KR20060111539A - 항-ｅｇｆｒ 항체의 고체형 - Google Patents

항-ｅｇｆｒ 항체의 고체형 Download PDF

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주잔네 마토이스
한스-크리스티안 말러
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메르크 파텐트 게엠베하
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Abstract

본 발명은 수성 매질 중에서의 용해 또는 현탁에 의해 생물학적으로 활성인 항체 단백질을 생성시키는 EGF 수용체 (EGFR) 에 대한 항체의 고체형, 구체적으로는 EGF 수용체에 대한 단일클론 항체, 특히 바람직하게는 Mab C225 (세툭시마브) 및 Mab h425 (EMD 72000) 의 침전물 및 결정에 관한 것이다. 상기 단백질은 침전 시약에 의해서 수성 매질에 용해 또는 현탁된 항체 및/또는 이의 변종 또는 단편 중 하나를 침전시킴으로써 수득할 수 있다. 본 발명은 또한 침전된 비-결정질 형태, 침전된 결정질 형태 또는 가용성이거나 현탁된 형태인 상기 항체의 고체형 하나 이상, 및 임의적 담체 및/또는 보조적 물질 및/또는 다른 약학적 활성 성분을 함유한 약학적 제제, 및 본 발명의 항-EGFR 항체의 고체형의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

항-ＥＧＦＲ 항체의 고체형 {SOLID FORMS OF ANTI-EGFR ANTIBODIES}
본 발명은 침전 시약에 의해서 수성 매질에 용해 또는 현탁된 항체 및/또는 이의 변종 및/또는 단편 중 하나를 침전시킴으로써 수득가능한, 수성 또는 비-수성 매질 중에서의 용해 또는 현탁을 통해 생물학적으로 활성인 항체 단백질을 생성시키는, EGF 수용체 (EGFR) 에 대한 항체의 고체형, 구체적으로는 EGF 수용체에 대한 단일클론 (monoclonal) 항체, 특히 바람직하게는 Mab C225 (세툭시마브) 및 Mab h425 (EMD 72000) 의 침전물 및 결정에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 침전된 비-결정질, 침전된 결정질 또는 용해되거나 현탁된 형태인 전술한 항체의 고체형 하나 이상, 및 임의적 부형제 및/또는 보조제 및/또는 추가의 약학적 활성 성분을 포함한 약학적 제제, 및 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형의 제조 방법에 관한 것이다.
생명공학 분야에서의 진보는 지난 10 년의 과정 동안 재조합 DNA 기술에 의해서 일련의 약학용 단백질을 제조하는 것이 가능하도록 하였다. 단백질 약제, 예컨대 단일클론 항체는, 예를 들면, 종양 치료에서, 예를 들면 특이적 면역요법 또는 종양 백신화에 사용된다. 치료적 단백질은 통상의 유기 및 무기 활성 성분보다 크고 복잡하며, 단백질의 생물학적 활성에 영향을 주거나 그렇지 않으면 비 목적한 효과를 유발할 수 있는 복잡한 3 차원적 구조 및 다수의 관능기를 가진다. 제조, 저장 및 운송 동안, 단백질 약제는 단백질 활성 성분에 대한 안정성-감소 작용을 가질 수 있는 다수의 외인성 영향에 노출된다. 그러므로, 예를 들면 특정한 안정화 보조제의 첨가를 통해 단백질을 안정시킬 수 있게 하기 위해서, 특이적 분해 반응의 원인 및 기작을 정확하게 연구할 필요가 있다 (예를 들면, Manning M. C., Patel K., & Borchardt R. T. (1989) Stability of protein pharmaceuticals. Pharm. Res. 6, 903-918 참조).
문헌에는 치료적 단백질의 다양한 제형이 개시되어 있다. 그러나, 단백질 활성 성분의 약학적 제제에서의 조성 요구조건은 매우 상이할 수 있고, 일반적으로 상이한 단백질의 특이적인 물리화학적 성질 및 분해 반응으로 인하여, 이미 확립되어 있는 단백질 제형을 신규의 단백질 활성 성분에 적용하는 것은 불가능하다. 그러므로 이들 신규 활성 성분의 적절한 약학적 제형 및 안정한 형태는 여전히 주요 과제이다.
화학적 불안정성은 단백질의 공유결합 변형에 의해 구별된다. 단백질의 1 차 구조는 화학적 결합의 파괴, 신규 형성 또는 재형성을 통해서 변화된다. 새롭게 형성된 물질은 일반적으로 본래의 천연 단백질과 생물학적 활성이 완전히 상이하다. 물리적 불안정성은 공유결합의 파괴 없이 분자의 공간 배열 (2 차, 3 차 및 4 차 구조) 을 변형시킨다. 이들은 변성, 회합, 응집, 침전 또는 흡착으로 분류될 수 있다. 물리적 불안정성은 특히 상대적으로 큰 단백질의 경우에서 빈번한 현상이다. 침전물은 육안으로 보았을 때 응집물과 동등하며, 기계적 인 측면에서 응집물 또는 회합물의 집단에 의해 형성된다. 용해도 한계의 초과 및 침전으로 인하여, 광학 현미경을 통해서는 약 10 ㎛ 의 직경이고 육안으로는 약 50 ㎛ 인 박편이 시각화된다. 단백질 응집은 가역 또는 비가역 과정일 수 있다 (예를 들면, Cleland J. L., Powell M. F. & Shire S. J. (1993) The development of stable protein formulations: A close look at protein aggregation, deamidation, and oxidation. Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 10, 307-377 참조).
이전의 문헌에 단백질의 표준 정제 방법으로서 염, 중합체 및 유기 용매에 의한 단백질의 침전이 기재되어 있지만 (Scopes R. K. (1997) Separation by Precipitation. In: Protein Purification: Principles and Practice (ed Scopes R. K.), 2 edn, pp. 41-71. Springer Verlag, New York), 이 방법의 사용은 일반적으로, 특히 면역글로불린의 경우에, 변성, 이와 연관된 활성에서의 감소 및 불량한 양적 수율을, 특히 염 및 유기 용매의 사용 시에 초래한다 (Phillips A. P., Martin K. L., & Horton W. H. (1984) The choice of methods for immunoglobulin IgG purification: Yield and purity of antibody activity. Journal of Immunological Methods 74, 385-393). 반면에, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 의 사용 시에는, 보다 양호한 결과가 달성되었다 (A. Polson, G. M. Potgieter, J. F. Largier, and G. E. F. Joubert, F. J. Mears. The Fractionation of Protein Mixtures by linear Polymers of High Molecular Weight. Biochem. Biophys. Acta 82: 463-475, 1964).
단백질 결정은 바람직하게는 효소의 정제 과정 (하류 공정) 으로부터, 및 X-선 구조 분석에 의한 단백질의 3 차 구조 설명에 대해서 공지되어 있다 (R. K. Scopes. Analysis for purity: Crystallization. In: Protein Purification: Principles and Practice, edited by R. K. Scopes, New York: Springer Verlag, 1997, p. 284-301). 단백질 사이에서 새롭게 정렬된 분자 간 접촉의 형성이 여기서 발생한다. 이는 이동성이 감소된 느린 과정이다. 용액 내 단백질의 농도는 과정 중에 감소된다.
문헌에 면역글로불린의 구조 설명에 대한 표준 방법으로서 염, 중합체 및 유기 용매에 의한 단백질의 결정화가 기재되어 있지만 (Harris L. J., Skaletsky E., & McPherson A. (1995) Crystallization of Intact Monoclonal Antibodies. Proteins: Structure, Function, and Genetics 23, 285-289; Harris L. J., Skaletsky E., & McPherson A. (1998) Crystallographic Structure of an Intact IgG1 Monoclonal Antibody. Journal of Molecular Biology 275, 861-872; Edmundson A. B., Guddat L. W., & Andersen K. N. (1993) Crystal Structures of intact IgG antibodies. ImmunoMethods 3, 197-210), 예를 들면 그대로의 글리코실화 항체의 결정화는, 단백질의 크기, 개별적인 항체 분자의 상이한 글리코실화 패턴 및 이와 연관된 미세불균일성, 뿐만 아니라 면역글로불린의 구조적 유연성이 결정 격자로의 정렬된 혼입을 보다 어렵게 하거나 심지어 이를 막기 때문에, 극도로 어렵다 (McPherson A. (1999) Crystallization of Biological Macromolecules, 1 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). 또한, 항체 분자는 응집으로의 경향을 나타내는데, 이는 마찬가지로 결정화에서의 큰 어려움을 야기시킨다 (McPherson A. (1999) Crystallization of Biological Macromolecules, 1 edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). 또한, 결정화 과정 동안의 항체의 변성 위험은 치료적 항체의 결정화가 당업자에게 비매력적이도록 만든다. 즉, 단지 소수의 그대로의 항체만이 지금까지 구조적 설명에 대해서 결정화되어 왔으며, 단지 3 개의 항체만이 지금까지 제조 규모로 결정화되어 왔다. 즉, 생물학적 거대분자 결정화 데이터베이스 (Gilliland, G. L., Tung, M., Blakeslee, D. M. and Ladner, J. 1994. The Biological Macromolecule Crystallization Database, Version 3.0: New Features, Data, and the NASA Archive for Protein Crystal Growth Data. Acta Crystallogr. D50 408-413) 에 기입된, 이미 결정화된 면역글로불린은 주로 Fab 및 Fc 단편이다.
WO 02072636 에 항체 결정이 기재되어 있지만, 이들은 약학적 제형에서 가능한 한 멀리 피해야 하는 세정제, 및 일부가 독물학적으로 비허용성인 보조제를 사용하여, 접종에 의한 복잡한 방법으로 제조된다. 또한, 기재된 방법에서는 입자 크기를 조절할 수 없다. 대조군 실험 (실시예 8 참조) 에서는, WO 02072636 에 기재된 방법을 사용하였을 때, 기재된 침상 결정이 단백질 용액 및 음성 대조군 (단백질 없음) 둘 다에서 수득됨을 보여주는 것이 가능하였다. 이로부터, 침전 시약의 결정에 최대한 단백질 함유물이 추정적으로 존재함이 명백하다.
전술한 이유에 의해서, 항체의 결정화는 당업자에게 극도로 어려우며, 문헌에 개시된 결정화 방법은 1 차, 2 차 및 3 차 구조, 글리코실화 및 구조적 유연성 의 측면에서 상이한 공지된 항체의 상당한 이질성으로 인하여, 공지된 항체 모두에는 적용할 수 없음이 명백하다. 마찬가지로 전술한 이유에 의해서, 치료적 항체의 침전물을 제조하는 것은, 특히, 비가역 변성이 예상되기 때문에 당업자에게 비매력적이었다.
그러므로 본 발명의 목적은 치료적 단백질, 특히 항체에 대해 안정한 형태, 예를 들면 침전물 또는 결정을 밝혀냄으로써, 이들의 효능을 제조, 저장, 운송 및 적용 동안 유지시키는 것이다. 전술한 바와 같이, 이미 확립되어 있는 단백질 제형은 일반적으로 신규 단백질 활성 성분에 적용할 수 없기 때문에, 본 발명의 추가 목적은 EGF 수용체에 대한 단일클론 항체, 예를 들면, Mab C225 (세툭시마브) 및 Mab h425 (EMD 72000) 에 대한 신규의 안정한 제형을 밝혀내는 것이다. Mab C225 (세툭시마브) 또는 Mab h425 (EMD 72000) 를 포함한 제형은 WO 03053465 및 WO 03007988 에 개시되어 있지만, WO 03053465 에 개시된 제형은 상대적으로 낮은 단백질 농도를 가지고, 실온에서 장기간 안정하지 않으며, WO 03007988 에 개시된 제형도 마찬가지로 상대적으로 낮은 단백질 농도를 가지고, 제제 (동결건조물) 를 사용 전에 재구성시켜야 한다. 결론적으로, 본 발명의 추가 목적은 고농도의 전술한 항체를 갖는 안정한 약학적 제제를 밝혀내는 것이다.
단백질 제형의 안정화를 위한 동결건조 방법은, 예를 들면, WO 9300807 및 WO 9822136 에 개시되어 있지만, 동결건조 제제의 유의적인 단점은 사용자가 동결건조물을 사용 전에 재구성시켜야 하는 데 있으며, 이는 사용 전 제조에서 상당한 오류의 원인이 된다. 액체 제형에 비해서 추가의 제조 과정이 부가되기 때문 에, 상기 방법은 방법 개발 (동결건조 동안의 안정성 보장), 제조 (제조 원가 및 기간) 및 예를 들면 유효성 검증을 위한 부가 작업의 측면에서 불리하다.
따라서, 본 발명의 목적은 스트레스 상태, 예컨대 승온, 대기 습도 및/또는 전단력에 대해 증가된 안정성을 갖고, 독물학적으로 비허용성인 보조제를 포함하지 않은, 전술한 항체에 대한 고체형 및 제형을 밝혀내는 것이다.
발명의 개요
놀랍게도, 전술한 항체의 고체형이 제조될 수 있으며, 이들 고체형 및 이로부터 제조된 제형은 종래 기술에서 언급된 단점을 갖지 않는 것으로 밝혀졌다. 이하에 기재된 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형 및/또는 이로부터 제조된 제형은, 놀랍게도, 하기 중에서 선택된 하나 이상의 이점에 의해 구별된다: 높은 안정성, 조절가능한 입자 크기, 재용해 또는 재현탁 후에도 천연적이고 생물학적으로 활성인 단백질, 고순도, 약학적으로 비허용성인 작용제의 부재 및 이로 인한 높은 안전성, 직접 사용에 대한 양호한 내약성 및 가능성, 낮은 응집 경향 및 이로 인한 고농축 제형의 제조 가능성, 및 용액에 비해서 단백질 현탁액으로서의 제형 상 낮은 점성. 이하에 기재된 본 발명에 따른 제조 방법은, 놀랍게도, 하기 중에서 선택된 하나 이상의 이점에 의해 구별된다: 단순성, 시간 및 비용의 절약, 약학적으로 허용성인 작용제의 사용, 고수율. 즉, 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는, 단일 침전 시약의 첨가만을 필요로 하기 때문에, 문헌에 기재된 기술보다 유의적으로 단순하고, 시간 절약적이며, 비용 효과적인 방식으로 수행될 수 있다.
또한, 적절한 완충제 시스템 중의 항체 용액에 침전 시약을 첨가하는데, 즉 예를 들면 세정제와 같은 추가적 보조제에 의한 반응 용액의 안정화는 필요하지 않다. 비경구 투여용 제제에서의 세정제 사용은 이들이 적지 않은 독성 및 면역성 잠재력을 야기시키며 (Sweetana S. & Akers M. J. (1996) Solubility principles and practices for parenteral drug dosage form development. PDA J. Pharm. Sci. Technol. 50, 330-342) 이들이 또한 단백질 2 차 구조에서의 변화를 초래할 수 있기 때문에 (Vermeer A. W. P. & Norde W. (2000) The influence of the binding of low molecular weight surfactants on the thermal stability and secondary structure of IgG. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 161, 139-150) 일반적으로 회피되거나 최소화되어야 한다. 즉, 생성된 항-EGFR 항체의 고체형은 약제에 직접 사용할 수 있고, 약리학적으로 비허용성인 작용제의 제거를 위한 추가 정제는 필요하지 않다. 이에 비하여, WO 02072636 에서 수득된 결정은 약리학적 비허용성 작용제, 예를 들면 CHES, 이미다졸, TRIS, 염화 망간 (II), 염화 아연 (II), 황산 구리 (II), 2-프로판올, 2-메토일-2,4-펜탄디올, HEPES, 황산 리튬, 에톡시에탄올 또는 세정제, 예컨대 폴리소르베이트 80 또는 20 을 복잡한 방법으로 제거해야만 하거나, 심지어 전술한 비허용성 작용제를 제거하는 것이 완전히 불가능하다.
놀랍게도, EGF 수용체에 대한 항체 (항-EGFR 항체), 바람직하게는 단일클론 항-EGFR 항체, 특히 바람직하게는 Mab C225 (세툭시마브) 또는 Mab h425 (EMD 72000) 를 적절한 pH 및 적절한 온도에서, 적절한 완충제 존재 하에, 중합체, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 염, 바람직하게는 암모늄 술페이트, 또는 유기 용매, 바람직하게는 에탄올, 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된 특정 침전 시약의 원조에 의해서 인큐베이션한 경우, 바람직하게 안정한 고체형이 수득되는 것으로 밝혀졌다.
놀랍게도, 본 발명에 따른 방법으로 수득된 항-EGFR 항체, 바람직하게는 단일클론 항-EGFR 항체, 특히 바람직하게는 Mab C225 (세툭시마브) 또는 Mab h425 (EMD 72000), 및/또는 이들의 변종 또는 단편의 고체형은 바람직하게는 재용해 후에도 천연적이고, 바람직하게는 고수율로 수득된다.
그러므로, 본 발명은 적절한 완충제 존재 하에, 적절한 pH 및 적절한 온도에서, 중합체, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 염, 바람직하게는 암모늄 술페이트, 또는 유기 용매, 바람직하게는 에탄올, 또는 이들의 혼합물 중에서 선택된 침전 시약에 의해서 수성 매질에 용해 또는 현탁된 항체 및/또는 이의 변종 및/또는 단편 중 하나를 침전시킴으로써 수득가능한, 수성 매질 중에서의 용해 또는 현탁을 통해 생물학적으로 활성인 항체 단백질을 생성시키는 항-EGFR 항체 및/또는 이들의 변종 또는 단편의 고체형에 관한 것이다.
항- EGFR 항체의 고체형:
"본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형" 이라는 표현은 바람직하게는 수성 또는 비-수성 매질 중에서의 용해 또는 현탁을 통해 생물학적으로 활성인 항체 단백질을 생성시키는 침전물 또는 결정을 의미하는 것으로서 취해진다.
본 발명에 따른 고체형은 이하에 기재된 방법에 따라 수성 매질 중에 용해 또는 현탁된 항체를 침전시킴으로써 수득된다. 본 발명에 따른 고체형은 ㎛ 및 nm 범위 내일 수 있다.
침전물:
본 발명의 목적에서, "침전물" 이라는 용어는 무정형의 비-결정질 구조 또는 응집 및 회합 상태인 고체형을 의미하는 것으로서 취해진다.
결정:
본 발명의 목적에서, "결정" 이라는 용어는 결정질 구조인 고체형을 의미하는 것으로서 취해진다.
결정질 구조는 하기 방법을 사용하여 검출할 수 있다.
침전된: 본 발명의 목적에서, "침전된" 이라는 용어는 침전된 형태, 즉 방법 조건에 따라 침전물 또는 결정의 형태인 본 발명에 따른 고체형을 의미하는 것으로서 취해진다.
침전된 결정질: 본 발명의 목적에서, "침전된 결정질 또는 결정질" 이라는 용어는 정렬된 결정질 구조인 본 발명에 따른 고체형을 의미하는 것으로서 취해진다.
침전된 비-결정질: 본 발명의 목적에서, "침전된 비-결정질" 이라는 용어는 무정형의 비-결정질 구조 또는 응집 및 회합 상태인 본 발명에 따른 고체형을 의미하는 것으로서 취해진다.
용해된: 본 발명의 목적에서, "용해된" 이라는 용어는 본 발명에 따른 용액에 용해 또는 재용해된 본 발명에 따른 고체형을 의미하는 것으로서 취해진다.
현탁된 : 본 발명의 목적에서, "현탁된" 이라는 용어는 본 발명에 따른 용액에 현탁 또는 재현탁된 본 발명에 따른 고체형을 의미하는 것으로서 취해진다.
본 발명의 목적에서, "수성 매질" 은, 본 발명에 따른 수성 매질이 단독으로 항체의 침전 또는 결정화를 일으키는 것이 아니라, 침전 또는 결정화가 본 발명에 따른 침전 시약의 첨가를 통해서만 발생한다는 성질을 갖는, 물 또는 물과 적절한 비활성 용매 및 예를 들면 완충제, 안정제 또는 보조제와 같은 실시예 1 에서 언급되는 다른 작용제와의 혼합물을 의미하는 것으로서 취해진다.
본 발명의 목적에서, "비-수성 매질" 은, 본 발명에 따른 비-수성 매질이 단독으로 항체의 침전 또는 결정화를 일으키는 것이 아니라, 침전 또는 결정화가 본 발명에 따른 침전 시약의 첨가를 통해서만 발생한다는 성질을 갖는, 오일 또는 오일과 물 또는 다른 적절한 비활성 용매 및 예를 들면 안정제 또는 보조제와 같은 실시예 1 에서 언급되는 다른 작용제와의 혼합물을 의미하는 것으로서 취해진다.
본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 측면 및 본 발명의 목적에서, "생물학적으로 활성인", "천연적인" 및 "효과적인" 이라는 용어는, 본 발명에 따른 항-EGFR 항체가 본 발명에 따른 고체형으로의 전환 및 후속의 재용해 또는 재현탁 후에도 그들의 생물학적 효과, 특히 EGFR 에 대한 결합, 리간드, 특히 EGF 의, EGFR 에 대한 결합의 저해, 조절, 특히 EGFR-매개 신호 변환의 저해 및 EGFR-매개 질환의 예방 또는 치료 효과를 발휘할 수 있음을 의미하는 것으로서 취해진다.
특히, 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 결정의 직접적인 제조는, 항체가 일반적으로 결정 격자로의 정렬된 혼입을 보다 어렵게 하거나 심지어 이를 막는 응집으로의 경향을 강하게 나타내기 때문에 기대되지 않았었다 (McPherson A. (1999) Crystallization of Biological Macromolecules, 1 edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York). 단백질 구조, 글리코실화 및 구조적 분절 유연성 측면에서의, 심지어 1 종의 항체 내에서도 나타나는 전술한 이질성에 기인한, 본 발명에 따른 항체의 결정화에 있어서 당업자에게 예상되는 어려움에도 불구하고, 놀랍게도, 본 발명에 따른 방법에 의해서 우수한 결과가 달성되었다.
본 발명에 따라 생성된 항체의 결정의 높은 안정성은 또한, 면역성 부작용의 측면에서 중대한 것으로 간주되는 입자 모양 및 입자 크기 스펙트럼에서의 변화, 또는 단백질의 1 차 구조 또는 2 차 구조에서의 변화가 발생하지 않는 것을 특징으로 한다. 즉, 본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 생성된 결정의 입자 크기가 조절가능하고, 바람직하게는 안정한 3 차원 결정이 수득된다는 이점을 제공한다. 결정 크기는 ㎛ 및 nm 범위 내일 수 있다.
항- EGFR 항체: 본 발명에 따른 항-EGFR 항체는 바람직하게는 단일클론이고 쥣과 동물 또는 인간 기원의 것이며; 이들은 특히 바람직하게는 쥣과 동물 기원의 것이고 키메릭 (chimeric) 이거나 인간화된 것이다. 상피 성장 인자의 수용체 (EGFR) 를 지향하는 항체는 특히 바람직하게는 Mab C225 (세툭시마브) 또는 Mab h425 (EMD 72000) 및/또는 이의 변종 또는 단편이다. EGFR 을 지향하는 추가적 항체는, 예를 들면, EP 0586002 및 J. Natl. Cancer Inst. 1993, 85: 27-33 (Mab 528) 에 기재되어 있다.
Mab C225 ( 세툭시마브 , Erbitux ™): Mab C225 (세툭시마브) 는 EGF 수용체에 결합하는, 임상적으로 증명된 항체이다. Mab C225 (세툭시마브) 는 가변 영역은 쥣과 동물 기원의 것이고 불변 영역은 인간 기원의 것인 키메릭 항체이다. 이것은 Naramura et al., Cancer Immunol. Immunotherapy 1993, 37: 343-349 및 WO 96/40210 A1 에 처음으로 기재되었다.
Mab h425 ( EMD 72000): Mab h425 (EMD 72000) 는 쥣과 동물 항-EGFR 항체 425 로부터 수득된 인간화 단일클론 항체 (Mab) (Mab 425) 이다 (EP 0531472). 쥣과 동물 단일클론 항체 Mab 425 는 인간 암종 세포주 A431 내에서 상피 성장 인자의 수용체 (EGFR) 의 세포외 에피토프 (epitope) 에 결합하기 때문에, 여기에서 발달시켰다. 이것은 EGF 의 결합을 저해하는 것으로 밝혀져 있다 (Murthy et al., 1987). EGFR 발현의 증가는 다양한 공급원의 악성 조직에서 발견되므로, 결과적으로 Mab 425 는 인간 종양의 진단 및 치료요법적 치료에 대해 가능한 활성 성분이다. 즉, Mab 425 는 시험관 내에서 종양 세포독성을 조정하고, 시험관 내에서 표피 및 결직장 암종 세포주의 종양 성장을 억제한다 (Rodeck et al., 1987). 또한, Mab 425 는 마우스에서 인간 악성 신경교종의 이종이식부에 결합하는 것으로 나타났다 (Takahashi et al., 1987). 이것의 인간화 또는 키메릭 형태는, 예를 들면, EP 0531472; Kettleborough et al., Protein Engineering 1991, 4: 773-783; Bier et al., Cancer Chemother Pharmacol. 2001, 47: 519-524; Bier et al., Cancer Immunol. Immunother. 1998, 46: 167-173 에 개시되어 있다. Mab h425 (EMD 72000) 는 임상 단계 I/II 중에 있으며, 그 불변 영역이 κ 및 인간 γ-1 쇄로 이루어진 인간화 항체 (h425) 이다 (EP 0531472).
인간 항-EGFR 항체는 WO 9110741, WO 9402602 및 WO 9633735 에 기재된 바와 같이, XenoMouse 기술에 의해서 제조될 수 있다. 이 기술에 의해 제조된 임상 시험을 거친 항체는, 예를 들면, ABX-EGF 이다 (Abgenix, Crit. Rev. Oncol. Hematol. 2001, 38: 17-23; Cancer Research 1999, 59: 1236-43).
항체: 항체 또는 면역글로불린은 본 발명의 목적에서 최광의로 사용되며, 특히, 다클론 (polyclonal) 항체 및 다중특이적 항체 (예를 들면 이중특이적 항체) 및 특히 바람직하게는 생물학적으로 활성인 그대로의 단일클론 항체 (Mab), 및 이들의 변종 및 단편에 관한 것이다. 상기 용어는 또한 둘 이상의 항체 또는 이들의 단편으로 이루어지고/거나 상이한 결합 특이성을 가지며 서로 결합하는 이종항체를 포함한다. 이들의 불변 영역의 아미노산 서열에 따라, 항체는 하기와 같은 상이한 항체 (면역글로불린) 클래스로 할당될 수 있다: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM. 이들 다수는 서브-클래스 (동기준표본), 예를 들면 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2 로 추가 하위분류될 수 있다. 항체는 일반적으로 약 150 kDa 의 분자량을 가지고, 2 개의 동일한 경쇄 (L) 및 2 개의 동일한 중쇄 (H) 로 이루어진다. 단일클론 항체는 동종 세포의 집단으로부터 수득된다. 이들은 단일 에피토프에 대해 고도로 특이적이고 이를 지향하는 반면, 다클론 항체는 상이한 에피토프를 지향하는 상이한 항체를 포함한다. 단일클론 항체의 제조 방법에는, 예를 들면, Kohler and Milstein (Nature 256, 495 (1975)) 에 의해서 및 Burdon et al., (1985) "Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterisation of Rodent and Human Hybridomas", Eds, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam 에 기재된 하이브리도마 (hybridoma) 방법이 포함된다. 이들은 특히 공지된 재조합 DNA 기술에 의해서 제조될 수 있다 (예를 들면, US 4816567 참조). 단일클론 항체는 또한, 예를 들면 Clackson et al. (Nature, 352: 624-628 (1991)) 및 Marks et al. (J. Mol. Biol., 222: 58, 1-597 (1991)) 에 기재된 기술의 원조에 의해서, 파지 항체 라이브러리 (phage antibody library) 로부터 단리시킬 수 있다.
변종 및 단편: 항체의 변종 (뮤테인 (mutein)) 은 구조적으로 관련된 단백질, 예를 들면 1 차 서열 (아미노산 서열) 의 변형, 글리코엔지니어링 (글리코실화 위치 또는 구조의 변종, 또한 탈글리코실화 단백질), PEG 화, 변형된 숙주 세포에서의 제조, 또는 기타 다른 기술에 의해서 수득될 수 있는 것이다. 본원에서 본 발명에 따른 변종은 상기 예에만 제한되는 것이 아니라, 당업자에게 공지되어 있는 본 발명에 따른 항체의 모든 변종을 포함한다. 항체의 단편 (부분적 분절) 은, 예를 들면, 파파인, 펩신 및 플라스민의 원조에 의한 제한 효소 소화 또는 유전 공학에 의한 부분적 분절의 제조에 의해서 수득된 항체의 분열 생성물이다. 전형적인 부분적 분절은, 예를 들면, 2 가 F(ab')2 단편, 1 가 Fab 단편 및 Fc 단편이다 (Lottspeich F., H. Zorbas (ed.). Bioanalytik, Heidelberg; Berlin: Spektrum Akademischer Verlag GmbH, (1998) pp. 1035). 본원에서 본 발명에 따른 단편은 상기 예에만 제한되는 것이 아니라, 당업자에게 공지되어 있는 본 발명에 따른 항체의 모든 단편을 포함한다.
약학적 제제: "약학적 제형" 및 "약학적 제제" 라는 용어는 본 발명의 목적에서 동의어로 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같은, "약학적으로 용인된" 은 비목적한 생리학적 부작용, 예컨대 오심, 현기증, 소화 불량 등이 없는, 약제, 침전 시약, 부형제, 보조제, 안정제, 용매 및 이로부터 수득된 약학적 제제의 포유류에 대한 투여를 촉진시키는 기타 다른 작용제에 관한 것이다.
비경구 투여용 약학적 제제에서는, 제형의 등장성, 최적 pH (euhydria) 및 용인성 및 안전성 (저 독성), 사용된 보조제와 1 차 포장재의 안전성에 대한 요구가 존재한다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형은 바람직하게는, 사용된 침전 시약이 생리학적 허용성 작용제이고, 이로써 약학적 제형에 본 발명에 따른 고체형을 사용하기 전에, 예를 들면, 고농도의 유기 용매 또는 기타 다른 독물학적 비허용성 보조제와 같은 독물학적 비허용성 작용제의 제거를 위한 추가 정제 단계가 불필요하기 때문에, 직접 사용이 가능한 이점을 가진다. 따라서, 바람직하게는 고수율의 천연적이고 약학적으로 허용성인 고순도의 단백질을 동반한 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형의 제조는, 바람직하게는 단순하고, 시간 절약적이며, 비용이 많이 들지 않는다.
그러므로 본 발명은 또한 침전 시약에 의해서 수용액에 용해 또는 현탁된 항체 및/또는 이의 변종 및/또는 단편을 침전시킨 다음, 상기 침전 생성물을 분리시키는 것을 특징으로 하는, 수성 매질 중에서의 용해 또는 현탁을 통해 생물학적으로 활성인 항체 단백질을 생성시키는 본 발명에 따른 항-EGFR 항체 및/또는 이의 변종 및/또는 단편 중 하나의 고체형의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법에서 사용되는 침전 시약은 바람직하게는 중합체, 특히 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 염, 특히 바람직하게는 암모늄 술페이트, 또는 유기 용매, 특히 바람직하게는 에탄올이다.
본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형은 실시예 1 에서 언급되는 본 발명에 따른 침전 시약, 바람직하게는 중합체, 예컨대 특히 바람직하게는 200 내지 80,000, 바람직하게는 400 내지 20,000, 특히 바람직하게는 400 내지 8,000 의 평균 분자량을 갖는, 0.1 내지 99.9 % (w/v) 농도의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG); 염, 예컨대 특히 바람직하게는 0.1 내지 4.5 M 농도의 암모늄 술페이트, 0.1 내지 4.5 M 농도의 소듐 아세테이트 트리히드레이트, 0.1 내지 1.5 M 농도의 트리소듐 시트레이트 디히드레이트, 0.1 내지 1.2 M 농도의 포타슘 포스페이트, 0.1 내지 4.7 M 농도의 포타슘 클로라이드, 0.1 내지 6.1 M 농도의 소듐 클로라이드, 0.1 내지 3.0 M 농도의 디포타슘 히드로겐포스페이트, 0.1 내지 0.5 M 농도의 디소듐 히드로겐포스페이트 디히드레이트, 또는 유기 용매, 예컨대 특히 바람직하게는 0.1 내지 99.9 % (v/v) 농도의 에탄올, 또는 이들의 혼합물, 및 보조제, 완충제 및/또는 안정제를, 본 발명에 따른 항체를 포함한 용액에 배취 (batch) 방법으로 첨가하고, 혼합물을 실시예 1 에서 언급되는 pH 값 및 온도에서 인큐베이션함으로써 제조할 수 있다. 이를 위해서, 정의된 농도의 실시예 1 에서 언급되는 침전 시약, 보조제, 완충제 및/또는 안정제를 포함한 원료 용액의 정의된 부피를 유리하게는, 그 제조에서 수득된 바와 같은, 정의된 농도의 EGFR 항체를 갖는 용액 (0.01 내지 150 mg/ml, 바람직하게는 2 내지 100 mg/ml, 특히 바람직하게는 약 5 내지 20 mg/ml) 에 첨가하고, 물 또는 완충제 (예를 들면 1 mM 내지 200 mM, 바람직하게는 2 내지 20 mM, 특히 바람직하게는 약 10 mM 농도의 시트레이트 또는 포스페이트 완충제; 또한 예를 들면 1 내지 1000 mM, 바람직하게는 40 mM 내지 310 mM 농도의 포타슘 클로라이드, 소듐 클로라이드와 같은 등장제가 첨가된 것) 로 미리 계산된 농도까지 임의 희석한다. 대안적으로는, 본 발명에 따른 침전 시약, 보조제, 완충제 및 안정제를 또한 고체형으로 첨가할 수 있다. 항체 그 자체가 예를 들면 동결건조물과 같은 고체 응집물 상태인 경우에, 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형은 먼저 본 발명에 따른 항체를 물 또는 하나 이상의 추가 성분을 포함한 수용액에 용해시킨 다음, 정의된 농도의 실시예 1 에서 언급되는 침전 시약, 보조제, 완충제 및/또는 안정제를 포함한 원료 용액의 정의된 부피를 첨가함으로써 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 침전 시약, 보조제, 완충제 및/또는 안정제는 또한 고체 응집물 상태로 첨가될 수도 있다. 본 발명에 따른 항체는 유리하게는 또한 침전 시약, 보조제, 완충제 및/또는 안정제를 전부 포함한 용액에 직접 용해시킬 수 있다.
본 발명은 또한 당업자에게 공지되어 있으며 이들이 생각해낼 수 있는 전술한 작용제의 모든 수화물, 염 및 유도체를 포함한다.
본 발명에서 언급되는 작용제 중 하나 이상은 유리하게는 침전 과정 중에 또는 완료 후에 첨가될 수 있고, 예를 들면 부가적인 정제 단계를 수행하기 위해서 다시 임의 제거될 수 있다.
본 발명에서 언급되는 침전 시약, 보조제, 완충제 및/또는 안정제 중 하나 이상은 유리하게는 항체의 제조 과정 중에 또는 완료 후에 첨가될 수 있다. 이는 바람직하게는 본 발명에 따른 항체를 이의 제조 후에 수행하는 최종 정제 단계에서 추가적 침전 시약, 보조제, 완충제 및/또는 안정제를 하나, 복수 또는 전부 포함한 수용액에 직접 용해시킴으로써 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 약학적 제제의 제조에 대해서, 각각의 추가적 성분(들)은 그 다음에 보다 적은 각각의 양으로 첨가하거나 전혀 첨가하지 않아도 된다. 각각의 성분을 항체의 제조에 이은 최종 정제 단계에서 추가적 침전 시약, 보조제, 완충제 및/또는 안정제를 전부 포함한 수용액에 용해시키는 것이 특히 바람직하다. 즉, 유리하게는 직접적으로 포장되거나 동결건조될 용액이 수득될 수 있다. 각각의 항체를 포함하여 생성된 용액을 4 내지 10 의 pH, 바람직하게는 pH 5 내지 9 로 조정하고, 무균-여과시키고, 필요에 따라 동결건조시킨다.
반응은 적절한 용매, 구체적으로는 비활성 용매 중에서, 당업자에게 공지된 방법에 의해 수행된다. 적절한 비활성 용매는 에탄올, 글리세롤, 물 또는 순수 또는 예를 들어 완충 작용이나 등장성-생성 작용을 갖는 염과 같은 기타 다른 보조제를 포함한 물과의 혼합물이다. 물이 특히 바람직하다.
본원에 기재된 방법은 특히 바람직하게는 배취 형식으로 수행될 수 있다. 본 발명에 따른 방법으로 제조된 본 발명에 따른 항-EGFR 항체 및/또는 이들의 변종 및/또는 단편의 고체형은 특히 바람직하게는 수성 매질 중에서의 용해 또는 현탁을 통해 생물학적으로 활성인 항체 단백질로 전환될 수 있다. 이를 위해서, 수용액에 용해 또는 현탁된 항체 및/또는 이의 변종 및/또는 단편 중 하나를 특히 바람직하게는 실시예 1 에서 언급되는 침전 시약에 의해 침전시킨 다음, 상기 침전 생성물을 분리시킨다.
침전 시약 농도의 선택에 따라서, 무정형 침전물 또는 결정이 수득된다. 침전물은 바람직하게는 상대적으로 높은 침전 시약 농도에서 수득되는 반면, 결정은 바람직하게는 상대적으로 낮은 침전 시약 농도에서 수득된다. 침전 시약 농도, 단백질 농도, 본 발명에 따른 기타 다른 작용제, pH 및 온도의 적절한 선택을 통해서, 반응을 목적한 방향으로 유도할 수 있다. 실시예 2 및 3 은 Mab C225 (Erbitux™) 에 대한 예시적 결정화 조건을 부여하고, 실시예 4 및 5 는 예시적 침전 조건을 부여한다. 본 발명에 따른 침전 방법 및 본 발명에 따른 결정화 방법은 또한 조합할 수 있다.
적절한 반응 온도는 -10 내지 40 ℃, 바람직하게는 0 내지 25 ℃ 및 특히 바람직하게는 4 내지 20 ℃ 의 온도이다. 사용된 압력은 바람직하게는 1 내지 20 bar, 특히 바람직하게는 대기압이다. 사용된 pH 는 바람직하게는 4 내지 10 이다. 반응 지속시간은 선택된 반응 조건에 의존한다. 일반적으로, 반응 지속시간은 0.5 시간 내지 10 일, 바람직하게는 1 내지 24 시간, 특히 바람직하게는 2 내지 12 시간이다.
본 발명에 따른 고체형의 "용매화물" 이라는 용어는 비활성 용매 분자가 그들의 상호 인력에 기인하여 형성한, 본 발명에 따른 고체형 상의 부가물을 의미하는 것으로서 취해진다. 용매화물은, 예를 들면 수화물, 예컨대 일수화물 또는 이수화물, 또는 알코올레이트, 즉 예를 들어 에탄올과 같은 알코올과의 첨가 화합물이다.
본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 생성된 고체형은 이들이 제조된 해당 용액으로부터 (예를 들면 원심분리 및 세척에 의해서) 분리될 수 있고, 분리 후에는, 상이한 조성물 내에 저장될 수 있으며, 또는 이들은 제조 용액에 적접적으로 남아있을 수 있다. 본 발명에 따라 생성된 고체형은 또한 특정 용도를 위해서 목적한 용매에 녹일 수 있다. 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형은 재용해 또는 재현탁 후에도 바람직하게는 생물학적으로 활성이고, 항체의 변성은 바람직하게는 본 발명에 따른 방법에서 발생하지 않는다. 즉, 단백질의 생물학적 효능이 바람직하게는 유지된다.
또한 놀랍게도, 안정한 약학적 제형이 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형의 원조에 의해서 제조될 수 있음이 밝혀졌다. 이들 제형은 바람직하게는, 예를 들면 산화, 기계적 응력, 불리한 pH 값 및 온도와 같은 물리화학적 영향에 대해서, 통상적인 항체의 단백질 용액보다 높은 안정성을 가진다. 이와 유사한 안정성은 그렇지 않으면 일반적으로, 예를 들면, 안정제의 첨가, 냉 저장, 동결 또는 동결건조와 같은 고가이고 시간 소비적인 방법에 의해서만 달성될 수 있다. 높은 안정성은 바람직하게는, 예를 들면, 즉석 제형, 연장된 기간 동안 활성 성분을 지연 방출 또는 조절 방출하는 제형과 같은 약학적으로 유용한 제형의 보다 단순하고 저가인 저장, 운송 및 제조를 촉진한다.
그러므로 본 발명은 추가로 저장 안정성 약제로서의 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형에 관한 것이다.
본 발명은 특히 바람직하게는 또한 침전된 비-결정질, 침전된 결정질 또는 용해되거나 현탁된 형태인 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형 하나 이상, 및 임의적 부형제 및/또는 보조제 및/또는 추가의 약학적 활성 성분을 포함한 약학적 제제에 관한 것이다.
즉, 본 발명에 따른 약학적 제제는 침전된 형태의, 즉 침전물 또는 결정으로서의, 또는 재용해 또는 재현탁된 형태의 본 발명에 따른 고체형을 포함할 수 있다. 그러므로 본 발명은 또한 침전, 재용해 또는 현탁된 형태인 항-EGFR 항체, 바람직하게는 단일클론 항-EGFR 항체, 특히 바람직하게는 Mab C225 (세툭시마브) 또는 Mab h425 (EMD 72000) 및/또는 이들의 변종 또는 단편의 침전물 및/또는 결정 하나 이상, 뿐만 아니라 임의적 부형제 및/또는 보조제 및/또는 추가의 약학적 활성 성분을 포함한 약학적 제제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형은 바람직하게는, 통상의 고농축 단백질 용액의 경우에서 관찰될 수 있는 바와 같은, 본 발명에 따른 항체의 불리한 비목적한 응집 또는 비목적한 고점성의 발생 없이, 고농축 제형의 제조를 가능하게 한다. 즉, 높은 활성 성분 함량을 갖는 즉석 용액을 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형의 원조에 의해서 수성 용매 또는 수성 매질에 재용해 또는 재현탁시킬 수 있다. 단백질 활성 성분의 극 고농축 제형은 최근에 정도의 증가를 요구받고 있다. 치료에 사용된 대부분의 항체는 mg/kg 범위의 투여량으로 사용된다. 투여되는 높은 투여량 및 적은 부피 (예를 들면 피하 투여에 대해서 약 1 내지 1.5 ml) 는 100 mg/ml 을 초과하는 농도를 갖는 고농축 단백질 제제에 대한 요구를 나타낸다. 또한, 고농축 단백질 제형은 시험관 내 및 생체 내 (동물 모델) 에서의 허용성 및 효능 연구에 대한 전임상 실험, 인간에서의 허용성 및 효능 연구에 대한 임상 실험 및 생성물의 임상적 용도 (특히 피하 투여 상에서의) 에서 상당한 이점을 가질 수 있다. 이들의 이점은, 특히, 상대적으로 작은 부피의 제제가 사용되어야 한다는 것으로 이루어진다. 상대적으로 저농도인 단백질 약제의 주입 또는 주사에 비해서, 이는 예를 들면 환자에 대한 단백질 약제의 피하 투여를 가능하게 한다. 단백질 약제의 피하 투여는 다양한 동기를 가질 수 있다. 예를 들면, "치료 농도범위" 와 관련된 특이적 표적화를 목적으로 할 수 있다. 추가로, 피하 투여는 환자가 의료 인력에의 의지 없이 스스로 투여를 수행할 수 있다는 이점을 가진다. 인슐린의 예가 이들 이점을 명확하게 보여준다. 그러나, 피하 투여용 주사는 최대용량이 1 내지 1.5 ml 일 수 있기 때문에, 100 mg/ml 을 초과하여 함유한 고농축 단백질 제형이 빈번하게 필요하다.
놀랍게도, 액체 제형 중 바람직하게는 10 내지 200 mg/ml, 특히 바람직하게는 50 내지 150 mg/ml 의 단백질 농도를 가능하게 하는 고농축 약학적 제제를 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형의 원조에 의해서 수득할 수 있다. 이는 고농축 단백질 제형에서는 불안정성에 대한 경향이 희석 단백질 제형에서보다 훨씬 크기 때문에 기대되지 않았던 것이다 (Fields, G., Alonso, D., Stiger, D., Dill, K. (1992) "Theory for the aggregation of proteins and copolymers." J. Phys. Chem. 96, 3974-3981). 단백질 분자의 "충전 밀도" 는 높은 단백질 농도에서 증가한다. 따라서 충돌 횟수의 증가가 추정되고, 때때로 단백질 회합이 발생할 수 있다. 이 과정은 일반적으로는 핵생성 및 성장 기작을 통해 발생하는데, 여기서 중요한 핵은 종종 가용성 회합 단백질이지만, 이는 불용성 단백질 침전물 (변성 단백질) 로 급속하게 전환될 수 있다 (Reithel, J. F. (1962) "The dissociation and association of protein structures", Adv. Protein Chem. 18, 123). 단백질 응집물의 크기는 β-락토글로불린에 대해 이미 나타난 바와 같이, 단백질 농도의 증가에 따라 증가된다 (Roefs, S. P. F. M., De Kruif, K. G. (1994) "A model for the denaturation and aggregation of β+-lactoglobulin." Eur. J. Biochem. 226, 883-889).
공지된 면역글로불린의 고농축 제형에서의 제한은 보통, 항체의 즉석 액체 제형 중 2 내지 50 mg/ml (Humira®) 이다.
그러나, 본 발명에 따른 고체형으로는 안정한 고농축 제형을 제조할 수 있는데, 이는 기대되지 않았었다. 즉, 침전 또는 결정화 단계가 고농축의 안정한 항체 제형을 부여할 수 있는데, 이는 재현탁 또는 재용해 후에, 동일한 농도의 액체 항체 제형에 비해 감소된 점성을 가짐으로써 비경구 투여의 경우에 취급이 간단하다.
그러므로 본 발명은 또한 존재하는 항체가 생물학적으로 활성이고, 항체 농도가 바람직하게는 10 내지 200 mg/ml, 특히 바람직하게는 50 내지 150 mg/ml 인 것을 특징으로 하는, 침전된 비-결정질, 침전된 결정질 또는 용해되거나 현탁된 형태인 본 발명에 따른 항-EGFR 항체 및/또는 이의 변종 및/또는 단편 중 하나의 고체형 하나 이상을 포함한 약학적 제제에 관한 것이다.
본 발명은 또한 항체 농도가 바람직하게는 10 내지 200 mg/ml, 특히 바람직하게는 50 내지 150 mg/ml 이고, 하나 이상의 본 발명에 따른 항-EGFR 항체 및/또는 이의 변종 및/또는 단편 중 하나의 고체형을 본 발명에 따른 용액에 용해 또는 재현탁시키는 것을 특징으로 하는, 본 발명에 따른 고농축 약학적 제제의 제조 방법에 관한 것이다.
수성 제제는 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형을 수성 용액에 용해 또는 현탁시키고, 임의로는 보조제를 첨가함으로써 제조할 수 있다. 이를 위해서, 정의된 농도의 상기 추가 보조제를 포함한 원료 용액의 정의된 부피를 유리하게는 정의된 농도의 본 발명에 따른 고체형을 갖는 용액 또는 현탁액에 첨가하고, 혼합물을 물로 미리 계산된 농도까지 임의 희석한다. 대안적으로는, 보조제를 고체형으로 첨가할 수 있다. 그 다음, 각 경우에 필요한 양의 원료 용액 및/또는 물을 수득된 수용액 또는 현탁액에 첨가할 수 있다.
본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형은 또한 유리하게는 추가 보조제를 전부 포함한 용액에 직접 용해 또는 현탁시킬 수 있다.
4 내지 10 의 pH, 바람직하게는 5 내지 9 의 pH, 및 250 내지 350 mOsmol/kg 의 삼투질농도를 갖는 항체 함유 용액 또는 현탁액은 유리하게는 본 발명에 따른 고체형을 수성 용매로 재구성시킴으로써 제조될 수 있다. 이로써 재현탁 또는 재용해된 제제를 실질적으로 통증 없이 정맥 내, 동맥 내 및 또한 피하적으로 직접 투여할 수 있다. 또한, 제제를 예를 들면 추가의 활성 성분을 또한 함유할 수도 있는 글루코스 용액, 등장성 식염수 용액 또는 링거액과 같은 주입액에 첨가함으로써, 또한 상대적으로 많은 양의 활성 성분이 투여되도록 할 수도 있다.
본 발명에 따른 약학적 제제는 또한 침전되거나 결정질이고/거나 재용해되거나 재현탁된 형태인 본 발명에 따른 침전물 및/또는 결정의 혼합물을 포함할 수도 있다.
본 발명에 따른 제제는 생리학적으로 양호하게 용인되고, 제조가 용이하며, 정확하게 분배할 수 있고, 바람직하게는 분석, 저장 및 운송 동안 그리고 복합적 동결 및 해동 공정 동안의 분해 생성물 및 응집물의 측면에서 안정하다. 이들은 바람직하게는 3 개월 이상 내지 2 년의 기간 동안 냉장고 온도 (2 내지 8 ℃) 와 실온 (23 내지 27 ℃) 및 60 % 의 상대 대기 습도 (R. H.) 에서 안정한 방식으로 저장될 수 있다. 놀랍게도, 본 발명에 따른 제제는 또한 바람직하게는 6 개월 이상 동안 심지어 승온 및 대기 습도, 예를 들면 40 ℃ 의 온도 및 75 % 의 상대 대기 습도에서의 저장 시에도 안정하다.
예를 들면, 본 발명에 따른 고체형은 건조에 의해 안정한 방식으로 저장될 수 있고, 필요에 따라 용해 또는 현탁에 의해 즉석 약학적 제제로 전환될 수 있다. 가능한 건조 방법은, 예를 들면, 이들 예에만 제한됨 없이, 질소 기체 건조, 진공 오븐 건조, 동결건조, 유기 용매 세척 후 공기 건조, 액체층 건조, 유동층 건조, 분무 건조, 롤러 건조, 층 건조, 실온에서의 공기 건조 및 추가 방법이다.
"유효량" 이라는 용어는 예를 들면 연구자 또는 내과의에 의해 추구되거나 목적되는 조직, 계, 동물 또는 인간에서의 생물학적 또는 의학적 반응을 유발시키는 약제 또는 약학적 활성 성분의 양을 나타낸다.
또한, "치료적 유효량" 이라는 용어는 이러한 양을 취하지 못한 상응하는 대상에 비해서 하기 결과를 갖는 양을 나타낸다: 질환, 증후군, 질환 상태, 병, 장애의 향상된 치료, 치유, 예방 또는 제거, 또는 부작용의 예방, 또는 질환, 병 또는 장애의 진행 감소. "치료적 유효량" 이라는 용어는 또한 정상적인 생리학적 기능을 증가시키기에 유효한 양을 포함한다.
약제는 투여 단위당 미리 정해진 양의 활성 성분을 포함한 투여 단위의 형태로 투여될 수 있다. 이러한 유형의 단위는, 치료할 질환 상태, 투여 방법, 및 환자의 연령, 체중 및 건강에 따라, 예를 들면, 본 발명에 따른 활성 성분을 0.5 mg 내지 1 g, 바람직하게는 1 mg 내지 800 mg 포함할 수 있다. 바람직한 투여 단위 제형은 활성 성분의, 앞서 지시된 바와 같은 일간 투여량 또는 하위-투여량, 또는 이에 상응하는 분획을 포함한 것이다. 추가로, 이러한 유형의 약제는 약학 분야에 일반적으로 공지되어 있는 방법 중 하나에 의해서 제조될 수 있다.
약제는 임의의 목적한 적절한 경로, 예를 들면 경구 (협측 또는 설하 포함), 직장, 폐, 비측, 국소 (협측, 설하 또는 경피 포함), 질 또는 비경구 (피하, 근육 내, 정맥 내 또는 진피 내 포함) 경로에 의한 투여에 적합하도록 할 수 있다. 이러한 유형의 약제는, 예를 들면, 활성 성분과 부형제(들) 또는 보조제(들)를 조합함으로써, 약학 분야에 공지되어 있는 모든 방법에 의해서 제조될 수 있다.
비경구 투여가 바람직하게는 본 발명의 약제의 투여에 적절하다. 비경구 투여의 경우, 정맥 내 및 피하 투여가 특히 바람직하다. 정맥 내 투여의 경우, 주사는 직접적으로 또는 주입액에 대한 첨가로서 수행할 수 있다.
피하 투여용 약제는, 안정한 고농축 제형을 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형의 원조에 의해서 제조할 수 있기 때문에 특히 적절하다. 이로써 비경구 또는 피하 투여에 필요한 고농축 제형 및 적은 투여 부피가 달성될 수 있다.
피하 투여는 환자가 전문 의료인의 원조 없이 스스로 약제를 투여할 수 있다는 이점을 가진다. 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형은 또한 활성 성분이 서서히 지연 및/또는 조절 방출되는, 비경구 투여용 약제의 제조에 적절하다. 본 발명에 따른 침전물 및/또는 결정은 바람직하게는 여기서 현탁액의 형태이고, 연장되고/거나 조절된 기간 동안 용해된 다음, 천연적이고 효과적인 상태로 된다. 즉, 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형은 또한 서방성 제형의 제조에 적절하고, 이는 투여가 오직 상대적으로 긴 시간 간격을 두고 필요하기 때문에 환자에게 유리하다. 본 발명에 따른 약학적 제제는 또한 종양에 직접적으로 주사됨으로써, 의도한 바와 같은 작용의 위치에서 그들의 작용을 직접적으로 전개할 수 있다.
비경구 투여에 적합한 약제에는 항산화제, 완충제, 세균발육저지제 및 제형을 치료할 수용자의 혈액과 등장성이 되도록 만들어 주는 용질을 포함한 수성 및 비-수성 무균 주사액; 뿐만 아니라 현탁 매질 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 또는 비-수성 무균 현탁액이 포함된다. 제형은 단일-투여량 또는 다-투여량 용기, 예를 들면 밀폐된 앰플 및 바이알에 담아 동결건조 상태로 저장할 수 있는데, 이로써 사용 직전에 오직 무균 담체 액체, 예를 들면 주사용수를 첨가하기만 하면 된다. 제형에 따라서 제조된 주사액 및 현탁액은 무균 분말, 과립 및 정제로부터 제조될 수 있다.
임의로는 재용해된 형태인, 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형은 또한 예를 들면 소단층 소포, 대단층 소포 및 다층 소포와 같은 리포좀 공급 시스템의 형태로 투여될 수 있다. 리포좀은 예를 들면 콜레스테롤, 스테아릴아민 또는 포스파티딜콜린과 같은 다양한 인지질로부터 형성될 수 있다.
침전, 재용해 또는 현탁된 형태인 본 발명에 따른 항-EGFR 항체 및 이들의 변종의 고체형은 또한 표적화된 약제 부형제로서의 가용성 중합체와 연결될 수 있다. 이러한 중합체에는 팔미토일 라디칼로 치환된, 폴리비닐피롤리돈, 피란 공중합체, 폴리히드록시프로필메트아크릴아미도페놀, 폴리히드록시에틸아스파타미도페놀 또는 폴리에틸렌 옥시드 폴리리신이 포함될 수 있다. 항-EGFR 항체의 고체형은 또한 약제의 저속 방출을 달성하기에 적합한 생물분해성 중합체 부류, 예를 들면 폴리락트산, 폴리-엡실론-카프로락톤, 폴리히드록시부티르산, 폴리오르토에스테르, 폴리아세탈, 폴리디히드록시피란, 폴리시아노아크릴레이트, 폴리락트-co-글리콜산, 중합체, 예컨대 덱스트란과 메트아크릴레이트의 컨쥬게이트, 폴리포스포에스테르, 각종 다당류 및 폴리아민 및 폴리-ε-카프로락톤, 알부민, 키토산, 콜라겐 또는 변형 젤라틴 및 가교되거나 양쪽성인 히드로겔의 블록 공중합체와 연결될 수 있다.
경피 투여에 적합한 약제는 수용자 표피와의 확장되고 밀접한 접촉을 위한 독립적 고약으로서 전달될 수 있다. 즉, 예를 들면, Pharmaceutical Research 3(6), 318 (1986) 에 일반적인 용어로 기재된 바와 같은, 전리요법에 의해 고약으로부터 활성 성분이 공급될 수 있다.
국소적 투여에 적합한 약제는 연고, 크림, 현탁액, 로션, 분말, 용액, 페이스트, 겔, 스프레이, 에어로졸 또는 오일로서 제형화될 수 있다.
눈 또는 기타 다른 외부 조직, 예를 들면 입 및 피부의 치료를 위해서, 제형은 바람직하게는 국소적 연고 또는 크림으로서 투여된다. 연고로서의 제형의 경우, 활성 성분은 파라핀 또는 수혼화성 크림 기재와 함께 사용될 수 있다. 대안적으로는, 활성 성분은 수중유 크림 기재 또는 유중수 기재에 의해 크림이 되도록 제형화될 수 있다.
눈에 대한 국소적 투여에 적합한 약제에는 활성 성분을 적절한 부형제, 특히 수성 용매에 용해 또는 현탁시킨 점안액이 포함된다.
직장 투여에 적합한 약제는 좌약 또는 관장제의 형태로 전달될 수 있다.
흡입에 의한 투여에 적합한 약제에는 에어로졸, 분무기 또는 취분기를 갖는 다양한 유형의 가압 분배용기에 의해 생성될 수 있는 미립자 가루 또는 안개가 포함된다. 본 발명의 목적에서, 특히 바람직한 것은 흡입제로서 투여하기 위한 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형의 분말이다.
질 투여에 적합한 약제는 페서리 (pessary), 탐폰 (tampon), 크림, 겔, 페이스트, 폼 (foam) 또는 스프레이 제형으로 전달될 수 있다.
앞서 구체적으로 언급된 성분 외에도, 본 발명에 따른 약제가 또한 특정 유형의 약학적 제형과 관련된 분야에서 일반적인 기타 다른 작용제를 포함할 수도 있음은 당연하다.
본 발명은 추가로 하기의 별도 포장으로 이루어진 세트 (키트) 에 관한 것이다:
a) 유효량의 침전, 재용해 또는 현탁된 형태인 항-EGFR 항체, 바람직하게는 단일클론 항-EGFR 항체, 특히 바람직하게는 Mab C225 (세툭시마브) 또는 Mab h425 (EMD 72000) 및/또는 이들의 변종 또는 단편의 침전물 및/또는 결정, 및
b) 유효량의 추가적 약제 활성 성분.
세트는 적절한 용기, 예컨대 박스 또는 카튼 (carton), 개개의 병, 백 또는 앰플을 함유한다. 세트는, 예를 들면, 유효량의 임의로는 재용해된 형태인 본 발명에 따른 고체형, 및 유효량의 용해되거나 동결건조된 형태인 추가적 약제 활성 성분을 각자 함유한 별개의 앰플을 함유할 수도 있다.
본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형의 치료적 유효량은, 예를 들면, 연령 및 체중, 치료가 필요한 정확한 질환 상태, 및 이의 심각도, 제형의 특성 및 투여 방법을 포함하는 다수의 인자에 의존하고, 궁극적으로는 치료하는 의사 또는 수의사에 의해서 결정된다. 그러나, 종양 성장, 예를 들면 장암 또는 유방암의 치료를 위한 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 유효량은, 일반적으로는 1 일 당 수용자 (포유류) 의 체중 kg 당 0.1 내지 100 mg 범위 및 특히 전형적으로는 1 일 당 체중 kg 당 1 내지 10 mg 범위이다. 즉, 70 kg 의 성체 포유류에 대한 1 일의 실제 양은 일반적으로 70 내지 700 mg 일 것인데, 여기서 상기 양은 1 일 당 단일 투여량으로 주어지거나 일반적으로는 1 일 당 일련의 하위-투여량 (예를 들면 2, 3, 4, 5 또는 6) 으로 주어짐으로써, 전체 일간 투여량이 동일하도록 할 수 있다. 적절한 항체 역가는 당업자에게 공지된 방법으로 측정된다. 투여에 제안된 양은 일반적으로 목적한 종양 저해 작용을 달성하기에 충분한 양이다. 그러나, 투여량은 또한 부작용, 예컨대 비목적한 교차 반응, 과민 반응 등이 발생하지 않도록 가능한 한 낮게 선택되어야 한다.
본 발명은 추가로 침전된 비-결정질, 침전된 결정질 또는 용해되거나 현탁된 형태인 생물학적 활성 항체 및/또는 이의 변종 및/또는 단편 중 하나를 포함한 의약 제조에서의, 본 발명에 따른 고체형의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 의약은, 특히, 질환 및 질환 상태의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다. 그러므로, 본 발명은 질환의 치료 및/또는 예방용 의약 제조에서의, 침전, 재용해 또는 현탁된 형태인 본 발명에 따른 항-EGFR 항체, 바람직하게는 단일클론 항-EGFR 항체, 특히 바람직하게는 Mab C225 (세툭시마브) 또는 Mab h425 (EMD 72000) 및/또는 이들의 변종 또는 단편의 고체형의 용도에 관한 것이다.
다양한 시험관 내 및 생체 내 연구에는, 예를 들면 암 세포 증식의 저해, 종양-매개 혈관신생의 감소, 암 세포 세포자멸사의 유도 및 방사선 치료요법과 통상적 화학요법의 독성 효과 증가에 의해서, 종양에 대한 항체로 EGFR 을 다양한 수준으로 차단하는 것이 나타나 있다.
재용해 또는 현탁된 형태인 본 발명에 따른 항체의 고체형을 포함한 약제는 EGFR 을 효과적으로 조절, 조정 또는 저해할 수 있고, 그러므로 조절되지 않거나 장애적인 EGFR 활성과 연관된 질환의 예방 및/또는 치료에 사용할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형은 그러므로 특정 형태의 암 치료 및 병적인 혈관신생, 예컨대 당뇨병성 망막증 또는 염증에 의해 유발된 질병에서 사용할 수 있다.
그러므로 본 발명은 추가로 EGFR 및/또는 EGFR-매개 신호 변환에 의해 유발, 매개 및/또는 만연된 질환의 치료 및/또는 예방용 의약 제조에서의, 침전, 재용해 또는 재현탁된 형태인 본 발명에 따른 고체형의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 약제는 예를 들면 암종 (예를 들면 폐, 췌장, 갑상선, 방광 또는 결장의 암종), 골수병 (예를 들면 골수성 백혈병) 또는 선종 (예를 들면 결장 융모 선종) 과 같은 고형 암종을 포함한 암, 병적 혈관신생 및 전이성 세포 이동의 치료 및/또는 예방에 특히 적합하다. 약제는 추가로 보체 활성화-의존성 만성 염증 (Niculescu et al. (2002) Immunol. Res., 24: 191-199) 및 HIV-1 (인간 면역결핍 바이러스 제 1 형) 에 의해 유도된 면역결핍 (Popik et al. (1998) J Virol, 72: 6406-6413) 의 치료에 유용하다.
또한, 본 약제는 포유류, 특히 인간에 대한 EGFR-유도성 질환의 치료에서의 약학적 활성 성분으로 적절하다. "EGFR-유도성 질환" 이라는 용어는 EGFR 활성에 의존하는 병리학적 상태에 관한 것이다. EGFR 은 증식, 부착 및 이동, 뿐만 아니라 분화를 포함하는 다양한 세포 활동의 신호 변환 경로에 직간접적으로 관여한다. EGFR 활성과 관련된 질환에는 종양 세포의 증식, 고형 종양의 성장을 촉진하는 병적인 신혈관형성, 눈에서의 신혈관형성 (당뇨병성 망막증, 노화-유도성 시력감퇴 등) 및 염증 (건선, 류머티즘성 관절염 등) 이 포함된다.
본원에서 논의되는 질병은 일반적으로 과잉증식성 및 비-과잉증식성 질병의 2 가지 군으로 분류된다. 이와 관련하여, 건선, 관절염, 염증, 자궁내막증, 흉터 형성, 양성 전립선 비대증, 면역 질환, 자가면역 질환 및 면역결핍증은 비-암성 질환으로 간주되고, 이들 중에서 관절염, 염증, 면역 질환, 자가면역 질환 및 면역결핍증은 일반적으로 비-과잉증식성 질병으로 간주된다.
이와 관련하여, 뇌암, 폐암, 편평상피 세포 암종, 방광암, 위암, 췌장암, 간암, 신장암, 결직장암, 유방암, 두부암, 경부암, 식도암, 부인과 암, 갑상선암, 임파종, 만성 백혈병 및 급성 백혈병은 암성 질환으로 간주되고, 이들 모두는 일반적으로 과잉증식성 질병의 군에 속하는 것으로 간주된다. 구체적으로는, 암 세포 성장 및 특히 EGFR 에 의해 직간접적으로 매개되는 암 세포 성장이 본 발명의 표적을 나타내는 질병이다.
본 발명에 따른 약제는 이종이식 종양 모델에서 생체 내 항증식 작용을 갖는 것으로 나타날 수 있다. 본 발명에 따른 약제는 과잉증식성 질병에 걸린 환자에게, 예를 들면 종양 성장의 저해, 림프증식성 질병과 관련된 염증의 감소, 이식 거부반응 또는 조직 수리로 인한 신경적 손상의 저해 등을 위해 투여된다. 본 약제는 예방 또는 치료 목적에 유용하다. 본원에서 사용되는 "치료하다" 라는 용어는 질환의 예방 및 현존하는 병의 치료 둘 다에 관한 것으로서 사용된다. 증식의 예방은 명백한 질환의 발달 전에, 예를 들면 종양 성장의 예방, 전이적 성장의 예방, 심혈관 수술과 관련된 재협착의 감소 등을 위해 본 발명에 따른 약제의 투여함으로써 달성된다. 대안적으로, 약제는 환자의 임상적 증후를 안정시키거나 개선시킴으로써, 계속되는 질환을 치료하는 데 사용된다.
숙주 또는 환자는 임의의 포유류 종, 예를 들면 영장류 종, 특히 인간; 마우스, 래트 및 햄스터를 포함하는 설치류; 토끼, 말, 소, 개, 고양이 등에 속할 수 있다. 인간 질환의 치료에 대한 모델을 제공하는 동물 모델이 실험 연구에서 중요하다.
본 발명에 따른 약제로의 치료에 대한 특정 세포의 수용성은 시험관 내 시험으로 측정할 수 있다. 전형적으로는, 세포 배양물을 상이한 농도의 본 발명에 따른 약제와 함께, 활성 성분이 세포 사멸을 유도하거나 이동을 저해할 수 있기에 충분한 기간, 일반적으로는 약 1 시간 내지 1 주 동안 인큐베이션한다. 시험관 내 시험은 생체검사 샘플로부터 배양된 세포를 사용하여 수행할 수 있다. 그 다음, 처리 후에 잔류한 생존 세포를 계수한다.
투여량은 사용된 특정 약제, 특정 질병, 환자 상태 등에 따라 달라진다. 전형적으로, 치료적 투여량은 환자의 생존을 유지시키면서, 표적 조직에서의 비목적한 세포 집단을 상당히 감소시키기에는 충분한 양이다. 치료는 일반적으로 상당한 감소, 예를 들면 약 50 % 이상의 특정 세포 수 감소가 발생할 때까지 계속하고, 체내에서 비목적한 세포가 본질적으로 검출되지 않을 때까지 계속할 수 있다.
다양한 분석 시스템을 EGFR 저해제의 확인에 이용할 수 있다. 섬광 근접 분석 (Sorg et al., J. of. Biomolecular Screening, 2002, 7, 11-19) 및 플래쉬플레이트 분석에서는, 기질로서의 단백질 또는 펩티드의 방사성 인산화를 γATP 를 사용하여 측정한다. 저해제 화합물의 존재 하에서, 방사성 신호의 감소 또는 전무가 검출될 수 있다. 추가로, 균일한 시간-분해 형광 공명 에너지 전이 (HTR-FRET) 및 형광 편광 (FP) 기술이 분석 방법으로 유용하다 (Sills et al., J. of Biomolecular Screening, 2002, 191-214).
다른 비-방사성 ELISA 분석 방법은 특이적 포스포-항체 (포스포-AB) 를 사용한다. 포스포-AB 는 오직 인산화된 기질에만 결합한다. 상기 결합은 2 차 페록시다제-접합 항-양 항체를 사용하여 화학발광에 의해 검출할 수 있다 (Ross et al., 2002, Biochem. J., just about to be published, manuscript BJ20020786).
세포 증식 및 세포 사멸 (세포자멸사) 의 조절이상과 관련된 다수의 질병 및 질환 상태가 존재한다. 본 발명에 따른 약제로 치료, 예방 또는 개선시킬 수 있는 질병 및 질환 상태에는 이하에 나열된 질병 및 질환 상태가 포하되지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 약제는 혈관을 통한 혈류의 제한, 예를 들면 신생내막 폐색성 병변을 초래하는, 이 혈관 내막층에서의 평활근 세포 및/또는 염증 세포의 증식 및/또는 이동을 수반하는 다수의 상이한 질병 및 질환 상태의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 중요한 폐색성 이식 혈관 질병에는 아테롬성 동맥경화증, 이식 후의 관상 동맥 질환, 정맥 이식 협착, 문합 주위 보철술 재협착, 혈관성형술 또는 스텐트 삽입술 후의 재협착 등이 포함된다.
본 발명은 암의 치료 또는 예방에서의 본 발명에 따른 약제의 용도에 관한 것이다. 그러므로 본 발명은 특히 바람직하게는 종양 및/또는 종양 전이의 치료 및/또는 예방용 의약 제조에서의 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형의 용도에 관한 것인데, 여기서 종양은 특히 바람직하게는 뇌종양, 비뇨생식관 종양, 림프계 종양, 위종양, 후두부 종양, 단핵구성 백혈병, 폐 선암, 소세포성 폐 암종, 췌장암, 교아세포종 및 유방암종으로 이루어진 군에서 선택되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 추가로 편평상피 세포 암종, 방광암, 위암, 간암, 신장암, 결직장암, 유방암, 두부암, 경부암, 식도암, 부인과 암, 췌장암, 임파종, 만성 백혈병 및 급성 백혈병으로 이루어진 암성 질병으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 치료용 의약 제조에서의 본 발명에 따른 약제의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 약제는 암 치료를 위해서 환자에게 투여될 수 있다. 본 약제는 종양 혈관신생을 저해함으로써 종양의 성장에 영향을 준다 (J. Rak et al. Cancer Research, 55: 4575-4580, 1995). 본 발명에 따른 약제의 혈관신생 저해성은 또한 망막 신혈관형성과 관련된 특정 형태의 실명 치료에 적절하다.
그러므로 본 발명은 또한 혈관신생에 의해 유발, 매개 및/또는 만연된 질환의 치료 및/또는 예방용 의약 제조에서의, 침전, 재용해 또는 현탁된 형태인 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형의 용도에 관한 것이다.
혈관신생에 관여하는 상기 유형의 질환은 안질환, 예컨대 망막 혈관형성, 당뇨병성 망막증, 노화-유도성 시력감퇴 등이다.
그러므로 본 발명은 또한 망막 혈관형성, 당뇨병성 망막증, 노화-유도성 시력감퇴 및/또는 염증 질환으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 치료 및/또는 예방용 의약 제조에서의, 침전, 재용해 또는 현탁된 형태인 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 추가로 건선, 류머티즘성 관절염, 접촉성 피부염, 후기형 과민 반응, 염증, 자궁내막증, 흉터 형성, 양성 전립선 비대증, 면역 질환, 자가면역 질환 및 면역결핍증으로 이루어진 군에서 선택된 질환의 치료 및/또는 예방에서의, 본 발명에 따른 약제의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 골육종, 골관절염 및 척추염으로 이루어진 군에서 선택된 골 병리의 치료 및/또는 예방에서의, 본 발명에 따른 약제의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 따른 약제는 추가로, 현존하는 특정 암 화학요법 및 방사선요법에 부가적이거나 공동상승적인 효과를 제공하는 데 사용될 수 있고/거나 현존하는 특정 암 화학요법 및 방사선요법의 효능을 회복시키는 데 사용될 수 있다.
그러므로 본 발명은 또한 치료적 유효량의 침전, 재용해 또는 현탁된 형태인 본 발명에 따른 고체형을 1) 에스트로겐 수용체 조절제, 2) 안드로겐 수용체 조절제, 3) 레티노이드 수용체 조절제, 4) 세포살상제, 5) 항증식제, 6) 페닐 단백질 전이효소 저해제, 7) HMG-CoA 환원효소 저해제, 8) HIV 단백질분해효소 저해제, 9) 역 전사효소 저해제, 10) 성장 인자 수용체 저해제 및 11) 혈관신생 저해제로 이루어진 군으로부터의 화합물과 조합하여 투여하는, 질환의 치료 및/또는 예방용 약제 제조에서의, 침전, 재용해 또는 현탁된 형태인 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형의 용도에 관한 것이다.
그러므로 본 발명은 또한 치료적 유효량의 침전, 재용해 또는 현탁된 형태인 본 발명에 따른 고체형을 방사선요법 및 1) 에스트로겐 수용체 조절제, 2) 안드로겐 수용체 조절제, 3) 레티노이드 수용체 조절제, 4) 세포살상제, 5) 항증식제, 6) 페닐 단백질 전이효소 저해제, 7) HMG-CoA 환원효소 저해제, 8) HIV 단백질분해효소 저해제, 9) 역 전사효소 저해제, 10) 성장 인자 수용체 저해제 및 11) 혈관신생 저해제로 이루어진 군으로부터의 화합물과 조합하여 투여하는, 질환의 치료 및/또는 예방용 약제 제조에서의, 침전, 재용해 또는 현탁된 형태인 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형의 용도에 관한 것이다.
즉, 본 발명에 따른 약제는 또한 치료될 증상에 대한 그 특정 유용성에 대해서 선택된 익히 공지된 다른 치료제와 함께 투여될 수 있다. 예를 들면, 골 증상의 경우, 유리한 조합에는 항골흡수성 비스포스포네이트, 예컨대 알렌드로네이트 및 리세드로네이트; 인테그린 차단제 (추가로 이하에 정의되는 바와 같은 것), 예컨대 αvβ3 길항제; 호르몬 대체 요법에 사용되는 접합 에스트로겐, 예컨대 Prempro®, Premarin® 및 Endometrion®; 선택적 에스테로겐 수용체 조절제 (SERM), 예컨대 랄록시펜, 드롤록시펜, CP-336.156 (Pfizer) 및 라소폭시펜; 카텝신 K 저해제; 및 ATP 양성자 펌프 저해제와의 조합이 포함된다.
본 약제는 또한 공지된 항암제와의 조합에 적절하다. 이들 공지된 항암제에는 하기가 포함된다: 에스트로겐 수용체 조절제, 안드로겐 수용체 조절제, 레티노이드 수용체 조절제, 세포살상제, 항증식제, 페닐 단백질 전이효소 저해제, HMG-CoA 환원효소 저해제, HIV 단백질분해효소 저해제, 역 전사효소 저해제, 성장 인자 저해제 및 혈관신생 저해제. 본 화합물은 방사선요법과의 동시 투여에 특히 적절하다.
"에스트로겐 수용체 조절제" 는 기작과 상관없이, 수용체에 대한 에스트로겐의 결합을 방해하거나 저해하는 화합물을 가리킨다. 에스트로겐 수용체 조절제의 예에는 타목시펜, 랄록시펜, 이독시펜, LY353381, LY117081, 토레미펜, 풀베스트란트, 4-[7-(2,2-디메틸-1-옥소프로폭시-4-메틸-2-[4-[2-(1-피페리디닐)에톡시]페닐]-2H-1-벤조피란-3-일]페닐 2,2-디메틸-프로파노에이트, 4,4'-디히드록시벤조페논-2,4-디니트로페닐히드라존 및 SH646 이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
"안드로겐 수용체 조절제" 는 기작과 상관없이, 수용체에 대한 안드로겐의 결합을 방해하거나 저해하는 화합물을 가리킨다. 안드로겐 수용체 조절제의 예에는 피나스테리드 및 다른 5α-환원효소 저해제, 닐루타미드, 플루타미드, 비칼루타미드, 리아로졸 및 아비라테론 아세테이트가 포함된다.
"레티노이드 수용체 조절제" 는 기작과 상관없이, 수용체에 대한 레티노이드의 결합을 방해하거나 저해하는 화합물을 가리킨다. 이러한 레티노이드 수용체 조절제의 예에는 벡사로텐, 트레티노인, 13-시스-레티노산, 9-시스-레티노산, α-디플루오로메틸오르니틴, ILX23-7553, 트랜스-N-(4'-히드록시페닐)레티나미드 및 N-카르복시페닐 레티나미드가 포함된다.
"세포살상제" 는 알킬화제, 종양 괴사 인자, 삽입물질, 미세소관 저해제 및 국소이성화효소 저해제를 포함하는, 주로 세포 기능에 대한 직접적인 작용을 통해 세포 사멸을 초래하거나, 세포 감수분열을 저해 또는 방해하는 화합물을 가리킨다.
세포살상제의 예에는 티라파지민, 세르테네프, 카켁틴, 이포스파미드, 타소네르민, 로니다민, 카르보플라틴, 알트레타민, 프레드니무스틴, 디브로모둘시톨, 라니무스틴, 포테무스틴, 네다플라틴, 옥살리플라틴, 테모졸로미드, 헵타플라틴, 에스트라무스틴, 임프로술판 토실레이트, 트로포스파미드, 니무스틴, 디브로스피듐 클로라이드, 푸미테파, 로바플라틴, 사트라플라틴, 프로피로마이신, 시스플라틴, 이로풀벤, 덱시포스파미드, 시스-아민디클로로(2-메틸피리딘)플라티넘, 벤질구아닌, 글루포스파미드, GPX100, (트랜스,트랜스,트랜스)-비스-무-(헥산-1,6-디아민)-무-[디아민-플라티넘(II)]비스[디아민(클로로)플라티넘(II)] 테트라클로라이드, 디아리지디닐-스페르민, 아르세닉 트리옥시드, 1-(11-도데실아미노-10-히드록시운데실)-3,7-디메틸잔틴, 조루비신, 이다루비신, 다우노루비신, 비산트렌, 미톡산트론, 피라루비신, 피나피드, 발루비신, 암루비신, 안티네오플라스톤, 3'-데아미노-3'-모르폴리노-13-데옥소-10-히드록시카르미노마이신, 안나마이신, 갈라루비신, 엘리나피드, MEN10755 및 4-데메톡시-3-데아미노-3-아지리디닐-4-메틸술포닐다우노루비신이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다 (WO 00/50032 참조).
미세소관 저해제의 예에는 파클리탁셀, 빈데신 술페이트, 3',4'-디데히드로-4'-데옥시-8'-노르빈칼루코블라스틴, 도세탁솔, 리족신, 돌라스타틴, 미보불린 이세티오네이트, 아우리스타틴, 세마도틴, RPR109881, BMS184476, 빈플루닌, 크립토피신, 2,3,4,5,6-펜타플루오로-N-(3-플루오로-4-메톡시페닐)벤젠술폰아미드, 안하이드로빈블라스틴, N,N-디메틸-L-발릴-L-발릴-N-메틸-L-발릴-L-프롤릴-L-프롤린-t-부틸아미드, TDX258 및 BMS188797 이 포함된다.
국소이성화효소 저해제의 일부 예는 토포테칸, 히캅타민, 이리노테칸, 루비테칸, 6-에톡시프로피오닐-3',4'-O-엑소벤질리덴카르트레우신, 9-메톡시-N,N-디메틸-5-니트로피라졸로[3,4,5-클]아크리딘-2-(6H)-프로판아민, 1-아미노-9-에틸-5-플루오로-2,3-디히드로-9-히드록시-4-메틸-1H,12H-벤조[데]피라노[3',4':b,7]인돌리지노[1,2b]퀴놀린-10,13(9H,15H)-디온, 루르토테칸, 7-[2-(N-이소프로필아미노)에틸]-(20S)캄프토테신, BNP1350, BNPI1100, BN80915, BN80942, 에토포시드 포스페이트, 테니포시드, 소부족산, 2'-디메틸아미노-2'-데옥시에토포시드, GL331, N-[2-(디메틸아미노)에틸]-9-히드록시-5,6-디메틸-6H-피리도[4,3-b]카르바졸-1-카르복사미드, 아술라크린, (5a,5aB,8aa,9b)-9-[2-[N-[2-(디메틸아미노)에틸]-N-메틸아미노]에틸]-5-[4-히드록시-3,5-디메톡시페닐]-5,5a,6,8,8a,9-헥소히드로푸로(3',4':6,7)나프토(2,3-d)-1,3-디옥솔-6-온, 2,3-(메틸렌디옥시)-5-메틸-7-히드록시-8-메톡시벤조[c]페난트리디늄, 6,9-비스[(2-아미노에틸)아미노]벤조[g]이소퀴놀린-5,10-디온, 5-(3-아미노프로필아미노)-7,10-디히드록시-2-(2-히드록시에틸아미노메틸)-6H-피라졸로[4,5,1-데]아크리딘-6-온, N-[1-[2-(디에틸아미노)에틸아미노]-7-메톡시-9-옥소-9H-티옥산텐-4-일메틸]포름아미드, N-(2-(디메틸아미노)에틸)아크리딘-4-카르복사미드, 6-[[2-(디메틸아미노)에틸]아미노]-3-히드록시-7H-인데노[2,1-c]퀴놀린-7-온 및 디메스나이다.
"항증식제" 에는 안티센스 RNA 및 DNA 올리고뉴클레오티드, 예컨대 G3139, ODN698, RVASKRAS, GEM231 및 INX3001, 및 항대사산물, 예컨대 에오시타빈, 카르모푸르, 테가푸르, 펜토스타틴, 독시플루리딘, 트리메트렉세이트, 플루다라빈, 카페시타빈, 갈로시타빈, 시타라빈 옥포스페이트, 포스테아빈 소듐 히드레이트, 랄티트렉세드, 팔티트렉시드, 에미테푸르, 티아조푸린, 데시타빈, 놀라트렉세드, 페메트렉세드, 넬자라빈, 2'-데옥시-2'-메틸리덴시티딘, 2'-플루오로메틸렌-2'-데옥시시티딘, N-[5-(2,3-디히드로벤조푸릴)술포닐]-N'-(3,4-디클로로페닐)우레아, N6-[4-데옥시-4-[N2-[2(E),4(E)-테트라데카디에노일]글리실아미노]-L-글리세로-B-L-만노헵토-피라노실]아데닌, 아플리딘, 엑테이나스시딘, 트록사시타빈, 4-[2-아미노-4-옥소-4,6,7,8-테트라히드로-3H-피리미디노[5,4-b]-1,4-티아진-6-일-(S)-에틸]-2,5-티에노일-L-글루탐산, 아미노프테린, 5-플루오로우라실, 알라노신, 11-아세틸-8-(카르바모일옥시메틸)-4-포르밀-6-메톡시-14-옥사-1,11-디아자테트라-시클로(7.4.1.0.0)테트라데카-2,4,6-트리엔-9-일아세트산 에스테르, 스와인소닌, 로메트렉솔, 덱스라족산, 메티오니나제, 2'-시아노-2'-데옥시-N4-팔미토일-1-B-D-아라비노푸라노실 시토신 및 3-아미노피리딘-2-카르복스알데히드 티오세미카르바존이 포함된다. "항증식제" 에는 또한 "혈관신생 저해제" 하에 앞서 나열된 것 이외의 성장 인자에 대한 단일클론 항체, 예컨대 트라스투주마브, 및 재조합 바이러스-매개 유전자 전이를 통해 전달될 수 있는 종양 억제제 유전자, 예컨대 p53 가 포함된다 (예를 들면, 미국 특허 제 6,069,134 호 참조). 본 발명에 따른 약제는 또한 당업자에게 공지된 다른 모든 치료적 항체 또는 전술한 질환과 관련하여 적절한 약학적 활성 성분과 조합하여 투여될 수 있다.
추가로, 침전, 재용해 또는 현탁된 형태인 본 발명에 따른 항체의 본 발명에 따른 고체형은 EGFR 의 활성 또는 발현을 단리 및 조사하는 데 사용될 수 있다. 또한, 이들은 조절되지 않거나 장애적인 EGFR 활성과 연관된 질병에 대한 진단 방법에서 사용하기에 특히 적절하다. 그러므로 본 발명은 추가로 EGFR 의 활성화제 또는 저해제, 특히 바람직하게는 EGFR 의 저해제로서의, 침전, 재용해 또는 현탁된 형태인 본 발명에 따른 항-EGFR 항체의 고체형의 용도에 관한 것이다.
진단 목적에서, 본 발명에 따른 항체는, 예를 들면, 방사성 표지될 수 있다. 바람직한 표지화 방법은 아이오도겐 (iodogen) 방법이다 (Fraker et al., 1978). 진단 목적에서, 항체는 특히 바람직하게는 F(ab')2 단편으로 사용된다. 이로써 우수한 결과가 달성되는데, 이는 배경 제거가 불필요함을 의미한다. 상기 유형의 단편은 공지된 방법에 의해서 제조될 수 있다 (예를 들면, Herlyn et al., 1983). 일반적으로는, 산성 pH 에서 펩신 소화를 수행하고, 소화되지 않은 IgG 및 중쇄 단편으로부터 단백질 A Sepharose™ 크로마토그래피에 의해서 단편을 분리한다.
본 발명에 따른 침전물 및/또는 결정은 바람직하게는 실시예에 기재된 바와 같은 효소 분석에서 쉽게 검출될 수 있는 유리한 생물학적 활성을 나타낸다. 상기 유형의 효소-기반 분석에서, 본 발명에 따른 항체는 바람직하게는, 적절한 범위, 바람직하게는 μM 범위 및 보다 바람직하게는 nM 범위의 IC50 값에 의해 일반적으로 증명되는 저해 효과를 나타내고 유발한다.
측정 방법:
측정 방법과 관련하여, 본 발명은 당업자에게 또는 문헌으로부터 공지된 모든 측정 방법을 포함한다.
결정질 구조는, 예를 들면, X-선 회절 측정에서의 회절 스펙트럼을 참조하여 측정할 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 항체의 결정질 구조는 편광 필터를 사용한 현미경 연구에 의해서 측정할 수 있다. 추가의 측정 방법에는, 이에 제한됨 없이, 전자현미경 사진이 포함된다.
침전, 재용해 또는 재현탁된 형태인 본 발명에 따른 고체형의 단백질 크기, 구조적 무결성, 순도 또는 글리코실화 패턴 측정에는, 이에 제한됨 없이, SE-HPLC, 펩티드 지도화 (소화), N-말단 서열분석, SDS page, TRIS/글리신 구배 겔 (비-감소형), FTIR (푸리에 전환 적외선 스펙트럼) 방법, CD (원편광 2 색성 분광분석법), RAMAN 분광분석법, 탄수화물 염색 (PAS 방법), 올리고당 프로파일링, 단당류 조성물의 측정 및 등전 집중이 포함된다.
본 발명에 따른 고체형 또는 제형의 안정성은, 예를 들면, 이에 제한됨 없이, 안정성 프로그램, 예를 들면 연장된 기간 동안 25 ℃ 및 60 % 상대 대기 습도와 40 ℃ 및 70 % 상대 대기 습도에서의 저장, 및 예를 들면 전술한 측정 방법 (SE-HPLC, FT-IR, SDS-PAGE (감소형 또는 비-감소형)) 에 의한 일정 간격에서의 단백질의 안정성 또는 구조적 무결성 측정의 원조에 의해서 측정될 수 있다.
침전된 결정질, 침전된 비-결정질, 용해 또는 현탁된 형태인 본 발명에 따른 고체형의 생물학적 활성 또는 효능의 측정 방법에는, 예를 들면, 이에 제한됨 없이, ELISA, 생물학적 세포 분석, FTIR 또는 CD 가 포함된다.
침전된 결정질, 침전된 비-결정질, 용해 또는 현탁된 형태인 본 발명에 따른 고체형의 응집 감소 경향 및 이로 인한 고농축 제형의 제조 가능성, 결정 크기 또는 침전물 크기의 측정 방법에는, 예를 들면, 이에 제한됨 없이, 시각적 검사, 하위-가시적 입자 분석, 비탁분석이나 혼탁분석 또는 동적 광산란 특징화가 포함된다.
상기 및 하기에서, 모든 온도는 ℃ 로 지시된다. 하기 실시예에서, "통상의 후처리" 는 최종 생성물의 구성에 따라서, 필요한 경우 물을 첨가하고, 필요한 경우 pH 를 2 내지 10 으로 조정하는 것을 의미한다.
실시예 1: 본 발명에 따라 사용할 수 있는 작용제 및 침전 및/또는 결정화 조건
하기 목록은 각 경우에서 당업자에게 공지된 상기 화합물의 가능한 모든 수화물, 관련 염 및 유도체를 포함한다.
1. 침전 시약:
1.1 염:
예를 들면 소듐 아세테이트 트리히드레이트, 포타슘 클로라이드, 소듐 클로라이드, 트리소듐 시트레이트 디히드레이트, 디포타슘 히드로겐포스페이트, 디소듐 히드로겐포스페이트 디히드레이트, 암모늄 술페이트, 암모늄 아세테이트, 암모늄 브로마이드, 암모늄 클로라이드, 트리암모늄 시트레이트, 디암모늄 히드로겐시트레이트, 암모늄 디히드로겐포스페이트, 디암모늄 히드로겐포스페이트, 디암모늄 타르트레이트, 시트르산 모노히드레이트, 이미다졸, 포타슘 아세테이트, 포타슘 브로마 이드, 트리포타슘 시트레이트 모노히드레이트, 포타슘 디히드로겐포스페이트, 포타슘 술페이트, 마그네슘 아세테이트 테트라히드레이트, 마그네슘 브로마이드 헥사히드레이트, 마그네슘 클로라이드 헥사히드레이트, 마그네슘 술페이트 헵타히드레이트, 소듐 디히드로겐포스페이트 모노히드레이트, 소듐 술페이트 데카히드레이트, 프롤린, 숙신산, 아연 아세테이트 디히드레이트, 아연 술페이트 헵타히드레이트.
1.2 중합체:
예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 (PEG):
시클로덱스트린, 덱스트란, 소듐 카르복시메틸셀룰로스 (Na-CMC), 폴록사머, 폴리아크릴산, 폴리에틸렌 글리콜 모노메틸 에테르 (mPEG), 폴리프로필렌 글리콜 (PPG), 폴리비닐 알코올 (PVA), 폴리비닐피롤리돈 (PVP).
1.3 유기 용매:
예를 들면 에탄올, 글리세롤.
2. 보조제:
예를 들면 점성-변형 물질, 세정제 (예를 들면 Tween®, Solutol® HS 15, Pluronic®, Cremophor® EL, Avacel® 20, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트), 환원제 (글루타티온, 2-메르캅토에탄올, 디티오트레이톨), 착제 (EDTA, EGTA).
3. 완충제 :
예를 들면 포스페이트 완충제: Na (또는 K) 포스페이트; 또한 등장제 (예를 들면 NaCl (또는 KCl)) 를 첨가한 것, 가능한 pH 약 6.0 내지 8.2.
시트레이트 완충제: Na 시트레이트 또는 시트르산, 가능한 pH 약 2.2 내지 6.5; 또한 등장제 (예를 들면 NaCl) 를 첨가한 것; 다른 염들 또한 등장화에 대해 고려된다.
숙시네이트 완충제: pH 약 4.8 내지 6.3.
아세테이트 완충제: 소듐 아세테이트, pH 약 2.5 내지 6.
히스티딘 완충제: pH 약 6.0 내지 7.8.
글루탐산: pH 8.0 내지 10.2.
글리신 (N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신): pH 약 8.6 내지 10.6.
글리시네이트 완충제: pH 약 6.5 내지 7.5.
이미다졸: pH 6.2 내지 7.8.
포타슘 클로라이드: pH 약 1.0 내지 2.2.
락테이트 완충제: pH 약 3.0 내지 6.0.
말레에이트 완충제: pH 약 2.5 내지 5.0.
타르트레이트 완충제: pH 약 3.0 내지 5.0.
TRIS: pH 약 6.8 내지 7.7.
포스페이트/시트레이트 완충제.
4. pH 범위:
이론상 고려할 수 있는 pH 는 pH 4 내지 10, 바람직하게는 pH 5 내지 9 이다.
5. 온도 범위:
이론상 고려할 수 있는 온도 범위는 -10 ℃ 내지 40 ℃; 바람직하게는 0 내지 25 ℃, 특히 바람직하게는 4 ℃ 내지 20 ℃ 의 온도이다.
6. 안정제:
6.1 아미노산:
예를 들면 아르기닌, 오르니틴, 리신, 히스티딘, 글루탐산, 아스파트산, 이소루신, 루신, 알라닌, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 세린, 프롤린.
6.2 당 및 당 알코올:
예를 들면, 수크로스, 락토스, 글루코스, 만노스, 말토스, 갈락토스, 프룩토스, 소르보스, 라피노스, 트레할로스, 글루코사민, N-메틸글루코사민, 갈락토사민, 뉴라믹산.
6.3 항산화제:
예를 들면 아세톤 소듐 비술파이트, 아스코르브산, 아스코르브산 에스테르, 부틸히드록시아니솔 (BHA), 부틸히드록시톨루엔 (BHT), 시스테인, 노르디히드로구아이아레트산 (NDGA), 모노티오글리세롤, 소듐 비술파이트, 소듐 메타비술파이트, 토코페롤, 글루타티온.
6.4 보존제:
예를 들면 m-크레졸, 클로로크레졸, 페놀, 벤질 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤, 부틸파라벤, 클로로부탄올, 페닐 수은 니트레이트, 페닐 수은 아세테이트, 티메르살, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드.
6.5 시클로덱스트린 :
예를 들면 히드록시프로필-β-시클로덱스트린, 술포부틸에틸-β-시클로덱스트린, γ-시클로덱스트린, α-시클로덱스트린.
6.6 알부민:
예를 들면 인간 혈청 알부민 (HSA), 소 혈청 알부민 (BSA).
6.7 다가 알코올:
예를 들면 글리세롤, 에탄올, 만니톨.
6.8 염:
예를 들면 아세테이트 염 (예를 들면 소듐 아세테이트), 마그네슘 클로라이드, 칼슘 클로라이드, 트로메타민, EDTA (예를 들면 Na-EDTA).
7. 등장제 :
예를 들면 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 글루코스, 글리세롤, 덱스트로스, 소듐 술페이트.
실시예 2: 암모늄 술페이트에 의한 Erbitux ™ 의 결정화
단백질 500 ㎕ (10 mM 포스페이트 중 20 mg/ml, pH 8.0)
완충제 400 ㎕ (10 mM 포스페이트, pH 8.0)
침전제 100 ㎕ (10 mM 포스페이트 중 포화 암모늄 술페이트 용액, pH 8.0)
단백질 용액에 대한 침전 시약의 첨가는 용액 중에서 수행하였다 (배취 공정). 피펫으로 옮긴 후, 샘플을 "핸드 쉐이킹 (hand shaking)" 에 의해서 혼합하여야 한다. 공정은 실온 또는 4 ℃ 에서 수행할 수 있다.
실시예 3: 에탄올에 의한 Erbitux ™ 의 결정화
단백질 500 ㎕ (10 mM 시트레이트 중 20 mg/ml, pH 5.5)
완충제 400 ㎕ (10 mM 시트레이트, pH 5.5)
침전제 100 ㎕ (10 mM 시트레이트 중 50 % (v/v) 의 에탄올, pH 5.5)
또는
단백질 500 ㎕ (10 mM 시트레이트 중 20 mg/ml, pH 5.5)
침전제 500 ㎕ (10 mM 시트레이트 중 50 % (v/v) 의 에탄올, pH 5.5)
단백질 용액에 대한 침전 시약의 첨가는 용액 중에서 수행하였다 (배취 공정). 피펫으로 옮긴 후, 샘플을 "핸드 쉐이킹" 에 의해서 혼합하여야 한다. 공정은 실온 또는 4 ℃ 에서 수행할 수 있다.
실시예 4: 암모늄 술페이트에 의한 Erbitux ™ 의 침전
단백질 500 ㎕ (10 mM 포스페이트 중 20 mg/ml, pH 8.0)
침전제 500 ㎕ (10 mM 포스페이트 중 포화 암모늄 술페이트 용액, pH 8.0)
또는
단백질 200 ㎕ (10 mM 포스페이트 중 20 mg/ml, pH 8.0)
침전제 800 ㎕ (10 mM 포스페이트 중 포화 암모늄 술페이트 용액, pH 8.0)
또는
단백질 500 ㎕ (10 mM 시트레이트 중 20 mg/ml, pH 5.5)
침전제 500 ㎕ (10 mM 시트레이트 중 포화 암모늄 술페이트 용액, pH 5.5)
또는
단백질 200 ㎕ (10 mM 시트레이트 중 20 mg/ml, pH 5.5)
침전제 800 ㎕ (10 mM 시트레이트 중 포화 암모늄 술페이트 용액, pH 5.5)
단백질 용액에 대한 침전 시약의 첨가는 용액 중에서 수행하였다 (배취 공정). 피펫으로 옮긴 후, 샘플을 "핸드 쉐이킹" 에 의해서 혼합하여야 한다. 공정은 실온 또는 4 ℃ 에서 수행할 수 있다.
실시예 5: PEG 에 의한 Erbitux ™ 의 침전
단백질 500 ㎕ (10 mM 포스페이트 중 20 mg/ml, pH 8.0)
침전제 500 ㎕ (10 mM 포스페이트 중 50 % (w/v) 의 PEG 4000, pH 8.0)
또는
단백질 500 ㎕ (10 mM 시트레이트 중 20 mg/ml, pH 5.5)
침전제 500 ㎕ (10 mM 시트레이트 중 50 % (w/v) 의 PEG 4000, pH 5.5)
또는
단백질 500 ㎕ (10 mM 포스페이트 중 20 mg/ml, pH 8.0)
침전제 500 ㎕ (10 mM 포스페이트 중 50 % (w/v) 의 PEG 8000, pH 8.0)
또는
단백질 500 ㎕ (10 mM 시트레이트 중 20 mg/ml, pH 5.5)
침전제 500 ㎕ (10 mM 시트레이트 중 50 % (w/v) 의 PEG 8000, pH 5.5)
단백질 용액에 대한 침전 시약의 첨가는 용액 중에서 수행하였다 (배취 공정). 피펫으로 옮긴 후, 샘플을 "핸드 쉐이킹" 에 의해서 혼합하여야 한다. 공정은 실온 또는 4 ℃ 에서 수행할 수 있다.
실시예 6: 결정 형태의 현미경 조사
실시예 1 및 2 에서 수득된 결정을 현미경으로 조사하였다. 결정에서 전형적인 복굴절성 및 단백질에서 전형적인 쿠마시 브릴리언트 블루 (Coomassie Brilliant Blue) 에 의한 염색성이 둘 다 검출되었다.
약 50 내지 200 ㎛ 의 크기를 갖는 결정이 발견되었다.
실시예 7: 천연성에 대한 침전물의 조사
실시예 4 및 5 에서 수득된 침전물을 재분산시켜 FT-IR 분광분석법으로 조사하였다. 침전 전 시작 물질과 재분산된 침전물의 아미드 I-2 유도 스펙트럼은 일치하였다.
실시예 8: WO 02072636 에 기재된 결정화 방법의 수행
특허 출원 WO 02072636 으로부터의 결과를 검사하기 위해, 먼저 WO 02072636 에 기재된 대조군 실험에서의, 추후에 종자 결정으로 사용될 수 있는 결정을 Wizard I 스크린에 의해 수득하는 것을 시도하였다. 칼슘 클로라이드 또는 칼슘 아세테이트를 사용한 침전 조건 하에서 침상 결정이 수득되었지만, 이들은 단백질이 없는 시트레이트 완충액에서도 마찬가지로 형성되었다. 즉, 기재된 침상 결정은 WO 02072636 에 기재된 방법을 사용하였을 때 단백질 용액 및 음성 대조군 (단백질 없음) 둘 다에서 수득되었다. 이로부터, 침전 시약의 결정에 최대한 단백질 함유물이 추적적으로 존재함이 명백해졌다.

Claims (18)

  1. 침전 시약에 의해서 수성 매질에 용해 또는 현탁된 항체 및/또는 이의 변종 및/또는 단편 중 하나를 침전시킴으로써 수득가능한, 수성 매질 중에서의 용해 또는 현탁을 통해 생물학적으로 활성인 항체 단백질을 생성시키는 항-EGFR 항체 및 또는 이의 변종 및/또는 단편 중 하나의 고체형.
  2. 제 1 항에 있어서, 침전 시약으로 염, 중합체 및/또는 유기 용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 고체형.
  3. 제 2 항에 있어서, 침전 시약으로 암모늄 술페이트, 소듐 아세테이트, 소듐 시트레이트, 포타슘 포스페이트, PEG 및/또는 에탄올을 사용하는 것을 특징으로 하는 고체형.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 침전물인 것을 특징으로 하는 고체형.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 결정인 것을 특징으로 하는 고체형.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 항-EGFR 항체가 단일클론 (monoclonal) 이고, 쥣과 동물 또는 인간 기원의 것임을 특징으로 하는 고체형.
  7. 제 6 항에 있어서, 항-EGFR 항체가 쥣과 동물 기원의 것이고, 키메릭 (chimeric) 이거나 인간화된 것임을 특징으로 하는 고체형.
  8. 제 7 항에 있어서, 항-EGFR 항체가 Mab C225 (세툭시마브) 또는 Mab h425 (EMD 72000) 인 것을 특징으로 하는 고체형.
  9. 침전 시약에 의해서 수용액에 용해 또는 현탁된 항체 및/또는 이의 변종 및/또는 단편 중 하나를 침전시킨 다음, 상기 침전 생성물을 분리시키는 것을 특징으로 하는, 수성 매질 중에서의 용해 또는 현탁을 통해 생물학적으로 활성인 항체 단백질을 생성시키는 항-EGFR 항체 및/또는 이의 변종 및/또는 단편 중 하나의 고체형의 제조 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 침전 시약으로 암모늄 술페이트, PEG 및/또는 에탄올을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9 항 또는 제 10 항에 있어서, 배취 (batch) 형식으로 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 저장-안정성 약제로서의 고체형.
  13. 침전된 비-결정질, 침전된 결정질 또는 가용성이거나 현탁된 형태인 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 고체형 하나 이상, 및 임의적 부형제 및/또는 보조제 및/또는 추가의 약학적 활성 성분을 포함한 약학적 제제.
  14. 제 13 항에 있어서, 항체 농도가 10 내지 200 mg/ml 인 것을 특징으로 하는 약학적 제제.
  15. 제 14 항에 있어서, 항체 농도가 50 내지 150 mg/ml 인 것을 특징으로 하는 약학적 제제.
  16. 침전된 비-결정질, 침전된 결정질 또는 용해되거나 현탁된 형태인 생물학적 활성 항체 및/또는 이의 변종 및/또는 단편 중 하나를 포함한 의약 제조에서의, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 항-EGFR 항체 및/또는 이의 변종 및/또는 단편 중 하나의 고체형의 용도.
  17. 제 16 항에 있어서, 종양 및/또는 종양 전이의 치료 및/또는 예방용 의약 제 조에서의 용도.
  18. 제 17 항에 있어서, 종양이 뇌종양, 비뇨생식관 종양, 림프계 종양, 위종양, 후두부 종양, 단핵구성 백혈병, 폐 선암, 소세포성 폐 암종, 췌장암, 교아세포종 및 유방암종으로 이루어진 군에서 선택되는 용도.
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