KR20060083778A - 캄페롤 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 캄페롤 배당체로부터 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 캄페롤(kaempferol)을 분리하는 것을 특징으로 하는 캄페롤 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 식물로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 캄페롤 배당체를 함유하는 식물 추출물을 수득하는 제 1 단계; 및 상기 식물 추출물을 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해하여 캄페롤을 분리하는 제 2 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 캄페롤을 제조하는 방법에 관한 것으로, 상기, 캄페롤 배당체는 카멜리아시드 A(camelliaside A) 또는 카멜리아시드 B(camelliaside B)를 포함하는 것을 특징으로 하며, 상기 식물 추출물은 녹차 씨 또는 녹차 잎으로부터 유래된 것임을 특징으로 한다. 본 발명의 상기 방법을 이용하면, 식물 특히, 녹차 씨와 녹차 잎으로부터 주요한 생리활성물질인 캄페롤을 대량으로 생산할 수 있다.
캄페롤, 배당체, 식물, 추출물, 산, 염기, 효소, 미생물, 카멜리아시드, 녹차 씨, 녹차 잎

Description

캄페롤 제조방법{Manufacturing method of Kaempferol}
도 1a 및 1b는 실시예 1의 녹차 씨 추출물을 실시예 3의 방법으로 효소를 이용하여 가수분해하기 전과 후의 변화를 고속액체 크로마토그래피로 측정한 결과로, 도 1a는 가수분해 전 녹차 추출물 내 카멜리아시드 A 및 카멜리아시드 B의 함량을 측정한 도이고, 도 1b는 가수분해 후 녹차 추출물 내 캄페롤의 함량을 측정한 도이다.
본 발명은 캄페롤 배당체로부터 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 캄페롤(kaempferol)을 분리하는 것을 특징으로 하는 캄페롤 제조방법에 관한 것이다.
캄페롤(kaempferol)은 하기 화학식 1로 표시되며, 플라보노이드(flavonoid) 중의 하나인 플라보놀(flavonol)의 대표적인 성분 중의 하나로 식물의 꽃 또는 잎에 널리 분포되어있다.
Figure 112005002838819-PAT00001
플라보놀은 100개 이상이 이미 알려져 있으며 캄페롤(kaempferol), 퀘르세틴(quercetin) 및 미리세틴(myricetin)의 3종류가 가장 많이 존재하는 것으로 알려져 있다.
특히, 캄페롤은 항산화, 항염 등의 생리활성이 뛰어난 물질로 다양한 효능이 연구되어 지고 있으며, 다양한 분야로의 적용이 이루어지고 있다. 그러나, 현재 사용되고 있는 캄페롤은 대부분 식물 추출물의 형태로, 함량으로 수 ppm에서 수십 ppm만을 함유하고 있어 캄페롤의 실질적인 효능이 발현된다고 보기 어렵다. 이러한 문제점은 캄페롤을 다량으로 함유한 식물을 찾기 어렵고, 또한 고함량의 캄페롤을 제조하기 위한 분리정제도 경제성을 감안할 때 큰 장점이 없어 캄페롤의 대량생산에 대한 연구는 거의 없는 실정이다.
녹차는 전세계의 가장 오래된 역사를 가지고 있는 음료로, 최근 녹차에 대한 관심이 높아지면서 차의 성분과 그 약리 효과에 대한 연구가 많이 이루어지고 있다. 녹차는 다른 식품에 비하여 트레아민(threamine)과 폴리페놀(polyphenol)류가 다량 함유되어 있다. 녹차의 기능성분은 다엽중의 폴리페놀(polyphenol)류에 속하는 플라벤-3-올(flavan-3-ol)을 기본으로 하는 카테친(catechin)으로 (+)-카테친, (-)-에피카테친(epicatechin), (-)-에피갈로카테친-3-갈레이트(epigallocatechin-3-gallate), (-)-갈로카테친(gallocatechin) 등이 주성분인 것으로 알려져 있다. 특히 녹차에 들어 있는 폴리페놀류는 혈중 콜레스테롤을 저하시키고, 항산화작용, 항암작용, 해독작용, 항균작용, 충치예방작용, 노화억제작용, 미백효과 및 향기성분 등이 보고되고 있다. 또한 녹차에 들어 있는 폴리페놀류는 통풍예방은 물론 과산화지질을 억제하고 노화를 지연시키며 중성지질의 생성을 억제하므로 비만을 방지하고 모세혈관의 저항력을 증진시킨다고 보고되고 있다.
그러나, 이러한 다양한 효능을 가지고 있는 녹차는 대부분 잎을 사용하고 있으며 유사한 효능 물질을 함유하고 있는 녹차 씨는 재배 목적 외에 특별히 사용되고 있지 못하다. 또한 모든 관심과 연구가 녹차 잎의 카테친류, 특히 EGCG(epigallocatechin gallate)에 집중되어 있다.
따라서, 본 발명에서는 녹차 중, 특히 특별한 용도로 사용되지 못하고 있는 녹차 씨와 EGCG에 초점이 맞추어져 있는 녹차 잎에서 카테친류 외에 캄페롤 모핵을 갖는 캄페롤 배당체, 특히 캄페롤에 3개의 당이 붙어 있는 카멜리아시드 A(camelliaside A), 카멜리아시드 B(camelliaside B) 등의 배당체들(glycosides)이 다량 함유되어 있음을 발견하고, 이로부터 생리활성이 뛰어난 아글리콘(aglycone) 타입의 캄페롤을 대량생산 할 수 있는 방법을 연구한 결과, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 캄페롤 배당체로부터 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 캄페롤을 분리 제조하는 방법을 제공하는 것으로, 식물, 특히 녹차 씨 또는 녹차 잎에 다량 함유되어 있는 캄페롤 배당체(glycosides), 특히 카멜리아시드 A(camelliaside A), 카멜리아시드 B(camelliaside B) 등의 배당체들(glycosides)로부터 캄페롤(kaempferol)을 분리하여 제조하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 의한 캄페롤(kaempferol) 제조방법은 캄페롤 배당체로부터 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 캄페롤을 분리하는 것을 특징으로 한다.
보다 상세하게는, 상기 캄페롤 제조방법은 식물로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 캄페롤 배당체를 함유하는 식물 추출물을 수득하는 제 1 단계; 및 상기 식물 추출물을 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해하여 캄페롤을 분리하는 제 2 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기에서 캄페롤 배당체는 카멜리아시드 A(camelliaside A) 또는 카멜리아시드 B(camelliaside B)를 포함하는 것임을 특징으로 한다.
상기 제 1 단계에서, 상기 식물 추출물은 녹차 씨 또는 녹차 잎으로부터 유래된 것임을 특징으로 한다.
또한, 상기 유기용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기용매, 또는 이들 유기 용매와 물과의 혼합용매, 바람직하게는 80 % 에탄올을 사용할 수 있다.
상기 산은 염산, 황산 및 질산으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 산, 또는 이들 산과 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매를 사용할 수 있다. 이 때, 사용할 수 있는 산의 농도는 0.1N ~ 2N 이고, 혼합용매의 알코올 함량은 10 ~ 50% 이고, 반응온도는 50 ~ 100 ℃이고, 반응시간은 0.5 ~ 8 시간이다.
상기 염기는 수산화나트륨 및 수산화칼륨으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기, 또는 이들 염기와 에탄올, 메탄올, 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매를 사용할 수 있다. 이 때, 사용할 수 있는 염기의 농도는 0.1N ~ 2N 이고, 혼합용매의 알코올 함량은 10 ~ 50% 이고, 반응온도는 50 ~ 100 ℃이고, 반응시간은 0.5 ~ 24 시간이다.
상기 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물은 당 결합을 분해하는 효소 또는 상기 당 결합을 분해하는 효소를 생산하는 미생물을 사용하며, 상기 효소는 캄페롤 배당체에서 당 부분을 제거하여 캄페롤을 분리하는 것임을 특징으로 하며, 상기 캄페롤 배당체는 바람직하게는 카멜리아시드 A 또는 카멜리아시드 B를 포함하는 것임을 특징으로 한다.
또한, 상기 효소는 더욱 바람직하게는 글루코시다제(glucosidase), 아라비노시다제(arabinosidase), 람노시다제(rhamnosidase), 자일로시다제(Xylosidase), 셀룰라제(cellulase), 헤스페리디나제(hesperidinase), 나린지나제(naringinase), 글루쿠로니다제(glucuronidase), 펙티나제(pectinase), 갈락토시다제(galactosidase) 및 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase)로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용하는 것을 특징으로 한다.
또한, 상기 효소를 생산하는 미생물은 아스퍼질러스(aspergillus)속, 바실러스(bacillus)속, 페니실리움(penicillium)속, 리조푸스(rhizopus)속, 리조무코르(rhizomucor)속, 탈라로마이세스(talaromyces)속, 비피도박테리움(bifidobacterium)속, 모르티에렐라(mortierella)속, 크립토코커스(cryptococcus)속 및 마이크로박테리움(microbacterium)속으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 하기와 같다.
상기 제 1 단계에서, 식물로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 캄페롤 배당체인 카멜리아시드 A 또는 카멜리아시드 B를 함유하는 식물 추출물을 수득하기 위하여, 식물에 약 1 내지 6 배, 바람직하게는 약 3 배의 물 또는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기용매, 또는 이들 유기용매와 물과의 혼합용매를 넣고, 상온에서 1 내지 5 회 교반하면서 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 식물에 약 1 내지 8 배, 바람직하게는 약 4 배의 물 또는 유기용매를 넣고, 1 내지 5회 환류 추출한 후, 10 내지 20 ℃에서 1 내지 3일간 침적시킨 후, 여과와 원심분리를 통하여 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 등을 이용하여 색소를 제거한 다음, 수층을 부탄올 등을 사용하여 1 내지 5회 추출한 후, 수득한 유기용매층을 감압농축하여 부탄올 등의 엑기스를 얻은 다음, 이를 소량의 메탄올 등에 녹인 후, 대량의 에틸아세테이트 등을 추가하여 생성된 침전물을 건조시켜, 본 발명의 상기 식물 추출물을 수득할 수 있다.
상기 제 2 단계에서, 상기 식물 추출물을 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해하여 캄페롤을 제조한다.
이 때, 산을 이용하는 경우, 식물 추출물에 0.1N ~ 2N 농도, 바람직하게는 1N 농도의 산, 또는 산 및 알코올의 혼합용매(바람직하게는 50% 에탄올 혼합용매)를 가한 후, 50 내지 100 ℃, 바람직하게는 80 ℃ 수욕조에서 1 내지 48 시간, 바람직하게는 8 시간 동안 가열 환류시켜 가수분해하여 반응액을 수득할 수 있다.
염기를 이용하는 경우, 식물 추출물을 녹인 후, 0.1N ~ 2N 농도, 바람직하게는 1N 농도의 염기, 또는 염기 및 알코올의 혼합용매(바람직하게는 50% 부탄올 혼합용매)를 가해 50 내지 100 ℃, 바람직하게는 100 ℃ 수욕조에서 1 내지 48 시간, 바람직하게는 8 시간 동안 가열 환류시켜 가수분해하여 반응액을 수득할 수 있다.
효소를 이용하는 경우, 식물 추출물을 5 내지 20 배, 바람직하게는 약 10 배의 산성완충용액에 용해시킨 다음, 효소를 첨가하여 약 37 ℃ 수욕상에서 약 40 내지 55 시간, 바람직하게는 약 48시간 동안 교반하면서, 박층크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 열수(80 ~ 100 ℃) 중에서 5 내지 15 분 동안 가열하여 가수분해 반응을 종료시키고 반응액을 수득할 수 있다.
상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하는 경우, 식물 추출물을 5 내지 10 배, 바람직하게는 약 10 배의 이온수에 용해시킨 후 약 121 ℃에서 30분간 멸균하여 약 30 ℃로 냉각한 후 미리 배양된 미생물을 액체량 대비 5~10 % 로 접종하여 30 ℃에서 2 내지 5일, 바람직하게는 5일 동안 배양시킨 후, 박층 크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 가수분해 반응을 종료시키고, 배양액을 5,000 내지 10,000 rpm으로 원심분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척 한 후 원심분리하여 침전물로써 반응액을 수득할 수 있다.
상기와 같이 산, 염기, 효소, 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해 한 후, 수득한 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 알코올을 가하여 1 내지 5회 교반시킨 후, 침전된 염들을 여과를 통하여 제거하고, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하고, 수득된 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올 = 8:1~4:1)로 분리하여 캄페롤을 수득할 수 있다.
이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하지만, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.
[실시예 1] 녹차 씨 추출물의 제조
녹차 씨 2 ㎏에 각각 헥산 6 ℓ를 넣고, 상온에서 3회 교반 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 녹차 씨 1 kg에 80 % 메탄올 4 ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 후, 15 ℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 1 ℓ로 5회 추출하여 색소를 제거하고, 수층을 1-부탄올 500 ㎖로 3회 추출하였다. 이로부터 얻은 총 1-부탄올층을 감압농축하여 1-부탄올 엑기스를 얻고, 이를 소량의 메탄올에 녹인 다음, 대량의 에틸아세테이트에 추가하여, 생성된 침전물을 건조 함으로써, 녹차 씨 추출물 250 g을 수득하였다.
[실시예 2] 녹차 잎 추출물의 제조
녹차 잎 2 ㎏에 헥산 6 ℓ를 넣고, 상온에서 3회 교반 추출하여 탈지시킨 다음, 탈지된 녹차 잎 1 kg 에 80 % 메탄올 4 ℓ를 넣고, 3회 환류 추출한 후, 15 ℃에서 1일간 침적시켰다. 그 후, 여과포 여과와 원심분리를 통해 잔사와 여액을 분리하고, 분리된 여액을 감압농축하여 얻은 엑기스를 물에 현탁한 후, 에테르 1 ℓ로 5회 추출하여 색소를 제거하고, 수층을 1-부탄올 500 ㎖로 3회 추출하였다. 이로부터 얻은 총 1-부탄올층을 감압농축하여 1-부탄올 엑기스를 얻고, 이를 소량의 메탄올에 녹인 다음, 대량의 에틸아세테이트에 추가하여, 생성된 침전물을 건조함으로써, 녹차 잎 추출물 150 g을 수득하였다.
[실시예 3] 산 가수분해 방법에 의한 캄페롤의 제조
상기 실시예 1에서 수득한 녹차 씨 추출물 10 g에 20배(v/w)의 1 N HCl-50 % 메탄올 용액(v/v)을 가하여, 80 ℃ 수욕조에서 8시간 동안 가열 환류시켜, 카멜리아시드 A와 카멜리아시드 B에 결합된 당들을 가수분해시킨 후, 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 에탄올(200 ㎖)을 가해 교반시킨 후(3회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거한 다음, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득한 후, 수득된 조생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올 = 8:1∼4:1)로 분리하여 캄페롤 0.95 g을 수득하였다.
[실시예 4] 염기 가수분해 방법에 의한 캄페롤의 제조
상기 실시예 1에서 수득한 녹차 씨 추출물 10 g을 건조피리딘(500 ㎖)에 녹이고, 여기에 소디움 메톡사이드(sodium methoxide)(powder, 10 g)를 가해 수욕조에서 8시간동안 가열 환류시켜, 카멜리아시드 A와 카멜리아시드 B에 결합된 당들을 가수분해시킨 후, 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 에탄올(200 ㎖)을 가해 교반시킨 후(3회), 침전된 염들을 여과를 통해 제거하였다. 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하였으며, 수득된 얻은 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름-메탄올=8:1∼4:1)로 분리하여 캄페롤 0.25 g을 수득하였다.
[실시예 5] 효소분해 방법에 의한 캄페롤의 제조
상기 실시예 1에서 수득한 녹차 씨 추출물 10 g을 100 ㎖의 0.1 M 초산완충용액(pH 4.5)에 용해시키고, 여기에 효소 2.5 g(헤스페리디나제 0.5 g, 나린지나제 0.5 g, 셀룰라제 0.5 g, β-글루쿠로니다제 0.2 g, β-갈락토시다제 0.5 g, 아밀로글루코시다제 0.3 g ; Sigma사 제조)을 첨가하여 37 ℃ 수욕상에서 48 시간동안 교반시키면서, 박층크로마토그래피에 의해 주기적으로 확인하여, 기질(camelliaside A와 camelliaside B)이 완전히 소실되면 열수(80 ∼ 100 ℃) 중에서 10분간 가열하여 반응을 종료시킨 후, 반응액을 감압농축하여 용매를 제거하고, 잔사에 에탄올(200㎖)을 가해 교반시킨 다음(3회), 침전물을 여과를 통해 제거한 다음, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하였다. 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올= 8:1∼4:1)로 분리하여 캄페롤 1.02 g을 얻었다.
[실시예 6] 미생물을 이용한 캄페롤의 제조
상기 실시예 2에서 수득한 녹차 잎 추출물 10 g을 100 ㎖의 이온수에 용해시키고, 121 ℃에서 30분간 멸균하여 30 ℃로 냉각한 후 미리 배양된 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) KCCM 11885를 액체량 대비 5~10 %로 접종하여 30 ℃에서 5일 동안 배양시킨 후, 박층 크로마토그래피로 기질의 소거율을 확인하여 기질이 완전히 소실되면 반응을 종료시키고, 배양액을 5,000 내지 10,000 rpm으로 원심분리하여 회수한 침전물을 증류수로 3회 세척 후 원심분리하여 침전물로써 반응액을 얻은 다음, 상기 침전물에 에탄올(200㎖)을 가해 교반시킨 후(3회), 침전물을 여과를 통해 제거한 다음, 여과된 여액을 감압농축하여 조 생성물을 수득하였고, 상기 수득한 조 생성물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(클로로포름:메탄올= 8:1∼4:1)로 분리하여 캄페롤 0.62 g을 얻었다.
[실험예 1] 카멜리아시드 A(Camelliaside A) 및 카멜리아시드 B(Camelliaside B)의 동정
상기 실시예 1에서 수득한 녹차 씨 추출물 10 g을 실리카겔 칼럼크로마토그래피(실리카겔 100 g 충진)로 정제하였다. 이 때, 전개용매로는 클로로포름과 메탄올을 사용하였고, 클로로포름과 메탄올의 비를 10:1에서 2:1까지 농도구배를 높여 분획을 수득하였으며, 이들 분획으로부터 카멜리아시드 A 0.82 g과 카멜리아시드 B 1.24 g을 수득하였다. 상기 수득한 두 생성물들을 동정한 결과(Varian Gemini 2000 300MHz, Varian사), 하기 표 1과 같은 특성을 나타내므로 카멜리아시드 A 및 카멜리아시드 B로 동정하였다
< 카멜리아시드 A의 물리화학적 성상 >
성상 : 연한 녹황색의 미세결정
양성(Positive) FAB-MS : 756.9[M+H]
< 카멜리아시드 B의 물리화학적 성상 >
성상 : 연한 녹황색의 미세결정
양성(Positive) FAB-MS : 726.9[M+H]
카멜리아시드 A 및 카멜리아시드 B의1H- NMR 및13C-NMR 데이터
카멜리아시드 A 카멜리아시드 B
13C 1H 13C 1H
캄페롤 1.09(3H, d, 6.3 Hz) 캄페롤 1.09(3H, d, 6.3Hz)
2 159.247 3.2∼3.8(16H, m) 2 158.697 3.2∼3.8(15H, m)
3 134.717 4.4(1H, d, H1-Rha) 3 134.827 4.4(1H, d, H1-Rha)
4 179.475 4.7(1H, d, H1-Gal) 4 179.425 4.7(1H, d, H1-Gal)
5 161.467 5.3(1H, d, 7.8 Hz, H1-Glc) 5 161.363 5.3(1H, d, 7.8Hz, H1-Glc)
6 101.122 6.17(1H, d, 1.8Hz, H6) 6 99.919 6.17(1H, d, 1.8Hz, H6)
7 163.019 6.37(1H, d, 1.8Hz, H8) 7 163.038 6.37(1H, d, 1.8Hz, H8)
8 95.063 6.9(2H, d, 9Hz, H3`,5`) 8 94.847 6.9(2H, d, 9Hz, H3`,5`)
9 166.589 8.0(2H, d, 8.7Hz, H2`,6`) 9 165.906 8.0(2H, d, 8.7Hz, H2`,6)
10 105.565 10 105.725
1` 122.936 1` 122.924
2`,6` 132.365 2`,6` 132.346
3`,5` 116.239 3`,5` 116.167
4` 158.595 4` 158.473
Glc Glc
1 101.122 1 100.830
2 82.048 2 81.927
3 78.281 3 78.205
4 72.073 4 71.424
5 77.818 5 76.839
6 68.226 6 68.112
Rha Rha
1 102.211 1 102.139
2 72.293 2 72.274
3 73.856 3 73.853
4 71.402 4 72.062
5 69.713 5 69.698
6 17.853 6 17.845
Gal Xyl
1 104.476 1 105.133
2 75.378 2 74.676
3 76.945 3 77.051
4 71.274 4 70.996
5 77.867 5 66.541
6 62.591
* Glc: 글루코오스, Rha: 람노오스, Gal: 갈락토오스, Xyl: 자일로오스
[실험예 2] 캄페롤의 동정
상기 실시예 3 내지 6에서 제조된 생성물은 하기와 같은 특성을 나타내므로 캄페롤로 동정(Varian Gemini 2000 300MHz, Varian사)하였다.
< 캄페롤의 물리화학적 성상 >
성상 : 연한 녹황색의 미세 결정
양성(Positive) FAB-MS : 287[M+H]+
1H-NMR : 6.1(1H, d, 1.8Hz), 6.3(1H, d, 1.8Hz), 6.8(2H, dd, 9Hz), 8.0(2H, dd, 9Hz)
13C-NMR : 94.467, 99.248, 104.518, 116.265, 123.710, 130.649, 137.069, 147.970, 158.200, 160.480, 162.446, 165.519, 177.285
[실험예 3] 가수분해(효소분해) 후 캄페롤의 함량 변화
녹차 씨 추출물을 상기 실시예 1의 방법으로 제조한 다음, 상기 실시예 3의 방법으로 효소분해 반응을 진행시킨 후, 효소분해 반응 전과 효소분해 반응 후의 변화를 고속액체 크로마토그래피를 이용하여 측정하였다. 이 때, 효소반응 전의 녹차 씨 추출물 내에 함유되어 있는 카멜리아시드 A 및 카멜리아시드 B의 함량을 측정한 결과를 도 1a에 나타내었고, 효소반응 후의 캄페롤 함량을 측정한 결과를 도 1b에 나타내었다.
그 결과, 도 1a 및 도 1b에 나타낸 바처럼, 효소반응 후 카멜리아시드 A 및 카멜리아시드 B가 거의 모두 캄페롤로 전환되었음을 알 수 있었다.
이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명의 캄페롤 배당체로부터 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 캄페롤을 분리하는 것을 특징으로 하는 캄페롤(kaempferol) 제조방법을 이용하면, 식물, 특히 녹차 씨 또는 녹차 잎으로부터 캄페롤 배당체, 특히 카멜리아시드 A 또는 카멜리아시드 B를 포함하는 식물 추출물을 수득한 후, 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용한 가수분해방법을 통하여 주요한 생리활성물질의 하나인 캄페롤을 대량으로 생산할 수 있다.

Claims (11)

  1. 캄페롤 배당체로부터 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 캄페롤을 분리하는 것을 특징으로 하는 캄페롤 제조방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 캄페롤 제조방법은
    식물로부터 물 또는 유기용매를 이용하여 캄페롤 배당체를 함유하는 식물 추출물을 수득하는 제 1 단계; 및
    상기 식물 추출물을 산, 염기, 효소 또는 상기 효소를 생산하는 미생물을 이용하여 가수분해하여 캄페롤을 분리하는 제 2 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 캄페롤 제조방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 캄페롤 배당체는 카멜리아시드 A(camelliaside A) 또는 카멜리아시드 B(camelliaside B)를 포함하는 것을 특징으로 하는 캄페롤 제조방법.
  4. 제 2항에 있어서, 상기 제 1 단계의 식물 추출물은 녹차 씨 또는 녹차 잎으 로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 캄페롤 제조방법.
  5. 제 2항에 있어서, 상기 유기 용매는 에탄올, 메탄올, 부탄올, 에테르, 에틸아세테이트 및 클로로포름으로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 유기용매, 또는 이들 유기용매와 물과의 혼합용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 캄페롤 제조방법.
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 산은 염산, 황산 및 질산으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 산, 또는 이들 산과 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 캄페롤 제조방법.
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 염기는 수산화나트륨 및 수산화칼륨으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 염기 또는 이들 염기와 에탄올, 메탄올 및 부탄올로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상의 알코올과의 혼합용매를 사용하는 것을 특징으로 하는 캄페롤 제조방법.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 효소는 캄페롤 배당체에서 당 부분을 제거하여 캄페롤을 분리하는 것임을 특징으로 하는 캄페롤 제조방법.
  9. 제 8항에 있어서, 상기 캄페롤 배당체는 카멜리아시드 A 또는 카멜리아시드 B를 포함하는 것임을 특징으로 하는 캄페롤 제조방법.
  10. 제 8항에 있어서, 상기 효소는 글루코시다제(glucosidase), 아라비노시다제(arabinosidase), 람노시다제(rhamnosidase), 자일로시다제(Xylosidase), 셀룰라제(cellulase), 헤스페리디나제(hesperidinase), 나린지나제(naringinase), 글루쿠로니다제(glucuronidase), 펙티나제(pectinase), 갈락토시다제(galactosidase) 및 아밀로글루코시다제(amyloglucosidase)로 구성되는군으로부터 선택된 하나 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 캄페롤 제조방법.
  11. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 효소를 생산하는 미생물은 아스퍼질러스(aspergillus)속, 바실러스(bacillus)속, 페니실리움(penicillium)속, 리조푸스(rhizopus)속, 리조무코르(rhizomucor)속, 탈라로마이세스(talaromyces)속, 비피도 박테리움(bifidobacterium)속, 모르티에렐라(mortierella)속, 크립토코커스(cryptococcus)속 및 마이크로박테리움(microbacterium)속으로 구성되는 군으로부터 선택된 하나 이상을 사용하는 것을 특징으로 하는 캄페롤 제조방법.
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