KR20050089983A - 면역자극성 서열 올리고뉴클레오타이드 및 이의 이용방법 - Google Patents

면역자극성 서열 올리고뉴클레오타이드 및 이의 이용방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 면역제어성 폴리뉴클레오타이드 및 이러한 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 이용한 개체의 면역제어 방법을 제공한다.

Description

면역자극성 서열 올리고뉴클레오타이드 및 이의 이용방법{Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same}
본 발명은 면역제어성 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 면역반응 제어를 위한 폴리뉴클레오타이드의 투여에 관한 것이다.
감염이나 다른 항원 시험접종(antigenic challenge)에 대해 발생되는 면역반응의 종류는 일반적으로 이러한 반응에 관여하는 T 헬퍼(Th) 세포의 아군에 따라 나뉠 수 있다. Th1 아군은 지연과민 및 세포독성 T 림프구(CTL)의 활성화와 같은 고전적 세포매개 기능에 작용하는 반면, Th2 아군은 B-세포 활성화의 헬퍼(helper)로서 보다 효과적으로 작용한다. 항원에 대한 면역반응의 종류는 일반적으로 항원에 반응하는 세포가 생성하는 시토킨(cytokine)의 영향을 받는다. Th1 및 Th2 세포에 의해 분비되는 시토킨의 차이는 이러한 두 아군의 다른 생물학적 기능을 반영하는 것이라 생각한다(예컨대, Romagnani(2000) Ann. Allergy Asthma Immunol. 85:9-18).
Th1 아군은 바이러스 감염, 세포내 병원균 및 종양 세포에 대한 반응에 특히 적합한데, 그 이유는 CTL을 활성화시키는 IL-2 및 IFN-γ를 분비하기 때문이다. Th2 아군은 자유 생활 박테리아 및 연충 기생체에 대한 반응에 보다 적합하며 알레르기 반응을 매개할 수 있는데, 이는 IL-4 및 IL-5가 각각 IgE 생성과 호산구 활성화를 유도하는 것으로 알려져 있기 때문이다. 일반적으로, Th1 및 Th2 세포는 독특한 패턴의 시토킨을 분비하며, 따라서 한 종류의 반응은 다른 종류의 반응의 활성을 적절히 유지시킬 수 있다. 따라서, Th1/Th2 균형의 이동은 예를 들어 알레르기 반응을 초래하거나 또는 CTL 반응의 증가를 초래할 수 있다.
결핵 및 말라리아와 같은 다양한 감염성 질환에서 Th2 타입의 반응은 감염에 대하여 예방적 가치가 거의 없다. 표적 항원 유래의 소형 펩타이드 및 그 외에 통용되는 항원 제제(잠재적으로 감염성인 순수 바이러스 입자의 사용은 피하고 있다)를 사용하는 제안된 백신은 치료 효과 달성에 필요한 면역반응을 항상 유도하지는 못한다. 일반적으로, 단백질계 백신은 유의적인 세포매개 면역성없이 항체를 중화시키는 높은 역가를 특징으로 하는 Th2 타입의 면역반응을 유도한다.
더욱이, 항체 반응의 몇 가지 타입은 특정 징후에는 부적절한데, 특히 IgE 항체 반응이 과민성 쇼크를 초래할 수 있는 알레르기에는 매우 부적절하다. 일반적으로, 알레르기 반응은 Th2 타입 면역반응을 수반하기도 한다. 알레르기 천식을 비롯한 알레르기 반응은 알레르기항원에 노출된 지 수초 내지 수분 내에 일어나고 세포 탈과립을 특징으로 하는 초기 단계 반응과, 4 내지 24시간 후에 일어나고 알레르기항원 노출 부위로의 호산구의 침윤을 특징으로 하는 후기 단계 반응을 특징적으로 나타낸다. 구체적으로, 알레르기 반응의 초기 단계 동안, 알레르기항원은 호염기구 및 비만 세포 상의 IgE 항체를 가교결합시켜, 탈과립과 후속으로 비만세포 및 호염기구로부터 히스타민 및 기타 다른 염증의 매개인자의 방출을 유도한다. 후기 단계 반응 동안에는 호산구가 알레르기항원 노출 부위로 침윤된다(여기서 조직 손상 및 기능이상이 일어난다).
알레르기 장애의 항원 면역요법은 항원을 소량에서부터 점차 증가량으로 피하 주사하는 것을 수반한다. 이러한 면역 치료는 IgE 매개의 과민증을 유도할 위험이 있고 알레르기 후기 단계 반응의 시토킨 매개 사건을 효과적으로 처리하지 못한다. 따라서 지금까지 이러한 시도는 단지 제한적 성공만을 거두었다.
일반적으로 면역자극성 서열이라 알려져 있는 특정 DNA 서열의 투여는 Th1 관련 시토킨의 분비로 표시되는 바와 같이 Th1 타입 성향을 가진 면역반응을 유도한다. 항원과 함께 면역자극성 폴리뉴클레오타이드의 투여는 투여된 항원에 대한 Th1 타입 면역반응을 초래한다(Roman et al.(1997) Nature Med. 3:849-854). 예를 들어, 식염수 또는 보조제 명반 중의 대장균(이.콜리) β-갈락토시다제(β-Gal)를 피내 주사한 마우스는 특이적 IgG1 및 IgE 항체와, IFN-γ가 아닌 IL-4 및 IL-5를 분비하는 CD4+ 세포를 생성하여 반응했는데, 이는 T 세포가 주로 Th2 아군임을 보여주었다. 하지만, β-Gal을 암호하고 면역자극성 서열을 함유하는 플라스미드 DNA(식염수 중에 함유)를 피내 주사(또는 빗살 스크래치 피부 어플리케이터를 이용하여)한 마우스는 IgG2a 항체와, IL-4 및 IL-5가 아닌 IFN-γ를 분비하는 CD4+ 세포를 생성하여 반응했으며, 이는 T 세포가 주로 Th1 아군임을 증명했다. 더욱이, 이와 같이 플라스미드 DNA가 주사된 마우스에 의한 특정 IgE의 생성은 66 내지 75%로 감소되었다(Raz et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:5141-5145). 일반적으로, 나출 DNA 면역에 대한 반응은 Th1 타입의 반응을 나타내는 항원 자극성 CD4+ T 세포에 의한 IL-2, TNFα 및 IFN-γ의 생성을 특징으로 한다. 이것은 특히 IgE 생성의 감소를 통해 확인되듯이 알레르기 및 천식 치료에 매우 중요하다. 면역자극성 폴리뉴클레오타이드의 Th1 타입 면역반응 자극능은 박테리아 항원, 바이러스 항원 및 알레르기항원에 의해 입증되고 있다(예컨대, WO 98/55495 참조).
폴리뉴클레오타이드의 면역자극 활성에 대해 설명하고 있는 문헌에는 다음과 같은 것이 있다:
면역제어성 폴리뉴클레오타이드에는 일반적으로 CG 서열이 포함된다. IMP의 CG에 인접한 뉴클레오타이드 역시 이 폴리뉴클레오타이드의 면역제어 활성에 역할을 하는 것으로 보인다. 따라서, 면역제어성 폴리뉴클레오타이드의 지속적인 동정은 필수 과제로 남아있다.
본원에 인용된 모든 특허, 특허출원 및 공개문헌은 그 전문이 참고로 원용되었다.
도 1은 4가지 다른 IMP, 즉 서열번호 1, 27, 113 및 172의 상이한 용량에 대한 반응으로 인간 PBMC로부터 생성되는 IFN-α의 양(pg/ml)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 IMP에 의해 자극된 NK 세포 용해 활성을 도시한 그래프이다.
본 발명의 수행 양태
본 발명자들은 면역제어성 폴리뉴클레오타이드 및 이러한 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 이용하여 개체, 특히 인간의 면역반응을 제어하는 방법을 발견했다. 본 발명의 조성물은 본 명세서에 기술한 바와 같은 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 함유한다. 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 a) 적어도 하나의 CG 디뉴클레오타이드를 함유하는, 염기 길이가 적어도 8개인 팔린드롬 서열 및 b) 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이나 그 부근에 적어도 하나의 TCG 트리뉴클레오타이드를 함유한다.
본 발명자들은 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드가 인간 세포를 비롯한 면역 세포를 다양한 방식으로 효율적으로 제어함을 발견했다. 또한, 본 발명자들은 인간 세포로부터 타입 I 인터페론, 예컨대 IFN-α 및 IFN-ω, 및 IFN-γ 등을 비롯한 시토킨 생산을 효과적으로 자극할 수 있음을 발견했다. 또한, 본 발명자들은 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드가 B 세포의 증식을 효과적으로 자극할 수 있음을 발견했다. 또한, 본 발명자들은 본 발명에 따른 일부 면역제어성 폴리뉴클레오타이드가 형질세포성(plasmacytoid) 수지상 세포를 활성화시켜 성숙되도록 함을 발견했다. 또한, 본 발명자들은 본 발명에 따른 면역제어성 폴리뉴클레오타이드 일부의 존재가 배양물 중에서 형질세포성 수지상 세포 아폽토시스를 지연시킬 수 있음을 발견했다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 개체에게 투여하여 면역반응을 제어하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 본 발명에 따른 IMP를 함유하는 킷트를 제공한다. 이러한 킷트는 또한 검체의 면역제어를 위해 본 발명에 따른 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 지침서와 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 함유할 수 있다.
일반 기술
본 발명의 수행에는 별다른 표시가 없는 한, 당해 기술분야에 속하는 분자생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 수 있다. 이러한 기술들은 다음과 같은 문헌에 상세하게 설명되어 있다[Molecular Cloning : A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al. , 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984) ; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. , 1987); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir & C. C. Blackwell, eds. ) ; Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller & M. P. Calos, eds. , 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. , eds., 1987); PCR : The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al. , eds. , 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al. , eds. , 1991); The Immunoassay Handbook (D. Wild, ed., Stockton Press NY, 1994) ; Bioconjugate Techniques (Greg T. Hermanson, ed. , Academic Press, 1996); and Methods of Immzcnological Analysis (R. Masseyeff, W. H. Albert, and N. A. Staines, eds., Weinheim : VCH Verlags gesellschaft mbH, 1993).
정의
본 명세서에 사용된 바와 같은 단수적 표현은 별다른 표시가 없는한 복수의 의미도 포함하는 것이다. 예를 들어, IMP에는 IMP 1종 이상이 포함된다.
본 명세서에 교대로 사용된 바와 같이, "폴리뉴클레오타이드" 및 "올리고뉴클레오타이드"라는 용어에는 일본쇄 DNA(ssDNA), 이본쇄 DNA(dsDNA), 일본쇄 RNA(ssRNA) 및 이본쇄 RNA(dsRNA), 변형된 올리고뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오사이드 또는 이의 혼합물이 포함된다. 이러한 올리고뉴클레오타이드는 선형 또는 환형일 수 있고, 또는 선형과 환형 분절을 모두 포함할 수도 있다. 올리고뉴클레오타이드는 일반적으로 포스포디에스테르 결합을 통해 결합된 뉴클레오사이드의 중합체이며, 대안적 결합으로서 포스포로티오에이트 에스테르가 올리고뉴클레오타이드에 사용될 수도 있다. 뉴클레오사이드는 퓨린(아데닌(A) 또는 구아닌(G) 또는 이의 유도체) 또는 피리미딘(티민(T), 시토신(C) 또는 우라실(U) 또는 이의 유도체) 염기가 당에 결합되어 있는 것이다. DNA의 4가지 뉴클레오사이드 단위(또는 염기)는 데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘 및 데옥시시티딘으로 불린다. 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드의 포스페이트 에스테르이다.
본 명세서에 사용된 "면역제어성 폴리뉴클레오타이드" 또는 "IMP"라는 용어는 시험관내, 생체내 및/또는 생체외에서 측정했을 때 측정가능한 면역반응에 영향을 미치고(또는) 기여하는 폴리뉴클레오타이드를 의미한다. 측정가능한 면역반응의 예에는 항원 특이적 항체 생산, 시토킨 분비, 림프구 집단, 예컨대 NK 세포, CD4+ T 림프구, CD8+ T 림프구, B 림프구 등의 활성화 또는 증식이 포함되며, 이에 국한되는 것은 아니다. 바람직하게는, IMP 서열은 Th1형 반응을 우선적으로 활성화시킨다.
본 명세서에 사용된 "면역제어성" 또는 "면역반응을 제어하는"이란 용어에는 면역자극성 효과 뿐만 아니라 면역억제성 효과도 포함된다. 면역제어는 주로 전반적인 면역 반응의 정성적 변화를 의미하는 것이지만, 면역제어와 관련하여 정량적 변화가 일어날 수도 있다. 본 발명에 따라 면역제어되는 면역반응은 "Th2형" 면역반응에 대치되는 반응으로서, "Th1형" 면역 반응으로 이동되는 반응이다. Th1형 반응은 일반적으로 세포 면역계(예컨대, 세포독성 림프구) 반응으로 간주되는 반면, Th2형 반응은 일반적으로 "체액" 또는 항체계 반응이다. Th1형 면역반응은 일반적으로 항원에 대한 "지연형 과민" 반응을 특징으로 하고, Th1 관련 시토킨, 예컨대 IFN-γ, IFN-α, IL-2, IL12 및 TNF-β 뿐만 아니라 IL-6(IL-6은 또한 Th2형 반응과도 관련이 있기도 하다)의 증가된 수준을 통해 생화학적 측면에서 검출할 수 있다. Th1형 면역반응은 일반적으로 세포독성 림프구(CTL)의 생산 및 낮은 수준 또는 일시적인 항체 생산과 관련이 있다. Th2형 면역반응은 일반적으로 IgE 생산을 비롯한 항체 생산의 보다 높은 수준, CTL 생산의 부재 또는 최소화 뿐만 아니라 IL-4와 같은 Th2 관련 시토킨의 발현과 관련이 있다. 따라서, 본 발명에 따른 면역제어는 예컨대 본 발명에 따라 처리된 개체에서의 IFN-γ 및/또는 IFN-α의 증가 및/또는 IgE 생산 감소를 미처리 시와 비교하여 확인할 수 있다.
"3'"라는 용어는 일반적으로 동일 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드에서 다른 영역이나 위치로부터 3'(하류) 방향에 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 영역이나 위치를 의미한다. "3' 단말"이란 용어는 폴리뉴클레오타이드의 3' 말단을 의미한다.
"5'"란 용어는 일반적으로 동일한 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 다른 영역이나 위치로부터 5'(상류) 방향에 있는 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드의 영역이나 위치를 의미한다. "5' 단말"이란 용어는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단을 의미한다.
다른 서열에 "인접한" 영역, 부분 또는 서열은 그 영역, 부분 또는 서열에 바로 접해 있는 것이다. 예를 들어, 면역제어성 폴리뉴클레오타이드의 특정 부분에 인접한 추가 폴리뉴클레오타이드 서열(예컨대, TCG 트리뉴클레오타이드)은 그 영역에 직접 접해 있는 것이다.
"팔린드롬 서열" 또는 "팔린드롬"이란 용어는 역위된 반복체, 예컨대 ABCDD'C'B'A'(여기서, 염기, 예컨대 A 및 A', B 및 B', C 및 C', D 및 D'는 왓슨 크리크 염기쌍을 형성할 수 있다)인 핵산 서열을 의미한다. 이러한 서열은 일본쇄이거나 이본쇄 구조를 형성할 수 있거나 또는 일정 조건하에서 헤어핀 루프 구조를 형성할 수도 있는 것이다. 예를 들어, 본 명세서에 사용된 바와 같은 "8 염기 팔린드롬"은 팔린드롬 서열이 8개 염기 길이, 즉 ABCDD'C'B'A'인 핵산 서열을 의미한다. 팔린드롬 서열은 비팔린드롬 서열을 함유하기도 하는 폴리뉴클레오타이드의 일부분일 수 있다. 즉, 폴리뉴클레오타이드는 1개 이상의 팔린드롬 서열 부분과 1개 이상의 비팔린드롬 서열 부분을 함유할 수 있다. 대안적으로, 폴리뉴클레오타이드 서열은 전체가 팔린드롬일 수도 있다. 1개 이상의 팔린드롬 서열 부분을 보유한 폴리뉴클레오타이드에서, 팔린드롬 서열 부분은 서로 중첩되거나 또는 서로 중첩되지 않을 수도 있다.
"접합체"라는 용어는 IMP와 항원이 결합된 복합체를 의미한다. 이러한 접합체의 결합에는 공유 결합 및/또는 비공유 결합이 포함된다.
"항원"이란 용어는 항체 또는 T 세포 항원 수용체에 의해 인식되고 특이적으로 결합되는 물질을 의미한다. 항원에는 펩타이드, 단백질, 당단백질, 다당류, 복합 탄수화물, 당, 강글리오사이드, 지질 및 인지질; 이의 부분 및 이의 혼합물이 포함될 수 있다. 항원은 자연에서 발견되는 항원 또는 합성 항원일 수 있다. IMP와 함께 투여하기에 적당한 항원에는 B 세포 또는 T 세포 항원 특이적 반응을 유도할 수 있는 임의의 분자가 포함된다. 항원은 이 항원에 특이적인 항체 반응을 유도하는 것이 바람직하다. 합텐은 "항원"의 범위에 포함되는 것이다. 합텐은 그 자체가 면역원성은 아니지만, 항원 결정인자를 함유하는 면역원 분자와 접합되었을 때 면역원성이 되는 저분자량 화합물이다. 소형 분자는 항원성이 되기 위하여 합텐화될 필요가 있을 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항원에는 펩타이드, 지질(예컨대, 스테롤, 지방산 및 인지질), 헤모필러스 인플루엔자 백신에 사용되는 것과 같은 다당류, 강글리오사이드 및 당단백질이 포함된다.
"보조제"라는 용어는 항원과 같은 면역원성 제제에 첨가했을 때 이 혼합물에 노출 시, 수용 숙주 내의 제제에 대한 면역 반응을 비특이적으로 증강 또는 강화시키는 물질을 의미한다.
"펩타이드"란 용어는 펩타이드가 합텐인지의 여부를 불문하고 항체 생산 또는 시토킨 활성과 같은 생물학적 반응에 영향을 미치기에 충분한 길이와 조성을 보유한 폴리펩타이드이다. 일반적으로, 펩타이드는 아미노산 잔기의 길이가 적어도 6개인 것이다. 또한, "펩타이드"라는 용어에는 변형된 아미노산도 포함되며(자연 발생인지 또는 비자연 발생인지의 여부를 불문하고), 이러한 변형에는 인산화, 글리코실화, 페길화, 지질화 및 메틸화가 이에 국한됨이 없이 포함된다.
"항원성 펩타이드"에는 정제된 천연 펩타이드, 합성 펩타이드, 재조합 단백질, 조단백질 추출물, 약독화 또는 불활성화 바이러스, 세포, 미생물 또는 이러한 펩타이드의 단편이 포함될 수 있다. 따라서, "항원성 펩타이드" 또는 "항원 폴리펩타이드"는 1가지 이상의 항원성을 나타내는 폴리펩타이드 전체 또는 일부를 의미한다. 따라서, 예를 들어, "Amb a 1 항원성 폴리펩타이드" 또는 "Amb a 1 폴리펩타이드 항원"은 항원성(즉, 항체 또는 T 세포 수용체에 특이적으로 결합하는 성질)을 나타내는, 전서열, 서열의 부분 및/또는 서열의 변형 여부에 관계없이 Amb a 1에서 유래되는 아미노산 서열이다.
"전달 분자" 또는 "전달 매개체"는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드가 특정 부위로 및/또는 특정 시기와 관련하여 전달되도록 허용하고(하거나) 촉진하는 화학적 잔기를 의미한다. 전달 매개체는 면역반응을 추가로 자극하거나 자극하지 않을 수 있다.
"항원에 대한 알레르기 반응"은 일반적으로 호산구 및/또는 항원 특이적 IgE의 생성 및 그 결과 나타나는 효과를 특징으로 하는 면역반응을 의미한다. 당업계에 공지된 바와 같이, IgE는 비만 세포 및 호염기구 상의 IgE 수용체에 결합한다. 이후에 IgE에 의해 인식되는 항원에 노출되는 즉시, 항원은 비만 세포와 호염기구 상의 IgE와 가교결합하여 히스타민 방출(이에 제한되지 않음)을 비롯한 상기 세포들의 탈과립을 유발한다. 따라서, "항원에 대한 알레르기 반응", "알레르기" 및 "알레르기 증상"이란 용어는 본 발명의 일부 방법을 적용하는데 있어서 동일하게 적절한 것으로 이해되고 간주되어야 한다. 또한, 본 발명의 방법에는 기존 알레르기 증상의 치료 뿐만 아니라 알레르기 반응의 예방에 동일하게 적절한 방법이 포함되는 것으로 이해되고 간주되어야 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같은, "알레르기항원"이란 용어는 검체에게 노출되었을 때 알레르기 반응을 유도하는 분자, 일반적으로 단백질의 항원성 부분 또는 항원을 의미한다. 일반적으로, 검체는 예컨대 피부발진 및 발적 시험 또는 당해 기술분야에 공지된 임의의 방법을 통해 알 수 있듯이, 알레르기항원에 알레르기를 나타낸다. 만일 검체의 소수 아군만이 분자에 노출되었을 때 알레르기(예컨대, IgE) 면역반응을 나타낸다면 그 분자는 알레르기항원이라고 할 수 있다. 분리된 알레르기항원으로는 다수가 당해 기술분야에 공지되어 있다. 그 예에는, 본 명세서의 표 1에 제시된 알레르기항원이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
"탈감작"이란 용어는 민감함이 확인된 알레르기항원의 증가 용량을 검체에게 투여하는 과정을 의미한다. 탈감작에 사용되는 알레르기항원의 용량에 대한 예는 당해 기술, 예컨대 문헌[Fornadley (1998) Otolaryngol. Clin. North Am. 31: 111-127]에 공지되어 있다.
"항원 특이적 면역요법"이란, 항원이 수반되고 면역반응의 항원 특이적 제어가 발생되는 모든 형태의 면역요법을 의미한다. 알레르기와 관련된 항원 특이적 면역요법에는 탈감작 요법이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
"마이크로담체"란 용어는 물에 불용성이고 크기가 약 150, 120 또는 100㎛ 미만, 바람직하게는 약 50 내지 60㎛ 미만, 바람직하게는 약 10㎛ 미만, 바람직하게는 약 5, 2.5, 2 또는 1.5㎛ 미만인 미립자 조성물을 의미한다. 마이크로담체에는 약 1㎛ 미만, 바람직하게는 약 500nm 미만의 크기를 가진 마이크로담체인 "나노담체"가 포함된다. 마이크로담체에는 생체적합성인 자연발생의 중합체, 합성 중합체 또는 합성 공중합체로 제조된 입자와 같은 고상 입자가 포함되지만, 아가로스 또는 가교 아가로스로 제조된 마이크로담체는 본 명세서에 기술된 마이크로담체 뿐만 아니라 당해 기술분야에 공지된 다른 생체분해성 물질의 정의에 포함되거나 포함되지 않을 수도 있다. 본 발명에 유용한 마이크로담체는 생체분해성이거나 비생체분해성일 수 있다. 비생체분해성인 고상 마이크로담체는 포유동물의 생리적 조건하에서 비침식성 및/또는 비분해성인 중합체 또는 기타 다른 물질로 제조된 것으로서, 그 예에는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 실리카, 세라믹, 폴리아크릴아마이드, 금, 라텍스, 하이드록시아파타이트, 덱스트란 및 강자성 물질 및 상자성 물질이 포함된다. 생체분해성인 고상 마이크로담체는 포유동물의 생리적 조건하에서 분해성인 중합체(예컨대, 폴리(락트산), 폴리(글리콜린산) 및 이의 공중합체) 또는 침식성인 중합체(예컨대, 폴리(오르토 에스테르), 예컨대 3,9-디에틸리덴-2,4,8,10-테트라옥사스피로[5.5]운데칸(DETOSU) 또는 폴리(무수물), 예컨대 세바스산의 폴리(무수물))로 제조될 수 있다. 또한, 마이크로담체는 액상(예컨대, 오일계 또는 지질계)인 것으로서, 예컨대 리포좀, 항원이 없는 이스콤(콜레스테롤, 인지질 및 보조제 활성 사포닌의 안정된 복합체인 면역자극 복합체), 또는 수중유 또는 유중수 에멀젼에서 관찰되는 소적 또는 미셀 등일 수 있다. 생체분해성 액상 마이크로담체는 일반적으로 생체분해성 오일을 포함하는데, 그 예에는 스쿠알렌 및 식물유를 비롯하여 당해 기술분야에 공지된 수많은 종류가 있다. 마이크로담체는 일반적으로 형태가 구형이지만, 구형과 다른 마이크로담체도 사용할 수 있다(예컨대, 타원체형, 막대형 등). 이러한 마이크로담체는 불용성(물에 대해)인 성질로 인하여 물과 수계(수성) 용액으로부터 여과해낼 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "비생체분해성"이란 용어는 정상적인 포유동물 생리적 조건하에서 분해되거나 침식되지 않는 마이크로담체를 의미한다. 일반적으로, 마이크로담체는 정상인의 혈청 중에서 37℃하에 72시간 동안 항온배양한 후에도 분해(즉, 질량이나 평균 중합체 길이가 5% 미만으로 상실)되지 않는다면, 비생체분해성인 것으로 간주한다.
마이크로담체가 정상적인 포유동물 생리적 조건하에서 분해되거나 침식된다면, 이는 "생체분해성으로 간주한다. 일반적으로, 마이크로담체가 정상인의 혈청 중에서 37℃하에 72시간 동안 항온배양한 후에도 분해(즉, 질량이나 평균 중합체 길이가 5% 미만으로 상실되면)된다면, 생체분해성인 것으로 간주한다.
마이크로담체의 "크기"는 일반적으로 제조자가 언급하는 입자의 "설계 크기" 또는 의도한 크기이다. 크기는 직접 측정되는 치수, 예컨대 평균 직경 또는 최대 직경이거나 또는 여과 선별 분석과 같은 간접 분석법으로 측정할 수도 있다. 마이크로담체 크기의 직접 측정은 일반적으로 광학 현미경 또는 주사 전자 현미경(SEM)과 같은 현미경을 이용하여 공지의 크기의 입자와 비교하거나 측미계를 참고로 하여 보통 수행한다. 제조 공정 중에 크기의 약간의 편차가 발생하므로, 마이크로담체가 전술한 측정값의 ±약 5 내지 10%인 것으로 측정되면 그 마이크로담체는 기술된 크기인 것으로 간주한다. 또한, 크기 특성은 동적 광 산란 또는 동적 광 차단 기법을 이용하여 측정할 수도 있다. 대안으로, 마이크로담체의 크기는 여과 선별 분석법으로 측정할 수도 있다. 기술된 크기의 "스크린형" 필터(즉, 보유 필터가 필터 내부에 박히는 "적층형 필터"와 달리 보유 입자가 필터 표면에 존재하는 필터, 예컨대 폴리카보네이트 또는 폴리에테르설폰 필터)를 통해 입자의 97% 이상이 통과한다면 마이크로담체는 기술된 크기 보다 적은 것이다. 마이크로담체 입자의 약 97% 이상이 기술된 크기의 스크린형 필터에 의해 보유된다면 그 마이크로담체는 기술된 크기 보다 큰 것이다. 즉, 마이크로담체의 적어도 약 97%가 약 10㎛ 내지 약 10nm 범위의 크기라면 10㎛ 세공의 스크린 필터는 통과하고 10nm 스크린 필터에는 보유된다.
이와 같은 설명에서 나타나듯이, 마이크로담체의 크기 또는 크기 범위에 대한 언급에는 기술된 크기 및/또는 크기 범위의 근접 변화값 및 근사값이 포함된다. 이것은 크기 및/또는 크기 범위를 언급할 때 "약" 이란 용어를 사용하여 반영했지만, "약"의 언급 없이 기재된 크기 또는 크기 범위가 정확한 크기 및/또는 크기 범위를 의미한다는 것은 아니다.
"면역제어성 폴리뉴클레오타이드/마이크로담체 복합체" 또는 "IMP/MC 복합체"란 용어는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드 및 마이크로담체의 복합체를 의미한다. 복합체의 성분들은 공유결합되거나 비공유결합될 수 있다. 비공유결합은 소수성 상호작용, 이온(정전기) 결합, 수소결합 및/또는 반데르발스 인력을 비롯한 임의의 비공유결합력을 통해 매개될 수 있다. 소수성 결합인 경우에, 결합은 일반적으로 IMP에 공유결합된 소수성 잔기(예컨대, 콜레스테롤)을 통해 이루어진다.
"개체"는 조류와 같은 척추동물로서, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간이다. 포유동물에는 인간, 영장류, 가축, 변종 동물, 설치류 및 애완동물이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
물질의 "유효량" 또는 "충분양"은 유리한 결과 또는 목적한 결과, 예컨대 임상 결과를 제공하기에 충분한 양으로서, "유효량" 자체는 사용되고 있는 상황에 따라 달라진다. 공동투여되는 항원에 대한 면역반응을 제어하는 조성물을 투여하는 상황에서는, 면역제어성 폴리뉴클레오타이드와 항원의 유효량은 항원만이 투여되는 경우에 수득되는 면역반응과 비교했을 때 제어를 달성하기에 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상으로 투여될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "공동투여"란 용어는 면역반응의 제어를 위해 적어도 2종의 다른 물질을 충분히 가까운 시간 내에 투여하는 것을 의미한다. 바람직하게는, 공동투여는 적어도 2종의 다른 물질을 동시 투여하는 것을 의미한다.
반응 또는 파라미터의 "자극"이란 그 반응 또는 파라미터를 유인 및/또는 증강시키는 것을 포함한다. 예를 들어, Th1 반응과 같은 면역반응의 "자극"은 반응 유인 및/또는 증강을 통해 일어날 수 있는 반응의 증가를 의미한다. 이와 마찬가지로, 시토킨 또는 세포 종류(예, CTL)의 "자극"은 시토킨 또는 세포 종류의 양이나 수준의 증가를 의미한다. B 세포 "자극"은 예컨대 증강된 B 세포 증식, 유도된 B 세포 활성화 및/또는 자극된 B 세포로부터 IL-6 및/또는 TNF-α와 같은 시토킨의 생산 증가를 포함한다.
"IgE 관련 장애"는 지속적이거나 일시적일 수 있는, 상승된 IgE 수준이 일부 특징인 생리적 상태이다. IgE 관련 장애에는 알레르기 및 알레르기 반응, 식품 알레르기, 알레르기 관련 장애(이하에 설명됨), 천식, 비염, 아토피성 피부염, 결막염, 두드러기, 쇼크, 벌목류(Hymenoptera) 독침 알레르기 및 약물 알레르기, 및 기생충 감염이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 이 용어에는 이러한 장애의 관련 징후도 포함된다. 일반적으로, 이러한 장애에서 IgE는 항원 특이적인 것이다.
"알레르기 관련 장애"는 항원 특이적 IgE 면역반응의 영향으로부터 산출되는 장애를 의미한다. 이러한 영향에는, 저혈압과 쇼크가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 아나팔락시스(anaphylaxis)는 혈행으로 방출된 히스타민이 혈관확장 뿐만 아니라 모세혈관의 투과성 증가로 인한 혈행으로부터 혈장의 현저한 상실을 유발하는 알레르기 관련 장애의 일 예이다. 아나팔락시스는 관련 영향이 몸 전체에 나타나는 전신성으로 유발될 수도 있고, 반응이 특정 표적 조직이나 기관에 제한적인 국소성으로 유발될 수도 있다.
본 명세서에 사용된 "바이러스 질환"이란 용어는 병인 인자가 바이러스인 질병을 의미한다. 바이러스 질병의 예에는 B형 간염, C형 간염, 인플루엔자, 후천성 면역결핍증(AIDS) 및 대상포진이 포함된다.
본 명세서에 사용되고 당해 기술분야에 공지된 바와 같이, "치료"는 유리하거나 목적한 결과, 예컨대 임상 결과를 수득하기 위한 시도이다. 본 발명의 목적 상, 유리하거나 목적한 임상 결과에는, 검측가능성 여부에 관계없이 1가지 이상의 증상의 경감 또는 완화, 질병 정도의 감소, 질병의 안정된(즉, 악화되지 않는) 상태, 질병 전이 방지, 질병 진행의 지연 또는 서행, 질병 상태의 완화 또는 경감, 및 진정(일부 또는 완전 진정 여부를 불문하고)을 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. "치료"는 또한 치료를 받지 않은 경우에 예상되는 수명과 비교했을 때 연장된 생존을 의미할 수도 있다.
질병 또는 장애의 "경감"은 이러한 장애를 치료하지 않는 경우와 비교했을 때 장애 또는 질병 상태의 정도 및/또는 바람직하지 않은 임상 징후가 감소되고(되거나) 질병의 진행 시간이 느려지거나 연장되는 것을 의미한다. 특히, 알레르기인 경우에, 당업자라면 잘 알고 있듯이, 경감은 알레르기항원에 대한 면역반응의 제어 시 일어날 수 있다. 또한, 경감은 1회 용량 투여 시 반드시 나타나는 것은 아니며, 종종 일련의 용량을 투여했을 때 나타난다. 즉, 반응이나 장애의 경감에 충분한 양은 1회 이상의 투여로 제공될 수 있다.
면역제어성 폴리뉴클레오타이드 및 항원에 의해 "유도되는" "항체 역가" 또는 "항체 양"은 면역제어성 폴리뉴클레오타이드 및 항원 투여 후 일정 시점에서 측정되는 소정의 항체 양을 의미한다.
"Th1 관련 항체"는 생산 및/또는 증가가 Th1 면역반응과 관련이 있는 항체이다. 예를 들어, IgG2a는 마우스 중의 Th1 관련 항체이다. 본 발명의 목적 상, Th1 관련 항체의 측정은 이러한 항체 1종 이상의 측정일 수 있다. 예를 들어, 인간에서, Th1 관련 항체의 측정은 IgG1 및/또는 IgG3의 측정을 수반할 수 있다.
"Th2 관련 항체"는 생산 및/또는 증가가 Th2 면역반응과 관련이 있는 항체이다. 예를 들어, IgG1은 마우스 중의 Th2 관련 항체이다. 본 발명의 목적 상, Th2 관련 항체의 측정은 이러한 항체 1종 이상의 측정일 수 있다. 예를 들어, 인간에서의 Th2 관련 항체의 측정은 IgG2 및/또는 IgG4의 측정을 수반할 수 있다.
시토킨 생산, 항체 생산 또는 히스타민 방출과 같은 기능 또는 활성을 "억제하는"이란 당해의 조건이나 파라미터를 제외하고는 동일한 조건에서 비교했을 때 또는 다른 조건과 비교했을 때 기능이나 활성이 감소하는 것이다. 예를 들면, 히스타민 방출을 억제하는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드 및 항원을 함유하는 조성물은 예컨대 항원에 의해서만 유도되는 히스타민 방출에 비해 히스타민 방출을 감소시키는 것이다. 다른 예로서, 항체 생산을 억제하는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드 및 항원을 함유하는 조성물은 예컨대 항원에 의해서만 생산되는 항체의 정도 및/또는 수준에 비해 항체의 정도 및/또는 수준을 감소시키는 것이다.
"혈청 단백질"은 무병 포유동물, 특히 무병 소의 혈청에서 일반적으로 관찰되는 단백질이다. 가장 우세한 혈청 단백질은 혈청 알부민이다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 "포함하는"이란 용어와 이의 동종어는 포괄적 의미로 사용된 것으로서, "포괄하는"이란 용어 및 이의 대응 동종어와 동등한 표현이다.
본 발명의 조성물
본 발명은 개체의 면역반응을 제어하기 위한 면역제어성 폴리뉴클레오타이드(IMP)를 제공한다. 본 발명의 조성물은 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 단독(또는 2종 이상의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드의 혼합물) 함유하거나 또는 다른 면역제어성 제제, 예컨대 펩타이드 항원(이하에 설명됨) 및/또는 추가 보조제와 함께 함유하는 것이다. 본 발명의 조성물은 면역제어성 폴리뉴클레오타이드 및 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 부형제, 예컨대 완충액은 당해 기술분야에 공지되어 있다(Remington : Die Science ahd Practice of Phaf°macy, 20th edition, Mack Publishing (2000)).
투여 시, 항원과 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드 및 경우에 따라 보조제를 함유하는 조성물은 항원에 대한 면역반응을 상승시킬 수 있고, 이에 따라 IMP와 항원만을 함유하는 조성물로부터 산출되는 면역반응에 비해 증강된 면역반응을 제공할 수 있다. 보조제는 당해 기술분야에 공지되어 있으며, 그 예에는 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼, 명반(알루미늄염), 리포좀 및 폴리스티렌, 전분, 폴리포스파젠 및 폴리락타이드/폴리글리코사이드를 포함하지만 이에 국한되지 않는 마이크로입자가 포함되며, 이에 국한되는 것은 아니다. 또한, 기타 다른 적당한 보조제로서, MF59, DETOX™(Ribi), 스쿠알렌 혼합물(SAF-1), 뮤라밀 펩타이드, 사포닌 유도체, 미코박테리아 세포벽 제제, 모노포스포릴 지질 A, 마이콜린산 유도체, 비이온성 블록 공중합체 계면활성제, Quil A, 콜레라 독소 B 서브유닛, 폴리포스파젠 및 유도체, 및 문헌[Takahashi et al.(1990) Nature 344: 873-875)에 기술된 것과 같은 면역자극 복합체(ISCOM) 뿐만 아니라 지질계 보조제 및 본 명세서에 기술된 기타 다른 보조제도 포함되지만, 이에 국한되지는 않는다. 수의학적 용도 및 동물에서의 항체 생산 용도인 경우에는 프로인트 보조제(완전 및 불완전 모두)의 분열촉진성 성분이 사용될 수 있다.
본 발명의 IMP는 특정 징후에 대한 기타 다른 치료법에 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, IMP 외에도, 본 발명의 조성물은 추가로 말라리아 환자용의 클로로퀸과 같은 항말라리아 약물, 리슈만편모충증 환자용의 펜트아미딘 및/또는 알로퓨리놀과 같은 리슈만편모충박멸 약물, 결핵 환자용의 이소니아지드, 리팜핀 및/또는 에탐부톨과 같은 항미코박테리아 약물 또는 아토피(알레르기) 환자용의 알레르기항원 탈감작 약물을 함유할 수도 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 본 발명의 조성물은 IMP를 포함할 수 있고, 추가로 1종 이상의 다른 면역치료 제제(즉, 면역계를 통해 작용하는 제제 및/또는 면역계 유래의 제제), 예컨대 시토킨, 보조제 및 항체 등을 함유할 수 있다. 치료 항체의 예에는 이하 설명될 항체와 같은 암과 관련하여 사용되는 항체(예컨대, 항암 항체)가 포함된다.
면역제어성 폴리뉴클레오타이드
본 발명에 따르면, 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 CG 디뉴클레오타이드를 1개 이상 함유하는 염기 길이가 적어도 8개인 팔린드롬 서열(즉, 팔린드롬)을 1개 이상 함유한다. 이러한 IMP는 또한 이 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이나 그 부근에 1개 이상의 TCG 트리뉴클레오타이드를 함유한다(즉, 5'-TCG). 일부 경우에는, 팔린드롬 서열 및 5'-TCG가 IMP 중의 염기 0개, 1개 또는 2개에 의해 분리되기도 한다. 또 다른 일부 경우에는, 팔린드롬 서열에 5'-TCG 전체 또는 일부가 포함된다.
IMP는 당해 기술분야에 이미 개시된 바 있는 것으로서, 그 활성은 시토킨 분비, 항체 생산, NK 세포 활성화, B 세포 증식, T 세포 증식과 같은 다양한 양태의 면역반응을 나타내는 표준 분석법을 사용하여 용이하게 확인할 수 있다(예컨대, WO 97/28259; WO 98/16247 ; WO 99/11275; Krieg et al. (1995) Nature 374: 546- 549; Yamamoto et al. (1992a) ; Ballas et al. (1996); Klinman et al. (1997); Sato et al. (1996); Pisetsky (1996a) ; Shimada et al. (1986) Jpn. J. CancerRes. 77: 808-816; Cowdery et al. (1996) J. Immunol. 156: 4570-4575; Roman et al. (1997); Lipford et al. (1997a); WO 98/55495 및 WO 00/61151 참조). 따라서, 면역제어성 IMP의 동정, 시험 및/또는 확인에는 이러한 방법과 그 외 다른 방법을 사용할 수 있다.
IMP는 염기 또는 염기쌍의 길이가 10개 보다 많은 임의의 길이, 바람직하게는 15개 보다 많은 임의의 길이, 보다 바람직하게는 20개 보다 많은 임의의 길이일 수 있다.
본 명세서에서 분명하게 시사되듯이, 본 명세서에 기술된 서열식에서 임의의 파라미터 및 모든 파라미터는 독립적으로 선택되는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, x=0-2이면, y는 x의 값(또는 식 중의 다른 임의의 선택가능한 파라미터)에 관계없이 독립적으로 선택될 수 있다.
일부 구체예에서, IMP는 a) 적어도 2개의 CG 디뉴클레오타이드가 0개, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 염기에 의해 서로 분리되어 있고 팔린드롬 서열의 염기 길이가 적어도 8개인, 적어도 2개의 CG 디뉴클레오타이드를 함유하는 팔린드롬 서열; 및 b) (TCG)y 서열이 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0개, 1개, 2개 또는 3개의 염기째에 위치하고[여기서, y는 1 또는 2이다], (TCG)y 서열의 3' 말단이 팔린드롬 서열의 5' 말단으로부터 0개, 1개 또는 2개 염기에 의해 분리되어 있는, (TCG)y 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, b)의 (TCG)y서열의 CG 디뉴클레오타이드는 a)의 팔린드롬 서열에 존재하는 적어도 2개의 CG 디뉴클레오타이드 중 하나로 간주될 수 있다. 일부 구체예에서, 팔린드롬 서열의 CG 디뉴클레오타이드는 1개, 3개 또는 4개의 염기에 의해 서로 분리되기도 한다. 이 문단이나 본 명세서의 다른 부분에 기술되는지의 여부를 불문하고 본 발명의 일부 IMP에서, 팔린드롬 서열은 G와 C가 2/3 미만인 염기 조성을 갖기도 한다. 일부 구체예에서, 팔란드롬 서열은 A와 T가 1/3 초과인 염기 조성을 갖기도 한다.
일부 양태에서, IMP는 a) 적어도 2개의 CG 디뉴클레오타이드가 0개, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 염기를 통해 서로 분리되어 있고 팔린드롬 서열의 염기 길이가 적어도 8개인, 적어도 2개의 CG 디뉴클레오타이드를 함유하는 팔린드롬 서열; 및 (b) (TCG)y 서열이 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0개, 1개, 2개 또는 3개의 염기째에 위치하고 있는, (TCG)y 서열[여기서, y는 1 또는 2이다]을 포함하되, 팔린드롬 서열이 상기 (TCG)y 서열 전체 또는 부분을 포함하고, b)의 (TCG)y 서열 중 CG 디뉴클레오타이드가 a)인 팔린드롬 서열의 CG 디뉴클레오타이드 중 하나로 간주될 수 있는 것이다. 일부 구체예에서, 팔린드롬 서열의 CG 디뉴클레오타이드는 1개, 3개 또는 4개의 염기에 의해 서로 분리되어 있는 것이 바람직하다.
따라서, 일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열식의 서열을 함유할 수 있다: 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1CGX1'(CG)p)z(서열번호 155)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x = 0-3, y = 1-4, w = -2, -1, 0, 1 또는 2, p=0 또는 1, q= 0, 1 또는 2, z= 1 내지 20, X1 및 X1'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치한다]. IMP는 또한 (X1CGX1'(CG)p)z 서열을 1개 이상 함유하는, 염기 길이가 8개 이상인 팔린드롬 서열을 함유한다. w= -1인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 3' 염기는 처음 (X1CGX1'(CG)p) 서열의 5' X1이다. 일부 구체예에서, (TCG(Nq))y 서열은 0개, 1개, 또는 2개의 염기에 의해 팔린드롬 서열과 분리되어 있다. 다른 구체예에서, 팔린드롬 서열은 (TCG(Nq))y 서열 전부 또는 일부를 포함하기도 한다. 일부 구체예에서, p가 0일 때, X1은 A 또는 T이다.
일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열을 함유하는 것이다(밑줄친 부분은 팔린드롬 서열이다):
일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열식의 서열을 함유할 수도 있다: 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1X2X3CGX3'X2'X1'(CG)p)z(서열번호 157)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x는 0-3, y는 1-4, w는 -3, -2, -1, 0, 1 또는 2, p는 0 또는 1, q는 0, 1 또는 2, z는 1 내지 20이며, X1과 X1', X2와 X2' 및 X3과 X3'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치하는 것이다]. 또한, IMP는 염기 길이가 8개 이상인 팔린드롬 서열을 함유하는데, 이 팔린드롬 서열은 적어도 하나의 (X1X2X3CGX3'X2'X1'(CG)p)(서열번호 224) 서열 중 처음 (X1X2X3CGX3'X2'X1')를 함유한다. w가 -1인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 3' 염기는 처음 (X1X2X3CGX3'X2'X1'(CG)p)(서열번호 224) 서열의 5' X1이다. w가 -2인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 말단에서 2번째(즉, 끝에서 2번째) 및 말단(즉, 끝) 3' 염기는 각각 처음 (X1X2X3CGX3'X2'X1'(CG)p)(서열번호 224) 서열의 5' X1 및 X2이다. w가 -3인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 말단에서 3번째(즉, 끝에서 3번째), 말단에서 2번째(즉, 끝에서 2번째) 및 말단(즉, 끝) 3' 염기는 각각 처음 (X1X2X3CGX3'X2'X1'(CG)p)(서열번호 224) 서열의 5' X1, X2 및 X3이다. 일부 구체예에서, (TCG(Nq))y 서열은 팔린드롬 서열로부터 0개, 1개 또는 2개의 염기에 의해 분리되어 있다. 다른 구체예에서, 팔린드롬 서열은 (TCG(Nq))y 서열 전부 또는 일부를 포함하기도 한다. 일부 구체예에서, p가 1인 경우에, X1, X2 및 X3은 각각 A 또는 T이다. 일부 구체예에서, p가 0인 경우에 X1, X2 및 X3 중 적어도 2개는 A 또는 T이다.
일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열을 함유한다(밑줄친 부분은 팔린드롬 서열이다):
일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열식의 서열을 함유할 수도 있다: 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1X2X3X4CGX4'X3'X2'X1'(CG)p)z(서열번호 158)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x는 0-3, y는 1-4, w는 -3, -2, -1, 0, 1 또는 2, p는 0 또는 1, q는 0, 1 또는 2, z는 1 내지 20이며, X1과 X1', X2와 X2', X3과 X3' 및 X4와 X4'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치하는 것이다]. 또한, IMP는 염기 길이가 10개 이상인 팔린드롬 서열을 함유하는데, 이 팔린드롬 서열은 적어도 하나의 (X1X2X3X4CGX4'X3'X2'X1'(CG)p)(서열번호 226) 서열 중 처음 (X1X2X3X4CGX4'X3'X2'X1')(서열번호 225)를 함유한다. w가 -1인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 3' 염기는 처음 (X1X2X3X4CGX4'X3'X2'X1'(CG)p)(서열번호 226) 서열의 5' X1이다. w가 -2인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 말단에서 2번째(즉, 끝에서 2번째) 및 말단(즉, 끝) 3' 염기는 각각 처음 (X1X2X3X4CGX4'X3'X2'X1'(CG)p)(서열번호 226) 서열의 5' X1 및 X2이다. w가 -3인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 말단에서 3번째(즉, 끝에서 3번째), 말단에서 2번째(즉, 끝에서 2번째) 및 말단(즉, 끝) 3' 염기는 각각 처음 (X1X2X3X4CGX4'X3'X2'X1'(CG)p)(서열번호 226) 서열의 5' X1, X2 및 X3이다. 일부 구체예에서, (TCG(Nq))y 서열은 팔린드롬 서열로부터 0개, 1개 또는 2개의 염기에 의해 분리되어 있다. 다른 구체예에서, 팔린드롬 서열은 (TCG(Nq))y 서열 전부 또는 일부를 포함하기도 한다. 일부 구체예에서, p가 1인 경우에, X1, X2, X3 및 X4 중 적어도 3개는 각각 A 또는 T이다. 일부 구체예에서, p가 0인 경우에 X1, X2, X3 및 X4 중 적어도 2개는 A 또는 T이다.
일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열을 함유한다(밑줄친 부분은 팔린드롬 서열이다):
일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열식의 서열을 함유할 수도 있다: 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1CGCGX1'(CG)p)z(서열번호 162)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x는 0-3, y는 1-4, w는 -1, 0, 1 또는 2, p는 0 또는 1, q는 0, 1 또는 2, z는 1 내지 20이며, X1과 X1'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치하는 것이다]. 또한, IMP는 염기 길이가 8개 이상인 팔린드롬 서열을 함유하는데, 이 팔린드롬 서열은 적어도 하나의 (X1CGCGX1'(CG)p) 서열 중 처음 (X1CGCGX1')를 함유한다. w가 -1인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 3' 염기는 처음 (X1CGX1'(CG)p) 서열의 5' X1이다. 일부 구체예에서, (TCG(Nq))y 서열은 팔린드롬 서열로부터 0개, 1개 또는 2개의 염기에 의해 분리되어 있다. 다른 구체예에서, 팔린드롬 서열은 (TCG(Nq))y 서열 전부 또는 일부를 포함하기도 한다. 일부 구체예에서, 일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열을 함유한다(밑줄친 부분은 팔린드롬 서열이다):
일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열식의 서열을 함유할 수도 있다: 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(CGX1X1'CG(CG)p)z(서열번호 161)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x는 0-3, y는 1-4, w는 -2, 0, 1 또는 2, p는 0 또는 1, q는 0, 1 또는 2, z는 1 내지 20이며, X1과 X1'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치하는 것이다]. 또한, IMP는 염기 길이가 8개 이상인 팔린드롬 서열을 함유하는데, 이 팔린드롬 서열은 적어도 하나의 (CGX1X1'CG(CG)p) 서열 중 처음 (CGX1X1'CG)를 함유한다. w가 -2인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 말단에서 2번째(즉, 끝에서 2번째) 및 말단(즉, 끝) 3' 염기는 CG 및 처음 (CGX1X1'(CG)p) 서열의 5' CG이다. 일부 구체예에서, (TCG(Nq))y 서열은 팔린드롬 서열로부터 0개, 1개 또는 2개의 염기에 의해 분리되어 있다. 다른 구체예에서, 팔린드롬 서열은 (TCG(Nq))y 서열 전부 또는 일부를 포함하기도 한다. 일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열을 함유한다(밑줄친 부분은 팔린드롬 서열이다):
일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열식의 서열을 함유할 수도 있다: 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1X2CGX3X3'CGX2'X1'(CG)p)z(서열번호 159)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x는 0-3, y는 1-4, w는 -2, -1, 0, 1 또는 2, p는 0 또는 1, q는 0, 1 또는 2, z는 1 내지 20이며, X1과 X1', X2와 X2', 및 X3과 X3'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치하는 것이다]. 또한, IMP는 염기 길이가 10개 이상인 팔린드롬 서열을 함유하는데, 이 팔린드롬 서열은 적어도 하나의 (X1X2CGX3X3'CGX2'X1'(CG)p)(서열번호 217) 서열 중 처음 (X1X2CGX3X3'CGX2'X1')(서열번호 216)를 함유한다. w가 -1인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 3' 염기는 처음 (X1X2CGX3X3'CGX2'X1'(CG)p)(서열번호 217) 서열의 5' X1이다. w가 -2인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 말단에서 2번째(즉, 끝에서 2번째) 및 말단(즉, 끝) 3' 염기는 각각 처음 (X1X2CGX3X3'CGX2'X1'(CG)p)(서열번호 217) 서열의 5' X1 및 X2이다. 일부 구체예에서, (TCG(Nq))y 서열은 팔린드롬 서열로부터 0개, 1개 또는 2개의 염기에 의해 분리되어 있다. 다른 구체예에서, 팔린드롬 서열은 (TCG(Nq))y 서열 전부 또는 일부를 포함하기도 한다. 일부 구체예에서, p가 1인 경우에, X1, X2, 및 X3은 각각 A 또는 T이다. 일부 구체예에서, p가 0인 경우에 X1, X2, 및 X3 중 적어도 2개는 A 또는 T이다. 일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열을 함유한다(밑줄친 부분은 팔린드롬 서열이다):
일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열식의 서열을 함유할 수도 있다: 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1X2CGX2'X1'(CG)p)z(서열번호 156)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x는 0-3, y는 1-4, w는 -2, -1, 0, 1 또는 2, p는 0 또는 1, q는 0, 1 또는 2, z는 1 내지 20이며, X1과 X1', X2와 X2'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치하는 것이다]. 또한, IMP는 염기 길이가 8개 이상인 팔린드롬 서열을 함유하는데, 이 팔린드롬 서열은 적어도 하나의 (X1X2CGX2'X1'(CG)p)z 서열 중 처음 (X1X2CGX2'X1')를 함유한다. w가 -1인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 3' 염기는 처음 (X1X2CGX2'X1'(CG)p) 서열의 5' X1이다. w가 -2인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 말단에서 2번째(즉, 끝에서 2번째) 및 말단(즉, 끝) 3' 염기는 각각 처음 (X1X2CGX2'X1'(CG)p) 서열의 5' X1 및 X2이다. 일부 구체예에서, (TCG(Nq))y 서열은 팔린드롬 서열로부터 0개, 1개 또는 2개의 염기에 의해 분리되어 있다. 다른 구체예에서, 팔린드롬 서열은 (TCG(Nq))y 서열 전부 또는 일부를 포함하기도 한다. 일부 구체예에서, X1 및 X2는 각각 A 또는 T이다.
일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열을 함유한다(밑줄친 부분은 팔린드롬 서열이다):
일부 구체예에서, 서열번호 156의 서열식을 함유하는 IMP 중의 X1X2는 AA가 아닌 것이다. 일부 구체예에서, 서열번호 156의 서열식을 함유하는 IMP 중의 X1은 A가 아닌 것이다. 따라서, 일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열을 함유한다(밑줄친 부분은 팔린드롬 서열이다):
일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열식의 서열을 함유할 수도 있다: 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1X2X3X4X5CGX5'X4'X3'X2'X1'(CG)p)z(서열번호 160)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x는 0-3, y는 1-4, w는 -3, -2, -1, 0, 1 또는 2, p는 0 또는 1, q는 0, 1 또는 2, z는 1 내지 20이며, X1과 X1', X2와 X2', X3과 X3', X4와 X4' 및 X5 및 X5'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치하는 것이다]. 또한, IMP는 염기 길이가 12개 이상인 팔린드롬 서열을 함유하는데, 이 팔린드롬 서열은 적어도 하나의 (X1X2X3X4X5CGX5'X4'X3'X2'X1'(CG)p)(서열번호 219) 서열 중 처음 (X1X2X3X4X5CGX5'X4X3'X2'X1')(서열번호 218)을 함유한다. w가 -1인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 3' 염기는 처음 (X1X2X3X4X5CGX5'X4'X3'X2'X1'(CG)p)(서열번호 219) 서열의 5' X1이다. w가 -2인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 말단에서 2번째(즉, 끝에서 2번째) 및 말단(즉, 끝) 3' 염기는 각각 처음 (X1X2X3X4X5CGX5'X4'X3'X2'X1'(CG)p)(서열번호 219) 서열의 5' X1 및 X2이다. w가 -3인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 말단에서 3번째(즉, 끝에서 3번째), 말단에서 2번째(즉, 끝에서 2번째) 및 말단(즉, 끝) 3' 염기는 각각 처음 (X1X2X3X4X5CGX5'X4'X3'X2'X1'(CG)p)(서열번호 219) 서열의 5' X1, X2 및 X3이다. 일부 구체예에서, (TCG(Nq))y 서열은 팔린드롬 서열로부터 0개, 1개 또는 2개의 염기에 의해 분리되어 있다. 다른 구체예에서, 팔린드롬 서열은 (TCG(Nq))y 서열 전부 또는 일부를 포함하기도 한다. 일부 구체예에서, X1, X2, X3, X4 및 X5 중 적어도 3개는 각각 A 또는 T이다. 일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열을 함유한다(밑줄친 부분은 팔린드롬 서열이다):
일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열식의 서열을 함유할 수도 있다: 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1X2CGCGX2'X1'(CG)p)z(서열번호 163)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x는 0-3, y는 1-4, w는 -2, -1, 0, 1 또는 2, p는 0 또는 1, q는 0, 1 또는 2, z는 1 내지 20이며, X1과 X1' 및 X2와 X2'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치하는 것이다]. 또한, IMP는 염기 길이가 8개 이상인 팔린드롬 서열을 함유하는데, 이 팔린드롬 서열은 적어도 하나의 (X1X2CGCGX2'X1'(CG)p)(서열번호 220) 서열 중 처음 (X1X2CGCGX2'X1')를 함유한다. w가 -1인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 3' 염기는 처음 (X1X2CGCGX2'X1'(CG)p)(서열번호 220) 서열의 5' X1이다. w가 -2인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 말단에서 2번째(즉, 끝에서 2번째) 및 말단(즉, 끝) 3' 염기는 각각 처음 (X1X2CGCGX2'X1'(CG)p)(서열번호 220) 서열의 5' X1 및 X2이다. 일부 구체예에서, (TCG(Nq))y 서열은 팔린드롬 서열로부터 0개, 1개 또는 2개의 염기에 의해 분리되어 있다. 다른 구체예에서, 팔린드롬 서열은 (TCG(Nq))y 서열 전부 또는 일부를 포함하기도 한다. 일부 구체예에서, X1 및 X2는 각각 A 또는 T이다. 일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열을 함유한다(밑줄친 부분은 팔린드롬 서열이다):
5'-TCGTCGATCGCGATCGACGA (서열번호 144)
일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열식의 서열을 함유할 수도 있다: 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1X2X3CGCGX3'X2'X1'(CG)p)z(서열번호 164)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x는 0-3, y는 1-4, w는 -3, -2, -1, 0, 1 또는 2, p는 0 또는 1, q는 0, 1 또는 2, z는 1 내지 20이며, X1과 X1', X2와 X2' 및 X3과 X3'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치하는 것이다]. 또한, IMP는 염기 길이가 10개 이상인 팔린드롬 서열을 함유하는데, 이 팔린드롬 서열은 적어도 하나의 (X1X2X3CGCGX3'X2'X1'(CG)p)(서열번호 222) 서열 중 처음 (X1X2X3CGX3'X2'X1')(서열번호 221)를 함유한다. w가 -1인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 3' 염기는 처음 (X1X2X3CGCGX3'X2'X1'(CG)p)(서열번호 222) 서열의 5' X1이다. w가 -2인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 말단에서 2번째(즉, 끝에서 2번째) 및 말단(즉, 끝) 3' 염기는 각각 처음 (X1X2X3CGCGX3'X2'X1'(CG)p)(서열번호 222) 서열의 5' X1 및 X2이다. w가 -3인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 말단에서 3번째(즉, 끝에서 3번째), 말단에서 2번째(즉, 끝에서 2번째) 및 말단(즉, 끝) 3' 염기는 각각 처음 (X1X2X3CGX3'X2'X1'(CG)p)(서열번호 222) 서열의 5' X1, X2 및 X3이다. 일부 구체예에서, (TCG(Nq))y 서열은 팔린드롬 서열로부터 0개, 1개 또는 2개의 염기에 의해 분리되어 있다. 다른 구체예에서, 팔린드롬 서열은 (TCG(Nq))y 서열 전부 또는 일부를 포함하기도 한다. 일부 구체예에서, p가 1인 경우에, X1, X2 및 X3은 각각 A 또는 T이다. 일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열을 함유한다(밑줄친 부분은 팔린드롬 서열이다):
5'-TCGTCGAATCGCGATTCGACGA (서열번호 145).
일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열식의 서열을 함유할 수도 있다: 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(CGX1X2X2'X1'CG(CG)p)z(서열번호 165)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x는 0-3, y는 1-4, w는 -2, 0, 1 또는 2, p는 0 또는 1, q는 0, 1 또는 2, z는 1 내지 20이며, X1과 X1', 및 X2와 X2'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치하는 것이다]. 또한, IMP는 염기 길이가 8개 이상인 팔린드롬 서열을 함유하는데, 이 팔린드롬 서열은 적어도 하나의 (CGX1X2X2'X1'CG(CG)p)(서열번호 223) 서열 중 처음 (CGX1X2X2'X1'CG)를 함유한다. w가 -2인 IMP에서, (TCG(Nq))y 서열의 말단에서 2번째(즉, 끝에서 2번째) 및 말단(즉, 끝) 3' 염기는 CG 및 처음 (CGX1X2X2'X1'CG(CG)p)(서열번호 223) 서열의 5' CG이다. 일부 구체예에서, (TCG(Nq))y 서열은 팔린드롬 서열로부터 0개, 1개 또는 2개의 염기에 의해 분리되어 있다. 다른 구체예에서, 팔린드롬 서열은 (TCG(Nq))y 서열 전부 또는 일부를 포함하기도 한다. 일부 구체예에서, X1 및 X2는 각각 A 또는 T이다. 일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열을 함유한다(밑줄친 부분은 팔린드롬 서열이다):
5'-TCGTCGCGATATCGCGACGA (서열번호 146).
y가 2 이상인 본 명세서에 기술된 임의의 모티프(즉, 서열번호 155 내지 165)를 함유하는 IMP에서, (TCG(Nq))의 각 y 반복체에 존재하는 (Nq)는 독립적으로 선택될 수 있다. 예를 들어, y가 2인 IMP에서, 처음 TCG(Nq)는 N이 A, q가 1이며, 제2 TCG(Nq)는 q가 0일 수 있는데, 이러한 경우에 IMP의 이 부분은 ...TCGATCG...일 것이다. 일부 구체예에서의 본 명세서에 기술된 임의의 모티프(서열번호 155 내지 165)를 함유하는 IMP 중 일부 구체예에서, x는 0 또는 1인 것이 바람직하다. 본 명세서에 기술된 임의의 모티프(즉, 서열번호 155 내지 165)를 함유하는 IMP의 일부 구체예에서, y는 1 또는 2인 것이 바람직하다. 본 명세서에 기술된 임의의 모티프(즉, 서열번호 155 내지 165)를 함유하는 IMP의 일부 구체예에서, w는 0인 것이 바람직하다. 본 명세서에 기술된 임의의 모티프(즉, 서열번호 155 내지 165)를 함유하는 IMP의 일부 구체예에서, z는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8인 것이 바람직하다.
전술한 바와 같이, IMP는 염기 길이가 적어도 8개인 팔린드롬 서열을 1개 이상 함유한다. 일부 구체예에서, IMP는 적어도 다음과 같은 길이(염기), 즉 10개, 12개, 14개, 16개, 18개, 20개, 22개, 24개, 26개, 28개,30개 중에서 선택되는 적어도 하나의 팔린드롬 서열을 함유한다. 일부 구체예에서, 팔린드롬 서열은 IMP에서 적어도 1회 이상 반복된다. 일부 구체예에서, 팔린드롬 서열은 존재한다면 (TCG(Nq))y 서열의 5'측 염기를 포함하기도 한다.
면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 변형을 함유할 수도 있다. IMP의 변형에는 당업계에 공지된 임의의 변형이 포함되는데, 그 예에는 3'OH 또는 5'OH 기의 변형, 뉴클레오타이드 염기의 변형, 당 성분의 변형 및 포스페이트 기의 변형이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 다양한 변형에 대해서는 이하에 설명될 것이다. 변형 염기는 이러한 변형 염기가 왓슨 크리크 염기쌍을 통하여 자신의 천연 상보체에 대해 동일한 특이성을 유지한다면 IMP의 팔린드롬 서열에 포함될 수 있다(예컨대, 이 IMP의 팔린드롬 부분이 그대로 자기 상보성이다).
IMP는 선형 또는 환형일 수 있고, 또는 원형 부분을 포함하고(하거나) 헤어핀 루프를 포함할 수도 있다. 일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 환형 서열을 함유하는 것이다(밑줄친 부분은 팔린드롬 서열이다):
(서열번호 181)
IMP는 일본쇄 또는 이본쇄 DNA일 수 있을 뿐만 아니라, 일본쇄 또는 이본쇄 RNA 또는 기타 다른 변형된 폴리뉴클레오타이드일 수 있다. 일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 이본쇄 서열을 함유하기도 한다:
5'-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT/5'-ATCATCTCGAACGTTCGACGA (서열번호 27/서열번호 29) (이본쇄 서열은 서열번호 182이다);
5'-TCG*TCG*AACG*TTCG*AG*ATG*AT/5'-ATCATCTCGAACGTTCGACGA (G*= 7-데아자-8-아자-dG, 서열번호 187/서열번호 29) (이본쇄 서열은 서열번호 183이다);
5'-TCGTCGA*A*CGTTCGA*GA*TGA*T/5'-ATCATCTCGAACGTTCGACGA (A*= 2-아미노-dA, 서열번호 188/서열번호 29) (이본쇄 서열은 서열번호 184이다);
5'-TCGTCGAA*CGT*TCGAGATGAT/5'-ATCATCTCGAACGTTCGACGA (A* = 2-아미노-dA; T* = 2-티오-dT, 서열번호 189/서열번호 29) (이본쇄 서열은 서열번호 185이다);
5'-TCGTCGA*A*CGT*T*CGAGATGAT/5'-ATCATCTCGAACGTTCGACGA (A* = 2-아미노-dA; T* = 2-티오-dT, 서열번호 190/서열번호 29) (이본쇄 서열은 서열번호 186이다).
IMP는 자연발생 염기 또는 변형된 비자연발생 염기를 함유할 수 있고, 변형된 당, 포스페이트 및/또는 말단을 함유할 수도 있다. 예를 들어, 포스포디에스테르 결합 이외에, 포스페이트 변형에는 메틸 포스포네이트, 포스포로티오에이트, 포스포아미데이트(가교 또는 비가교성), 포스포트리에스테르 및 포스포로디티오에이트가 이에 제한됨이 없이 포함되며, 임의 조합이 사용될 수도 있다. 기타 다른 비포스페이트 결합도 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 골격쇄만을 함유하는 것이다. 일부 구체예에서, IMP는 포스페이트 골격쇄 중에 복합 포스페이트 결합, 예컨대 포스포디에스테르 결합과 포스포로티오에이트 결합의 복합을 함유할 수 있다. 예컨대, 일부 구체예에서 IMP는 다음과 같은 서열을 함유하는 것이다("s"는 포스포로티오에이트 결합을 나타낸다):
5'-TCGTCGAAACGTTTCGACAGT (서열번호 62), 모두 포스포로티오에이트 결합;
5'-TCGTTCGAACGTTCGAACGA (서열번호 88), 모두 포스포로티오에이트 결합;
5'-TsCsGsTTCGAACGTTCGsAsAsCsGsA (서열번호 89), 포스포로티오에이트/포스포디에스테르 키메라;
5'-GsGsTCGAACGTTCGAGsGsGsGsGsG (서열번호 26), 포스포로티오에이트/포스포디에스테르 키메라;
5'-TsCsGsTCGAACGTTCGAGsGsGsGsGsG (서열번호 33), 포스포로티오에이트/포스포디에스테르 키메라;
5'-TsCsGsTGCATCGATGCAGGsGsGsGsG (서열번호 34), 포스포로티오에이트/포스포디에스테르 키메라.
당업계에 공지된 당 변형, 예컨대 2'-알콕시-RNA 유사체, 2'-아미노-RNA 유사체, 2'-플루오로-DNA 및 2'-알콕시 또는 아미노-RNA/DNA 키메라 및 본 명세서에 기술된 기타 다른 변형이 또한 제공될 수 있고, 임의의 포스페이트 변형과 함께 조합될 수 있다. 염기 변형(이하에 추가 논의됨)의 예에는, IMP의 사이토신 C-5 및/또는 C-6으로 전자 끄는 잔기의 첨가(예컨대, 5-브로모사이토신, 5-클로로사이토신, 5-플루오로사이토신, 5-요오도사이토신) 및 IMP의 우라실 C-5 및/또는 C-6으로 전자 끄는 잔기의 첨가(예컨대, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-플루오로우라실, 5-요오도우라실)가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다(예컨대, 국제 특허출원 WO 99/62923 참조). 전술한 바와 같이, IMP의 팔린드롬 서열 중에 대한 염기 변형의 사용은 왓슨 크리크 염기쌍에 관여하는 염기의 자기 상보능을 방해하지 않아야 한다. 하지만, 팔린드롬 서열 외에서의 변형 염기에는 이러한 제한없이 사용될 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, IMP는 다음과 같은 서열을 함유한다:
5'-uCGuCGAACGTTCGAGATG (서열번호: 21),u=2'-0-메틸-우리딘 ;
5'-TcGTCGAACGTTCGAGATG (서열번호: 22),c=2'-O-메틸-시티딘;
5'-TCGTcGAACGTTCGAGATG (서열번호: 23),c=2'-O-메틸-시티딘;
5'-TBGTBGAABGTTBGAGATGAT (서열번호: 28), B=5-브로모-2'-데옥시시티딘.
IMP는 당해 기술분야에 공지된 기술 및 핵산 합성 장치를 사용하여 합성할 수 있는데, 그 예에는 효소법, 화학법 및 보다 큰 올리고뉴클레오타이드 서열의 분해법이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다[예컨대, Ausubel et al.(1987); 및 Sambrook et al.(1989) 참조]. 효소적으로 조립되는 경우에, 각 유닛들은 T4 DNA 또는 RNA 리가제와 같은 리가제를 이용하여 결합시킬 수 있다(미국 특허 5,124,246). 올리고뉴클레오타이드 분해는 올리고뉴클레오타이드를 뉴클레아제에 노출시켜 달성할 수 있다(미국 특허 4,650,675).
IMP는 또한 통상적인 폴리뉴클레오타이드 분리 절차에 따라 분리할 수도 있다. 이러한 절차에는 뉴클레오타이드 공유 서열을 검출하는 게놈 또는 cDNA 라이브러리에 대한 프로브의 하이브리드화, 공유된 구조 특징을 검출하는 발현 라이브러리의 항체 선별 및 폴리머라제 연쇄 반응에 의한 특정 천연 서열의 합성이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
환형의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 분리하거나, 재조합법을 통해 합성하거나 또는 화학합성할 수 있다. 분리 또는 재조합법을 통해 환형 IMP가 수득되는 경우에는 IMP는 플라스미드인 것이 바람직하다. 작은 환형 올리고뉴클레오타이드의 화학적 합성은 문헌에 기술된 임의의 방법을 사용하여 수행할 수 있다[예컨대, Gao et al.(1995) Nucleic Acids Res. 23: 2025-2029; and Wang et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 2326-2333 참조].
대부분의 IMP의 이본쇄(즉, 이중 가닥)와 헤어핀 형태는 동적 평형상태에 있는 것으로서, 일반적으로 낮은 폴리뉴클레오타이드 농도와 고온에서는 헤어핀 형태가 선호된다. 가닥간 또는 가닥내 공유 가교결합은 열, 이온, pH 및 농도에 의해 유도되는 형태 변형에 대하여 각각 이본쇄 또는 헤어핀 안정성을 증가시킨다. 화학적 가교결합은 폴리뉴클레오타이드를 물리화학적 및 생물학적 특성용의 이본쇄 또는 헤어핀 형태로 고정시키는데 사용될 수 있다. 형태학적으로 동종성이고 가장 활성적인 형태(이본쇄 또는 헤어핀 형태)로 "고정된", 가교결합된 IMP는 이의 비가교결합성 대응물 보다 뛰어난 활성일 가능성이 많다. 따라서, 본 발명의 일부 IMP는 가닥간 및/또는 가닥내 공유 가교결합을 함유하는 것이다.
이본쇄 DNA를 화학적으로 가교결합시키는 방법에는 다양한 방법이 당해 기술분야에 공지되어 있다. 가교결합된 폴리뉴클레오타이드 산물이 목적한 면역제어 활성을 보유하는 한 어떤 가교결합법도 사용할 수 있다.
예를 들어, 이본쇄 또는 헤어핀 말단에 존재하는 2개의 마주보는 티미딘 사이에 이황화 가교를 형성시키는 방법이 있다. 이러한 가교결합 방법에서, 당해의 올리고뉴클레오타이드는 5'-DMT-N3-(tBu-SS-에틸)티미딘-3'-포스포아미다이트("T*")로 합성한다. 이황화 가교를 형성시키기 위하여, 혼합된 이황화 결합을 환원시키고, 올리고뉴클레오타이드를 정제한 뒤, 가닥을 하이브리드화하고 화합물을 공기산화시켜, 헤어핀 형태인 경우에는 가닥내 가교결합을 형성시키고, 이본쇄 형태인 경우에는 가닥간 가교결합을 형성시킨다. 또는, 먼저 올리고뉴클레오타이드를 하이브리드화한 뒤, 환원, 정제 및 공기산화시킨다. 이러한 방법 및 기타 다른 방법에 대해서는 문헌[예컨대, Glick et al. (1991) J. Org. Chem. 56: 6746-6747, Glick et al. (1992) J. Am. Chem. Soc. 114: 5447-5448, Goodwin et al. (1994) Tetrahedron Letters 35: 1647-1650, Wang et al. (1995) J. 4in. Chem. Soc. 117: 2981-2991, Osborne et al. (1996) Bioorgafaic & Medicinal Chemistry Letters 6: 2339- 2342 and Osborne et al. (1996) J. Am. Chem. Soc. 118: 11993-12003]에 설명되어 있다.
가교결합을 위해 5'-DMT-N3-(tBu-SS-에틸)티미딘-3'-포스포아미다이트("T*")가 포함될 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열의 예에는 다음과 같은 것이 있다. 서열번호 27 유사체의 3' 말단에 T*의 도입(5'-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT*-3', 서열번호 27 유사체 1) 및 서열번호 29 유사체의 5' 말단에 T*의 도입(5'-T*TCATCTCGAACGTTCGACGA-3', 서열번호 29 유사체1)은 이 두 가닥의 이본쇄 중에서 서열번호 27 유사체의 3' 말단에 가교결합이 형성되도록 한다. 서열번호 113 유사체의 두 위치에서의 T* 도입은 2개의 가교결합을 이본쇄를 형성시키거나 단일 가교결합을 통해 헤어핀 형태를 유지시킬 수 있다. 예를 들어, 서열 5'-TCGT*AACGTTCGAACGTTCGAACGTTT*-3(서열번호 113 유사체 1)의 헤어핀 구조로의 폴딩과 치환된 T 잔기에서의 가교결합 형성은 다음과 같은 2차 구조를 가진 가교결합된 폴리뉴클레오타이드를 생성한다:
이와 같이 동일한 서열의 헤어핀 구조 또는 이본쇄 구조는 두 위치(3' 말단 및 5' 말단에서부터 4번째 염기)가 억압되기는 하지만 자유인 5'-TCG를 보유할 것이다.
또 다른 가교결합 방법은 이본쇄 또는 헤어핀 구조 내의 분지(offset) 잔기 사이에 이황화 가교를 형성시키는 방법이다. 이러한 가교결합법에서는 당해의 올리고뉴클레오타이드가 전환가능한 뉴클레오사이드(시판품, 예컨대 글렌 리서치 제품)로 합성된다. 이 방법은 다른 염기도 사용가능하지만 A-A 이황화 또는 C-A 이황화 가교 및 결합을 이용한다. 이황화물로 변형된 폴리뉴클레오타이드를 형성시키기 위해, 전환가능한 뉴클레오사이드를 함유하는 폴리뉴클레오타이드를 시스타민(또는 다른 이황화물 함유 아민)과 반응시킨다. 이황화물 가교를 형성시키기 위해서는, 혼합된 이황화 결합을 환원시키고, 올리고뉴클레오타이드를 환원시킨 뒤, 가닥을 하이브리드화한 뒤, 화합물을 공기 산화시켜 헤어핀 형태인 경우에는 가닥내 가교결합을 형성시키고, 이본쇄 형태인 경우에는 가닥간 가교결합을 형성시킨다. 또는, 먼저 올리고뉴클레오타이드를 하이브리드화한 뒤, 환원, 정제 및 공기산화시킬 수도 있다. 이러한 방법에 대해서는 문헌[예컨대, Ferentz et al. (1991) J ; Am. Chem. Soc. 113: 4000-4002 and Ferentz et al. (1993) J. Am. Chem. Soc. 115: 9006-9014]에 설명되어 있다.
분지성 N6-시스타민-2'-dA(A*) 잔기가 이본쇄 가교결합에 사용되는 폴리뉴클레오타이드 서열의 예에는 다음과 같은 것이 있다. 서열 5'-TCGTCGAACGTTCGAGA*TGAT-3'(서열번호 191)의 3' 말단 및 이의 상보체인 5'-ATCA*TCTCGAACGTTCGACGA-3'(서열번호 192)의 5' 말단에 A*의 도입은 이 두 가닥의 이본쇄 중에서 서열번호 191의 3' 말단에 가교결합을 형성시킨다. 이러한 변형은 또한 헤어핀 구조를 가교결합시키는 데에도 사용될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드와 변형 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 기술은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 포스포디에스테르 결합을 함유하는 자연발생의 DNA 또는 RNA는 일반적으로 3' 말단이 고체 지지체에 부착되어 있는 성장하는 올리고뉴클레오타이드의 5'-하이드록시 기에 적당한 뉴클레오사이드 포스포아미다이트를 연속으로 커플링시킨 뒤, 중간체인 포스파이트 트리에스테르를 포스페이트 트리에스테르로 산화시켜 제조한다. 목적하는 폴리뉴클레오타이드 서열이 합성되었으면, 지지체로부터 폴리뉴클레오타이드를 분리시키고, 포스페이트 트리에스테르 기를 보호기제거하여 포스페이트 디에스테르를 수득하며, 뉴클레오사이드 염기는 수성 암모니아 또는 다른 염기를 이용하여 탈보호한다. 예를 들어, 문헌[Beaucage (1993) "Oligodeoxyribonucleotide Synthesis"in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, Totowa, NJ ; Warner et al. (1984) DNA 3: 401 및 미국 특허 4,458, 066]을 참조할 수 있다.
IMP는 또한 포스페이트 변형된 폴리뉴클레오타이드도 함유할 수 있는데, 이 중 일부는 폴리뉴클레오타이드를 안정화시키는 것으로 알려져 있다. 따라서, 일부 구체예에는 안정화된 면역제어성 폴리뉴클레오타이드가 포함된다. 변형된 포스페이트 결합 또는 비포스페이트 결합을 함유하는 폴리뉴클레오타이드의 합성도 역시 당해기술분야에 공지되어 있다. 예컨대, 문헌[Matteucci (1997) "Oligonucleotide Analogs: an Overview"in Oligonucleotides as Therapeutic Agents, (D. J. Chadwick and G. Cardew, ed. ) John Wiley and Sons, New York, NY]을 참조할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 중에서 당이나 당 유사체 부에 부착될 수 있는 인 유도체(또는 변형된 포스페이트 기)는 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 알킬포스포노에이트, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포아미데이트 등일 수 있다. 이러한 포스페이트 유사체의 제조 및 이의 뉴클레오타이드, 변형된 뉴클레오타이드 및 올리고뉴클레오타이드로의 도입 자체는 공지되어 있으므로, 본 명세서에 상세하게 기술할 필요는 없을 것이다[Peyrottes et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 1841-1848; Chaturvedi et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 2318-2323; and Schultz et al. (1996) Nucleic Acids Res. 24: 2966-2973]. 예를 들어, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오타이드의 합성은 산화 단계 대신에 황화 단계를 이용하는 것을 제외하고는 전술한 자연발생의 올리고뉴클레오타이드 합성법과 유사하게 실시할 수 있다[Zon(1993) "Oligonucleoside Phosphorothioates"in Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties (Agrawal, ed.) Humana Press, pp. 165-190)]. 이와 마찬가지로, 다른 포스페이트 유사체의 합성법도 개시되어 있는데, 예컨대 포스포트리에스테르는 문헌[Miller et al. (1971) JACS 93: 6657-6665]에, 비가교성 포스포아미데이트는 문헌[Jager et al. (1988) Biochem. 27: 7247-7246]에, N3' 내지 P5' 포스포아미디에이트는 문헌Nelson et al. (1997) JOC 62: 7278-7287]에, 포스포로디티오에이트는 미국 특허 5,453,496에 기술되어 있다. 기타 다른 비인계 변형 올리고뉴클레오타이드도 사용할 수 있다(Stirchak et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 6129-6141). 포스포로티오에이트 골격쇄를 보유한 폴리뉴클레오타이드는 포스포디에스테르 골격쇄를 보유한 폴리뉴클레오타이드 보다 우수한 면역원성이며, 숙주에게 주사된 후 보다 큰 분해내성을 보일 수 있다(Braun et al. (1988) J. Immunol. 141: 2084-2089; and Latimer et al. (1995) Mol. Immunol. 32: 1057-1064).
본 발명에 사용된 IMP는 1종 이상의 리보뉴클레오타이드(유일한 또는 주요 당 성분으로서 리보스를 함유하는 것), 데옥시리보뉴클레오타이드(주요 당 성분으로서 데옥시리보스를 함유하는 것)를 포함하거나 당해기술분야에 공지된 바와 같이 변형 당 또는 당 유사체가 IMP에 포함될 수도 있다. 따라서, 리보스 및 데옥시리보스 외에 당 잔기는 펜토스, 데옥시펜토스, 헥소스, 데옥시헥소스, 글루코스, 아라비노스, 크실로스, 릭소스, 및 당 "유사체"인 사이클로펜틸 기일 수 있다. 당은 피라노실 또는 푸라노실 형태일 수 있다. IMP에서, 당 잔기는 리보스, 데옥시리보스, 아라비노스 또는 2'-O-알킬리보스의 푸라노사이드인 것이 바람직하며, 이러한 당은 α 또는 β의 아노머 형태인 각각의 헤테로시클릭 염기에 부착될 수 있다. 당 변형에는 2'-알콕시-RNA 유사체, 2'-아미노-RNA 유사체, 2'-플루오로-DNA 및 2'-알콕시 또는 아미노-RNA/DNA 키메라가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예를 들어, IMP의 당 변형에는 2'-O-메틸-우리딘 및 2'-O-메틸-시티딘이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 당이나 당 유사체와, 이러한 당이나 당 유사체가 헤테로시클릭 염기(핵산 염기)에 부착된 각 "뉴클레오사이드"의 제법 자체는 공지되어 있는 바, 임의의 특정 실시예에 포함될 수 있는 정도 외에는 본 명세서에 상세히 설명될 필요는 없다. 당 변형도 또한 이루어질 수 있고 IMP 제조시 임의의 포스페이트 변형과 함께 조합될 수 있다.
IMP에 포함되는 헤테로시클릭 염기 또는 핵산 염기는 자연발생의 주요 퓨린 및 피리미딘 염기(즉, 전술한 바와 같은 우라실, 티민, 시토신, 아데닌 및 구아닌) 뿐만 아니라 자연발생 변형 및 합성 변형을 보유한 전술한 주요 염기일 수 있다. 즉, IMP에는 2'-데옥시우리딘 및/또는 2-아미노-2'-데옥시아데노신이 포함될 수 있다.
당업자는 당해 기술분야에서 이용할 수 있는 다양한 헤테로시클릭 염기와 다양한 당 잔기( 및 당 유사체)를 함유하는 "합성" 비천연 뉴클레오사이드가 다양하게 존재하며, 본 발명의 타 기준에 충족되는 한 자연발생의 핵산이 보유한 주요 5가지 염기 성분 외에 다른 1종 또는 여러 종류의 헤테로시클릭 염기가 IMP에 포함될 수 있음을 잘 알고 있을 것이다. 하지만, IMP의 헤테로시클릭 염기에는 우라실-5-일, 시토신-5-일, 아데닌-7-일, 아데닌-8-일, 구아닌-7-일, 구아닌-8-일, 4-아미노피롤로[2.3-d] 피리미딘-5-일, 2-아미노-4-옥소피롤로[2,3-d]피리미딘-5-일, 2-아미노-4-옥소피롤로[2.3-d]피리미딘-3-일 기가 이에 제한됨이 없이 포함되고, 여기서 퓨린은 9번 위치를 통해 IMP의 당 잔기에 부착되고, 피리미딘은 1번 위치를 통해 부착되며, 피롤로피리미딘은 7번 위치를 통해 부착되고, 피라졸로피리미딘은 1번 위치를 통해 부착되는 것이 바람직하다.
IMP는 적어도 하나의 변형 염기를 함유할 수 있다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, "변형 염기"는 "염기 유사체"와 동의어로서, 예컨대 "변형 시토신"은 "시토신 유사체"와 동의어이다. 이와 마찬가지로, "변형" 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드 또는 뉴클레오타이드 "유사체"와 동의어로서 본 명세서에 정의되고 있다. 염기 변형의 예에는, IMP의 5-C 및/또는 C-6에 전자 끄는 잔기의 첨가가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 전자 끄는 잔기는 할로겐인 것이 발마직하다. 이러한 변형 시토신에는 아자시토신, 5-브로모시토신, 브로모우라실, 5-클로로시토신, 염소화된 시토신, 시클로시토신, 시토신 아라비노사이드, 5-플루오로시토신, 플루오로피리미딘, 플루오로우라실, 5,6-디하이드로시토신, 5-요오도시토신, 하이드록시우레아, 요오도우레아, 요오도우라실, 5-니트로시토신, 우라실 및 임의의 다른 피리미딘 유사체 또는 변형 피리미딘이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 염기 변형의 다른 예에는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드 중의 우라실의 C-5 및/또는 C-6에 대한 전자 끄는 잔기의 첨가가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 여기서, 전자 끄는 잔기는 할로겐인 것이 바람직하다. 이러한 변형 우라실에는 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-플루오로우라실, 5-요오도우라실이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
염기 변형의 다른 예에는 염기에 대한 하나 이상의 티올 기의 첨가가 포함되는데, 그 예에는 2-아미노-아데닌, 6-티오-구아닌, 2-티오-티민, 4-티오-티민, 5-프로피닐-우라실 및 4-티오-우라실이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 염기 변형의 다른 예에는 N4-에틸시토신, 7-데아자구아닌, 7-데아자-8-아자구아닌 및 5-하이드록시시토신이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다[예컨대, Kandimalla et al. (2001) Bioorg.Med.Chem. 9:807-813 참조]. 일부 구체예에서, IMP에는 변형 염기를 보유한 다음과 같은 서열이 포함된다(밑줄친 부분은 팔린드롬 서열이다):
실시예 1에 예시된 바와 같이, 저농도에서 이본쇄 형태를 유지하는 IMP는 인간 PBMC로부터 IFN-α 생산을 자극할 수 있는 경향이 있다. 가교결합을 통한 이본쇄 폴리뉴클레오타이드 형태의 안정화는 전술한 바와 같다. 상보성 서열과 이본쇄 형태일 때, 특정 변형 염기도 이본쇄의 안정성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 2-아미노-dA(시판품, 예를 들어, 글렌 리서치 제품)는 dA와 T 사이에 형성되는 바와 같은, 2개의 수소 결합 대신에 T와 3개의 수소 결합을 형성한다. 서열번호 27의 유사체인 서열번호 188은 서열번호 27의 5개의 dA 염기 대신에 5개의 2-아미노-dA 염기를 함유하고 서열번호 27 보다 더 강력한 자체 이본쇄를 형성한다(크기 배제 크로마토그래피 데이터). 이러한 변형 염기의 도입은 변형 당 약 3℃의 Tm을 상승시킨다. 실시예 1을 통해 본 명세서에 입증되듯이, 서열번호 188은 또한 인간 PBMC를 0.8㎍/ml의 IMP로 처리했을 때 서열번호 27 보다 많은 IFN-α 생산을 유도했다. 이본쇄 서열번호 884는 일본쇄 서열번호 188 보다 약 3배 많은 IFN-α를 유도했다.
염기 변형된 뉴클레오사이드의 제조 및 이러한 염기 변형된 뉴클레오사이드를 이용한 변형 올리고뉴클레오타이드의 합성에 대해서는 예컨대 미국 특허 4,910,300, 4,938,882 및 5,093,232에 설명되어 있다. 이러한 염기 변형된 뉴클레오사이드는 화학 합성을 통해 올리고뉴클레오타이드의 말단이나 내부 위치로 도입될 수 있도록 설계될 수 있다. 이와 같이 올리고뉴클레오타이드의 말단이나 내부 위치에 존재하는 염기 변형된 뉴클레오사이드는 펩타이드 또는 다른 항원의 부착 부위로서 작용할 수 있다. 당 잔기는 변형된 뉴클레오사이드에 대해서도 개시되어 있으며(예컨대, 미국 특허 4,849,513, 5,015,733, 5,118,800, 5,118,802 등), 유사하게 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 대략 다음과 같은 길이(염기 또는 염기쌍의 길이) 중 임의의 길이 미만인 것이다: 10,000; 5,000; 2500; 2000; 1500; 1250; 1000; 750; 500; 300; 250; 200; 175; 150; 125; 100; 75; 60; 50; 40; 30; 25; 20; 15; 14; 13; 12; 11; 10. 일부 구체예에서, 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 대략 다음과 같은 길이(염기 또는 염기쌍 길이) 중 임의의 길이 보다 큰 것이다: 10; 11; 12; 13; 14; 15; 20; 25; 30; 40; 50; 60; 75; 100; 125; 150; 175; 200; 250; 300; 350; 400; 500; 750; 1000; 2000; 5000; 7500; 10000; 20000; 50000. 또는, 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 상한선이 10,000; 5,000; 2500; 2000; 1500; 1250; 1000; 750; 500; 300; 250; 200; 175; 150; 125; 100; 75; 60; 50; 40; 30; 25; 20; 15; 14; 13; 12; 11; 10 이고, 독립적으로 선택되는 하한선이 10; 11; 12; 13; 14; 15; 20; 25; 30; 40; 50; 60; 75; 100; 125; 150; 175; 200; 250; 300; 350; 400; 500; 750; 1000; 2000; 5000; 7500인 범위이되, 하한선이 상한선 보다 적은 크기인 임의의 크기일 수 있다. 일부 구체예에서, IMP는 염기 길이가 약 200 또는 그 미만인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 본 명세서에 기술된 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 제조하는 방법도 제공한다. 이러한 방법은 본 명세서에 기술된 방법 중 임의의 방법일 수 있다. 예를 들어, 이 방법은 IMP를 합성하는 것(예컨대, 고상 합성법을 이용하여)일 수 있고, 추가로 임의의 정제 단계를 포함할 수도 있다. 정제 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있다. 기타 다른 제조방법에는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드와 항원을 조합시키는 방법이 포함된다.
항원
모든 항원은 면역제어성 폴리뉴클레오타이드와 공동투여되고(되거나) 면역제어성 폴리뉴클레오타이드와 항원을 함유하는 조성물( 및 이러한 조성물의 제법)에 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 항원은 알레르기항원이다. 재조합 알레르기항원의 예는 표 1에 제시하였다. 다수의 알레르기항원의 제법은 당업계에 공지되어 있는데, 예컨대, 돼지풀 화분 알레르기항원 항원 E(Amb a I) (Rafnar et al. (1991) J. Biol. Chem. 266: 1229-1236), 목초 알레르기항원 Lol p 1 (Tamborini et al. (1997) Eur. J. Biochem. 249: 886-894), 주요 먼지 진드기 알레르기항원 Der pI 및 Der PII (Chua et al. (1988) J. Exp. Med. 167: 175-182; Chua et al. (1990) Int. Arch. Allergy Appl. Irnmunol. 91: 124-129), 집고양이 알레르기항원 Fel d I (Rogers et al. (1993) Mol. Immunol. 30: 559-568), 흰자작나무 화분 Bet vl (Breiteneder et al. (1989) EMBO J. 8: 1935-1938), 삼나무 알레르기항원 Cry j1 및 Cry j2 (Kingetsu et al. (2000) Immunology 99: 625-629), 및 기타 다른 나무 화분 유래의 단백질 항원(Elsayed et al. (1991) Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 204: 17-31)이 이에 국한됨이 없이 포함된다. 제시된 바와 같이, 나무 유래의 알레르기항원, 예컨대 자작나무, 향나무 및 삼나무 유래의 알레르기항원은 공지되어 있다. 생체내 투여를 위한 목초 화분 유래의 단백질 항원의 제법은 보고되어 있다.
일부 구체예에서, 알레르기항원은 식품 알레르기항원으로서, 그 예에는 Ara hI (Stanley et al. (1996) Adv. Exp. Med. Biol. 409: 213-216)과 같은 땅콩 알레르기항원; Jug rI(Tueber et al. (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 101: 807- 814)과 같은 호두 알레르기항원; 알부민(Pastorello et al. (1998) J. Allergy Clin. Immunol. 102: 1021-1027)과 같은 브라질 너트 알레르기항원; Pen aI(Reese et al. (1997) Int. Arch. Allergy Immunol. 113: 240-242)과 같은 새우 알레르기항원; 오보뮤코이드(Crooke et al. (1997) J.Immunol. 159: 2026-2032)와 같은 계란 알레르기항원; 소 β-락토글로빈(Selot al. (1999) Clin. Exp. Allergy 29: 1055-1063)과 같은 우유 알레르기항원; 파르브알부민(Van Do et al.(1999) Scand. J. Immunol. 50: 619-625; Galland et al. (1998) J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl. 706: 63-71)과 같은 어류 알레르기항원이 이에 국한됨이 없이 포함된다. 일부 구체예에서, 알레르기항원은 라텍스 알레르기항원으로서, 그 예에는 Hev b7(Sowka et al. (1998) Eur. J. Biochem. 255: 213-219)이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 표 1에는 사용될 수 있는 알레르기항원의 목록을 예시하였다.
일부 구체예에서, 항원은 감염 인자에서 유래하는 것으로서, 그 예에는 원생동물, 박테리아, 진균(단세포 및 다세포 모두 포함) 및 바이러스 감염 인자가 있다. 적당한 바이러스 항원의 예는 본 명세서에 설명되어 있을 뿐만 아니라 당해 기술분야에 공지되어 있다. 박테리아에는 헤모필러스 인플루엔자(Hemophilus influenza), 미코박테리움 튜베르큘로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 보르데텔라 퍼투시스(Bordetella pertussis)가 있다. 원생동물 감염 인자에는 말라리아 원충(malarial plasmodia), 리슈만편모충(Leishmania) 종, 트리파노소마(Trypanosoma) 종 및 쉬스토소마(Schistosoma) 종이 포함된다. 진균에는 칸디다 알비칸스(Candida albicans)가 있다.
일부 구체예에서, 항원은 바이러스 항원이다. 바이러스 폴리펩타이드 항원에는 HIV gag 단백질(예컨대, 막 고착화(MA) 단백질, 코어 캡시드(CA) 단백질 및 뉴클레오캡시드(NC) 단백질이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다), HIV 폴리머라제, 인플루엔자 바이러스 기질(M) 단백질 및 인플루엔자 바이러스 뉴클레오캡시드(NP) 단백질과 같은 HIV 단백질, B형 간염 표면 항원(HBsAg), B형 간염 코어 단백질(HBcAg), e형 간염 단백질(HBeAg), B형 간염 DNA 폴리머라제, C형 간염 항원 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 인플루엔자 백신접종에 대해 논의하고 있는 참고문헌에는 다음과 같은 것이 있다: Scherle and Gerhard (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 4446-4450; Scherle and Gerhard (1986) J. Exp. Med. 164: 1114- 1128; Granoff et al. (1993) Vaccine 11 : 546-51 ; Kodihalli et al. (1997) J. Virol. 71: 3391-3396; Ahmeida et al. (1993) Vaccine 11: 1302-1309; Chen et al. (1999) Vaccine 17: 653-659; Govorkova and Smirnov (1997) Acta Virol (1997) 41: 251-257; Koide et al. (1995) Vaccine 13: 3-5; Mbawuike et al. (1994) Vaccine 12: 1340-1348; Tamura et al. (1994) Vaccine 12: 310- 316; Tamura et al. (1992) Eur. J. Immunol. 22: 477-481; Hirabayashi et al. (1990) Vaccine 8: 595-599. 항원 폴리펩타이드의 다른 예에는 다수의 감염 인자가 알려져 있는 그룹 특이성 또는 서브그룹 특이성 항원이 있으며, 예컨대 아데노바이러스, 헤르페스 단순 바이러스, 파필로마 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스 및 폭스바이러스가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
다수의 항원 펩타이드 및 단백질은 공지되어 있고 당업계에서 입수용이하다; 기타 다른 것은 통상적인 기법을 사용하여 동정할 수 있다. 종양 형성이나 기존 종양의 치료를 위한 면역화에서, 면역제어성 펩타이드에는 종양 세포(생 세포 또는 방사선조사된 세포), 종양 세포 추출물 또는 종양 항원의 단백질 서브유닛, 예컨대 Her-2/neu, Mart1, 암배 항원(CEA), 강글리오사이드, 인간 유지방 글로뷸(HMFG), 뮤신(MUC1), MAGE 항원, BAGE 항원, GAGE 항원, gp100, 전립선 특이성 항원(PSA) 및 티로시나제가 포함될 수 있다. 면역을 기반으로 한 피임용 백신은 IMP와 함께 투여되는 정자 단백질을 포함시켜 제조할 수 있다[Lea et al.(1996) Biochim. Biophys. Acta 1307:263].
약독화 바이러스 및 불활성화 바이러스는 항원으로서 본 발명에 사용하기에 적당하다. 이러한 바이러스의 제법은 당업계에 공지되어 있고, 다수가 시판되고 있다[예컨대, Physicians'Desk Reference (1998) 52nd edition, Medical Economics Company, Inc.]. 예를 들어, 소아마비 바이러스는 IPOL(Pasteur Merieux Connaught) 및 ORIMUNE® (Lederle Laboratories) 등이, A형 간염 바이러스에는 VAQTAC® (Merck) 등이, 홍역 바이러스에는 ATTENUVAX® (Merok), 유행성 이하선염 바이러스에는 MUMPSVAXO® (Merck) 등이, 풍진 바이러스에는 MERUVAX® II (Merck) 등이 입수용이하다. 또한, HIV-1, HIV-2, 헤르페스 단순 바이러스, B형 간염 바이러스, 로타바이러스, 인간 및 비인간의 파필로마바이러스 및 지연 뇌 바이러스와 같은 약독화 및 불활성화된 바이러스도 펩타이드 항원을 제공할 수 있다.
일부 구체예에서, 항원에는 바이러스 벡터, 예컨대 백시니아, 아데노바이러스 및 카나리아 마마가 포함된다.
항원은 당업계에 공지된 정제 기법을 사용하여 그 근원으로부터 분리되거나 또는 보다 편리하게는 재조합법을 사용하여 제조할 수도 있다.
항원성 펩타이드에는 정제된 천연 펩타이드, 합성 펩타이드, 재조합 단백질, 조단백질 추출물, 약독화 또는 불활성화 바이러스, 세포, 미생물, 이러한 펩타이드의 단편이 포함될 수 있다. 면역제어성 펩타이드는 천연물이거나 화학적 또는 효소적으로 합성될 수 있다. 당업계에 공지된 임의의 화학적 합성법이 적당하다. 용액상 펩타이드 합성법은 중간 크기의 펩타이드 작제에 사용될 수 있으나, 펩타이드의 화학적 작제 시, 고상 합성법도 사용될 수 있다[Atherton et al. (1981) Hoppe Seylers Z Physio. Chem. 362: 833-839]. 펩타이드 생성을 위한 아미노산의 커플링에는 단백분해 효소도 사용할 수 있다[Kullmann (1987) Enzymatic Peptide Synthesis, CRC Press, Inc]. 또는, 세포의 생화학적 기구을 사용하거나 생물학적 근원으로부터의 분리를 통해 펩타이드를 수득할 수도 있다. 재조합 DNA 기법도 펩타이드 생산에 이용될 수 있다[Hames et al. (1987) Transcription and Translation: A Practical Approach, IRL Press]. 또한, 펩타이드는 친화성 크로마토그래피와 같은 표준 기법을 이용하여 분리할 수도 있다.
항원은 펩타이드, 지질(예컨대, 콜레스테롤을 제외한 스테롤, 지방산 및 인지질), 에이취 인플루엔자(H. influenza) 백신에 사용되는 것과 같은 다당류, 강글리오사이드 및 당단백질인 것이 바람직하다. 이러한 항원은 당업계에 공지된 여러 방법을 통해 수득할 수 있는데, 그 예에는 분리법 및 화학적 및 효소적 방법들을 이용한 합성법이 있다. 특정 경우에, 예컨대 다수의 스테롤, 지방산 및 인지질인 경우에, 이러한 분자의 항원성 부분은 시판되고 있다.
본 발명의 조성물 및 이러한 조성물을 이용하는 방법에 유용한 바이러스 항원의 예에는, HIV 항원이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이러한 항원에는 HIV 엔벨로프 당단백질 유래의 항원(예컨대, gp160, gp120 및 gp41을 포함하며, 이에 국한되지 않는다) 등이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. HIV 유전자 및 항원의 서열은 다수가 공지되어 있다. 예를 들어, 로스 알라모스 내쇼널 레보레이토리즈 HIV 서열 데이터베이스는 HIV 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열을 수집하여 관리하고 주석을 단다. 이러한 데이터베이스는 인터넷 및 연간 공보를 통해 이용할 수 있다[Human Retroviruses and AIDS Compendium (예컨대, 2000년판) 참조].
감염 인자 유래의 항원은 당업계에 공지된 방법을 통해 수득할 수 있는데, 그 예에는 천연 바이러스 또는 박테리아 추출물 유래, 감염 인자로 감염된 세포 유래, 정제된 폴리펩타이드 유래, 재조합 생산된 폴리펩타이드 유래 및/또는 합성 펩타이드가 포함될 수 있다.
IMP 항원
항원과 함께 사용될 때 IMP는 다양한 방식으로 항원과 함께 투여될 수 있다. 일부 구체예에서, IMP와 항원은 서로 공간상 근접하게 투여되거나 또는 혼합물(즉, 용액 중에)로서 투여될 수도 있다. 이하에 기술되는 바와 같이, 공간상 근접은 다양한 방식으로 수행될 수 있는데, 그 예에는 접합(결합), 캡시드화, 또는 플랫폼(platform)에 부착하거나 표면 상에 흡착하는 방법이 있다. 일반적이면서 가장 바람직한 방법은, IMP와 항원을 혼합물로서 투여하는 것과 비교했을 때 생성되는 면역반응이 향상되기에 효과적인 간격을 두고 근접하게 연합하여 투여하는 것이다.
일부 구체예에서, IMP는 항원과 접합된다. 이 때, IMP 부는 접합체의 항원 부와 다양한 방식, 예컨대 공유 상호작용 및/또는 비공유 상호작용을 통해 커플링될 수 있다.
이러한 잔기들 사이의 결합은 IMP의 3' 또는 5' 말단에서 이루어지거나, 또는 IMP의 내부 위치에 있는 적당하게 변형된 염기에서 이루어질 수 있다. 항원이 펩타이드이고 적당한 반응기(예컨대, N-하이드록시숙신이미드 에스테르)를 함유한다면 이 항원은 시토신 잔기의 N4 아미노 기와 직접 반응할 수 있다. IMP에 존재하는 시토신 잔기의 수와 위치에 따라 특이적 커플링이 하나 이상의 잔기에서 이루어질 수 있다.
또는, 당업계에 공지된 바와 같은 변형된 올리고뉴클레오사이드가 IMP의 어느 한 말단이나 IMP 내부 위치에 도입될 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오사이드는 탈보호되면 당해 항원 상에 존재하거나 부착될 수 있는 다양한 작용기와 반응성인, 보호된 작용기를 함유할 수 있다.
항원이 펩타이드 또는 폴리펩타이드라면, 접합체의 이러한 항원 잔기는 고체 지지체 화학을 통해 IMP의 3' 말단에 부착될 수 있다. 예를 들어, IMP 잔기는 지지체 상에 사전합성된 폴리펩타이드부에 첨가될 수 있다[Haralambidis et al. (1990a) Nucleic Acids Res. 18: 493-499; and Haralambidis et al. (1990b) Nucleic Acids Res. 18: 501-505]. 또는, IMP는 3' 말단에 뻗어있는 절단성 링커를 통해 고체 지지체에 연결되도록 합성될 수 있다. 지지체로부터 IMP를 화학적 절단하면, 올리고뉴클레오타이드의 3'-말단에는 말단 티올기가 남거나(Zuckermann et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 5305-5321; and Corey et al. (1987) Science 238 : 1401-1403) 또는 말단 아미노기가 남게 된다(Nelson et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 1781-1794). 이와 같은 아미노 변형된 IMP와 펩타이드의 아미노 기와의 접합은 문헌[Benoit et al. (1987) Neuromethods 6: 43-72]에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 한편, 티올 변형된 IMP와 펩타이드의 카르복실 기와의 접합은 문헌[Sinah et al. (1991) Oligonucleotide Analogues : A Practical Approach, IRL Press]에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 또한, 부속된 말레이미드를 보유하는 올리고뉴클레오타이드와 펩타이드의 시스테인 잔기의 티올 측쇄와의 커플링 방법은 문헌[Tungetal. (l991) BioconjugChem. 2: 464-465]에 기술되어 있다.
접합체의 펩타이드부 또는 폴리펩타이드부는 합성 동안 올리고뉴클레오타이드에 도입된 아민, 티올 또는 카르복실 기를 통해 IMP의 5' 말단에 부착될 수 있다. 바람직하게는, 올리고뉴클레오타이드가 고체 지지체에 고정되는 동안, 한쪽 말단에 보호된 아민, 티올 또는 카르복실을 함유하고 다른쪽 말단에 포스포아미다이트를 함유하는 결합 기가 5'-하이드록실에 공유 부착되는 것이 좋다[Agrawal et al. (1986) Nucleic Acids Res. 14: 6227-6245; Connolly (1985) Nucleic Acids Res. 13: 4485-4502; Kremsky et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15: 2891-2909; Connolly (1987) Nucleic Acids Res. 15: 3131-3139; Bischoff et al. (1987) Anal. Biochem. 164: 336-344; Blanks et al. (1988) Nucleic Acids Res. 16: 10283-10299; 및 미국 특허 4,849,513, 5,015,733, 5,118,800 및 5,118,802]. 탈보호에 이어서, 아민, 티올 및 카르복실 작용기는 올리고뉴클레오타이드를 펩타이드에 공유 부착하는데 사용될 수 있다[Benoit et al. (1987); and Sinah et al. (1991)].
IMP-항원 접합체는 또한 비공유 상호작용, 예컨대 이온 결합, 소수성 상호작용, 수소 결합 및/또는 반데르발스 인력을 통해 형성될 수도 있다.
비공유 결합된 접합체는 비오틴-스트렙트아비딘 복합체와 같은 비공유 상호작용을 포함할 수 있다. 비오틴 기는 예컨대 IMP의 변형 염기에 부착될 수 있다[Roget et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 7643-7651]. 펩타이드 부에 스트렙트아비딘 잔기의 도입은 스트렙트아비딘 접합 펩타이드와 비오틴화된 올리고뉴클레오타이드의 비공유 결합 복합체를 형성시킨다.
비공유 결합은 또한 IMP와 항원 내에 존재하는 잔기, 예컨대 하전 아미노산을 수반하는 이온 상호작용을 통해, 또는 올리고뉴클레오타이드 및 항원 둘 모두와 상호작용할 수 있는 하전 잔기를 함유하는 링커 부의 이용을 통해 일어날 수도 있다. 예를 들어, 일반적으로 음하전인 IMP와 펩타이드의 양하전 아미노산 잔기, 예컨대 폴리리신, 폴리아르기닌 및 폴리히스티딘 잔기 사이에는 비공유 접합이 일어날 수 있다.
IMP와 항원 사이의 비공유 접합은 자신의 천연 리간드로서 DNA와 상호작용하는 분자의 DNA 결합 모티프를 통해 일어날 수 있다. 예를 들어, 이러한 DNA 결합 모티프는 전사 인자 및 항DNA 항체 중에서 찾아볼 수 있다.
지질에 대한 IMP의 결합은 표준 방법을 이용하여 형성될 수 있다. 이러한 방법에는 올리고뉴클레오타이드-인지질 접합체의 합성(Yanagawa et al. (1988) Nucleic Acids Symp. Ser. 19: 189-192), 올리고뉴클레오타이드-지방산 접합체의 합성(Grabarek et al. (1990) Anal. Biochem. 185: 131-135; and Staros et al. (1986) Anal. Biochem. 156: 220-222), 및 올리고뉴클레오타이드-스테롤 접합체의 합성[Boujrad et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5728-5731]이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
올리고뉴클레오타이드와 과당류의 결합은 공지된 표준 방법을 이용하여 형성시킬 수 있다. 이러한 방법에는 올리고뉴클레오타이드-과당류 접합체의 합성(여기서, 과당류는 면역글로불린의 일부이다)이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다[O'Shannessy et al. (1985) J. Applied Biochem. 7: 347-355].
환형 IMP와 펩타이드 또는 항원의 결합은 여러 가지 방식으로 형성시킬 수 있다. 재조합 또는 화학적 방법으로 환형 IMP를 합성하는 경우에는, 변형 뉴클레오사이드가 적당하다[Ruth (1991) in Oligonucleotides and Analogues : A Practical Approach, IRL Press]. 그 다음, 표준 결합 기술을 사용하여 환형 IMP를 항원이나 다른 펩타이드에 연결시킬 수 있다[Goodchild (1990) Bioconjug Chem. 1: 165]. 환형 IMP가 분리되거나 또는 재조합이나 화학적 방법으로 합성되는 경우에는, 항원이나 다른 펩타이드에 도입된 반응성 기(예컨대, 카르벤, 라디칼)를 화학적 활성화시키거나, 광활성화시켜 결합을 형성시킬 수 있다.
올리고뉴클레오타이드에 펩타이드 및 기타 다른 분자를 부착시키는 또 다른 방법은 미국 특허 5,391,723; Kessler (1992)"Nonradioactive labeling methods for nucleic acids"in Kricka (ed.) Nonisotopic DNA Probe Techniques, Academic Press; and Geoghegan et al. (1992) Bioconjug. Clzem. 3: 138-146에서 찾아볼 수 있다.
IMP는 기타 다른 방식으로 항원과 근접 연합될 수 있다. 일부 구체예에서, IMP와 항원은 캡슐화에 의해 근접 연합되기도 한다. 다른 구체예에서, IMP와 항원은 플랫폼 분자에 결합을 통해 근접 연합되기도 한다. "플랫폼 분자"(또한, "플랫폼"이라 부르기도 한다)는 IMP와 항원의 부착을 허용하는 부위를 함유한 분자이다. 다른 구체예에서, IMP와 항원은 표면, 바람직하게는 담체 입자 상에 흡착을 통해 근접 연합되기도 한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 방법은 IMP와 제1 항원의 근접 연합을, 표적에 의해 복합체가 이용될 때까지 유지시킬 수 있는 캡슐화제(또는, 이러한 캡슐화제를 함유하는 조성물)를 이용한다. IMP, 항원 및 캡슐화제를 함유하는 이러한 조성물은 보조제 수중유 에멀젼, 마이크로입자 및/또는 리포좀 형태인 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, IMP-면역제어성 분자를 캡슐화하는 보조제 수중유 에멀젼, 마이크로입자 및/또는 리포좀은 크기가 약 0.04㎛ 내지 약 100㎛인 입자 형태인 것이 좋은데, 특히 다음과 같은 범위 중 임의의 입자 크기 범위인 것이 바람직하다: 약 0.1㎛ 내지 약 20㎛; 약 0.15㎛ 내지 약 10㎛; 약 0.05㎛ 내지 약 1.00㎛; 약 0.05㎛ 내지 약 0.5㎛.
마이크로스피어, 비드, 거대분자 복합체, 나노캡슐과 같은 콜로이드성 분산계와, 수중유 에멀젼, 미셀, 혼합 미셀 및 리포좀과 같은 지질 기반계는 IMP 함유 조성물의 캡슐화에 효과적일 수 있다.
캡슐화 조성물은 또한 임의의 다양한 성분을 함유하기도 한다. 이러한 성분에는, 명반, 지질, 인지질, 지질막 구조물(LMS), 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 기타 다른 중합체, 예컨대 폴리펩타이드, 글리코펩타이드 및 다당류가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
캡슐화 성분으로 적당한 폴리펩타이드에는 당업계에 공지된 임의의 성분이 포함되며, 그 예에는 지방산 결합 단백질이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 변형 폴리펩타이드는 임의의 다양한 변형을 함유할 수 있는데, 그 예에는 글리코실화, 포스포릴화, 미리스틸화, 황산화 및 하이드록실화가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 명세서에 사용된 바와 같은, 적당한 폴리펩타이드는 IMP 함유 조성물을 보호하여 이의 면역제어 활성을 보존하는 것이다. 결합 단백질의 예에는 소혈청 알부민(BSA) 및 완두콩 알부민과 같은 알부민류가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
기타 다른 적당한 중합체는 약제학 기술분야에 공지된 임의의 중합체일 수 있는데, 그 예에는 덱스트란, 하이드록시에틸 전분 및 다당류와 같은 자연발생의 중합체 및 합성 중합체가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 자연발생의 중합체의 예에는 단백질, 글리코펩타이드, 다당류, 덱스트란 및 지질이 포함된다. 또 다른 중합체는 합성 중합체일 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적당한 합성 중합체의 예에는 PEG와 같은 폴리알킬 글리콜(PAG), 폴리옥시에틸화된 글리세롤(POG)과 같은 폴리옥시에틸화된 폴리올(POP), 폴리트리메틸렌 글리콜(PTG), 폴리프로필렌 글리콜(PPG), 폴리하이드록시에틸 메타크릴레이트, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리아크릴산, 폴리에틸옥사졸린, 폴리아크릴아마이드, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리아미노산, 폴리우레탄 및 폴리포스파젠이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 합성 중합체는 또한 선형 또는 분지형의 치환 또는 비치환 단독중합체, 공중합체 또는 2종 이상의 다른 합성 단량체의 블록 공중합체일 수 있다.
본 발명의 캡슐화 조성물에 유용한 PEG는 화학업체에서 구입하거나 또는 당업자에게 공지된 기술을 사용하여 합성한다.
본 명세서에 사용된 "LMS"라는 용어는 극성 지질의 극성 머리기가 계면의 수성상에 마주보도록 배열하여 막 구조를 형성시킨 층상 지질 입자를 의미한다. LMS의 예에는 리포좀, 미셀, 코킬레이트(즉, 일반적으로 원통형인 리포좀), 마이크로에멀젼, 단층상 소포, 다층상 소포 등이 있다.
본 발명의 바람직한 콜로이드성 분산계는 리포좀이다. 리포좀으로 캡슐화된 항원으로 면역화된 마우스에서, 리포좀은 항원에 대한 Th1형 면역반응을 향상시키는 것으로 나타났다[Aramaki et al.(1995) Vaccine 13: 1809-1814). 본 명세서에 사용된 바와 같은, "리포좀" 또는 "지질 소포"는 적어도 하나, 가능하다면 하나 보다 많은 지질이중막이 결합한 작은 소포이다. 리포좀은 인지질, 당지질, 지질, 콜레스테롤과 같은 스테로이드, 관련 분자 또는 이의 혼합물로부터 당업계에 공지된 임의의 기술을 통해 인위적으로 제조되는데, 그 예에는 초음파처리, 압출 또는 지질-세정제 착물로부터 세정제를 제거하는 방법이 있고, 이에 국한되는 것은 아니다. 리포좀은 또한 선택적으로 추가 성분, 예컨대 조직 표적 성분을 함유할 수도 있다. "지질막" 또는 "지질이중막"은 반드시 지질만으로 이루어질 필요는 없고, 막의 일반 구조가 2중의 친수성 표면에 소수성 코어가 개재되어 있는 시트형이라면 추가로 임의의 적당한 다른 성분, 예컨대 콜레스테롤 및 다른 스테로이드, 지질 용해성 화합물, 임의의 길이의 단백질 및 다른 양극성 분자(이에 국한되지 않는다)를 함유할 수 있다. 막 구조에 대한 일반적 설명은 문헌[The Encyclopedia of Molecular Biology by J. Kendrew (1994). For suitable lipids see e. g., Lasic (1993) "Liposomes: from Physics to Applications"Elsevier, Amsterdam]에 논의되고 있다.
IMP 함유 조성물을 함유하는 리포좀의 제조방법은 당업계에 공지되어 있다. 지질 소포는 당업계에 공지된 임의의 적당한 기술로 제조할 수 있다. 그 방법에는, 마이크로캡슐화, 마이크로유체화, LLC법, 에탄올 주입법, 프레온 주입법, "버블"법, 세정제 투석, 수화, 초음파처리 및 역상 증발 등이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다[Watwe et al.(1995) Curr.Sci. 68:715-724]. 이러한 기술들은 가장 바람직한 속성의 소포를 제공하기 위해 조합할 수도 있다.
본 발명은 조직 또는 세포 표적 성분을 함유하는 LMS의 사용도 포함한다. 이러한 표적 성분은 순수 동물, 기관 또는 세포 배양물에 투여했을 때 다른 조직이나 세포 부위에 비하여 우선적으로 특정 조직이나 세포 부위에 축적되게 하는 LMS의 성분이다. 표적 성분은 일반적으로 리포좀의 외부에서부터 접근할 수 있는 것으로서, 따라서 외측 표면에 결합되거나 외측 지질 이중막에 삽입되는 것이 바람직하다. 표적 성분은 특히 펩타이드, 대형 펩타이드의 일정 영역, 세포 표면 분자 또는 마커에 특이적인 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 핵산, 탄수화물, 복합 탄수화물의 일정 영역, 특정 지질, 이러한 분자들 중 임의의 분자에 부착된 약물, 호르몬, 합텐과 같은 소형 분자일 수 있다. 세포 종류에 특이적인 세포 표면 마커에 대하여 특이성이 있는 항체는 당업계에 공지되어 있고, 당업계에 공지된 방법을 통해 용이하게 제조가능하다.
LMS는 치료적 처리가 유도될 수 있도록 임의의 세포 종류에 대하여 표적화될 수 있는데, 이러한 세포 종류에는 면역반응을 제어하고(하거나) 면역반응에 참여할 수 있는 세포 종류가 있다. 이러한 표적 세포 및 기관에는 대식세포, 수지상 세포 및 림프구와 같은 APC, 림프절 및 비장과 같은 림프 구조물, 및 비림프 구조물, 특히 수지상 세포가 발견되는 구조물이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 LMS 조성물은 추가로 계면활성제를 함유할 수 있다. 계면활성제는 양이온, 음이온, 양쪽친화성 또는 비이온성일 수 있다. 계면활성제의 바람직한 군은 비이온 계면활성제이고, 특히 수용성인 것이 바람직하다.
IMP와 항원이 플랫폼 분자에 결합을 통해 근접 연합되어 있는 구체예에서, 플랫폼은 단백질계 또는 비단백질계(즉, 유기)일 수 있다. 단백질계 플랫폼의 예에는 알부민, 감마글로불린, 면역글로불린(IgG) 및 오브알부민이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다[Borel et al. (1990) Immunol. Methods 126: 159-168; Dumas et al. (1995) Arch. Dematol. Res. 287: 123-128; Borel et al. (1995) I7ct. Arch. Allergy Immunol. 107: 264-267; Borel et al. (1996) Ann. N. Y. Acad. Sci. 778: 80-87]. 플랫폼은 IMP와 항원 모두와 결합되도록 다가(즉, 1개 이상의 결합 부위를 함유한다)이다. 따라서, 플랫폼은 2개 또는 그 이상, 3개 또는 그 이상, 4개 또는 그 이상, 5개 또는 그 이상, 6개 또는 그 이상, 7개 또는 그 이상, 8개 또는 그 이상, 9개 또는 그 이상, 10개 또는 그 이상의 결합 부위를 함유할 수 있다. 중합체 플랫폼의 다른 예에는 덱스트란, 폴리아크릴아마이드, 피콜, 카르복시메틸셀룰로스, 폴리비닐 알코올 및 폴리 D-글루탐산/D-리신이 있다.
플랫폼 분자의 이용 원리는 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 플랫폼은 IMP와 항원에 적당한 결합 부위를 함유하거나 또는 함유하도록 유도체화된다. 또한, 또는 대안적으로 IMP 및/또는 항원은 유도체화되어 적당한 결합기를 얻을 수 있다. 예를 들어, 단순 플랫폼은 펩타이드와 같은 이작용성 링커(즉, 2개의 결합 부위를 보유한다)이다. 또 다른 예는 이하에 논의된다.
플랫폼 분자는 생물학적으로 안정화되어, 즉 생체내 배출 반감기가 종종 수시간 내지 수일 내지 수개월로서 치료 효능을 제공하고, 바람직하게는 소정의 조성으로 이루어진 합성 단쇄로 구성된 것이다. 일반적으로, 플랫폼의 분자량은 약 200 내지 약 1,000,000 범위이고, 바람직하게는 다음과 같은 범위 중 임의의 범위인 것이다: 약 200 내지 약 500,000; 약 200 내지 약 200,000; 약 200 내지 약 50,000(또는 그 이하, 예컨대 30,000). 원자가 플랫폼 분자의 예는 폴리에틸렌 글리콜(PEG; 바람직하게는 분자량이 약 200 내지 약 8000인 것), 폴리-D-리신, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈, D-글루탐산과 D-리신(3:2 비율)과 같은 중합체(또는 중합체로 구성된 것)이다. 사용될 수 있는 다른 분자는 알부민과 IgG이다.
본 발명에 사용하기에 적당한 기타 다른 플랫폼 분자에는 미국 특허 5,552,391에 개시된 화학적으로 정의된 비중합체성 원자가 플랫폼 분자가 있다. 이외에도, 본 발명에 사용하기에 적당한 화학적으로 정의된 균일한 원자가 플랫폼 분자는 유도체화된 2,2'-에틸렌디옥시디에틸아민(EDDA) 및 트리에틸렌 글리콜(TEG)이다.
또 다른 적당한 원자가 플랫폼 분자에는 테트라아미노벤젠, 헵타아미노베타시클로덱스트린, 테트라아미노펜타에리쓰리톨, 1,4,8,11-테트라아자시클로테트라데칸(Cyclam) 및 1,4,7,10-테트라아자시클로도데칸(Cyclen)이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.
일반적으로, 이러한 플랫폼은 표준 화학 합성법으로 제조한다. PEG는 유도체화되어야 하고 다가화되어야 하는데, 이는 표준 기술로 수행될 수 있다. 접합체 합성에 적당한 일부 물질, 예컨대 PEG, 알부민 및 IgG는 시중에서 입수할 수 있다.
플랫폼 분자와 IMP 및 항원의 접합은 일반적으로 1종 이상의 가교제와 항원, IMP 플랫폼 및 플랫폼 분자 상의 작용기를 수반하는 다양한 임의의 방법으로 실시할 수 있다. 플랫폼과 IMP 및 항원은 적당한 결합기를 보유해야 한다. 결합기는 표준 합성 화학 기술로 플랫폼에 첨가한다. 예를 들어, 결합기는 표준 고상 합성법 또는 재조합법을 통해 폴리펩타이드 항원과 IMP에 첨가될 수 있다. 재조합 기술은 링커 부착을 위해 해독후 변형을 필요로 할 수 있고, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있다.
일 예로서, 폴리펩타이드는 이러한 폴리펩타이드를 플랫폼에 커플링시키는 부위로서 작용하는 아미노기, 카르복실기 또는 설프하이드릴기와 같은 작용기를 함유하는 아미노산 측쇄부를 포함한다. 이러한 작용기를 보유한 잔기는 폴리펩타이드가 이러한 기를 함유하고 있지 않은 경우에는 폴리펩타이드에 첨가될 수도 있다. 이러한 잔기는 고상 합성법 또는 재조합법으로 도입될 수 있는데, 이 기술들은 모두 펩타이드 합성 기술분야에 공지된 것이다. 폴리펩타이드가 탄수화물 측쇄를 보유하는 경우(또는 항원이 탄수화물인 경우)에는 작용성 아미노기, 설프하이드릴기 및/또는 알데하이드기가 통상적인 화학법에 따라 도입될 수 있다. 예를 들어, 1차 아미노기는 소듐 시아노보로하이드라이드의 존재하에 에틸렌디아민과 산화된 당의 반응을 통해 도입될 수 있고, 설프하이드릴은 시스테아민 이염산염의 반응에 이어 일반 디설파이드 환원제를 이용한 환원을 통해 도입될 수 있는 한편, 알데하이드 기는 과요오드산염 산화 이후 생성될 수 있다. 이와 유사한 방식으로, 플랫폼 분자는 적당한 작용기를 갖고 있지 않다면 작용기를 함유하도록 추가로 유도체화될 수 있다.
다양한 길이의 친수성 링커는 IMP와 항원을 플랫폼 분자에 연결시키는데 유용하다. 적당한 링커에는 에틸렌 글리콜의 선형 올리고머 또는 중합체가 포함된다. 이러한 링커에는 서열식 R1S(CH2CH2O)nCH2CH2O(CH2)mCO2R2의 링커가 포함된다(이 식에서, n은 0 내지 200, m은 1 또는 2, R1은 H 또는 트리틸과 같은 보호기, R2는 H 또는 알킬 또는 아릴, 예컨대 4-니트로페닐 에스테르이다. 이러한 링커는 티올 반응기를 함유하는 분자, 예컨대 할로아세일, 말레이아미드 등을 티오에테르를 통해 아미노기를 함유하는 제2 분자에 아미드 결합을 통해 연결시키는데 유용하다. 이러한 링커는 부착 순서와 관련해서는 가변적일 수 있는데, 즉 티오에테르가 먼저 또는 나중에 형성될 수 있다.
IMP와 항원이 표면 상에 흡착을 통해 근접 연합되어 있는 구체예에서, 표면은 무기 또는 유기 코어로 제조된 담체 입자(예컨대 나노입자) 형태일 수 있다. 이러한 나노입자의 예에는 나노결정형 입자, 알킬시아노아크릴레이트의 중합으로 제조된 나노입자 및 메틸리덴 말로네이트의 중합으로 제조된 나노입자가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. IMP와 항원이 흡착될 수 있는 다른 표면에는 활성화된 탄소 인자 및 단백질-세라믹 나노플레이트가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 담체 입자의 다른 예도 본 명세서에 제시되어 있다.
흡착된 분자를 세포로 전달하기 위한 목적의 표면에 대한 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드의 흡착은 당업계에 공지되어 있다[예컨대, Douglas et al. (1987) Crit. Rev. Later. Drug. Carrier Syst. 3: 233-261; Hagiwara et al. (1987) In Vivo 1: 241-252; Bousquet et al. (1999) Pharm. Res. 16: 141-147; and Kossovsky et al., 미국 특허 5,460, 831]. 흡착 표면을 함유하는 물질은 생체분해성인 것이 바람직하다. IMP 및/또는 항원의 표면에 대한 흡착은 비공유 상호작용, 예컨대 이온 및/또는 소수성 상호작용을 통해 일어날 수 있다.
일반적으로, 나노입자와 같은 담체의 특성, 예컨대 표면 하전, 입자 크기 및 분자량 등은 중합 조건, 단량체 농도 및 중합 공정 동안 안정화제의 존재에 따라 달라진다(Douglas et al., 1987). 담체 입자의 표면은 예컨대 표면 코팅에 의해 변형되어 IMP 및/또는 항원이 흡착될 수 있거나 흡착 향상될 수 있다. 흡착된 IMP 및/또는 항원을 보유한 담체 입자는 다른 물질로 추가 코팅될 수 있다. 이러한 다른 물질의 첨가는 예컨대 검체에게 일단 투여되면 입자의 반감기를 연장시키고(시키거나) 특정 세포 종류 또는 조직으로 입자를 표적화할 수 있다(본 명세서에서 설명된다).
IMP와 항원이 흡착될 수 있는 나노결정형 표면에 대해서는 예컨대 미국 특허 5,460,831에 기술되어 있다. 나노결정형 코어 입자(직경이 1㎛ 이하)는 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및/또는 다른 약제의 흡착을 촉진시키는 표면 에너지 변형층으로 코팅된다. 미국 특허 5,460,831에 기술된 바와 같이, 예컨대 코어 입자는 올리고뉴클레오타이드의 흡착을 촉진하는 표면으로 코팅되고, 이어서 액체-항원 혼합물 형태의 항원 제조물로 코팅된다. 이러한 나노입자는 내부층이 IMP이고 외부층이 항원인, 일반적으로 0.1㎛ 정도의 나노미터 크기 입자의 자가-결집성 복합체이다.
다른 흡착 표면은 알킬시아노아크릴레이트의 중합으로 제조된 나노입자이다. 알킬시아노아크릴레이트는 음이온 중합 과정을 통해 산성화된 수성 매질에서 중합될 수 있다. 중합 조건에 따라 소형 입자는 20 내지 3000nm 범위의 크기를 갖는 경향이 있으며, 특이적인 표면 특성과 특이적인 표면 하전을 보유한 나노입자를 제조하는 것이 가능하다(Douglas et al., 1987). 예를 들어, 올리고뉴클레오타이드는 테트라페닐포스포늄 클로라이드와 같은 소수성 양이온 또는 세틸트리메틸 암모늄 브로마이드와 같은 4차 암모늄염의 존재하에 폴리이소부틸 및 폴리이소헥실시아노아크릴레이트 나노입자에 흡착될 수 있다. 이러한 나노입자에 대한 올리고뉴클레오타이드 흡착은 핵산 사슬의 음하전을 띤 인산염기와 소수성 양이온 사이의 이온쌍 형성에 의해 매개되는 것으로 시사되었다(예컨대, Lambert et al.(1998) Biochimie 80: 969-976, Chavany et al. (1994) Pharm. Res. 11: 1370-1378; Chavany et al. (1992) Pharm. Res. 9: 441-449). 또한, 폴리알킬시아노아크릴레이트 나노입자에는 폴리펩타이드가 흡착될 수도 있다[예컨대, Douglas et al., 1987; Schroeder et al. (1998) Peptides 19: 777- 780].
또 다른 흡착 표면은 메틸리덴 말로네이트의 중합에 의해 제조된 나노입자이다. 예를 들어, 문헌(Bousquet et al., 1999)에 기술된 바와 같이, 폴리(메틸리덴 말로네이트 2.1.2) 나노입자에 흡착된 폴리펩타이드는 처음에는 정전기력을 통해 흡착되고, 이어서 소수성 힘을 통해 안정화되는 것으로 나타난다.
IMP/MC 복합체
IMP는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드/마이크로담체(IMP/MC) 복합체 형태로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 IMP/MC 복합체를 함유하는 조성물을 제공한다.
본 발명에 유용한 마이크로담체는 크기가 약 150, 120 또는 100㎛ 미만이고, 보다 일반적으로는 약 50 내지 60㎛ 미만이며, 바람직하게는 약 10㎛ 미만이고, 정제수에 불용성인 것이다. 본 발명에 사용되는 마이크로담체는 비생체분해성의 마이크로담체가 사용가능하기는 하지만 생체분해성인 것이 바람직하다. 마이크로담체는 일반적으로 "비드" 또는 기타 다른 입자와 같은 고상이지만, 생체분해성 중합체는 오일을 함유하는 수중유 에멀젼과 같은 액상 마이크로담체도 이용가능하다. 마이크로담체로서 유용한 것으로 허용되는 다양한 생체분해성 및 비생체분해성 물질은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 조성물 또는 방법에 유용한 마이크로담체는 일반적으로 크기가 약 10㎛ 미만(예컨대, 평균 직경이 약 10㎛ 미만이거나, 또는 입자의 적어도 약 97%가 10㎛ 체 필터를 통해 통과한다)이고, 나노담체(즉, 크기가 약 1㎛ 미만인 담체)도 포함된다. 마이크로담체는 크기의 상한 범위가 약 9, 7, 5, 2 또는 1㎛, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 250, 200 또는 100nm 이내 중에서 선택되고, 독립적으로 선택되는 하한 범위가 약 4, 2 또는 1㎛ 또는 약 800, 600, 500, 400, 300, 250, 200, 150, 100, 50, 25 또는 10nm이며, 이러한 하한 범위가 상한 범위 보다 적은 것이 바람직하다. 일부 구체예에서, 마이크로담체는 크기가 약 1.0 내지 1.5㎛, 약 1.0 내지 2.0㎛ 또는 약 0.9 내지 1.6㎛ 범위인 것이 바람직하다. 바람직한 특정 구체예에서, 마이크로담체는 크기가 약 10nm 내지 약 5㎛, 약 25nm 내지 약 4.5㎛, 약 1㎛, 약 1.2㎛, 약 1.4㎛, 약 1.5㎛, 약 1.6㎛, 약 1.8㎛, 약 2.0㎛, 약 2.5㎛ 또는 약 4.5㎛인 것이다. 마이크로담체가 나노담체인 경우에, 바람직한 구체예에는 약 25 내지 약 300nm, 50 내지 약 200nm, 약 50nm 또는 약 200nm의 나노담체가 포함된다.
고상 생체분해성 마이크로담체는 생체분해성 중합체로부터 제조될 수 있으며, 그 예에는 생체분해성 폴리에스테르, 예컨대 폴리(락트산), 폴리(글리콜린산) 및 이의 공중합체(블록 공중합체 포함) 뿐만 아니라 폴리(락트산)과 폴리(에틸렌 글리콜)의 블록 공중합체; 폴리오르토에스테르, 예컨대 3,9-디에틸리덴-2,4,8,10-테트라옥사스피로[5.5]운데칸(DETOSU)을 주성분으로 하는 중합체; 폴리무수물, 예컨대 세바스산과 같이 비교적 친수성인 단량체를 주성분으로 하는 폴리(무수물) 중합체; 폴리무수물 이미드, 예컨대 글리신 또는 알라닌과 같은 아미노산을 포함하는 세바스산 유래의 단량체를 주성분으로 하는 폴리무수물 중합체(즉, 아미노산은 아미노 말단 질소를 통해 세바스산에 이미드 결합된다); 폴리무수물 에스테르; 폴리포스파젠, 특히 카르복실산 기의 생성을 통해 중합체 골격쇄의 분해를 촉매할 수 있는 가수분해 민감성 에스테르 기를 함유하는 폴리(포스파젠)(Schacht et al., (1996) Biotechnol. Bioeng. 1996: 102); 및 폴리(락트산-코-리신)과 같은 폴리아미드류가 포함되지만, 이에 국한되는 것은 아니다.
마이크로담체 제조에 적당한 비생체분해성 물질의 다양한 예도 역시 당업계에 공지되어 있으며, 그 예에는 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 실리카, 세라믹, 폴리아크릴아미드, 덱스트란, 하이드록시아파타이트, 라텍스, 금 및 강자성 또는 상자성 물질이 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 특정 구체예에서는, 금, 라텍스 및/또는 자기성 비드가 제외된다. 특정 구체예에서, 마이크로담체는 제2 물질(예컨대, 폴리스티렌)로 캡슐화된 제1 물질(예컨대, 자기 물질)로 제조될 수 있다.
고상 마이크로스피어는 당업계에 공지된 기술로 제조한다. 예를 들어, 고상 마이크로스피어는 에멀전-용매 추출/증발 기술로 제조할 수 있다. 이러한 기술에서, 생체분해성 중합체, 예컨대 폴리무수물, 폴리(알킬-α-시아노아크릴레이트) 및 폴리(α-하이드록시 에스테르), 구체적으로 폴리(락트산), 폴리(글리콜린산), 폴리(D,L-락틱-코-글리콜린산) 및 폴리(카프로락톤)은 일반적으로 염화메틸렌과 같은 적당한 유기 용매에 용해되어 에멀젼의 분산 상(DP)을 형성한다. DP는 폴리비닐알코올(PVA) 또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)과 같은 용해된 계면활성제를 함유하는 과량의 수성 연속상(CP)에 고속 균질화를 통해 유화시킨다. CP 중의 계면활성제는 분리된 적당한 크기의 에멀젼 소적 형성을 유도한다. 유기 용매는 그 다음 CP 중으로 추출된 후, 반응계의 온도 상승에 의해 증발된다. 그 다음, 원심분리 또는 여과를 통해 고상 마이크로입자를 분리한 뒤, 예컨대 동결건조 또는 진공 적용을 통해 건조시킨 다음 4℃에 보관한다.
건조된 미소구의 물리화학적 특성, 예컨대 평균 크기, 크기 분포 및 표면 하전은 결정지어질 수 있다. 크기 특정은 예컨대 동적 광산란 기술로 결정하며, 표면 하전은 제타 전위 측정으로 결정했다.
액상 마이크로담체에는 생체분해성 중합체 또는 오일을 함유하는 리포좀, 미셀, 오일 소적 및 기타 다른 지질 또는 오일 기반 입자가 포함된다. 특정 구체예에서, 생체분해성 중합체는 계면활성제이다. 다른 구체예에서, 액상 마이크로담체는 스쿠알렌이나 식물유와 같은 생체분해성 오일의 내포로 인해 생체분해성인 것이다. 또 다른 바람직한 액상 마이크로담체는 수중유 에멀젼 내의 오일 소적이다. 마이크로담체로서 사용되는 수중유 에멀젼은 스쿠알렌과 같은 생체분해성 치환체를 함유하는 것이 바람직하다.
IMP/MC 복합체는 IMP가 마이크로담체의 표면에 결합된 것(즉, IMP가 MC 내에 캡슐화되지 않은 것)이고, 바람직하게는 복수 IMP 분자가 각 마이크로담체에 결합된 것이다. 특정 구체예에서, 마이크로담체는 1종 이상의 IMP와 결합되도록 여러 IMP 혼합물이 마이크로담체와 복합체를 형성할 수 있다. IMP와 MC 사이의 결합은 공유결합 또는 비공유결합일 수 있다. 당업자라면 잘 알고 있듯이, IMP는 변형 또는 유도체화될 수 있고, 마이크로담체 조성은 IMP/MS 복합체 형성에 바람직한 결합 종류를 수용하도록 선택 및/또는 변형될 수 있다.
공유 결합된 IMP/MC 복합체는 당업계에 공지된 임의의 공유 가교결합 기술을 사용하여 결합시킬 수 있다. 일반적으로, IMP 부는 이 부분이 마이크로담체에 결합될 수 있는 부위를 제공하기 위하여 추가 부(예컨대, 유리 아민, 카르복실 또는 설프하이드릴 기) 또는 변형된(예컨대 포스포로티오에이트) 뉴클레오타이드 염기를 도입하도록 변형될 수 있다. 복합체의 IMP 부와 MC 부 사이의 결합은 IMP의 3' 말단 또는 5' 말단에서 이루어지거나 또는 IMP 내부 위치에 있는 적당하게 변형된 염기에서 이루어질 수 있다. 이러한 마이크로담체는 또한 일반적으로 공유 결합을 형성시킬 수 있는 잔기가 도입되도록 변형되지만, 마이크로담체에 보통 존재하는 작용기가 이용될 수도 있다. IMP/MC는 공유 복합체를 형성시키는 조건(즉, IMP와 공유 결합을 형성하는 활성화된 부를 함유한 활성화된 마이크로담체의 이용 또는 가교제의 존재)하에서 마이크로담체와 IMP를 항온처리하여 제조한다.
다양한 가교결합 기술은 당업계에 공지되어 있으며, 그 예에는 아미노기, 카르복실기 및 설프하이드릴기와 반응성인 가교제가 포함된다. 당업자에게 자명하듯이, 가교제와 가교 방법의 선택은 목적하는 IMP/MC 복합체의 최종 형태 뿐만 아니라 IMP와 마이크로담체 각각의 형태에 따라서도 달라질 수 있다. 가교제는 동종이작용성이거나 이종이작용성인 것일 수 있다. 동종이작용성인 가교제가 사용되는 경우에, 가교제는 IMP와 MC 상의 동일한 부를 이용한다(예컨대, IMP와 MC 모두가 1개 이상의 유리 아민을 함유하는 경우에는 IMP와 MC를 공유 결합시키기 위해 알데하이드 가교제를 사용할 수 있다). 이종이작용성 가교제는 IMP와 MC 상의 다른 부를 이용하며(예컨대, IMP 상의 유리 설프하이드릴과 MC 상의 유리 아민을 공유 결합시키기 위해 말레이미도-N-하이드록시숙신이미드 에스테르가 사용될 수 있다), 마이크로담체간의 결합 형성을 최소화하는 것이 바람직하다. 대부분 경우, 마이크로담체 상에 제2 가교결합 부가 존재하지 않는다면, 마이크로담체 상의 제1 가교결합 부와 IMP 상의 제2 가교결합 부를 통해 가교결합이 이루어지는 것이 바람직하다. IMP/MC 복합체를 제조하는 바람직한 1가지 방법은 이종이작용성 가교제와 항온처리하여 마이크로담체를 "활성화"시킨 뒤, 활성화된 MC와 IMP를 반응에 적당한 조건하에서 항온처리하여 IMP/MC 복합체를 형성시키는 것이다. 가교제는 반응성 부 사이에 "스페이서" 아암(arm)을 도입시킬 수도 있고, 또는 가교제 중의 2개의 반응성 부가 직접 결합될 수도 있다.
바람직한 일 구체예에서, IMP 잔기는 마이크로담체에 가교결합하기 위하여 적어도 하나의 유리 설프하이드릴(예컨대, 5'-티올 변형 염기 또는 링커에서 제공된)을 함유하고, 마이크로담체는 유리 아민 기를 함유하는 것이다. 이러한 두 기와 반응성인 이종이작용성 가교제(예컨대, 말레이미드 기와 NHS-에스테르를 함유하는 가교제), 예컨대 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트는 MC를 활성화시킨 뒤, IMP를 공유 가교결합시켜 IMP/MC 복합체를 형성시키는데 사용된다.
비공유결합성 IMP/MC 복합체는 일반적으로 결합쌍이 IMP와 MC를 결합시키는 경우처럼, 임의의 비공유 결합 또는 상호작용, 예컨대 이온(정전기) 결합, 소수성 상호작용, 수소 결합, 반데르발스 인력 또는 2종 이상의 다른 상호작용의 조합을 통해 결합될 수 있다.
바람직한 비공유 IMP/MC 복합체는 일반적으로 소수성 또는 정전기(이온) 상호작용, 또는 이의 조합을 통해 복합체화된다(예컨대, 결합쌍을 이용하여 MC에 결합시킨 폴리뉴클레오타이드와 IMP 간의 염기쌍을 통해). 폴리뉴클레오타이드 골격쇄의 친수성 성질로 인해, 복합체 형성이 소수성 상호작용에 의해 좌우되는 IMP/MC 복합체는 일반적으로 고도 소수성 잔기가 도입되도록 복합체의 IMP 부의 변형을 필요로 한다. 이러한 소수성 부는 조성물을 투여하고자 하는 개체(예컨대 포유동물, 특히 인간)에서 자연발생성이고, 생체적합성이며 비면역원성인 것이다. 바람직한 소수성 부의 예에는 지질, 스테로이드, 콜레스테롤과 같은 스테롤 및 테르펜이 포함된다. 이러한 소수성 부를 IMP에 결합시키는 방법은 물론 IMP의 형태와 소수성 부의 종류에 따라 달라질 것이다. 소수성 부는 IMP의 임의의 편리한 부위, 바람직하게는 5' 또는 3' 말단에 첨가될 수 있다. IMP에 콜레스테롤 부가 첨가되는 경우라면, 통상적인 화학적 반응을 통해(예컨대, Godard et al.(1995) Eur.J.Biochem. 232:404-410), 콜레스테롤 부가 IMP의 5' 말단에 첨가되는 것이 바람직하다. 소수성 결합을 통해 결합된 IMP/MC 복합체에 유용한 마이크로담체는 오일 소적이나 소수성 중합체와 같은 소수성 물질로 제조되는 것이 바람직하지만, 소수성 잔기가 도입되도록 변형된 친수성 물질도 역시 사용될 수 있다. 마이크로담체가 리포좀 또는 관강을 함유한 다른 액상 마이크로담체라면, IMP/MC 복합체는 MC 제조 동안 IMP의 캡슐화를 피하기 위하여 MC 제조 후 MC와 IMP의 혼합을 통해 형성되는 것이 바람직하다.
정전기 결합을 통해 결합된 비공유결합성 IMP/MC 복합체는 일반적으로 폴리뉴클레오타이드 골격쇄의 다량의 음하전을 이용한다. 따라서, 비공유결합성 IMP/MC 복합체에 유용한 마이크로담체는 일반적으로 생리적 pH(예컨대, 약 pH 6.8 내지 7.4)에서 양하전성(양이온성)인 것이다. 이러한 마이크로담체는 본래 양하전을 보유하는 것이거나 또는 일반적으로 양하전을 보유하지 않는 화합물로 제조한 마이크로담체를 양하전성(양이온성)이 되도록 유도체화하거나 또는 다른 방식으로 변형시킬 수 있다. 예컨대, 마이크로담체 제조에 사용되는 중합체는 1차 아민과 같은 양하전 기가 첨가되어 유도체화될 수 있다. 대안적으로, 제조 공정 중, 마이크로담체의 배합 시에 양하전성 화합물이 첨가될 수도 있다(예컨대, 폴리(락트산)/폴리(글리콜린산 공중합체 제조 공정 중에 양하전성 계면활성제를 사용하여 최종 마이크로담체 입자 상에 양하전을 부여할 수 있다).
본 명세서에 설명된 바와 같이, 양이온 마이크로스피어 제조를 위해, 양이온 지질 또는 중합체, 예컨대 1,2-디올레오일-1,2,3-트리메틸암모니오프로판(DOTAP), 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB) 또는 폴리리신이 DP 또는 CP에 이들 상에서의 용해성에 따라 첨가되기도 한다.
본 명세서에서 설명되듯이, IMP/MC 복합체는 폴리뉴클레오타이드와 입자를, 바람직하게는 수성 혼합물 상태로 항온처리하여 양이온 마이크로스피어 상에 흡착시켜 예형시킬 수 있다. 이러한 항온처리는 임의의 바람직한 조건, 예컨대 상온(실온)(예컨대, 약 20℃) 또는 냉장(예컨대, 4℃) 하에서 수행할 수 있다. 양이온 마이크로스피어와 폴리뉴클레오타이드는 비교적 신속하게 연합되므로, 항온처리는 임의의 바람직한 시간, 예컨대 5, 10, 15분 또는 그 이상, 예컨대 하룻밤동안 및 그 이상의 항온처리 시간 동안 수행할 수 있다. 예를 들어, IMP는, 폴리뉴클레오타이드와 입자를 4℃에서 하룻밤동안 수성 항온처리함으로써, 양이온 마이크로스피어 상에 흡착시킬 수 있다. 하지만, 양이온 마이크로스피어와 폴리뉴클레오타이드는 자발적으로 연합하기 때문에, 폴리뉴클레오타이드와 MC를 단순히 함께 투여함으로써 IMP/MC 복합체를 형성시킬 수도 있다. 마이크로스피어는 폴리뉴클레오타이드 연합 전과 후에 크기 및 표면 하전 측면에서 특징이 규명될 수 있다. 선택된 배취는 그 다음 적당한 대조군과 대비하여, 예컨대 본 명세서에서 설명되는 것처럼 확립된 인간 말초혈액단핵세포(PBMC)에서, 및 마우스 비장세포 분석법을 통해 평가될 수 있다. 또한, 이 제형은 적당한 동물 모델에서 평가될 수도 있다.
뉴클레오타이드 염기쌍에 의해 결합된 비공유결합성 IMP/MC 복합체는 통상적인 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 염기쌍을 이룬 IMP/MC 복합체는 IMP에 적어도 부분적으로 상보성인 폴리뉴클레오타이드가 결합된, 바람직하게는 공유결합된 마이크로담체를 사용하여 제조한다. IMP와 포획 뉴클레오타이드 사이의 상보성의 단편은 적어도 6개, 8개, 10개 또는 15개 연속적 염기쌍인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 적어도 20개 연속적 염기쌍인 것이다. 포획 뉴클레오타이드는 당업계에 공지된 임의의 방법을 통해 MC에 결합될 수 있으며, 5' 또는 3' 말단에서 IMP에 공유결합되는 것이 바람직하다.
다른 구체예에서는, IMP/MC 복합체에서 IMP와 MC를 결합시키는데 결합쌍이 이용될 수 있다. 이러한 결합쌍은 수용체와 리간드, 항체와 항원(또는 에피토프), 또는 높은 친화성(예컨대, 약 10-8 미만의 Kd)으로 결합하는 기타 다른 결합쌍일 수 있다. 바람직한 결합쌍의 한 종류는 비오틴과 스트렙트아비딘 또는 비오틴과 아비딘으로서, 매우 단단한 복합체를 형성한다. IMP/MC 복합체 결합을 매개인자로서 결합쌍을 사용하는 경우에 IMP는 결합쌍의 한 구성원과, 일반적으로 공유 결합을 통해 유도체화하고, MC는 결합쌍의 다른 구성원으로 유도체화한다. 이러한 두가지 유도체화된 화합물의 혼합물은 IMP/MC 복합체를 형성시킨다.
많은 IMP/MC 복합체 구체예들은 항원을 사용하지 않으며, 특정 구체예에서는 IMP/MC 복합체 치료의 대상인 질환이나 장애와 관련있는 항원은 배제된다. 또 다른 구체예에서, IMP는 1종 이상의 항원 분자와 결합되기도 한다. 항원은 다양한 방식, 예컨대 WO 98/16247에 기술된 바와 같이 공유 및/또는 비공유 상호작용 등으로 IMP/MC 복합체의 IMP 부에 커플링될 수 있다. 대안적으로, 항원은 마이크로담체에 결합될 수 있다. 항원이 IMP에 결합되어 있는 IMP/MC 복합체 중의 IMP와 항원 사이의 결합은 본 명세서에 설명되고 당업계에 공지된 기술, 예컨대 이에 제한되지 않는 직접 공유 결합, 가교제 부(스페이서 아암을 포함할 수 있다)를 통한 공유 접합, 특정 결합쌍(예컨대, 비오틴과 아비딘)을 통한 비공유 접합 및 정전기 또는 소수성 결합을 통한 비공유 접합을 통해 형성시킬 수 있다.
양이온 축합제 및 안정화제를 이용한 IMP 복합체
IMP는 수용체의 면역반응 제어를 위해 양이온 축합제, IMP 및 안정화제를 함유하는 조성물(즉, CIS 조성물)로서 투여될 수 있다(미국 특허 출원 60/402,968 참조). 일부 구체예에서, CIS 조성물은 추가로 항원 및/또는 지방산을 포함할 수도 있다.
본 발명의 CIS 조성물은 일반적으로 미립자 형태이다. 당업자에게는 자명한 것처럼, 본 발명의 CIS 미립 조성물은 다른 크기의 입자들의 집단으로 이루어진다. 이러한 자연발생의 가변성으로 인해, 본 발명의 조성물에 함유된 입자의 "크기"는 일정 범위로 기술되거나 최대 또는 최소 직경으로서 기술될 것이다. 따라서, 입자는 적어도 95%의 입자(질량 기준)가 특정 치수에 부합하는 것이라면 특정 크기인 것으로 간주한다(예컨대, 입자의 적어도 97%가 직경이 20㎛ 미만이라면, 이 조성물은 직경이 20㎛ 미만인 입자로 구성된 것으로 간주한다). 입자 크기는 당업계에 공지된 임의의 편리한 방법으로 측정할 수 있는데, 예컨대 여과(예컨대, 컷오프 크기 보다 큰 입자를 포획할 수 있는 "층상형(depth)" 필터 사용), 동적 광 산란, TEM(특히 동결 분쇄 가공과 조합으로) 및 SEM을 비롯한 전자현미경 등이 이용될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 CIS 조성물은 직경이 약 50㎛ 미만, 보다 바람직하게는 직경이 약 20㎛ 미만인 입자를 함유하는 것이지만, 일부 구체예에서의 입자는 직경이 약 3, 2 또는 1㎛ 미만일 수도 있다. 바람직한 입자 크기 범위에는 직경이 약 0.01㎛ 내지 50㎛, 0.02 내지 20㎛, 0.05 내지 5㎛, 0.05 내지 3㎛ 범위인 것이 포함된다.
CIS 조성물의 성분들은 조성물에 다양한 비율/양으로 존재할 수 있지만, 안정화제 및 지방산 및 항원과 같은 선택 성분의 양은 비교적 불변성인 것으로서, 안정화제는 일반적으로 약 0.1% 내지 0.5%(v/v) 범위이고, 지방산은 약 0 내지 0.5% 범위이며, 항원 농도는 약 0.1 내지 약 100㎍/ml, 바람직하게는 약 1 내지 약 100㎍/ml, 보다 바람직하게는 약 10 내지 50㎍/ml 범위인 것으로 고려되어야 한다. IMP와 양이온 축합제의 양과 비율은 본 발명의 조성물 중에서 가장 큰 범위로 변화되기 쉽다. IMP의 양은 이 IMP의 분자량의 함수로서 특정 범위로 변화될 수 있는데, 일반적으로 약 50㎍/ml 내지 약 2mg/ml 범위, 바람직하게는 약 100㎍/ml 내지 1mg/ml 범위이다. 양이온 축합제는 일반적으로 IMP 보다 과량(질량 기준)으로 제공되는데, 일반적으로 약 1:2(IMP:양이온 축합제) 내지 약 1:6의 비율 범위, 보다 바람직하게는 약 2:5 내지 1:5의 비율 범위로 제공한다.
CIS 조성물의 입자 크기는 다양한 변수의 함수이다. 조성물에 존재하는 입자의 크기 분포는 양이온 축합제:IMP의 비율을 변화시켜 제어할 수 있다. 예를 들어, 예시적인 +ISS/0.4% Tween 85/0.4% 올레이트/폴리믹신(polymyxin) B 조성물에서 양이온 축합제:IMP 비율의 변화는 평균 입자 크기를 양이온 축합제:IMC가 1인 경우의 약 1.5㎛에서부터 양이온 축합제:IMC가 10인 경우의 약 45㎛로 변화시킬 수 있다.
특정 구체예에서, CIS 조성물은 양이온 축합제, IMP 및 비이온 세정제인 안정화제를 함유한다. 다른 구체예에서, CIS 조성물은 막붕괴성 양이온 리포펩타이드(바람직하게는 폴리믹신, 보다 바람직하게는 폴리믹신 B), IMP 및 안정화제를 함유한다. 일부 구체예에서, 안정화제는 혈청 단백질(특히 소혈청 단백질)은 아닌 것이다. 이러한 구체예 군의 예시적 조성물은 안정화제로서 Tween 80 또는 Tween 85와 같은 폴리옥시에틸렌 에테르 세정제를 이용하여 선택적 추가 안정화제로서 올레이트를 이용한다.
일부 구체예에서, CIS 조성물은 면역제어성 입자를 함유하는 것으로서, 이러한 입자는 양이온 축합제, IMP 및 비이온성 세정제인 안정화제를 혼합하는 공정을 통해 제조되어진다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 면역제어성 입자를 함유하되, 이 입자가 막 붕괴성 양이온 리포펩타이드(바람직하게는 폴리믹신, 보다 바람직하게는 폴리믹신 B), IMP 및 안정화제의 혼합 공정을 통해 제조되는 것이다. 일부 구체예에서, 안정화제는 혈청 단백질(특히, 소혈청 단백질)이 아닌 것이다.
일부 구체예에서, CIS 조성물은 면역제어성 입자를 함유하되, 이 입자가 IMP와 비이온성 세정제인 안정화제의 혼합을 통해 IMP/안정화제 혼합물을 형성한 뒤, 이 IMP/안정화제 혼합물과 양이온성 축합제의 혼합을 통해 제조되어지는 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 면역제어성 입자를 함유하되, 이 입자가 IMP와 안정화제의 혼합을 통해 IMP/안정화제 혼합물을 형성한 뒤, 이 IMP/안정화제 혼합물과 막붕괴성 양이온 리포펩타이드(바람직하게는 폴리믹신, 보다 바람직하게는 폴리믹신 B)의 혼합을 통해 제조되어지는 것이다. 일부 구체예에서, 안정화제는 혈청 단백질(특히, 소혈청 단백질)이 아닌 것이다.
일부 구체예에서, CIS 조성물은 양이온 축합제, IMP 및 비이온성 세정제인 안정화제를 함유하는 면역제어성 입자를 포함하는 것이다. 다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 막 붕괴성 양이온 리포펩타이드(바람직하게는 폴리믹신, 보다 바람직하게는 폴리믹신 B), IMP 및 안정화제를 함유하는 면역제어성 입자를 포함하는 것이다. 일부 구체예에서, 안정화제는 혈청 단백질(특히, 소혈청 단백질)이 아닌 것이다.
CIS 조성물 및 CIS 조성물의 사용 방법에 유용한 양이온 축합제는 생리적 pH(즉, 약 7.0 내지 약 7.5 사이의 pH)에서 양하전을 띤 분자이다. 본 발명에 사용되는 양이온 축합제는 쯔비터이온성이 아니고, 분자당 1개 보다 많은 양하전을 보유한 다가양이온성인 것이다. 본 발명에 유용한 양이온 축합제에는 친수성 또는 양극성 다가양이온이 포함된다.
바람직한 양이온 축합제에는 (a) 막붕괴성 양이온 리포펩타이드, 예컨대 폴리믹신 A, 폴리믹신 B(폴리믹신 B1 및 폴리믹신 B2 포함), 폴리믹신 C, 폴리믹신 D, 폴리믹신 E(또한 콜리스틴이라고도 알려져 있음), 폴리믹신 K, 폴리믹신 M, 폴리믹신 P, 폴리믹신 S 및 폴리믹신 T를 포함하는 폴리믹신류, 서큘린(circulin) A, 서큘린 B, 서큘린 C, 서큘린 D, 서큘린 E 및 서큘린 F를 포함하는 서큘린류, 옥타펩틴, 암포테리신 B를 포함하는 암포테리신류, 및 옥타노일-KFFKFFKFF 및 아실 KALA(옥타노일-WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALEACEA)를 포함하는 아실화 펩타이드(이에 국한되는 것은 아니다); (b) 폴리믹신 B, 노나펩타이드, 세크로핀 A, 세크로핀 B 및 세크로핀 P1을 포함하는 세크로핀류, KFFKFFKFF 및 KALA(WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA)를 이에 국한됨이 없이 포함하는 막붕괴성 양이온 펩타이드; (c) 일본쇄 양이온 계면활성제, 예컨대 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 벤질-디메틸-암모늄 브로마이드(BDAB), CpyrB(세틸-피리디늄 브로마이드), CimB(세틸 이미다졸륨 브로마이드), 및 폴리-L-리신(PLL) 및 폴리에틸렌이민(PEI)을 이에 국한됨이 없이 함유하는 다가양이온 중합체(이에 국한되지 않는다)가 포함된다. 특정 구체예에서, 양이온 축합제는 막붕괴성 양이온 리포펩타이드, 바람직하게는 폴리믹신, 보다 바람직하게는 폴리믹신 B이다. 일부 구체예에서, 지방산 에스테르(즉, 지질) 및 이본쇄 양이온 계면활성제는 양이온 축합제에서 제외될 수 있다.
CIS 조성물 및 CIS 조성물의 사용 방법에 유용한 안정화제에는 물에 현탁성이고 물의 표면 장력을 감소시키는 것이 포함되지만, 수용성 및/또는 물에 완전 혼화성인 안정화제가 바람직하다. 다양한 종류의 안정화제가 본 발명의 조성물과 방법에 유용한데, 그 예에는 단백질(바람직하게는 친수성 단백질), 비이온성 세정제, 중합체 계면활성제(예컨대, 폴리비닐 알코올 및 폴리비닐 피롤리돈), 양이온 세정제, 음이온 세정제 및 지방산이 있으며, 일부 구체예에서는 혈청 단백질(특히 소혈청 단백질), 지방산 및/또는 이온성 세정제는 안정화제의 정의에서 제외될 수 있다.
모든 단백질이 본 발명에 따른 안정화제로서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 안정화제는 항원으로서 의도되지 않은 단백질인 것이다(이하 설명 참조); 이러한 구체예에서, 단백질은 조성물의 의도된 수용체와 동종에서 유래되는 것이 바람직하다(예컨대, 조성물이 인체용이라면, 안정화제로서 사용되는 단백질은 사람 단백질인 것이 바람직하다). 혈청 알부민은 이러한 구체예에서 안정화제로서 유용한 예시적 단백질이다. 다른 구체예에서, 항원 역시 안정화제로서 유용한데, 이러한 경우에 항원은 반드시 의도된 수용체와 부합되는 종일 필요는 없고, 일반적으로 부합되지 않는 종인 것이 바람직하다. 본 발명의 조성물 및 방법에 유용한 항원은 이하에 설명되어진다.
CIS 조성물 및 CIS 조성물의 사용 방법에 유용한 비이온성 세정제에는 데실디메틸포스핀 옥사이드(APO-10) 및 디메틸도데실포스핀 옥사이드(APO-12), 옥타노일-N-메틸글루카미드(MEGA-8), 노나노일-N-메틸글루카미드(MEGA-9) 및 데카노일-N-메틸 글루카미드(MEGA-10)와 같은 글루카미드류, 폴리옥시에틸렌(10) 도데실 에스테르(Genapol C100), 폴리옥시에틸렌(4) 라우릴 에테르(BRIJ® 30), 폴리옥시에틸렌(9) 라우릴 에테르(LUBROL® PX), 폴리옥시에틸렌(23) 라우릴 에테르(BRIJ® 35), 폴리옥시에틸렌(2) 세틸 에테르(BRIJ® 52), 폴리옥시에틸렌(l0) 세틸에테르(BRIJ® 56), 폴리옥시에틸렌(20) 세틸 에테르(BRIJ® 58), 폴리옥시에틸렌(2) 스테아릴 에테르(BRIJ® 72), 폴리옥시에틸렌(l0) 스테아릴 에테르(BRIJ® 76), 폴리옥시에틸렌(20) 스테아릴 에테르(BRIJ® 78), 폴리옥시에틸렌(100) 스테아릴 에테르(BRIJ® 700), 폴리옥시에틸렌(2) 올레일 에테르(BRIJ® 92), 폴리옥시에틸렌(l0) 올레일 에테르(BRIJ® 97), 폴리옥시에틸렌(20) 올레일 에테르(BRIJ® 98), 이소트리데실폴리(에틸렌글리콜에테르)8(Genapol 80), PLURONIC® F-68, PLURONIC® F-127, 도데실폴리(에틸렌글리콜에테르)9(Thesit)폴리옥시에틸렌(10) 이소옥틸페닐 에테르(TRITON® X-100), 폴리옥시에틸렌(8) 이소옥틸페닐 에테르(TRITON® X-114), 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노라우레이트(TWEEN® 20), 폴리옥시에틸렌소르비탄 모노팔미테이트(TWEEN® 40), 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노스테아레이트(TWEEN® 60), 폴리옥시에틸렌소르비탄 트리스테아레이트(TWEEN® 65), 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노올레이트(TWEEN® 80), 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 트리올레이트(TWEEN® 85), 폴록사머 188, 및 폴리에틸렌글리콜-p-이소옥틸페닐 에테르(Nonidet NP40)를 포함하는 폴리옥시에틸렌 에테르 세정제, 시클록헥실-n-에틸-β-D-말토사이드, 시클로헥실-n-헥실-β-D-말토사이드, 및 시클로헥실-n-메틸-β-D-말토사이드를 포함하는 알킬 말토사이드 세정제, n-데카노일슈크로스, 메틸 6-O-(N-헵틸카르바모일)-a-D-글루코피라노사이드(HECAMEG)를 포함하는 글루코피라노사이드류 및 n-데실-β-D-글루코피라노사이드, n-헵틸-β-D-글루코피라노사이드, n-도데실-β-D-글루코피라노사이드, n-노닐-β-D-글루코피라노사이드, n-옥틸-α-D-글루코피라노사이드 및 n-옥틸-β-D-글루코피라노사이드, 알킬 티오글루코피라노사이드류, 예컨대 n-헵틸-β-D-티오글루코피라노사이드, 알킬 말토피라노사이드류, 예컨대 n-데실-β-D-말토피라노사이드 및 n-옥틸-β-D-말토피라노사이드와 같은 알킬 글루코피라노사이드류, n-데실-β-D-티오말토사이드, 디기토닌, n-도데카노일 슈크로스, n-도데실-β-D-말토사이드, 헵탄 1,2,3-트리올, n-옥타노일-β-D-글루코실아민(NOGA), n-옥타노일 슈크로스, 폴록사머 188 및 폴록사머 407과 같은 폴록사머(폴리옥시에틸렌/폴리옥시프로필렌 블록 공중합체), 및 SB-10, SB-12 및 SB-14를 포함하는 설포베타인, 및 n-운데실-β-D-말토사이드가 있다. 바람직한 안정화제에는 폴리옥시에틸렌 에테르 세정제, 특히 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노올레이트 및 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 트리올레이트가 포함된다.
CIS 조성물 및 CIS 조성물의 사용 방법에 유용한 음이온 세정제에는 카프릴산과 이의 염, 케노데옥시콜린산 및 이의 염, 콜린산 및 이의 염, 데칸설폰산 및 이의 염, 데옥시콜린산 및 이의 염, 글리코데옥시콜린산 및 이의 염, 라우로일사르코신 및 이의 염, n-도데실 설페이트 및 이의 염(나트륨 염 및 리튬 염 포함), 타우로케노데옥시콜린산 및 이의 염, 타우로콜린산 및 이의 염, 타우로데하이드로콜린산 및 이의 염, 타우로데옥시콜린산 및 이의 염, 타우로리토콜린산 및 이의 염, 및 타우로우르소데옥시콜린산 및 이의 염이 포함된다.
양이온 세정제에는 세틸피리디늄 및 이의 염, 세틸트리메틸암모니아 및 이의 염, 예컨대 세틸트리메틸암모늄 브로마이드(CTAB), 도데실트리메틸암모니아 및 이의 염, 예컨대 도데실트리메틸암모늄 브로마이드, 알킬암모늄 이미다졸린, 4차 이미다졸린 및 테트라데실트리메틸암모니아 및 이의 염, 예컨대 테트라데실트리메틸암모늄 브로마이드가 있다.
안정화제로서 사용할 수 있는 것으로 선택되는 세정제는 오일/물(o/w) 에멀젼화 세정제로 간주되는 것이 바람직하다. o/w 에멀젼화 세정제는 당업계에 공지되어 있고, 일반적으로 소수성/친지성 수지(HLB)가 약 8 내지 약 18인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 미립 조성물에 첨가되는 세정제는 HLB가 약 10 내지 약 16, 보다 바람직하게는 약 11 내지 약 15인 것이 좋다(예컨대, 폴리에틸렌 글리콜 소르비탄 모노올레이트, HLB=15.4; 폴리옥시에틸렌(10) 이소옥틸페닐 에테르, HLB=13.5; 폴리옥시에틸렌(20) 소르비탄 트리올레이트 HLB=11).
특정 구체예에서, CIS 조성물은 또한 추가 성분으로서 1종 이상의 지방산 또는 이의 염을 포함할 수 있다. 지방산을 안정화제 성분으로서 이용하는 구체예와 지방산을 조성물의 추가 성분으로 이용하는 구체예에서, 안정화제로서 사용되는 지방산과 "추가" 성분으로서 사용되는 지방산은 상이한 것이다. 본 발명의 CIS 조성물에 유용한 지방산은 크기가 4 내지 30개 탄소원자 범위인 것으로서, 불포화(예컨대, 스테아르산), 일불포화(예컨대, 올레산) 또는 다불포화(예컨대, 리놀레산) 지방산일 수 있지만, 일불포화 및 다불포화 지방산이 일반적으로 바람직하다.
일부 구체예에서, CIS 조성물은 탄소 사슬 길이가 적어도 약 4개, 5개, 6개, 8개, 10개, 15개, 18개 또는 20개인 지방산 및 약 30개, 25개, 20개, 19개, 15개 또는 10개 미만인 지방산을 포함할 수 있다. 즉, 일부 구체예에서, 본 발명에 사용되는 지방산은 탄소원자가 약 4개 내지 30개, 5개 내지 25개, 10개 내지 20개, 또는 15개 내지 20개 범위인 탄소 사슬을 보유하는 것일 수 있다.
CIS 조성물에 유용한 지방산에는 아라키돈산, 데칸산, 도코산산, 도코사헥산산, 에이코산산, 헨네이코산산, 헵타데칸산, 헵탄산, 헥산산, 라우르산, 리놀레산, 리놀렌산, 미리스트산, 노나데칸산, 노난산, 옥탄산, 올레산, 팔미트산, 펜타데칸산, 스테아르산, 테트라코산산, 트리코산산, 트리데칸산 및 운데칸산이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. CIS 조성물에 사용할 수 있는 바람직한 지방산에는 올레산, 팔미트올레산 및 리놀레산이 있다.
본 발명의 특정 구체예에서, 항원은 CIS에 조성물에 첨가되거나 CIS 조성물과 함께 투여되기도 한다. 항원을 함유하는 CIS 조성물은 항원을 미립 조성물 자체에 첨가하거나, 또는 미립 조성물이 현탁된 용액에 용해 또는 현탁시킬 수 있다. 모든 항원이 본 발명의 CIS 조성물에 첨가되거나 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 방법
본 명세서에 기술된 바와 같이, 본 발명의 IMP는 특히 IL-6, TNF-α, IFN-γ 및 타입 I 인터페론, 예컨대 IFN-α 및 IFN-ω의 생산을 자극할 수 있고, B 세포 증식을 자극할 수 있으며(있거나) 형질세포성 수지상 세포를 활성화시켜 분화시킬 수 있다, 본 발명의 IMP는 또한 다른 시토킨, 케모킨 및 활성화-관련 단백질, 예컨대 IP-10(인터페론 유도 단백질 10kDa), MCP-1(단핵구 화학주성 단백질 1), MCP-2, MCP-3, MIG, MIP-3b, CD80, CD86, CD40, CD54 및 MHC 클래스 II(이에 국한되지 않음)의 생산을 자극할 수 있다. 본 발명의 IMP는 또한 IFN-α 유도성 유전자, 예컨대 2,5-올리고아데닐레이트 신타제(2,5-OAS), 인터페론 자극성 유전자-54K(ISG-54K) 및 구아닐레이트 결합 단백질-1(GBP-1)(이에 국한되지 않음)의 발현을 자극할 수도 있다. 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 또한 형질세포성 수지상 세포의 아폽토시스를 지연시키는 시그널을 제공할 수도 있다. 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 또한 천연 킬러(NK) 세포의 용해 활성도 자극할 수 있다. 따라서, 본 발명의 IMP는 특히 개체의 면역반응을 제어하는데 효과적이다.
본 발명은 개체에게 본 명세서에 기술된 바와 같은 IMP를 투여하는 것을 포함하여, 개체, 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간의 면역반응을 제어하는 방법을 제공한다. 면역제어는 Th1 타입 면역반응을 자극하고(하거나) Th2 타입의 면역반응을 억제 또는 감소시키는 것을 포함할 수 있다. IMP는 면역반응의 제어에 충분한 양으로 투여한다. 본 명세서에 기술된 바와 같이, 면역반응의 제어는 체액성 및/또는 세포성반응일 수 있으며, 당업계의 표준 방법 및 본 명세서에 기술된 바에 따라 측정할 수 있다.
예를 들어, 동물 또는 세포 집단, 예컨대 포유동물, 경우에 따라 인간, 혈액 세포(예컨대, PBMC, 림프구, 수지상 세포), 기관지 폐포 세척 세포, 또는 ISS 반응성 세포를 함유하는 기타 다른 세포 또는 세포 집단의 면역반응의 제어는 이러한 세포를 본 명세서에 기술된 IMP 또는 IMP 함유 조성물(예컨대, IMP, IMP와 항원, IMP-항원 접합체, IMP/마이크로담체 복합체 등을 함유하는 조성물)과 접촉시킴으로써 수행한다. 이러한 제어는 모든 형태의 접촉, 예컨대 세포와 IMP의 시험관내 공동배양, 포유동물(예컨대, 실험 동물) 피부에 IMP의 투여 및 비경구 투여 등을 통해 수행할 수 있다.
동물이나 세포 집단의 면역반응은 임의의 다양한 방식, 예컨대 IFN-γ, IFN-α, IL-2, IL-12, TNF-α, IL-6, IL-4, IL-5, IP-10, ISG-54K, MCP-1 중 1종 이상의 발현 증가, 또는 면역 자극의 유전자 발현 프로필 특성의 변화 뿐만 아니라 B 세포 증식 및 수지상 세포 성숙과 같은 반응 등을 통해 측정할 수 있다. 세포 집단에서의 면역반응 자극능은 다수의 용도, 예컨대 면역억제성 제제의 분석 시스템에서의 용도 등에 사용할 수 있다.
본 명세서에 기술된 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 공급받기에 적당한 개체에는 다수가 있다. 개체는 인간인 것이 바람직하나, 반드시 인간일 필요는 없다.
특정 구체예에서, 개체는 알레르기 또는 알레르기 유도 천식과 같은, Th2 타입 면역반응과 관련된 장애를 앓고 있는 것이다. IMP 투여는 면역제어를 유발하여 1종 이상의 Th1 타입 반응에 관련된 시토킨의 농도를 증가시키고, 결과적으로 알레르기항원에 대한 개체의 반응과 관련있는 Th2 타입의 반응 특징은 감소시킬 수 있다. Th2 타입 반응과 관련있는 장애를 앓고 있는 개체의 면역제어는 이 장애의 1가지 이상의 증상을 경감 또는 완화시킨다. 이러한 장애가 알레르기 또는 알레르기 유도 천식인 경우에, 1가지 이상의 증상의 완화에는 비염, 알레르기성 결막염, IgE의 혈행 농도, 히스타민의 혈행 농도 및/또는 '구조(rescue)' 흡입기 치료의 요구(에컨대, 계량 흡입기 또는 분무기를 통해 투여되는 흡입 알부테롤) 중에서 1가지 이상의 경감이 포함된다.
또 다른 구체예에서, 본 발명의 면역제어성 치료를 받는 개체는 백신 투여 개체이다. 여기서, 백신은 예방 백신 또는 치료 백신일 수 있다. 예방 백신은 개체가 감염가능성이 있는 장애와 관련있는 1종 이상의 에피토프(예컨대, 결핵 예방용 백신으로서 엠 튜베르큘로시스 항원)를 함유하는 것이다. 치료 백신은 개체가 앓고 있는 특정 장애와 관련있는 1종 이상의 에피토프, 예컨대 결핵 환자 중의 M.튜베르큘로시스 또는 M.보비스 표면 항원, 알레르기가 있는 개체 중에 있는 개체에게 알레르기성인 항원(즉, 알레르기 탈감작 치료), 암환자 유래의 종양 세포(예컨대, 미국 특허 5,484,596에 기술된 것), 또는 암환자의 종양 관련 항원을 포함할 수 있다.
IMP는 백신과 함께 투여될 수도 있고(예컨대, 동일 주사액으로, 또는 동시적이지만 별도의 주사액으로), 별도로 투여될 수도 있다(예컨대, 백신 투여 보다 저적어도 12시간 전 또는 후). 특정 구체예에서, 백신의 항원은 IMP에 공유 또는 비공유 결합된 IMP의 일부이다. 다른 구체예에서, IMP는 예방 백신으로서 단독으로 투여되어, 생물전 또는 테러의 제제로 사용되는 천연 또는 유전자 변형 유기체를 비롯한 다양한 박테리아 또는 바이러스 병원균에 의한 감염 내성을 증가시킬 수 있다. 백신을 공급받은 개체에 대한 면역제어성 폴리뉴클레오타이드 치료제의 투여는 백신에 대한 면역반응이 IMP 없는 백신을 공급받은 개체에 비하여 Th1 타입의 반응쪽으로 편향되도록 한다. Th1 타입 반응으로의 편향은 백신 중의 항원에 대한 지연형 과민(DTH) 반응, 증가된 IFN-γ 및 기타 다른 Th1 타입 반응 관련 시토킨, 백신의 항원에 특이적인 CTL 생산, 백신 항원에 특이적인 IgE의 낮은 또는 감소된 농도, 백신 항원에 특이적인 Th2 관련 항체의 감소 및/또는 백신 항원에 특이적인 Th1 관련 항체의 증가를 통해 확인할 수 있다. 치료 백신인 경우에, IMP와 백신의 투여는 백신이 치료하고자 한 장애의 1종 이상의 증상을 경감시킨다. 당업자에게 자명하듯이, 정확한 증상과 이의 향상 방식은 치료하고자 하는 장애에 따라 달라질 것이다. 예를 들면, 치료 백신이 결핵에 대한 것이라면 백신과 IMP 치료는 기침, 흉벽 통증, 고열 및/또는 당업계에 공지된 기타 다른 증상을 감소시킨다. 백신이 알레르기 탈감작 치료에 사용되는 알레르기항원인 경우에, 치료는 알레르기 증상을 감소시킬 것이다(예컨대, 비염, 알레르기 결막염, IgE의 혈행 농도 및/또는 히스타민의 혈행 농도의 감소).
본 발명의 기타 다른 구체예에는 기존 질병 또는 장애, 예컨대 암이나 감염 질환을 보유한 개체의 면역제어성 치료에 관한 것이다. 암은 대부분의 암은 체내의 다른 세포에서 발견되지 않는 종양 관련 항원 및/또는 종양 특이 항원을 발현하기 때문에 면역제어의 매력적인 표적이다. 종양 세포에 대항하는 Th1 타입 반응의 자극은 면역계에 의한 종양 세포의 직접 사멸 및/또는 방관자(bystander) 사멸을 초래하여 암세포 및/또는 증상을 감소시킨다. 즉, 암환자에 대한 IMP 투여는 종양 세포에 대한 Th1 타입 면역반응을 자극시킨다. 이러한 면역반응은 세포성 면역계 세포(예컨대, CTL, NK 세포) 또는 체액성 면역계 성분의 직접 작용을 통해, 또는 면역계가 표적으로 하는 세포의 근접 세포에 대한 방관자 효과를 통해 종양 세포를 사멸시킬 수 있다[예컨대, Cho et al.(2000) Nat.Biotechnol. 18:509-514 참조]. 암인 경우에, IMP 투여는 추가로 항종양 항체, 화학치료 방법 및/또는 방사선 치료와 같은 1가지 이상의 추가 치료 제제의 투여를 수반할 수 있다. 항종양 항체 단편 및/또는 이의 유도체, 및 모노클로날 항종양 항체, 이의 단편 및/또는 유도체를 이에 국한됨이 없이 포함하는 항종양 항체는 암치료 시의 이러한 항체 시약의 투여와 관련하여 당업계에 공지되어 있다(예컨대, Rituxan®(리투시마브); Herceptin®(트라스투주마브)). 1가지 이상의 추가 치료 제제의 투여는 IMP 투여 전이나 후 및/또는 동시에 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 면역제어성 치료는 또한 감염 질환을 앓는 개체, 특히 체액성 면역 반응에 내성이 있는 감염 질환을 앓는 개체에게 유용하다(예컨대, 미코박테리아 감염 및 세포내 병원균 유발 질환). 면역제어성 치료는 세포 병원균(예컨대, 박테리아 또는 원생동물)이나 아세포 병원균(예컨대, 바이러스)이 원인인 감염 질환의 치료에 사용될 수 있다. IMP 치료는 결핵(예컨대, 엠 튜베르쿨로시스(M. tuberculosis) 및/또는 엠 보비스(M. bovis) 감염), 나병(즉, 엠 레프레(M. leprae) 감염), 또는 엠 마리눔(M. marinum) 또는 엠 울서란스(M. ulcerans) 감염과 같은 미코박테리아 질환을 앓고 있는 개체에게 투여될 수 있다. IMP 치료는 또한 인플루엔자 바이러스, 호흡기 합포체 바이러스(RSV), B형 간염 바이러스, C형 간염 바이러스, 헤르페스 바이러스, 특히 헤르페스 단순 바이러스 및 파필로마 바이러스에 의한 감염을 포함하는 바이러스 감염의 치료에 유용하다. 또한. 말라리아(예컨대, 플라스모듐 바박스(Plasmodium vivax), 피 올발레(P. ovale), 피 팔시파럼(P.falciparum) 및/또는 피 말라리애(P. malariae)에 의한 감염), 리슈만편모충증(예컨대, 리슈마니아 도노바니(Leishmania donovani), 엘 트로피카(L. tropica), 엘 멕시카나(L. mexican), 엘 브라질리엔시스(L. braziliensis), 엘 페루비아나(L. peruviana), 엘 인판텀(L. infantum), 엘 챠가시(L. chagasi), 및/또는 엘 아에티오피카(L. aethiopica)에 의한 감염), 및 톡소포자충증(즉, 톡소플라스모시스 곤디(Toxoplasmosis gondii)에 의한 감염)와 같은 세포내 기생충 유발 질환에도 IMP 치료가 효과적이다. IMP 치료는 또한 주혈흡충증(즉, 에스 헤마토비움(S. haematobium), 에스 만소니(S. matzsoni), 에스 자포니컴(S. japonicum) 및 에스 메콘지(S. mekongi)와 같은 주혈흡충 속의 혈액 흡충에 의한 감염) 및 간흡충증(즉, 클로노키스 시넨시스(Clonorchis sinensis)에 의한 감염)과 같은 기생충 질환의 치료에도 유용하다. 감염성 질환을 앓고 있는 개체에 대한 IMP의 투여는 감염성 질환의 증상을 경감시킨다. 일부 구체예에서, 감염성 질환은 비바이러스 질환이다.
또한, 본 발명은 IL-2, IL-12, TNF-β, IFN-γ 및 IFN-α를 포함하는, 개체의 1종 이상의 Th1 관련 시토킨을 증가 또는 자극하는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 IFN-γ가 증가되도록 개체에게 IMP의 유효량을 투여하여, 개체, 특히 증가된 IFN-γ 농도를 필요로 하는 개체의 IFN-γ를 증가 또는 자극하는 방법을 제공한다. 증가된 IFN-γ를 필요로 하는 개체는 일반적으로 IFN-γ의 투여 시 반응하는 장애를 갖는 개체이다. 이러한 장애에는 궤양성 결장염을 이에 국한됨이 없이 포함하는 수많은 염증성 장애가 포함된다. 이러한 장애에는 또한 특발 폐 섬유증(IPF), 피부경화증, 피부의 방사선 유도성 섬유증, 주혈흡충증 유도의 간 섬유증을 비롯한 간 섬유증, 신장 섬유증 뿐만 아니라 IFN-γ 투여시 개선될 수 있는 기타 다른 증상을 이에 국한됨이 없이 포함하는 다양한 섬유증 장애도 포함된다. 본 발명에 따른 IMP 투여는 IFN-γ 농도 증가, IFN-γ에 반응하는 장애의 1가지 이상의 증상의 경감, 1가지 이상의 증상의 안정화 및/또는 진행 예방 또는 지연(예컨대, 추가 병변이나 증상의 감소 또는 제거)을 제공한다.
본 발명의 방법은 이러한 장애의 치료에 기준이 되는 기타 다른 치료, 예컨대 IPF에서의 전신 코르티코스테로이드 치료(예컨대, 코르티손)와 같은 항염증제 투여 등과 함께 수행될 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 타입 I 인터페론의 농도가 증가되도록 개체에게 IMP의 유효량을 투여하여, 개체, 특히 증가된 타입 I 인터페론 농도를 필요로 하는 개체 중의 IFN-α, IFN-β 및 IFN-ω를 비롯한 타입 I 인터페론을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 IFN-α의 농도가 증가되도록 개체에게 IMP의 유효량을 투여하여, 개체, 특히 증가된 IFN-α 농도를 필요로 하는 개체 중의 IFN-α를 증가시키는 방법을 제공한다. 증가된 IFN-α를 필요로 하는 개체는 일반적으로 재조합 IFN-α를 비롯한 IFN-α의 투여에 반응하는 장애, 예컨대 바이러스 감염 및 암(이에 국한되지 않음)을 가진 개체이다. 보다 높은 농도의 IFN-α의 증가 생산이 바람직한 일부 구체예에서, IMP는 적어도 다음과 같은 길이(염기), 즉 10개, 12개, 14개, 16개, 18개, 20개, 22개, 24개, 26개, 28개 또는 30개의 길이를 가진 팔린드롬 서열을 1개 이상 함유하는 것이고, 일부 구체예에서, IMP는 30개 보다 긴 염기 길이를 가진 팔린드롬 서열을 1개 이상 함유하는 것이다.
본 발명에 따른 IMP의 투여는 IFN-α 농도를 증가시키고, IFN-α에 반응하는 장애의 1가지 이상의 증상의 경감, 1가지 이상의 증상의 안정화 및/또는 진행 예방 또는 지연(예컨대, 추가 병변 또는 증상의 제거)을 초래한다. 본 발명의 방법은 이러한 장애의 치료에 기준이 되는 기타 다른 치료, 예컨대 바이러스 감염에 대한 항바이러스제의 투여 등과 함께 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 개체에게 IMP의 유효량을 투여하여, IgE 관련 장애를 가진 개체 중의 IgE 농도, 특히 혈청 농도를 감소시키는 방법을 제공한다. 이러한 방법에서, 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 단독(예컨대, 항원 없이)으로 투여되거나, 또는 항원, 예컨대 알레르기항원과 함께 투여될 수 있다. IgE의 감소는 IgE 관련 장애의 1종 이상의 증상을 경감시킨다. 이러한 증상에는 비염, 결막염, 알레르기항원에 대한 민감성 감소, 알레르기성 개체의 알레르기 증상의 감소, 또는 알레르기 반응의 중증도 감소가 포함된다. 따라서, 본 발명은 개체의 알레르기 증상을 치료하는 방법도 제공한다. 일부 구체예에서, 알레르기 증상을 치료하는 방법에는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 특정 양 또는 용량의 항원과 함께 투여하는 것이 포함된다. 추가적인 임의의 항원이 투여된다면, 투여되는 항원의 양 또는 용량은 치료 전 과정 동안 일정하게 유지시키거나 또는 감소 또는 증가시킬 수 있다(통상적인 탈감작 치료에서와 같이).
일부 구체예에서, 본 발명은 CTL 생산이 증가되도록 개체에게 IMP의 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 개체, 특히 CTL의 증가된 수 및/또는 활성을 필요로 하는 개체의 CTL 생산을 자극하는 방법을 제공한다. 증가된 CTL 생산을 필요로 하는 개체는 CTL 활성에 일반적으로 반응하는 장애를 가진 개체이다. 이러한 장애에는 암 및 세포내 감염이 포함되지만 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명에 따른 IMP 투여는 CTL 농도를 증가시키고 CTL활성에 반응하는 장애의 1종 이상의 증상의 경감, 1종 이상의 증상의 안정화 및/또는 진행의 예방 또는 지연(추가 병변 또는 증상의 감소 또는 제거)을 초래한다.
본 발명의 방법에는 본 명세서에 기술된 모든 구체예, 예컨대 면역제어성 폴리뉴클레오타이드/마이크로담체 복합체 형태(항원의 유무 또는 일정 투여 시간 동안의 항원 유무 하에) 또는 항원과 근접 연합 형태로 IMP를 투여하는 것이 포함된다.
당업자에게 자명한 것처럼, 본 발명의 방법은 IMP가 투여되는 특정 징후에 대한 다른 치료법과 함께 수행될 수 있다. 예를 들어, IMP 치료는 말라리아 환자를 위한 클로로퀸과 같은 말라리아 약물과 함께, 리슈만편모충증 환자를 위한 펜타미딘 및/또는 알로퓨리놀과 같은 리슈만편모충 약물과 함께, 결핵 환자를 위한 이소니아지드, 리팜핀 및/또는 에탐부톨과 같은 항미코박테리아 약물과 함께 또는 아토피(알레르기) 환자를 위한 알레르기항원 탈감작 치료와 함께 수행될 수 있다.
본 명세서에 사용된 바와 같은 IMP 투여는 추가로 시토킨, 보조제 및 항체(예컨대, 항체 단편 및/또는 유도체 및 모노클로날 항체, 이의 단편 및/또는 유도체, 이에 국한되지 않음)를 이에 국한됨이 없이 포함하는 추가 면역치료제(즉, 면역계를 통해 작용하고(하거나) 면역계 유래인 제제) 1종 이상의 투여를 포함할 수 있다. 치료 항체의 예에는 암과 관련하여 사용되는 항체(예컨대 항종양 항체)가 포함된다. 이러한 추가 면역치료제의 투여는 본 명세서 기술된 모든 방법에 적용된다.
IMP는 또한 보조제와 함께 투여될 수 있다. IMP 및 보조제와 함께 항원의 투여는 항원에 대한 면역반응을 증강시키고, 이에 따라 IMP와 항원만을 함유하는 조성물에서 생성되는 반응에 비해 증강된 면역반응을 나타낼 수 있다. 보조제는 당업계에 공지되어 있으며, 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼, 명반(알루미늄염), 리포좀 및 마이크로입자, 예컨대 폴리스티렌, 전분, 폴리포스파젠 및 폴리락타이드/폴리글리코사이드(이에 국한되지 않음)를 포함하지만, 이에 국한되는 것은 아니다. 기타 다른 적당한 보조제에는 또한 MF59, DETOX™(Ribi), 스쿠알렌 혼합물(SAF-1), 뮤라밀 펩타이드, 사포닌 유도체, 미코박테리움 세포벽 제조물, 모노포스포릴 지질 A, 미콜산 유도체, 비이온성 블록 공중합체 계면활성제, Quil A, 콜레라 독소 B 서브유닛, 폴리포스파젠 및 유도체, 문헌[Takahashi et al.(1990) Nature 344:873-875]에 기술된 바와 같은 면역자극성 복합체(ISCOM) 뿐만 아니라 지질계 보조제 및 본 명세서에 기술된 기타 다른 보조제가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 수의용 및 동물에서의 항체 생산용에는 프로인트 보조제(완전 및 불완전)의 분열촉진성 성분이 사용될 수 있다.
투여 및 면역반응의 측정
IMP는 본 명세서에 기술된 바와 같은 다른 약제 및/또는 면역원성제 및/또는 면역자극제와 함께 투여될 수 있고, 이의 생리학적으로 허용되는 담체와 혼합될 수 있다(따라서, 이러한 조성물도 본 발명에 포함된다). IMP는 본 명세서에 기술된 임의의 형태일 수 있다.
따라서, IMP는 시토킨, 보조제 및 항체를 이에 국한됨이 없이 포함하는 기타 다른 면역치료제와 함께 투여할 수 있다.
모든 면역원성 조성물에서와 같이, 특정 IMP 제제의 면역학적 유효량 및 투여 방법은 개체, 치료되어야 하는 증상 및 당업자에게 자명한 기타 다른 요인에 따라 달라질 수 있다. 고찰되어야 하는 요인에는 투여된다면 항원의 항원성, IMP가 보조제, 전달 분자 및/또는 항원과 함께 또는 공유 부착되어 투여되는지의 여부, 투여 경로 및 면역화 용량의 투여 횟수가 있다. 이러한 요인들은 당업계에 공지되어 있고, 당업자라면 이러한 결정을 지나친 실험없이 수행할 수 있을 것이다. 적당한 투여량 범위는 면역반응의 목적한 제어(예컨대, IFN-α 및/또는 IFN-γ의 자극)를 제공하는 범위이다. 항원에 대한 면역반응이 필요한 경우에는 적당한 투여량 범위는 항원에 대한 면역반응의 목적한 제어를 제공하는 범위이다. 일반적으로 투여량은 투여되는 IMP 함유 조성물의 총 양 보다는 환자에게 투여되는 IMP의 양에 따라 결정한다. 전달되는 IMP의 양으로 제시되는 IMP의 유용한 투여량 범위는 예컨대 대략 다음과 같은 임의의 범위일 수 있다: 1 내지 500㎍/kg, 100 내지 400㎍/kg, 200 내지 300㎍/kg, 1 내지 100㎍/kg, 100 내지 200㎍/kg, 300 내지 400㎍/kg, 400 내지 500㎍/kg. 각 환자에게 제공되는 절대량은 생체이용율, 청소율 및 투여 경로와 같은 약리학적 성질에 따라 달라진다.
특정 IMP 제제의 유효량과 투여방법은 개개의 환자, 목적 결과 및/또는 장애의 종류, 질병의 단계 및 당업자에게 자명한 기타 다른 요인에 따라 달라질 수 있다. 특정 용도에 유용한 투여 경로는 당업자에게 명백한 것이다. 투여 경로에는 국소, 피부, 경피, 경점막, 표피, 비경구, 위장, 및 비인두 및 폐, 예컨대 기관지경유 및 폐포경유 경로가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 적당한 투여량 범위는 혈액 농도로 측정했을 때 약 1 내지 10μM의 조직 농도에 도달하기에 충분한 IMP 함유 조성물을 제공하는 범위이다. 각 환자에게 제공되는 절대량은 생체이용율, 청수율 및 투여 경로와 같은 약리학적 성질에 따라 달라진다.
본 명세서에 기술된 바와 같이, APC 및 다량의 APC를 함유하는 조직은 IMP의 바람직한 표적이다. 즉, APC가 비교적 고농도로 존재하는 포유동물 피부 및/또는 점막으로의 IMP 투여가 바람직하다.
본 발명은 국소 투여에 적당한 IMP 제제, 예컨대 생리학적으로 허용되는 임플란트, 연고, 크림, 린스 및 젤을 이에 국한됨이 없이 제공한다. 국조 투여는 예컨대 전달 시스템에 분산된 드레싱 또는 붕대, 절개부 또는 열린 상처부위에 전달 시스템의 직접 투여, 또는 당해 부위 지향성인 경피 투여 장치를 이용한 투여이다. IMP가 분산되어 있는 크림, 린스, 젤 또는 연고는 국소 연고 또는 상처 충진형 제제로서 사용하기에 적당하다.
피부 투여에 바람직한 경로는 침습성이 가장 적은 경로이다. 이러한 수단 중에서 바람직한 수단에는 경피 전달, 표피 투여 및 피하 주사가 있다. 이러한 수단 중에서, 표피 투여가 피내 조직에 존재할 것으로 예상되는 APC의 농도가 보다 높기 때문에 바람직하다.
경피 투여는 IMP가 피부를 투과하여 혈류로 유입될 수 있게 할 수 있는 크림, 린스, 젤 등의 투여를 통해 수행한다. 경피 투여에 적당한 조성물에는 피부에 직접 적용되거나 경피 장치(소위, "패취")와 같은 보호성 담체에 첨가되는 약제학적으로 허용되는 현탁액, 오일, 크림 및 연고 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 적당한 크림, 연고 등의 예는 의사 처방 참고서 등에서 찾아볼 수 있다.
경피 전달의 경우, 이온삼투요법이 적당한 방법이다. 이온삼투 전달은 성분을 수일 이상 동안 온전한 피부를 통해 연속으로 전달하는 시판 패취를 사용하여 수행할 수 있다. 이러한 방법의 사용은 약학적 조성물을 비교적 높은 농도로 조절 전달할 수 있고, 혼합 약물을 주입시킬 수 있으며 흡수 촉진제가 동시 사용될 수 있게 한다.
본 방법에 유용한 패취 제품의 예에는 제너럴 메디칼 컴패니社(캘리포니아 로스앤젤레스 소재)의 상표명 LECTRO PATCH 제품이 있다. 이 제품은 중성 pH에서 저장소의 전극을 전기적으로 유지시키고 여러 농도의 투여량을, 연속적으로 및/또는 주기적으로 투여하는데 사용될 수 있다. 이러한 패취의 제조 및 사용은 LECTRO PATCH 제품에 동봉된 제조사의 지침서에 따라 수행되어야 하며; 이러한 지침서는 본원에 참고원용된다. 기타 다른 폐색성 패취 시스템도 적당하다.
경피 전달의 경우, 저주파 초음파 전달도 적당한 방법이다[Mitragotri et al. (1995) Science 269:850-853]. 저주파 초음파의 주파수(약 1MHz) 적용은 고분자량의 조성물을 포함한, 치료 조성물의 전신 조절 전달을 허용한다.
표피 투여는 본질적으로 자극제에 대한 면역반응을 자극하기에 충분하게 표피의 최외각 층을 기계적 또는 화학적으로 자극하는 것을 수반한다. 구체적으로, 자극은 자극 부위로 APC를 유인하기에 충분해야 한다.
기계적 자극 수단의 일 예는 피부를 자극하여 APC를 자극 부위로 유인하고, 타인(tine)의 말단에서부터 전달된 IMP를 흡수하도록 할 수 있는 복수의 매우 좁은 직격의 짧은 타인(tine)을 이용한다. 예를 들어, 파스퇴르 메루 오브 라이온(프랑스)社에서 제작한 MONO-VACC 재래식 튜베르쿨린 시험은 IMP 함유 조성물의 도입에 적당한 장치를 수반한다.
이 장치(펜실베니아 스위프트워터에 소재하는 코너트 레보레이토리즈, 인크.社(미국)에서 배포한 장치)는 한쪽 말단에는 주사기 플런저를 보유하고 다른쪽 말단에는 타인 디스크를 보유한 플라스틱 용기로 구성되어진다. 타인 디스크는 표피 세포의 최각층만을 긁을 수 있는 길이의 복수의 미세직경 타인을 지지하고 있다. MONO-VACC 킷트에 함유된 각 타인에는 재래식 튜베르쿨린이 코팅되어 있는데, 본 발명에서는 각 주사바늘에 IMP 제제의 약학적 조성물이 코팅되어진다. 이러한 장치의 사용은 장치 제품에 포함되어 있는 제작자의 지침서에 따르는 것이 바람직하다. 또한, 본 구체예에 사용될 수 있는 기타 유사 장치는 현재 알레르기 시험 수행에 사용되는 것이다.
IMP의 표피 투여에 적당한 다른 시도에는 표피의 최외각 세포를 자극하여 APC이 이 구역으로 유인되기에 충분한 면역반응을 자극하는 화합물의 사용이 있다. 그 일 예는 녹세마 코포레이션에서 상표명 NAIR로 시판하는 국소 탈모제 크림에 사용되는 살리실산과 같은 각질용해제이다. 이러한 시도는 또한 점막으로의 상피 투여에도 사용될 수 있다. 화학 자극제는 또한 기계식 자극제(예컨대, MONO-VACC 타입 타인에 화학 자극제가 코팅된 경우 제공되듯이)와 함께 적용될 수 있다. IMP는 화학자극제를 함유하는 담체에 현탁되거나 담체와 공동투여될 수 있다.
비경구 투여 경로에는, 전기(이온삼투요법) 또는 직접 주사, 예컨대 중추 정맥선, 정맥내, 근육내, 복강내, 피내 또는 피하 주사로의 직접 주사 등이 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 비경구 투여에 적당한 IMP 제제는 일반적으로 USP 수 또는 주사용수에 조제되는 것이고, 추가로 pH 완충제, 염 확장성 약물, 보존제 및 다른 약제학적으로 허용되는 부형제를 함유할 수 있다. 비경구 주사용의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 주사용 식염수 및 인산염 완충 식염수와 같은 약제학적으로 허용되는 멸균 등장액에 조제될 수 있다.
위장 투여 경로에는 섭취 경로 및 직장 경로가 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 본 발명에는 섭취용의 약제학적으로 허용되는 분말, 환제 또는 액체 및 직장 투여용의 좌약을 이에 국한됨이 없이 포함하는 위장 투여에 적당한 IMP 제제가 포함된다. 당업자에게 자명하듯이, 환제 또는 좌약은 추가로 조성물의 부피를 팽창시키기 위한 전분과 같은 약제학적으로 허용되는 고체를 포함할 수 있다.
비인두 및 폐 투여는 흡입을 통해 수행되고, 그 경로에는 비내, 기관지경과 및 폐경과 경로 등의 전달 경로가 포함된다. 즉, 본 발명은 무수 분말 흡입 전달 시스템용의 분말 제형 뿐만 아니라 에어로졸 형성용의 액체 현탁제를 이에 국한됨이 없이 포함하는, 흡입 투여에 적당한 IMP 제제를 포함한다. IMP 제제의 흡입 투여에 적당한 장치에는 아토마이저, 기화기, 분무기 및 무수 분말 흡입 전달 장치가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다.
당업계에 공지된 바와 같이, 본 명세서에 기술된 투여 경로에 사용되는 용액 또는 현탁제는 다음과 같은 임의의 성분을 1종 이상 포함할 수 있다: 멸균 희석제, 예컨대 주사용수, 식염수 용액, 고정용 오일, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세린, 프로필렌 글리콜 또는 기타 다른 합성 용매; 항균제, 예컨대 벤질 알코올 또는 메틸 파라벤; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 중아황산나트륨; 킬레이트화제, 예컨대 에틸렌디아민테트라아세트산; 완충제, 예컨대 아세트산염, 구연산염 또는 인산염, 및 염화나트륨이나 덱스트로스와 같은 장성 조정제. pH는 염산 또는 수산화나트륨과 같은 산이나 염기로 조정할 수 있다. 비경구 제제는 유리나 플라스틱으로 제조된 앰플, 일회용 주사기 또는 다용량 바이엘에 밀봉될 수 있다.
당업계에 공지된 바와 같이, 주사용으로 적당한 약학적 조성물은 멸균 수성 용액(수용성인 경우) 또는 분산액 및 멸균 주사용 용액 또는 분산액의 즉석 제조용 멸균 분말을 포함한다. 정맥내 투여의 경우에, 적당한 담체에는 생리적 식염수, 정균수, Cremophor EL™(BASF, 뉴저지 파시파니 소재) 또는 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된다. 모든 경우에, 조성물은 멸균되어야 하고 용이한 주사성이 유지될 정도까지 유체이어야 한다. 또한, 제조 및 보관 조건 하에서 안정해야 하고 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대한 보존성이 있어야 한다. 담체는 물, 에탄올, 폴리올(예컨대, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이의 적당한 혼합물을 함유하는 용액 또는 분산액일 수 있다. 적당한 유동성은 예컨대, 레시틴과 같은 코팅의 사용, 분산액인 경우에는 필요한 입자 크기의 유지 및 계면활성제의 사용을 통해 유지시킬 수 있다. 미생물의 작용 방지는 다양한 항균 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등을 통해 달성될 수 있다. 또한, 조성물에는 당, 폴리알코올(예컨대, 만니톨, 소르비톨) 및 염화나트륨과 같은 등장제가 포함되는 것이 바람직할 수 있다. 주사성 조성물의 장기 흡수는 조성물에 흡수 지연 제제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴을 첨가하여 달성할 수 있다.
당업계에 공지되어 있듯이, 멸균 주사성 용액은 필요한 양의 활성 화합물을, 필요에 따라 전술한 1종 이상의 성분을 보유한 적당한 용매에 첨가한 뒤, 여과 멸균하여 제조할 수 있다. 일반적으로, 분산액은 염기성 분산 매질 및 필요에 따라 전술한 기타 다른 성분을 함유하는 멸균 부형제에 활성 화합물을 첨가하여 제조한다. 멸균 주사성 용액을 제조하기 위한 멸균 분말인 경우에, 바람직한 제조 방법은 사전에 멸균 여과된 용액으로부터 활성 성분과 임의의 바람직한 추가 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다.
전달 경로는 유도되는 면역반응을 제어하는 것으로 선택할 수 있다. 예를 들어, 인플루엔자 바이러스 벡터를 근육내 또는 표피(유전자 총) 경로를 통해 투여했을 때 IgG 역가와 CTL 활성은 동일하게 나타났지만, 근육 접종은 주로 IgG2a를 생산한 반면, 표피 경로는 주로 IgG1을 생산했다[Pertmer et al.(1996) J.Virol. 70:6119-6125]. 즉, 당업자는 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 경로에 따라 유인되는 면역원성의 약간의 차이를 이용할 수 있다.
전술한 조성물 및 투여 방법은 본 발명의 IMP 제제를 투여하는 방법을 예시하는 것이지, 제한하기 위한 것이 아니다. 다양한 조성물 및 장치의 제조 방법은 당업자의 실행능력에 속하는 것으로서 본 명세서에는 상세하게 설명하지 않았다.
IMP에 대한 면역반응의 분석은 예컨대 항원 특이적 항체 생산의 측정(예컨대, 특이적 항체 아군의 측정), CD4+ T 세포, B 세포, NK 세포 또는 CTL과 같은 특정 림프구 집단의 활성화, 수지상 세포(예컨대, 형질세포성 수지상 세포)의 성숙, IFN-γ, IFN-α, IFN-ω, TNF-α, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12, IP-10, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MIG 또는 MIP-3β와 같은 시토킨 및 케모킨의 생산 및/또는 히스타민 방출을 이에 국한됨이 없이 포함하는 당업계에 공지된 임의의 방법으로 수행할 수 있다. 특이적 항체 반응의 측정 방법은 효소 결합된 면역흡착 분석법(ELISA)을 포함하며 당업계에 공지되어 있다. CD4+ T 세포와 같은 특정 종류의 림프구 수의 측정은 예컨대 형광 활성화 세포 분류법(FACS)으로 수행할 수 있다. 특정 세포 집단의 활성화 측정은 특정 세포 종류의 활성화에 특이적인 마커, 예컨대 세포 표면 마커의 발현을 측정하여 수행할 수 있다. 세포 마커 발현은 예컨대 FACS 분석 등으로 특정 마커의 세포 표면 발현을 측정하거나 RNA 발현을 측정하여 수행할 수 있다. 세포독성 및 CTL 분석은 예컨대, 문헌[Raz et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 : 9519-9523 and Cho et al. (2000)]에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 시토킨 농도는 예컨대 ELISA로 측정할 수 있다. 수지상 세포의 성숙 측정은 예컨대 문헌[Hartmann et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 9305-9310]에 기술된 바와 같이 수행할 수 있다. 면역원에 대한 면역반응을 평가하는 이러한 분석법 및 기타 다른 분석법은 당업계에 공지되어 있다. 예컨대, 문헌[Selected Methods in Cellular Immunology (1980) Mishell and Shiigi, eds. , W. H. Freeman and Co.]를 참조할 수 있다.
IMP에 대한 면역반응의 측정(정량적 및 정성적)은 또한 IMP에 의해 생산이 자극되는 시토킨, 케모킨 및/또는 시토킨에 의해 유도되는 기타 다른 분자, 예컨대 IFN-γ 및/또는 IFN-α의 농도 측정으로 수행될 수 있다. 따라서, 본 발명의 IMP는 또한 IFN-γ 및/또는 IFN-α 유도성 시토킨, 케모킨 및 염증성 단백질, 예컨대 IP-10(인터페론 유도성 단백질 10kDa), IFN-γ에 의해 유도된 모노킨 및 단핵구 화학주성 단백질 1(MCP-1)(이에 국한되지 않음)의 발현을 자극할 수 있다. IMP에 대한 면역반응은 또한 항바이러스 활성이 있는 것으로 알려진 시토킨, 케모킨 및/또는 기타 다른 분자, 예컨대 2,5-올리고아데닐레이트 신타제(2,5-OAS), 인터페론 자극성 유전자-54K(ISG-54K), MxA, MxB 및 구아닐레이트 결합 단백질-1(GBP-1) 등의 측정을 통해 분석될 수 있다. 즉, 항바이러스 분자 및 IFN-γ 및/또는 IFN-α에 의해 유도된 분자는 IMP 활성의 마커로서 사용될 수 있다. 이러한 인터페론 유도성 분자 생산 및/또는 유전자 발현의 측정은 당업계에 공지된 임의의 방법, 예컨대 RNA 생산을 측정하는 정량적 PCR 및 ELISA(이에 국한되지 않음)를 통해 수행할 수 있다.
Th1 타입 반응은 자극되고, 즉 유인 및/또는 향상되는 것이 바람직하다. 본 발명과 관련하여, Th1 타입 면역반응의 자극은 IMP 없이 치료한 세포와 비교하여, IMP로 처리한 세포의 시토킨 생산을 측정하여 시험관내 또는 생체외에서 확인할 수 있다. 세포의 시토킨 생산 측정 방법에는 본 명세서에 기술된 방법 뿐만 아니라 당업계에 공지된 임의의 방법이 포함된다. IMP 처리에 대한 반응으로 생산되는 시토킨의 타입은 세포에 의한 Th1 타입 또는 Th2 타입 편향성 면역반응인지를 시사해준다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "Th1 타입 편향성(Th1-type biased)" 시토킨 생산이란 용어는 자극제의 존재하에 Th1 타입 면역반응과 관련된 시토킨이 자극 부재 하에 상기 시토킨에 의해 생산된 양과 비교했을 때, 측정가능한 정도의 증가된 생산임을 의미한다. 이러한 Th1 타입 편향성 시토킨의 예에는 IL-2, IL-12, IFN-γ 및 IFN-α가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이에 반해, "Th2 타입 편향성 시토킨"이란 Th2 타입 면역반응과 관련된 시토킨을 의미하는 것으로서, IL-4, IL-5 및 IL-13을 포함하나, 이에 국한되는 것은 아니다. IMP 활성 측정에 유용한 세포에는 면역계의 세포, 숙주 및/또는 세포주에서 분리된 원시세포, 바람직하게는 APC 및 림프구, 보다 바람직하게는 대식세포 및 T 세포가 있다.
Th1 타입 면역반응의 자극은 또한 IMP로 처리된 숙주에서 측정할 수도 있는데, 예컨대 당업계에 공지된 다음과 같은 임의의 방법으로 측정할 수 있다: (1) 항원 시험접종 전과 후에 측정된 IL-4 또는 IL-5 농도의 감소; 또는 경우에 따라 IMP 없이 처리된 항원-초회감작된(antigen-primed), 또는 초회감작 및 시험접종된 대조군과 비교했을 때, IMP 처리된 숙주에서의 IL-4 또는 IL-5 수준의 감소(또는 심지어 부재)의 측정; (2) 항원 시험접종 전과 후의 IL-12, IL-18 및/또는 IFN(α, β 또는 γ)의 농도 증가; 또는 IMP 없이 처리된 항원 초회감작된, 또는 초회감작 및 시험접종된 대조군과 비교했을 때, IMP 처리된 숙주에서의 IL-12, IL-18 및/또는 IFN(α, β 또는 γ)의 보다 높은 농도의 측정; (3) IMP 없이 처리된 대조군과 비교했을 때 IMP 처리된 숙주에서의 "Th1 타입 편향성" 항체 생산; 및/또는 (4) 항원 시험접종 전과 후에 측정했을 때 항원 특이적 IgE 농도의 감소; 또는 IMP 없이 처리된 항원 초회감작된, 또는 초회감작 및 시험접종된 대조군과 비교했을 때 IMP 처리된 숙주에서의 보다 낮은 농도(또는 심지어 미측정)의 항원 특이적 IgE 측정. 이와 같은 다양한 측정은 본 명세서에 기술되거나 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 시험관내 또는 생체외에서, APC에 의해 제조된 시토킨 및/또는 림프구, 바람직하게는 대식세포 및/또는 T 세포를 측정하여 수행할 수 있다. 이러한 측정 중 일부는 본 명세서에 기술되거나 또는 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 항원 특이적 항체의 클래스 및/또는 서브클래스를 측정하여 수행할 수 있다.
IMP 처리에 반응하여 생산되는 항원 특이적 항체의 클래스 및/또는 서브클래스는 세포에 의한 Th1 타입 또는 Th2 타입 편향성 면역반응을 시사해준다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "Th1 타입 편향성" 항체 생산이란 용어는 Th1 타입 면역반응과 관련된 항체(즉, Th1 관련 항체)의 측정가능한 생산 증가를 의미한다. 1가지 이상의 Th1 관련 항체가 측정될 수 있다. 이러한 Th1 타입 편향성 항체의 예에는 인간 IgG1 및/또는 IgG3(예컨대, Widhe et al. (1998) Scand. J. Immunol. 47: 575-581 and de Martino et al. (1999) Ann. Allergy Asthma Immunol. 83: 160-164), 및 쥐 IgG2a가 포함되나, 이에 국한되는 것은 아니다. 이에 반해, ""Th2 타입 편향성 항체"는 Th2 타입 면역 반응과 관련된 항체를 의미하는 것인데, 그 예에는 인간 IgG2, IgG4 및/또는 IgE(예컨대, Widhe et al. (1998) and de Martino et al. (1999) 참조) 및 쥐 IgG1 및/또는 IgE가 포함되지만 이에 국한되지는 않는다.
IMP 투여 결과로서 나타나는 Th1 타입 편향성 시토킨 유도는 향상된 세포성 면역반응, 예컨대 NK 세포, 세포독성 킬러 세포, Th1 헬퍼 및 기억 세포에 의해 수행되는 면역반응을 생산한다. 이러한 반응들은 종양 뿐만 아니라 바이러스, 진균, 원생동물 기생충, 박테리아, 알레르기 질환 및 천식에 대한 예방 또는 치료 백신에 사용하기에 특히 유리하다.
일부 구체예에서, Th2 반응은 억제(감소)된다. Th2 반응의 억제는 예컨대 알레르기항원에 반응하여 나타나는 히스타민 방출의 감소 및 IgE 감소 뿐만 아니라 Th2 관련 항체 농도의 감소, IL-4 및 IL-5와 같은 Th2 관련 시토킨 농도의 감소 등을 통해 측정할 수 있다.
본 발명의 킷트
본 발명은 킷트를 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명의 킷트는 일반적으로 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 IMP를 함유하는 용기를 1개 이상 함유한다. 이러한 킷트는 추가로 본 명세서에 기술된 임의의 방법(예컨대, 면역제어, 감염성 질환의 1가지 이상의 증상의 경감, IFN-γ 농도의 증가, IFN-α 농도의 증가 또는 IgE 관련 장애의 경감)에서의 IMP 사용에 관한, 일반적인 지침용지와 같은 적당한 지침서 세트를 포함할 수 있다.
이러한 킷트는 임의의 편리한 적당한 패키징으로 포장된 IMP을 포함할 수도 있다. 예를 들어, IMP가 무수 제형(예컨대, 동결 건조 또는 무수분말)이라면, 일반적으로 탄성 마개가 있는 바이엘을 사용하여, 탄성 마개를 통한 유체 주입으로 IMP가 용이하게 재현탁될 수 있도록 한다. 비탄성의 1회용 마개(예컨대, 밀봉 유리) 또는 탄성 마개를 구비한 앰플은 IMP의 액체 제형에 가장 편리하게 사용되는 형태이다. 또한, 특정 장치, 예컨대 흡입기, 비측 투여 장치(예컨대, 아토마이저) 또는 미니펌프와 같은 주입 장치와 함께 사용되는 패키지도 생각해볼 수 있다.
IMP의 사용에 관한 지침서는 일반적으로 의도한 사용방법에 바람직한 투여량, 투여 스케줄 및 투여 경로와 관련된 정보를 담고 있는 것이다. IMP의 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예컨대, 다회용량 패키지) 또는 서브유닛 용량일 수 있다. 본 발명의 킷트에 제공되는 지침서는 일반적으로 라벨이나 포장 삽입물(예컨대, 킷트에 포함된 용지)로 제공되는 지침 용지이지만, 기계 판독성 지침서(예컨대, 자기 또는 광 저장 디스크에 담긴 지침서)도 사용될 수 있다.
일부 구체예에서, 킷트는 추가로 IMP와 동일한 용기(제형)에 포장되거나 포장되지 않을 수 있는 항원(1종 이상의 항원)을 포함한다. 항원은 본 명세서에 기술된 것과 같은 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명의 킷트는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드/마이크로담체 복합체(IMP/MC) 형태의 IMP를 함유하며, 추가로 본 명세서에 기술된 임의의 방법(예컨대, 면역제어, 감염성 질환의 1가지 이상의 증상의 경감, IFN-γ 농도의 증가, IFN-α 농도의 증가 또는 IgE 관련 장애의 경감)에서의 IMP/MC 복합체의 사용에 관한, 일반적인 지침용지와 같은 적당한 지침서 세트를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 킷트는 IMP/MC 복합체의 생산용 재료가 포함되기도 하여, 일반적으로 IMP와 MC의 별도의 용기가 포함될 수 있고, 특정 구체예에서는 예형된 MC가 아닌 MC 생산용 재료가 공급될 수도 있다. IMP와 MC는 공급된 IMP와 MC의 혼합 시 IMP/MC 복합체가 형성되는 형태로 공급되는 것이 바람직하다. 이러한 형태는 IMP/MC 복합체가 비공유 결합을 통해 결합될 때 바람직하다. 또한, 이러한 형태는 IMP와 MC가 이종이작용성 가교제를 통해 가교결합되어질 때 바람직하여, IMP 또는 MC 중 어느 하나가 "활성화된" 형태(예컨대, IMP와 반응성인 부가 유용하게 이종이작용성 가교제에 결합된 형태)로 공급되는 것이 좋다.
액상 MC를 함유하는 IMP/MC 복합체 킷트는 액상 MC 생산용 재료를 함유하는 1개 이상의 용기를 포함하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 수중유 에멀젼 MC용의 IMP/MC 킷트는 유성상과 수성상을 함유하는 1개 이상의 용기를 함유할 수 있다. 용기의 내용물은 유화되어 MC를 생산하고, 그 다음 IMP, 바람직하게는 변형되어 소수성 부를 포함한 IMP와 혼합될 수 있다. 이러한 재료에는 수중유 에멀젼 생산을 위한 오일 및 물이 포함되거나, 또는 동결건조된 리포좀 성분(예컨대, 인지질, 콜레스테롤 및 계면활성제의 혼합물)의 용기와 1개 이상의 수성상(예컨대, 약제학적으로 허용되는 수성 완충액) 용기가 포함된다. 특정 구체예에서, 본 발명의 킷트는 본 명세서에 기술된 바와 같은 임의의 면역제어성 CIS 미립 조성물을 함유하는 1개 이상의 용기에 양이온 축합제-IMP-안정화제(CIS) 조성물 형태로 IMP를 함유하는 것이다. 대안적으로, 본 발명의 킷트는 본 발명의 CIS 조성물의 성분들을 담은 1개 이상의 용기를 함유할 수도 있다. 이러한 구체예의 형태에는, IMP/안정화제 혼합물 용기와 양이온 축합제 용기를 보유한 킷트, IMP 용기, 안정화제 용기 및 양이온 축합제 용기를 구비한 킷트가 있다. 이러한 킷트는 추가로 본 명세서에 기술된 임의의 방법(예컨대, 면역제어, 감염성 질환의 1가지 이상의 증상의 경감, IFN-γ 농도의 증가, IFN-α 농도의 증가 또는 IgE 관련 장애의 경감)에서의 CIS 미립 조성물의 사용에 관한, 일반적인 지침용지와 같은 적당한 지침서 세트를 포함할 수 있다. CIS 조성물의 성분이 담긴 용기를 함유하는 킷트 구체예는 일반적으로 본 명세서에 개시된 방법에 따라 CIS 조성물을 제조하는 지침서도 포함할 것이다. 본 발명의 CIS 조성물 및/또는 CIS 조성물의 성분 외에도, 킷트 구체예에는 또한 본 명세서에 개시된 방법에 따라 CIS 조성물을 생산하는 지침서 및 본 명세서에 기술된 임의의 방법들에 대한 면역제어성 CIS 조성물의 사용에 관한 지침서도 구비할 수 있다.
다음 실시예는 본 발명의 예시하는 것이지, 제한하는 것이 아니다.
본 발명은 면역제어성 폴리뉴클레오타이드(IMP) 및 이러한 폴리뉴클레오타이드를 이용하여 개체, 특히 인간의 면역반응을 제어하는 방법에 관한 것이다.
일 양태로서, 본 발명은 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 특정 구체예로서, 본 발명은 본 명세서에 기술된 임의의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 또한 예를 들어 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 임의의 다른 다양한 성분, 예컨대 항원을 추가로 포함할 수도 있다.
일 양태에서, 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 (a) 적어도 2개의 CG 디뉴클레오타이드가 0개, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 염기에 의해 분리되어 있고 팔린드롬(palindrome) 서열의 염기 길이가 적어도 8개인, 적어도 2개의 CG 디뉴클레오타이드를 함유하는 팔린드롬 서열; 및 (b) (TCG)y의 5' T가 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0개, 1개, 2개 또는 3개 염기째에 위치하고, (TCG)y가 팔린드롬 서열의 5' 말단으로부터 0개, 1개 또는 2개 염기에 의해 분리되어 있는, (TCG)y[여기서, y는 1 또는 2이다]를 포함한다. 이 문단이나 본 명세서의 다른 부분에 기술되는지의 여부를 불문하고 본 발명의 일부 면역제어성 폴리뉴클레오타이드에서, 팔린드롬 서열은 G와 C가 2/3 미만인 염기 조성을 갖는 것이다. 일부 구체예에서, 팔란드롬 서열은 A와 T가 1/3 초과인 염기 조성을 갖는 것이다.
다른 양태에서, 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 (a) 적어도 2개의 CG 디뉴클레오타이드가 0개, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개의 염기에 의해 분리되어 있고 팔린드롬 서열의 염기 길이가 적어도 8개인, 적어도 2개의 CG 디뉴클레오타이드를 함유하는 팔린드롬 서열; 및 (b) (TCG)y의 5' T가 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0개, 1개, 2개 또는 3개의 염기째에 위치하고 있는, (TCG)y[여기서, y는 1 또는 2이다]를 포함하되, (a)인 팔린드롬 서열이 상기 (TCG)y 서열 전체 또는 부분을 포함하고 (TCG)y 서열의 CG가 (a)인 팔린드롬 서열의 CG 디뉴클레오타이드 중 하나일 수 있는 것이다.
또 다른 양태에서, 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 (a) 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1X2CGX2'X1'(CG)p)z(서열번호 156)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x = 0-3, y = 1-4, w = -2, -1, 0, 1 또는 2, p=0 또는 1, q= 0, 1 또는 2, z= 1 내지 20, X1 및 X1'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, X2 및 X2'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이며, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치한다]; 및 (b) 상기 (X1X2CGX2'X1'(CG)p)z 서열의 처음 (X1X2CGX2'X1')를 포함하는, 염기 길이가 적어도 8개인 팔린드롬 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, X1 및 X2는 각각 A 또는 T이다.
다른 양태에서, 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 (a) 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1X2CGX3X3'CGX2'X1'(CG)p)z(서열번호 159)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x=0-3, y=1-4, w= -2, -1, 0, 1 또는 2, p=0 또는 1, q=0, 1 또는 2, z= 1-20이며, X1 및 X1'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, X2 및 X2'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이며, X3 및 X3'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치한다]; 및 (b) (X1X2CGX3X3'CGX2'X1'(CG)p)z(서열번호 217) 서열의 처음 (X1X2CGX3X3'CGX2'X1')(서열번호 216)을 함유하는, 염기 길이가 적어도 10개인 팔린드롬 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, p=1일 때, X1, X2 및 X3은 각각 A 또는 T이다. 일부 구체예에서, p=0일 때, X1, X2 및 X3 중 적어도 2개는 A 또는 T이다.
다른 양태에서, 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 (a) 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1X2X3X4X5CGX5'X4'X3'X2'X1'(CG)p)z(서열번호 160)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x=0-3, y=1-4, w= -3, -2, -1, 0, 1 또는 2, p=0 또는 1, q=0, 1 또는 2, z= 1-20이며, X1 및 X1'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, X2 및 X2'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이며, X3 및 X3'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, X4 및 X4'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이며, X5 및 X5'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치한다]; 및 (b) (X1X2X3X4X5CGX5'X4'X3'X2'X1'(CG)p)z(서열번호 219) 서열의 처음 (X1X2X3X4X5CGX5'X4'X3'X2'X1')(서열번호 218)을 함유하는, 염기 길이가 적어도 12개인 팔린드롬 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, X1, X2, X3, X4 및 X5 중 적어도 3개는 A 또는 T이다.
다른 양태에서, 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 (a) 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(CGX1X1'CG(CG)p)z(서열번호 161)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x = 0-3, y = 1-4, w = -2, 0, 1 또는 2, p=0 또는 1, q= 0, 1 또는 2, z= 1 내지 20이며, X1 및 X1'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치한다]; 및 (b) 상기 (CGX1X1'CG(CG)p)z 서열의 처음 (CGX1X1'CG)를 포함하는, 염기 길이가 적어도 8개인 팔린드롬 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 (a) 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1CGCGX1'(CG)p)z(서열번호 162)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x = 0-3, y = 1-4, w = -1, 0, 1 또는 2, p=0 또는 1, q= 0, 1 또는 2, z= 1 내지 20이며, X1 및 X1'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치한다]; 및 (b) 상기 (X1CGCGX1'(CG)p)z 서열의 처음 (X1CGCGX1')를 포함하는, 염기 길이가 적어도 8개인 팔린드롬 서열을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 (a) 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1X2CGCGX2'X1'(CG)p)z(서열번호 163)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x = 0-3, y = 1-4, w = -2, -1, 0, 1 또는 2, p=0 또는 1, q= 0, 1 또는 2, z= 1 내지 20, X1 및 X1'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, X2 및 X2'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이며, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치한다]; 및 (b) 상기 (X1X2CGCGX2'X1'(CG)p)z 서열의 처음 (X1X2CGCGX2'X1')를 포함하는, 염기 길이가 적어도 8개인 팔린드롬 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, X1 및 X2는 각각 A 또는 T이다.
다른 양태에서, 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 (a) 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1X2X3CGCGX3'X2'X1'(CG)p)z(서열번호 164)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x=0-3, y=1-4, w= -3, -2, -1, 0, 1 또는 2, p=0 또는 1, q=0, 1 또는 2, z= 1-20이며, X1 및 X1'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, X2 및 X2'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이며, X3 및 X3'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치한다]; 및 (b) (X1X2X3CGCGX3'X2'X1'(CG)p)z(서열번호 222) 서열의 처음 (X1X2X3CGCGX3'X2'X1')(서열번호 221)을 함유하는, 염기 길이가 적어도 10개인 팔린드롬 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, p=1일 때, X1, X2 및 X3은 각각 A 또는 T이다. 일부 구체예에서, p=0일 때, X1, X2 및 X3 중 적어도 2개는 A 또는 T이다.
다른 양태에서, 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 (a) 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(CGX1X2X2'X1'CG(CG)p)z(서열번호 165)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x = 0-3, y = 1-4, w = -2, 0, 1 또는 2, p=0 또는 1, q= 0, 1 또는 2, z= 1 내지 20이며, X1 및 X1'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, X2 및 X2'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이며, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치한다]; 및 (b) 상기 (CGX1X2X2'X1'CG(CG)p)z 서열(서열번호 223)의 처음 (CGX1X2X2'X1'CG)를 포함하는, 염기 길이가 적어도 8개인 팔린드롬 서열을 포함한다. 일부 구체예에서, X1 및 X2는 각각 A 또는 T이다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 개체의 면역 반응 제어에 충분한 양으로 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체의 면역반응 제어방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따른 면역제어는 Th2 타입 면역반응과 관련있는 장애(예컨대, 알레르기, 알레르기 유도성 천식 또는 아토피 피부염)를 앓고 있는 개체, 치료 백신(예컨대, 알레르기 에피토프, 미코박테리아 에피토프 또는 종양 관련 에피토프를 함유하는 백신)) 또는 예방 백신과 같은 백신접종을 받는 개체, 암을 보유한 개체 및 감염 질환을 보유한 개체를 비롯한 개체에게 수행될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하여, 개체의 감마 인터페론(IFN-γ)을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 면역제어성 폴리뉴클레오타이드의 투여는 개체의 IFN-γ를 증가시킨다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드의 유효량을 개체에게 투여하는 것을 포함하여, 개체의 알파 인터페론(IFN-α)을 증가시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 면역제어성 폴리뉴클레오타이드의 투여는 개체의 IFN-α를 증가시킨다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드의 유효량을 감염성 질환이 있는 개체에게 투여하는 것을 포함하여, 감염성 질환의 1종 이상의 증상을 경감시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 면역제어성 폴리뉴클레오타이드의 투여는 감염성 질환의 1종 이상의 증상을 경감시킨다.
다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드의 유효량을 IgE 관련 장애를 앓고 있는 개체에게 투여하는 것을 포함하여, IgE 관련 장애의 1종 이상의 증상을 경감시키는 방법을 제공한다. 본 발명에 따른 면역제어성 폴리뉴클레오타이드의 투여는 IgE 관련 장애의 1종 이상의 증상을 경감시킨다.
또한, 본 발명은 킷트, 바람직하게는 전술한 본 발명의 방법들을 수행하는 킷트에 관한 것이다. 이러한 본 발명의 킷트는 일반적으로 본 발명의 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 (일반적으로 적당한 용기에) 함유하며, 추가로 개체의 면역제어에 있어서 면역제어성 폴리뉴클레오타이드의 사용 지침서를 함유할 수도 있다.
실시예 1: 면역제어성 폴리뉴클레오타이드에 의한 인간 세포의 면역제어
면역제어성 폴리뉴클레오타이드(IMP) 또는 면역제어성 서열(5'- TGACTGTGAACCTTAGAGATGA-3' (서열번호 2)) 없는 폴리뉴클레오타이드, SAC 및 매질 만을 함유하는 대조용 샘플을 인간 말초혈액 단핵세포(PBMC)에 대한 면역제어 활성에 대해 시험했다. 또한, 표준 면역제어성 폴리뉴클레오타이드 5'- TGACTGTGAACGTTCGAGATGA(서열번호 1)도 시험했다. 별다른 표시가 없는 한, 검사된 폴리뉴클레오타이드는 전부 변형된 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오타이드이다.
말초 혈액은 헤파린처리된 주사기를 사용하여 정맥천자를 통해 지원자로부터 수집했다. 혈액을 FICOLL®(Amersham Pharmacia Biotech) 쿠션 상에 중층시켜 원심분리했다. FICOLL® 계면에 위치한 PBMC를 수집한 뒤, 냉장된 인산염완충식염수(PBS)로 2회 세척했다. 이 세포를 재현탁시키고, 10% 열불활성화된 인간 AB 혈청 + 50유닛/ml 페니실린, 50㎍/ml 스트렙토마이신, 300㎍/ml 글루타민, 1mM 피루브산나트륨 및 1xMEM 비필수 아미노산(NEAA)이 첨가된 RPMI 1640에 2x106 세포/ml 농도로 48웰 또는 96웰 평판에 담아 배양했다.
이 세포를 0.2 내지 20㎍/ml 용량 범위의 시험 샘플(IMP 또는 대조군)의 존재하에 24시간 동안 배양한 뒤, 각 웰로부터 무세포 배지를 수집하여 IFN-γ 및/또는 IFN-α 농도를 분석했다. IFN-γ 및 IFN-α는 바이오사이언스 인터내쇼널, 인크.(BioScience International, Inc.)社 제품인 CYTOSCREEN™ ELISA 킷트를 제조사의 지시에 따라 사용하여 분석했다. 일반적으로, 시험 샘플은 4명의 인간 공급자로부터 수득한 PBMC를 가지고 시험했다.
IMP는 인간 PBMC에 의한 IFN-γ 및/또는 IFN-α 분비를 자극했다. 인간 PBMC 분석에서, IFN-γ의 배경 농도는 공급자에 따라 심지어 유의적으로 다를 수 있다. 하지만, IFN-α와 같은 기타 다른 시토킨은 미자극 상태에서 일반적으로 안정된 패턴의 활성화를 나타내고, 통상적으로 낮은 배경 농도를 보였다. PBMC를 이용한 이러한 분석의 결과는 표 2 내지 7에 정리했다.
용량 적정 분석에서, 4명의 공급자로부터 얻은 PBMC를 0.2 내지 20㎍/ml의 전술한 바와 같은 서열번호 27로 자극했다. 생산되는 IFN-α 및 IFN-γ의 양은 전술한 바와 같이 측정하고, 4명의 공급자로부터 얻은 결과를 평균하여 그 평균값을 표 2에 제시했다.
IMP 적정 -IFN(pg/ml)
서열번호 27 (㎍/ml) IFN-γ IFN-α
20 412 749
8 583 4036
3.2 203 4073
1.3 39 887
0.5 15 108
0.2 11 50
표 2에 제시된 결과로부터 알 수 있듯이, IFN-α 생산을 유도하는 능력은 IMP 용량이 증가함에 따라 증가했고, 약 3 내지 8㎍/ml에서 최적화되었으며, 그 이상의 용량에서는 활성이 감소했다. 추가 분석을 통해 이와 같은 결과를 확인했다.
4명의 공급자로부터 얻은 PBMC를 IMP 20㎍/ml 또는 대조군으로 자극하고 IFN-α 및 IFN-γ 생산 자극을 전술한 바와 같이 평가했다. 시험된 폴리뉴클레오타이드는 다음과 같다:
각 공급자의 PBMC로부터 수득되는 시토킨 생산 결과는 평균하여 그 평균값을 표 3에 제시했다.
표 3을 통해 증명되듯이, 표준 IMP(서열번호 1) 보다 많은 IFN-α생산을 자극하는 IMP는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이나 그 부근에 적어도 하나의 TCG 서열을 포함하고, 5'-TCG 서열 옆이나 이 서열로부터 3개의 염기 이내에 적어도 8개의 염기 길이를 가진 팔린드롬 서열을 함유했다. 일반적으로, IFN-γ 생산의 자극은 IFN-α 생산의 자극을 반영하지만, IFN-γ 자극의 변화 범위는 IFN-α 보다 훨씬 적었다. 팔린드롬 서열과 5'-TCG가 분리되어 있는 폴리뉴클레오타이드에서, 그 분리가 제2 TCG 트리뉴클레오타이드에 의해 이루어지거나 제2 TCG 트리뉴클레오타이드와 중복되면(예컨대, 서열번호 14 참조), 일반적으로 IFN-α 생산에 바람직했다. 5'-TCG를 함유하지만 전술한 바와 같은 팔린드롬 서열을 함유하지 않은 IMP는 매우 낮은 농도의 IFN-γ를 유도했고, IFN-α 생산은 유도하지 못했다(예컨대, 서열번호 18 및 11 참조). 5'-TCG 트리뉴클레오타이드를 함유하지 않고 6 내지 8개 염기의 팔린드롬을 함유하는 IMP는 IFN-γ를 유도하지만 IFN-α는 단지 소량만을 유도했다(예컨대, 서열번호 1 및 4 참조). 특히, 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 최고 3개의 염기 대신 TCG를 함유하고 적어도 10개의 염기 길이를 가진 팔린드롬 서열을 함유하는 IMP는 5'-TCG가 없는 IMP 표준물(서열번호 1)에 비해, 매우 높은 농도의 IFN-α를 유도했다(예컨대, 서열번호 24 및 8 참조).
IFN-α 생산 자극에 대한 IMP 용량 의존성을 시험하기 위한 분석을 수행했다. 이 분석에서 시험된 IMP에서는 폴리뉴클레오타이드 중의 팔린드롬 서열의 위치 및/또는 5' 말단에 있는 적어도 1개의 TCG 서열의 위치를 변화시켰다. 시험된 폴리뉴클레오타이드 중에서 일부는 8개 이상의 염기길이를 가진 팔린드롬 서열 없이 CG 디뉴클레오타이드 및 5'-TCG 서열만을 가진 것이었다(예컨대, 서열번호 11, 서열번호 18; 5'-TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT (서열번호 3) 참조). 또한, 5'-TCG 트리뉴클레오타이드 없이 염기길이가 8개 이상인 팔린드롬 서열과 CG 디뉴클레오타이드를 보유한 폴리뉴클레오타이드도 시험했다(예컨대, 서열번호 1, 서열번호 4;
4명의 공급자로부터 수득한 PBMC를 IMP 0.8, 4.0 또는 20㎍/ml 또는 대조군으로 자극했다. IFN-α 생산 자극은 전술한 바와 같이 평가하고, 4명의 공급자의 평균 결과를 표 4에 기록했다.
표 4에 제시된 결과는 염기길이가 적어도 8개인 팔린드롬 서열과 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이나 그 부근에 있는 적어도 하나의 TCG 서열이 인간 PBMC로부터 IFN-α 생산을 자극하는데 중요함을 입증하는 것이다.
또 다른 분석으로서, IFN-α 생산 자극에 미치는 IMP 용량 의존성을 시험했다. 이 분석에서 시험한 IMP는 폴리뉴클레오타이드내 CG 디뉴클레오타이드 및 5'-TCG 서열의 존재에 따라 다양한 것이었다. 시험된 폴리뉴클레오타이드 중에서 일부는 팔린드롬 서열은 보유하지만 CG 디뉴클레오타이드는 없는 것(예컨대, 서열번호 2; 5'- TGCTTGCAAGCTTGCAAGCA (서열번호 90), 5'- TCAGTCAGTCAGCTGACTGACTGA (서열번호 96)) 및/또는 5'-TCG 서열이 없는 것(예컨대, 서열번호 1, 90, 96; 5'-ACCGATAACGTTGCCGGTGACGGCACCACG (서열번호 92), 5'-AACAACAACGTTGTTGTT (서열번호 95), 5'-ACCGATAACGTTGCCGGTGACGGCACCACG (서열번호 25), 5'- AACAACAACGTTGTTGTT (서열번호 94))이었다. 또한, 이 분석에는 폴리뉴클레오타이드 5'-TCGTTGCAAGCTTGCAACGA (서열번호 91)도 시험했다. IMP 중 일부는 인산염 골격쇄 조성이 상이한 것이었다. 3명의 공급자로부터 수득한 PBMC를 0.8, 4.0 또는 20㎍/ml의 IMP 또는 대조군으로 자극했다. IFN-α 생산의 자극은 전술한 3명의 공급자로부터 얻은 PBMC를 사용하여 평가하고, 3명의 공급자로부터 산출되는 결과의 평균값을 표 5에 기록했다.
표 5에 제시된 결과로부터 알 수 있듯이, 보다 높은 활성을 지닌 서열번호 42에 존재하는 CG 디뉴클레오타이드를 GC 디뉴클레오타이드로 전환시키면 IFN-α를 유도하는 서열번호 90의 능력이 소실되었다. 이와 마찬가지로, CG 디뉴클레오타이드가 없는 팔린드롬 폴리뉴클레오타이드인 서열번호 96도 불활성이었다.
표 5로부터 알 수 있듯이, 2가지 대표적인 포스포디에스테르 폴리뉴클레오타이드인 서열번호 25와 서열번호 94 및 이의 완전 변형된 포스포로티오에이트 변형체, 서열번호 92 및 서열번호 95는 각각 인간 PMBC로부터 IFN-α를 유도하는데 있어서 비활성이었다. 서열번호 25와 92는 모티프 AACGTT를 비롯하여 여러개의 CG 디뉴클레오타이드를 함유하지만, TCG 또는 적어도 8개 염기의 팔린드롬 서열을 함유하지 않는다. 서열번호 94와 95는 18개 염기의 팔린드롬과 1개의 CG 디뉴클레오타이드를 함유하지만 TCG 트리뉴클레오타이드를 함유하지 않는다. 따라서, 이러한 폴리뉴클레오타이드들은 본 명세서에 기술된 모티프들에 부합되지 않는다.
모두 포스포로티오에이트 결합(서열번호 30 및 32) 또는 키메라성 포스포로티오에이트/포스포디에스테르 결합(서열번호 26 및 33)을 함유하는 서열번호 26, 30, 32 및 33은 인간 PBMC로부터 많은 양의 IFN-α를 유도했다. 서열번호 34(키메라 포스포로티오에이트/포스포디에스테르 결합을 함유하는 것) 및 93(모두 포스포로티오에이트 결합 함유)은 둘 다 인간 PBMC로부터 IFN-α를 유도했다.
IFN-α 자극에 대한 팔린드롬 서열 길이의 효과를 시험하는 분석에서, 4명의 공급자로부터 수득한 PBMC를 2㎍/ml 또는 20㎍/ml의 IMP 또는 대조군으로 자극하고, IFN-α 생산의 자극은 전술한 바와 같이 평가한 뒤, 평균 결과를 표 6에 정리했다. 시험된 폴리뉴클레오타이드 중에 5'- TTCGAACGTTCGTTAACGTTCG (서열번호 20) 및 5'- TCGTCGAACGTTCGAACGTTCG (서열번호 19)도 있다.
표 6에 제시된 결과는 염기길이가 8개 이상인 팔린드롬 서열과 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단이나 그 부근에 적어도 1개의 TCG 서열의 존재가 인간 PBMC로부터 IFN-α를 자극하는데 중요함을 입증한다.
다양한 12개 염기의 팔린드롬 서열을 보유한 IMP의 IFN-α자극 활성을 시험하는 분석에서, 4명의 공급자로부터 수득한 PBMC를 0.8, 4 또는 20㎍/ml의 IMP 또는 대조군으로 자극하고, IFN-α 생산의 자극을 전술한 바와 같이 평가한 후, 평균값을 표 7에 정리했다.
표 7에 제시된 결과는 12개 염기 팔린드롬을 보유한 시험된 모든 IMP가 인간 PBMC로부터 IFN-α를 자극하는데 활성임을 보여주었다. 이러한 IMP는 서열 TCGX1X2CGX2'X1'CGA (서열번호 198)의 12개 염기 팔린드롬을 함유하고 있다(여기서, X1 및 X2에는 종래 면역억제성 서열 또는 면역중화성 서열로 간주된 바 있는(Krieg et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 12631-12636), CGCG, CCGG 및 GCGC가 형성될 수도 있지만 제한되는 뉴클레오타이드는 없다). 예를 들어, 서열번호 49 및 50은 IFN-α를 자극하는데 활성이고 서열 CGCG를 함유한다. 서열번호 49는 앞서 기술된 서열번호 161을 함유하는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드이다. 서열번호 50은 앞서 기술된 서열번호 162를 함유하는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드이다.
보다 긴 팔린드롬을 보유한 IMP는 특히 보다 낮은 IMP 용량에서 인간 PBMC로부터 IFN-α를 보다 높은 농도로 유도했다. 도 1에 제시된 분석 결과에서 확인할 수 있듯이, 서열번호 172에 대한 반응으로 세포에서 생산되는 IFN-α의 양은 IMP 0.4 ㎍/ml 용량에서 서열번호 113, 서열번호 27 및 서열번호 1 보다 상당히 높았다(p<0.001). IMP 중의 팔린드롬의 길이는 서열번호 172는 28개 염기, 서열번호 113은 22개 염기, 서열번호 27은 12개 염기, 서열번호 1은 8개 염기였다.
또 다른 분석에서, 총 IMP 길이와 IMP 팔린드롬 길이를 인간 PBMC로부터의 IFN-α 생산 유도와 비교했다. 시험된 폴리뉴클레오타이드 중에는 다음과 같은 서열이 있다:
4명의 공급자로부터 수득한 PBMC를 0.8, 4.0 또는 20㎍/ml의 IMP 또는 대조군으로 자극하고 그 결과 수득되는 IFN-α 생산은 전술한 바와 같이 평가했다. 각 IMP 농도에서 4명의 공급자 샘플에 대한 평균 결과는 표 8에 정리했다.
표 8에 제시된 결과는, 시험된 폴리뉴클레오타이드에서 인간 PBMC의 IFN-α 생산을 자극하는 폴리뉴클레오타이드의 최소 총 길이가 약 10개 염기길이의 팔린드롬을 보유한 약 12개 염기임을 시사했다. 따라서, 보다 높은 농도의 IFN-α 생산이 요구되는 일부 구체예에서, IMP는 최소한 다음과 같은 길이(염기)의 팔린드롬 서열을 1개 이상 함유하는 것이다: 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26. 28 또는 30. 일부 구체예에서, IMP는 염기 길이가 30개 보다 긴 팔린드롬 서열을 적어도 1개 함유하는 것이다.
다른 분석법에서, 3명의 공급자로부터 얻은 PBMC를 0.8, 4.0 또는 20㎍/ml의 IMP 또는 대조군으로 자극했다. IFN-α, IFN-β 및 IFN-ω 생산 자극은 전술한 바와 같이 평가했다. IFN-ω는 PBL 바이오메디칼 레보레이터리즈에서 입수한 ELISA 킷트를 사용하여 분석하고, IFN-ω의 측정 하한값과 상한값은 각각 48pg/ml 및 6000pg/ml였다. IFN-β는 바이오소스로부터 입수한 ELISA 킷트로 분석했으며, 그 측정 상한값과 하한값은 각각 12 IU/ml 및 3046 IU/ml였다. 각 IMP 농도에서 수득되는 3명의 공급자 샘플에 대한 평균값을 표 9에 정리했다.
표 9에서 확인할 수 있듯이, 본 발명의 IMP는 IFN-α 생산 뿐만 아니라 인간 PBMC로부터 IFN-ω의 생산도 자극한다. 전술한 분석법에서, IFN-β는 검출되지 않았다.
또 다른 분석법으로, 2본쇄 형태의 폴리뉴클레오타이드를 비이본쇄 형태와 인간 PBMC로부터의 IFN-α 생산 유도에 대해 비교했다. 시험된 폴리뉴클레오타이드 중에는 다음과 같은 서열이 있다: 서열번호 1, 서열번호 90, 서열번호 27 및 5'- TCGTCGAACGTTCGAGATGAT/5'-ATCATCTCGAACGTTCGACGA (서열번호 182 - 서열번호 27과 서열번호 29의 이본쇄). 3명의 공급자로부터 얻은 PBMC를 0.4, 0.8, 4.0 또는 20㎍/ml의 IMP 또는 대조군으로 자극하고, 그 결과 수득되는 IFN-α 생산량을 전술한 바와 같이 평가했다. 폴리뉴클레오타이드의 동일한 총 용량을 사용하여 이본쇄 서열과 일본쇄 서열을 비교했다(예컨대, 4 ㎍/ml의 서열번호 27을 2㎍/ml의 서열번호 27과 2㎍/ml의 서열번호 29를 함유하는 이본쇄 서열번호 182 4㎍/ml과 비교했다). 각 IMP 농도에서 3명의 공급자로부터 수득되는 평균 결과는 표 10에 정리했다.
표 10에서 확인할 수 있듯이, 서열번호 27의 이본쇄 형태인 서열번호 182는 낮은 IMP용량에서 IFN-α 생산을 자극하는데 있어서 서열번호 27 보다 높은 활성을 나타냈다. 보다 높은 용량(4 및 20㎍/ml)에서는 서열번호 27이 다소 높은 자극성을 나타냈다.
또 다른 분석법으로, 변형된 염기를 함유하는 폴리뉴클레오타이드와 함유하지 않는 폴리뉴클레오타이드를 인간 PBMC에 의한 IFN-α 생산 유도에 대해 비교했다. 시험된 폴리뉴클레오타이드 중에는 다음과 같은 서열이 있다: 서열번호 1, 서열번호 2, 5'-TCGTCGAACGTTCGAGATGAT (서열번호 27) 및 5'-TCXTCXAACXTTCXAGATGAT(X= 7-데아자-dG, 서열번호 193). 서열번호 27과 서열번호 193은 서열번호 27에 존재하는 4개의 dG 대신 데아자-dG가 치환된 것을 제외하고는 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖고 있다. 4명의 공급자로부터 얻은 PBMC를 0.8, 4.0 또는 20㎍/ml의 IMP 또는 대조군으로 자극하고, 그 결과 수득되는 IFN-α 생산은 전술한 바와 같이 평가했다. 각 IMP 농도에서 4명의 공급자로부터 수득되는 평균 결과는 표 11에 정리했다.
표 11에서 알 수 있듯이, 서열번호 193은 0.8㎍/ml 용량에서는 제외하고 서열번호 27과 비슷한 IFN-α 자극 활성을 나타냈다.
또한, 변형 염기를 함유하는 폴리뉴클레오타이드의 일본쇄 및 이본쇄 형태를 인간 PBMC에 의한 IFN-α 생산 유도 활성에 대해 평가했다. 시험된 폴리뉴클레오타이드 중에는 다음과 같은 것이 있다: 일본쇄 및 이본쇄의 서열번호 1, 일본쇄 서열번호 2, 일본쇄 서열번호 29, 일본쇄 및 이본쇄 서열번호 27, 일본쇄 및 이본쇄 서열번호 187, 일본쇄 및 이본쇄 서열번호 188, 일본쇄 및 이본쇄 서열번호 189, 일본쇄 및 이본쇄 서열번호 190, 일본쇄 서열번호 194, 일본쇄 서열번호 197. 서열번호 187, 188, 189, 190, 194 및 197은 표시된 치환체를 제외하고는 서열번호 27과 동일한 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것이다:
8명의 공급자로부터 얻은 PBMC를 0.2, 0.4, 0.8, 1.6, 4.0 또는 8㎍/ml의 IMP 또는 대조군으로 다양하게 자극하고, 수득되는 IFN-α 생산은 전술한 바와 같이 평가했다. 이본쇄는 동일한 총 용량의 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 일본쇄 서열과 비교했다(예컨대, 4 ㎍/ml의 서열번호 27을 2㎍/ml의 서열번호 27과 2㎍/ml의 서열번호 29를 함유하는 이본쇄 서열번호 182 4㎍/ml과 비교했다). 각 IMP 농도에서 8명의 공급자로부터 수득되는 평균 결과는 표 12에 정리했다.
표 12로부터 알 수 있듯이, IMP에 특정 변형 염기의 사용은 IFN-α 자극 활성이 있는 폴리뉴클레오타이드를 제공할 수 있다. 또한, 183을 제외하고는, 상보체 서열과의 이본쇄 폴리뉴클레오타이드 형성이 특히 낮은 용량에서 IFN-α 생산 자극에 있어서 높은 활성의 IMP를 제공한다는 결과를 보여준다. 스스로 이본쇄를 형성할 수 없는 폴리뉴클레오타이드, 예컨대 서열번호 189 및 서열번호 190은 소량의 IFN-α를 유도한 반면, 보다 긴 서열(예컨대, 28개 염기 팔린드롬을 보유한 30량체인 서열번호 172) 및 이본쇄 서열번호 182는 팔린드롬 염기 길이가 28개 미만인 다른 IMP 및 서열번호 27 보다, 저용량(예컨대, 0.4 및 0.8㎍/ml)에서 보다 많은 IFN-α를 유도했다(표 12 및 도 1에 제시됨). 논의된 바와 같이, 특정 변형 염기는 형성된 이본쇄의 안정성을 증가시킬 수 있다.
실시예 2: 면역제어성 폴리뉴클레오타이드에 의한 인간 B 세포의 활성화
인간 B 세포를 활성화시키는 IMP의 능력은 IMP와의 항온처리에 대한 반응으로 나타나는 B 세포 증식 및 IL-6 생산을 측정하여 확인했다. 인간 PBMC를 CD19 MACS 비드(Miltenyi Biotec)와 항온배양하고 자석을 통해 통과시켜, 양성 선발로 CD19+ B 세포를 분리했다(FACS 측정시 CD19+가 >98%). 증식 분석을 위해, B 세포는 96웰 둥근바닥 평판에서 1x 105/웰(5x105/ml) 농도로 배양했다. 이러한 세포는 2㎍/ml의 IMP 또는 대조군과 3반복으로 72시간 동안 항온배양했다. 배양 완료 후, 평판에 3H-티미딘(1μCi/웰, 아머샴 제품)을 첨가하고 8시간 더 배양했다. 그 다음, 평판을 수거하여 표준 액체 신틸레이션 기법을 사용하여 방사능 혼입율을 측정하고, 데이터를 cpm(분당 계수)으로 수집했다. IL-6 분비를 위해서는, B 세포를 48웰 평판에서 0.5 내지 1x 106/웰 농도로 5㎍/ml IMP 또는 대조군과 함께 48시간 동안 배양한 뒤, 배양 상청액을 수거하여, CytoSet 항체 쌍을 이용하여 ELISA로 제조자(BioSource)의 지시에 따라 IL-6에 대해 평가했다. 검출 상한/하한 범위는 4000/2 pg/ml 였다.
표 13에 제시된 B 세포 증식 분석 결과는 각 공급자의 세포에서 나타나는 3반복 세포 증식율 cpm 값의 평균 및 두 공급자의 cpm 값의 평균이다. 표 13에 제시된 B 세포 IL-6 분석의 결과는 각 공급자의 세포에서 생산되는 IL-6의 양 및 두 공급자의 평균값이다.
표 13에 제시된 결과로부터 알 수 있듯이, CG 디뉴클레오타이드를 함유하는 화합물은 B 세포 증식 및 IL-6 생산을 유도했다. 표 9에 제시된 결과로부터 알 수 있듯이, 면역제어성 폴리뉴클레오타이드의 양호한 B 세포 자극 활성이 CG 디뉴클레오타이드의 존재에 의존적이기는 하지만, 높은 IFN-α 유도를 위하여 본 명세서에 기술된 보다 특이적인 모티프를 반드시 필요로 하지는 않았다.
또 다른 분석으로, 이본쇄 형태의 폴리뉴클레오타이드를 비이본쇄 형태와 B 세포 활성화에 대해 비교했다. 시험된 폴리뉴클레오타이드 중에는 다음과 같은 것이 있다: 서열번호 1, 서열번호 90, 서열번호 27 및 서열번호 182(서열번호 27과 서열번호 29의 이본쇄). 3명의 공급자로부터 수득한 B세포를 1.0 또는 5.0㎍/ml의 IMP 또는 대조군으로 자극하고 그 결과 수득되는 세포 증식 및 IL-6 생산을 전술한 바와 같이 평가했다. 각 IMP 농도에서 3명의 공급자로부터 수득되는 평균 결과는 표 14에 정리했다.
표 14에 제시된 결과로부터, 서열번호 27의 이본쇄 형태인 서열번호 182가 IL-6 생산 및 세포 증식 자극을 통해 측정한 B 세포 활성화 측면에서 서열번호 27와 대략 동일한 활성을 갖고 있음을 알 수 있었다.
실시예 3: 면역제어성 폴리뉴클레오타이드에 의한 쥐 세포의 면역제어
면역제어성 폴리뉴클레오타이드 또는 대조용 폴리뉴클레오타이드를 마우스 비장세포의 면역제어 활성에 대해 평가했다. 시험된 폴리뉴클레오타이드로는 완전 변형된 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오타이드를 사용했다. 시험된 폴리뉴클레오타이드 중에는 서열번호 1(양성 대조군) 및 서열번호 2(음성 대조군)가 있다.
BALB/c 마우스 비장의 단편을, 인산염 완충 식염수(PBS)에 용해된 콜라게나제/디스파제(0.1U/ml/0.8U/ml)로 37℃에서 45분 동안 분해한 뒤, 분해된 단편을 금속 체를 통해 강제로 통과시켜 기계적 분산시켰다. 분산된 비장세포를 원심분리로 펠릿화한 다음, 새로운 배지(10% 태내 송아지 혈청, 50유닛/ml 페니실린, 50㎍/ml 스트렙토마이신, 2mM 글루타민 및 0.05mM β-머캅토에탄올을 보유한 RPMI 1640)에 재현탁시켰다.
이러한 마우스 비장세포를 96웰 평판의 웰에 분배하고(7x107 세포/ml), 37℃에서 1시간 동안 배양했다. 2x 농도의 시험 샘플 또는 대조군 100㎕를 첨가하고, 세포를 24시간 동안 더 배양했다. 각 시험 샘플 또는 대조군은 2반복으로 시험했다. 각 웰로부터 배지를 수거하고 시험하기 전까지 -80℃에 동결시켜 두었다. 수거된 배지를 해동시키고 ELISA로 시토킨 농도를 검사했다. 5.0, 1.0 및 0.1㎍/ml를 비롯한 다양한 농도에서 폴리뉴클레오타이드를 시험했다. 시험된 폴리뉴클레오타이드 중에는 다음과 같은 서열이 있다: 5'-TGACTGTGAACGTTCGAAATGA (서열번호 36) 및 5'-TGACTGTGAACGTTCGAAGTGA (서열번호 37). 대조군 샘플은 단지 배지와 PANSORBIN® 열사멸된, 포르말린 고정된 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)(SAC)(CalBiochem)를 첨가했다.
IL-6, IL-12 및 IFN-γ는 샌드위치식 ELISA를 이용하여 분석했다. 마우스 비장세포 분석 실험한 배지를 항IL-6, 항IL-12 p40/p70 또는 항IFN-γ 모노클로날 항체(Nunc) 코팅된 미량역가 평판에서 배양했다. 결합된 시토킨(IL-6, IL-12 또는 IFN-γ)의 검출은 비오틴화된 항시토킨 항체(항IL-6, 항IL-12 p40/070 또는 항-INF-γ) 및 스트렙트아비딘-양고추냉이 퍼옥시다제 접합된 제2 항체를 이용하여 수행하고, 퍼옥시다제의 존재하에 발색성 퍼옥시다제 기질인 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)을 이용하여 발색시킨 다음, Emax 정밀 미량평판 판독기(Molecular Devices)를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 정량했다. IL-6이 45 pg/ml 미만인 값은 45pg/ml로 간주했다(즉, 45= <45). IL-12 p40/p70이 36pg/ml 미만인 값은 36pg/ml로 간주했다(즉, 36= <36). 54pg/ml 미만인 IFN-γ 값은 54pg/ml로 간주했다(즉, 54= <54).
표 15 및 16은 IMP에 대한 반응으로 생산되는 시토킨의 분석 결과를 정리한 것이다. CG 디뉴클레오타이드를 함유하는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 높은 IFN-α 유도를 위한 본 명세서에 기술된 보다 특이적인 모티프의 존재에 관계없이, 일반적으로 쥐 비장세포에 의한 IL-6, IL-12 및 IFN-γ 분비를 자극했다.
표 15와 표 16에 제시된 결과로부터 알 수 있듯이, CpG를 함유하는 모든 화합물은 쥐 비장세포로부터 IL-12 생산을 유도하고, CpG 모티프를 함유하는 대부분(전부는 아님)의 화합물은 쥐 비장세포로부터 IL-6 및 IFN-γ 생산을 유도했다. 표 15 및 16에 제시된 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 쥐 비장세포에 대한 면역제어성 폴리뉴클레오타이드의 IL-6, IL-12 및 IFN-γ 자극 활성이 전반적으로 CG 디뉴클레오타이드의 존재에 의존적이기는 하지만, 높은 IFN-α 유도를 위해 본 명세서에 기술된 보다 특이적인 모티프를 필요로 하지는 않았다.
실시예 4: 면역제어성 폴리뉴클레오타이드에 의한 인터페론 유도성 유전자 발현의 자극
본 명세서에서 확인된 바와 같이, 면역제어성 폴리뉴클레오타이드는 PBMC로부터 IFN-γ 및/또는 IFN-α 생산을 유도할 수 있다. 또 다른 시토킨 유전자, 케모킨 유전자 및 기타 다른 유전자의 mRNA 발현 유도에 대하여 인간 PBMC에 미치는 IMP의 활성을 정량적 PCR 기법인 TaqMan 기법을 사용하여 분석했다. 시험된 폴리뉴클레오타이드에는 완전 변형된 포스포로티오에이트 올리고데옥시뉴클레오타이드가 사용되었다. 시험된 폴리뉴클레오타이드 중에는 서열번호 1(양성 대조군) 및 서열번호 2(음성 대조군)가 있다.
인간 PBMC는 실시예 1에 기술된 바와 같이 제조했다. 이 세포를 5㎍/ml 농도의 시험 샘플(IMP 또는 대조군)의 존재하에 24시간 동안 배양했다. 총 RNA는 Qiagen RNeasy Mini Protocol(퀴아겐)을 사용하여 추출하고 올리고 dT(프로메가), 랜덤 헥사머(프로메가) 및 SuperScript RT II(InVitrogen)를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. cDNA는 1:10으로 희석하고, QuantiTect SYBR 그린 PCR 매스터 혼합물(퀴아겐) 및 나출형 프라이머(오페론에서 합성한 것)를 사용하거나 또는 QuantiTect 프로브 PCR 매스터 혼합물(퀴아겐) 및 표지된 프로브를 가진 PDAR 프라이머(Applied BioSystms)를 사용하여 PCR을 수행했다. 반응은 GeneAmp 5700 Sequence Detector(PE BioSystms)로 검출했다.
합성된 프라이머용 서열의 예는 다음과 같다(5'에서 3'방향으로 기재):
IFN-γ, IL-1α, IL-6, IP-10, MCP-3 및 MIP-3β는 PE 바이오시스템즈社의 PDAR로 측정했다. 각 유전자의 한계 사이클(CT) 값은 식 1.8(UBQ-GENE)(100,000)(여기서, UBQ는 3반복 우비퀴틴 실험의 평균 CT이고, GENE는 당해 유전자의 이반복 실험의 평균 CT이며, 100,000은 모든 값을 0 이상이 되게 하기 위한 계수로서 임의 선택된 값이다)을 사용하여 우비퀴틴에 대해 규정화했다. 각 실험의 음성 대조군인 배지만으로의 자극을 1의 값으로 지정하고, 모든 데이터는 음성 대조군에 대한 유도배수로 나타냈다.
표 17에는 IMP 서열번호 27에 대한 반응으로 PBMC로부터 나타나는 시토킨, 케모킨 및 염증성 단백질 유전자 발현의 분석 결과를 정리했다. 또한, 폴리뉴클레오타이드 5'-GGTGCATCGATGCAGGGGGG (서열번호 154)도 시험했다. 데이터 값은 배지 대조군(1.0)에 대한 유도배수의 평균값과 SEM이다.
표 17에 나타나듯이, 서열번호 27은 케모킨 IP-10, MCP-2, MCP-3, MIG 및 MIP-3β의 발현을 상당히 증가시켰다. IL-1α의 발현은 서열번호 27의 존재하에서 감소되었다. 또한 서열번호 27은 IFN-α 유도성 유전자 2,5-올리고아데닐레이트 신테타제(2,5-OAS), 인터페론 자극성 유전자-54K(ISG-54K) 및 구아닐레이트 결합 단백질-1(GBP-1)의 발현을 현저하게 증가시켰다.
이러한 분석에서, IMP 서열번호 27은 시토킨 G-CSF, IL-1β, IL-6, IL-12 p40, IL-23, TNF-α, 또는 케모킨 BCA-1, IL-8, LPTN, MCP-1, MDC, MIP-la, MIP-lb, MIP-3a, RANTES 및 TARC의 mRNA 발현 수준에는 유의적 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
실시예 5: 면역제어성 폴리뉴클레오타이드에 의한 NK 세포 용해 활성의 자극
본 발명의 IMP는 IMP 표준물과 비교했을 때 개선된 천연 킬러(NK) 세포 용해 활성을 자극한다. NK 세포 용해 활성은 K562 표적 세포의 용해를 통해 분석했다. 간략히 정리하면, PBMC를 배양물에서 10mg/ml IMP(앞서 수득된 최적 용량) 또는 음성 대조용 폴리뉴클레오타이드로 48시간동안 자극했다. 이와 같이 처리된 PBMC를 그 다음 51Cr 로딩된 K562 종양 표적 세포와 일정범위의 작동제:표적 비율로 4시간 동안 공동배양했다. 그 다음, 세포 용해시 방출되는 51Cr을 TopCount NXT 신틸레이션 계수기(Packard)로 측정하고 cpm(분당 개수)으로 기록했다.
2가지 다른 PBMC 공급자로부터의 NK 세포 자극의 결과는 도 2에 제시했다. 본 분석에 사용한 IMP는 서열번호 1, 서열번호 90, 서열번호 27, 서열번호 172 및 서열번호 113이다. IMP 중의 팔린드롬 길리은 서열번호 172의 경우 28개 염기, 서열번호 113의 경우 22개 염기, 서열번호 27의 경우 12개 염기, 서열번호 1의 경우 8개 염기이다. 비IMP 대조군인 서열번호 90은 20개 염기 길이의 팔린드롬을 보유하지만 5'-C, G-3' 서열은 함유하지 않는다. 이 실험에서, 염기 길이가 12개 이상인 팔린드롬을 보유한 IMP는 팔린드롬 염기 길이가 8개인 표준 IMP 서열번호 1에 비해 증가된 양의 NK 세포 용해 활성을 자극했다.
이상, 본 발명은 명백한 이해를 목적으로 상세한 설명과 실시예를 통해 약간 상세하게 설명하였지만, 특정 변화 및 변형이 수행될 수 있다는 것은 당업자라면 잘 알고 있을 것이다. 따라서, 상세한 설명과 실시예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다.
<110> DYNAVAX TECHNOLOGIES CORPORATION <120> Immunostimulatory sequence oligonucleotides and methods of using the same <130> 377882003340 <150> US 60/436,122 <151> 2002-12-23 <150> US 60/447,885 <151> 2003-02-13 <150> US 60/467,546 <151> 2003-05-01 <160> 227 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 1 tgactgtgaa cgttcgagat ga 22 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide not containing CG <400> 2 tgactgtgaa ccttagagat ga 22 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 3 tcgtcgtttt gtcgttttgt cgtt 24 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 4 tcaacgttcg ttaacgttcg tt 22 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 5 tcgtcgaacg ttcgttaacg ttcg 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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acgttcgacg atca 24 <210> 117 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 117 tcgaacgttc gaacgttcga atttt 25 <210> 118 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 118 tcgttcgaac gttcgaacga atgat 25 <210> 119 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 119 tcgacgtcga cgtcgacgtc ga 22 <210> 120 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 120 acgtcgacgt cgacgtcgac gt 22 <210> 121 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 121 tcgtcgacgt cgacgtcgac gt 22 <210> 122 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 122 tcgtcggcgc cggcgccggc gc 22 <210> 123 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 123 tcgtcgccgg cgccggcgcc gg 22 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 124 tcgatacgtc gacgtcgacg t 21 <210> 125 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 125 tcgtcgaagc gcttcgacag t 21 <210> 126 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 126 tcgtcgaatc gattcgacag t 21 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 127 tcgtcgagtc gactcgacag t 21 <210> 128 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 128 tcgtcgcaac gttgcgacag t 21 <210> 129 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 129 tcgtcgccgc gcggcgacag t 21 <210> 130 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 130 tcgaaacgtt tcgacagtga t 21 <210> 131 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 131 tcgaggtcga cctcgagatg at 22 <210> 132 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 132 atcgatgtcg acatcgatat gat 23 <210> 133 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 133 tcgtcgtcga cgacgagatg at 22 <210> 134 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 134 tcggtcgatc gacgtcgatc gac 23 <210> 135 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 135 tcggacggcc gtcgacggcc gtc 23 <210> 136 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 136 tcggacgtac gtcgacgtac gtc 23 <210> 137 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 137 tcgatcgtac gatatcgtac gat 23 <210> 138 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 138 tcgtcggacg atcgtccgac ga 22 <210> 139 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 139 tcgtcgcgta cgcgagatga t 21 <210> 140 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 140 tcgtcgcggc cgcgagatga t 21 <210> 141 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 141 tcgcgatcgc gcgatcgcga 20 <210> 142 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 142 tcgtcgacgc gtcgagatga t 21 <210> 143 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 143 tcgtcggcgc gccgagatga t 21 <210> 144 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 144 tcgtcgatcg cgatcgacga 20 <210> 145 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 145 tcgtcgaatc gcgattcgac ga 22 <210> 146 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 146 tcgtcgcgat atcgcgacga 20 <210> 147 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 147 tcgaacgttc gttcgaacga acgtt 25 <210> 148 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 148 tcgaacgttt tcgaaaacgt t 21 <210> 149 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 149 tcgtgcatcg atgcacga 18 <210> 150 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 150 tcgcgaacgt tcgaacgttc g 21 <210> 151 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 151 tcgcgaacgt tcgaacgttt c 21 <210> 152 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 152 tcgataacgt tcgaacgtta t 21 <210> 153 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 153 tcgataacgt tcgaacgttt c 21 <210> 154 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 154 ggtgcatcga tgcagggggg 20 <210> 155 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 1 <223> n = absent, n, nn, or nnn <221> misc_feature <222> 2-5 <223> Sequence of bases at positions 2-5 may be present 1, 2, 3, or 4 times <221> misc_feature <222> 6 <223> n = absent, n, nn; or absent with the 3' most base of (tcgn) positions 2-5 as the 5' most base of (ncgncg) positions 7-12 <221> misc_feature <222> 11, 12 <223> Sequence of bases at positions 11-12 may or may not be present <221> misc_feature <222> 5 <223> n = absent, n, or nn <221> misc_feature <222> (7)...(12) <223> Sequence of bases at positions 7-12 may be present 1-20 times <221> misc_feature <222> (7)...(7) <223> n = any base so long as complementary of base at position 10 <221> misc_feature <222> (10)...(10) <223> n = any base so long as complementary of base at position 7 <400> 155 ntcgnnncgn cg 12 <210> 156 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 1 <223> n = absent, n, nn, or nnn <221> misc_feature <222> 2-5 <223> Sequence of bases at positions 2-5 may be present 1, 2, 3, or 4 times <221> misc_feature <222> 6 <223> n = absent; n; nn; or absent with the 3' most base of (tcgn) positions 2-5 as the 5' most base of (nncgnncg) positions 7-14; or absent with the last and second to last 3' bases of (tcgn) positions 2-5 be the second and first 5' bases respectively of (nncgnncg) positions 7-14 <221> misc_feature <222> 13, 14 <223> Sequence of bases at positions 13-14 may or may not be present <221> misc_feature <222> 5 <223> n = absent, n, or nn <221> misc_feature <222> (7)...(14) <223> Sequence of bases at positions 7-14 may be present 1-20 times <221> misc_feature <222> (7)...(7) <223> n = any base so long as complementary of base at position 12 <221> misc_feature <222> (12)...(12) <223> n = any base so long as complementary of base at position 7 <221> misc_feature <222> (8)...(8) <223> n = any base so long as complementary of base at position 11 <221> misc_feature <222> (11)...(11) <223> n = any base so long as complementary of base at position 8 <400> 156 ntcgnnnncg nncg 14 <210> 157 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 1 <223> n = absent, n, nn, or nnn <221> misc_feature <222> 2-5 <223> Sequence of bases at positions 2-5 may be present 1, 2, 3, or 4 times <221> misc_feature <222> 6 <223> n = absent; n; nn; or absent with the 3' most base of (tcgn) positions 2-5 as the 5' most base of (nnncgnnncg) positions 7-16; or absent with the last and second to last 3' bases of (tcgn) positions 2-5 as the second and first 5' bases respectively of (nnncgnnncg) positions 7-16; or absent with the last, second to last and third to last 3' bases of (tcgn) positions 2-5 as the third, second and first 5' bases, respectively of (nnncgnnncg) positions 7-16 <221> misc_feature <222> 15, 16 <223> Sequence of bases at positions 15-16 may or may not be present <221> misc_feature <222> 5 <223> n = absent, n, or nn <221> misc_feature <222> (7)...(16) <223> Sequence of bases at positions 7-16 may be present 1-20 times <221> misc_feature <222> (7)...(7) <223> n = any base so long as complementary of base at position 14 <221> misc_feature <222> (14)...(14) <223> n = any base so long as complementary of base at position 7 <221> misc_feature <222> (8)...(8) <223> n = any base so long as complementary of base at position 13 <221> misc_feature <222> (13)...(13) <223> n = any base so long as complementary of base at position 8 <221> misc_feature <222> (9)...(9) <223> n = any base so long as complementary of base at position 12 <221> misc_feature <222> (2)...(2) <223> n = any base so long as complementary of base at position 9 <400> 157 ntcgnnnnnc gnnncg 16 <210> 158 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 1 <223> n = absent, n, nn, or nnn <221> misc_feature <222> 2-5 <223> Sequence of bases at positions 2-5 may be present 1, 2, 3, or 4 times <221> misc_feature <222> 6 <223> n = absent; n; nn; or absent with the 3' most base of (tcgn) positions 2-5 as the 5' most base of (nnnncgnnnncg) positions 7-18; or absent with the last and second to last 3' bases of (tcgn) positions 2-5 as the second and first 5' bases respectively of (nnnncgnnnncg) positions 7-18; or absent with the last, second to last and third to last 3' bases of (tcgn) positions 2-5 be the third, second and first 5' bases respectively of (nnnncgnnnncg) positions 7-18 <221> misc_feature <222> 17, 18 <223> Sequence of bases at positions 17-18 may or may not be present <221> misc_feature <222> 5 <223> n = absent, n, or nn <221> misc_feature <222> (7)...(18) <223> Sequence of bases at positions 7-18 may be present 1-20 times <221> misc_feature <222> (7)...(7) <223> n = any base so long as complementary of base at position 16 <221> misc_feature <222> (16)...(16) <223> n = any base so long as complementary of base at position 7 <221> misc_feature <222> (8)...(8) <223> n = any base so long as complementary of base at position 15 <221> misc_feature <222> (15)...(15) <223> n = any base so long as complementary of base at position 8 <221> misc_feature <222> (9)...(9) <223> n = any base so long as complementary of base at position 14 <221> misc_feature <222> (14)...(14) <223> n = any base so long as complementary of base at position 9 <221> misc_feature <222> (10)...(10) <223> n = any base so long as complementary of base at position 13 <221> misc_feature <222> (13)...(13) <223> n = any base so long as complementary of base at position 10 <400> 158 ntcgnnnnnn cgnnnncg 18 <210> 159 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 1 <223> n = absent, n, nn, or nnn <221> misc_feature <222> 2-5 <223> Sequence of bases at positions 2-5 may be present 1, 2, 3, or 4 times <221> misc_feature <222> 6 <223> n = absent; n; nn; or absent with the 3' most base of (tcgn) positions 2-5 as the 5' most base of (nncgnncgnncg) positions 7-18; or absent with the last and second to last 3' bases of (tcgn) positions 2-5 as the second and first 5' bases respectively of (nncgnncgnncg) positions 7-18 <221> misc_feature <222> 17, 18 <223> Sequence of bases at positions 17-18 may or may not be present <221> misc_feature <222> 5 <223> n = absent, n, or nn <221> misc_feature <222> (7)...(18) <223> Sequence of bases at positions 7-18 may be present 1-20 times <221> misc_feature <222> (7)...(7) <223> n = any base so long as complementary of base at position 16 <221> misc_feature <222> (16)...(16) <223> n = any base so long as complementary of base at position 7 <221> misc_feature <222> (8)...(80) <223> n = any base so long as complementary of base at position 15 <221> misc_feature <222> (15)...(15) <223> n = any base so long as complementary of base at position 8 <221> misc_feature <222> (11)...(11) <223> n = any base so long as complementary of base at position 12 <221> misc_feature <222> (12)...(12) <223> n = any base so long as complementary of base at position 11 <400> 159 ntcgnnnncg nncgnncg 18 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 1 <223> n = absent, n, nn, or nnn <221> misc_feature <222> 2-5 <223> Sequence of bases at positions 2-5 may be present 1, 2, 3, or 4 times <221> misc_feature <222> 6 <223> n = absent; n; nn; or absent with the 3' most base of (tcgn) positions 2-5 as the 5' most base of (nnnnncgnnnnncg) positions 7-20; or absent with the last and second to last 3' bases of (tcgn) positions 2-5 as the second and first 5' bases respectively of (nnnnncgnnnnncg) positions 7-20; or absent with the last, second to last and third to last 3' bases of (tcgn) positions 2-5 as the third, second and first 5' bases respectively of (nnnnncgnnnnncg) positions 7-20 <221> misc_feature <222> 19, 20 <223> Sequence of bases at positions 19-20 may or may not be present <221> misc_feature <222> 5 <223> n = absent, n, or nn <221> misc_feature <222> (7)...(20) <223> Sequence of bases at positions 7-20 may be present 1-20 times <221> misc_feature <222> (7)...(70) <223> n = any base so long as complementary of base at position 18 <221> misc_feature <222> (18)...(18) <223> n = any base so long as complementary of base at position 7 <221> misc_feature <222> (8)...(8) <223> n = any base so long as complementary of base at position 17 <221> misc_feature <222> (17)...(17) <223> n = any base so long as complementary of base at position 8 <221> misc_feature <222> (9)...(9) <223> n = any base so long as complementary of base at position 16 <221> misc_feature <222> (16)...(16) <223> n = any base so long as complementary of base at position 9 <221> misc_feature <222> (10)...(10) <223> n = any base so long as complementary of base at position 15 <221> misc_feature <222> (15)...(15) <223> n = any base so long as complementary of base at position 10 <221> misc_feature <222> (11)...(11) <223> n = any base so long as complementary of base at position 14 <221> misc_feature <222> (14)...(14) <223> n = any base so long as complementary of base at position 11 <400> 160 ntcgnnnnnn ncgnnnnncg 20 <210> 161 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 1 <223> n = absent, n, nn, or nnn <221> misc_feature <222> 2-5 <223> Sequence of bases at positions 2-5 may be present 1, 2, 3, or 4 times <221> misc_feature <222> 6 <223> n = absent; n; nn; or absent with the second to last and last 3' bases of (tcgn) positions 2-5 as CG and as the first and second 5' bases respectively of (cgnncgcg) positions 7-14 <221> misc_feature <222> 13, 14 <223> Sequence of bases at positions 13-14 may or may not be present <221> misc_feature <222> 5 <223> n = absent, n, or nn <221> misc_feature <222> (7)...(14) <223> Sequence of bases at positions 7-14 may be present 1-20 times <221> misc_feature <222> (9)...(9) <223> n = any base so long as complementary of base at position 10 <221> misc_feature <222> (10)...(10) <223> n = any base so long as complementary of base at position 9 <400> 161 ntcgnncgnn cgcg 14 <210> 162 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 1 <223> n = absent, n, nn, or nnn <221> misc_feature <222> 2-5 <223> Sequence of bases at positions 2-5 may be present 1, 2, 3, or 4 times <221> misc_feature <222> 6 <223> n = absent; n; nn; or absent with the 3' most base of (tcgn) positions 2-5 as the 5' most base of (ncgcgncg) positions 7-14 <221> misc_feature <222> 13, 14 <223> Sequence of bases at positions 13-14 may or may not be present <221> misc_feature <222> 5 <223> n = absent, n, or nn <221> misc_feature <222> (7)...(14) <223> Sequence of bases at positions 7-14 may be present 1-20 times <221> misc_feature <222> (7)...(7) <223> n = any base so long as complementary of base at position 12 <221> misc_feature <222> (12)...(12) <223> n = any base so long as complementary of base at position 7 <400> 162 ntcgnnncgc gncg 14 <210> 163 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 1 <223> n = absent, n, nn, or nnn <221> misc_feature <222> 2-5 <223> Sequence of bases at positions 2-5 may be present 1, 2, 3, or 4 times <221> misc_feature <222> 6 <223> n = absent; n; nn; or absent with the 3' most base of (tcgn) positions 2-5 as the 5' most base of (nncgcgnncg) positions 7-16; or absent with the last and second to last 3' bases of (tcgn) positions 2-5 as the second and first 5' bases respectively of (nncgcgnncg) positions 7-16 <221> misc_feature <222> 15, 16 <223> Sequence of bases at positions 15-16 may or may not be present <221> misc_feature <222> 5 <223> n = absent, n, or nn <221> misc_feature <222> (7)...(16) <223> Sequence of bases at positions 7-16 may be present 1-20 times <221> misc_feature <222> (7)...(7) <223> n = any base so long as complementary of base at position 14 <221> misc_feature <222> (14)...(14) <223> n = any base so long as complementary of base at position 7 <221> misc_feature <222> (8)...(8) <223> n = any base so long as complementary of base at position 13 <221> misc_feature <222> (13)...(13) <223> n = any base so long as complementary of base at position 8 <400> 163 ntcgnnnncg cgnncg 16 <210> 164 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 1 <223> n = absent, n, nn, or nnn <221> misc_feature <222> 2-5 <223> Sequence of bases at positions 2-5 may be present 1, 2, 3, or 4 times <221> misc_feature <222> 6 <223> n = absent; n; nn; or absent with the 3' most base of (tcgn) positions 2-5 as the 5' most base of (nnncgcgnnncg) positions 7-18; or absent with the last and second to last 3' bases of (tcgn) positions 2-5 as the second and first 5' bases respectively of (nnncgcgnnncg) positions 7-18; or absent with the last, second to last and third to last 3' bases of (tcgn) positions 2-5 as the third, second and first 5' bases respectively of (nnncgcgnnncg) positions 7-18 <221> misc_feature <222> 17, 18 <223> Sequence of bases at positions 17-18 may or may not be present <221> misc_feature <222> 5 <223> n = absent, n, or nn <221> misc_feature <222> (7)...(18) <223> Sequence of bases at positions 7-18 may be present 1-20 times <221> misc_feature <222> (7)...(0) <223> n = any base so long as complementary of base at position 16 <221> misc_feature <222> (16)...(16) <223> n = any base so long as complementary of base at position 7 <221> misc_feature <222> (8)...(8) <223> n = any base so long as complementary of base at position 15 <221> misc_feature <222> (15)...(15) <223> n = any base so long as complementary of base at position 8 <221> misc_feature <222> (9)...(9) <223> n = any base so long as complementary of base at position 14 <221> misc_feature <222> (14)...(14) <223> n = any base so long as complementary of base at position 9 <400> 164 ntcgnnnnnc gcgnnncg 18 <210> 165 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 1 <223> n = absent, n, nn, or nnn <221> misc_feature <222> 2-5 <223> Sequence of bases at positions 2-5 may be present 1, 2, 3, or 4 times <221> misc_feature <222> 6 <223> n = absent; n; nn; or absent with the second to last and last 3' bases of (tcgn) positions 2-5 as CG and the first and second 5' bases respectively of (cgnnnncgcg) positions 7-16 <221> misc_feature <222> 15, 16 <223> Sequence of bases at positions 15-16 may or may not be present <221> misc_feature <222> 5 <223> n = absent, n, or nn <221> misc_feature <222> (7)...(16) <223> Sequence of bases at positions 7-16 may be present 1-20 times <221> misc_feature <222> (9)...(9) <223> n = any base so long as complementary of base at position 12 <221> misc_feature <222> (12)...(12) <223> n = any base so long as complementary of base at position 9 <221> misc_feature <222> (10)...(10) <223> n = any base so long as complementary of base at position 11 <221> misc_feature <222> (11)...(11) <223> n = any base so long as complementary of base at position 10 <400> 165 ntcgnncgnn nncgcg 16 <210> 166 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 166 tcgtcgaacg ttcgagatg 19 <210> 167 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 167 tcgtcgaacg ttcg 14 <210> 168 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 168 tcgaacgttc gatcgaacgt tcga 24 <210> 169 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 169 tcgaccggtc gaccggtcga 20 <210> 170 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 170 tcgaacgttc gaacgttgat gt 22 <210> 171 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 171 tcgaacgttc gaagatgatg at 22 <210> 172 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 172 tcgaacgttc gaacgttcga acgttcgaat 30 <210> 173 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 173 tcgataacgt tcgaacgttc gaacgttat 29 <210> 174 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 174 tcgtaacgtt cgaacgttcg aacgtta 27 <210> 175 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 175 tcgaacgttc gaacgttcga acg 23 <210> 176 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 176 tcgaccggtc gaccggtcga ccggt 25 <210> 177 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 177 tcgcgcgcgc gcgcgcgcga 20 <210> 178 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 178 tcgcccgggc gcccgggcga 20 <210> 179 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 179 tcggccggac gtccggacga 20 <210> 180 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 180 tcggccggcc ggccggccga 20 <210> 181 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> (1)...(22) <223> Polynucleotide is circular <400> 181 tcgaacgttc gaacgttcga at 22 <210> 182 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 182 Lys Phe Phe Lys Phe Phe Lys Phe Phe 1 5 <210> 183 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 183 Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His 1 5 10 15 Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Glu Ala Cys Glu Ala 20 25 30 <210> 184 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide <400> 184 Trp Glu Ala Lys Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys His 1 5 10 15 Leu Ala Lys Ala Leu Ala Lys Ala Leu Lys Ala Cys Glu Ala 20 25 30 <210> 185 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 21 <223> n = 5'-DMT-N3-(tBu-SS-ethyl)thymidine-3'-phosphoroamid ite <400> 185 tcgtcgaacg ttcgagatga n 21 <210> 186 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 1 <223> n = 5'-DMT-N3-(tBu-SS-ethyl)thymidine-3'-phosphoroamid ite <400> 186 ntcatctcga acgttcgacg a 21 <210> 187 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing C modified G <221> modified_base <222> 3, 6, 10, 14, 16, 19 <223> n = 7-deaza-8-aza-dG <400> 187 tcntcnaacn ttcnanatna t 21 <210> 188 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> modified_base <222> 7, 8, 15, 17, 20 <223> n = 2-amino-dA <400> 188 tcgtcgnncg ttcgngntgn t 21 <210> 189 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> modified_base <222> 8 <223> n = 2-amino-dA <221> modified_base <222> 11 <223> n = 2-thio-dT <400> 189 tcgtcgancg ntcgagatga t 21 <210> 190 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> modified_base <222> 7, 8 <223> n = 2-amino-dA <221> modified_base <222> 11, 12 <223> n = 2-thio-dT <400> 190 tcgtcgnncg nncgagatga t 21 <210> 191 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> modified_base <222> 17 <223> n = N6-cystamine-2-dA <400> 191 tcgtcgaacg ttcgagntga t 21 <210> 192 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> modified_base <222> 4 <223> n = N6-cystamine-2-dA <400> 192 atcntctcga acgttcgacg a 21 <210> 193 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing C modified G <221> modified_base <222> 3, 6, 10, 14 <223> n = 7-deaza-dG <400> 193 tcntcnaacn ttcnagatga t 21 <210> 194 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing C modified G <221> modified_base <222> 3, 7, 11, 15, 19, 23 <223> n = 7-deaza-8-aza-dG <400> 194 tcnaacnttc naacnttcna acntt 25 <210> 195 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> modified_base <222> 4, 11, 12, 18, 21 <223> n = 5-propynyl-dU <400> 195 tcgncgaacg nncgaganga n 21 <210> 196 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> modified_base <222> 8, 9, 16, 17, 24, 25 <223> n = 5-propynyl-dU <400> 196 tcgaacgnnc gaacgnncga acgnn 25 <210> 197 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> modified_base <222> 4, 5, 12, 13, 20, 21 <223> n = 2-amino-dA <400> 197 tcgnncgttc gnncgttcgn ncgtt 25 <210> 198 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 4 <223> n = any base so long as complementary of base at position 9 <221> misc_feature <222> 9 <223> n = any base so long as complementary of base at position 4 <221> misc_feature <222> 5 <223> n = any base so long as complementary of base at position 8 <221> misc_feature <222> 8 <223> n = any base so long as complementary of base at position 5 <400> 198 tcgnncgnnc ga 12 <210> 199 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <400> 199 tcgtcgaacg tt 12 <210> 200 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 200 cacttggtcc tgcgcttga 19 <210> 201 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 201 caattgggaa tgcaacaact ttat 24 <210> 202 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 202 agggagcatg aaaacacatt tca 23 <210> 203 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 203 ttgctggtag tttatgacta attccaag 28 <210> 204 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 204 tggaacgtgt gaaagctgag tct 23 <210> 205 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 205 catctgctca ttctttcttt gca 23 <210> 206 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 206 cccaggagga gtttggcaa 19 <210> 207 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 207 tgctggatca tctcatggag g 21 <210> 208 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 208 ctggactggc aatagcaagc t 21 <210> 209 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 209 agagggtcaa tggcgttctg 20 <210> 210 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 210 ctgctcatgg cagccacttt 20 <210> 211 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 211 agcaggtgat tggaatggaa a 21 <210> 212 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 212 catcttgctg gttctgattg ga 22 <210> 213 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 213 tggtgctgat gcaggaacag 20 <210> 214 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 214 cttctgcctg ctgcactttg 20 <210> 215 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 215 ctgggccaga gggctgat 18 <210> 216 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 1 <223> n = any base so long as complementary of base at position 10 <221> misc_feature <222> 10 <223> n = any base so long as complementary of base at position 1 <221> misc_feature <222> 2 <223> n = any base so long as complementary of base at position 9 <221> misc_feature <222> 9 <223> n = any base so long as complementary of base at position 2 <221> misc_feature <222> 5 <223> n = any base so long as complementary of base at position 6 <221> misc_feature <222> (6)...(6) <223> n = any base so long as complementary of base at position 5 <400> 216 nncgnncgnn 10 <210> 217 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 11, 12 <223> Sequence of bases at positions 11-12 may or may not be present <221> misc_feature <222> 1-12 <223> Sequence of bases at positions 1-12 may be present 1-20 times <221> misc_feature <222> 1 <223> n = any base so long as complementary of base at position 10 <221> misc_feature <222> 10 <223> n = any base so long as complementary of base at position 1 <221> misc_feature <222> 2 <223> n = any base so long as complementary of base at position 9 <221> misc_feature <222> (9)...(9) <223> n = any base so long as complementary of base at position 2 <221> misc_feature <222> (5)...(5) <223> n = any base so long as complementary of base at position 6 <221> misc_feature <222> (6)...(6) <223> n = any base so long as complementary of base at position 5 <400> 217 nncgnncgnn cg 12 <210> 218 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 1 <223> n = any base so long as complementary of base at position 12 <221> misc_feature <222> 12 <223> n = any base so long as complementary of base at position 1 <221> misc_feature <222> 2 <223> n = any base so long as complementary of base at position 11 <221> misc_feature <222> 11 <223> n = any base so long as complementary of base at position 2 <221> misc_feature <222> 3 <223> n = any base so long as complementary of base at position 10 <221> misc_feature <222> (10)...(10) <223> n = any base so long as complementary of base at position 3 <221> misc_feature <222> (4)...(4) <223> n = any base so long as complementary of base at position 9 <221> misc_feature <222> (9)...(9) <223> n = any base so long as complementary of base at position 4 <221> misc_feature <222> (5)...(5) <223> n = any base so long as complementary of base at position 8 <221> misc_feature <222> (8)...(8) <223> n = any base so long as complementary of base at position 5 <400> 218 nnnnncgnnn nn 12 <210> 219 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 13, 14 <223> Sequence of bases at positions 13-14 may or may not be present <221> misc_feature <222> 1-14 <223> Sequence of bases at positions 1-14 may be present 1-20 times <221> misc_feature <222> 1 <223> n = any base so long as complementary of base at position 12 <221> misc_feature <222> 12 <223> n = any base so long as complementary of base at position 1 <221> misc_feature <222> 2 <223> n = any base so long as complementary of base at position 11 <221> misc_feature <222> (11)...(11) <223> n = any base so long as complementary of base at position 2 <221> misc_feature <222> (3)...(3) <223> n = any base so long as complementary of base at position 10 <221> misc_feature <222> (10)...(10) <223> n = any base so long as complementary of base at position 3 <221> misc_feature <222> (4)...(4) <223> n = any base so long as complementary of base at position 9 <221> misc_feature <222> (9)...(9) <223> n = any base so long as complementary of base at position 4 <221> misc_feature <222> (5)...(5) <223> n = any base so long as complementary of base at position 8 <221> misc_feature <222> (8)...(8) <223> n = any base so long as complementary of base at position 5 <400> 219 nnnnncgnnn nncg 14 <210> 220 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 9, 10 <223> Sequence of bases at positions 9-10 may or may not be present <221> misc_feature <222> 1-10 <223> Sequence of bases at positions 1-10 may be present 1-20 times <221> misc_feature <222> 1 <223> n = any base so long as complementary of base at position 8 <221> misc_feature <222> 8 <223> n = any base so long as complementary of base at position 1 <221> misc_feature <222> 2 <223> n = any base so long as complementary of base at position 7 <221> misc_feature <222> (7)...(7) <223> n = any base so long as complementary of base at position 2 <400> 220 nncgcgnncg 10 <210> 221 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 1 <223> n = any base so long as complementary of base at position 10 <221> misc_feature <222> 10 <223> n = any base so long as complementary of base at position 1 <221> misc_feature <222> 2 <223> n = any base so long as complementary of base at position 9 <221> misc_feature <222> 9 <223> n = any base so long as complementary of base at position 2 <221> misc_feature <222> 3 <223> n = any base so long as complementary of base at position 8 <221> misc_feature <222> (8)...(8) <223> n = any base so long as complementary of base at position 3 <400> 221 nnncgcgnnn 10 <210> 222 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 11, 12 <223> Sequence of bases at positions 11-12 may or may not be present <221> misc_feature <222> 1-12 <223> Sequence of bases at positions 1-12 may be present 1-20 times <221> misc_feature <222> 1 <223> n = any base so long as complementary of base at position 10 <221> misc_feature <222> 10 <223> n = any base so long as complementary of base at position 1 <221> misc_feature <222> 2 <223> n = any base so long as complementary of base at position 9 <221> misc_feature <222> (9)...(9) <223> n = any base so long as complementary of base at position 2 <221> misc_feature <222> (3)...(3) <223> n = any base so long as complementary of base at position 8 <221> misc_feature <222> (8)...(8) <223> n = any base so long as complementary of base at position 3 <400> 222 nnncgcgnnn cg 12 <210> 223 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 9, 10 <223> Sequence of bases located at positions 9-10 may or may not be present <221> misc_feature <222> 1-10 <223> Sequence of bases at positions 1-10 may be present 1-20 times <221> misc_feature <222> 3 <223> n = any base so long as complementary of base at position 6 <221> misc_feature <222> 6 <223> n = any base so long as complementary of base at position 3 <221> misc_feature <222> 4 <223> n = any base so long as complementary of base at position 5 <221> misc_feature <222> (5)...(5) <223> n = any base so long as complementary of base at position 4 <400> 223 cgnnnncgcg 10 <210> 224 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 9, 10 <223> Sequence of bases located at positions 9-10 may or may not be present <221> misc_feature <222> 1 <223> n = any base so long as complementary of base at position 8 <221> misc_feature <222> 8 <223> n = any base so long as complementary of base at position 1 <221> misc_feature <222> 2 <223> n = any base so long as complementary of base at position 7 <221> misc_feature <222> 7 <223> n = any base so long as complementary of base at position 2 <221> misc_feature <222> (3)...(3) <223> n = any base so long as complementary of base at position 6 <221> misc_feature <222> (6)...(6) <223> n = any base so long as complementary of base at position 3 <400> 224 nnncgnnncg 10 <210> 225 <211> 10 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 1 <223> n = any base so long as complementary of base at position 10 <221> misc_feature <222> 10 <223> n = any base so long as complementary of base at position 1 <221> misc_feature <222> 2 <223> n = any base so long as complementary of base at position 9 <221> misc_feature <222> 9 <223> n = any base so long as complementary of base at position 2 <221> misc_feature <222> 3 <223> n = any base so long as complementary of base at position 8 <221> misc_feature <222> (8)...(8) <223> n = any base so long as complementary of base at position 3 <221> misc_feature <222> (4)...(4) <223> n = any base so long as complementary of base at position 7 <221> misc_feature <222> (7)...(7) <223> n = any base so long as complementary of base at position 4 <400> 225 nnnncgnnnn 10 <210> 226 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 11, 12 <223> Sequence of bases located at positions 11-12 may or may not be present <221> misc_feature <222> 1 <223> n = any base so long as complementary of base at position 10 <221> misc_feature <222> 10 <223> n = any base so long as complementary of base at position 1 <221> misc_feature <222> 2 <223> n = any base so long as complementary of base at position 9 <221> misc_feature <222> 9 <223> n = any base so long as complementary of base at position 2 <221> misc_feature <222> (3)...(3) <223> n = any base so long as complementary of base at position 8 <221> misc_feature <222> (8)...(8) <223> n = any base so long as complementary of base at position 3 <221> misc_feature <222> (4)...(4) <223> n = any base so long as complementary of base at position 7 <221> misc_feature <222> (7)...(7) <223> n = any base so long as complementary of base at position 4 <400> 226 nnnncgnnnn cg 12 <210> 227 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polynucleotide containing CG <221> misc_feature <222> 4, 27 <223> n = 5'-DMT-N3-(tBu-SS-ethyl)thymidine-3'-phosphoramidi te <400> 227 tcgnaacgtt cgaacgttcg aacgttn 27

Claims (35)

  1. a) 적어도 2개의 CG 디뉴클레오타이드를 함유하되, 이 CG 디뉴클레오타이드가 0개, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 염기에 의해 분리되어 있고, 염기 길이가 적어도 8개인 팔린드롬 서열; 및
    b) (TCG)y[여기서, y는 1 또는 2이고, (TCG)y의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0개, 1개, 2개 또는 3개 염기째에 위치하며, (TCG)y는 상기 팔린드롬 서열의 5' 말단으로부터 0개, 1개 또는 2개 염기에 의해 분리되어 있다]
    를 포함하는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  2. 제1항에 있어서, 팔린드롬 서열이 A와 T가 1/3보다 많은 염기 조성을 갖는 특징인 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  3. 제1항에 있어서, 팔린드롬 서열이 (TCG)y 서열 전부 또는 일부를 포함하는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  4. a) 적어도 2개의 CG 디뉴클레오타이드를 함유하되, 이 CG 디뉴클레오타이드가 0개, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개 염기에 의해 분리되어 있고, 염기 길이가 적어도 8개인 팔린드롬 서열; 및
    b) (TCG)y 서열[여기서, y는 1 또는 2이고, (TCG)y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0개, 1개, 2개 또는 3개 염기째에 위치하며, (a)의 팔린드롬 서열이 (TCG)y 서열 전부 또는 일부를 포함한다]
    을 포함하고, (TCG)y 서열의 CG가 (a)의 팔린드롬 서열의 CG 디뉴클레오타이드 중 하나일 수 있는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제4항에 있어서, 팔린드롬 서열이 A와 T가 1/3 보다 많은 염기 조성을 갖는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  6. 제4항에 있어서, 팔린드롬 서열이 (TCG)y 서열 전부 또는 일부를 포함하는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  7. a) 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1X2CGX2'X1'(CG)p)z(서열번호 156)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x = 0-3, y = 1-4, w = -2, -1, 0, 1 또는 2, p=0 또는 1, q= 0, 1 또는 2, z= 1 내지 20, X1 및 X1'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, X2 및 X2'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이며, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치한다]; 및
    b) 상기 (X1X2CGX2'X1'(CG)p)z 서열의 처음 (X1X2CGX2'X1')를 포함하는, 염기 길이가 적어도 8개인 팔린드롬 서열
    을 포함하는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  8. 제7항에 있어서, 팔린드롬 서열이 A와 T가 1/3 보다 많은 염기 조성을 갖는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  9. 제7항에 있어서, IMP가 서열번호 27, 서열번호 39, 서열번호 53, 서열번호 55, 서열번호 113, 서열번호 175 및 서열번호 172로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 서열을 함유하는 것인 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  10. a) 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1X2CGX3X3'CGX2'X1'(CG)p)z(서열번호 159)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x=0-3, y=1-4, w= -2, -1, 0, 1 또는 2, p=0 또는 1, q=0, 1 또는 2, z= 1-20이며, X1 및 X1'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, X2 및 X2'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이며, X3 및 X3'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치한다]; 및
    b) 상기 (X1X2CGX3X3'CGX2'X1'(CG)p)z 서열의 처음 (X1X2CGX3X3'CGX2'X1')을 함유하는, 염기 길이가 적어도 10개인 팔린드롬 서열
    을 포함하는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  11. 제10항에 있어서, 팔린드롬 서열이 A와 T가 1/3 보다 많은 염기 조성을 갖는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  12. a) 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1X2X3X4X5CGX5'X4'X3'X2'X1'(CG)p)z(서열번호 160)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x=0-3, y=1-4, w= -3, -2, -1, 0, 1 또는 2, p=0 또는 1, q=0, 1 또는 2, z= 1-20이며, X1 및 X1'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, X2 및 X2'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이며, X3 및 X3'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, X4 및 X4'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이며, X5 및 X5'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치한다]; 및
    b) 상기 (X1X2X3X4X5CGX5'X4'X3'X2'X1'(CG)p)z 서열의 처음 (X1X2X3X4X5CGX5'X4'X3'X2'X1')을 함유하는, 염기 길이가 적어도 12개인 팔린드롬 서열
    을 포함하는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  13. 제12항에 있어서, 팔린드롬 서열이 A와 T가 1/3 보다 많은 염기 조성을 갖는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  14. a) 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(CGX1X1'CG(CG)p)z(서열번호 161)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x = 0-3, y = 1-4, w = -2, 0, 1 또는 2, p=0 또는 1, q= 0, 1 또는 2, z= 1 내지 20이며, X1 및 X1'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치한다]; 및
    b) 상기 (CGX1X1'CG(CG)p)z 서열의 처음 (CGX1X1'CG)를 포함하는, 염기 길이가 적어도 8개인 팔린드롬 서열
    을 포함하는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  15. 제14항에 있어서, 팔린드롬 서열이 A와 T가 1/3 보다 많은 염기 조성을 갖는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  16. a) 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1CGCGX1'(CG)p)z(서열번호 162)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x = 0-3, y = 1-4, w = -1, 0, 1 또는 2, p=0 또는 1, q= 0, 1 또는 2, z= 1 내지 20이며, X1 및 X1'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치한다]; 및
    b) 상기 (X1CGCGX1'(CG)p)z 서열의 처음 (X1CGCGX1')를 포함하는, 염기 길이가 적어도 8개인 팔린드롬 서열
    을 포함하는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  17. 제16항에 있어서, 팔린드롬 서열이 A와 T가 1/3 보다 많은 염기 조성을 갖는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  18. a) 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1X2CGCGX2'X1'(CG)p)z(서열번호 163)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x = 0-3, y = 1-4, w = -2, -1, 0, 1 또는 2, p=0 또는 1, q= 0, 1 또는 2, z= 1 내지 20, X1 및 X1'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, X2 및 X2'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이며, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치한다]; 및
    b) 상기 (X1X2CGCGX2'X1'(CG)p)z 서열의 처음 (X1X2CGCGX2'X1')를 포함하는, 염기 길이가 적어도 8개인 팔린드롬 서열
    을 포함하는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  19. 제18항에 있어서, 팔린드롬 서열이 A와 T가 1/3 보다 많은 염기 조성을 갖는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  20. a) 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(X1X2X3CGCGX3'X2'X1'(CG)p)z(서열번호 164)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x=0-3, y=1-4, w= -3, -2, -1, 0, 1 또는 2, p=0 또는 1, q=0, 1 또는 2, z= 1-20이며, X1 및 X1'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, X2 및 X2'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이며, X3 및 X3'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개째에 위치한다]; 및
    b) 상기 (X1X2X3CGCGX3'X2'X1'(CG)p)z 서열의 처음 (X1X2X3CGCGX3'X2'X1')을 함유하는, 염기 길이가 적어도 10개인 팔린드롬 서열
    을 포함하는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  21. 제20항에 있어서, 팔린드롬 서열이 A와 T가 1/3 보다 많은 염기 조성을 갖는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  22. a) 5'-Nx(TCG(Nq))yNw(CGX1X2X2'X1'CG(CG)p)z(서열번호 165)[여기서, N은 뉴클레오사이드이고, x = 0-3, y = 1-4, w = -2, 0, 1 또는 2, p=0 또는 1, q= 0, 1 또는 2, z= 1 내지 20이며, X1 및 X1'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이고, X2 및 X2'는 자기 상보성 뉴클레오사이드이며, (TCG(Nq))y 서열의 5' T는 폴리뉴클레오타이드의 5' 말단으로부터 0 내지 3개의 염기째에 위치한다]; 및
    b) 상기 (CGX1X2X2'X1'CG(CG)p)z 서열의 처음 (CGX1X2X2'X1'CG)를 포함하는, 염기 길이가 적어도 8개인 팔린드롬 서열
    을 포함하는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  23. 제22항에 있어서, 팔린드롬 서열이 A와 T가 1/3 보다 많은 염기 조성을 갖는 면역제어성 폴리뉴클레오타이드.
  24. 제1항에 기재된 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 면역제어성 조성물.
  25. 개체의 면역반응을 제어하기에 충분한 양으로 제1항에 기재된 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체의 면역반응 제어방법.
  26. 개체의 면역반응을 제어하기에 충분한 양으로 제4항에 기재된 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 개체에게 투여하는 것을 포함하는, 개체의 면역반응 제어방법.
  27. 개체 중의 인터페론-감마(IFN-γ)를 증가시키기에 충분한 양으로 제1항에 기재된 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 개체에게 투여하는 것을 포함하여, 개체 중의 IFN-γ를 증가시키는 방법.
  28. 개체 중의 인터페론-감마(IFN-γ)를 증가시키기에 충분한 양으로 제4항에 기재된 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 개체에게 투여하는 것을 포함하여, 개체 중의 IFN-γ를 증가시키는 방법.
  29. 개체 중의 인터페론-알파(IFN-α)를 증가시키기에 충분한 양으로 제1항에 기재된 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 개체에게 투여하는 것을 포함하여, 개체 중의 IFN-α를 증가시키는 방법.
  30. 개체 중의 인터페론-알파(IFN-α)를 증가시키기에 충분한 양으로 제4항에 기재된 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 개체에게 투여하는 것을 포함하여, 개체 중의 IFN-α를 증가시키는 방법.
  31. 개체 중의 인터페론-알파(IFN-α)를 증가시키기에 충분한 양으로 제7항에 기재된 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 개체에게 투여하는 것을 포함하여, 개체 중의 IFN-α를 증가시키는 방법.
  32. 감염성 질환의 증상을 경감시키기에 충분한 양인, 유효량의 제1항에 기재된 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 개체에게 투여하는 것을 포함하여, 개체 중의 감염성 질환의 증상을 경감시키는 방법.
  33. 감염성 질환의 증상을 경감시키기에 충분한 양인, 유효량의 제4항에 기재된 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 개체에게 투여하는 것을 포함하여, 개체 중의 감염성 질환의 증상을 경감시키는 방법.
  34. IgE 관련 장애가 있는 개체에게 이러한 IgE 관련 장애의 증상을 경감시키기에 충분한 양인, 유효량의 제1항에 기재된 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 것을 포함하여, 개체 중의 IgE 관련 장애의 증상을 경감시키는 방법.
  35. IgE 관련 장애가 있는 개체에게 이러한 IgE 관련 장애의 증상을 경감시키기에 충분한 양인, 유효량의 제4항에 기재된 면역제어성 폴리뉴클레오타이드를 투여하는 것을 포함하여, 개체 중의 IgE 관련 장애의 증상을 경감시키는 방법.
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