CN106256905B - 一种对草鱼有免疫增强活性的CpG ODN序列及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于水生动物基因工程领域，涉及一种对草鱼有免疫增强活性的CpG ODN序列及其应用。公开了一种对草鱼有免疫增强活性的CpG ODN序列，该序列是SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，它包含CpG基序的寡聚脱氧核苷酸序列，该序列中含有三个‘AACGTT’重复，以及一个‘TCGA’回文序列。通过草鱼头肾单个核细胞与草鱼肾细胞系的初步筛选，验证CpG对草鱼免疫活性的增强作用，通过其对信号通路相关基因的激活作用，筛选出对草鱼细胞具有免疫增强活性最强烈的CpG ODN序列。通过攻毒试验，再次验证了CpG ODN序列具有强烈的免疫增强作用。该序列可制备成草鱼免疫增强剂、免疫佐剂或疫苗，可在预防草鱼疾病中推广应用。

Description

一种对草鱼有免疫增强活性的CpG ODN序列及其应用

技术领域

本发明属于水生动物基因工程技术领域，具体涉及一种对草鱼有免疫增强活性的CpG ODN序列及其应用。本发明还与水生动物免疫学、分子生物学和细胞生物学领域相关。本发明还涉及以该CpG ODN序列制备免疫增强剂以及在相关鱼病防治中的应用。

背景技术

草鱼(Ctenopharyngodon idella，英文名grass carp)，属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属。草鱼是我国特有的鲤科大型经济鱼类，生长迅速，具有广泛的饲料来源，因此成为中国淡水养殖的四大家鱼之一，并且已经成功移殖到欧、亚、非、美各洲的许多国家。2013年，全球草鱼产量已达到522万吨，产值超过500亿元人民币，其中中国草鱼产量所占比例超过95％。在草鱼养殖过程中，易产生疾病，例如出血、肠炎、烂鳃、赤皮等，这四大传染性疾病的暴发大大降低鱼种的成活率，一般可至30％左右(苏建国,杨春荣.草鱼主要传染病的免疫学研究进展.动物医学进展，2000,21(4):183-185)，造成极大的经济损失。因此，草鱼疫苗的制备是极为重要的研究方向。

疫苗(vaccine)是用于预防传染病的抗原制剂，通常由钝化、弱化或无害的病原体或其产物制成，以其来刺激机体，可使机体产生保护性免疫力。传统疫苗中含有的一些灭活或者低活性的微生物会导致疫苗在使用过程中产生副作用，而通过现代生物技术获得的重组蛋白和人工合成的多肽虽然比灭活疫苗更为安全，但是其免疫效果比灭活疫苗差，需要利用其他手段刺激免疫应答以得到更好的免疫效果。1925年，Ramon首先在疫苗中加入某种其他物质，如琼脂、金属盐、卵磷脂和皂甙等，达到了提高抗原的特异性免疫应答的效果(Ramon G.Sur l’augmentation anormale de l’antitoxine chez les chevauxproducteurs de serum antidiphterique.Bull Soc Centr Med Vet,1925,101:227-234)，此后，免疫佐剂的种类逐渐多样化。免疫佐剂(immunoadjuvant)就是指先于抗原或与抗原同时应用，能非特异性地改变或增强机体对该抗原的特异性免疫应答，能增强相应抗原的免疫原性或改变免疫反应类型的物质，但其本身无抗原性。但是对于许多传染病疫苗，由于没有合适的免疫佐剂而影响了其应用。因此，疾病的防控除了研发出高效低毒的疫苗外，免疫佐剂的研发也起着至关重要的作用。

新型免疫佐剂近年来日益受到人们的重视。随着免疫学研究的不断深入和基因工程技术的迅速发展，已研制出多种DNA重组疫苗、合成肽疫苗等新型疫苗。这些新型疫苗纯度高、特异性强，但分子小、免疫原性弱，难以诱导机体产生有效的免疫应答，需用相应佐剂来增强其免疫原性或增强宿主对抗原的保护性应答(Donnelly J J.New developments inadjuvants.Mechanisms of ageing and development,1997,93(1):171-177)。而目前唯一通过FDA批准的能用于人的佐剂-铝胶佐剂只能激发体液免疫，不能诱导细胞介导的免疫反应，而后者对于机体细胞内寄生病原体(病毒、原生动物等)以及肿瘤产生免疫力尤为必要。由于铝胶佐剂免疫佐剂性效果有限，所以它已远远不能满足新型疫苗发展的要求。为此，近年来各国科研工作者为寻找新的免疫佐剂开展了广泛的研究，并取得了一定进展。

CpG是指由胞嘧啶(cytosine，C)、鸟嘌呤(guanine，G)及使两者相连的磷酸二酯键(phosphodiester bond，p)组成的二核苷酸，CpG二核苷酸及其5'端和3'端的各两个碱基构成CpG基序(CpG motifs)，CpG基序也被称为免疫刺激序列(immunostimulatorysequences，ISS)，而CpG ODN是指含有未甲基化的CpG基序的寡聚脱氧核苷酸。非甲基化的CpG在细菌DNA中更普遍，而在脊椎动物DNA中很少见，也更易引起脊椎动物的免疫反应。合成的CpG ODN具有和细菌DNA类似的免疫刺激作用，而全硫代修饰的CpG ODN相较于未修饰磷酸二酯骨架的CpG ODN更稳定。CpG ODN具有物种特异性，不仅不同物种除所需CpG基序不同，而且最适基序数目及排列也有差异(赵渝,赵冰,陆苹.DNA疫苗的分子佐剂应用研究进展.2002,(5):10-12；Tafalla C,Bogwald J,Dalmo RA.Adjuvants and immunostimulantsin fish vaccines:current knowledge and future perspectives.Fish&shellfishimmunology,2013,35(6):1740-1750)。CpG ODN在与淋巴细胞表面的DNA黏合蛋白结合后进入细胞内涵体，内涵体可以作为CpG的起始识别信号，TLR9(Toll-like receptor 9，Toll样受体9)特异识别CpG，引起先天性免疫应答，从而调控后续可能的获得性免疫应答。

研究显示，CpG作为佐剂，可明显促进Th1型免疫应答的产生。其与不完全弗氏佐剂联合应用时，其效应甚至强于完全弗氏佐剂。即使与Th2型佐剂如氢氧化铝合用亦可明显促进免疫应答的产生，且Th1型应答明显强于Th2型应答。CpG ODN能直接激活B细胞、树突状细胞、巨噬细胞、抗原提呈细胞等，间接激活T细胞、NK细胞，诱导以Th1型为主的免疫应答，是一种高效的免疫佐剂。CpG ODN在基因疫苗、免疫缺陷性疾病、肿瘤、感染性疾病及过敏性疾病的治疗中有着强大的潜在应用价值，并且近年来已被作为新型佐剂用于多种疫苗的研究(Angel J B,Cooper C L,Clinch J,et al.CpG increases vaccine antigen-specificcell-mediated immunity when administered with hepatitis B vaccine in HIVinfection.Journal of immune based therapies and vaccines.2008,6(1):4；MutwiriG,Benjamin P,Soita H,et al.Co-administration of polyphosphazenes with CpGoligodeoxynucleotides strongly enhances immune responses in mice immunizedwith Hepatitis B virus surface antigen.Vaccine,2008,26(22):2680-2688；Moura-Costa L F,Bahia R C,Carminati R,et al.Evaluation of the humoral and cellularimmune response to different antigens of Corynebacterium pseudotuberculosisin Canindégoats and their potential protection against caseouslymphadenitis.Veterinary immunology and immunopathology,2008,126(1):131-141)。

基于上述原因，申请人在若干已公布的序列基础中，改造筛选出一条针对草鱼有强烈免疫增强活性的CpG ODN序列，以此为基础，发掘其作为免疫增强剂的潜力，并在细胞模型上检测其对细胞增殖、抗病毒活性以及相应信号通路上基因的表达情况，进一步验证其免疫增强活性。

发明内容

本发明的第一个目的在于通过对若干CpG ODN序列的筛选验证，确定一条针对草鱼具有强烈免疫增强作用的特异的CpG ODN序列。

本发明的第二个目的是基于上述获得的CpG ODN序列，发掘其制备免疫增强剂的潜力，增强草鱼的免疫活性。

本发明的第三个目的还包括将上述CpG ODN序列制成的免疫佐剂，配合草鱼疫苗使用，应用于草鱼相关疾病的防治。

本发明通过以下技术方案实施：

以若干已经发表的和自行设计的CpG ODN序列为基础，人工合成CpG ODN，并进行全硫代修饰。通过草鱼头肾单个核细胞与草鱼肾细胞系的初步筛选，验证CpG对草鱼免疫活性的增强作用，并通过其对信号通路相关基因的激活作用，筛选出对草鱼细胞具有免疫增强活性最强烈的CpG ODN序列。最终进行攻毒实验，再一次验证了本发明中申请的CpG ODN序列具有的强烈的免疫增强作用。

本发明的技术方案如下所述：

人工合成了一种包含未甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸序列，并进行全硫代修饰，得到一种如序列表SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列，该序列中含有三个‘AACGTT’重复，以及一个‘TCGA’回文序列。

本发明的CpG ODN序列可用于制备免疫增强剂或免疫佐剂。

本发明的CpG ODN序列还可在制备草鱼疫苗中应用。

所述免疫增强剂、免疫佐剂或疫苗可在草鱼疾病预防中推广应用。

对本发明的人工合成的CpG ODN序列的生物功能验证参见《具体实施方式》。

本发明的优点在于：

1.本发明的第一个优点在于人工合成CpG ODN可以刺激机体对免疫原产生迅速、强烈的免疫应答，在免疫原性较弱和免疫原数量较少的时候更能发挥其重要性。CpG ODN作为高效免疫增强剂将会发挥重要的作用。

2.本发明的第二个优点是以CpG ODN为基础制备的免疫增强剂的优越性在于①制备方法简单，易于保存和运输；②质量易于控制，易规模化生产，成本低廉；③易于构建和改造，利用分子生物学技术在基因水平即可实现预期的免疫应答强度和类型。

3.本免疫增强剂的第三个优势在于其安全性高。对人体无毒副作用，同时也受机体免疫调控网络调节。

附图说明

序列表SEQ ID NO：1是本发明人工合成的对草鱼有免疫增强活性的CpG ODN序列，序列全长为25bp。

图1：是本发明的总体技术流程图。

图2：使用草鱼原代单个核细胞采用检测细胞增殖的方法筛选CpG ODN序列的其中一个结果图。

图3：使用草鱼肾细胞细胞系采用检测细胞增殖的方法筛选CpG ODN序列的另一个结果图。

图4：显示不同CpG ODN序列刺激CIK细胞后不同时期的草鱼TLR9基因表达量变化。

图5：显示不同CpG ODN序列刺激GCRV感染后的CIK细胞后不同时期草鱼TLR9基因表达量变化。

图6：显示不同CpG ODN序列刺激GCRV感染后的CIK细胞后不同时期草鱼呼肠孤病毒VP4基因表达量变化。

图7：显示特定CpG ODN序列分别刺激CIK细胞与GCRV感染后的CIK细胞后不同时期的草鱼RIG-I基因表达量变化。

图8：显示特定CpG ODN序列分别刺激CIK细胞与GCRV感染后的CIK细胞后不同时期的草鱼MDA5基因表达量变化。

具体实施方式

实施例

1.草鱼的养殖

本发明中所使用草鱼从湖北省武汉市团丰百容渔场购置，为常用鱼种。规格大小为50-100g左右，暂养于华中农业大学水产学院循环水养殖系统，每天投喂相当于鱼体重1.5％的人工配合饲料(武汉海大饲料有限公司生产的商业饲料)。暂养两周后，待草鱼适应环境，并确认无疾病症状后，开始进行实验。

2.草鱼头肾单个核细胞的分离

(1)在循环养殖系统中随机捞出三条实验草鱼，使用浓度为150mg/L的MS-222麻醉剂(常规试剂，按常规方法)深度麻醉，并称量体重、量取体长。

(2)待草鱼深度麻醉后，将其放入解剖盘内，在鱼体喷洒75％的酒精消毒，转入无菌操作台中进行下一步操作。

(3)采用尾椎静脉取血法，将实验用鱼取尽量多的血，将血液放入4℃冰箱中备用。

(4)解剖鱼体，将头肾无菌分离，放入培养皿中，用事先准备好的生理盐水或磷酸盐缓冲液(简称PBS，成分为：NaCl 8克，KCl 2克，Na₂HPO₄.7H₂O 1.15克，kH₂PO₄0.2克，加双蒸水定容至1升，在121℃高压蒸汽下灭菌30min)，将残留血液以及结缔组织等杂质冲洗掉。

(5)将头肾组织放在另一个干净的培养皿中的100目不锈钢网上，用弯头镊子小心研磨，将头肾打散成单细胞，一边研磨一边加入L-15meshing，制成草鱼头肾单个核细胞悬液。

(6)使用细胞计数板对细胞悬液进行单个核细胞计数，稀释到适当浓度备用。

(7)制作细胞滴片，瑞氏吉姆萨染色，镜检观察。

3.细胞培养

(1)冷冻细胞活化(解冻)

1)操作人员戴防护面罩及手套，防止细胞冻存管可能爆裂带来伤害。

2)自液氮罐中取出细胞冻存管，检查盖子是否旋紧。

3)将新鲜的完全培养基(培养基为DMEM，购自Gibco公司；10％胎牛血清即FBS，购自Biosource公司；100U/ml青霉素，购自Sigma公司；100U/ml链霉素，购自Sigma公司)置于37℃预温，预温后喷以70％酒精擦拭，转入无菌操作台内。

4)取出冻存管，立即放入37℃水槽中快速解冻，轻摇冻存管使其在1分钟内全部融化，以70％酒精擦拭冻存管外部，转入无菌操作台内。

5)取出细胞悬液，缓缓加入有培养基的细胞培养板(稀释比例为1：10-1：15(微升/微升))，混合均匀，放入CO₂培养箱培养。取0.1ml解冻细胞悬液进行存活测试。

(2)细胞传代培养

1)取出草鱼肾细胞系(Ctenopharyngodon idella kidney,CIK)细胞(CIK细胞由中国典型培养物保藏中心(CCTCC)提供，中国.武汉.武汉大学)，显微镜下观察细胞形态和密度，确定细胞生长状况，是否需要传代或换液。

2)将完全培养基、PBS、0.25％胰酶等预热及超净台消毒，将试剂及细胞板等喷酒精后移入超净台，将废液缸喷足酒精移入超净台，取酒精棉放入超净台。

3)点燃酒精灯，将瓶口拧松，过火消毒。

4)在确定细胞生长状况良好且没有污染的情况下，吸出完全培养基。

5)用适量PBS清洗细胞表面三次，并弃去PBS缓冲液。

6)加入适量胰酶消化细胞适当时间。

7)待消化完全后，用胰酶6倍体积的上述完全培养基中止消化，并吹打细胞培养板孔底部。

8)加适量上述完全培养基吹打混匀细胞，沿壁轻轻吹打，按合适比例进行细胞传代，标记好细胞名称、代数及传代日期并放入培养箱。

9)将所有试剂收至冰箱，将废液缸及废液取出，废液缸喷酒精清洗。

10)用酒精棉仔细擦拭操净台表面，检查显微镜、离心机是否关闭，孵箱是否正常。

11)做实验记录，打开超净台和细胞间紫外杀菌灯，15min后关闭。

(3)细胞冷冻保存(冻存)

1)冷冻前一日观察细胞生长情况，更换半量或全量培养基。

2)使用前配制细胞保存液，步骤如下：将二甲基亚砜(DMSO)加入新鲜培养基(DMEM，购自Gibco公司；20％胎牛血清，购自Biosource公司)中，终浓度为5～10％，混合均匀，置于室温下待用。

3)细胞传代后，收集细胞，取少量细胞悬液计数细胞浓度及冻前存活率。

4)离心，去除上清液，加入适量上述细胞保存液，使细胞浓度为1-5×10⁶个/ml，混合均匀，分装于已标示完全的细胞冻存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬液进行污染检测。

4.CpG ODN刺激与GCRV感染

(1)CpG刺激

1)试验前将正常CIK细胞扩大培养，并将扩大培养后的CIK细胞消化铺板，稳定24h后进行试验。

2)在超净工作台上，将人工合成的每种不同CpG ODN粉末分别稀释至浓度为100μM，加入到新鲜的去血清培养基(简称DMEM，购自Gibco公司；100U/ml青霉素，购自Sigma公司；100U/ml链霉素，购自Sigma公司)中，使CpG ODN终浓度为5μM。

3)将稳定后的CIK细胞中的细胞培养液吸出，重新加入带有CpG ODN溶液的培养基，放入CO₂培养箱培养，每隔一定时间后取样检测相关指标。

(2)GCRV感染

1)试验前将正常CIK细胞扩大培养，并将扩大培养后的CIK细胞消化铺板，稳定24h后进行实验。

2)在超净工作台上将正常CIK细胞和CpG刺激后的CIK细胞中的培养基吸出。

3)添加有5μl/ml活化后的草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV，病毒滴度为3.63×10⁷TCID₅₀/ml，制备草鱼呼肠孤病毒的方法参见肖克宇，陈昌福，水产微生物学，中国农业出版社，2004年)的无血清培养基，然后放入CO₂培养箱中培养(5％CO₂浓度，饱和湿度)，每隔12小时取样检测相关细胞增殖和基因表达指标。

5.实时荧光定量PCR检测基因表达

(1)总RNA提取和反转录

总RNA提取参照Trizol试剂说明书，使用Trizol试剂(购自宝生物工程大连有限公司)提取，并按说明使用M-Mlv反转录酶(购自Promega公司)将RNA反转录为cDNA。

(2)引物设计与合成

应用引物设计软件Primer Premier 5.0设计用于荧光定量RT-PCR实验的引物，该引物由武汉奥科鼎盛生物科技有限公司合成。引物序列如表1所示：

表1本发明中所使用的定量引物序列

注：扩增各对应的基因的引物中，第一行引物为上游引物，第二行引物为下游引物。

(3)实时荧光定量RT-PCR

实时荧光定量RT-PCR(qRT-PCR)检测CiTLR9基因(GenBank登录号FJ969850)、VP4基因(GenBank登录号GQ469997)、CiRIG-I基因(GenBank登录号GQ478334)和CiMDA5基因(GenBank登录号FJ542045)的表达情况。

定量仪器型号为罗氏荧光定量LightCycler 480。

qRT-PCR体系为4μl cDNA模板(浓度为50ng/μl)，0.2μl上游引物(扩增对应基因的上游引物见表1)，0.2μl下游引物(扩增对应基因的下游引物见表1)，3.1μl去离子水，7.5μlSYBR Green荧光染料混合体系(购自BioEasy公司)。

qRT-PCR程序为95℃预变性2min，然后进行以下循环：94℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，共进行45个循环，65-95℃制备熔解曲线，最后40℃冷却。

(4)统计分析

实验数据使用t检验处理，P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。实验结果如附图4-8所示。

试验结果显示，本发明合成的CpG ODN序列可极显著促进草鱼原代单个核细胞增殖(见图2)，并且在CIK细胞上也显示出细胞增殖增强活性(见图3)，可增强草鱼免疫活性，具有作为免疫增强剂或免疫佐剂的潜力。图4显示本发明所涉及CpG ODN序列1670A具有极显著的抗病毒活性，可以抑制GCRV病毒VP4基因的表达。通过检测CpG受体TLR9基因的表达(见图5，图6)，发现在GCRV感染后或无GCRV感染的CIK细胞中，本发明人工合成的序列都可极显著引起其受体基因的表达，通过TLR受体信号通路，发挥免疫增强作用。并且还有可能间接通过另一重要免疫信号通路RLR通路中的RIG-I成员，发挥抗病毒调控作用(图7，图8)。因此，本发明合成的CpG ODN序列对草鱼具有强烈的免疫增强活性，可以以该序列为基础制备草鱼相关的免疫增强剂或免疫佐剂，在草鱼免疫中推荐使用剂量为1-10μM。也可以采用人工合成或将该序列连接到合适的质粒中。应用于制备免疫增强剂或免疫佐剂，以增强草鱼的免疫应答，达到更好的疾病防控效果。

以本发明合成的序列为基础制备的免疫增强剂或免疫佐剂配合草鱼疫苗使用，添加到草鱼商品化灭活疫苗、弱毒疫苗(制备疫苗的方法为本领域常用方法)中，在草鱼疾病防控中发挥重要作用，将大大减少在草鱼养殖过程中因疾病造成的经济损失。

Claims (3)

1.一种包含未甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸序列，所述的寡聚脱氧核苷酸序列如序列表SEQ ID NO：1所示，其特征在于，在所述的SEQ ID NO：1所示的序列中含有三个‘AACGTT’重复，以及一个‘TCGA’回文序列；此包含未甲基化CpG基序的寡聚脱氧核苷酸序列采用人工合成方法获得，采用全硫代修饰。

2.包含权利要求1所述的寡聚脱氧核苷酸序列的草鱼免疫增强剂或草鱼疫苗免疫佐剂。

3.权利要求1所述的包含未甲基化的寡聚脱氧核苷酸序列在制备草鱼疫苗中的应用。