CN105810072A - 一种蛋白质结晶的教学试剂盒及其方法 - Google Patents
一种蛋白质结晶的教学试剂盒及其方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种蛋白质结晶的教学试剂盒，该试剂盒内的物品包括3种不同的蛋白沉淀剂，溶菌酶粉末，稀释缓冲液，染色剂，过滤器，结晶平皿和封口膜。本发明还涉及应用该教学试剂盒进行蛋白质结晶的方法。本发明教学试剂盒针对生物科学教学中的溶菌酶结晶实验，将实验所需的试剂和材料装入试剂盒内，降低了实验准备工作强度，该教学试剂盒操作简便，有助于实验人员在较短的时间内掌握并完成蛋白质结晶实验，提高了实验效率，节约了成本，可以在生物基础教学实验中进行大规模推广。
Description
技术领域
本发明涉及一种蛋白质结晶的教学试剂盒，用于生物科学教学中蛋白质结晶的实验。本发明还涉及应用前述试剂盒进行蛋白质结晶的方法。
背景技术
蛋白质的三维结构是生命科学研究中极为重要的信息，最常用的蛋白质三维结构的解析手段是X射线衍射，而获得高质量的蛋白质晶体是使用该技术进行蛋白质结构分析的重要前提。鸡蛋清溶菌酶是较容易生长出理想单晶的蛋白质，具有结晶试剂简单、成晶时间短和蛋白质晶体易于长大的特点，因此被作为一种重要的模型蛋白，广泛应用于蛋白质结晶机理和方法的基础研究。
目前，市场上已有多种用于蛋白质结晶条件筛选的试剂盒，具有方便、快捷、高效和结果准确可靠的特点，但是主要是用于科学研究等领域，并不适合基础教学实验。现有的由HamptonResearch公司推出的蛋白质结晶演示试剂主要是通过提纯鸡蛋清中的溶菌酶来进行蛋白质结晶实验，该演示试剂为科研人员进行蛋白质结晶技术的培训提供了便利，但仍存在以下缺点使它并不适合应用于基础的生物科学教学实验：（1）该演示试剂不是一个整体的试剂盒，实验所需试剂和材料需分别购买；（2）该试剂盒缺乏对蛋白质结晶实验的具体操作流程的指导，不便于学生理解；（3）无法鉴别盐晶和蛋白质晶体。
由于我国生物基础研究和药物筛选领域对蛋白质及其复合物进行结构解析和功能分析的研究越来越多，因此发明一种适用于生物科学教学的教学试剂盒尤为重要和迫切，将此技术引入实验教学，对培养学生的科研兴趣有重大意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供一种可直接用于生物科学教学实验的蛋白质结晶的教学试剂盒，以降低实验成本，提高实验效率。
本发明所要解决的另一个技术问题是还提供了一种应用上述试剂盒进行蛋白质结晶的方法。
本发明所要解决的再一个技术问题是还提供了另一种应用上述试剂盒进行蛋白质结晶的方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种蛋白质结晶的教学试剂盒，其特点是，其由下列物品构成：
（1）蛋白沉淀剂A，1支，其组成为：体积分数30%的PEG4000，浓度0.05M、pH4.5的醋酸钠缓冲液，浓度1M的氯化钠；
（2）蛋白沉淀剂B，1支，其组成为：体积分数4%的PEG4000，浓度676.7mM、pH3.0的醋酸钠缓冲液，质量浓度13.3%的氯化钠；
（3）蛋白沉淀剂C，1支，其组成为：浓度0.1M、pH7.4的醋酸钠缓冲液，质量浓度6.5%的氯化钠；
（4）溶菌酶粉末，20mg，1袋；
（5）稀释缓冲液：浓度0.02M、pH4.6的醋酸钠缓冲液，1支；
（6）染色剂：质量浓度0.3%的亚甲基蓝，1支；
（7）过滤器，1个；
（8）结晶平皿，30个；
（9）封口膜，1卷。
本发明所述的溶菌酶粉末是将从鸡蛋清中提取的溶菌酶进行干燥处理后得到的，为市售的成熟产品，其中一个生产销售商为Sigma-Aldrich公司，产品编号：62970；产品名称：Lysozymefromchickeneggwhite；剂型：粉剂；规格：5g；保存温度：-20℃。
本发明所述的教学试剂盒针对蛋白质结晶实验，将试剂和材料装入试剂盒内，试剂盒中的材料根据10个实验小组的使用量设计，一组材料可供一个2-3人实验小组的学生使用，十组材料可供一个30人左右的班级开展实验。
本发明还提供了一种蛋白质结晶的方法，其特点是，该方法应用了以上技术方案所述的教学试剂盒，其步骤如下：
（1）将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为10-50mg/mL的溶菌酶溶液，经过滤器过滤除去杂质，备用；
（2）将结晶平皿盖子反放于桌面上，按照体积比1:1分别取5μL步骤（1）得到的溶菌酶溶液和蛋白沉淀剂A或B或C滴于结晶平皿盖子中心，再滴加1μL染色剂一起混匀；向结晶平皿中加入2mL前述蛋白沉淀剂，并将结晶平皿盖子小心盖在结晶平皿上，勿让液滴滴落；
（3）用封口膜将结晶平皿密封，在室温下静置，再通过体式显微镜观察蛋白质晶体的形成情况。
本发明上述的一种蛋白质结晶的方法中，进一步优选的技术方案或者技术特征是：在步骤（1）中，将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为30mg/mL的溶菌酶溶液。
本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。本发明还提供了另一种蛋白质结晶的方法，其特点是，该方法应用了以上技术方案所述的教学试剂盒，其步骤如下：
（1）将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为10-50mg/mL的溶菌酶溶液，经过滤器过滤除去杂质，备用；
（2）将结晶平皿盖子反放于桌面上，按照体积比1:1分别取5μL步骤（1）得到的溶菌酶溶液和蛋白沉淀剂A或B或C滴于结晶平皿盖子中心，混匀；向结晶平皿中加入2mL前述蛋白沉淀剂，并将结晶平皿盖子小心盖在结晶平皿上，勿让液滴滴落；
（3）用封口膜将结晶平皿密封，在室温下静置，待蛋白质晶体形成后，取1μL染色剂对其进行染色处理，并通过体式显微镜观察蛋白质晶体的形成情况。
本发明所述的另一种蛋白质结晶的方法中，进一步优选的技术方案或者技术特征是：在步骤（1）中，将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为30mg/mL的溶菌酶溶液。
本发明所述的蛋白沉淀剂A和B为快速结晶条件，实验过程中使用蛋白沉淀剂A或B时可在20-30min形成可见晶体；所述的蛋白沉淀剂C为慢速结晶条件，实验过程中使用此蛋白沉淀剂时需要过夜才可形成可见晶体。
与现有技术相比，本发明试剂盒将溶菌酶结晶实验所需的试剂和材料装入盒内，降低了实验准备工作强度，减少了因分别购买试剂和材料造成的浪费。同时，建立了应用本发明试剂盒进行蛋白质结晶的方法，在蛋白质结晶的方法中通过染色处理将蛋白质结晶和在结晶过程中可能出现的盐晶区分开来，以帮助相关实验经验尚浅或没有经验的实验学生更好地识别蛋白质结晶。本发明试剂盒操作简便，有助于实验学生在较短的时间内掌握并完成蛋白质结晶实验，提高了实验效率，节约了成本，可以在生物基础教学实验中进行大规模推广。
附图说明
图1为本发明实施例15所述的方法得到的溶菌酶蛋白结晶图；
图2为本发明实施例16所述的方法得到的溶菌酶蛋白结晶图；
图3为本发明实施例17所述的方法得到的溶菌酶蛋白结晶图。
具体实施方式
以下参照附图，进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
实施例1，一种蛋白质结晶的教学试剂盒，其由下列物品构成：
（1）蛋白沉淀剂A，1支，其组成为：体积分数30%的PEG4000，浓度0.05M、pH4.5的醋酸钠缓冲液，浓度1M的氯化钠；
（2）蛋白沉淀剂B，1支，其组成为：体积分数4%的PEG4000，浓度676.7mM、pH3.0的醋酸钠缓冲液，质量浓度13.3%的氯化钠；
（3）蛋白沉淀剂C，1支，其组成为：浓度0.1M、pH7.4的醋酸钠缓冲液，质量浓度6.5%的氯化钠；
（4）溶菌酶粉末，20mg，1袋；
（5）稀释缓冲液：浓度0.02M、pH4.6的醋酸钠缓冲液，1支；
（6）染色剂：质量浓度0.3%的亚甲基蓝，1支；
（7）过滤器，1个；
（8）结晶平皿，1只；
（9）封口膜，1卷。
实施例2，实施例1所述的蛋白质结晶的教学试剂盒，所述的溶菌酶粉末为鸡蛋清溶菌酶粉末。
实施例3，利用实施例1或2所述的教学试剂盒进行蛋白质结晶的方法，其步骤如下：
（1）将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为10mg/mL的溶菌酶溶液，经过滤器过滤除去杂质，备用；
（2）将结晶平皿盖子反放于桌面上，按照体积比1:1分别取5μL步骤（1）得到的溶菌酶溶液和蛋白沉淀剂A或B滴于结晶平皿盖子中心，再滴加1μL染色剂一起混匀；向结晶平皿中加入2mL前述蛋白沉淀剂，并将结晶平皿盖子小心盖在结晶平皿上，勿让液滴滴落；
（3）用封口膜将结晶平皿密封，在室温下静置20-30min，再通过体式显微镜观察蛋白质晶体的形成情况。
实施例4，实施例3所述的利用实施例1或2所述的教学试剂盒进行蛋白质结晶的方法的步骤（1）中：将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为50mg/mL的溶菌酶溶液。其余相同。
实施例5，实施例3所述的利用实施例1或2所述的教学试剂盒进行蛋白质结晶的方法的步骤（1）中：将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为30mg/mL的溶菌酶溶液。其余相同。
实施例6，利用实施例1或2所述的教学试剂盒进行蛋白质结晶的方法，其步骤如下：
（1）将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为10mg/mL的溶菌酶溶液，经过滤器过滤除去杂质，备用；
（2）将结晶平皿盖子反放于桌面上，按照体积比1:1分别取5μL步骤（1）得到的溶菌酶溶液和蛋白沉淀剂C滴于结晶平皿盖子中心，再滴加1μL染色剂一起混匀；向结晶平皿中加入2mL前述蛋白沉淀剂，并将结晶平皿盖子小心盖在结晶平皿上，勿让液滴滴落；
（3）用封口膜将结晶平皿密封，在室温下静置过夜，再通过体式显微镜观察蛋白质晶体的形成情况。
实施例7，实施例6所述的利用实施例1或2所述的教学试剂盒进行蛋白质结晶的方法的步骤（1）中：将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为50mg/mL的溶菌酶溶液。其余相同。
实施例8，实施例6所述的利用实施例1或2所述的教学试剂盒进行蛋白质结晶的方法的步骤（1）中：将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为30mg/mL的溶菌酶溶液。其余相同。
实施例9，利用实施例1或2所述的教学试剂盒进行蛋白质结晶的方法，其步骤如下：
（1）将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为10mg/mL的溶菌酶溶液，经过滤器过滤除去杂质，备用；
（2）将结晶平皿盖子反放于桌面上，按照体积比1:1分别取5μL步骤（1）得到的溶菌酶溶液和蛋白沉淀剂A或B滴于结晶平皿盖子中心，混匀；向结晶平皿中加入2mL前述蛋白沉淀剂，并将结晶平皿盖子小心盖在结晶平皿上，勿让液滴滴落；
（3）用封口膜将结晶平皿密封，在室温下静置20-30min，待蛋白质晶体形成后，取1μL染色剂对其进行染色处理，并通过体式显微镜观察蛋白质晶体的形成情况。
实施例10，实施例9所述的利用实施例1或2所述的教学试剂盒进行蛋白质结晶的方法的步骤（1）中：将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为50mg/mL的溶菌酶溶液。其余相同。
实施例11，实施例9所述的利用实施例1或2所述的教学试剂盒进行蛋白质结晶的方法的步骤（1）中：将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为30mg/mL的溶菌酶溶液。其余相同。
实施例12，利用实施例1或2所述的教学试剂盒进行蛋白质结晶的方法，其步骤如下：
（1）将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为10mg/mL的溶菌酶溶液，经过滤器过滤除去杂质，备用；
（2）将结晶平皿盖子反放于桌面上，按照体积比1:1分别取5μL步骤（1）得到的溶菌酶溶液和蛋白沉淀剂C滴于结晶平皿盖子中心，再滴加1μL染色剂一起混匀；向结晶平皿中加入2mL前述蛋白沉淀剂，并将结晶平皿盖子小心盖在结晶平皿上，勿让液滴滴落；
（3）用封口膜将结晶平皿密封，在室温下静置过夜，再通过体式显微镜观察蛋白质晶体的形成情况。
实施例13，实施例12所述的利用实施例1或2所述的教学试剂盒进行蛋白质结晶的方法的步骤（1）中：将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为50mg/mL的溶菌酶溶液。其余相同。
实施例14，实施例12所述的利用实施例1或2所述的教学试剂盒进行蛋白质结晶的方法的步骤（1）中：将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为30mg/mL的溶菌酶溶液。其余相同。
实施例15，参照附图，利用实施例1或2所述的教学试剂盒进行蛋白质结晶的方法，其步骤如下：
（1）将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为20mg/mL的溶菌酶溶液，经过滤器过滤除去杂质，备用；
（2）将结晶平皿盖子反放于桌面上，按照体积比1:1分别取5μL步骤（1）得到的溶菌酶溶液和蛋白沉淀剂A滴于结晶平皿盖子中心，再滴加1μL染色剂一起混匀；向结晶平皿中加入2mL前述蛋白沉淀剂，并将结晶平皿盖子小心盖在结晶平皿上，勿让液滴滴落；
（3）用封口膜将结晶平皿密封，在室温下静置20-30min，再通过体式显微镜观察蛋白质晶体的形成情况。
实施例16，参照附图，利用实施例1或2所述的教学试剂盒进行蛋白质结晶的方法，其步骤如下：
（1）将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为20mg/mL的溶菌酶溶液，经过滤器过滤除去杂质，备用；
（2）将结晶平皿盖子反放于桌面上，按照体积比1:1分别取5μL步骤（1）得到的溶菌酶溶液和蛋白沉淀剂B滴于结晶平皿盖子中心，再滴加1μL染色剂一起混匀；向结晶平皿中加入2mL前述蛋白沉淀剂，并将结晶平皿盖子小心盖在结晶平皿上，勿让液滴滴落；
（3）用封口膜将结晶平皿密封，在室温下静置20-30min，再通过体式显微镜观察蛋白质晶体的形成情况。
实施例17，参照附图，利用实施例1或2所述的教学试剂盒进行蛋白质结晶的方法，其步骤如下：
（1）将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为40mg/mL的溶菌酶溶液，经过滤器过滤除去杂质，备用；
（2）将结晶平皿盖子反放于桌面上，按照体积比1:1分别取5μL步骤（1）得到的溶菌酶溶液和蛋白沉淀剂C滴于结晶平皿盖子中心，混匀；向结晶平皿中加入2mL前述蛋白沉淀剂，并将结晶平皿盖子小心盖在结晶平皿上，勿让液滴滴落；
（3）用封口膜将结晶平皿密封，在室温下静置过夜，待蛋白质晶体形成后，取1μL染色剂对其进行染色处理，并通过体式显微镜观察蛋白质晶体的形成情况。
Claims (4)
1.一种蛋白质结晶的教学试剂盒，其特征在于，其由下列物品构成：
（1）蛋白沉淀剂A，1支，其组成为：体积分数30%的PEG4000，浓度0.05M、pH4.5的醋酸钠缓冲液，浓度1M的氯化钠；
（2）蛋白沉淀剂B，1支，其组成为：体积分数4%的PEG4000，浓度676.7mM、pH3.0的醋酸钠缓冲液，质量浓度13.3%的氯化钠；
（3）蛋白沉淀剂C，1支，其组成为：浓度0.1M、pH7.4的醋酸钠缓冲液，质量浓度6.5%的氯化钠；
（4）溶菌酶粉末，20mg，1袋；
（5）稀释缓冲液：浓度0.02M、pH4.6的醋酸钠缓冲液，1支；
（6）染色剂：质量浓度0.3%的亚甲基蓝，1支；
（7）过滤器，1个；
（8）结晶平皿，30个；
（9）封口膜，1卷。
2.根据权利要求1所述的蛋白质结晶的教学试剂盒，其特征在于，所述的溶菌酶粉末为鸡蛋清溶菌酶粉末。
3.一种蛋白质结晶的方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述的教学试剂盒，其步骤如下：
（1）将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为10-50mg/mL溶菌酶溶液，经过滤器过滤除去杂质，备用；
（2）将结晶平皿盖子反放于桌面上，按照体积比1:1分别取5μL步骤（1）得到的溶菌酶溶液和蛋白沉淀剂A或B或C滴于结晶平皿盖子中心，再滴加1μL染色剂一起混匀；向结晶平皿中加入2mL前述蛋白沉淀剂，并将结晶平皿盖子小心盖在结晶平皿上，勿让液滴滴落；
（3）用封口膜将结晶平皿密封，在室温下静置，通过体式显微镜观察蛋白质晶体的形成情根据权利要求3所述的蛋白质结晶的方法，其特征在于，在步骤（1）中，将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为30mg/mL的溶菌酶溶液。
4.一种蛋白质结晶的方法，其特征在于，采用权利要求1或2所述的教学试剂盒，其步骤如下：
（1）将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为10-50mg/mL的溶菌酶溶液，经过滤器过滤除去杂质，备用；
（2）将结晶平皿盖子反放于桌面上，按照体积比1:1分别取5μL步骤（1）得到的溶菌酶溶液和蛋白沉淀剂A或B或C滴于结晶平皿盖子中心，混匀；向结晶平皿中加入2mL前述蛋白沉淀剂，并将结晶平皿盖子小心盖在结晶平皿上，勿让液滴滴落；
（3）用封口膜将结晶平皿密封，在室温下静置，待蛋白质晶体形成后，取1μL染色剂对其根据权利要求5所述的蛋白质结晶的方法，其特征在于，在步骤（1）中，将溶菌酶粉末用稀释缓冲液配制成终浓度为30mg/mL的溶菌酶溶液。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20160727 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |