggagatctgggatgtg
L234W	RCP (SEQ ID NO:164)	cacatcccagatctcctcccagaaaggcggcagc
W238P	FP (SEQ ID NO:165)	ctcgaggagatcccggatgtggcaggacatg
W238P	RCP (SEQ ID NO:166)	catgtcctgccacatccgggatctcctcgag
W238E	FP (SEQ XD NO:167)	cctcgaggagatcgaggatgtggcaggacatg
W238E	RCP (SEQ ID NO:168)	catgtcctgccacatcctcgatctcctcgagg
W238L	FP (SEQ ID NO:169)	ctcgaggagatcttggatgtggcaggacatg
W238L	RCP (SEQ ID NO:170)	catgtcctgccacatccaagatctcctcgag
W238M	FP (SEQ ID NO:171)	cctcgaggagatcatggatgtggcaggacatgtc
W238M	RCP (SEQ ID NO:172)	gacatgtcctgccacatccatgatctcctcgagg
W238Y	FP (SEQ ID NO:173)	cctcgaggagatctacgatgtggcaggacatgtc
W23 8Y	RCP (SEQ ID NO:174)	gacatgtcctgccacatcgtagatctcctcgagg

/7/

167

Os produtos de ácido nucléico PCR resultantes que codificam os domínios de ligação EcR foram então fundidos, cada um, a um domínio de ligação GAL4 DNA, conforme descrito no Exemplo 1.2 acima. As construções de GAL4/receptor EcR mutantes foram testadas quanto à atividade por meio de transfecção dos mesmos para dentro de células NIH3T3 junto com VP16/PRXREF-LmRXREF e pFRLuc na presença de diversos ligantes.

O mutante Gal4-CfEcR-DEF(VYG) foi criado por meio da inserção de uma glicina extra na extremidade terminada em C do mutante V1071/Y127E[CfECR(VY)] com substituição EcR por PCR. Essencialmente, isso foi feito em duas etapas: PCRamplificação de CfEcR-DEF(VYG) e substituição do CfEcR(VY) no vetor GAL4-CfEcR DEF(VY)pBIND 1-9 pelo CfEcR-DEF(VYG) PCR-amplifiçado. A região CfEcR-DEF (com a glicina extra) foi amplificada usando-se o vetor GAL4-CfEcR DEF(VY)pBIND como gabarito e os seguintes iniciadores PCR:

5EcR-wt

GGAATTCCCGGGATCCGGCCTGAGRGCGTAGTACCC (SEQ ID NO:

175)

3EcR-gly

CTCTCTGCCTGCGGCCGCCTATCCGAGATTCGTGGGGGACTCGAGGATAG (SEQ ID NO: 176)

O produto PCR foi isolado e preparado com Not I (cortes na extremidade 3; incluídos no iniciador 3' PCR) e Xma I (cortes na extremidade 5'; presente no iniciador 5'PCR). Este produto foi ligado ao vetor preparado da seguinte maneira: GAL4-CfEcR DEF(VY) pBIND 1-9 foi preparado

168 /7.

vcom Xma I e Not I (a preparação (digestão) remove o CfEcRDEF (VY) do vetor). Os fragmentos foram separados em agarose gel 1% e o vetor DNA com migração mais lenta foi purificado. Após a ligação entre o vetor e o fragmento CfEcR-DEF(VYG) descrito acima, a reação de ligação foi transformada em bactéria. As colônias positivas foram selecionadas pela colônia PCR usando os iniciadores mencionados acima. As mutações VYG no clone selecio-nado foram confirmadas por seqüenciamento.

EXEMPLO 2 aumentam a realizaram aminoácido ligação de

Este exemplo descreve a identificação de ecdisteróide responsivo a mutantes de substituição do domínio de ligação do ligante CfEcR que exibem maior atividade em resposta ao ligante ecdisteroidal. Em um esforço para identificar as mutações de substituição no CfEcR que atividade do ligante CfEcR, os requerentes a mutação de resíduos de prognosticados como sendo críticos para a ecdisteróide e criaram fitas de expressão de gene GAL4/mutante CfEcR-DEF cDNA, conforme descrito no Exemplo 1 acima usando o kit de mutagênese direcionado ao sítio mediado por PCR. Os que sofreram mutação e os WT cDNAs correspondentes às diversas construções comutadas no Exemplo foram feitos e testados em ensaios de informação de luciferase acionados por GAL4, conforme descrito abaixo.

Transfecções: Os DNAs foram transferidos para células NIH3T3 de rato (ATCC) conforme a seguir. Foram seguidos métodos padrões para cultura e manutenção das

169 /73 células. As células foram colhidas e depositadas em placas de 96 poços (96-well) a 2.500 células por poço, em 50 :gL de meio de crescimento contendo soro bovino fetal a 10% (FBS Fetal Bovine Serum). Vinte e quatro horas mais tarde, as células foram tratadas com 35 gL de meio de crescimento livre de soro contendo dimetilsulfóxido (DMSO; controle) ou uma solução DMSO de ligante. Então, as células foram transfectadas usando reagente de transfecção Superfect™ (Qiagen Inc.) . Para cada poço, 0,625 gL de Superfect™ foram misturados com 14,2 μΕ de meio de crescimento livre de soro. 0,16 gg de construção de informação e 0,04 qg de cada construção de receptor foram adicionados à mistura de reagente de transfecção. O conteúdo da mistura de transfecção foi misturado em um misturador de turbilhão e deixado à temperatura ambiente por 30 minutos. Ao final da incubação, 15 μύ de mistura de transfecção foi adicionada às células. As células foram mantidas a 37°C e 5% CO₂ por 48 horas em 5% FBS.

Ligantes: Os ligantes ecdisteroidais ponasterona A e 20-hidroxiecdisona foram adquiridos de Sigma Chemical Company e Invitrogen. O ligante não ecdisteroidal diacilidrazina N-(2 etil-3-metoxibenzoil)-N'-(3,5-dimetilbenzoil)Ν'-terc-butilidrazina (RG-102240, GS® -E ligand) é um ligante ecdisteróide estável sintético que foi sintetizado em Rohm and Haas Company. Os ligantes não ecdisteroidais, diacilidrazina RG-101691, RG-102362, RG-115840, RG-115853, RG-115855, RG-115859 e RG-115898 foram sintetizados por RheoGene Inc. A síntese de RG-101691, RG-102362, RG-115840, /77

170

RG-115859 e RG-115898 é descrita abaixo. A síntese de RG115853 e RG-115855 é descrita no pedido de patente copendente No. 10/775.883. Os ligantes não ecdisteroidais tetraidroquinolina RG-120499 e RG-120S00 foram sintetizados por RheoGene, Inc. e foram descritos no pedido de patente U.S. co-pendente No. 10/460.820. Todos os ligantes foram dissolvidos em DMSO.

Síntese de Ligantes:

Preparação de ácido 3,5-Dimetil-benzóico N-terc-butil-N'-(3 etil-2-metil-benzoil)-hidrazida (RG-101691)

Acido 3-amino-2-metilbenzóico (6,16 g) foi aquecido em refluxo por 30 minutos em HBr concentrado. A mistura foi resfriada até 0°C e tratada com uma solução de NaNO₂ a 0°C (2,8 g em 5,6 mL H₂0) . A solução de sal de diazônio resultante foi lentamente adicionada a uma solução pré-aquecida (60-70°C) de CuBr (3,8 g) em 3,2 mL de HBr concentrado. Após a adição, a mistura foi agitada por toda a noite a temperatura ambiente e filtrada. O bolo de filtro recuperado foi lavado primeiro com água e então com HCl 10% e seco em ar para render 6,93 g de ácido 3-bromo-2metilbenzõico como um sólido pulverizado púrpura claro. Este material foi dissolvido em acetato de etil, lavado duas vezes com HCl 5%, seco em Na₂SO₄ e recristalizado a partir de 4:1 hexanos:acetato de etil, primeiro a temperatura

171 )'Η ambiente e então, sob refrigeração. RMN ¹H (DMSO, 200 MHz) , Ô (ppm): 7,72 (dd, 2H), 7,2 (t, 1H), 2,5 (s, 3H).

Ácido 3-Bromo-2-metilbenzóico (7,03 g, 32,7 mmol) sofreu refluxo em 10 mL de SOC1₂ (98 mmol) e uma queda de

DMF por horas. SOC1₂ em excesso foi removido em vácuo. O resíduo foi dissolvido em 20 mL de CH₂C1₂ e adicionado a uma solução resfriada em gelo de 2-amino-2-metil-propan-l-ol (8,74 g, 9,36 mL) em 20 mL de CH₂C1₂. A mistura foi agitada a temperatura ambiente por 18 horas e o solvente foi removido em vácuo para deixar um resíduo oleoso. SOC1₂ (7,4 mL, 100 mL, 3 eq.) foi adicionado a este resíduo em um período de uma hora, a mistura foi agitada um adicional de 3 0 minutos e então despejada em 150 mL de éter. Uma fase imiscível oleosa formada e o éter foi descartado. O óleo foi misturado com 100 mL de NaOH 20% e extraído com 3 x porções de 150 mL de éter. Os extratos de éter foram combinados, secos em MgSO₄ e o solvente foi removido era vácuo para render um óleo amarelo. A cromatografia em sílica gel usando éter como eluente rendeu 4,87 g de 2-(3-bromo-2-metil20 fenil)-4,4-dimetil-4,5-diidro-oxazol como um óleo incolor. (Rf= 0,25 (4:1 hexano: éter). RMN ^XH (CDC1₃, 200 MHz), δ (ppm): 7,62 (m, 2H) , 7,1 (t, 1H) , 4,1 (s, 2H) , 2,6 (s, 3H) , !i£

172

1,4 (s, 6H).

UPrMgBr

2. NI(dppp)Clj I

Br

-(3-bromo-2-metil-fenil)-4,4-dimetil-4,5-diidrooxazol (3,4 g, 12,7 mmol) foi dissolvido em 30 mL de etil éter sob atmosfera de nitrogênio em um frasco de fundo redondo de 100 mL equipado com agitação magnética, termômetro e condensador de refluxo. Ni(dppp)Cl₂ (100 mg) foi adicionado e a mistura foi resfriada até 0°C em um banho de gelo. Etil magnésio brometo (5,5 mL, 3M em éter) foi adicionado, a mistura de reação foi agitada a 0°C por 3 0 minutos, a temperatura ambiente por 2,5 horas e finalmente em refluxo por 2 horas. Então a mistura foi resfriada até 0°C, temperada com NH₄C1 aquoso saturado. A camada orgânica foi removida e a camada aquosa foi extraída com éter. As fases orgânicas foram combinadas e secas em MgSO₄. O solvente foi removido em vácuo para dar 2,84 g de 2-(3-etil2-metil-fenil)-4,4-dimetil-4,5-diidro-oxazol, RMN ¹H (CDC1_3í

200 MHz), δ	(ppm): 7,5	(d, 2H) , 7,2	(m,	2H) , 4,1 (s,	2H) ,
2,7 (m, 2H)	, 2,45 (s,	3H) , 1,4 (s,	6H) ,	1,2 (t, 3H) ,	Rf=
0,25 (4:1	hexano:éter:	), contendo	ca.	5% original	aril

brometo. A oxazolina foi suspensa em 100 mL de 6N HCI e sofreu refluxo por 5 horas com agitação vigorosa. Permitiuse que a mistura resfriasse até a temperatura ambiente, onde '7/

173 ácido 3-etil-2-metil-benzóico cristalizou: 1,74 g, m.p. 9698°C, RMN ^XH (CDC1_3í 200 MHz), Ô (ppm) : 7,85 (d, 1H) , 7,4 (d, 1H) , 7,22 (t, 1H) , 2,7 (q, 2H) , 2,6 (s, 3H) , 1,21 (t, 3H) . Um adicional de 110 mg foi recuperado por extração por éter da fase aquosa.

Ácido 3-etil-2-metil-benzóico (0,517 g) sofreu refluxo em 3 mL de cloreto de tionil com uma gota de DMF por diversas horas. O cloreto de tionil foi removido em vácuo para render 0,89 g (4,48 mmol) de cloreto de 3-etil-2-metil10 benzoil. O cloreto ácido foi dissolvido em 5 mL de CH₂C1₂ e adicionado lentamente e simultaneamente, porém separadamente, com 5 mL de NaOH aquoso (0,0 g, 7,5 mmol) a uma solução de ácido 3,5-dimetil-benzóico N-terc-butil-hidrazida (0,96 g, 4,36 mmol) dissolvido em 10 mL de CH₂C1₂ pré15 resfriado a -5°C. Durante a adição, a temperatura foi mantida abaixo de 5°C. Deixou-se que a mistura aquecesse lentamente até a temperatura ambiente e foi agitada durante toda a noite. A camada orgânica foi removida e a camada aquosa foi extraída com CH₂C1₂. Os extratos orgânicos foram combinados, secos e o solvente foi removido em vácuo para

1,5 g de produto cru. O resíduo foi extraído com 100 mL de hexanos sob refluxo, e o extrato quente foi decantado a

174

partir de um resíduo oleoso e deixado a resfriar até a temperatura ambiente, onde ácido 3,5-dimetil-benzóico Nterc-butil-N'-(3-etil-2-metil-benzoil)-hidrazida cristalizou

(0,56 g,	m.p.	167-	-169°C, RMN 2Η	(CDCI3, 200 MHz) ,	δ (ppm) :
5 7,43 (s,	1H) ,	7,18	(m, 1H) , 7,1	(s, 2H), 7,03 (s,	1H), 7,0
(m, 1H) ,	6,35	(d,	1H) , 2,58 (q,	2H) , 2,3 (s, 6H) ,	1,95 (s,
3H), 1,6	(s,	9H) ,	1,15 (t, 3H)	. A dissolução do	resíduo

oleoso e a cristalização renderam uma segunda colheita de material menos puro, 0,21 g.

Preparação de ácido 3,5-Dimetil-benzóico N-terc-butil-N'-(3 isopropil-2-metil-benzoil)-hidrazida (RG-102362)

Um frasco de fundo redondo seco de 250 mL com três gargalos equipado com agitação magnética e mantido sob uma atmosfera de nitrogênio foi carregado com 5,0 g de 2-(315 bromo-2-metil-fenil)-4,4-dimetil-4,5-diidro-oxazol, 60 mL de THF anidro e 100 mg Ni (dppp) CI2 A mistura foi resfriada até 15°C, e cloreto de magnésio isopropil (11 mL, 2M em etil éter) foi adicionado. Uma reação exotérmica suave aconteceu e a mistura escureceu ligeiramente. A reação foi agitada durante toda a noite a temperatura ambiente, ponto em que RMN ‘‘Ή indicou 50% de completamento. A adição de ca 75 mg Ni(dppp)Cl₂ e refluxo por 3 horas não resultou em progressão

175 adicional da reação. A mistura foi resfriada até 15°C, e um adicional de 13 mL de cloreto de magnésio isopropil (2M e, etil éter) e 100 mg de catalisador níquel foram adicionados e a mistura foi agitada durante a noite a temperatura ambiente. A reação foi temperada com NH₄CL aquoso saturado, a camada orgânica foi removida, a camada aquosa foi extraída e as fases orgânicas foram combinadas e secas. O solvente foi removido em vácuo para render 3,84 g de produto cru como um óleo amarelo. Cromatografia de coluna em sílica gel usando 4:1 hexanos:éter como eluente rendeu 0,79 g de 2-(3isopropil-2-metil-fenil)-4,4-dimetil-4,5-diidro-oxazol como um óleo incolor. RMN (CDC1₃, 200 MHz), δ (ppm) : 7,5 (d, 1H), 7,37 (d, 1H), 7,22 (t, 1H), 4,13 (s, 2H), 3,23 (m, 1H),

2,5 (s, 3H) , 1,45 (s, 6H) , 1,22 (d, 6H) . A oxazolina foi suspensa em 34 mL de 6N HCl e sofreu refluxo em um banho de óleo por 6 horas. A mistura foi resfriada e extraída com CH₂C1₂. O extrato foi seco em Na₂S0₄ e evaporado para render 0,76g de ácido 3-isopropil-2-metil-benzóico, adequadamente puro para a próxima etapa. RMN ⁴Η (CDC1₃, 3 00 MHz) , δ (ppm) : 7,8 (d, 1H) , 7,48 (d, 1H) , 7,3 (t, 1H) , 3,3 (m, 1H) , 2,55 (s, 3H), 1,2 (d, 6H).

Ácido 3-isopropil-2-metil-benzóico (0,75 g) sofreu refluxo em ca. 3 mL de cloreto de tionil com uma gota de DMF

176 por diversas horas e o cloreto de tionil foi removido em vácuo para render cloreto de 3-isopropil-2-metil-benzoil. O cloreto ácido foi dissolvido em 5 mL de CH₂C1₂ e adicionado lentamente e simultaneamente, porém separadamente, com 5 mL .5 de NaOH aquoso (0,265 g, 6,6 mmol) a uma solução de ácido 3,5-dimetil-benzóico N-terc-butil-hidrazida (0,973 g, 4,4 mmol) dissolvido em 10 mL de CH₂C1₂, pré-resfriado ate -5°C. Durante a adição, a temperatura foi mantida abaixo de 5°C. Deixou-se a mistura aquecer lentamente até a temperatura ambiente e foi agitada durante toda a noite. A camada orgânica foi removida e a camada aquosa foi extraída com CH₂C1₂. os extratos orgânicos foram combinados, secos e o solvente foi removido em vácuo para dar 1,61 g de produto cru como um óleo amarelo. Este material sofreu cromatografia em sílica gel usando 4: 1 hexanos: acetato de etil como eluente, e subseqüentemente, foi triturado a partir de 1: 1 hexano: éter, dando ácido 3,5-dimetil-benzóico N-terc-butilN'-(3-isopropil-2-metil-benzoil)-hidrazida, após remoção árdua de éter em um forno a vácuo a 60°C (0,35 g, m.p.

182.5°C. RMN ^ΤΗ (CDCl₃, 200 MHz), δ (ppm) : 7,6 (s, 1H) , 7,25 (d, 1H) , 7,1 (s, 2H) , 7,05 (s, 1H) , 7,0 (m, 1H) , 6,3 (d,

1H) , 3,1 (m, 1H) , 2,3 (s, 6H) , 1,95 (s, 3H) , 1,6 (s, 9H) ,

1,18 (m, 6H).

Preparação de ácido 3,5-dimetil-benzóico N'-(5-etil-2,325 diidro-benzo[1,4]dioxina-6-carbonil)-N-(l-etil-2,2-dimetilpropil)-hidrazida (RG-115858)

177 ο

ο

2,38 g (18 mmol) de t-butil carbazato foram dissolvidos em 50 mL de CH₂C1₂ em um frasco de fundo redondo de 250 mL e resfriado até 0°C. Foi preparada uma solução aquosa de K₂CO₃ (4,15 g K₂CO₃/ 35 mL H₂O) e adicionados à mistura de reação que foi novamente resfriada até 0°C. 3,63 g (16 mmol) de 5-etil-2,3-diidro-benzo[1,4]dioxina-6carbonil cloreto foram dissolvidos em 4 0 mL de CH₂C1₂ e adicionados a partir de um funil separatório, em forma de gotas, por 15 minutos. A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 3 dias. A mistura de reação foi transferida para um funil separatório com CH₂C1₂ e H₂0. A fase de água foi completamente extraída com CH₂C1₂. Então, o extrato de CH₂C1₂ foi extraído com 0,5 N HCl, seco e evaporado. O resíduo foi adicionalmente seco em um forno a vácuo para render 5,15 g de um sólido marrom de ácido Ν'-(5etil-2,3-diidro-benzo[1,4]dioxina-6-carbonil)-hidrazinacarboxílico e éster terc-butil. TLC (1:1 acetato de etil: hexano) deu um único ponto a Rf = 0,43 e NMR indicou um produto muito puro: RMN ‘‘lí (CDC1₃, 500 MHz), δ (ppm) : 7,5 (br, 1H), 6,75 (d, 2H), 4,28 (br, 4H), 2,76 (m, 2H), 1,5 (s, 9H), 1,18 (t, 3H).

TFA

178 &L

5,15 g (16 mmol) de ácido N'- (5-etil-2,3-diidrobenzo[1,4]dioxina-6-carbonil)-hidrazinacarboxílico tercbutil éster foram adicionados a um frasco de 200 mL de fundo redondo. Cerca de 20 mL de ácido trifluoroacético foram 5 adicionados e a mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 24 horas. Então, cerca de 40 mL de água foram adicionados, seguido pela adição lenta de NaOH/H₂O a 10% frio, com agitação, até o ácido ser neutralizado (pH -14). A mistura de reação foi transferida para um funil separatório e extraída com acetato de etil sacudindo-se gentilmente (cuidado: evolução de gás). O extrato de acetato de etil foi seco e evaporado para render 5,51 g de um semi-sólido viscoso amarelo pálido. Então, o material foi colocado em um forno a vácuo a 50°C por cerca de 1 hora para render 4,62 g de ácido 5-etil-2,3-diidro-benzo[1,4]dioxina-6-carboxílico hidrazida. A divagem t-Boc é conseguida com ácido trifluoroacético não diluído; o uso de solvente adjuntivo sempre resultou em rendimentos muito menores. RMN ¹H (CDC1₃, 500 MHz), δ (ppm): 7,0 (br, 1H), 6,83 (m, 1H), 6,71 (m, 1H),

4,28 (br s, 4H), 2,76 (m, 2H), 1,6 (br, 2H), 1,17 (t, 3H).

N-NH,

AcOH, EtOH

NaCNBH,

1,12 g (5,1 mmol) de ácido 5-etil-2,3-diidrobenzo [ 1,4 ] dioxina-6-carboxílico hidrazida, 1,37 g (12 mmol) de 2,2 dimetil pentanona-3, 30 mL de etanol e 20 gotas

179 /fô de ácido acético glacial sofreram refluxo por 6 horas para gerar ácido 5-etil-2,3-diidro-benzo[1,4]dioxina-6-carboxílico (l-etil-2,2-dimetil-propilideno)-hidrazida, que foi usado in situ. À mistura de reação resfriada, foram adicionados 3 mL de ácido acético glacial e 0,63 g (10 mmol) de NaCNBH₃. a reação foi agitada a temperatura ambiente por 24 horas. 25 mL de água foram adicionados e a maior parte do álcool foi removida em um evaporador rotativo. Então, NaOH/H₂O 10% foi adicionado até a mistura de reação ficar básica. O produto foi extraído com acetato de etil, que foi então seco e evaporado para dar 1,61 g de resíduo. Ácido 5etil-2,3-diidro-benzo[1,4 ]dioxina-6-carboxílico N'-(l-etil2,2-dimetil-propil)-hidrazida puro foi obtido (ca 0,77 g) por cromatografia de coluna em sílica gel, eluindo com 25% acetato de etil/hexano. TLC: Rf= 0,53, 1: 1 acetato de etil :hexano) . RMN ¹H (CDC1₃, 500 MHz) , δ (ppm) : 7,1 (br s,

1H) , 6,8 (d, 1H) , 6,7 (d, 1H) , 4,27 (m, 4H) , 2,8 (m, 2H) , 2,4 (m, 1H), 1,7 (m, 1H), 1,3 (m, 1H), 1,2 (t, 3H), 1,15 (t, 3H), 0,97 (s, 9H).

K₂co₃ ch₂ci₂

RG-115858

0,214 g (0,70 mmol) de ácido 5-etil-2,3-diidrobenzo [1,4]dioxina-6-carboxílico Ν' -(l-etil-2,2-dimetil-propil)-hidrazida, 151 mg (0,9 mmol) de cloreto 3,5

180 dimetilbenzoil, 7 mL de K₂CO₃/H₂O 25% e 7 mL de CH₂C1₂ foram adicionados a um frasco de 2 0 mL e agitado a temperatura ambiente por 24 horas. A mistura de reação foi transferida para um funil separatório e diluições de NaHC0₃ e CH₂C1₂ foram adicionadas. A camada de CH₂C1₂ foi separada e a camada de água foi extraída duas vezes com CH₂C1₂. Os extratos de CH₂C1₂ foram secos em MgSO₄ e evaporados para render 0,59 g de um resíduo branco. Purificação por cromatografia de coluna e elução com 15 mL de acetato de etil 20%/hexano rendeu cerca de 350 mg de ácido 3,5-dimetilbenzóico Ν' -(5-etil-2,3-diidro-benzo[ 1,4 ]dioxina-6carbonil)-N-(l-etil-2,2-dimetil-propil)-hidrazida (95% puro TLC: Rf= 0,56, 1:1 acetato de etil:hexano) . RMN ¹H (CDC1₃,

500 MHz), Ô (ppm) : 7,05 (s, 1H) , 7,0 (s, 2H) , 6,6 (d, 1H) ,

6,27 (d, 1H) , 4,65 (d, 1H) , 4,25 (s, 4H) , 2,9 (m, 1H) , 2,3 (s, 6H), 2,0 (m, 1H), 1,55-1,7 (m, 2H), 1,25 (m, 3H), 0,091,2 (3s, 9H), 0,9 (t, 3H).

Preparação de ácido 3,5-dimetóxi-4-metil-benzôico N-(1-tercbutil-3,4,4-trimetil-pent-2-enil)-Ν' -(5-etil-2,3-diidro20 benzol[1,4]dioxina-6-carbonil)-hidrazida (RG115898)

2,38 g (18 mmol) de t-butil carbazato foram dissolvidos em 50 mL de CH₂C1₂ em um frasco de fundo redondo de 250 mL e resfriados até 0°C. Uma solução aquosa de K₂CO₃

181

foi preparada 4,15 g K₂CO₃/35 mL H₂0) e adicionada à mistura de reação, que foi novamente resfriada até 0°C. 3,63 g (116 mmol) de 5-etil-2,3-diidro-benzo[1,4]dioxina-6-carbonil cloreto foram dissolvidos em 40 mL de CH₂CL₂ e adicionados a partir de um funil separatório, em forma de gotas, por 15 minutos. A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 3 dias. A mistura de reação foi transferida para um funil separatório com CH₂C1₂ e H₂0. A fase de água foi totalmente extraída com CH₂C1₂. O extrato de CH₂C1₂ foi então extraído com 0,5 N HCl, seco e evaporado. O resíduo foi adicionalmente seco em um forno a vácuo para render 5,5 g de um sólido marrom de ácido Ν'-(5-etil-2,-diidrobenzo [,4]dioxina-6-carbonil)-hidrazinacarboxílico terc-butil éster. TLC (1:1 acetato de etil:hexano) deu um único ponto em Rf = 0,4 e NMR indicou um produto muito puro. RMN ¹H (CDC1₃, 500 MHz), δ (ppm) : 7,5 (br, 1H) , 7,0 (br, 1H) , 6,75 (d, 2H) , 4,28 (br, 4H) , 2,76 (m, 2H) , 1,5 (s, 9H) , 1,18 (t,

3H) .

5,15 g (16 mmol) de ácido Ν'- (5-etil-2,3-diidro20 benzo[1,4]dioxina-6-carbonil)-hidrazinacarboxílico tercbutil éster foram adicionados a um frasco de fundo redondo de 200 mL. Cerca de 20 mL de ácido trifluoroacético foram adicionados e a mistura de reação foi agitada a temperatura

182 ,/Β ambiente por 24 horas. Então, cerca de 40 mL de água foram adicionados, seguido pela adição lenta de NaOH/H₂O a 0%, com agitação, até o acido ser neutralizado (pH ~ 14) . A mistura de reação foi transferida para um funil separatório e extraída com acetato de etil sacudindo-se gentilmente (cuidado: evolução de gás). O extrato de acetato de etil foi seco e evaporado para render 5,51 g de um semi-sólido viscoso amarelo pálido. Então, o material foi colocado em um forno a vácuo a 50°C por cerca de 1 hora para render 4,62 g de ácido 5-etil-2,3-diidro-benzo[1,4]dioxina-6-carboxílico hidrazida. A divagem t-Boc é melhor conseguida com ácido trifluoroacético sem diluição, o uso de solventes adjuntivos sempre resultou em rendimentos muito menores. RMN ¹H (CDC1₃, 500 MHz) , δ (ppm) : 7,00 (br, 1H) , 6,83 (m, 1H) , 6,71 (m,

1H) , 4,28 (br s, 4H) , 2,76 (m, 2H) , 1,6 (br, 2H) , 1,17 (t, 3H) .

2,2,5,6,6-Pentametil-hept-4-en-3-ona (1,48 g, 8,1 mmol) foi dissolvido em álcool n-butil (20 mL). Então, ácido 5-etil-2,3-diidro-benzo[1,4]dioxina-6-carboxílico hidrazida (1,80 g, 8,1 mmol) e 10 gotas de ácido acético glacial foram adicionados. A mistura de reação sofreu refluxo por 20 horas (necessário para a reação completa) e foi monitorada por

183

TLC. A uma solução do ácido intermediário 5-etil-2,3-diidrobenzo [1,4]dioxina-6-carboxílico (l-terc-butil-3,4,4-trimetil -pent-2-enilideno)-hidrazida, foram adicionados 1,8 mL de ácido acético glacial e 1,02 g (16,2 mmol) de cianoboroidreto de sódio. A reação sofreu refluxo por três horas. A reação foi resfriada e 50 mL de água e NaOH a 10% foram adicionados até a reação ficar básica (pH = ca.14). A maior parte do álcool foi removida em um evaporador rotativo e o resíduo foi extraído com EtOAc. O extrato aquoso foi seco e concentrado a peso constante, rendendo 4 g de um material viscoso. 2,3 g de ácido 5-etil-2,3-diidrobenzo [1,4]dioxina-6-carboxílico puro N'- (l-terc-butil-3,4,4trimetil-pent-2-enil)-hidrazida foi obtido (óleo amarelo, Rf = 0,30 em 25% EtOAc em n-Hexano, rendimento 73%) por cromatografia de coluna em sílica gel. RMN ^ΧΗ (CDC1₃, 400

MHz), δ	(ppm): 7,42	(br, 1H), 6,80 (d, J = 8,4 Hz,	1H) , 6,71
(d,	J =	8,4 Hz, 1H)	, 6,17	(br, 1H), 5,30	(dd, J	= 0,8, 10
Hz,	1H) ,	4,33-4,29	(τη, 4H) ,	3,68 (d, J =	10 Hz,	1H), 2,80
(m,	2H) ,	1,72 (s, 3H), 1,21	(s, 3H), 1,12	(s, 9H)	, 1,05 (s,

9H) .

184

Ácido 5-etil-2,3-diidro-benzo[1,4]dioxina-6-carboxílico Ν' -(l-terc-butil-3,4,4-trimetil-pent-2-enil)-hidrazida (150 mg, 0,39 mmol) e cloreto 3,5-dimetóxi-4metilbenzoil (83 mg, 0,39 mmol) foram dissolvidos em 5 mL de CH₂C1₂. 5 mL de 25% K₂CO₃ foram adicionados e a mistura de reação foi agitada à temperatura ambiente durante a noite. A reação foi monitorada por TLC. As fases foram separadas, adicionando-se CH₂C1₂ adicional e/ou água, conforme necessário, para ajudar a manipulação. A camada de CH₂C1₂ foi seca e o solvente foi removido em vácuo para fornecer 210 mg de produto cru. Este material foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel, eluindo com um gradiente de etapa de 10-25% acetato de etil em hexano para render ácido 3,5-dimetóxi-4-metil-benzóico N'-(1-terc-butil3,4,4-trimetil-pent-2-enil)-Ν' -(5-etil-2,3-diidro-benzo[1,4] dioxina-6-carbonil)-hidrazida RG115898 (83 mg, R_f=0,19 em

25% acetato de etil em n-hexano, rendimento 38 %) . RMN ^TH (400 MHz, DMSO-d6), δ (ppm): 10,19 (s, 1H) , 6,75 (d, J = 8,0 Hz, 1H) , 6,69 (s, 2H) , 6,61 (d, J = 8,0 Hz, 1H) , 5,43 (d, J = 10,0 Hz, 1H) , 5,41 (d, 14,4 Hz, 1H) , 4,30-4,20 (m, 4H) ,

3,80 (s, 6H), 2,21-2,15 (m, 1H), 2,01 (s, 3H), 1,81 (m, 1H), 1,76-1,64 (m, 1H) , 1,06 (s, 9H) , 1,00 (s, 9H) , 0,70 (t, J =

7,6 Hz, 3H).

Preparação de ácido 3,5-dimetil-benzóico N-(1-terc-butilpentil)-N'-(4-etil-benzoil)-hidrazida (RG-115840)

OH O

185

2,2-dimetil-heptano-3-ol (0,23 mol) foi dissolvido em 3 50 mL de CH₂C1₂ em um frasco de fundo redondo de 500 mL com uma barra de agitação magnética. O frasco foi parcialmente resfriado com gelo. 76,6 g (0,355 mol) de clorocromato de peridíneo foram adicionados, ao mesmo tempo em que se agitava vigorosamente. A reação virou negra e aqueceu lentamente. A mistura de reação foi agitada a temperatura ambiente por 24 horas. A solução foi decantada da borra negra, que foi lavada com hexano. Os extratos orgânicos foram combinados e cromatografados diretamente em sílica gel. (Nota: descobriu-se que apenas a sílica aprisionava e removia os compostos de cromo não reagidos reduzidos). O produto 2,2-dimetil-heptano-3-ona, eluído com CH₂Cl₂/hexano em uma fração subseqüente de acetato de etil 10%/hexano para render 29,19 g de produto a 88% de rendimento. RMN ^XH (CDC1₃, 500 MHz) , δ (ppm) : 2,48 (t, 2H) , 1,54 (m, 2H), 1,28 (m, 2H), 1,13 (s, 9H), 0,90 (m, 3H).

Preparação de ácido 4-etil-benzóico N'- (1-terc-butilpentil)-hidrazida

Ácido	4-etil-benzóico hidrazida (1,64 g, 10 mmol)
foi dissolvido	em	12,5 mL de	metanol. Uma gota de	acido
acético foi então	adicionada,	seguida por 1,55 g de	2,2-

dimetil-heptano-3-ona. A mistura foi agitada a temperatura

186

Τϋ ambiente por diversos dias, tempo em que 2,1 mL de ácido acético e 667 mg de NaBH₃CN foram adicionados. Após agitação por ca. 7 horas, o metanol foi removido em vácuo. O produto residual foi diluído com ca. 20 mL de água e extraído com cloreto de metileno. Os extratos foram secos em MgSO₄, filtrado dos sólidos e o solvente foi removido em vácuo para fornecer 1,8 g de produto cru. Este material foi purificado por cromatografia de coluna em sílica gel, eluindo com um gradiente de 100% de hexanos - 100% de éter etil. Ácido 4etil-benzóico N'- (1-terc-butil-pentil)-hidrazida foi recuperado em 45% de rendimento (1,32 g).

Ácido 4-etil-benzóico N'-(1-terc-butil-pentil)hidrazida (14,5 mg, 0,5 mmol) foi dissolvido em 5 mL de cloreto de metileno e 1,5 mmol de PS-NMM (804 mg, uma resina de poliestireno funcionalizada com -SO₂NH (CH₂) ₃-morfolina, disponibilizada em Argonaut Technologies, San Carlos, CA) foi adicionado. A mistura foi diluída com 3 mL de cloreto de metileno para gerar uma suspensão agitável, foi adicionado cloreto 3,5-dimetilbenzoil (0,5 mmol, 74 mL) e a mistura foi agitada durante toda a noite. No dia seguinte, 1 mmol (77 5 mg) de resina AP-NCO (resina funcionalizada por isocianato, disponível em Argonaut Technologies, San Carlos, CA) e 1

187

mmol (401,6 mg) de resina AP-trisamina (poliestirenoCH₂NHCH₂CH₂NH (CH₂CH₂NH₂) 2, disponível em Argonaut Technologies, San Carlos, CA) foi adicionado com 3 mL de cloreto de metileno para limpar o material inicial remanescente. A mistura foi agitada por 4 horas, as resinas foram filtradas e o filtrado foi seco para fornecer 191 mg de produto cru, que indicou um ponto por análise TLC. Este material foi purificado por cromatografia instantânea em sílica gel usando um gradiente de 100% hexano - 100% etil éter.

Rendimento: 50 mg (ca. 23%) ácido 3,5-dimetil-benzóico N-(lterc-butil-pentil)-N'-(4-etil-benzoil)-hidrazida. RMN ¹H (CDC1_3í 400 MHz), Ô (ppm): 7,8+7,5 (br/br, 1H), 7,4-6,9 (m,

7H) , 4,7 + 3,6 (m/m, 1H) , 2,65 (m, 2H) , 2,38+2,28 (s/s, 6H) , 1,9+1,75 (br, 2H), 1,4-1,2 (br, m, 7H), 1,1 (br s, 9H), 0,95 (br s, 3H) .

Relatório de Ensaios: As células foram colhidas 40 horas após a adição de ligantes. 125 gL de tampão de lise (parte de sistema de relatório de ensaio de Dual-luciferase™ da Promega Corporation) foram adicionados a cada poço da placa de 24 poços. As placas foram colocadas em um sacudidor rotativo por 15 minutos. Vinte gL de lisato foram ensaiados. A atividade da luciferase foi medida usando sistema de relatório de ensaio Dual-luciferase™ da Promega Corporation, seguindo as instruções do fabricante. As atividades de indução de dobra (FI) foram calculadas dividindo-se as unidades de luz relativas (RLU - Relative Light Unit) nas células tratadas com ligante com RLU em células tratadas com CMSO (controle não tratado).

/97

188

EXEMPLO 3

Este exemplo descreve a identificação de mutantes de substituição do domínio de ligação do ligante CfEcR que são geralmente responsivos a ecdisteróides que exibem maior atividade em resposta a ecdisteróides. Em um esforço para identificar as mutações de substituição no CfEcR que aumentam a atividade de ecdisteróides, os requerentes fizeram a mutação de resíduos de aminoácidos e criaram fitas de expressão de gene GAL4/mutanteCfEcR-DEF cDNA, conforme descrito no Exemplo 1 acima usando o kit de mutagênese direcionado a sitio mediado por PCR. Os DNAs com mutação e WT correspondentes às diversas construções de comutação resumidas acima no Exemplo 1.1 e 1.2 foram feitos e testados em um relatório de ensaio de luciferase acionado por GAL4, conforme descrito no Exemplo 2.

Foram identificados resíduos de aminoácidos específicos que, quando substituídos, rendem um receptor de ecdisone mutante que exibe maior atividade em resposta a um ligante ecdisteróide. O efeito de uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 119 de SEQ ID NO: 1 sobre a atividade do receptor CfEcR-DEF com mutação é apresentada na Tabela 3a, como um aumento com relação à atividade de GAL4/tipo selvagem CfEcR-DEF (WT). O efeito de uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 96 de SEQ ID NO: 1 e substituição dupla de aminoácido em resíduos de amina 96 e 119 sobre a atividade do receptor CfEcR-DEF é apresentada na Tabela 3b como EC₅₀ e indução de dobra máxima relativa. Os EC_50s foram calculados a partir de

189 /93 dados de resposta de dose usando um modelo logístico de três parâmetros. Max FI relativo foi determinado como a indução máxima de dobra do ligante testado (uma modalidade da invenção) observada em qualquer concentração relativa à indução de dobra máxima de ligante GS®-E (RG-102240; ácido 3,5-dimetil-benzóico N-terc.butil-N-(2-etil-3-metóxi-benzoil) -hidrazida) observada em qualquer concentração.

Tabela 3a

Mutante CfEcR-DEF que mostra atividade aumentada de ecdisteróide.

Aumento de dobra sobre WT

	N119F
1,6 nM ligante GS®-E (RG-102240)	1,22
8 nM ligante GS®-E (RG-102240)	0,73
40 nM ligante GS®-E (RG-102240)	0,06
200 nM ligante GS®-E (RG-102240)	0,01
1 μΜ ligante GS®-E (RG-102240)	0,08
5 μΜ ligante GS®-E (RG-102240)	0,59
1,6 nM PonA	1,33
8 nM PonA	1,7
4 0 nM PonA	9,42
200 nM PonA	6,50
1 μΜ PonA	3,00

190 /9ί/

Tabela 3b

Mutantes CfEcR-DEF que mostram maior atividade de ecdisteróide

Mutante		DAH RG- 102240	DAH RG- 101691	DAH RG- 102362	THQ RG120499	THQ RG- 120500	ECD 20E	ECD PonA
V96S	EC50 (μΜ)	1,14	0,87	2,07	>33	>33	>33	-2
V96S	Rei Max FI	1	0,9	0,57	0	0	0,02	0,92
N119F/V96T	EC50 (μΜ)	-8	3,63	-10	-20	>33	-8	-0,3
N119F/V96T	Rei Max FI	1	0,13	0,19	0,1	0,02	0,46	2,02

Conforme visto nas Tabelas 3a e 3b, a atividade de ecdisteróides foi aumentada de maneira significativa quando o domínio de ligação do ligante CfEcR sofreu mutação nos resíduos de aminoácidos 96 ou 119 de SEQ ID NO: 1 e mutação dupla nos resíduos de aminoácidos 96 e 119 de SEQ ID NO: 1, indicando que estes resíduos são resíduos importantes no pacote de ligação do ligante de CfEcR.

EXEMPLO 4

Este exemplo descreve a identificação de mutantes de substituição de domínio de ligação do ligante CfEcR adicionais que geralmente não respondem a diacilidrazinas não ecdisteróides que exibem grande atividade em resposta a ligantes de diacilidrazina. Em um esforço para identificar mutações de substituição em CfEcR que aumentem a atividade do ligante diacilidrazina, os requerentes fizeram a mutação de resíduos de aminoácidos previstos como críticos para a ligação de ecdisteróides e criaram fitas de expressão de

191 gene GAL4/mutanteCfEcR-DEF cDNA, conforme descrito no Exemplo 1 acima usando kit de mutagênese direcionado ao sítio mediado por PCR. Os que sofreram mutação e os WT cDNAs correspondentes às diversas construções comutadas resumidas .5 acima nos Exemplos 1.1 e 1.2, foram feitos e testados em ensaios de relatório de luciferase acionada por GAL4, conforme descrito no Exemplo 2.

Foram identificados resíduos de aminoácidos específicos que, quando substituídos, rendem receptores de ecdisona mutantes que exibem maior atividade em resposta a ligantes diacilidrazina não ecdisteróides. O efeito de uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 48, 52,

54, 109, 110, 125, 132 e 223 de SEQ ID NO: 1 e uma substituição dupla nos resíduos de aminoácido 52 e 110 de

SEQ ID NO: 1 sobre a atividade do receptor CfEcR-DEF que sofreu mutação é apresentado nas Tabelas 4a e 4b como EC₅₀ e indução de dobra máxima relativa. Os EC₅₀s foram calculados a partir de dados de resposta de dose usando um modelo de logística de três parâmetros. FI Max Relativo foi determi20 nado como a indução de dobra máxima do ligante testado ( uma modalidade da invenção) observada em qualquer concentração relativa à indução de dobra máxima de ligante GS®-E (ácido 3,5-dimetil-benzóico N-terc-butil-N'-(2-etil-3-metóxi-benzoil)hidrazida observado em qualquer concentração.

192 /55

Tabela 4a.

Mutantes CfEcR que mostram maior atividade do ligante diacilidrazina

Mutante		DAH	DAH	DAH	THQ	THQ	ECD	ECD
RG- 102240	RG- 101691	RG- 102362	RG- 120499	RG- 120500	20E	PonA
A110E	EC50(μΜ)	0,59	0,85	1,02	>33	>22	>22	~10
A110E	Rei Max FI	1	1,02	0,78	0	0,01	0	1,09
A110N	EC50	1,41	0,88	0,72	>23>	>33	>33	>33
A110N	Rei Max FI	1	0,99	0,86	0	0	0	0
F109M	EC50(μΜ)	0,66	0,65	0,82	>33	-20	>33	-20
F109M	Rei Max FI	0,55	0,67	0,77	>33	>33	>33	>33
A11OP	Rei Max FI	1	0,89	0,64	0	0	0	0
F48Y	EC50 (μΜ)	1,27	0,93	0,59	>33	>33	>33	-10
F48Y	Rei Max FI	1	0,69	0,48	0	0	0	0
F48W	EC50 (μΜ)	-1	1,53	0,77	>33	>33	>33	-10
F48W	Rei Max FI	1	0,74	0,51	0	0	0	0,65
F48L	EC50 (μΜ)	0,46	0,3	0,56	>33	>33	>33	-10
F48L	Rei Max FI	1	0,81	0,53	0	0	0	0,59
M54T	EC50 (μΜ)	0,08	0,03	0,05	>33	>33	>33	9,46
M54T	Rei Max FI	1	0,71	0,66	0	0	0	0,5
T52L	EC50 (μΜ)	-0,5	0,21	0,33	>33	>33	>33	5,03
T52L	Rei Max FI	1	0,74	0,61	0	0	0	0,54
T52V/A110P	EC50 (μΜ)	0,33	0,24	0,32	>33	>33	>33	>33
T52V/A110P	Rei Max FI	1	0,66	0,94	0	0	0	0

Tabela 4b ⁵ Mutantes CfEcR que mostram maior atividade do ligante diacilidrazina

Mutante		RG- 102240	RG- 115840	RG- 115853	RG- 115855	RG- 115859	RG- 115898
F48R	EC50 (μΜ)	7,23	3m58	0,1	5,18	9,41	>33
F48R	Rei Max FI	1	2,65	5,71	1,02	1,25	0
L132E	EC50 (μΜ)	0,41	1,67	1,54	0,45	0,08	2,15
L132E	Rei Max FI	1	1,56	1,12	1,15	0,51	0,34

193 /9

Τ'

M125I	EC50 (μΜ)	1,36	3,02	1,53	2	0,28	>33
M125I	Rei Max FI	1	0,45	0,54	0,69	0,76	0
L223Y	EC50 (μΜ)	3,15	0,58	0,65	0,3	1,27	0,33
L223Y	Rei Max FX	1	1,42	. 0,77	1,6	0,79	0,2
M125G	EC50 (μΜ)	14,17	2,97	0,14	0,08	5	0,08
M125G	Rei Max FI	1	47,96	39,41	46,54	3,14	28,81
M125N	EC50 (μΜ)	9,88	3,3	0,5	0 . >33	8	0,94
M125N	Rei Max FI	1	22,56	11,64	25,3	4,11	11,57

Conforme visto nas Tabelas 4a e 4b, a atividade de diacilidrazinas foi aumentada de maneira significativa quando o domínio de ligação do ligante CfEcR foi mudado em resíduos de aminoácidos 48, 52, 54, 109, 110, 125, 132 e 223 de SEQ ID NO: 1 e duplamente mudados nos resíduos de aminoácidos 52 e 110 de SEQ ID NO: 1, indicando que estes resíduos são importantes no pacote de ligação do ligante de

CfEcR.

EXEMPLO 5

Este exemplo descreve a identificação de mutantes de substituição de domínio de ligação de ligante CfEcR que são geralmente diacilidrazina e responsivos a ecdisteróide que exibem maior atividade em resposta a ligante diacilidrazina e ecdisteróide. Em um esforço para identificar mutações de substituição em CfEcR que aumentem a atividade do ligante diacilidrazina e atividade do ligante ecdisteróide, os requerentes realizaram mutação em resíduos de aminoácidos e (22

194 criaram fitas de expressão de gene GAL4/mutanteCfEcR-DEF cDNA conforme descrito no Exemplo 1 acima usando kit de mutagenese direcionado ao sítio mediado por PCR. Os mudados e os WT cDNAs correspondentes às diversas construções de comutação resumidas acima nos Exemplos 1.1 e. 1.2 foram feitos e testados em ensaios de relatório de luciferase acionado por GAL4, conforme descrito no Exemplo 2. 0 efeito de uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 109, 132, 238 de SEQ ID NO: 1 ou substituição de resíduos de aminoácido 52, 107 e 127 de SEQ ID NO: 1 ou 107, 127 e adição de uma glicina na extremidade de SEQ ID NO: 1 sobre a atividade do receptor CfEcR-DEF que sofreu mutação, é apresentado na Tabela 5.

Tabela 5

Mutantes CfEcR que mostram atividade de diacilidrazina e ecdisteróide aumentada

Mutante		DAH	DAH	DAH	THQ	THQ	ECD	ECD
RG- 102240	RG- 101691	RG- 102362	RG- 120499	RG- 120500	20E	PonA
F109W	EC50 (μΜ)	0,61	0,49	1,41	>33	>33	>33	4,06
F109W	Rei Max FI	1	0,79	0,7	0,01	0,01	0	0,08
V107I/Y127E/T52V	EC50 (μΜ)	0,06	0,02	<0,01	>33	>33	>33	~1
V107I/Y127E/T52V	Rei Max FI	1	0,88	0,73	0	0	0,04	0,67
V107I/Y127E/G	EC50 (μΜ)	0,17	0,02	0,06	>33	>33	>33	1,65
V107I/Y127E/G	Rei Max FI	1	0,85	0,81	0	0	0,03	0,67
L132M	EC50 (μΜ)

/99

195

L132M	Rei Max FI	0,77 1	0,51 0,77	0,13 0,66	>33 0,01	>33 0,04	>33 0	5,47 0,57
L132V	EC50 (|1M)	2,32	0,66	0,29	>33	>33	>33	6,56
L132V	Rei Max FI	1	0,77	0,74	0,01	0,04	0	0,57
W238P	EC50 (μΜ)	-0,4	0,65	0,29	>33	>33	>33	>33
W238P	Rei Max FI	1	0,91	0,4	0,01	0,01	0	0,73

Conforme visto na Tabela 5, as atividades de diacilidrazina e de ecdisteróide foram aumentadas quando o domínio de ligação do ligante CfEcR foi mudado em resíduos de aminoácido 48, 51, 52, 54, 96, 120, 125, 128, 132, 234 e 238, indicando que estes resíduos são importantes no pacote de ligação do ligante CfEcR.

EXEMPLO 6

Este Exemplo descreve a identificação de mutantes de substituição de domínio de ligação de ligante CfEcR que são geralmente responsivos a diacilidrazina e tetraidroquinilina que exibem atividade aumentada em resposta a ligantes de diacilidrazina e tetraidroquinolina. Em um esforço para identificar mutações de substituição em CfEcR que aumentem a atividade do ligante diacilidrazina e atividade do ligante tetraidroquinolina, os requerentes realizaram a mutação de resíduos de aminoácidos previstos e criados fitas de expressão de gene GAL4/mutanteCfEcR-DEF cDNA, conforme descrito no Exemplo 1, usando kit de mutagênese direcionada a sítio mediada por PCR. Os mudados e os WT cDNAs correspondentes às diversas construções de comutação resumidas acima no Exemplo 1.1 e 1.2 foram feitas e testadas

196 em ensaios de relatório de luciferase acionada por GAL4, conforme descrito no Exemplo 2. O efeito de mutações triplas em resíduos de aminoácidos 107, 110 e 127 de SEQ ID NO: 1 e mutações duplas em 107 e 127 de SEQ ID NO: 1 sobre a atividade do receptor CfEcR-DEF é apresentado na Tabela 6.

Tabela 6

Mutantes CfEcR que mostram maior atividade de diacilidrazina e tetraidroquinolina

Mutante		1 DAH RG- 102240	2 DAH RG- 101691	3 DAH RG- 102362	4 THQ RG- 120499	5 THQ RG- 120500	6 ECD 20E	7 ECD PonA
V107I/Y127E/A110P	EC50 (μΜ)	0,30	0,34	0,10	~20	3,71	>33	>33
V107X/Y127E/A11)P	Rei Max FI	1,00	0,96	0,63	0,08	0,16	0,00	0,01
V128F/A110P	EC50 (μΜ)	~8	~5		0,45	0,28	>33	>33
V128F/A110P	Rei Max FI	1,00	0,08		0,51	0,68	0,00	0,00

Conforme visto na Tabela 6, as atividades de 10 diacilidrazina e tetraidroquinolina não ecdisteróides foram aumentadas quando o domínio de ligação do ligante CfEcR foi mudado nos resíduos de aminoácido 107, 110 e 127 e 107 e

127, indicando que estes resíduos são importantes no pacote de ligação do ligante de CfEcR.

EXEMPLO 7

A Tabela 7 descreve o efeito do ligante diacilidrazina GS™ versus o controle DMSO em diversas concentrações sobre a indução de dobra máxima de diversos mutantes CfEcR.

197

Tabela 7

Efeito de ligante GS™-E v. Controle DMSO sobre a indução de dobra máxima de mutantes CfEcR.

Mutante	ligante GS™-E max Fl (relativo a DMSO)	Concentração (mM) em Fl Max
A110E	4926	10,00
A110N	1678	10,00
A110W	5207	10,00
F109W	3063	10,00
F109P	1	10,00
F109L	20	33,3-
F109M	1475	3,3
F109N	1506	33,3
F48Y	1355	33,3
F48W	1638	33,3
F48L	2599	33,3
I51N	1	33,30
I51L	2478	33,30
L132M	1517	10,00
L132N	785	33,30
L132V	2128	10,00
L234M	4578	33,30
L234I	2650	10
M125P	1	33,3
M125R	2407	33,3
M125C	9	33,3
M54W	1678	10
M54T	4460	10,00
M92L	1203	33,30
M92E	141	33,30
R95H	3413	33,30
R95M	1691	33,30
R95W	1820	33,30
T52L	1128	33,3
T52E	1537	33,3
V96L	4378	10

198

V96W	615	33,3
V96S	1828	33,3
W238P	4812	10
W238E	1018	33,3
W238Y	11	33,3
Y120W	1889	33,3
Y120M	1708	33,3
N119F/V96T	1738	33,3
V107I/Y127E	3146	10
V107I/Y127E/A110P	2212	10
M125E	1196	33,3
M125L	2250	33,3
T52P	301	33,3
V96E	2962	33,30
A110P	2289	3,3
V128F/A110P	2960	33,30
V128F	550	33,30

EXEMPLO 8

Este exemplo descreve a identificação de mutantes de substituição de domínio de ligação de ligante CfEcR que exibem menor atividade em resposta a ligantes diacilidrazina.

Em um esforço para identificar mutações de substituição em CfEcR que diminuam a atividade do ligante diacilidrazina, os requerentes realizaram mutação de resíduos de aminoácidos que são críticos na ligação de diacilidrazina e criaram cassetes de expressão de gene GAL4/mutanteCfEcR-DEF cDNA, conforme descrito no exemplo 1 usando kit de mutagênese direcionada a sítio mediada por PCR. Os mudados e os WT cDNAs correspondentes às diversas construções de comutação resumidas acima no exemplo 1.1 e 1.2 foram feitos e testados em ensaios de relatório de luciferase acionada por GAL4, conforme descrito no Exemplo 2. O efeito de uma substituição

199 de aminoácido nos resíduos de aminoácido 48, 51, 52, 54, 92, 95, 96, 109, 120, 125, 219, 223, 234 ou 238 de SEQ ID NO: 1 sobre a atividade do receptor CfEcR-DEF mudado é apresentado nas Tabelas 8a e 8b.

Tabela 8a

Mutantes CfEcR que mostram atividade reduzida de diacilidrazina

Mutante		DAH	DAH	DAH	THQ	THQ	ECD	ECD
RG- 102240	RG- 101691	RG- 102362	RG- 120499	RG- 120500	20E	PonA
M92L	EC50 (μΜ)	-8	9,9	-20	>33	>33	>33	>33
M92L	Rei Max FI	1	0,41	0,05	0	0	0	0
M92E	EC50 (μΜ)	-8	-20	>33	>33	>33	>33	>33
M92E	Rei Max FI	1	0,08	0,04	0	0	0	0,01
R95W	EC50 (μΜ)	-7	-10	-8	>33	>33	>33	>33
R95W	Rei Max FI	1	0,37	0,25	0	0	0	0
T52E	EC50 (μΜ)	-7	-7	7,16	>33	>33	>33	>33
T52E	Rei Max FI	1	0,57	0,34	0	0	0	0
W23 8E	EC50 (μΜ)	-6	-8	3,45	>33	>33	>33	>33
W238E	Rei Max FI	1	0,71	0,45	0	0	0	0
Y120M	EC50 (μΜ)	-4	-10	-10	>33	>33	>33	>33
Y120M	Rei Max FI	1	0,3	0,13	0	0	0	0,04
151L	EC50 (μΜ)	3,2	2,28	3,35	>33	>33	>33	-8
151L	Rei Max FI	1	0,88	0,53	0	0	0	0,66

200

V96W	EC50 (μΜ)	-1	3,61	3,26	>33	>33	>33	>3
V96W	Rei Max FI	1	0,75	0,38	0	0,01	0	0,83
Y120W	EC50 (μΜ)	4,21	9,76	4,96	>33	>33	>33	-10
Y120W	Rei Max FI	1 ·	0,89	0,67	0,02	0,01	0	0,69
W238Y	EC50 (μΜ)	-13	>33	>33	>33	>33	>33	>33
W238Y	Rei Max FI	1	0,3	0,06	0,13	0,1	0,18	0,07
F109N	EC50 (μΜ)	2,7	3,95	1,85	>33	>33	>33	>33
F109N	Rei Max FI	1	0,85	0,4	0	0	0	0
L234M	EC50 (μΜ)	1,43	1,79	2,04	>33	>33	>33	>33
L234M	Rei Max FI	1	0,77	0,43	0	0	0	0,02
M125E	EC50 (μΜ)	-2	0,98	0,83	>33	>33	>33	>33
M125E	Rei Max FI	1	0,53	0,4	0	0	0	0
V96E	EC50 (μΜ)	-2	1,62	1,86	>33	>33	>33	>33
V96E	Rei Max FI	1	0,81	0,48	0	0	0,	0,02
F48N	EC50 (μΜ)	0,75	1,73	1,68	>33	>33	>33	-20
F48N	Rei Max FI	1	0,88	0,66	0	0	0	0,17
L234I	EC50 (μΜ)	0,77	0,94	2,46	>33	>33	>33	-7
L234I	Rei Max FI	1	0,73	0,44	0	0,01	0	0,56
M54W	EC50 (μΜ)	1,17	1,63	1,24	>33	>33	>33	-10
M54W	Rei Max FI	1	0,75	0,44	0,01	0,01	0	0,46
V96L	EC50 (μΜ)	-1	1,68	2,67	>33	>33	>33	7,49
V96L	Rei Max FI	1	0,62	0,58	0	0	0	0,49

201

Tabela 8b

Mutantes CfEcR que mostram atividade reduzida de diacilidrazina.

Mutante		RG- 102240	RG- 115840	RG- 115853	RG- 115855	RG- 115859	RG- 115898
I51M	EC50 (μΜ)	3,94	4,13	2,94	1,33	2	>33
Rei Max FI	1	0,27	0,46	0,84	1,07	0,02
L234R	EC50 (μΜ)	17,1	20	>33	>33	20	>33
Rei Max FI	1	2,24	0,2	0,21	3,8	0,58
L234W	EC50 (μΜ)	11,48	>33	>33	6	5	>33
Rei Max FI	1	0,06	0,07	0,44	0,42	0,02
M219A	EC50 (μΜ)	2,9	2,87	3,65	1,44	3,18	1
Rei Max FI	1	0,6	0,79	0,86	0,85	0,05
L223K	EC50 (μΜ)	3,93	1	2,5	1,23	0,38	0,28
Rei Max FI	1	0,93	0,54	0,87	0,9	0,18
M125V	EC50 (μΜ)	1,64	3,79	1,72	2	1	>33
Rei Max FI	1	0,47	0,5	0,74	0,87	0,01
M219K	EC50 (μΜ)	2,9	>33	3,31	1,93	5	>33
Rei Max FI	1	0,01	0,22	0,34	0,66	0
M219W	EC50 (μΜ)	3,35	2,33	-20	2	4	>33
Rei Max FI	1	0,39	0,12	0,34	0,46	0
M219Y	EC50 (μΜ)	0,82	1	-20	2	2	>33
Rei Max FI	1	0,68	0,05	0,32	0,51	0,01

202

T52M	EC50 (μΜ)	6,74	5	1,36	10	3,56	>33
Rei Max FI	1	0,15	0,32	0,66	1,08	0,01
T52R	EC50 (μΜ)	6,69	>33	5	3,31	6,14	>33
Rei Max FI	1	0,02	0,06	0,2	0,41	0
W238L	EC50 (μΜ)	11,13	2	>33	2	5	>33
Rei Max FI	1	0,41	0,02	0,09	1,08	0
V238M	EC50 (μΜ)	10,47	2	>33	2	1,85	>33
Rei Max FI	1	0,41	0,05	0,72	16,07	0,03
F48K	EC50 (μΜ)	11,09	3,76	4,42	2,45	>33	>33
Rei Max FI	1	0,18	0,71	4,78	0,02	0,08
T52G	EC50 (μΜ)	3,52	3,61	3,35	2	6,49	>33
Rei Max FI	1	0,23	0,28	0,31	0,44	0,01
T52Q	EC50 (μΜ)	2,95	2	>33	0,56	1,11	20
Rei Max FI	1	0,34	0,04	0,39	1,02	0,08
L223R	EC50 (μΜ)	8,69	2	2	1,2	5,19	>33
Rei Max FI	1	0,25	0,09	1,35	0,61	0,01

Conforme visto nas Tabelas 8a e 8b, a atividade de diacilidrazinas foi reduzida de maneira significativa quando o domínio de ligação do ligante CfEcR sofreu mutação nos resíduos de aminoácido 48, 51, 54, 92, 95, 96, 109, 120,

125, 219, 223, 234 ou 238 de SEQ ID NO: 1, indicando que estes resíduos são resíduos importantes no pacote de ligação

203 do ligante de CfEcR.

EXEMPLO 9

Este exemplo descreve a identificação de mutantes de substituição de domínio de ligação de ligante CfEcR que geralmente respondem a tetraidroquinolina e que exibem atividade aumentada em resposta a ligantes de tetraidraquinolina. Em um esforço para identificar as mutações de substituição em CfEcR que aumentam a atividade do ligante tetraidraquinolina, os requerentes realizaram mutação de resíduos de aminoãcidos específicos e criaram cassetes de gene GAL4/mutanteCfEcR-DEF cDNA, conforme descrito no exemplo 1 usando kit de mutagênese direcionada ao sítio mediada por PCR. Os que sofreram mutação e os WT cDNAs correspondentes às diversas construções de comutação resumidas acima no Exemplo 1.1 e 1.2 foram feitos e testados em ensaios de relatório de luciferase acionado por GAL4, conforme descrito no Exemplo 2. O efeito de uma substituição de aminoácido no resíduo de aminoácido 110 ou 128 da SEQ ID NO: 1 ou a substituição dupla de aminoácido nos resíduos de aminoácido 110 e 128 de SEQ ID NO: 1 sobre a atividade do receptor CfEcR-DEF que sofreu mutação, é apresentado na

Tabela 9.

204

Tabela 9

Mutantes CfEcR que mostram atividade de tetraidraquinolina reduzida

Mutante		DAH	DAH	DAH	THQ	THQ	ECD	ECD
RG- 102240	RG- 101691	RG- 102362	RG- 120499	RG- 120500	20E	PonA
A110W	EC50 (μΜ)	1,37	1,06	2,99	-10	-5	>33	>33
A110W	Rei Max FI	1	0,8	0,55	0,06	0,07	0	0,01
V128F	EC50 (μΜ)	>33	-8,3, 5,4	>33	>33	~10	-10	>33
V128F	Rei Max FI	0	0,04	2,34	0,05	1	0,02	0,03
V128F/A110P	EC50 (μΜ)	-8	-5		0,45	0,28	>33	>33
V128F/A110P	Rei Max FI	1	0,08		0,51	0,68	0	0

Conforme visto na Tabela 9, a atividade de tetraidraquinolinas foi aumentada de maneira significativa quando o domínio de ligação do ligante CfEcR foi mudado nos resíduos de aminoácido 110 ou 12 8 de SEQ ID NO: 1 ou duplamente mudados em resíduos de aminoácidos 110 e 128 de SEQ ID NO: 1, indicando que estes resíduos são resíduos importantes no pacote de ligação do ligante de CfEcR.

EXEMPLO 10

Este exemplo descreve a identificação de mutantes de substituição de domínio de ligação do ligante CfEcR que respondem de maneira diferenciada a ligantes de diacilidrazina. Estes mutantes exibem uma diminuição geral na atividade da diacilidrazina; no entanto, eles respondem seletivamente a um ligante diacilidrazina específico. Em um

205 esforço para identificar mutações de substituição em CfEcR, os requerentes realizaram mutação de resíduos de aminoácidos específicos e criaram cassetes de expressão de gene GAL4/ mutanteCfEcR-DEF cDNA, conforme descrito no exemplo 1 usando kit de mutagênese direcionada a sítio mediada por PCR. Os mudados e os WT cDNAs correspondentes às diversas construções de comutação resumidas acima no exemplo 1.1 e 1.2 foram feitos e testados em ensaios de relatório de luciferase acionada por GAL4, conforme descrito no Exemplo 2. O efeito de uma substituição de aminoácido nos resíduos de aminoácido 52, 95, 109, 125, ou 132 de SEQ ID NO: 1 sobre a atividade do receptor CfEcR mudado é apresentado nas Tabelas 10a e

10b.

Tabela 10a

Mutantes CfEcR que mostram atividade de diacilidrazina diminuída e atividade aumentada em resposta a diacilidrazina

RG-115855.

Mutante		RG- 102240	RG- 101691	RG- 102362	RG- 115855	RG- 120499	RG- 120500	20E	PonA
F109L	EC50 (μΜ)	-2	2,34	~2,5	1,73	>33	>33	>33	>33
F109L	Rei Max FI	1	0,68	0,17	1,01	0,03	0,02	0,09	0,03
L132M	EC50 (μΜ)	-12	-20	>33	0,39	>33	>33	>33	>33
L132M	Rei Max FI	1	0,08	0,01	0,90	0	0	0,01	0,01
R95H	EC50 (μΜ)	1,58	3,9	3,49	0,78	>33	>33	>33	>33
R95H	Rei Max FI	1	0,96	0,62	0,68	0	0	0	0,03
R95M	EC50 (μΜ)	2,76	3,3	4,28	3,74	>33	>33	>33	>33

206

R95M	Rei Max PI	1	0,57	0,27	0,33	0	0,01	0	0
M125L	EC50 (μΜ)	-10	>33	>33	0,16	>33	>33	>33	>33
M125L	Rei Max FI	1	0	0,01	2,15	0	0	0	0
T52P	EC50 (μΜ)	-10	>33	-6	3,87	>33	>33	>33	>33
T52P	Rei Max FI	1	0,02	0,11	1,93	0,03	0,03	0,02	0,03
M125W	EC50 (μΜ)	3,49	4,94	3,5	0,03	>33	>33	>33	>33
M125W	Rei Max FI	1	0,74	0,44	1,24	0	0	0	0
M125R	EC50 (μΜ)	3,7	-10	10,38	0,02	>33	>33	>33	-8
ml25R	Rei Max FI	0	0,01	0	1,39	0		0,01	0
M125C	EC50 (μΜ)	-8,>33	33	33	0,58	33	33	33	33
M125C	Rei Max FI	1	0,62	0,15	876,58	0,27	0,14	0,22	0,28
M125P	EC50 (μΜ)	>33	>33	>33	0,45	>33	>33	>33	>33
M125P	Rei Max FI	1	5,25	0,78	380,86	0,65	1,3	1,29	0,7

Tabela 10b

Mutantes CfEcR que mostram atividade de RG-102240 diacilidrazina reduzida e atividade aumentada em resposta a outras diacilidrazinas.

Mutante		RG- 102240	RG- 115840	RG- 115853	RG- 115855	RG- 115859	RG- 115898
M125S	EC50 (μΜ)	12,33	1,4	0,98	0,11	7,26	0,33
Rei Max FI	1	22,73	15,97	25,22	6,39	16,98
T52W	EC50 (μΜ)	18,33	4,07	2	0,96	7	0,18
Rei Max FI	1	30,59	89,32	49,21	2,81	4,24

207 c7//

Conforme visto nas Tabelas 10a e 10b, a atividade de diacilidrazinas foi afetada de maneira diferenciada quando o domínio de ligação do ligante CfEcR sofreu mutação nos resíduos de aminoácido 52, 95, 109, 125 ou 132 de SEQ ID

NO: 1, indicando que estes resíduos são importantes no pacote de ligação do ligante de CfEcR.

A presente invenção não deve ter seu escopo limitado pelas modalidades específicas descritas aqui. Na verdade, diversas modificações da invenção, além daquelas descritas tornar-se-ão aparentes, para aqueles que são versados na técnica, a partir da descrição anterior e das figuras em anexo. Tais modificações devem estar contidas no escopo das reivindicações anexas.

1/6

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Sistema de modulação da expressão de genes CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:

   (A) um cassete de expressão de gene que é capaz de ser expresso em uma célula hospedeira, o cassete de expressão de gene compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídio que compreende:

   i) um domínio de transativação;

   ii) um domínio de ligação a DNA que reconhece um elemento de resposta associado ao gene cuja expressão deva ser modulada; e iii) um domínio de ligação a ligante de receptor nuclear do Grupo H compreendendo pelo menos uma mutação, em que a sequência codificadora de tal domínio de ligação compreende a SEQ ID n° 21 contendo pelo menos uma mutação nas posições 385-387, 556-558 e 604-606, em que a mutação é selecionada do grupo que consiste em ACA a CCT, CCC, CCA ou CCG para nucleotídeos 385-387 da SEQ ID NO: 21, de TTC a TTA, TTG, CTT, CTC, CTA ou CTG para nucleotídeos 556-558 da SEQ ID NO: 21, e de ATG a CCT, CCC, CCA, CCG, AGA, AGG, CGT, CGC, CGA, CGG, TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG, TGT, TGC ou TGG para nucleotídeos 604606 da SEQ ID NO: 21; ou (B) um sistema de modulação de expressão de genes compreendendo:

   a) um primeiro cassete de expressão de gene que é capaz de ser expresso em uma célula hospedeira, compreendendo um polinucleotídeo que codifica um primeiro polipeptídio compreendendo:

   i) um domínio de ligação a DNA que reconhece um elemento de resposta associado a um gene cuja expressão deva ser modulada; e ii) um domínio de ligação a ligante de receptor nuclear; e

   b) um segundo cassete de expressão de gene que é capaz de ser expresso na célula hospedeira, compreendendo um polinucleotídeo que codifica um segundo

   Petição 870170062693, de 25/08/2017, pág. 16/23
2. 2/6 polipeptídio compreendendo:

   i) um domínio de transativação; e ii) um domínio de ligação a ligante de receptor nuclear, em que um dos domínios de ligação a ligante de receptor nuclear é um domínio de ligação a ligante de receptor nuclear do Grupo H compreendendo pelo menos uma mutação, em que a sequência codificadora de tal domínio de ligação compreende a SEQ ID n° 21 contendo pelo menos uma mutação nas posições 385- 387, 556-558 e 604-606, em que a mutação é selecionada do grupo que consiste em ACA a CCT, CCC, CCA ou CCG para nucleotídeos 385-387 da SEQ ID NO: 21, de TTC a TTA, TTG, CTT, CTC, CTA ou CTG para nucleotídeos 556-558 da SEQ ID NO: 21, e de ATG a CCT, CCC, CCA, CCG, AGA, AGG, CGT, CGC, CGA, CGG, TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG, TGT, TGC ou TGG para nucleotídeos 604- 606 da SEQ ID NO: 21; ou (C) um polinucleotídeo isolado codificando um domínio de ligação a ligante de receptor nuclear do Grupo H compreendendo pelo menos uma mutação, em que a sequência codificadora de tal domínio de ligação compreende a SEQ ID n° 21 contendo pelo menos uma mutação nas posições 385-387, 556-558 e 604-606, em que a mutação é selecionada do grupo que consiste em ACA a CCT, CCC, CCA ou CCG para nucleotídeos 385-387 da SEQ ID NO: 21, de TTC a TTA, TTG, CTT, CTC, CTA ou CTG para nucleotídeos 556-558 da SEQ ID NO: 21, e de ATG a CCT, CCC, CCA, CCG, AGA, AGG, CGT, CGC, CGA, CGG, TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG, TGT, TGC ou TGG para nucleotídeos 604- 606 da SEQ ID NO: 21.

   2. Sistema de modulação da expressão de genes, de acordo com a reivindicação 1(A), CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que compreende um segundo domínio de ligação a ligante de receptor nuclear selecionado no grupo que consiste em um domínio de ligação a ligante de receptor de retinóide X de vertebrado, um domínio de ligação a ligante de receptor de retinóide X de invertebrado, um domínio de ligação a ligante de proteína ultraespiráculo e um

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3. 3/6 domínio de ligação a ligante quimérico compreendendo dois fragmentos polipeptídicos, em que o primeiro fragmento polipeptídico é de um domínio de ligação a ligante de receptor de retinóide X de vertebrado, de um domínio de ligação a ligante de receptor de retinóide X de invertebrado ou de um domínio de ligação a ligante de proteína ultraespiráculo, e o segundo fragmento polipeptídico é de um domínio de ligação a ligante de receptor de retinóide X de vertebrado, de um domínio de ligação a ligante de receptor de retinóide X de invertebrado ou de um domínio de ligação a ligante de proteína ultraespiráculo diferente.

   3. Sistema de modulação da expressão de genes, de acordo com a reivindicação 1 (A) ou 1 (B), CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio de ligação a DNA é selecionado do grupo que consiste em domínio de ligação a DNA de receptor nuclear de grupo H, receptor nuclear de hormônio esteróide/tiroide, domínio de ligação a DNA de receptor de ecdisona, domínio de ligação a DNA de GAL4 e domínio de ligação a DNA de LexA.
4. 4. Sistema de modulação da expressão de genes, de acordo com a reivindicação 1(A) ou 1(B), CARACTERIZADO pelo fato de que o domínio de transativação é selecionado do grupo que consiste em domínio de transativação de receptor de ecdisona, domínio de transativação de VP16, domínio de transativação de ativador ácido de B42, domínio de transativação de receptor nuclear de grupo H, domínio de transativação de receptor nuclear de hormônio esteróide/tiróide, domínio de transativação de poliglutamina, domínio de transativação de ácido de aminoácido ou básico, domínio de transativação de B64, domínio de transativação de NF-kB e domínio de transativação de p65.
5. 5. Sistema de modulação da expressão de genes, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, CARACTERIZADO pelo fato de que a mutação de domínio de ligação a ligante de receptor nuclear do Grupo H é de ATG a um membro selecionado do grupo consistindo de CCT, CCC, CCA, CCG, AGA, AGG, CGT, CGC,

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   4/6

   CGA, CGG, TTA, TTG, CTT, CTC, CTA, CTG, TGT, TGC ou TGG, para nucleotídeos 604-606 da SEQ ID NO: 21.
6. 6. Vetor de expressão, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende o polinucleotídeo isolado, conforme definido na reivindicação 1(C), operacionalmente ligado a um elemento regulador da transcrição.
7. 7. Célula hospedeira isolada, a qual compreende o vetor de expressão conforme definido na reivindicação 6, CARACTERIZADA pelo fato de que o elemento regulador da transcrição é operacional na célula hospedeira, em que a célula hospedeira é selecionada de uma célula de bactéria, uma célula de fungo, e uma célula de levedura.
8. 8. Célula hospedeira isolada, CARACTERIZADA pelo fato de que compreende o sistema de modulação da expressão de genes de acordo com a reivindicação 1(A) ou 1(B), em que a célula hospedeira é selecionada de uma célula de bactéria, uma célula de fungo, e uma célula de levedura.
9. 9. Método para a modulação da expressão de um gene em uma célula hospedeira, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende as etapas de:

   a) introdução na célula hospedeira do sistema de modulação da expressão de genes de acordo com a reivindicação 1 (A) ou 1(B); e

   b) introdução na célula hospedeira de um ligante; em que o gene a ser modulado é um componente de um cassete de expressão de genes compreendendo:

   i) um elemento de resposta reconhecido pelo domínio de ligação a DNA;

   ii) um promotor que é ativado pelo domínio de transativação; e iii) um gene cuja expressão deva ser modulada; em que, com a introdução do ligante na célula hospedeira, a expressão do gene de b) iii) é modulada.
10. 10. Método, de acordo com a reivindicação 9, CARACTERIZADO pelo fato de que o ligante é selecionado do grupo que consiste em:

    a) um composto de fórmula:

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    5/6 em que:

    E é uma (C4-C12) alquila ramificada ou (C4-C12) alcenila ramificada contendo um carbono terciário ou uma ciano(C3-C12) alquila contendo um carbono terciário;

    R¹ é H, Me, Et, i-Pr, F, formila, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2C CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C^CH, 1-propinila, 2-propinila, vinila, OH, OMe, OEt, ciclopropila, CF2CF3, CH=CHCN, alila, azido, SCN, ou SCHF2;

    R² é H, Me, Et, n-Pr, i-Pr, formil, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CH2OMe, CH2CN, CN, C=CH, 1-propinila, 2-propinila, vinila, Ac, F, Cl, OH, OMe, OEt, O-n-Pr, OAc, NMe2, NEt2, SMe, SEt, SOCF3, OCF2CF2H, COEt, ciclopropila, CF2CF3, CH=CHCN, alila, azido, OCF3, OCHF2, O-i-Pr SCN, SCHF2, SOMe, NH-CN, ou está unido a R³ e aos carbonos da fenila aos quais R² e R³ estão fixados para formar um etilenodióxi, um anel diidrofurila com o oxigênio adjacente a um carbono de fenila ou um anel diidropropila com o oxigênio adjacente a um carbono de fenila;

    R³ é H, Et, ou está unido a R² e aos carbonos da fenila aos quais R² e R³ estão fixados para formar um etilenodióxi, um anel diidrofurila com o oxigênio adjacente a um carbono de fenila ou um anel diidropropila com o oxigênio adjacente a um carbono de fenila;

    R⁴, R⁵, e R⁶ são independentemente H, Me, Et, F, Cl, Br, formila, CF3, CHF2, CHCl2, CH2F, CH2Cl, CH2OH, CN, C^CH, 1-propinila, 2-propinila, vinila, OMe, OEt, SMe, ou SEt;

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    6/6 em que:

    R¹ é CH2CH3, CH3, ou CH3;

    R² é OCH3, CH2CH3 ou i-Pr; e R³ e R⁴ são CH3;

    R³ é 3-F-4-CH3-Ph ou 3-CH3-4-F-Ph; ou

    d) uma ecdisona, 20-hidroxiecdisona, ponasterona A, muristerona A, um oxiesterol, um 22(R) hidroxicolesterol, 24(S) hidroxicolesterol, 25-epoxicolesterol, T0901317, 5-alfa-6-alfaepoxicolesterol-3-sulfato, 7-cetocolesterol-3-sulfato, farnesol, um ácido biliar, um éster 1,1-bifosfonato ou um hormônio III juvenil.
11. 11. Método, de acordo com a reivindicação 10, CARACTERIZADO adicionalmente pelo fato de que compreende a introdução na célula hospedeira de um segundo ligante, em que o segundo ligante é ácido 9-cis-retinóico ou um análogo sintético de um ácido retinóico.
12. 12. Organismo não humano, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 8, em que o organismo não humano é selecionado de uma bactéria, um fungo e uma levedura.

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