KR20060095642A

KR20060095642A - 천연용매를 추출매체로 하는 소나무류 수피 유래 항산화성물질 추출방법 및 이에 의한 항산화성 추출물

Info

Publication number: KR20060095642A
Application number: KR1020050016421A
Authority: KR
Inventors: 한완택
Original assignee: 뉴트라팜주식회사
Priority date: 2005-02-28
Filing date: 2005-02-28
Publication date: 2006-09-01
Also published as: KR100659945B1; WO2006090953A1

Abstract

본 발명은 천연용매를 추출매체로 하는 소나무류 수피 유래 항산화성 물질 추출방법 및 이에 의한 항산화성 추출물에 관한 것으로, 소나무류 수피로부터 천연용매인 주정용액을 사용하여 항산화물질을 추출하는 단계 ; 상기 일차 추출물을 대상으로 천연 주정용액 및/또는 천연 동식물성 기름을 사용하여 일차 추출물로부터 비극성물질을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하며, 소나무류 수피로부터 항산화활성이 우수한 천연 항산화물질을 환경친화적이며 경제적으로 제공하기 위한 발명이다.

소나무 수피, 항산화물질, 천연용매, 추출, 분리

Description

천연용매를 추출매체로 하는 소나무류 수피 유래 항산화성 물질 추출방법 및 이에 의한 항산화성 추출물{Extraction method for antioxidants from pine trees using natural solvents and antioxidant extracts thereby}

본 발명은 천연용매를 추출매체로 하는 소나무류 수피 유래 항산화성 물질 추출방법 및 이에 의한 항산화성 추출물에 관한 것이다.

최근 노인인구의 급격한 증가하고 있고 각종 성인병의 주요원인이 활성산소로 밝혀짐에 따라 천연 항산화물질에 대한 연구와 관심이 크게 증가하고 있다.

활성산소는 프리라디컬을 갖는 산소를 말하며 화학적으로 매우 불안정한 특성을 지니고 있어 주위의 물질에 높은 반응성을 나타내어 세포내 단백질, 지질분자는 물론이고 유전물질인 DNA에도 산화적 손상을 입힘으로 인하여 세포의 기능 및 생명에 매우 치명적인 물질로 알려져 있다.

항산화제는 인체내에서 생성되는 이러한 활성산소의 소거활성을 갖는 물질로 인체에 축적된 산화적 스트레스에 의한 노화 및 각종 질병(동맥경화, 고혈압, 뇌출혈, 당뇨, 심장병 등)을 예방하고 개선하는 물질로 그 동안 많은 연구가 행하여져 왔으며 각종 질병의 치료제 기능을 지닌 강력한 천연 항산화물질의 개발이 절실히 요청되고 있다.

상기 활성산소를 제거하는 항산화물질로는 크게 합성항산화제와 천연항산화제로 구분할 수 있다.

합성항산화제로는 BHA(부틸레이티드 하이드록시아니솔, Butyrated hydoxyanisole), BHT(부틸레이티드 하이드록시톨루엔, Butyrated hydoxytoluene) 등이 널리 사용되고 있으나 최근 연구결과 이들 합성항산화제에 독성이 있다는 것이 밝혀지면서 보다 안전하고 항산화활성이 우수한 천연항산화물질의 개발이 요구되고 있는 것이다.

소나무류 수피에는 활성산소를 강력하게 제거하는 천연 항산화물질인 바이오플라보노이드류의 성분을 함유하고 있는 것으로 알려져 있으며, 소나무류로부터 항산화물질을 추출하는 방법으로 많은 특허출원이 있어왔다.

미국특허 제4,698,360호에 따를 경우, 소나무 수피로부터 항산화성 물질을 추출 분리하기 위하여 합성용매 (초산에칠, 클로로포름)를 반복적으로 사용하고 있고, 무기염류(소금, 황산암모니움, 황산나트륨)를 사용함에 따라 제조공정이 매우 복잡하고 매우 낮은 추출수율(수피 대비 약 0.21%)로 인하여 경제성이 매우 낮으며, 또한 항산화추출물에 잔류하는 합성유기용매로 인하여 식품으로 사용하기에는 그 안전성이 문제가 된다.

대한민국특허 제10-0212974호에 따를 경우, 소나무류 수피로부터 항산화물질을 추출, 분리하기 위하여 휘발성이 높은 합성유기용매인 메탄올, 디에틸에테르, 초산에칠, 헵탄 등을 사용함으로 인하여 작업성이 매우 열악하고 또한 항산화추출 물에 합성유기용매의 잔존가능성 때문에 식품으로 사용하기 어려운 문제가 발생된다.

또한 대한민국특허 제10-0429406호는 솔잎유래 항산화물질의 제조방법을 보이고 있는데 이에 따를 경우에도 합성유기용매인 메탄올과 초산에칠을 사용하고 있으며, 대한민국특허공고 제1993-0005694호는 녹차엽으로부터 항산화제의 제조방법을 보이고 있는데 이에 따를 경우에도 물에 탄산칼슘을 첨가하여 추출물을 추출한 뒤 흡착수지를 이용하여 항산화물질을 흡착시킨 후 초산에칠, 메탄올, 아세톤 등의 합성유기용매를 사용하여 항산화물질을 분리하고 있다.

나아가서, 홍화씨로부터 천연항산화물질을 분리정제하는 방법을 보이고 있는 대한민국특허 제10-0341797호에서도 메탄올, 핵산, 초산에칠, 클로로포름 등의 합성유기용매를 사용하여 항산화물질을 분리하고 있으며, 참께로부터 천연항산화성분의 분리방법을 보이는 대한민국특허 제10-0109461호에서도 메탄올, 초산에칠, 클로로포름 등의 합성유기용매를 사용하고 있으며, 녹차 생엽으로부터 카테킨류의 추출방법을 보이고 있는 대한민국특허 제10-0395464호에서도 다이클로로메탄, 초산에칠, 아세톤 등의 합성유기용매를 사용하고 있으며, 헛개나무로부터 항산화물질의 추출방법을 보이는 대한민국특허 제10-0439012호에서도 메탄올, 초산에칠 등의 합성유기용매를 사용하고 있다.

이와 같이 종래의 방법들에 따를 경우 항산화물질의 제조공정 중에 다량의 합성유기용매를 사용하고 있으며 이에 따라 추출물을 식품원료로 사용하는 데에 안전성과 법적인 문제가 제기되고 있며, 휘발성 유기용매를 취급해야 함에 따라 작업 조건이 매우 까다로우며, 대기 및 수질을 더럽히는 다량의 환경오염물질을 발생하는 등 항산화물질의 품질 및 제조공정중에 여러 가지 문제점이 발생한다.

특별히, 종래 추출방법에 의하면 소나무류 수피로부터 항산화물질을 추출, 분리하는 공정에서는 여러 단계의 복잡한 추출, 농축 및 분리 공정으로 구성되어 있음으로 인하여 항산화성 물질의 추출수율이 매우 낮으며, 작업성이 떨어지고 생산비용이 매우 높다는 문제점이 있으며, 또한 인체에 독성을 지닌 여러 가지 휘발성 합성유기용매를 항산화물질의 제조공정 중에 다량 사용하고 있기 때문에 작업안전성이 떨어지고, 대기오염 및 수질오염을 일으킬 수 있으며, 또한 생산된 항산화물질의 추출물에 합성유기용매의 잔존 가능성에 의하여 항산화추출물을 식품으로 사용할 수 없는 심각한 문제점이 발생하고 있다.

또한 종래 방법에서는 추출 및 분리공정 중에 여러 가지 염류, 즉 소금, 황산암모늄, 황산나트륨, 탄산칼슘 등을 사용함에 따라 염류를 항산화물질로부터 완전히 분리하는 공정이 추가적으로 필요하므로 작업성과 생산성이 매우 떨어지며, 염류에 의한 수질오염 등 환경문제가 발생되는 문제점이 있게 된다.

본 발명은 종래 방법에서 제기된 상기 문제점들을 해결하기 위하여 휘발성이 낮고 항산화물질 추출능력이 우수한 천연용매인 발효주정용액만을 사용하여 소나무류 수피로부터 항산화성 물질을 고효율로 추출하는 공정 및, 추출물에 함유되어 있는 송진 등의 비극성물질을 효율적으로 제거하고 항산화물질을 분리, 농축하기위하여 주정용액 및/또는 천연 동식물성 기름을 사용함으로써 제조공정을 단순화시키고, 환경오염물질의 발생을 최소화하여 환경처리비용을 절감할 수 있는 추출방법을 제공하는 것이다. 또한 본 발명에 의한, 추출공정에 의하여 얻어진 소나무 수피 유래 항산화성 추출물은 항산화활성이 우수할 뿐만 아니라 추출수율도 매우 높아, 본 발명에 의한 추출방법은 소나무류 수피로부터 높은 가격경쟁력을 지닌 항산화성 물질을 대량으로 생산할 수 있다.

본 발명은 소나무류 수피로부터 천연항산화성 물질을 추출하기 위하여 천연용매인 발효주정용액을 사용하여 수피로부터 항산화물질을 일차 추출하고, 주정용액 또는 천연 동식물성 기름을 사용하여 수피 추출물에 함유된 송진 등의 비극성물질을 효율적으로 제거하는 것을 특징으로 하는 천연항산화성 물질의 추출방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한 본 발명은 항산화성 추출물의 항산화활성과 추출효율을 높이기 위하여 주정용액 에탄올 농도, 사용량, 추출온도 등에 대한 조건을 특정하고, 추출물에 포함된 비극성물질을 효율적으로 제거하기 위하여 주정용액 또는 동식물성 기름을 사용하여 용매의 사용량, 추출온도, 여과 및 농축방법에 대한 조건을 소정하여 효율적인 천연항산화성 물질의 추출방법을 제공하는데 다른 목적이 있다.

나아가서, 본 발명은 상기 천연항산화성 추출방법에 의하여 얻어지는 천연항산화성 추출물, 특히 식품, 화장품, 의약품 그리고 사료 등의 원료 및 첨가제로서의 유용성을 가지는 추출물을 제공하자 하는 것이다.

본 발명에 따를 경우 화학적으로 비교적 안정한 천연용매만을 사용하여 안전성과 작업성을 높이고 환경친화적인 공정이 제공되며, 단순화된 제조공정단계를 통 하여 항산화물질의 추출수율과 항산화활성을 최대한 증대시켜 경제성을 높이게 된다.

본 발명은 소나무류 수피 유래 항산화성 물질을 추출하기 위한 방법에 관한 것으로 수피 전처리 공정, 수피 분쇄공정, 주정용액추출공정, 추출물 농축 또는 건조 공정, 주정용액 및/또는 동식물성 기름에 의한 비극성물질의 추출공정, 항산화물질 건조공정을 가지게 된다.

본 발명에서 ‘소나무류’라 함은 소나무과에 속하는 식물로 정의되며, 구체적으로는 적송(Pinus densiflora Sieb & Zucc.), 금강소나무(Pinus densiflora Sieb. & Zucc. for. erecta Uyeki), 구주소나무(Pinus sylvestris L.), 솔잣나무(Pinus pinea, Cupressus Sempervirens), 호주소나무(Casuarina equisetifolia J.R. & G. Forst., Casuarina litorea L. Casuarinaceae) 또는 히말라야산 소나무(Abies pindrow)가 예시될 수 있다.

또한 ‘수피’라 함은 소나무과 식물의 잎 또는 뿌리를 제외하고, 트렁크 및 가지부위로부터 입수될 수 있는 껍질부위를 언급하는 것이며, 전처리된 수피는 용매추출도를 향상시키기 위하여 바람직하게는 5 내지 100메쉬로 분쇄될 수 있다.

또한, 본 발명의 전과정에서 언급되는 "주정용액" 또는 "발효주정용액"이라 함은 전분이 함유된 물료(物料) 또는 당분(糖分)이 함유된 물료를 발효시킨 에탄올 주성분의 유동성 액체로 정의된다.

수피 추출공정에 사용된 주정용액에 함유된 에탄올의 농도는 1.0~95% 바람직 하게는 30~95%를 사용하고, 비극성물질의 추출공정에 사용된 주정용액의 에탄올 농도는 10~95% 바람직하게는 40~95%를 적용하며, 비극성물질의 추출공정에 사용되는 천연 동식물성 기름으로는 콩기름(대두유), 옥수수기름(옥배유), 채종유, 미강유, 참기름, 들기름, 홍화유, 해바라기유, 목화씨기름, 땅콩기름, 올리브유, 팜유류, 야자유, 혼합식용유, 정제가공유지, 쇼트닝, 고추씨기름, 우지 또는 돈지를 예시할 수 있다.

이하 본 발명의 방법을 공정별로 상세하게 기술하고자 한다. 그러나 이들이 본 발명의 기술적 범위를 한정하는 것은 아니다.

1. 수피 전처리공정: 소나무류 수피는 외부에 붙어 있는 이물질과 최외각층의 검게 풍화된 수피부분을 제거하고 적색부분의 수피만을 분리하여 분쇄공정에 사용한다.

2. 수피 분쇄공정: 분리된 수피는 파쇄기와 분쇄기를 사용하여 입자 또는 분말상태로 만든 후 추출공정에 사용한다. 바람직하게는 5 내지 100메쉬로 분쇄된다.

3. 주정용액 추출공정: 분쇄된 수피분말에 천연용매로 발효주정용액을 사용하여 항산화물질을 일차 추출한다. 상기 주정용액에 함유된 에탄올의 함량은 1.0~95%를 사용하고, 바람직하게는 에탄올의 함량은 30~95%를 사용한다. 수피:주정용액의 비율은 1:3 내지 1: 50의 무게비로 혼합하여 사용하고, 바람직하게는 1:4 내지 1:20의 무게비로 혼합하여 항산화물질을 추출한다. 추출온도는 -20~90 °C, 바람직하게는 10~70 °C에서 추출하고 추출시간은 5분~3일, 바람직하게는 30분~24 시간 동안 정치상태 또는 간헐적인 혼합 또는 계속적인 혼합에 의하여 항산화물질을 추출한다.

4. 추출물 농축 또는 건조 공정: 일차 추출이 완료되면 수피로부터 항산화물질추출액을 분리하기 위하여 공지된 여과 또는 원심분리 등의 방법을 사용하여 추출액과 수피를 분리한다. 여과공정에서 여과보조제로 규조토, 백도토, 벤토나이트, 산성백토, 탈크, 퍼라이트, 활성탄 등을 사용할 수 있다. 수피 여과박에 주정용액을 여과박 대비 1~20배, 바람직하게는 3~15배로 혼합하여 수피 여과박에 잔존하고 있는 항산화물질을 추가로 1~2회 더 추출한다. 이상에서 여과된 추출물은 혼합하고 공지의 감압농축방법에 의하여 에탄올과 물을 제거하여 추출농축액의 고형분 함량이 1.0~30%, 바람직하게는 3.0~15%가 되도록 농축한다. 추출농축액은 그대로 또는 공지의 건조방법, 예를 들면 동결건조, 감압건조, 열풍건조 또는 분무건조에 의하여 건조하여 분말로 만든 후 이후 비극성물질의 분리공정에 사용한다.

5. 주정용액 및/또는 천연 동식물성 기름에 의한 비극성물질의 분리공정: 추출농축액 또는 건조된 추출물분말로부터 송진 등의 비극성물질을 분리하기 위하여 다음과 같이 두 가지 공정중 한 방법을 선택적으로 적용하여 항산화물질을 농축한다.

(1) 분리매체로 주정용액을 사용할 경우: 비극성물질을 분리하기 위한 주정용액은 에탄올의 함량이 10~95%이며, 바람직하게는 40~95%를 사용한다. 추출농축액 또는 추출물분말:주정용액의 비율은 무게비로 1:1~1:30, 바람직하게는 1:3~1:15의 비율로 혼합한 후 비극성물질을 분리하여 항산화물질을 농축한다. 추출온도는 -20~90 °C, 바람직하게는 0~70 °C에서 추출하고 추출시간은 5분~24시간, 바람직하게는 30분~10시간 동안 정치상태 또는 간헐적인 혼합 또는 계속적인 혼합에 의하여 비극성물질을 분리한다. 항산화물질과 비극성물질이 함유된 주정용액은 공지의 여과 또는 원심분리 방법에 의하여 분리할 수 있다.

(2) 분리매체로 천연 동식물성 기름을 사용할 경우: 천연 동식물성 기름, 즉 콩기름(대두유), 옥수수기름(옥배유), 채종유, 미강유, 참기름, 들기름, 홍화유, 해바라기유, 목화씨기름, 땅콩기름, 올리브유, 팜유류, 야자유, 혼합식용유, 정제가공유지, 쇼트닝, 고추씨기름, 우지 또는 돈지를 단독으로 또는 2종 이상의 혼합물을 사용할 수 있다. 추출농축액 또는 추출물분말:천연 기름의 비율은 무게비로 1:0.5~1:20, 바람직하게는 1:1~1:10의 비율로 혼합하여 비극성물질을 기름층으로 분리하여 항산화물질을 농축한다. 비극성물질의 분리온도는 0~120 °C, 바람직하게는 20~80 °C에서 추출하고 추출시간은 30분~24시간, 바람직하게는 1.0시간~10시간 동안 정치상태 또는 간헐적인 혼합 또는 계속적인 혼합에 의하여 비극성물질을 분리한다. 농축된 항산화물질추출물과 비극성물질이 함유된 천연기름은 공지의 여과방법 또는 원심분리법에 의하여 분리할 수 있다.

선택적으로, 추출물분말을 사용하여 비극성물질을 분리하고자 할 경우 5.0~95%의 주정용액을 추출물분말 대비 1.0~20배의 무게비율로 첨가한 후 천연기름을 사용하여 비극성물질을 추출할 수 있다. 이때 비극성물질의 분리온도는 -20~90 °C, 바람직하게는 10~80 °C에서 추출하고 추출시간은 30분~24시간, 바람직하게는 1.0시간~10시간 동안 정치상태 또는 간헐적인 혼합 또는 계속적인 혼합에 의하여 비극성물질을 분리한다.

6. 항산화물질 건조공정: 비극성물질이 제거된 항산화성 농축추출물은 공지의 농축공정, 건조공정 및 분쇄공정 등에 의하여 농축액상 또는 고체분말상태로 제조한다.

<실시예 1>

1) 추출 및 여과공정: 국내 강원도 삼척지방에서 자생하고 있는 30년생 적송(Pinus densiflora Sieb & Zucc.)에서 얻은 수피로부터 최외각층을 제거한 후 파쇄기와 분쇄기를 사용하여 수피분말(30메쉬)을 얻었다. 1.0Kg의 수피분말에 60% 에탄올이 함유된 천연 주정용액 8.0Kg 을 혼합한 후 50 °C로 가열한 진탕항온수조에서 3시간동안 추출한 후 여과하였다. 수피 여과박에 60% 에탄올과 40% 물로 구성된 주정용액 4.0Kg을 가한 후 50 °C로 가열한 진탕항온수조에서 1시간동안 추출한 후 여과하였다.

2) 농축 및 건조 공정: 1)공정에서 얻은 추출물 여과액을 합친 후 감압농축기를 사용하여 에탄올과 물을 제거하여 항산화물질 일차 추출농축액 1,230g을 얻었다. 추출농축액을 분무건조하여 95g의 항산화물질 분말을 얻었다.

3) 비극성물질 분리 및 항산화물질 건조공정: 2) 공정에서 얻은 항산화물질 분말 30g에 주정 100g을 혼합한 후 30 °C 진탕항온수조에서 3시간동안 비극성물질을 분리한 후 여과하였다. 항산화물질이 함유된 여과박은 50 °C에서 3시간동안 건조한 후 분쇄하여 최종적으로 적갈색의 항산화물질 분말 14.2g을 얻었다.

<실시예 2>

실시예 1의 비극성물질 분리 및 항산화물질 건조공정에서 주정 100g대신 주정 70g과 대두유 100g을 사용하여 30 °C 진탕항온수조에서 5시간동안 비극성물질을 추출하여 제거한 후 원심분리에 의하여 비극성물질이 함유한 대두유층와 주정층을 분리하였다. 비극성물질이 제거된 고체상의 항산화물질은 50 °C에서 3시간동안 건조한 후 분쇄하여 최종적으로 적갈색의 항산화물질 분말 13.2g을 얻었다.

<실시예 3>

실시예 1의 추출 및 여과공정에서 95% 에탄올이 함유된 주정을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 항산화물질을 제조하였다. 최종적으로 적갈색의 항산화물질 분말은 12.3g을 얻었다.

<실시예 4>

실시예 1의 추출 및 여과공정에서 30% 에탄올이 함유된 주정용액을 사용하는 것을 제외하고는 동일한 방법으로 항산화물질을 제조하였다. 최종적으로 적갈색의 항산화물질 분말은 13.5g을 얻었다.

<실시예 5>

실시예 3의 비극성물질 분리 및 항산화물질 건조공정에서 주정 100g대신 주 정 70g과 대두유 100g을 사용하여 30 °C 진탕항온수조에서 5시간동안 비극성물질을 추출하여 제거한 후 원심분리에 의하여 비극성물질이 함유한 대두유층과 주정용액층을 제거하였다. 비극성물질이 제거된 고체상의 항산화물질은 50 °C에서 3시간동안 건조한 후 분쇄하여 최종적으로 적갈색의 항산화물질 분말 12.1g을 얻었다.

<실시예 6>

실시예 4의 비극성물질 분리 및 항산화물질 건조공정에서 주정 100g대신 주정 80g과 대두유 120g을 사용하여 30 °C 진탕항온수조에서 5시간동안 비극성물질을 추출하여 제거한 후 원심분리에 의하여 비극성물질이 함유한 대두유층과 주정용액층을 제거하였다. 비극성물질이 제거된 고체상의 항산화물질은 50 °C에서 3시간동안 건조한 후 분쇄하여 최종적으로 적갈색의 항산화물질 분말 11.3g을 얻었다.

<실시예 7>

실시예 1의 비극성물질 분리 및 항산화물질 건조공정에서 5 °C 진탕항온수조에서 5시간동안 비극성물질을 추출 제거한 후 여과하였다. 농축된 항산화물질이 함유된 여과박은 50 °C에서 3시간동안 건조한 후 분쇄하여 최종적으로 적갈색의 항산화물질 분말 15.7g을 얻었다.

<실시예 8>

실시예 3의 비극성물질 분리 및 항산화물질 건조공정에서 5 °C 진탕항온수 조에서 5시간동안 비극성물질을 추출 제거한 후 여과하였다. 농축된 항산화물질이 함유된 여과박은 50 °C에서 3시간동안 건조한 후 분쇄하여 최종적으로 적갈색의 항산화물질 분말 13.5g을 얻었다

<비교예 1>

미국특허 제4,698,360호에 게시된 방법과 동일한 방법에 의하여 소나무 수피 추출물을 다음과 같이 제조하였다. 추출에 사용된 수피는 강원도 삼척지방에서 자생하는 적송에서 분리한 100g의 수피분말(30메쉬)을 사용하였다. 수피에 증류수 500ml을 혼합하고 100 °C에서 2시간 가열하여 항산화물질을 추출한 후 여과하였다. 여과액을 20 °C 로 식힌 후 소금을 포화상태로 될 때까지 첨가하여 생성된 침전물을 여과하여 제거하였다. 추출물 여과액에 초산에틸 100ml을 혼합하여 항산화물질을 수층으로부터 분리하였다. 초산에칠을 사용한 분리공정은 2회 더 반복한 후 초산에칠층을 모두 합하고 이에 황산나트륨을 5.0g 가하여 탈수하였다. 탈수된 초산에칠층을 감압농축법에 의하여 80%의 초산에칠을 제거하였다. 농축된 초산에칠층에 200ml의 클로로포름을 가하여 침전물을 얻고 침전물을 여과법에 의하여 분리하였다. 침전물은 최종적으로 클로로폼 50ml을 가하여 세척하였고 침전물을 40 °C에서 건조하였다. 최종적으로 항산화물질 분말 0.21g을 얻었다.

<비교예 2>

대한민국특허 제10-0212974호에 게시된 방법과 동일한 방법에 의하여 소나무 수피 추출물을 다음과 같이 제조하였다. 추출에 사용된 수피는 강원도 삼척지방에서 자생하는 적송에서 분리한 100g의 수피분말(30메쉬)을 사용하였다. 수피에 1.0 liter의 메탄올과 물 혼합액 (메탄올:물=3:1 v/v)을 가하여 3일간 상온에서 추출한 다음 여과하였다. 추출수율을 높이기 위하여 메탄올용액을 2회 더 가하여 동일한 방법으로 추출한 후 여과하였다. 여과한 메탄올 추출액을 합하여 감압농축기로 330ml로 농축하였다. 농축된 추출액에 330ml의 메탄올을 첨가한 후 660ml의 헵탄을 혼합하고 30 °C 혼합진탕수조에서 2시간동안 비극성물질을 제거하였다. 헵탄을 사용하여 동일한 방법으로 2회 더 실시하여 비극성물질을 제거하였다. 비극성물질을 더 제거하기 위하여 메탄올 추출물에 디에틸 에테르 300ml을 가하고 30 °C 혼합진탕수조에서 2시간동안 비극성물질을 제거하였다. 헵탄을 사용하여 동일한 방법으로 2회 더 실시하여 비극성물질을 추가적으로 제거하였다. 비극성물질이 제거된 메탄올층은 감압농축법에 의하여 메탄올을 제거하였고, 잔류된 수층은 분무건조기를 이용하여 건조하여 최종적으로 항산화물질 분말 2.48g을 얻었다.

<실험예>

1) 항산화활성측정에 사용된 시료: 상기 실시예 1~8과 비교예 1 및 2에서 얻은 분말상의 소나무수피 유래 항산화물질 시료를 메탄올에 녹여 각 농도별(예; 50, 100, 300, 500, 700 μg/ml)로 시료를 준비하였다.

2) 항산화활성 측정방법: 시료의 항산화활성은 DPPH(1,1-디페닐-2-피크릴히드라진) 라디칼 소거활성 및 수퍼옥사이드 라디칼 소거활성을 측정하여 조사하였 다. 이때 활성시험의 지표로서 대표적인 항산화제인 BHA 및 비타민 E의 수용성 화합물인 Trolox를 사용하였다.

A) DPPH 라디칼 소거활성 측정법

96-well 플래이트를 사용하여 각 well당 각 농도별 시료용액 10 μl를 가하고, 에탄올에 녹인 1.5 x 10-4 M DPPH 용액 90 μl를 첨가한 후 10분간 반응을 시킨 다음 마이크로플래이트 측정기로 517 nm에서 흡광도를 측정하였다. 농도에 따른 DPPH 라디칼 소거활성을 다음 식에 의거하여 계산하였다. DPPH 용액 대신 에탄올을 첨가한 시료의 흡광도를 blank로 하였으며, 시료 대신 메탄올을 넣은 것을 대조구로 하였다.

DPPH 라디칼 소거활성(%) = (10분후 측정한 시료의 흡광도 변화) x 100/대조구의 흡광도

B) 슈퍼옥사이드 (Superoxide) 라디칼 소거활성 측정법

Superoxide 라디칼 소거활성은 Riboflavin/EDTA/Nitroblue Tetrazolium (NBT) 방법을 이용하여 측정하였다. 96-well 플래이트를 사용하여 각 well당 50 mM Potassium Phosphate Buffer (pH 7.8)에 녹인 0.03 mM Riboflavin, 1 mM EDTA, 0.6 mM Methionine 및 0.03mM NBT 용액 90 μl와 각 시료용액 10 μl를 첨가한 후 광화학반응에 의하여 발생된 수퍼옥사이드를 소거하는 활성을 측정하였다. 수퍼옥사이드 발생 광화학반응은 알루미늄 포일로 만든 광조사 상자에 설치된 2개의 형광램프 를 이용하였으며 램프와 반응용기와의 거리는 1000 Lux가 되도록 조절하였으며 25 °C에서 8분간 반응시킨 다음 560 nm에서의 흡광도를 마이크로플래이트 reader를 이용하여 측정하였다. 광화학반응에 의하여 발생된 수퍼옥사이드 라디칼은 NBT와 반응하여 청색의 Formazan을 형성하여 광흡수도가 증가되는데 시료에 의하여 수퍼옥사이드 라디칼이 소거되면 Formazan의 형성이 감소되어 광흡수도가 줄어든다. 따라서 시료의 수퍼옥사이드 소거활성은 시료대신 메탄올을 첨가한 것을 대조구로 하여 다음 식에 의하여 산출하였다.

라디칼 소거활성(%) = (1-시료의 흡광도변화) x 100 / 대조구의 흡광도변화

상기 DPPH 라디칼 소거활성과 슈퍼옥사이드 라디칼 소거활성에서 얻은 각 시료의 흡광도 결과로부터 라디칼 형성을 50% 억제하는데 필요한 시료의 농도를 ED50 (μg/ml)값으로 나타내어 측정방법별로 각 시료의 항산화활성(표 1과 표 2)을 비교하였으며, 각 시료의 항산화활성을 총량개념으로 환산한 총량 항산화활성(추출수율 x 상대적 항산화활성)을 비교하였다(표 3).

시료의 ED50 의 값이 낮을수록 시료는 높은 항산화활성을 나타낸다. 표 1에서와 같이 본 발명에 의한 항산화물질의 추출수율은 4.6~6.4%를 나타내었고 미국특허 제4,698,360호 (0.21%)보다 최대 21배의 수율, 대한민국특허 제10-0212974호(2.5%)보다 약 2.6배의 월등히 높은 추출수율을 보였다. 또한 표 2에서와 같이 DPPH라디칼에 대한 항산화활성의 경우 본 발명에 의하여 제조된 항산화물질은 종래 방법들보다 우수한 결과를 보였고, Trolox에 비하여 약 1.1~1.7배의 항산화활성을 보였다. Superoxide에 대한 항산화활성의 경우 본 발명에 의하여 제조된 항산화물질은 미국특허 제4,698,360호에 의한 시료와 유사한 항산화활성을 보였으나 대한민국특허 제10-0212974호에 의한 시료보다는 약 1.7배 높은 항산화활성을 보였으며, 특히 BHA에 비하여 약 1.7~2.2배, Trolox에 비하여 약 27~35배 이상의 매우 강력한 Superoxide 소거 항산화활성을 보였다. 따라서 표 3에서와 같이 본 발명에 의하여 제조된 항산화물질은 종래 방법들보다 월등히 높은 추출수율과 항산화활성을 동시에 지니고 있어 추출수율과 항산화활성을 곱한 총량개념으로 환산할 경우 종래 대조 방법들에 비하여 DPPH 항산화활성 측정법에 의하면 최소 3.5배에서 최대 45배, Superoxide 항산화활성 측정법에 의하면 최소 2.6배에서 최대 30배의 높은 항산화활성 총량을 보임에 따라 본 발명에 의한 제조된 항산화물질은 활성 뿐만 아니라 그 제조공정의 경제성도 매우 높음을 알 수 있다.

항산화물질의 추출 수율 및 DPPH 소거활성 비교

시료	추출수율 (%)	DPPH소거활성 (ED50, μg/ml)	상대적 항산화활성도 (%), Trolox 대비
BHA	-	6.5	392
Trolox	-	25.5	100
실시예 1	5.8	21.0	121
실시예 2	5.4	17.5	146
실시예 3	5.0	23.5	109
실시예 4	5.5	16.8	152
실시예 5	5.0	24.2	105
실시예 6	4.6	15.3	167
실시예 7	6.4	22.5	113
실시예 8	5.5	20.3	126
비교예 1	0.21	29.0	88
비교예 2	2.5	42.5	60

항산화물질의 Superoxide소거 항산화활성 비교

시료	Superoxide 소거활성 (ED50, μg/ml)	상대적 항산화활성도 (%), BHA 대비	상대적 항산화활성도 (%), Trolox 대비
BHA	12.7	100	1,575 이상
Trolox	200 이상	6.4 미만	100
실시예 1	6.8	187	2,940이상
실시예 2	6.2	205	3,230 이상
실시예 3	7.3	174	2,740 이상
실시예 4	5.7	223	3,510 이상
실시예 5	7.2	176	2,780 이상
실시예 6	5.9	215	3,390 이상
실시예 7	7.5	169	2,640 이상
실시예 8	6.9	184	2,880 이상
비교예 1	6.4	198	3,390 이상
비교예 2	9.5	134	2,110 이상

항산화활성의 총량개념을 적용한 제조방법별 항산화활성 비교

시료 또는 시료 제조방법	DPPH법에 의한 항산화활성 총량	DPPH법에 의한 상대적 총량 활성 비교(배)	Superoxide법에 의한 항산화활성 총량	Superoxide법에 의한 상대적 총량 활성 비교(배)
실시예 1	707	38.3	977	26.1
실시예 2	789	42.7	1,024	26.6
실시예 3	547	29.6	849	21.1
실시예 4	840	45.5	996	29.6
실시예 5	523	28.3	794	21.0
실시예 6	772	41.8	872	23.9
실시예 7	730	39.5	933	26.2
실시예 8	695	37.7	1,095	24.4
비교예 1	18	1.0**	42	1.0**
비교예 2	149	8.1	332	8.0

* 항산화활성 총량 = 추출수율 X 상대적 항산화활성도 (표 1과 표 2 자료 적용)

** 항산화활성의 상대적 총량 활성 비교에서 비교예 1을 1.0으로 계산함

이상 설명한 바와 같이, 본 발명은 물리화학적으로 비교적 안정한 천연용매인 발효주정용액을 사용하여 소나무류 수피로부터 항산화물질을 추출하고, 추출물로부터 발효주정용액 및/또는 천연 동식물성 기름을 사용하여 송진 등의 비극성물질을 분리하는 것을 특징으로 한 제조공정을 통하여 높은 추출수율과 높은 항산화 활성을 지닌 항산화물질을 생산하고 작업성이 매우 용이한 친환경적인 제조공정을 제공할 수 있다.

본 발명에 의한 제조공정은 종래 대조방법과 대비하여 항산화물질의 추출수율을 최소 2.6에서 최대 21배 높일 수 있고, 추출물의 항산화활성에 있어서도 종래방법들에 의하여 제조된 항산화물질보다 더 우수한 항산화활성을 보였다. 이는 종래방법들이 여러 단계의 복잡한 공정으로 구성되어 있어 공정 중에 많은 항산화물질의 손실이 발생하고, 또한 효율성이 떨어진 비극성물질의 추출분리공정을 적용함에 따른 것으로 판단된다. 추출수율과 추출물의 항산화활성을 곱한 총량개념으로 항산화물질의 총량을 환산하면 본 발명에 의한 항산화물질의 제조방법은 기존의 방법들에 비하여 최소 2.6배에서 최대 45배나 높은 항산화성 추출물을 제공한다.

또한 종래방법에서는 각종 합성유기용매를 사용함에 발생하는 따라 여러 가지 문제점들; 즉 용매의 높은 휘발성에 따른 화제위험성, 작업자 안전성, 폐기물의 처리비용, 용매의 재처리비용, 추출물에 잔존유기용매로 인한 식품사용의 제한성 등, 이 발생하나 본 발명은 식품으로 사용되는 무해한 천연 발효주정용액과 천연 동식물성 기름을 사용하므로 이러한 문제점을 해결함으로써 제조공정이 비교적 단 순하고 안전하며, 환경오염물질의 발생이 적으며, 제조된 항산화추출물을 즉시 식품으로 사용할 수 있고, 월등한 활성도 및 가격경쟁력을 지닌 천연항산화물질과 그 제조공정을 제공할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 추출물은 이외에 화장품, 의약품 또는 사료용 첨가제나 원료로 사용될 수 있다.

추가적으로, 국내 산야 및 목재산업의 부산물로 얻을 수 있는 국내산 소나무류 수피를 활용하여 고활성의 천연항산화물질을 제조하여 저가로 공급할 수 있으므로 국내 임산 부산물의 재활용, 소나무류의 부가가치 증대, 국내 임산농가의 소득증대뿐만 아니라 생산된 항산화물질을 활용한 다양한 건강기능성식품, 가공식품, 의약품 등의 개발을 통하여 식품산업의 발전과 국민건강 및 삶의 질 향상에 기여하고, 생산된 제품을 해외로 수출함에 따라 국제수지의 개선에도 크게 기여할 수 있는 유용한 발명인 것이다

Claims

소나무류 수피로부터 천연용매인 주정용액을 사용하여 항산화물질을 추출하는 단계 ;

상기 일차 추출물을 대상으로 천연 주정용액 및/또는 천연 동식물성 기름을 사용하여 일차 추출물로부터 비극성물질을 분리하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 소나무류 수피 유래 천연항산화성 물질 추출방법.
제1항에 있어서 상기 주정용액은 에탄올 농도가 1.0~95% 인 발효주정인 것을 특징으로 하는, 소나무류 수피 유래 천연항산화성 물질 추출방법.
제1항에 있어서 상기 천연 동식물성 기름은 콩기름(대두유), 옥수수기름(옥배유), 채종유, 미강유, 참기름, 들기름, 홍화유, 해바라기유, 목화씨기름, 땅콩기름, 올리브유, 팜유류, 야자유, 혼합식용유, 정제가공유지, 쇼트닝, 고추씨기름, 우지 및 돈지로 구성된 그룹에서 선택된 기름을 단독 또는 2종이상 적용하는 것을 특징으로 하는, 소나무류 수피 유래 천연항산화성 물질 추출방법.
제1항에 있어서 상기 소나무류 수피는 소나무, 적송(Pinus densiflora Sieb & Zucc.), 금강소나무(Pinus densiflora Sieb. & Zucc. for. erecta Uyeki), 구주소나무(Pinus sylvestris L.), 솔잣나무(Pinus pinea, Cupressus Sempervirens), 호주소나무(Casuarina equisetifolia J.R. & G. Forst., Casuarina litorea L. Casuarinaceae), 및 히말라야산 소나무(Abies pindrow)로 구성된 그룹에서 선택된 식물의 수피를 단독 또는 2종 이상을 적용하는 것을 특징으로 하는, 소나무류 수피 유래 천연항산화성 물질 추출방법.
제3항에 있어서 상기 천연 동식물성 기름의 사용량은 추출농축액 또는 건조된 추출물의 0.5내지 20배의 무게비율로 사용하여 비극성물질을 분리하는 것을 특징으로 하는, 소나무류 수피 유래 천연항산화성 물질 추출방법.
제1항에 있어서 상기 천연 주정용액 및 천연 동식물성 기름을 동시에 사용하여 일차 추출물로부터 비극성물질을 분리함으로써 항산화물질을 분리하는 것을 특징으로 하는, 소나무류 수피 유래 천연항산화성 물질 추출방법.
제1항의 추출방법에 의하여 추출된, 소나무류 수피 유래 천연항산화성 추출물.
제7항의 소나무류 수피 유래 천연항산화성 추출물을 유효성분으로 하는 식품, 화장품, 의약품 또는 사료용 첨가제.
제7항의 소나무류 수피 유래 천연항산화성 추출물을 유효성분으로 하는 식품 화장품, 의약품 또는 사료용의 원료.