CN114088828A - 一种胡芦巴叶提取物检测方法 - Google Patents

一种胡芦巴叶提取物检测方法 Download PDF

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王洪伦
胡娜
林鹏程
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Abstract

本发明提供一种胡芦巴叶提取物的检测方法，将胡芦巴叶通过超声醇提、溶剂萃取法得到胡芦巴叶提取物。本发明将高效液相色谱与DAD检测器及四极杆飞行时间串联质谱联用，对胡芦巴中的黄酮提取物进行了表征。本发明能够实现8种成分的有效分离，建立了标准可靠的检测方法，为胡芦巴叶提取物的开发和进一步研究提供了参考。

Description

一种胡芦巴叶提取物检测方法
技术领域
本发明涉及中药检测领域，具体涉及一种胡芦巴叶提取物检测方法。
背景技术
胡芦巴(Trigonella foenum-graecum L.)为豆科胡芦巴属一年生草本植物。胡芦巴属药食同源之品，其干燥成熟的种子作为常用中药收入《中华人民共和国药典》。目前已从胡芦巴中分离和研究了多种有效成分，主要包括生物碱、皂苷和黄酮类化合物，这些成分已被证实其潜在的药用价值。除了其已知的药用价值，如胃兴奋剂、抗糖尿病和半乳糖(乳糖诱导)效应外，有研究还表明其具有降低胆固醇血症、抗脂血症、抗氧化剂、护肝、抗炎、抗菌、抗真菌、抗溃疡、抗结石、抗癌药和其他杂酚的药物作用。这些研究大多使用了胡芦巴种子粉末或不同形式的提取物，而对其叶子提取物研究的很少。
李建峰等(食品研究与开发,2020,v.41；No.394(21):162-168)以葫芦巴叶为研究对象，采用同时蒸馏萃取法，配合气相色谱-质谱技术(gas chromatography-massspectrometer，GC-MS)系统分析葫芦巴叶中挥发性成分并研究其抗氧化活性，但并未对胡芦巴叶中的其他有效成分作进一步研究，因此对胡芦巴叶中含有的其他组分进行分析及研究很有必要，有利于胡芦巴叶产品的进一步开发与利用。
发明内容
为了弥补上述现有技术方案的不足，本发明提供一种胡芦巴叶提取物中黄酮类化合物的分离检测方法。
本发明的技术方案为：
将胡芦巴叶阴干、粉碎，经乙醇超声提取，减压浓缩，得到胡芦巴叶醇提物浸膏。将醇提物浸膏加水混悬，依次用石油醚和乙酸乙酯各萃取，将水萃取组分经减压浓缩、冷冻干燥，得胡芦巴叶提取物。
在本发明的具体实施方式中胡芦巴叶提取物通过以下方式得到：将胡芦巴叶阴干、粉碎，经95％乙醇超声提取，提取条件为：料液比1:10(g/mL)，提取5次，每次1h，提取温度60℃，超声频率40kHz。提取后合并上清液，减压浓缩，得到胡芦巴叶醇提物浸膏。将醇提物浸膏加水混悬，依次用2倍体积石油醚和乙酸乙酯各萃取5次，将水萃取组分经减压浓缩、冷冻干燥，得胡芦巴叶提取物。
进一步地，将上述提取物与甲醇混合，后经离心，取其上清液，得到供试品溶液。
在本发明的技术方案中，采用高效液相色谱法对胡芦巴叶提取物中的相关物质进行分离检测，其中检测器可以为紫外检测器、质谱检测器、核磁检测器、荧光检测器等常规用于表征检测物质结构的检测器。
在本发明的具体实施方案中，高效液相色谱的色谱条件为液相条件：流动相A：甲酸水溶液，流动相B：甲酸乙腈；色谱柱：C18；梯度洗脱程序如下：
Figure BDA0003332084980000021
其中，流动相A甲酸水溶液中甲酸的浓度为0.05％～0.5％，优选0.1％，流动相B甲酸乙腈溶液中甲酸的浓度为0.05％～0.5％，优选0.1％。
上述的梯度洗脱程序及流动相配比，能够更好地分离杂质，有利于胡芦巴叶提取物中相关物质的检出，是检测结果的准确度及精密度更高。
进一步地，在本发明的技术方案中高效液相色谱的流速为：0.1～0.5mL·min-1，进样量为3μL，柱温为：40～60℃。
其中，流速优选0.3mL.min-1,柱温优选50℃。
上述优选色谱条件有利于进一步提高对胡芦巴叶提取物中相关物质的检测灵敏度。
在本发明的具体实施方案中，采用DAD检测器、质谱检测器与高效液相色谱联用，从而达到分离检测的目的。
在本发明的技术方案中，DAD检测器的检测波长为254nm。
其中，采用质谱的检测条件为：UPLC-Triple-TOF 5600+飞行时间液质联用仪：负离子扫描模式；扫描范围：m/z 100-1500；离子源温度(TEM)：550℃；离子源电压(IS)：-4500V(负；一级扫描：去簇电压DP)：100V；聚焦电压(CE)：10V；二级扫描：使用TOF MS～Product Ion～IDA模式采集质谱数据，CID能量为-20、-40和-60V，进样前，用CDS泵做质量轴校正，使质量轴误差小于2ppm。
本发明的检测方法是对如下化合物的检测：槲皮素3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D半乳糖7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素3-O-β-D-(6”-乙酰基)葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚3-O-β-D-(6”-乙酰基)葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖苷、槲皮素3-O-β-D-(6”'-乙酰基)葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖苷、山奈酚3-O-β-D-(6”'-乙酰基)葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖苷。
本发明还对胡芦巴叶提取物的生物活性作了进一步研究，通过用于H2O2诱导L02建立氧化损伤细胞模型的建立，考察胡芦巴叶提取物对L02细胞的抗氧化作用，试验研究表明胡芦巴叶提取物在制备对肝细胞损伤的保护作用产品中具有一定的应用价值，即表明胡芦巴叶提取物具有一定的抗氧化活性，而有研究表明黄酮类成分也具有一定药效活性，因此本发明对这些化合物的检测，有利于对胡芦巴叶有效成分的检测和质量监控。
本发明的有益效果在于：
从胡芦巴叶提取物中首次分离鉴别出了:槲皮素3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D半乳糖7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素3-O-β-D-(6”-乙酰基)葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚3-O-β-D-(6”-乙酰基)葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖苷、槲皮素3-O-β-D-(6”'-乙酰基)葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖苷、山奈酚3-O-β-D-(6”'-乙酰基)葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖苷8类黄酮化合物，对胡芦巴叶提取物所含成分更加明确，有利于对胡芦巴叶有效成分的检测和质量监控，也有利于后续胡芦巴叶提取物在药品、保健品等方面的研究。
1、本发明的检测方法中8种化合物各峰之间分离度(R)均大于1.5表明该检测方法，分离度高，灵敏度好。
附图说明
图1为FLFs的HPLC图；
图2为FLFs的UPLC-Triple-TOF/MS的总离子流图；
图3为FLFs对L02细胞活力的影响图；
图4为不同浓度H2O2对L02细胞活力的影响图；
图5为FLFs对H2O2损伤L02细胞活力的影响图；
图6中A、B、C、D、E分别为FLFs对H2O2损伤L02细胞LDH、MDA、SOD、GSH和CAT的影响图。
具体实施方式
下面结合具体的实施方式来对本发明的技术方案做说明。
实验材料：
胡芦巴采自青海省西宁市湟中县，取新鲜胡芦巴叶片阴干后粉碎，过40目筛，待用。乙醇、乙腈、甲酸(厂商：国药集团化学试剂有限公司)。
实验仪器：
AcquityTM ultra型高效液相色谱仪(Waters，美国)，Triple TOF 5600+型飞行时间质谱，配有电喷雾离子源(AB SCIEX，美国)；Eppendorf minispan离心机(Eppendorf，德国)。
实施例1
胡芦巴叶提取物(Fenugreek Leaf flavonoids,FLFs)的制备：胡芦巴叶阴干、粉碎，经95％乙醇超声提取，提取条件为：料液比1:10(g/mL)，提取5次，每次1h，提取温度60℃，超声频率40kHz。提取后合并上清液，减压浓缩，得到胡芦巴叶醇提物浸膏。将醇提物浸膏加水混悬，依次用2倍体积石油醚和乙酸乙酯各萃取5次，将水萃取组分经减压浓缩、冷冻干燥，得FLFs，提取率为：7.8％。
供试品溶液的配制：取适量胡芦巴黄酮提取物溶于甲醇，离心取上清液。
检测方法：将配制好的溶液注入高效液相色谱，液相条件：流动相：A：0.1％甲酸水溶液，B：0.1％甲酸乙腈，流速：0.3mL·min-1，检测波长：254nm，色谱柱：BEH-C18 column1.7μm,2.1×150mm；Waters Corp.)；进样量：3μL柱温箱：50℃，梯度洗脱程序如表1。
表1液相梯度洗脱程序
Figure BDA0003332084980000051
质谱条件：UPLC-Triple-TOF 5600+飞行时间液质联用仪：负离子扫描模式；扫描范围：m/z 100-1500；离子源温度(TEM)：550℃；离子源电压(IS)：-4500V(负；一级扫描：去簇电压DP)：100V；聚焦电压(CE)：10V；二级扫描：使用TOF MS～Product Ion～IDA模式采集质谱数据，CID能量为-20、-40和-60V，进样前，用CDS泵做质量轴校正，使质量轴误差小于2ppm。。
实施例2
胡芦巴提取物成分分析：
利用HPLC-Q-TOF-MS/MS对FLFs中的特征成分进行了分析，其液相色谱见图1，总离子流图见图2。所得分离组分的色谱和质谱数据经计算机数据处理系统自动检索和与质谱库对照，结合分子离子峰和二级质谱碎片离子峰，经查阅文献对照和人工检索解析，鉴定出FLFs主要含有8种黄酮类化合物。黄酮苷类化合物的糖基多结合在3,5,7-位，依据正、负离子的二级质谱碎片峰信息，推定其结构关系，结合黄酮类裂解规律并与对照品比较，最终推定化合物结构。
经Q-TOF-MS/MS检测，FLFs中的化合物1、3、5和7其准分子离子[M-1]-分别为m/z787.1963、829.2055、625.1414、667.1532，其二级质谱均产生了m/z 301的离子，表明其苷元均为槲皮素(quercetin)。化合物1的二级质谱中产生了m/z 625.1488[M－H－162]-和462.0833[M－H－324]-的离子，表明分子中存在3个六碳糖结构，并推测其通过1个单糖链和1个二糖链结构连接于母核，根据高分辨质谱结果拟合，其分子式为C33H40O22，再结合Scifinder和Reaxy数据库检索结果，推测化合物1为槲皮素3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖7-O-β-D-葡萄糖苷(quercetin 3-O-β-D-glucosyl-(1→2)-β-D-galactoside 7-O-β-D-glucoside)。化合物3的二级质谱中产生了m/z 667.1587[M－H－162]-和462.0823[M－H－324－43]-的离子，较化合物1多1个乙酰基，推测该化合物为槲皮素3-O-β-D-(6”-乙酰基)葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖7-O-β-D-葡萄糖苷(quercetin 3-O-β-D-(6”-acetyl)glucosyl-(1→2)-β-D-galactoside 7-O-β-D-glucoside)。化合物5的二级质谱中产生了m/z 301.03563[M－H－324]-离子，表明分子中存在2个六碳糖结构，根据数据库检索结果，推测该化合物为槲皮素3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷(quercetin 3-O-β-D-glucosyl-(1→2)-β-D-glucoside)。化合物7的二级质谱中产生了m/z 625.1480[M－H－43]-和301.0354[M－H－324－43]-离子，较化合物5多1个乙酰基，推测该化合物为槲皮素3-O-β-D-(6”'-乙酰基)葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖苷(quercetin 3-O-β-D-(6”'-acetyl)glucosyl-(1→2)-β-D-galactoside)。
经Q-TOF-MS/MS检测，FLFs中的化合物2、4、6和8其准分子离子[M－1]-分别为m/z771.2004、813.2110、609.1464、651.1568，4个化合物的二级质谱均产生了m/z 285的离子，表明其苷元均为山柰酚(kaempferol)。化合物2的二级质谱中产生了m/z 609.1527[M－H－162]-和446.0876[M－H－324]-的离子，表明分子中存在3个六碳糖结构，并推测其通过1个单糖链和1个二糖链结构连接于母核，根据高分辨质谱结果拟合，其分子式为C33H40O21，再结合数据库检索结果，推测化合物2为山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖7-O-β-D-葡萄糖苷(kaempferol 3-O-β-D-glucosyl-(1→2)-β-D-galactoside 7-O-β-D-glucoside)。化合物4的二级质谱中产生了m/z 651.1665[M－H－162]-和446.0897[M－H－324－43]-的离子，较化合物2多1个乙酰基，推测该化合物为山奈酚3-O-β-D-(6”-乙酰基)葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖7-O-β-D-葡萄糖苷(kaempferol 3-O-β-D-(6”-acetyl)glucosyl-(1→2)-β-D-galactoside 7-O-β-D-glucoside)。化合物6的二级质谱中产生了m/z 285.0407[M－H－324]-离子，表明分子中存在2个六碳糖结构，同时产生的m/z255.0293[A－H－CO]-和227.0341[A－H－2CO]-离子，符合山柰酚的裂解规律，该化合物为山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖苷(kaempferol 3-O-β-D-glucosyl(1→2)-β-D-galactoside)。化合物8的二级质谱中产生了m/z 285.0402[M－H－324－43]-离子，较化合物6多1个乙酰基，推测该化合物为山奈酚3-O-β-D-(6”'-乙酰基)葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖苷(kaempferol 3-O-β-D-(6”'-acetyl)glucosyl-(1→2)-β-D-galactoside)。各化合物裂解的准分子离子峰、碎片峰质核比结果见表2。
表2 FLFs的LC-MS数据信息与指认
Figure BDA0003332084980000061
Figure BDA0003332084980000071
实施例3
胡芦巴叶提取物生物活性测定：
(1)不同浓度FLFs对L02细胞活力的影响
胡芦巴叶提取物(FLFs)以不同浓度作用L02细胞12h后，FLFs在3.125～25μg·mL-1时能增强L02细胞的活力，在浓度大于50μg·mL-1时抑制L02细胞的增殖活性，并且随着FLFs浓度的增加抑制作用增强(与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；图3)，基于上述结果，本发明采用3.125～25μg·mL-1的浓度梯度进行后续试验。
(2)L02细胞损伤模型的建立
为筛选出合适的H2O2建模浓度，用不同浓度的H2O2刺激L02细胞12h。随着H2O2浓度的增加，L02细胞的存活率也明显下降(与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；图4)。以半数致死量(IC50)为原则，本研究选择H2O2的造模浓度为650μmol·L-1。
(3)FLFs对H2O2损伤L02细胞活力的影响
由MTT结果可见，H2O2处理组细胞存活率与空白组相比差异显著降低(P<0.01)；与H2O2组相比，3.125-25μg·mL-1浓度下FLFs能显著提高H2O2损伤后L02细胞的存活率(P<0.01)(与空白组比较，**P<0.01；与H2O2组相比较，##P<0.0；图5)。
(4)FLFs对H2O2损伤L02细胞LDH、SOD、GSH、MDA和CAT的影响
如图6A和图6B(与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与H2O2组相比较，#P<0.05，##P<0.01)所示，与空白组相比，H2O2组的LDH和MDA水平显著升高(P<0.01)，说明肝细胞被损伤。经FLFs处理后，低浓度的FLFs就能显著降低LDH和MDA水平(P<0.01)，且随FLFs浓度的增大，效果越明显。如图6C-6E(与空白组比较，*P<0.05，**P<0.01；与H2O2组相比较，#P<0.05，##P<0.01)所示，与空白组相比，H2O2组的SOD、GSH和CAT水平显著降低，FLFs浓度大于6.25μg·mL-1时，SOD、GSH和CAT活性水平均有所升高。上述结果表明，FLFs能够改善H2O2对L02细胞的氧化损伤，即表明FLFs具有一定的抗氧化活性。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种胡芦巴叶提取物检测方法，其特征在于，包括以下内容：高效液相色谱的色谱条件为液相条件：流动相A：甲酸水溶液，流动相B：甲酸乙腈；色谱柱：C18；梯度洗脱程序如下：
Figure FDA0003332084970000011
2.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，采用紫外检测或质谱检测。
3.如权利要求2所述的检测方法，其特征在于，质谱的检测条件为：UPLC-Triple-TOF5600+飞行时间液质联用仪：负离子扫描模式；扫描范围：m/z 100-1500；离子源温度(TEM)：550℃；离子源电压(IS)：-4500V(负；一级扫描：去簇电压DP)：100V；聚焦电压(CE)：10V；二级扫描：使用TOF MS～Product Ion～IDA模式采集质谱数据，CID能量为-20、-40和-60V，进样前，用CDS泵做质量轴校正，使质量轴误差小于2ppm。
4.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，流动相A为：0.05％～0.5％甲酸水溶液，流动相B浓度为：0.05％～0.5％甲酸乙腈。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，流速为：0.1～0.5mL·min-1，进样量为3μL，柱温箱：40～60℃。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征在于，检测波长为254nm。
7.如权利要求1～6任一所述的检测方法，其特征在于，所述检测方法是对如下化合物的检测：槲皮素3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D半乳糖7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素3-O-β-D-(6”-乙酰基)葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖7-O-β-D-葡萄糖苷、山奈酚3-O-β-D-(6”-乙酰基)葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖7-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D-葡萄糖苷、山奈酚3-O-β-D-葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖苷、槲皮素3-O-β-D-(6”'-乙酰基)葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖苷、山奈酚3-O-β-D-(6”'-乙酰基)葡萄糖-(1→2)-β-D-半乳糖苷。
8.如权利要求1～6任一所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、制备溶液：取胡芦巴叶提取物，加入有机溶剂，离心，取上清液备用；(2)、将制备的溶液注入高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱HPLC-Q-TOF-MS/MS)仪，按照设定的条件，测得胡芦巴叶提取物的HPLC图谱。
9.如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，步骤(1)中加入的有机溶剂为甲醇。
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