CN1678773A - 结晶核的制造方法及结晶条件的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种高质量、有效、简单地制造蛋白质结晶和有机物的结晶的方法。配制蛋白质及有机物的溶液，通过将其慢慢地冷却，达到低度的过饱和。对该过饱和溶液照射飞秒激光(10)。在激光的焦点处产生局部的爆炸现象生成结晶核。以该结晶核为基础，在一定时间内使结晶生长，可以得到高质量的结晶。作为飞秒钛激光可以使用波长800nm、时间间隔120fs、频率1kHz、输出400mW的钛蓝宝石激光。

Description

结晶核的制造方法及结晶条件的筛选方法
技术领域
本发明涉及结晶核的制造方法及结晶条件的筛选方法。
背景技术
随着后基因组研究的发展，蛋白质的结构解析正在成为当务之急。为此，需要将蛋白质结晶。另外，有机结晶有望作为下一代设备材料，特别需要其高质量结晶制造技术。一般地，为了从溶液析出结晶，需要利用溶剂蒸发或温度变化等增大过饱和度。但是，有机物及蛋白质等这样的分子量大的物质，其过饱和度如果不能非常的大，就不能结晶。另外，在如上所述形成非常大的过饱和度的溶液中，一旦产生结晶，因为结晶快速生长，可能使得到的结晶出现质量上的问题。另外，这样的高分子量物质一般是难以结晶的，生产性也差。通常，进行实际结晶化尝试，通过试差法的结果来决定结晶条件。对于象蛋白质及有机物等这样的必须结晶的物质，利用上述方法是麻烦的、且不能实用。另外，有文献尝试使用纳秒的Nd:YAG激光，形成有机结晶(和Physical ReviewLetters 77(1996)第3475页、特开2002-068899)。但是，利用该方法不能充分结晶，特别是蛋白质结晶困难。
发明内容
本发明是鉴于上述问题进行的研究，其第1目的在于，提供简单有效地制造高质量的结晶的技术，第2目的在于，提供简单地确定结晶条件的技术。
为了实现前述第1目的，本发明的结晶核的制造方法是通过对溶解有结晶对象的溶质的溶液，照射皮秒脉冲激光及飞(毫微微)秒脉冲激光中的至少一种脉冲激光，生成结晶核。
如上所述，如果照射前述脉冲激光，即使是低过饱和溶液也生成结晶核，故可以此为基础慢慢地使结晶生长，结果是可以简单、有效地制造高质量的结晶。本发明的方法最适合蛋白质的结晶及有机物的结晶，也可以在其它物质的结晶中使用。
另外，为了实现前述第2目的，本发明的结晶条件的筛选方法包括：通过对溶解有结晶对象的溶质的溶液，照射皮秒脉冲激光及飞秒脉冲激光中的至少一种脉冲激光的工序；以及从通过照射前述激光判定结晶核是否生成的工序和通过照射前述激光判定溶质是否变化的工序中选择的至少一种。
如上所述，照射前述脉冲激光，观察结晶核的生成，如果生成了结晶核，可以将其溶液等条件判定为适合结晶。另外，照射前述脉冲激光，观察溶质的状态，只要溶质发生变化，就可以判定其溶液等的条件适合结晶。前述溶质的变化在蛋白质时，例如发生立体结构的变化(改性)。
对过饱和溶液，如果照射皮秒脉冲激光及飞秒脉冲激光中的至少一个脉冲激光，尽管生成结晶核，但其机理不清楚。对此，本发明者等推测如下。也就是，在前述脉冲激光的焦点，由于高密度的光子聚集，多个光子与一种溶质分子或溶剂分子碰撞，以高概率产生上述吸收光的现象(多光子吸收)。其结果是，在使脉冲激光聚集时，诱发其焦点进行剧烈地光吸收产生的爆炸现象(激光消融)，结晶核生成认为这是形成扰动产生的。并且，其后的机理认为有下述3种。
(1)利用脉冲激光使其产生光热变换，焦点附近的溶液瞬间蒸发，溶质被浓缩，结果是生成结晶核。
(2)利用脉冲激光诱发的消融，产生冲击波，由此使溶液局部地摇动，结果是生成结晶核。
(3)当激光脉冲能量增强时，在溶液中产生诱导散射，溶液中产生浓度梯度，生成结晶核。
如上所述，根据本发明，对于结晶困难的蛋白质及有机物，可以容易地有效地生成结晶核，只要使其慢慢地生成，就可以得到高质量的结晶。另外，本发明可以筛选结晶条件，并可以迅速地确定结晶条件。
附图说明
图1是本发明的实施例1中使用的激光照射装置的构成图。
图2是表示测定通过激光照射产生的冲击波大小的装置的一个实例的构成图。
图3是表示脉冲激光的冲击波和粒子的运动的关系的一个实例的构成图。
图4是表示以前述装置测定的冲击波的粒子发生移动距离和激光光线聚集点的关系的图。
图5是表示以前述装置测定的冲击波强度和激光脉冲能量的关系的图。
图6是表示本发明的其它的实施例中使用的激光照射装置的构成图。
图7是表示本发明的另外的其它实施例中使用的激光照射装置的构成图。
图8是本发明的一个实施例中产生的蛋白质结晶的照片。
图9是本发明的其它的实施例产生的蛋白质结晶的照片。
图10是本发明的另外的其它实施例产生的蛋白质结晶的照片。
图11是本发明的另外的其它实施例产生的蛋白质结晶的照片。
图12是本发明的另外的其它实施例产生的蛋白质结晶的照片。
图13是本发明的另外的其它实施例产生的蛋白质结晶的照片。
图14是参考例2使用的搅拌装置的示意图。
图15A和图15B是表示已有方法得到的结晶的照片，图15C和图15D是表示前述参考例2得到的结晶的照片。
图16是表示本发明的容器实例的剖面图。
图17是表示本发明的板的实例的斜视图。
图18是本发明的容器的其它的实例的图，A是平面图、B是剖面图。
图19是本发明的容器的其它的实例的图，A是平面图、B是剖面图。
图20是表示本发明的容器的其它的实例剖面图。
具体实施方式
下面对本发明进行进一步详细地说明。
如前所述，本发明中优选用透镜将皮秒脉冲激光及飞秒脉冲激光中的至少一种脉冲激光聚集在溶液中，在该光线聚集位置产生单次或多次的局部爆炸现象，由此生成结晶核，还优选通过前述爆炸现象使溶质发生变化。
本发明中，脉冲激光的脉冲峰值功率(光子流量：photon flux)例如为5×105(瓦特)或以上，优选2×109(瓦特)或以上。脉冲激光的脉冲峰值功率的上限没有特别的限定，例如为1018(瓦特)或以下，优选1015(瓦特)或以下，更优选1012(瓦特)或以下。
如后述，激光脉冲能量(W)和时间间隔(Δt)的积是脉冲峰值功率(I)，故激光的条件可以通过时间间隔按如下进行设定。另外，脉冲激光有皮秒脉冲激光及飞秒脉冲激光，其中，特别优选飞秒激光。
(皮秒脉冲激光)
    脉冲时间间隔(秒)     激光脉冲能量A(J/脉冲)   激光脉冲能量B(J/脉冲)
    一般的范围     10-9～10-12   0.5×10-3～0.5×10-6     2～2×10-3
    较好的范围     10-11～10-12   0.5×10-5～0.5×10-6     2×10-2～2×10-3
激光脉冲能量A：脉冲峰值功率(I)＝5×105(瓦特)或以上的情况
激光脉冲能量B：脉冲峰值功率(I)＝2×109(瓦特)或以上的情况
(飞秒脉冲激光)
    脉冲时间间隔(秒)     激光脉冲能量A(J/脉冲)   激光脉冲能量B(J/脉冲)
    一般的范围     10-12～10-15   0.5×10-6～0.5×10-9   2×10-3～2×10-6
    较好的范围     10-13～10-15   0.5×10-7～0.5×10-9   2×10-4～2×10-6
激光脉冲能量A：脉冲峰值功率(I)＝5×105(瓦特)或以上的情况
激光脉冲能量B：脉冲峰值功率(I)＝2×109(瓦特)或以上的情况
脉冲激光可以是单次照射，也可以是多次反复照射。脉冲激光的照射次数没有特别的限定，例如从1发(单次)到1000万次的范围。另外，反复多次照射时的激光反复照射频率例如1/10000000Hz～1kHz的范围。照射时间没有特别地限定，例如从1秒至1小时的范围。
脉冲激光的具体例有：飞秒钛蓝宝石激光、飞秒纤维激光、纳秒·皮秒Nd3+:YAG激光、纳秒·皮秒Nd3+:VYO4激光、受激准分子激光及变石激光等。
本发明中，溶解有结晶对象的溶质的溶液优选过饱和溶液，更优选低过饱和溶液。蛋白质溶液的浓度例如为200～500％，优选100～300％，更优选50～200％。有机物溶液的浓度例如为20～50％，优选10～30％，更优选5～20％。另外，本发明对象的蛋白质例如有：溶菌酶、葡萄糖异构酶、木聚糖酶(キシナラ一ゼ)、肌红蛋白、过氧化氢酶、胰蛋白酶、人溶菌酶、光活性黄蛋白质、碳酸烯醇丙酮酸羧化酶、核糖核酸酶、前列腺素F2α合成酶、腺甙脱氨酶、主要异物排出传输物等。有机物例如有4-二甲氨基-N-甲基-4’-N-苯乙烯基吡啶鎓甲苯磺酸盐(DAST，4-dimethylamino-N-metyl-4’-N-stilbazolium tosylate)、甲基硝基苯胺(MNA)、磷酸精氨酸(LAP)等。另外，如后述的实施例所述，利用本发明的方法，以前结晶困难的膜蛋白质可以结晶。
下面，图1表示实施本发明的装置的一个实例。如图所示，该装置包括：飞秒激光照射装置1、机械光闸(shutter)2、半波长板3、偏光器4、聚集透镜5、恒温水槽8。在恒温水槽8中，放入水9，其中配置放入溶解有结晶对象的溶质的溶液7的试样容器6。在恒温水槽8中使温度慢慢地降低，由此使溶液7的溶解度低下，形成过饱和状态。这时，当形成过度的过饱和时，结晶生长变快，故形成低度的过饱和。并且，当利用激光照射装置1照射激光10时，激光10通过机械光闸2、半波长板3、偏光器4及激光透镜5，在溶液7内聚集，在此通过剧烈的光吸收形成爆炸现象，这样引发结晶核生成。在使结晶生长时，如果以该结晶核为基础，经过一定时间慢慢地生长，则可以得到高质量的单晶。另外，筛选结晶条件时，准备多个溶液，一点一点地改变溶液的浓度、溶质的构成比率、温度条件，对它们照射激光后，观察溶液。并且，在可以确认结晶核生成或溶质变化时，判断为该溶液条件是适合结晶的条件，相反，判定为不适合结晶的条件。本发明的筛选方法优选用作确定结晶条件的一次筛选。
本发明中，优选溶解有结晶对象溶质的溶液通过使放入溶液的容器运动，边搅拌前述溶液，边产生前述结晶，使其生长。
如前所述，不直接搅拌溶液本身，通过使放入溶液的容器旋转、振动、摇动等运动，间接地搅拌前述溶液，可以进行简单稳定地搅拌。另外，可以选择适合结晶生成的搅拌，以使前述溶液的对流可以自由地控制。其结果是即使是以前难以结晶的蛋白质类的高分子也可以结晶。
对前述运动没有特别的限定，其可以为旋转、振动及摇动等，也可以进行以上两种或多种的组合后的运动。前述运动的程度也没有特别的限定，根据高分子溶液的种类等适当地进行确定。在进行圆周运动时，例如为10～1000rpm，优选30～200rpm，更优选50～100rpm。
对前述容器没有特别的限定，可以使用烧杯、浅底盘、有多个凹下部的凹板等。
结晶的产生和生长例如可以通过将前述溶液置于过饱和状态进行。过饱和状态例如可以使前述溶液中的溶剂蒸发。对蒸发没有特别的限定，可以是自然蒸发、通过加热蒸发、通过减压干燥蒸发、通过冻结干燥冻结等。除此之外，准备另外的容器，放入以比前述溶液高的浓度溶解有前述溶质以外的成分的储备溶液，在该容器和放入前述结晶对象的溶液的容器中，形成水蒸气可以移动的状态，这时前述结晶对象的溶液可以在稳定的条件下促进蒸发，特别是对于容易改性的蛋白质等生物高分子，优选该方法，上述方法通常称作蒸汽扩散法。
本发明中结晶的生长情况没有特别的限定。通常生长的结晶因为比重比溶液重而沉降，移动至容器底部。通常将这样的方法称作坐滴法(Sitting drop)法。但是，当在容器底生长结晶时，对于粘附在底部的，有时造成回收障碍。因此，优选在前述容器中放入比前述结晶对象的溶液比重大的溶液，在比前述比重大的液体和前述溶液的界面生长结晶。这样的方法通常称作浮滴法(Floating-drop)。
在使容器豫东来搅拌溶液的方法中，结晶对象物质没有特别的限定，例如有树脂、蛋白质、糖类、脂质和核酸等。该方法优选应用在难以结晶的蛋白质等生物高分子。蛋白质例如有：鸡蛋白溶菌酶、人溶菌酶、葡萄糖异构酶、木聚糖酶、碳酸烯醇丙酮酸羧化酶、核糖核酸酶、前列腺素F2α合成酶、腺甙脱氨酶、主要异物排出传输物等。
下面，本发明的容器是本发明制造方法或筛选使用的容器。本发明的容器有以下三种。
本发明的第1容器是在本发明的结晶核或结晶的制造方法中使用的容器或本发明的结晶条件的筛选中使用的容器，包括：第1室，其中加入结晶对象物质的溶液；第2室，其中加入储备溶液，该储备溶液中只有前述结晶对象物质的溶液中的结晶对象物质以外的成分以比前述结晶对象物质的溶液高浓度溶解；通路，使前述第1容器和前述第2容器连通，能够通过气体。前述第1室的一部分或全部是透明或半透明，以使激光光线可以照射前述结晶对象物质的溶液。
该容器利用所谓的蒸发扩散法促进结晶对象物质的溶液的溶剂的蒸发，促进结晶对象物质的结晶的生成，但通过对加入结晶对象物质的溶液的第1室照射激光，可以强制地生成结晶核，筛选结晶条件。
另外，在一个板内也可以形成多个前述第1容器。
本发明的第2容器是在本发明的结晶核或结晶的制造方法中使用的容器或本发明的结晶条件的筛选中使用的容器，包括：第1室，其中加入结晶对象物质的溶液；第2室，其中加入以比前述结晶对象物质的溶液高的浓度溶解结晶对象物质的溶液中只有结晶对象物质以外的成分的储备溶液；通路，使前述第1室和前述第2室连通，气体可以通过。并且有多个前述第1室，其通过多个前述通路和一个或以上的前述第2室连通，在前述多个通路中，通路的直径和通路的长度中的至少一个为彼此不同。前述第1室的一部分或全部是透明或半透明，以使激光光线可以照射前述结晶对象物质的溶液。
该容器利用所谓的蒸发扩散法促进结晶对象物质的溶液的溶剂的蒸发，促进结晶对象物质的结晶的生成。因为在前述多个通路中，通路的直径和通路的长度中的任何一个或两个分别不同，可以同时设定多个蒸汽扩散条件，筛选结晶的最佳条件，使其在该条件下生成结晶。
另外，在一个板内也可以形成多个前述第2容器。
本发明的第3容器是在本发明的结晶核或结晶的制造方法中使用的容器或本发明的结晶条件的筛选中使用的容器，包括：第1室，其中加入比结晶对象物质的溶液和比前述结晶对象物质的溶液的比重大、且不和前述结晶对象物质的溶液混合的非混合性高比重液；第2室，其中加入以比前述结晶对象物质的溶液高的浓度溶解结晶对象物质的溶液中只有结晶对象物质以外的成分的储备溶液，并且在前述第2室中形成前述第1室；在前述第1室中具有下部的大容积部和比其容积小的上部的小容积部，并且，其上部前端开口，前述两容器之间能够通过气体，至少前述第1室的上部或前端开口部保持结晶对象物质的溶液，而且，为使前述结晶对象物质的溶液中可以照射激光，容器的一部分或全部是透明或半透明。
该容器利用所谓的蒸发扩散法促进结晶对象物质的溶液的溶剂的蒸发，而且促进在结晶对象物质的溶液和非混合性高比重液体的界面生成结晶对象物质的结晶，由于在前述第1室的前述小容积或前端开口部保持结晶对象物质的溶液，故结晶对象物质的溶液也可以是少量。另外，位于前述第1室的前述大容积部的非混合性高比重液滴，例如用磁搅拌器等搅拌，可以间接地搅拌结晶对象物质的溶液，而且可以促进结晶。
在前述第3容器的前述第1室中，前述下部的大容积部的形状为倒圆锥台或倒棱锥台，前述上部的小容积部的形状为圆筒或方筒，优选前述两种连接。如果是这样的形状，在前述第1室中，前述上部的小容积部的前端开口的上部形成结晶对象物质的溶液的液体，并且在该状态下可以使前述结晶对象物质的溶液的溶剂蒸发。另外，也可以在一个板内形成多个前述第3容器。
本发明中，前述结晶对象物质没有特别的限定，例如有树脂、蛋白质、糖类、脂质和核酸等，其中，对蛋白质的结晶优选使用本发明的容器。蛋白质例如有：鸡蛋白溶菌酶、人溶菌酶、葡萄糖异构酶、木聚糖酶、碳酸烯醇丙酮酸羧化酶、核糖核酸酶、前列腺素F2α合成酶、腺甙脱氨酶、主要异物排出传输物等。
(实施例)
下面和比较例一起对本发明的实施例进行说明。
(装置)
将图1所示的装置应用在实施例1、2、比较例1和参考例中。该装置利用焦点距离170mm的透镜5将高功率飞秒钛蓝宝石激光10聚集，照射恒温水槽8中的试样溶液7中。恒温水槽8可以以±0.05℃的精度控制温度。激光10的波长为800nm、时间间隔为120fs。反复进行激光振荡(laser oscillation)，频率数可以从1kHz调整至1Hz。当对试样溶液7照射单次的激光脉冲时，反复将频率数调节至20Hz，通过从该脉冲列打开只有50ms机械光闸2，选用单脉冲。激光脉冲能量可以利用半波长3和偏振元件4调整。利用该装置可以对试样溶液7照射强度250μJ/脉冲(2×109瓦)的激光脉冲。
实施例1
将DAST(4-二甲氨基-N-甲基-4’-N-苯乙烯基吡啶鎓甲苯磺酸盐)3.5g和甲醇200ml和转子一起放入容积200ml的聚四氟乙烯容器6中，在初期温度27.0℃的恒温水槽8内用2小时上升到55.0℃，使其边用搅拌其搅拌边溶解。大约5小时之后，确认DAST溶解，将溶液7分成3份，作为培养溶液。这时，取出转子。溶液制备16小时之后，在55℃下加热10小时，之后每小时下降3℃，使温度下降至23℃。并且每小时下降0.1℃，使温度下降至21.4℃。该状态下以脉冲能量250μJ/脉冲(2×109瓦)、重复频率1kHz照射飞秒激光2分钟。之后，1小时确认没有结晶析出，10小时之后用肉眼观察结晶析出。在按原样保持前述温度的条件下，连续观察约6天，发现最初看到的结晶出现生长，而且确认有2、3个结晶。再照射强度250μJ/脉冲(2×109瓦)、重复频率1kHz的激光1分钟，确认之后3天没有结晶析出。
实施例2
作为结晶核生成对象使用鸡蛋白溶菌酶。该溶液通过在蒸馏水50ml中添加乙酸钠三水合物0.467g，在其中添加乙酸，调整至pH 4.5之后，添加氯化钠1.25g及鸡蛋白溶菌酶1.25g。将调整至室温的前述试样溶液7放入100ml的聚四氟乙烯容器6中，在恒温水槽8中在40℃保持24小时，使其完全溶解。之后用5小时使其冷却至25℃，用膜滤器除去杂质。将该溶液2ml和全氟化碳(Florinate)3ml分别加入10根直径18mm的带螺栓帽的玻璃瓶6中。使这些玻璃瓶6保持在25℃在恒温水槽8内静置，使溶液温度用20小时降低至15℃。该试样溶液(溶菌酶溶液)7的饱和点为23.8℃。然后，确认没有结晶析出，使其在24小时降低至14℃。在14℃下保持24小时，再确认没有结晶析出。然后，在1分钟内依次对溶液7内照射脉冲能量250μJ/脉冲(2×109瓦)的飞秒脉冲激光，观察变化。照射条件是使激光重复频率变化，在50Hz、100Hz内分别每次2瓶的照射前述玻璃瓶，作为比较对4个前述玻璃瓶不照射激光。激光照射1天之后，用肉眼确认结晶在50Hz、100Hz的溶液中析出。在没有照射激光的溶液中没有看到结晶析出。另外，对没有结晶析出的溶液分别照射500Hz、1000Hz的激光，观察在溶液内溶菌酶凝集(改性)，判定该溶液结晶的可能性。
比较例1
使用和实施例2相同的条件的蛋白质溶液，照射YAG激光(波长1064nm、5ns)，试验结晶核的生成。前述蛋白质溶液通过在蒸馏水50ml中添加乙酸钠三水合物0.467g，在其中添加乙酸，调整至pH 4.5之后，添加氯化钠1.25g及鸡蛋白溶菌酶1.25g。将调整至室温的前述试样溶液7放入100ml的聚四氟乙烯容器中，在恒温水槽中在40℃保持24小时，使其完全溶解。之后用5小时使其冷却至25℃，用膜滤器除去杂质。将该溶液2ml和全氟化碳3ml分别注入10个直径18mm的带螺钉盖玻璃瓶中。使这些玻璃瓶保持在25℃，在恒温水槽8内静置，使溶液温度在20小时内降低至15℃。该试样溶液(溶菌酶溶液)7的饱和点为23.8℃。然后，确认没有结晶析出，使其在24小时降低至14℃。在14℃下保持24小时，再确认没有结晶析出。然后，在1分钟内依次对溶液内照射YAG激光，观察变化。照射条件是使激光重复频率变化，分别照射10Hz、20Hz、50Hz、100Hz、500Hz、1000Hz，作为对照物对4个玻璃瓶不照射激光。激光脉冲能量为1.2mJ/脉冲。激光照射1天之后，不能确认结晶析出，为了再加大过饱和度，用10小时下降至16℃，保持12小时，确认没有结晶析出，再照射激光。照射条件和上述相同。这时也不能确认结晶析出，同样在15℃、14℃照射激光，结果是不能确定结晶析出和改性。在该例子中的脉冲平均功率比实施例中的飞秒脉冲激光大10倍，而脉冲峰值功率(pulse peak power，光流量)为2.5×105(瓦)，是实施例的一万分之一，可以推测由于上述原因结晶核不能生成。
参考例1
使用图2所示的装置，调察利用脉冲激光的爆炸现象产生的冲击波。该装置是将脉冲激光照射装置安装在正像显微镜上。如图所示，正像显微镜11设有放置观察对象物的载物台28、聚光透镜29和物镜(100倍、开口数1.25)26，在前述载物台28上配置微型晶片27。另外，在正像显微镜11的下部的聚光透镜29下部配置光源灯13，检测该光的CCD照相机12配置在显微镜11的上部。另外，在正像显微镜11外部配置脉冲激光照射装置21，激光22通过1/2波长板23和偏光器24照射在正像显微镜11内，通过二色镜25使光路直角弯曲，照射在载物台28上的微型晶片7。前述脉冲激光使用线性调频放大产生的高功率飞秒钛蓝宝石激光(800nm，120fs)。另外，在微型晶片27内放入聚苯乙烯微粒子(直径1m)的分散液。在该装置中，当照射激光22时，激光22聚集在配置于载物台28上的微型晶片27内的聚苯乙烯微粒子分散液上。然后，用CCD照相机12观察微型晶片27内的情况。
然后，使用该装置调察冲击波对聚苯乙烯微粒子的影响。也就是，根据前述条件对聚苯乙烯微粒子分散液内单次照射飞秒钛蓝宝石激光。当预想激光在光线聚集点产生时冲击波进行三维扩散，微粒子被压向远离激光光线聚集点的方向。用CCD照相机观察该冲击波引起的聚苯乙烯微粒子的运动，通过测定远离激光的光线聚集点的距离预测冲击波的大小。图3是表示脉冲激光照射产生的冲击波对聚苯乙烯微粒子施加的力的关系的示意图。在同一图中，f表示微粒子受到的冲击波的力，F0表示利用冲击波产生的力，R0表示微粒子的初期位置。R表示远离冲击波中心的微粒子的位置，r表示微粒子的半径，32表示激光光，33表示聚苯乙烯微粒子，34表示激光的光线聚集点，37表示聚苯乙烯微粒子分散液。图4是当照射脉冲激光时，该冲击波产生的微粒子的移动距离的关系的图。在同图中，横轴表示时间，纵轴表示远离冲击中心的微粒子的位置(R)，R0表示微粒子的初期位置，L表示微粒子的移动距离，黑圆点表示脉冲激光的照射时间。如该图所示，可知当照射脉冲激光时，微粒子瞬间远离焦点。冲击波通过脉冲应答三维的各向同性地传递，假设微粒子利用水的粘性阻力停止时，以下式子成立，可以从微粒子的初期位置(R0)和移动距离(L)的关系预测通过冲击波产生的力(F0)。
微粒子受到的冲击波的力：
f = F 0 πr 2 4 π R 0 2 δ ( t )
微粒子的运动方程式：
m d 2 R dt 2 = - 6 πηr dR dt + f
微粒子的位移量
L = R ( t = ∞ ) - R 0
⇔ L = F 0 · r 24 pη · 1 R 0 2
这样，观测高为数百的微粒子的运动，求得飞秒钛蓝宝石激光的脉冲能量和冲击波产生的力的关系。结果示于图5。在该图中纵轴表示冲击波的力((F0)，横轴表示激光脉冲能量(I0)。如图所示，在该参考例中可以用60nJ/脉冲或以上来确认冲击波。爆炸现象的最低限度因为依存于多光子的吸收的概率，故不是作为激光能量的总量所定义的激光脉冲能量，与瞬间到达的光的密度(I)有关。该参考例中时间间隔(Δt)120fs的脉冲激光的激光脉冲能量(W)为60nJ/脉冲，故其脉冲峰值功率(I)为如下值。
I＝W/Δt＝5×105(J/S·pulse＝watt)
因此，在该参考例中，时间间隔(Δt)Δt＜W/5×105。考虑该式和激光照射装置的能力，优选具有纳秒或以下的时间间隔的脉冲激光，更优选皮秒或以下，最适合飞秒或以下。另外，该参考例不能限定地解释本发明，另外，在该参考例中假设在激光光线聚集点产生的爆炸现象产生冲击波，本发明并不限于此。
另外，该参考例中为了使冲击波的可视化，使用聚苯乙烯微粒子，聚苯乙烯微粒子的重量为1.1×10-12g，是蛋白质一亿倍或以上的重量。也就是，蛋白质即使用比聚苯乙烯微粒子弱得多的冲击波，也可以使其密度发生变化。由聚苯乙烯微粒子的可视化定义的脉冲激光的脉冲峰值功率和激光脉冲能量不限定本发明的下限。
实施例3
本实施例是使鸡蛋白溶菌酶(14kDa)结晶化的实施例。蛋白质溶液的条件是25mg/ml的溶菌酶，2.5％的氯化钠、0.1M的乙酸钠、pH 4.5，室温下配制。将该溶液利用膜滤器除去杂质。
利用图6所示的激光照射装置和结晶板利用间歇法进行结晶。如图所示，利用该激光照射装置，使飞秒激光照射装置101照射的激光通过镜子102、波长板103、偏光器104及光闸105，用物镜(10倍)108聚集，照射在结晶板109的结晶培养容器部107。前述结晶板109利用蒸汽扩散法，包括放入蛋白质溶液的结晶培养容器部107和容器部107相连通的储备溶液部106。前述储备溶液是在蛋白质溶液中溶解与除去蛋白质后的剩余成分相同成分的溶液。由此促进蛋白质溶液的蒸发。在同一图中110是密封胶带，111是透明玻璃。并且，前述结晶培养容器部107成为通过目镜的透镜112用肉眼可能观察。另外，也可以利用CCD113照相机和控制器114观察。
激光照射是在温度·湿度管理的绝对无尘室(温度23℃±2℃、湿度65％±5％)进行。激光的波长为780nm，时间间隔为200飞秒(fs)，激光振荡的重复频率为1kHz。激光脉冲能量通过波长板和偏光器调节。激光的照射次数通过改变光闸的开闭时间进行调整。
将蛋白质溶液10μl放入结晶板110的各个结晶培养容器107中，在室温下对溶液中聚集照射激光。激光的脉冲强度为1.95nJ/脉冲。光闸的开闭时间设定为8脉冲(1/125秒)、62脉冲(1/16秒)、24000脉冲(24秒)、不照射(0秒)，使脉冲数发生变化。
激光照射后在设定为18℃的恒温槽中静置，观察之后的结晶生长。将激光照射2天后的照片表示在图8中。结晶析出数随着激光照射次数增加。另外不照射的样品较小的结晶析出的非常多。这是因为高过饱和溶液，结晶核在溶液中的所有位置自然产生的原因，每次产生大量的结晶核的原因。即使在通常的结晶培养中也可以观察到，成为结晶的高质量、大型化的障碍。另一方面，在照射激光后的样品中，室温低过饱和溶液内生成结晶核，该核成为种结晶，进行生长。为此，当增加脉冲数时，因为结晶核的生成量增加，故结果是使结晶析出增加。
如上所述，考虑到结晶核产生是与激光脉冲的照射次数有关的现象。由于照射次数的增加结晶数增加和照射次数增加因而生成结晶的概率增加是相同意义。另外，一般知道以下现象，即用于激光产生的爆炸现象的激光脉冲能量随照射次数的增加而减少(孵化效果)(例如S.Preuss等(Appl.Phys.Lett.62(23)，7 June 1993第3049-3051页))。也就是，一般认为由于照射次数增加，结晶生成必要的激光脉冲的脉冲峰值功率、激光脉冲能量减少。本实施例中，多次的激光照射产生的激光脉冲能量使由聚苯乙烯微粒子的运动来定义的激光脉冲能量的下限大幅度地下降，一般认为这是蛋白质分子比聚苯乙烯微粒子小得多，和脉冲激光的多次照射的结果。但是这些只是本发明者等的推测，不限于本发明的范围。
实施例4
本实施例是使核糖核酸酶H(17kDa)结晶的实施例。蛋白质溶液是在室温下将5mg/ml的核糖核酸酶H溶解在0.05M的三盐酸缓冲液(pH9.0)中配制的。之后利用膜滤器除去杂质。另外，储备容器液(外液)做成0.2M的三盐酸、pH 9.0。通过激光照射进行结晶是使用图6所示的激光照射装置和结晶板，采用Sitting-drop蒸汽扩散法进行的。
也就是，将蛋白质溶液10μl加入结晶培养容器107中，再在储备溶液部106中分别加入100μl的外液。然后，在室温使激光聚集照射在蛋白质溶液中。聚集照射在温度·湿度管理的绝对无尘室(温度23℃±2℃、湿度65％±5％)进行。激光的波长为780nm，时间间隔为200飞秒(fs)，激光振荡的重复频率为1kHz。激光脉冲能量通过波长板和偏光器调节。激光的照射次数通过改变光闸的开闭时间进行调整。激光的脉冲强度为1.95nJ/脉冲。光闸的开闭时间设定为8脉冲(1/125秒)、62脉冲(1/16秒)、4000脉冲(4秒)、8000脉冲(8秒)、不照射(0秒)，使脉冲数发生变化。
激光照射后在设定为14℃的恒温槽中静置，观察之后的结晶生长。将激光照射1天后的照片表示在图9中。不照射的样品即使经过2周或以上也没有发现结晶析出。但是，可发现激光照射条件不同析出状态不同。在8脉冲时，结晶核没有生成，相反，对照射62脉冲和4000脉冲后的溶液可以观察到结晶析出。另外，在照射8000脉冲的溶液内可以看到改性的核糖核酸H。
实施例5
本实施例是使葡萄糖异构酶(173kDa)的结晶的实施例。蛋白质溶液是在室温下将20mg/ml的葡萄糖异构酶溶解在0.2M的硫酸铵溶液(pH 7.0)中配制的。之后利用膜滤器除去杂质。另外，储备容器液(外液)是将0.2M的硫酸铵、15％的聚乙二醇(PEG)6000溶解后配制而成的溶液pH 7.0。通过激光照射进行结晶是使用图6所示的激光照射装置和结晶板，采用Sitting-drop蒸汽扩散法进行的。
也就是，将蛋白质溶液10μl加入结晶培养容器107中，在储备溶液部106中分别加入100μl的外液。然后，从储备溶液部106用移液管吸取5μl，注入结晶培养容器部107，使蛋白质溶液和储备溶液充分混合。然后在室温下使激光聚集照射在蛋白质溶液中。激光照射是在温度·湿度管理的绝对无尘室(温度23℃±2℃、湿度65％±5％)进行。激光的波长为780nm，时间间隔为200飞秒(fs)，激光振荡的重复频率为1kHz。激光脉冲能量通过波长板和偏光器调节。激光的照射次数通过改变光闸的开闭时间进行调整。激光的脉冲强度为1.95nJ/脉冲。光闸的开闭时间设定为8脉冲(1/125秒)、4000脉冲(4秒)、不照射(0秒)，使脉冲数发生变化。
激光照射后在设定为18℃的恒温槽中静置，观察之后的结晶生长。将激光照射1天后的照片表示在图10中。从照射激光的溶液可以观察析出结晶，但是，不照射的样品即使经过1个月或以上也没有发现结晶析出。本实施例可以使分子量约20万的巨大的蛋白质的葡萄糖异构酶结晶化。由此本发明的方法通过照射激光可以说对这样巨大的蛋白质的结晶有效。
实施例6
本实施例是对来自于锥体虫的前列腺素F2α合成酶(31kDa)的结晶的实施例。蛋白质溶液是在室温下，将20mg/ml的前述合成酶和0.005M的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP+)一起充分溶解在0.04M的三盐酸缓冲液(pH 8.0)中配制而成的。之后利用膜滤器除去杂质。另外，储备溶液液(外液)是将0.01M的HEPES氢氧化钠缓冲液(HEPES-NaOH)、2％的聚乙二醇(PEG)400、1.2M的硫酸铵溶液(pH 7.5)。
通过激光照射进行结晶是使用图7所示的激光照射装置和结晶化容器，采用悬滴蒸汽扩散法进行的。如图所示，在该激光照射装置中由飞秒激光照射装置101照射的激光通过镜子102、波长板103、偏光器104及光闸105，用物镜(10倍)108聚集，以照射在结晶化容器118的结晶溶液117。然后前述结晶溶液117可以通过目镜112用肉眼观察，另外，也可以利用CCD113照相机和控视器114观察。在同一图中，116是外液，115是玻璃板，119是润滑脂。
如图所示，将蛋白质溶液2μl和外液2μl混合后的结晶溶液的液滴形成在玻璃板115上。在结晶容器118中加入500μl的外液116，使前述结晶溶液的液滴117悬挂，用玻璃盖上。这时使用润滑脂119使其密封。注意不要使外液116落下，同时将结晶容器118反过来，对结晶溶液的液滴117光线聚集照射激光。激光照射是在温度·湿度管理的绝对无尘室(温度23℃±2℃、湿度65％±5％)进行。激光的波长为780nm，时间间隔为200飞秒(fs)，激光振荡的重复频率为1kHz。激光脉冲能量通过波长板和偏光器调节。激光的照射次数通过改变光闸的开闭时间进行调整。激光的脉冲强度为1.95nJ/脉冲。通过光闸的开闭照射62脉冲(1/16秒)。作为对比试验不照射激光培养样品。
激光照射后，在设定为20℃的恒温槽中静置，观察之后的结晶生长。将激光照射7天后的照片表示在图11中。可以观察到从照射激光的溶液析出结晶，不照射的样品中即使经过3个月也没有发现结晶。本实施例中通过激光照射在短时间内产生结晶。
实施例7
本实施例是对腺甙脱氨酶(ADA)本身结晶的实施例。蛋白质溶液是在室温下，将20mg/ml的ADA本身溶解在0.0025M的HEPES缓冲溶液(pH 7.5)中配制而成。其后利用膜滤器除去杂质。另外储备溶液(外液)配制如下(1)0.2M的柠檬酸钠、0.1M的二甲胂酸钠及30％异丙醇溶液(pH6.5)；(2)0.2M的乙酸铵、0.1M的柠檬酸钠及30％的聚乙二醇(PEG)4000的溶液(pH 5.6)。
通过激光照射进行结晶是使用图6所示的激光照射用和结晶化板，利用Sitting-drop蒸汽扩散法进行的。将蛋白质溶液2μl加入结晶培养容器部107，在储备溶液部106中分别加入100μl的外液(1)和(2)。之后用移液管吸取2μl，放入结晶培养容器部107。使蛋白质溶液和外液充分混合之后，在室温下对蛋白质溶液中光线聚集照射激光。激光的脉冲强度为1.95nJ/脉冲。通过光闸的开闭照射1000脉冲(1秒)。比较试验是不照射来培养样品。
激光照射后，在设定为20℃的恒温槽中静置，观察之后的结晶生长。将激光照射7天后的照片表示在图12中。可以观察到从照射激光的溶液析出结晶，不照射的样品中即使经过1个月也没有结晶。本蛋白质迄今为止还没有得到结晶，在本实施例中首先实现了结晶。
实施例8
本实施例是对大肠菌主要异物排出传输物(AcrB)结晶的实例。AcrB多变型膜蛋白质，1049氨基酸残基构成的单体是3个相互缠绕的3聚物蛋白质。
蛋白质溶液是在带有28mg/ml的组氨酸标识的AcrB中添加0.02M的磷酸钠(pH 6.2)、10％甘油和0.2％的十二烷基麦芽苷得以配制而成。另外，储备溶液(外液)将14.1～14.6％的聚乙二醇(PEG)4000、0.08M的磷酸钠(pH 6.2)和0.02M的柠檬酸钠-盐酸(pH 5.6)进行配制。
通过激光照射进行结晶是使用图6所示的结晶容器和装置，利用Sitting-drop蒸汽扩散法进行的。
将蛋白质溶液2μl加入结晶培养容器部107，在储备溶液部106中分别加入50μl的前述外液。之后用移液管从储备溶液部106吸取2μl，放入结晶培养容器部107，使蛋白质溶液和外液充分混合。本实施例中，使PEG4000的浓度从14.1％到14.6％，每0.1％准备6个条件的培养溶液，利用各个培养溶液进行结晶。之后，在温度·湿度管理的绝对无尘室(温度23℃±2℃、湿度65％±5％)利用物镜(倍率10倍)使高功率飞秒钛蓝宝石激光聚集光，对蛋白质溶液中照射。激光的波长为780nm，时间间隔为200飞秒(fs)，激光振荡的重复频率为1kHz。激光的脉冲强度为800nJ/脉冲。通过光闸的开闭时间，照射250脉冲(1/4秒)。对比试验通过不照射来培养试样。
激光照射后，在设定为25℃的恒温槽中静置，观察之后的结晶生长。将激光照射2天后的照片表示在图13中。如图所示，改变聚乙二醇(PEG)4000的浓度，配制结晶培养溶液。对任何一个培养溶液照射激光的溶液中都可以观察到结晶析出(图13中用箭头表示)，不照射的样品中即使经过1周也没有结晶(图中未表示)。
膜蛋白质尽管结晶困难，但是本实施例实现了膜蛋白质的结晶。
参考例2
该参考例是使容器运动，使蛋白质结晶的实例。
在鸡蛋白溶菌酶的结晶培养中，搅拌溶液。蛋白质溶液使用在蒸馏水50ml、乙酸钠三水和物0.467g中加入乙酸，调整至pH 4.5之后，添加氯化钠1.25g和鸡蛋白溶菌酶1.25g得到的溶液。将室温调整后的溶液放入100ml的聚四氟乙烯容器中，在恒温水槽中40℃下保持24小时，使其完全溶解。之后用5小时冷却至25℃，用孔径0.2μm的膜滤器除去杂质。另一方面，储备溶液使用向蒸馏水50ml、乙酸钠三水和物0.467g中加入乙酸，调整至pH 4.5之后，追加氯化钠3g得到的溶液。
相对于蛋白质溶液3μl和10μl将储备溶液设定为300μl，研究有无溶液搅拌带来的差别。结晶方法使用Sitting-drop蒸汽扩散法。另外也同时对使用全氟化碳(前述蛋白质溶液也是比重大的溶液)的2液界面上形成结晶的浮滴蒸汽扩散法使进行实验。全氟化碳溶液量为10μl。结晶培养是在20℃特定温度下进行。
搅拌机构使用旋转振荡器(TIETECH公司制造的BR-15)。旋转速度设定在50rpm慢慢地搅拌溶液。该搅拌装置的示意图表示在图14中。如图所示，在振荡器202上装载有凹板201，使其旋转运动进行搅拌。另外，凹板201的各凹部由2个小凹部和一个大凹部构成。适合应用浮滴(Floating-drop)法的小凹部中放入前述蛋白质溶液和214全氟化碳，适合应用Sitting-drop法的小凹部中放入前述蛋白质溶液212。另外在大凹部中放入以高浓度溶解溶菌酶以外成分的储备溶液213。利用该方法可以一次并简单地搅拌多的溶液。
结晶培养结果如图15所示。有无溶液搅拌导致结晶析出数和结晶尺寸明显不同。图15A、B所示，在以前的方法中不搅拌溶液，析出较多的非常小的结晶(微结晶)。另外，如图15C、D所示，通过溶液搅拌培养可以得到结晶析出数少而且大的结晶。另外，与溶液搅拌Sitting-drop法(参照图15C)相比，浮滴(图15D)结晶析出更少，结晶尺寸也大。
下面，根据图对本发明的容器的实施例进行说明。
实施例9
图16的剖面图中表示本发明的第1容器的一个实例。如图所示，该容器301具有第1室311和第2室313，前述两室由通路连通着。该容器301的上部用盖体316覆盖，形成密闭状态，另外前述容器301的底部315为了可以透过激光317，与前述第1室相对应的部分为透明或半透明。该底的部分的材料如果不通过光，没有特别的限定，例如可以使用丙烯酸树脂等透明树脂、石英玻璃、玻璃等透明部件。另一方面，其它部分的部件没有特别的限定，可以使用一般的树脂和玻璃等。该容器总体的大小没有特别的限定，例如为纵20～180mm×横100～120×高度3～50mm、优选纵40～150mm×横20～100×高度5～30mm、更优选纵50～130mm×横30～80×高度10～20mm。第1室311中放入蛋白质溶液等溶液312，第2室313中放入储备溶液314，故第1室311最好比第2室313小。该容器301例如可以按如下使用。
首先，取下盖体316，在第1室311中放入蛋白质溶液等高分子溶液312，在第2室313中放入储备溶液314，用盖体316加盖密封。这样如同一图用箭头表示的一样，从高分子溶液312产生的水蒸气通过通路转移至第2室313，由此可以促进高分子溶液312的溶剂的蒸发。并且，如果高分子溶液312形成过饱和状态，为了强制性地使其生成结晶核，从容器301的底部例如使脉冲激光317照射高分子溶液312。只要生成结晶核，在这种情况下可以使结晶生长；如果没有生成结晶核，该条件判断为不适合结晶，可以在其它的条件下实验结晶。
如上所述，照射照射脉冲激光，观察结晶核的生成，只要生成结晶核，其溶液等条件可以判断为适合结晶；在该条件下培养就可以得到结晶。另外照射脉冲激光，观察溶质的状态，只要溶质发生变化，就可以判断为该溶液等条件适合结晶。前述溶质的变化在蛋白质的情况下例如出现立体结构的变化(改性)。
本发明的容器中，激光的种类、照射条件等如本发明的制造方法等所记载的一样，这些激光的条件等在本发明的其它的容器或板上也可以通用。
实施例10
下面，将一个板内形成多个前述第1容器的实例表示在图17的斜视图中。
如图所示，该板302形成有6个第1容器321，包括第1室321a和第2室321b，前述两室由通路连通。另外，该板302由前述第1容器321形成的板本体322、底部323和盖体324构成。底部323由透明或半透明材料构成以使激光325可以照射。该板302的形成材料和容器321的大小等和前述的第1容器相同。另外该板302的大小没有特别的限定，例如为纵20～180mm×横10～120×高度3～50mm、优选纵40～150mm×横20～100×高度5～40mm、更优选纵50～130mm×横30～80×高度10～30mm。在该板302上容器321的个数为6个，本发明不限于此，每个板有容器数1～1536个、优选2～384个，更优选4～96个。该板302按如下所示使用。
也就是，首先，当在容器321部分的第1室321a中放入高分子溶液，在第2室321b放入储备溶液时，通过蒸汽扩散促进高分子溶液的溶剂的蒸发。并且如果高分子溶液形成过饱和状态，如前所述照射脉冲激光325，使其强制性地生成结晶核。如果生成结晶核，就可以达到培养目的得到高分子结晶。另外，在不生成结晶核时。判断为结晶条件不适合，在下一个的条件下实验结晶。在该板中由于形成多个容器，故可以将高分子溶液的浓度改变等，设定每个容器的不同的结晶条件，另外，可以使每个容器在不同的条件下照射激光
实施例11
下面，将本发明的第2容器的一个实例表示在图18中。在同图中(A)为平面图，(B)为剖面图。
如图所示，该容器303是圆柱结合在圆盘的底上的形状。在前述圆盘的周边部，从圆中心放射状地形成有8个第1室331，在前述圆柱的中间，形成有一个第2室332。通路333分别从前述第1室331延伸，和第2室332连通在一起。在前述8个通路333中，各通路333其各个通路的直径不同。该容器303整体的大小没有特别的限定，根据第1室的大小和个数及第2室的大小等适当地选择确定。前述第1室的大小例如为内径0.5～10mm、深度1～50mm、优选内径1～5mm、深度3～40mm、更优选内径1～3mm、深度3～30mm、第1室的个数例如为1～1536个，优选2～384个，更优选4～96个。前述第2室的大小例如为内径1～30mm、深度1～50mm、优选内径2～20mm、深度2～40mm、更优选内径3～15mm、深度3～30mm、前述通路的长度没有特别的限定，例如为0.5～50mm、优选1～30mm、更优选1～20mm。另外，该通路其路径分别不同，例如为0.3～10mm、优选0.5～5mm、更优选0.5～3mm。该容器303的材质没有特别的限定，例如可以由树脂或玻璃等构成，当对第1室照射激光时，为了使激光透过该部分，可以用前述透明或半透明部件构成。该容器303例如按如下使用。
也就是，首先，当在多个第1室331部分放入高分子溶液334，在第2室332放入储备溶液时，如图中箭头表示，利用蒸汽扩散即使由高分子溶液334产生的水蒸气通过通路333，向第2室332移动，促进高分子溶液334的溶剂的蒸发。在该蒸汽扩散中，因为通路333的通路的直径分别不同，故第1室333的各个蒸发扩散条件不同。因此在多个第1室中，生成结晶核的，在该条件下继续培养可以得到目的的高分子结晶。另外，未产生结晶核的第1室可以判断为结晶条件不适合。而且，如果高分子溶液334形成过饱和状态，如前所述可以照射脉冲激光，使其强制性地生成结晶核。如果生成了结晶核，就可以将其培养而得到目的高分子结晶。另外，在不生成结晶核时，判断为结晶条件不适合，在下一个的条件下实验结晶。
实施例12
下面，将本发明的第2容器的其它的实例表示在图19中。在同图中(A)为平面图，(B)为剖面图。
如图所示，该容器304是圆柱结合在圆盘的底上的形状。在前述圆盘的周边部，从圆中心放射状地形成有8个第1室341，并且在前述圆柱的中间，形成有一个第2室342，通路343从前述第1室341的各处延伸，和第2室342连通着。在前述8个通路343中，各通路333其各个通路的长度不同。该容器304整体的大小没有特别的限定，根据第1室的大小和个数及第2室的大小等适当地选择确定。前述第1室的大小例如为内径0.5～10mm、深度1～50mm、优选内径1～5mm、深度3～40mm、更优选内径1～3mm、深度3～30mm；第1室的个数例如为1～1536个，优选2～384个，更优选4～96个。前述第2室的大小例如为内径1～30mm、深度1～50mm、优选内径2～20mm、深度2～40mm、更优选内径3～15mm、深度3～30mm。前述通路的长度没有特别的限定，例如为0.5～50mm、优选1～30mm、更优选1～20mm。另外，该通路路径分别不同，例如为0.3～10mm、优选0.5～5mm、更优选0.5～3mm。该容器4的材质没有特别的限定，例如可以由树脂或玻璃等构成，在第1室照射激光时，为了使激光透过该部分，可以用前述透明或半透明部件构成。该容器304例如按如下使用。
也就是，首先，当在多个第1室341部分放入高分子溶液344，在第2室342放入储备溶液345时，如图中箭头表示，利用蒸汽扩散使由高分子溶液344产生的水蒸气通过通路343，向第2室342移动，促进高分子溶液344的溶剂的蒸发。在该蒸汽扩散中，因为通路343的通路的长度分别不同，故第1室343的各个蒸发扩散条件不同。因此在多个第1室中，生成结晶核的是，在该条件下继续直接培养可以得到目的的高分子结晶。另外，未产生结晶核的第1室可以判断为结晶条件不适合。而且，如果高分子溶液344形成了过饱和状态，如前所述可以照射脉冲激光，使其强制性地生成结晶核。如果生成了结晶核，就可以将其培养从而得到目的高分子结晶。另外，在不生成结晶核时，判断为结晶条件不适合，在下一个条件下实验结晶。
另外，实施例11中使通路的直径发生变化，实施例12中使通路的长度发生变化，也可以将它们组合使用。另外，也可以在一个板内形成多个实施例11的容器、实施例12的容器及将上述容器组合的容器的至少一种。该板的大小等条件例如和实施例10的板相同。
实施例13
下面，将本发明的第3容器的一个实例表示在图20中。如图所示，该容器305是在大容器351中配置有小容器352的结构。大容器351是圆柱状，其上部通过盖体加盖。前述小容器352由倒圆锥台形状本体部(大容积部)和与该本体部分的上部连接的圆筒部(小容积部)构成，前述圆筒部的前端开口。大容器351的内壁和小容器352的外壁之间的空间是装入储备溶液354的第2室。另外，小容器51的内部或其圆筒部前端口附近是加入高分子溶液355或使其保持的第1室。该容器305的大小没有特别的限定。前述大容器351的大小例如为内径3～30mm，深度5～100mm；优选内径5～25mm，深度10～50mm；更优选内径10～20mm，深度10～30mm；大容器352的大小例如在倒圆锥台形状本体部(大容积部)，最大内径3～30mm，最小内径0.3～5mm、高度4～90mm、在前述圆筒部(小容积部)，内径0.3～5mm、高度0.1～5mm；优选在倒圆锥台形状本体部(大容积部)，最大内径5～25mm，最小内径0.5～3mm、高度9～45mm、在圆筒部(小容积部)，内径0.5～3mm、高度0.1～3mm；更优选在倒圆锥台形状本体部(大容积部)，最大内径10～20mm，最小内径1～2mm、高度9～25mm、在圆筒部(小容积部)，内径1～2mm、高度0.1～2mm。另外，容器305的材质没有特别的限定，例如可以使用树脂、玻璃等。该容器中照射激光时，通过激光的部分可以由透明或半透明的部件构成，这样的部件例如有前面例举的。该容器305例如按照以下所述使用。
也就是，首先，在大容器351(室353)放入储备溶液354，小容器352装满非混合性高比重液体356。另外，在小容器352的底部配置磁搅拌子307。然后，在小容器352的圆筒部的前端配置高分子溶液355的液滴，在该状态下将容器305置于磁搅拌机306的上面，使前述搅拌子旋转。这样，通过储备溶液354的作用，促进水蒸气从高分子溶液355中产生。另外，通过搅拌子307的旋转使非混合性高比重液体356搅拌，其振动也传递给高分子溶液355，间接地搅拌高分子溶液，其结果是，促进结晶核的生成。然后，如果高分子溶液有结晶核生成，在该条件下继续培养，可是得到目的结晶，在没有结晶核生成的情况，判断该条件不适合结晶，可以在下一个条件下进行实验。而且，如果形成了过饱和状态，也可以对高分子溶液355照射激光。另外也可以在一个板内形成多个该实施例的容器内进行。该条件例如和实施例10的板相同。
如上所述，本发明的方法可用于蛋白质等有机物的结晶制造或筛选。

Claims (44)

1、一种结晶核的制造方法，其中，通过对溶解有结晶对象的溶质的溶液照射皮秒脉冲激光及飞秒脉冲激光中的至少一种脉冲激光，使其生成结晶核。
2、根据权利要求1所记载的制造方法，其中，利用透镜将脉冲激光聚集在溶液中，在该光线光线聚集位置，使其产生单次或多次的局部爆炸现象，由此生成结晶核。
3、根据权利要求1或2所记载的制造方法，其中，在激光照射一次时，脉冲激光的脉冲峰值功率为5×105瓦特或以上。
4、根据权利要求1至3任何一项所记载的制造方法，其中，在激光照射一次时，脉冲激光具有的激光脉冲能量为60nJ/脉冲或以上。
5、根据权利要求1或2所记载的制造方法，其中，在1秒照射激光1000脉冲或以上时，脉冲激光的脉冲峰值功率为1×104瓦特或以上。
6、根据权利要求1、2或5所记载的制造方法，其中，在1秒照射激光1000脉冲或以上时，脉冲激光具有的激光脉冲能量为1.95nJ/脉冲或以上。
7、根据权利要求1至6任何一项所记载的制造方法，其中，脉冲激光是飞秒脉冲激光。
8、根据权利要求1至7任何一项所记载的制造方法，其中，脉冲激光的照射次数为单次至1000万次。
9、根据权利要求1至8任何一项所记载的制造方法，其中，所述溶液为过饱和溶液。
10、一种结晶的制造方法，其中，利用权利要求1至9任何一项所记载的方法使结晶核在溶液中生成，以此为基础使结晶生长。
11、根据权利要求10所记载的制造方法，其中，结晶对象的溶质为有机物。
12、根据权利要求10所记载的制造方法，其中，结晶对象的溶质为蛋白质。
13、一种用于实施权利要求1至9任何一项所记载的方法的结晶核制造装置，其具有脉冲激光照射手段。
14、一种结晶条件的筛选方法，其包括：对溶解有结晶对象的溶质的溶液照射皮秒脉冲激光和飞秒脉冲激光中的至少一种脉冲激光的工序；以及从通过所述激光照射判定结晶核是否生成的工序和通过所述激光照射判定溶质是否变化的工序中选择的至少一种。
15、根据权利要求要求14所记载的筛选方法，其中，利用透镜将脉冲激光聚集在溶液中，在该光线聚集位置使其产生单次或多次的局部爆炸现象，由此诱发结晶核的生成或溶质的改性。
16、根据权利要求14或15所记载的筛选方法，在激光照射一次时，脉冲激光的脉冲峰值功率为5×105瓦特或以上。
17、根据权利要求14至16任何一项所记载的筛选方法，在激光照射一次时，脉冲激光具有的激光脉冲能量为60nJ/脉冲或以上。
18、根据权利要求14或15所记载的筛选方法，在1秒照射激光1000脉冲或以上时，脉冲激光的脉冲峰值功率为1×104瓦特或以上。
19、根据权利要求14、15或18所记载的筛选方法，在1秒照射激光1000脉冲或以上，脉冲激光具有的激光脉冲能量为1.95nJ/脉冲或以上。
20、根据权利要求14至19任何一项所记载的筛选方法，脉冲激光是飞秒脉冲激光。
21、根据权利要求14至20任何一项所记载的筛选方法，其脉冲激光的照射次数为单次至1000万次。
22、根据权利要求14至21任何一项所记载的筛选方法，其中，所述溶液为过饱和溶液。
23、根据权利要求14至22任何一项所记载的筛选方法，其中，结晶对象的溶质为有机物。
24、根据权利要求14至22任何一项所记载的筛选方法，其中，结晶对象的溶质为蛋白质。
25、一种用于实施权利要求14至24任何一项所记载的筛选方法的筛选装置，其具有脉冲激光照射手段。
26、根据权利要求10所记载的制造方法，其中，通过使放入所述溶液的容器运动来使所述溶液边搅拌边生成结晶、并进行培养。
27、根据权利要求26所记载的制造方法，其中所述运动是旋转、振动和摇动中的任何一种运动或将它们中的两种或多种进行组合的运动。
28、根据权利要求26或27所记载的制造方法，其中，所述容器是具有多个凹部的凹部板，在所述各凹部加入所述溶液。
29、根据权利要求26至28任何一项所记载的制造方法，其中通过使所述溶液中的溶剂蒸发，或改变温度等，达到过饱和状态。
30、根据权利要求26至29任何一项所记载的制造方法，其中，在所述容器中加入比所述溶液的比重大的液体，在所述比重大的液体和所述液体的界面使结晶生长。
31、根据权利要求26至30任何一项所记载的制造方法，其中，准备另外的容器，在另外的容器中加入以比所述溶液的浓度高的浓度溶解有所述溶液的溶质以外的成分的储备溶液，并且，在该另外的容器和放入所述溶质的容器中，以水蒸气能够移动的状态，使所述溶质的结晶产生、并生长。
32、根据权利要求26至31任何一项所记载的制造方法，其中，所述溶液的溶质是树脂、蛋白质、糖类、脂质和核酸中的至少一种。
33、一种在权利要求1至12任何一项所记载的制造方法中使用或在权利要求14至24中任何一项所记载的筛选方法中使用的容器，其包括：第1室，其中加入结晶对象物质的溶液；第2室，其中加入储备溶液，该储备溶液中只有所述结晶对象物质的溶液中的所述结晶对象物质以外的成分以比所述结晶对象物质的溶液高的浓度溶解；通路，其使所述第1室和所述第2室连通，能够通过气体；并且，所述第1室的一部分或全部是透明或半透明，以使激光光线能够照射在所述结晶对象物质的溶液中。
34、根据权利要求33所记载的容器，其中，所述结晶对象物质是树脂、蛋白质、糖类、脂质和核酸中的至少一种。
35、一种在权利要求1至12任何一项所记载的制造方法中使用或在权利要求14至24中任何一项所记载的筛选方法中使用的板，其中该板形成有多个权利要求33所记载的容器。
36、根据权利要求35所记载的板，其中，所述结晶对象物质是树脂、蛋白质、糖类、脂质和核酸中的至少一种。
37、一种在权利要求1至12的任何一项所记载的制造方法中使用或在权利要求14至24中任何一项所记载的筛选方法中使用的容器，包括：第1室，其中加入结晶对象物质的溶液；第2室，其中加入储备溶液，该储备溶液中只有所述结晶对象物质的溶液中的所述结晶对象物质以外的成分以比所述结晶对象物质的溶液高的浓度溶解；通路，其使所述第1室和所述第2室连通，能够通过气体；并且，所述第1室有多个，其利用多个所述通路和一个或以上的所述第2室连通，在所述多个通路中，通路的直径或通路的长度中的至少一种分别不同，所述第1室的一部分或全部为透明或半透明，以使激光光线能够照射在所述结晶对象物质的溶液中。
38、根据权利要求37所记载的容器，其中，所述结晶对象物质是树脂、蛋白质、糖类、脂质和核酸中的至少一种。
39、在权利要求1至12的任何一项所记载的制造方法中使用或在权利要求14至24中任何一项所记载的筛选方法中使用的板，该板形成有多个权利要求37所述的容器。
40、一种在权利要求1至12的任何一项所记载的制造方法中使用或在权利要求14至24中任何一项所记载的筛选方法中使用的容器，包括：第1室，其中加入结晶对象物质的溶液和比该溶液比重大、且不和所述结晶对象物质的溶液混合的非混合性高比重液体；第2室，其中加入储备溶液，该储备溶液中只有所述结晶对象物质的溶液中的所述结晶对象物质以外的成分以比所述结晶对象物质的溶液高的浓度溶解，并且在所述第2室中形成有所述第1室，在所述第1室中设有下部的大容积部和比其容积小的上部的小容积部，且该上部前端开口，所述两室的中间能够通过气体，至少在所述第1室的上部或前端开口部保持结晶对象物质的溶液，而且，容器的一部分或全部为透明或半透明，以使激光光线可以照射在所述结晶对象物质的溶液中。
41、根据权利要求40所记载的容器，其中，在所述第1室中，所述下部的大容积部的形状为倒圆锥台或倒棱锥台，所述上部的小容积部的形状为圆筒或矩形筒，所述两者连接在一起。
42、根据权利要求41所记载的容器，其中，在所述第1室中，所述上部的小容积部的前端开口的上面形成结晶对象物质的溶液的液滴，在该状态下，使所述结晶对象物质的溶液的溶剂蒸发。
43、根据权利要求40至42中任何一项所记载的容器，其中，所述结晶对象物质是树脂、蛋白质、糖类、脂质和核酸中的至少一种。
44、一种在权利要求1至12的任何一项所记载的制造方法中使用或在权利要求14至24中任何一项所记载的筛选方法中使用的板，该板形成有多个权利要求40所记载的容器。
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