KR100740208B1 - 미역 포자엽에서 분리한 신규한 항산화 물질과 분리 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항산화 활성을 가지는 신규 화합물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 미역 포자엽으로부터 분리한 신규 화합물(2,6-다이브로모-4-아미노페놀DAP;C₆H₅ONBr₂)과 상기 화합물의 추출 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 미역 포자엽 유래 신규 화합물은 항산화 활성이 높고, 열안정성이 우수하여 천연 항산화제로 유용하다.

미역포자엽, 항산화제, DPPH 라디칼, 아질산염 소거능

Description

미역 포자엽에서 분리한 신규한 항산화 물질과 분리 정제 방법{A Novel Antioxidative Compound and its Purification Techniques from Sporophyll of Undaria pinnatifida}

도 1은 신규 화합물(2,6-다이브로모-4-아미노페놀)의 FT/IR 스펙트럼 결과를 나타낸 그래프이다.

도 2는 신규 화합물(2,6-다이브로모-4-아미노페놀)의 UV 스펙트럼 결과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 신규 화합물(2,6-다이브로모-4-아미노페놀)의 EI/MS 스펙트럼 결과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 신규 화합물(2,6-다이브로모-4-아미노페놀)의 ¹H-NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 신규 화합물(2,6-다이브로모-4-아미노페놀)의 ¹³C-NMR 스펙트럼 결과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 신규 화합물(2,6-다이브로모-4-아미노페놀)의 HMBC 스펙트럼 결과를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 미역(Undaria pinnatifida) 포자엽으로부터 분리된 신규 항산화물질 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 미역포자엽으로부터 용매 추출하고, 추출된 물질을 다시 용매 분획한 다음, 크로마토그래피로 정제하여 미역 포자엽 유래 신규 항산화 물질을 분리하는 것에 관한 것이다.

현대사회는 경제적 발전과 더불어 생활은 윤택하여졌으나 스트레스 발생이 증가되고 고령화 사회가 되어짐에 따라 성인병 및 정신병의 질환이 증가되고 있는 추세이다. 이에 많은 건강기능성식품에의 관심이 고조되고 있으며 식품 중의 생리기능적 성분에 대한 연구 또한 더욱 활발히 진행되고 있다. 인체는 생명유지에 필요한 에너지를 만들기 위해 끊임없이 산소를 필요로 한다. 그러나 산화적 스트레스 (oxidative stress), 즉 신체의 산화-환원반응이 깨어져 반응력이 큰 산소화합물이 많이 생성되어지며 이들 산소화합물들은 산화촉진반응을 일으켜 많은 질병의 원인이 된다. 또한, 활성산소와 유리 라디칼에 의한 세포의 이화학적인 특성변화를 포함한 조직의 손상(Asada, K., Nippon Nogeikagaku Kaishi, 62:1100, 1988) 을 초래할 수 있으며, 그 외에도 폐장해(Fridovich, I. and Freeman, B., Annu. Rev. Physiol., 48:693, 1986), 간장해(Halliwell B. and Gutteridgeet, J. M. C., Free radical in biology and medicine. Clarendon press, 10, 1989), 심혈관계질환, 염증성 질환, 백내장(Yagi, K., Chem. Phys., 45:337, 1987)의 여러 종류의 질병을 유발할 뿐 아니라, 노화(Floyd, R. A., The FASEB J., 4:2587, 1990)와 관련이 매우 깊은 것으로 보고 되고 있다.

미역(Undaria pinnatifida)은 일본, 한국이 특산이며 한국에서는 서해안의 백령도에서 동해안 끝에 이르기까지 분포한다. 광합성을 할 수 있는 해조류의 경우 free radical과 다른 과산화물을 생성할 수 있는 빛과 고농도 산소에 노출되어 있어서 엽록체막 성분인 불포화지방산의 경우 광역학적 손상을 받기 쉽게 되어있다. 광합성에 의해 생성된 산소와 엽록체막의 불포화지방산이 있음에도 불구하고 해조류에서 이런 산화적 손상을 일으키지 않는다는 것은 해조류 내에 항산화적 기작과 항산화 성분이 있다는 것을 시사한다(Matsukawa, R. et al., J. Appl. Phycol., 9:29, 1997). 특히 미역 포자엽의 경우, 포화 지방산은 미역(Undaria pinnatifida) 엽상체와 유사한 경향을 보이고 있으나, 불포화지방산의 조성에 있어서는 oleic acid(18:1)의 함량이 6배∼7배 이상 함유하고 있다고 보고하고 있으며, eicosapentaenoic acid(C20:5)의 함량이 미역 엽상체에 비해서 3배가량 많이 함유되어 있다고 보고하고 있다(Smith, K. L. et al., Phytochem., 23:2469, 1984). 이에 미역 포자엽의 활용도를 높이고 기능성 항산화소재로서 충분한 연구 가치가 있다고 할 수 있다. 현재까지 미역의 포자엽을 이용한 연구는 미역귀를 이용한 잼의 제조(Kim, S. M. et al., J. Korean Soc. Food Nutr., 28:984, 2004), 항혈액응고 특성에 대한 연구(Koo, J. G et al., J. Korean Fish. Soc., 34:515, 2001), 중금속 흡착 특성에 대한 연구(Koo, J. G., J. Korean Fish. Soc., 34:521, 2001)는 보고되어 지고 있으나, 항산화 효과에 대한 연구는 국외 및 국내에서도 매우 부족한 실정이다.

이에 본 발명자들은 천연 항산화제를 개발하고자 예의 노력한 결과, 미역 포자엽으로부터 우수한 항산화 활성을 가지는 신규 물질을 분리하고, 상기 분리된 물질이 높은 열안전성을 가지며, 예방적 항산화물의 역할인 페로스 킬레이팅 효과가 우수하다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

결국, 본 발명의 주된 목적은 미역 포자엽 유래 신규 항산화 물질을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 항산화 물질로부터 추출되는 방법을 제공한는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 미역 포자엽 유래 신규 항산화 물질을 제공한다.

본 발명은 또한, 다음의 단계를 포함하는 화학식 1로 표시되는 항산화 물질의 제조방법으로 (a) 분쇄된 미역포자엽에 용매를 첨가한 다음 추출하는 단계; (b) 상기 추출된 물질을 용매 분획하는 단계; 및 (c) 상기 용매분획물을 크로마토그래피로 정제하는 단계를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 (a)단계의 용매는 물, 메탄올, 에탄올인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 (b)단계의 용매는 헥산/에틸아세테이트인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 (c)단계는 분취용 박층크로마토그래피(PTLC)를 수행한 다음, 분취용 액체크로마토그래피(preparative LC)를 수행하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 화학식 1로 표시되는 신규물질을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 항산화 물질을 함유한 미역 포자엽의 추출과 정제하는 방법 및 항산화 활성 측정은 다음과 같다.

본 발명의 건조 분말 미역 포자엽을 이물질을 제거한 후에 분쇄하여 용매를 넣고, 상온에서 반복 진탕 추출하여 상기 화학식 1로 표시되는 물질을 추출한다. 상기 용매로는 열수, 메탄올 그리고 에탄올로부터 하나이상 선택하여 사용하는 것이 바람직하다. 추출된 물질의 잔사를 제거하기 위하여 원심분리한 후, 여과지를 사용하여 여과하였다. 이에 다시 활성탄을 이용하여 색소를 제거한 후 진공회전 농축기를 사용하여 유기용매 및 열수 추출액을 얻었다. 상기 과정을 거친 추출물은 직접적으로 다양한 응용분야에 사용할 수 있으며, 또한 별도의 추가공정을 요하지 않기 때문에 경제적으로 매우 유리한 장점을 가지고 있다. 다만, 보다 순도가 높은 형태가 요구되는 경우에는 다음과 같이 추가적인 분리, 정제 과정을 거치는 것이 바람직하다.

추출과정에서 얻어진 항산화 물질은 용매 분획 공정으로 처리된다. 먼저, 노르말 헥산을 넣어 흔든 다음 평형화 시켜 분액깔때기에 부어서 지질을 제거한 후, 물:에틸아세테이트의 혼합용매에 섞은 다음 분액깔때기에 부어서 층 분리를 시킨 후 에틸 아세테이트층만을 모아서 실험에 사용하는 것이 바람직하다. 1차 용매 분획 결과, 본 발명의 신규 물질은 주로 에틸아세테이트층에 존재하게 된다.

상기 공정에 의하여 얻어진 분획물을 정제하기 위하여 부탄올/아세트산/물의 혼합용매로 분취용 박층크로마토그래피 하여 분리하고, 활성이 높은 성분만을 모아서 분취용 액체크로마토그래피법을 사용하여 정제한다. 바람직하게는 부탄올/아세트산/물의 비율이 6:1:2(v/v/v)로 사용한다. 이러한 크로마토그래피법은 예시적인 것으로, 본 발명의 신규 물질의 정제에 필요한 범위 내에서 기타 다른 크로마토그 래피법도 사용할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명할 것이다

실시예 1 : 미역포자엽의 유기용매 및 열수 추출

건조 분말 미역 포자엽 250 g을 이물질을 제거한 후에 분쇄하여 유기용매 및 열수 700 mL을 넣고 상온에서 12시간 2회 반복 진탕 추출하여 상기 화학식 1을 함유하는 항산화 물질을 추출한다. 추출된 물질의 잔사를 제거하기 위하여 원심분리한 후, 여과지를 사용하여 여과하였다. 이에 다시 활성탄을 이용하여 색소를 제거한 후, 농축하기 위하여 진공회전 농축기(N-1000, 아일라 제품, 일본)를 사용하여 57 g의 유기용매 및 열수 추출액을 얻었다.

실시예 2 : 미역포자엽의 항산화 추출물의 분획 및 분리

추출과정에서 얻어진 물질은 용매 분획 공정으로 처리된다. 먼저, 노르말 헥산을 넣어 흔든 다음 평형화 시켜 분액깔때기에 부어서 지질을 제거한 후, 물:에틸아세테이트(1:1 v/v)의 혼합용매에 섞은 다음 분액깔때기에 부어서 층 분리를 시킨 후 에틸 아세테이트층만을 모아서 실험에 사용하였다. 에틸 아세테이트분획 10 g을 부탄올:아세트산:물 = 6:1:2(v/v/v)의 혼합용매로 분취용 박층크로마토그래피(실리 카겔, 멀크제품, 독일)를 하여 7% DPPH로 발색시켰다. 그리고 254와 366 nm의 UV lamp(UVGL-25, 업랜드제품, 미국)를 사용하여, 형광을 띠는 spot을 확인 하였다. 분취용 박층크로마토그래피 획분 중에서 활성이 가장 높은 성분을 메탄올에 녹여 분취용 고성능액체 크로마토그래피(Jai LC 918, 일본) 시료 용액으로 사용하였다. 이때 이동상은 메탄올, flow rate는 분당 3 mL로 용출시켰으며, 이때 사용한 압력은 7 kgf/cm²이었다. 용출된 획분 중에서 DPPH 라디칼 활성이 높은 획분을 다시 재순환 시켜 분리, 정제하였다.

실시예 3 : 구조분석

실시예 2로부터 얻어진 정제된 항산화물질의 정성실험으로서 Dragendorff's spray reagent를 이용한 발색법에서 질소 화합물이 존재함을 알 수 있었으며, 질산은을 이용한 할로겐 원소 확인법에서 연노랑색의 침전물 생성으로 인한 브롬 원자를 확인하였다. FT/IR(JES PX2300, 줄사제품, 일본)스펙트럼 결과(도1참조), 3500 ㎝^-1에서의 파장은 하이드록실기를 나타내며, 1575 ㎝^-1와 1432 ㎝^-1에서의 파장은 아로마틱 링의 존재를 추정할 수 있었으며, 3100 ㎝^-1에서의 파장으로 보아 아미노기가 있음을 추정할 수 있었다. UV 스펙트럼(울트라스펙 2000, 팔마샤바이오택제품,영국) 결과를 보면(도2참조), 메탄올에서 λ_max 값이 209 nm와 270 nm로 나타났다. UV 스펙트럼에서는 일반적으로 전기음성도가 큰 물질이 분자사슬에 치환되어 있을 수록 그렇치 않은 경우보다 단파장으로 극대 흡수가 이동됨으로 단파장에서 극대 흡수가 일어나는 것은 분자 자체에 비교적 전기 음성도가 큰 물질로 구성되어져 있는 화합물로 추정되어진다(박재한등, 한국식품과학회지, 3:256, 1991). EI/MS 측정 결과(도3참조) m/z 265(4.08%), 267(11.22%), 269(2.38%)의 아이소토프가 나타났으며, 할로겐 화합물인 브롬 이온이 떨어져 나간 peak가 m/z 111에서 확인되어, 이 화합물이 브롬 원자 2개를 함유한 페놀 화합물로서 분자식 C₆H₅ONBr₂(MW:265)로 결정하였다. ¹H-NMR 스펙트럼에서(도4참조) δ_H 1.907, 3.364, 4. 875 으로 모두 3개의 독립된 signal이 2:1:2의 비율로 관측되었으며, 적분값으로 볼 때 총 5개의 proton이 존재하는 것으로 확인되었다. 아로마틱 링의 프로톤 시그널이 δ_H 4.875, 하이드록실기에 기인된 δ_H 3.364 그리고 아미노기에 기인된 δ_H 1.907에서 관측되었다. 또한, ¹³C-NMR 스펙트럼 결과는(도5참조) δc 179.044, 131.149, 128.666, 128.113의 시그널이 나타났다. δc 128.113의 시그널은 2개로 나누어 져서 2개의 탄소에 브롬원자가 결합되어 있음을 알 수 있었으며, δc 128.666의 시그널 역시 2개로 나누어져서 아로마틱 링에 붙어있는 2개의 프로톤을 확인 할 수 있었다. HMBC 스펙트럼에서(도6참조) 하이드록실 프로톤(δ_H 3.364)이 δc 179.044, 128.113과 커플링하여 C1과 C6이 각각 179.044, 128.113로 동정하였다. 아미노기의 프로톤(δ_H 4.875)이 δc 131.149, 128.666과 커플링하여 C4와 C5이 각각 131.149, 128.666로 동정하였다. ¹H-NMR과 ¹³C-NMR 스펙트럼 분석 결과 화학식 1은 2개의 브롬 원자와 1개의 아미노 기가 붙어있는 페놀 물질로 확인되었다. 상기 분석결과로부터 상기물질의 구조가 화학식 1임을 확인하였다.

실시예 4 : 항산화 활성 측정

1-1. DPPH 라디칼에 대한 소거 효과 측정

실시예 3에서 얻어진 DAP에 대한 항산화 활성 측정은 시료 용액 0.2 mL에 2× 10^-4 M DPPH를 0.8 mL를 넣고 흔들어 준 후, 10분동안 실온에서 방치한 후, 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구로서 시료 용액 대신에 같은 양의 에탄올을 가하여 진탕하고 방치한 후 흡광도를 측정하였다. 자유 라디칼 억제 활성능은 100-[(시료 첨가구의 흡광도/대조구의 흡광도)]×100]으로 나타내었으며, 자유 라디칼 억제 활성능의 50% 소거농도(IC₅₀)를 계산하여 나타내었다. 모든 실험은 3회 반복하여 평균값으로 나타내었다.

1-2. 아질산염 소거 효과 측정

시료의 아질산염 분해 작용은 1 mM NaNO₂ 용액 1mL에 농도별 시료 1mL을 첨가한 후, 여기에 0.1 N HCl을 이용하여 pH를 1.2로 조정한 후 증류수를 첨가하여 반응용액의 부피를 10 mL로 보정하였다. 37℃에서 1시간 반응시켜 얻은 반응 용액 1 mL을 취하고 여기에 2% 초산용액 5 mL을 첨가한 다음 Griess 시약 0.4 mL 첨가한후, 실온에서 15분간 방치한 다음, 잔존하는 아질산염을 구하였다. 대조구는 Griess 시약대신 증류수를 0.4 mL 사용하였다. 아질산염 분해율은 시료를 첨가한 경우와 첨가하지 않은 경우의 백분율로 나타내었다.

1-3. Fe²⁺ 킬레이팅 효과 측정

시료의 Fe²⁺ 킬레이팅 효과 측정은 각 농도별 시료 10 mL에 2 mM FeCl₂ 1 mL과 5 mM 페로진 2 mL을 첨가한 혼합물을 흔들어 주었다. 실온에서 10분간 방치한 후, 562 nm에서 흡광도 값을 측정하였다. 이때 대조구는 시료대신 증류수를 10 mL 사용하여 상기와 같은 방법으로 실행하였다. Fe²⁺ 킬레이트능은 100-[(시료 첨가구의 흡광도/무첨가구의 흡광도)×100]으로 나타내었다.

미역 포자엽으로부터 분리한 물질의 DPPH, NOO^-, Fe²⁺에 대한 항산화 활성조사

Components	DPPH(mg/mL)a	NOO-(mg/mL)b	Fe2+(mg/mL)c
DAP(2,6-다이브로모-4-아미노페놀)	1.21	0.29	16.36
L-ascorbic acid	0.025	1.04	-

a: DPPH 라디칼의 50% 소거농도(IC₅₀)를 계산하여 나타내었다.

b: NOO^- 이온의 50% 소거농도(IC₅₀)를 계산하여 나타내었다.

c: Fe²⁺이온과의 결합능의 농도(IC₅₀)를 계산하여 나타내었다.

종래에 널리 사용된 α-tocopherol과 BHT의 경우, Fe²⁺에 대한 킬레이팅 효과를 볼 수 없다고 보고(Chou et al., 2003)하여 대조군은 설정하지 않았으며, 미역 포자엽에서 추출한 항산화물질은 지질과 단백질의 산화를 촉진시키는 Fe²⁺에 대해 뛰어난 킬레이팅 효과를 가지고 있어, 생체 내에서 발생되는 단백질과 지질의 산화적 손상에 대하여 사전에 방어할 능력을 가지고 있으므로 앞으로 중요한 천연 항산화제로 기대되어진다.

1-4. 열안정성 평가

시료 1 mL을 0℃～120℃의 각 온도별로 1시간 처리한 후, 실온에서 30분간 방치하여 DPPH법을 이용한 항산화능을 측정하였다.

미역 포자엽으로부터 추출한 물질의 열안전성 조사

온도(℃)	항산화효과	항산화효과
0	90.5±2.73	안정
10	90.3±3.73	안정
20	89.8±3.21	안정
30	89.3±1.32	안정
40	89.7±4.50	안정
50	89.1±2.48	안정
60	91.5±1.88	안정
70	90.9±3.89	안정
80	83.7±8.61	안정
100	91.3±2.93	안정
120	91.3±2.93	안정

상기 표의 결과로부터 본 발명의 항산화성 천연 물질은 넓은 온도 범위에서 항산화 효과를 일정하게 유지시키므로 열안정성이 매우 우수하다는 것을 알 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명에 따른 신규물질은 기존의 항산화제과 비교하여 소거활성이 우수하고, 넓은 범위의 온도에서 열에 대한 안정성이 뛰어나고, Fe²⁺에 대해 뛰어난 킬레이팅 효과를 가지고 있어 예방적 항산화물질로서 기존의 합성항산화제를 대체할 수 있다. 또한, 우리나라 연근해에 널리 서식하는 미이용자원인 미역 포자엽을 이용하여 추출 및 정제하여 기능성 소재로서의 충분한 가치를 지니며 또한 경제성을 제고시킬 수 있는 장점을 갖는다.

Claims (6)

1. 삭제
2. 다음의 단계를 포함하는 화학식 1로 표시되는 항산화 물질의 제조방법:

   (a) 분쇄된 미역포자엽에 용매를 첨가한 다음 추출하는 단계;

   (b) 상기 추출물을 용매 분획하는 단계; 및

   (c) 상기 용매분획물을 크로마토그래피로 정제하는 단계.

   [화학식 1]

   
3. 제2항에 있어서, 상기 (a)단계의 용매는 물, 메탄올, 에탄올인 것을 특징으로 하는 추출하는 방법.
4. 제2항에 있어서, 상기 (b)단계의 용매는 헥산/에틸아세테이트인 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제2항에 있어서, 상기 (c)단계는 분취용 박층크로마토그래피(PTLC)를 수행한 다음, 분취용 액체크로마토그래피(preparative LC)를 수행하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제2항의 방법에 의해 제조된, 화학식 1로 표시되는 항산화 물질을 유효성분으로 함유하는 항산화 조성물.

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