CN110238530A - 飞秒激光在单个蛋白质晶体上加工微纳结构的方法及系统 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种飞秒激光在单个蛋白质晶体上加工微纳结构的方法及系统，属于飞秒激光加工领域。本发明方法利用飞秒激光在单个蛋白质晶体上加工微纳结构，而且加工精度高，热影响区域小，不会导致晶体结构的破坏和蛋白质的失活。利用本发明的加工系统，对于空间位置复杂的蛋白质晶体，可以通过对平移台的三轴平移控制，实现任意倾斜平面上的加工。本发明方法可以在单个蛋白质晶体表面或内部加工得到微纳结构，其中微纳结构的最小尺度为1‑10μm，实现的微纳结构包括烧蚀坑、点阵、微通道等，可以广泛应用于蛋白质芯片、微流控等技术领域。

Description

飞秒激光在单个蛋白质晶体上加工微纳结构的方法及系统

技术领域

本发明涉及一种飞秒激光在单个蛋白质晶体上加工微纳结构的方法及系统，属于飞秒激光加工领域。

背景技术

当前蛋白质等生物材料在生物医学、环境科学、药物分析、组织工程等领域有许多重要的应用，现阶段的一个研究热点之一是生物材料微纳结构的制作，这一技术在将生物材料集成于微器件及生物材料功能化中具有很大的应用前景和发展潜力。例如生物分子在材料表面上的微图案化对许多实际应用如表面生物诊断、生物传感器和生物医学器件等都是十分重要的，材料表面的化学结构、亲疏水性及拓扑结构等对蛋白质的吸附及细胞的黏附和生长具有非常重要的影响。专利一种在固体表面固定蛋白质的方法(申请号201110346431.X)通过图案化氮化铝基底，实现在基底上的蛋白质图案化沉积，可以应用于蛋白质芯片的制备。蛋白质晶体作为蛋白质的一种存在形式，在生物制药、大分子结构分析，生物检测等方面有许多重要的应用，在蛋白质晶体内部的加工也可能在新型蛋白质器件制备中有一定应用潜力。

目前使材料表面图案化并具有吸附或排斥生物分子功能的途径有很多，诸如微接触印刷、毛细微模塑、电子束刻蚀等，但是目前对于蛋白质晶体的加工和微纳结构制备，缺少适用的方法。现有方法存在的主要限制在于，传统的透明材料加工方法，如连续激光、纳秒激光等有比较强的热效应，可能对加工区域附近的蛋白质晶体结构，蛋白质分子生物活性产生影响，并在晶体上产生裂纹甚至破碎；另外，基于MEMS工艺的光刻、离子束刻蚀等方法受限于材料种类和平面加工的模式，一些蛋白质晶体需要在溶液环境中保持稳定，传统二维加工方法无法加工液体环境内的材料，或无法精确加工在溶液中有一定倾斜角度的平面。

飞秒激光加工是一种利用了飞秒激光峰值功率极高，脉冲时间极短等特点的加工方法，具有精度高，热影响区域小，三维加工自由度高，使用材料范围广泛等特点，已经被应用于许多生物材料、透明材料等的加工中。例如专利使用激光烧蚀技术的蛋白质分析方法(申请号03824652.X)利用超快激光烧蚀固定在蛋白质芯片表面的蛋白质，对产生的离子化物质进行成分分析；专利飞秒激光在石英玻璃内部烧蚀微通道的方法(申请号201710693874.3)，利用了飞秒激光对透明材料三维加工的优势，在石英玻璃内部加工得到微通道。但现有方法都没有涉及到对于蛋白质单晶的三维加工，无法应用于蛋白质结构分析和生物制造领域。

发明内容

本发明的目的是提出一种飞秒激光在单个蛋白质晶体上加工微纳结构的方法及系统，通过飞秒激光加工方法，在单个蛋白质晶体表面和内部选择区域进行烧蚀，加工出特定的微纳结构，同时保证对周围热影响小，不破坏晶体结构和蛋白质的生物活性。

本发明提出的利用飞秒激光在单个蛋白质晶体上加工微纳结构的方法，包括以下步骤：

(1)制备含有蛋白质晶体的蛋白质溶液，过程如下：

(1-1)将蛋白质固体与质量百分比浓度为2％-5％的盐溶液相互混合，得到蛋白质溶液，蛋白质溶液中，蛋白质的质量分数为饱和溶液质量分数的1～3倍，调节蛋白质溶液的pH值为4～6；

(1-2)配置与步骤(1-1)相同成分的质量百分比浓度为10％～20％盐溶液，将该盐溶液和步骤(1-1)的蛋白质溶液分别放在两个容器中，将该两个容器置于同一密闭容器中，在室温下静置6～24h，通过水分子的扩散作用，使蛋白质溶液的水逐渐蒸发析出蛋白质晶体，得到含有蛋白质晶体的蛋白质溶液；

(2)使飞秒激光入射到步骤(1)的含有蛋白质晶体的蛋白质溶液中，所述的飞秒激光的脉冲持续时间为35～120fs，单脉冲能量为蛋白质烧蚀阈值的1～3倍，重复频率为1～1000Hz。

上述方法中的盐为氯化钠、乙酸钠或磷酸二氢钠。

本发明提出的利用飞秒激光在单个蛋白质晶体上加工微纳结构的系统，包括飞秒激光器、快门、衰减片、第一反射镜、第二反射镜、第三反射镜、物镜、平移台和照相机；所述的飞秒激光器、快门、衰减片和第一反射镜共光轴设置，飞秒激光器产生的飞秒激光经过快门后经过衰减片调节飞秒激光功率，依次经第一反射镜、第二反射镜和第三反射镜反射后射入物镜，传播并聚焦到含有蛋白质晶体的溶液中；含有蛋白质晶体的溶液置于平移台上，通过平移台的运动，控制样品在XYZ轴方向运动；第三反射镜的另一侧设有照相机，用于观测和成像。

本发明提出的利用飞秒激光在单个蛋白质晶体上加工微纳结构的方法，其优点是：

本发明的飞秒激光在单个蛋白质晶体上加工微纳结构的方法，实现了在单个蛋白质晶体上加工出微纳结构。而且加工精度高，热影响区域小，不会导致晶体结构的破坏和蛋白质的失活。利用本发明的加工系统，对于空间位置复杂的蛋白质晶体，可以通过对平移台的三轴平移控制，实现任意倾斜平面上的加工。本发明方法可以在单个蛋白质晶体表面或内部加工得到微纳结构，其中微纳结构的最小尺度为1-10μm，实现的微纳结构包括烧蚀坑、点阵、微通道等，可以广泛应用于蛋白质芯片、微流控等技术领域。

附图说明

图1是本发明提出的飞秒激光在单个蛋白质晶体上加工微纳结构的系统的结构示意图。

图2为本发明实施例1在蛋白质晶体内部加工微阵列的示意图。

图3是本发明实施例2在蛋白质晶体表面加工微结构的示意图。

图1中，1是飞秒激光器，2是快门，3是衰减片，4是第一反射镜，5是第二反射镜，6是第三反射镜，7是物镜，8是平移台，9是含有蛋白质晶体的溶液，10是照相机。

图2中，11是聚焦的飞秒激光光束，12是蛋白质晶体。

具体实施方式

本发明提出的利用飞秒激光在单个蛋白质晶体上加工微纳结构的方法，包括以下步骤：

(1)制备含有蛋白质晶体的蛋白质溶液，过程如下：

(1-1)将蛋白质固体与质量百分比浓度为2％-5％的盐溶液相互混合，得到蛋白质溶液，蛋白质溶液中，蛋白质的质量分数为饱和溶液质量分数的1～3倍，盐可以用于促进蛋白质的溶解和结晶过程，调节蛋白质溶液的pH值为4～6；

(1-2)配置与步骤(1-1)相同成分的质量百分比浓度为10％～20％盐溶液，将该盐溶液和步骤(1-1)的蛋白质溶液分别放在两个容器中，将该两个容器置于同一密闭容器中，在室温下静置6～24h，通过水分子的扩散作用，使蛋白质溶液的水逐渐蒸发析出蛋白质晶体，得到含有蛋白质晶体的蛋白质溶液；

(2)使飞秒激光入射到步骤(1)的含有蛋白质晶体的蛋白质溶液中，所述的飞秒激光的脉冲持续时间为35～120fs，单脉冲能量为蛋白质烧蚀阈值的1～3倍，例如当脉冲持续时间为35fs时，单脉冲能量为可以为40～120nJ，重复频率为1～1000Hz。加工单个点时，脉冲个数为1～100个，加工线或面时，平移台移动速度为10～100μm/s。

脉冲持续时间在35-120fs，单脉冲能量为蛋白质烧蚀阈值的1-3倍(脉冲持续时间35fs条件下约为40-120nJ)，重复频率为1-1000Hz，

上述方法中的盐可以为氯化钠、乙酸钠或磷酸二氢钠。

本发明提出的利用飞秒激光在单个蛋白质晶体上加工微纳结构的系统，其结构如图1所示，包括飞秒激光器1、快门2、衰减片3、第一反射镜4、第二反射镜5、第三反射镜6、物镜7、平移台8和照相机10；所述的飞秒激光器1、快门2、衰减片3和第一反射镜4共光轴设置，飞秒激光器1产生的飞秒激光经过快门2后经过衰减片3调节飞秒激光功率，依次经第一反射镜4、第二反射镜5和第三反射镜6反射后射入物镜7，传播并聚焦到含有蛋白质晶体的溶液9中；含有蛋白质晶体的溶液9置于平移台8上，通过平移台8的运动，控制样品在XYZ轴方向运动；第三反射镜6的另一侧设有照相机10，用于观测和成像。

这种方法预期可以在单个蛋白质晶体表面或内部加工得到微纳结构，其中微纳结构的最小尺度为1-10μm，实现的微纳结构包括烧蚀坑、点阵、微通道等，在蛋白质芯片、微流控等领域都有潜在的应用。

下面结合实施例，进一步介绍本发明的内容：

本发明的实施例中使用的激光器为Coherent公司生产的钛蓝宝石飞秒激光器，中心波长800nm，脉冲持续时间<35fs。

实施例1：飞秒激光在单个蛋白质晶体内部加工多孔阵列

(1-1)本实施例中，以牛胰岛素作为蛋白质原料，过饱和溶液中成分为牛胰岛素粉末10mg/ml，磷酸二氢钠2％(质量分数)，

(1-2)取2μl(1-1)中所配的溶液滴在盖玻片上，悬挂在含10％(质量分数)磷酸二氢钠溶液的液池上方，密闭静置在20℃环境下24h，直到通过显微镜可以在悬挂的液滴中观察到100μm左右的蛋白质晶体。

本实施例加工蛋白质内部的间距为20μm的点阵，如附图2中所示，11为聚焦的激光光束，12为蛋白质晶体，虚线椭圆表示的点为待加工点阵列。所采用激光为飞秒激光，中心波长为800nm，脉冲持续时间在35fs，在蛋白质内部加工能量需要达到表面烧蚀阈值的2-3倍，因此选择单脉冲能量100nJ，重复频率为1000Hz，脉冲个数为100个(通过控制快门2打开时间为0.1秒实现)。规划路径为先在Z轴方向上移动平移台，使激光焦点位于蛋白质晶体12内部如附图2中虚线所示平面，接着在XY方向移动平移台位置，移动过程中通过快门2挡住激光，到达指定位置(附图2中虚线椭圆所示位置)时，打开快门2，0.1秒后关闭，然后移动至下一个待加工点，在所选的点处实现加工；调节衰减片3改变单脉冲能量为100nJ，根据上述规划的加工路径控制平移台8和快门2实现微纳结构加工。

实施例2：飞秒激光在单个蛋白质晶体表面上加工微纳结构

本实施例中以鸡蛋白溶菌酶作为蛋白质原料，过饱和溶液的成分为：鸡蛋白溶菌酶粉末30mg/ml，氯化钠2.5％(质量分数)，三水合乙酸钠1.36％(质量分数)。

取2μl该溶液滴在盖玻片上，悬挂在含10％(质量分数)氯化钠溶液的液池上方，密闭静置在20℃环境下24h，直到通过显微镜可以在悬挂的液滴中观察到100μm左右的蛋白质晶体。

本实施例加工蛋白质表面上的加工微纳结构，如附图3中所示，11为聚焦的激光光束，12为蛋白质晶体，有虚线图案的晶体表面为待加工表面，与XY平面成一定角度。所采用激光为飞秒激光，中心波长为800nm，脉冲持续时间在35fs，在蛋白质表面加工选择能量为烧蚀阈值的1.5倍，因此选择单脉冲能量60nJ，脉冲重复频率为1000Hz，平移台移动速度20μm/s。平移台运动路径需要使得激光聚焦在待加工平面上，通过成像系统中得到的倾斜平面上的点在XYZ轴坐标上的关系，确定加工图案的XYZ轴坐标，编写平移台运动路径使得激光焦点在晶体上移动的路径在晶体表面所确定的平面上，如图3中的虚线所示。调节衰减片3改变单脉冲能量为60nJ，打开快门2，根据上述规划的加工路径控制平移台8实现微纳结构加工。

Claims (3)

1.一种利用飞秒激光在单个蛋白质晶体上加工微纳结构的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：

(1)制备含有蛋白质晶体的蛋白质溶液，过程如下：

(1-1)将蛋白质固体与质量百分比浓度为2％-5％的盐溶液相互混合，得到蛋白质溶液，蛋白质溶液中，蛋白质的质量分数为饱和溶液质量分数的1～3倍，调节蛋白质溶液的pH值为4～6；

(1-2)配置与步骤(1-1)相同成分的质量百分比浓度为10％～20％盐溶液，将该盐溶液和步骤(1-1)的蛋白质溶液分别放在两个容器中，将该两个容器置于同一密闭容器中，在室温下静置6～24h，通过水分子的扩散作用，使蛋白质溶液的水逐渐蒸发析出蛋白质晶体，得到含有蛋白质晶体的蛋白质溶液；

(2)使飞秒激光入射到步骤(1)的含有蛋白质晶体的蛋白质溶液中，所述的飞秒激光的脉冲持续时间为35～120fs，单脉冲能量为蛋白质烧蚀阈值的1～3倍重复频率为1～1000Hz。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于其中所述的盐为氯化钠、乙酸钠或磷酸二氢钠。

3.一种利用飞秒激光在单个蛋白质晶体上加工微纳结构的系统，其特征在于包括飞秒激光器、快门、衰减片、第一反射镜、第二反射镜、第三反射镜、物镜、平移台和照相机；所述的飞秒激光器、快门、衰减片和第一反射镜共光轴设置，飞秒激光器产生的飞秒激光经过快门后经过衰减片调节飞秒激光功率，依次经第一反射镜、第二反射镜和第三反射镜反射后射入物镜，传播并聚焦到含有蛋白质晶体的溶液中；含有蛋白质晶体的溶液置于平移台上，通过平移台的运动，控制样品在XYZ轴方向运动；第三反射镜的另一侧设有照相机，用于观测和成像。