KR20050073609A - 마이크로입자－기반 방법 및 시스템, 및 이들의 응용 - Google Patents

Abstract

본 발명은 마이크로입자-기반 분석 방법, 시스템 및 응용에 관한 것이다. 구체적으로, 입자의 정체 및 존재 중 하나 또는 모두를 측정하고, 임의로 1종 이상의 특정 표적 분석물의 농도를 측정하기 위한 분석 방법으로서 공명광 산란을 이용하는 것이 기술된다. 생물학 및 화학 검정에 있어 이들 마이크로입자-기반 방법의 응용 역시 개시된다.

Description

마이크로입자－기반 방법 및 시스템, 및 이들의 응용{MICROPARTICLE－BASED METHODS AND SYSTEMS AND APPLICATIONS THEREOF}

본 발명은 일반적으로, 입자 식별, 분석물 결합의 정도 및 정체, 및 복합적인 생물학 및 화학 검정에서의 이들 방법의 응용 등의 요소들 중 하나 이상을 포함하는, 공명광 (resonant light) 산란을 이용하여 마이크로입자-기반 측정을 위한 방법, 시스템 및 응용에 관한 것이다.

생분석은 소형화 및 복합화, 즉, 많은 샘플을 동시에 측정하는 능력에 의해 점차 발전된다. 많은 경우에서 제한된 샘플 크기에 의한 더 작은 샘플 부피에서 더 많은 분석물을 측정하는 능력은 소형화된 마이크로 유체공학-기반 샘플 조작 시스템 및 마이크로-크기 시스템에서의 분석을 위한 새로운 방법이 발전하도록 하였다. 현존하는 광범위한 생물학 및 화학적 측정법, 예컨대 DNA 서열분석, 단백질 분석, 단일-뉴클레오티드 다형 (SNP) 분석, 고속 및 고분해능 분리 및 랩-온-칩 장치를 이용한 크로마토그래피 등이 예이다. 지난 십여년간 게노믹스 및 프로테오믹스의 대형 연구와 발견 조사에서 처리용량이 큰 스크리닝을 위한 고병렬적인, 소형화된 검정 시스템의 개발이 특별히 강조되어 왔다. 2-차원 고정 "바이오칩" 마이크로어레이 및, 더 최근에는 식별가능한 마이크로미터-크기 입자가 예이다. 양자의 접근 방식은 예컨대, 핵산간의 염기쌍 혼성화, 또는 수소 결합, 소수성 상호작용, 및 폴리펩티드간의 기타 결합 메카니즘 등의, 어레이 또는 입자 표면 상의 상보적 프로브와 분석물의 특이적 결합 또는 포획에 의존한다.

마이크로어레이 및 관련된 지지체 기술은 1990년대 나타나기 시작하여 이제는 확립된 산업을 포함한다. 예를 들어, 어피메트릭스 (Affymetrix)의 진칩 (GeneChip) (등록상표) 기술은 2 차원 어레이 상에 수백, 수천의 DNA 서열 프로브를 만들기 위한 포토리소그라피, 고체상 화학, 및 반도체 제조 기술을 이용하는 제조 방법이다. 이 방법은 예컨대 문헌 [Schena, M. et al., "Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray", Science 270, 467-470 (1995); Shalon,D. et al., "A DNA microarray systems for analyzing complex DNA samples using two-color fluorescent probe hydridization", Genome Res. 6, 639-645 (1996); Goldberg, M. J. and Rava, R. P. ,"Method of manufacturing biological chips, U.S. Patent No. 6,309,831 (2001) and Chee, M. et al.,"Arrays of nucleic acids on biological chips", U. S. Patent No. 5,837, 832 (1998)]에 기술되어 있다. 기타 DNA 마이크로어레이 기술이 예컨대, Hyseq,Inc., Molecular Dynamics,Inc., Nanogen, Incyte Pharmaceuticals, Inc., 및 기타 당업자에 의해 개발되어 왔다.

또한 생물계 내 단백질의 체계적인 연구로 본원에서 정의되는 프로테오믹스를 위해 고정된 어레이가 개발되고 있다. 예를 들어, 시퍼젠 바이오시스템스 (Ciphergen Biosystems)의 프로틴칩 (ProteinChip) (등록상표) 에레이 기술은 표면-증강 레이져 탈착/이온화 (SELDI)에 기초한 크로마토그래피 및 단백질 특징화를 포함하는 방법이다. 이들 기술은 레이져-기반 분자량 측정과 화학적으로 활성인 단백질 칩 에레이의 이용을 결합한다. 이 기술은 예컨대 문헌 [Hutchens, T. W. ,"Use of retentate chromatography to generate difference maps", U.S. Patent No. 6,225, 047 (2001); Hutchens, T.W. ,"Methods and apparatus for desorption and ionization of analytes", U.S. Patent No. 5,719,060 (1998); Weinberger, S.R., et al., "Current achievements using ProteinChip^(R) Array technology", Curr. Opin. Chem. Biol., 6 (1), 86-91 (2002)]에 기술되어 있다. 많은 다른 단백질 에레이 기술 역시 예컨대 Agilent Technologies, Inc., Zyomyx, Inc., Cambridge Antibody Technology 및 기타 당업자에 의해 개발되어 왔다.

측정되는 분석물의 유형과는 독립적으로, 마이크로어레이는 에레이 내에 각 프로브가 고정되는 위치에 의해 각 프로브의 정체를 결정하는 능력을 이룬다. 일반적으로, 각 프로브는 기재 또는 칩의 표면 상의 그리드 내에서 기지의 좌표에 합성되거나 배치된다. 이들 "바이오칩" 시스템은 다수의 분석을 동시에 수행할 수 있으나, 이들은 알려진 단점들을 갖는다. 예를 들어, 마이크로어레이는 고유의 불충분한 결합 동역학을 갖는다. 표면에서의 열악한 혼합 및 전형적인 바이오칩의 크기 때문에, 분석물이 그의 상보적인 프로브에 결합하기 위해 비교적 큰 확산 거리를 덮어야 한다. 이는 분석물이 표면으로, 그리고 표면상으로 서서히 확산되게 하고, 불완전한 결합 반응을 일으키고, 프로토콜이 실질적으로 연장되도록 한다. 추가로, 마이크로어레이 상의 샘플의 적용 및 측정은 본질적으로 배치 공정이고, 특히 자동화에 적합하지 않다. 일부 유형의 마이크로어레이는 고가이고 실험 또는 검정이 요구하는 필요에 따라 신속하게 주문제작되기 어렵다. 마이크로어레이의 가변성이 재생성 및 정확도를 감소시키고, 일부 경우에서는 상당한 측정상의 중복이 필요할 수 있다. 감도 및 동적 범위가 종종 마이크로어레이 데이터의 분석에서 문제점인 것으로 보고된다. 또한, 고정된 마이크로어레이에 있어서 재생하고 분류하고 후처리하고 분석물 상에 후속적인 측정을 수행하는 것은 일반적으로 불가능하다. 마지막으로, 대부분의 마이크로어레이 시스템에서, 형광단과 같은 리포터기 (reporter group)가 분석물의 결합을 검출하기 위해 필요하다. 일부 진전이 보고되기는 하였지만 (예컨대 문헌 [Kayyem, J.F., "Cycling probe technology using electron transfer detection", U.S. Patent No. 6,063,573 (2000); Nelson, B.P., et al., "Surface plasmon resonance imaging measurements of DNA and RNA hybridization adsorption onto DNA microarrays", Anal. Chem. 73,1-7 (2001)] 참조), 외부 리포터기의 이용은 비결합된 리포터로부터의 방해 신호를 제거하기 위해 샘플에 노출시킨 후 어레이를 세척하는 것이 필요하다. 대부분의 마이크로어레이 시스템에서 나타난 측정은 따라서 종말점 측정이다 (즉, 마이크로어레이는 분석물과 프로브간 결합의 실시간, 연속적 측정이 불가능하다).

마이크로입자의 이용은 2차원 마이크로어레이의 많은 단점들을 회피하는데, 이는 주로 결합 동력학이 더욱 양호한 소형의 잘 혼합된 부피에서 검정이 수행될 수 있기 때문이다. 샘플이 잘 혼합되는 경우, 고정된 검정에서와 같은 위치-의존성 변동이 없다. 더욱이, 작은 입자 크기 및 작은 샘플 부피는 프로브의 국소 농도를 증가시키고 분석물이 프로브와 결합하기 위해 이동해야 하는 확산 거리를 감소시켜, 결합 반응의 완결 속도 및 정도를 증가시킨다. 마이크로입자는 자동화된 샘플 조작 시스템에 의해 더욱 용이하게 조작될 수 있고, 따라서 주문 생산 및 자동화의 가능성이 2 차원 바이오칩 형태에 비해 우수하다.

입자-기반 검정에서는 유연성은 더욱 핵심적인 장점이다. 개별 입자들이 추적되고 조작될 수 있기 때문에, 분석물을 분리하거나 입자들의 부분집합 상에 추가적인 측정을 수행하는 것이 이론상 가능하다. 더 큰 마스터 라이브러리에서 특정 목적을 위해 입자들의 부분집합을 신속하게 선택하는 능력에 의해 맞춤 검정의 제작이 더욱 간단해진다.

그러나, 결합의 검출에 있어 혁신의 필요성이 남아있다. 앞서 언급하였듯이, 비표지화 결합 검출이 고정 어레이 시스템에 대해 보고되었지만, 입자 기반 검정에서의 외부 리포터기의 계속적인 사용은, 관련된 결점들이 고정 어레이에 있어 동일하였기 때문에 핵심적인 단점으로 남아있다. 아래 자세하게 개시하는 바와 같이, 본 발명의 주 목적은 입자 기반 검정에서 리포터기에 대한 필요성을 제거하여 프로토콜을 단순화하고, 시간 및 비용을 절감하고, 실시간으로 결합의 측정을 가능하게 하는 것이다.

전형적인 입자-기반 검정 시스템에서, 각 마이크로입자는 그 표면 상에 독특한 프로브의 다수의 카피를 지닌다. 일부 응용에서 마이크로입자는 유리 현탁액일 수 있기 때문에, 그러한 경우에는 고정 어레이에서 행해지는 것 처럼 프로브의 정체를 고정된 위치에 연결하는 것이 불가능하다. 오히려, 프로브의 정체가 입자의 정체와 독특하게 연결되어야 하므로, 각각의 입자가 독특한 식별 표지 또는 마커를 갖는 것이 요구된다. 문헌에서, 입자 식별은 착색 또는 형광 분자, 바코드, 또는 나노입자를 특유한 형광 시그너쳐와 결합시킴으로서 전형적으로 달성된다. 따라서, 병렬적으로 수행될 수 있는 입자-기반 검정의 수는 이용되는 특정 표지에 의해 제공되는 구분가능한 조합의 수, 예컨대 형광단의 수 및 아마도 그들의 상대적인 풍부함에 의해 제한된다.

형광-기반 입자 식별의 예는 루미넥스 코포레이션 (Luminex Corporation)의 플로메트릭스 (FlowMetrix)(등록상표) 시스템 및 래보러터리 멀티-어낼라이트 프로파일링 (LabMap (등록상표)) 기법이 있다. 이 시스템은 약 100 내지 1000 까지의 분석물이 유속 세포측정법에 의해 연속적으로 측정될 수 있게 한다. 이 기법은 두가지 이상의 독특한 형광 염료로 내부적으로 표지화된 마이크로구들을 포함한다. 마이크로구는 형광단 강도의 다양한 조합으로 더 코딩된다. 이 과정은 또한 코딩된 마이크로구의 표면 상에서의 반응 정량화를 위해 리포터 분자에 통합된 제3의 상이한 형광단을 포함한다. 코딩된 마이크로구 및 시스템의 제작은 예컨대 문헌 [Chandler, V. S., et al., "Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods, U. S. Patent No. 5,981, 180 (1999)]에 기술되어 있다. 많은 형광단의 비교적 넓은 방출 스펙트럼 덕분에, 적당한 수의 패턴이 이 부류의 표지와 독특하게 구분될 수 있다 (전형적으로 1000 미만).

비교적 좁은 형광 방출 스펙트럼을 갖는 나노입자의 이용이 예컨대 문헌들 [Chandler, M.B., et al., "Microparticles attached to nanoparticles labeled with fluorescence dye", U.S. Patent No. 6,268,222 (2001); Xu, H. et. al., "Multiplexed SNP genotyping using the Qbead^TM system; a quantum dot-encoded microsphere-based assay, Nucleic Acids Research 31(8), e43 (2003)]에 기술되어 있다. 기타 광학 마커, 예컨대 전기화학적으로 침착된 코드로 입자를 코딩하는 것 (예컨대 문헌들 [Nicewarner-Pena, S. R. et al., "Submicrometer metallic barcodes", Science 294, 137-141 (2001); Walton, I. D. et al., "Particles for multiplexed analysis in solution: detection and idetification of striped metallic particles using optical microscopy", Anal. Chem, 74, 2240-2247 (2002)]에 기술됨)은 입자-기반 검정의 작업적인 장점을 보유하면서도 검정의 다중성을 향상시킬 수 있다.

본 발명은 빛과 소정의 물리, 광학적 특성을 갖는 입자들 사이의 상호작용에 기반한다. 더 구체적으로는 구형 입자로부터 산란된 공명광 (본원에서 이용되는 빛과 입자들의 상호작용은 미 (Mie) 이론에 의해 기술되기 때문에 본원에서 공명 미 산란이라고 상호 바뀌어 언급됨)이 입자 정체 및 입자 표면에의 표적 종의 결합 정도 중 어느 것, 또는 모두를 측정하기 위해 이용된다. 빛과 입자들 사이의 상호작용의 이론은 많은 문헌, 예컨대 [Bohren, C. F., and Huffman, D.R., Absorption and Scattering of Light By Small Particles, John Wiley and Sons (1983); Kerker, M., The Scattering of Light and Other Electromagnetic Radiation, Academic Press (1969)] 등에서 제시된다. 더 구체적으로는 본 발명에 관련된 공명광 산란 스펙트럼에서 공명 구조의 처리에 관해서는 예컨대 문헌들 [Chylek, P. et al., "Narrow resonance structure in the Mie scattering characteristics", Appl. Optics 17, 3019-3021 (1978); Conwell, P.R. et al., "Resonant spectra of dielectric spheres", J. Opt. Soc. America A 1, 62-67 (1984); Probert-Jones, J. R., "Resonance component of backscattering by large dielectric spheres", J. Opt. Soc. America A 1, 822-830 (1984); Hill, S.C. and Benner, R.E., "Morphology-dependent resonances associated with stimulated processes in Microspheres", J. Opt. Soc. America B 3, 1509-1514; Lettieri, T. R., and Marx, E., "Resonance light scattering from a liquid suspension of Microspheres", Appl. Optics 25 (23), 4325-4331 (1986); Chylek, P. and Zhan, J., "Interference structure of the Mie extinction cross section",J. Opt. Soc. America A 6, 1846-1851 (1989); and Hill, S.C. et al., "Structural resonances observed in the fluoresece emission from small spheres on substrates", Appl. Optics 23, 1680 (1984)]을 참조하라. 산란광으로부터 구조 및 특성 정보를 이끌어 내는 계산 방법 및 컴퓨터 알고리즘의 개발이 예컨대 문헌들 [Conwell, P.R. et al., "Efficient automated algorithm for the sizing of dielectric Microparticles using the resonance spectrum", J. Opt. Soc. America A 1, 1181-1186 (1984); Lam, C.C. et al., "Explicit asymptotic formulas for the positions, widths, and strengths of resonances in Mie scattering", J. Opt. Soc. America B 9, 1585-1592 (1992); Chylek, P., "Resonance structure of Mie scattering: distance between resonances", J. Opt. Soc. America A 7, 1609-1613 (1990); Guimaraes, L. G., and Nussenzveig, H.M., "Uniform approximation to Mie resonances", J. Modern Optics 41,625-647 (1994)]에 기술되어 있다. 본 발명의 마이크로입자는 층상 구의 처리에 더욱 구체적으로 관련이 있고 문헌 [Kaiser, T. and Schweiger, G., "Stable algorithm for the computation of Mie coefficients for scattered and transmitted fields of a coated sphere", Computers in Physics 7, 682-686 (1993); and Hightower, R.L. and Richardson, C.B., "Resonant Mie scattering from a layered sphere", Appl. Optics 27, 4850-4855 (1988)] 등을 참조하라.

실제 응용에서, 공명광 산란이 입자 크기 및 굴절률 측정, 대기 에어로졸, 성간 입자 및 기타 측정의 연구에 이용되어 왔다. 예를 들어 상기 언급된 두 문헌 [Conwell (1984) 및 Lettieri (1986)]을 참조하라. 또한 문헌 [Ray, A. K. and Nandakumar, R., "Simultaneous determination of size and wavelength-dependent refractive indices of thin-layered droplets from optical resonances", Appl. Optics 34, 7759-7770 (1995); Huckaby, J. L., et al., "Determination of size, refractive index, and dispersion of single droplets from wavelength-dependent scattering spectra", Appl. Optics 33, 7112-7125 (1994); Hill, S. C., et al., "Sizing dielectric spheres and cylinders by aligning measured and computed resonance locations: algorithm for multiple orders", Appl. Optics 24, 2380-2390 (1985); Chylek, P. V. et al., "Simultaneous determination of refractive index and size of spherical dielectric partilces from light scattering data", Appl. Optics 22, 2303-2307 (1983)] 및 거기서 인용된 문헌을 참조하라. 이들 문헌에는 산란광 스펙트럼에서의 정교한 공명 특징의 정확한 검출은 높은 스펙트럼 분해능을 갖는 검출 방법을 필요로함을 나타내고 있다. 앞서 본 Chelek 등 (1983)에 의한 보고에서 피크의 파장 위치를 측정하는데 있어 전형적인 실험 상대 에러는 약 10⁵ 중 1 부분이다. 더욱 최근에는 예컨대 Huckaby (1994)에서 피크 측정의 상대 정확도는 약 2 x 10⁶ 중 1 부분 내지 2 x 10⁷ 중 1 부분이다.

Whitten 등에 의한 문헌 ["Morphological resonances for multicomponent immunoassays", Appl. Optics 34, 3203-3207 (1995)]은 항체-코팅된 마이크로구를 형광 스펙트럼의 공명 특징에 의해 측정한 그들의 크기에 기초하여 구별하는 기법을 기술한다. 그 논문에서 보고된 기법은 적은 수의 입자 소집단에서, 평균 직경 (6.5 및 10 마이크로미터)의 두 소집단 사이에서 비교적 큰 차이를 갖는, 명목 평균 직경을 갖는 각각의 소집단을 구분할 수 있었다. 본질적으로, 입자 직경은 식별 표지로 이용되었고, 직경은 관측된 공명 패턴을 이론적 계산치와 맞추어서 측정하였다. 상기 논문에 개시되었듯이, 직경 "표지"는 평균 직경이 실질적으로 다른 두개의 소집단 사이를 단지 구분할 수 있었다. 매우 유사한 마이크로입자의 크고 다양한 집단들을 식별하기 위한 이 접근 방식의 확장은 그 개시에서 교시되지 않았다. 더욱이, 본 발명의 방법 및 시스템은 또한 Whitten 등에 의한 개시에서 교시된 방법 및 시스템과는 실질적으로 다르다. 상기 개시는 입사광 파장이 고정되고 주사된 형광 스펙트럼에서 광학 공명이 발생하는 형광 검출 방법을 개시한다. 반대로, 본 발명의 바람직한 실시태양은 형광에 기반하지 않고, 주사된 입사 파장을 이용하며 Whitten 등에 의해 개시된 것과는 실질적으로 상이한 수단을 통해 산란된 광 스펙트럼을 검출한다.

Vollmer 등은 문헌 ["Protein detection by optical shift of a resonant microcavity", Appl. Phys. Lett. 80, 4057-4059 (2002)]에서 입자에서의 광학 공명의 이동에 기초한 유전체 마이크로입자에 결합한 단백질의 검출을 기술한다. 공명은 이로디드 (eroded) 광섬유에의 순간적인 결합에 의해 여기되었고 섬유를 통과하는 빛의 세기의 딥 (dip)으로서 검출하였다. 상기 개시에서 기술된 검출 방법은 광산란 측정에 기초하지 않는다. 더욱이, 입자 식별을 위한 광학 공명을 이용하는 가능성은 Vollmer 등에 의해 교시되지 않는다.

앞서 언급한 Hightower, R.L.과 Richardson, C.B는 입사하는 직선으로 편광된 평면파에 큰 층상 구가 공명 반응하는 것을 계산하기 위해 이론적인 모델링을 이용하였다. 이 계산 결과에 근거하여, 그들은 산란광 스펙트럼의 예리하고 독특한 특징이 혼합되지 않는 유체, 흡착된 층, 코팅, 및 소포의 연구에 이용될 수 있음을 제안하였다. 그러나 마이크로입자의 식별 또는 생물학 및 화학 검정에서의 검출을 위한 공명광 산란 스펙트럼의 이용은 그 개시에서 교시되어 있지 않다.

Serpenguzel 등은 문헌 ["Excitation of resonances of Microparticles on an optical fiber", Optics Lett 20, 654-656 (1995)]에서 광섬유에 대한 순간적인 결합을 이용하여 여기되는 고체 마이크로구의 공명광 산란의 측정을 기술한다. 상기 개시의 저자들은 이들 광산란 공명의 측정이 마이크로구 표면에 결합한 종들과 주위 용액의 시약간의 매우 민감한 흡수 및 반응 측정을 수행하는데 이용될 수 있음을 가정하였다. 그러나, 어떻게 그러한 측정이 수행될 수 있는지는 교시하지 않는다. 더욱이, 입자 식별을 위해 광학 공명을 이용하는 가능성이 Serpenguzel 등에 의해 교시되지 않는다.

Arnold 등은 미국 특허 출원 공개 제2003/0174923호에서 센서의 마이크로구 내에서 선회하는 광자의 공명 이동에 기초하여 물질을 검출하기 위한 방법 및 시스템을 기술한다. 마이크로구는 하나 이상의 광섬유와 결합하여 마이크로구는 상기 섬유와의 순간적인 결합에 의해 여기된다. 공명은 광섬유를 통과하는 빛의 세기에서의 딥으로서 검출된다. 상기 개시에서 기술된 검출 방법은 광산란 측정에 기초하지 않는다. 상기 개시는 또한 다수의 마이크로구가 다중 분석물의 검출에 이용될 수 있음을 개시한다. 그러나, 개시된 방법에서 마이크로구는 광섬유에 부착된 고정된 위치에 유지된다. 입자 추적에 이용하기 위해 입자 식별용 시그너쳐로서 광학 공명을 이용하는 가능성은 Arnold 등에 의해 교시되지도 암시되지도 않고, 따라서 부착된 프로브에 대해서도 마찬가지이다.

문헌에서의 보고와는 달리, 본 발명에서 마이크로입자의 식별을 위한 기초는 공명광 산란 패턴에 내재된 매우 풍부한 정보 내용을 효과적으로 이용하는 것이다. 본 출원에서 나중에 더욱 상세히 개시되는 바와 같이, 공명광 산란 패턴은 피크 위치, 피크 너비, 피크 순서, 다른 순서의 피크들 간의 주기 및 편극 의존성 스펙트럼 특성 등을 비롯한 (이에 한정되지는 않음) 다양한 변수들의 세트가 특징일 수 있다. 입자와 입자 사이에 산란 패턴에 영향을 주는 주요 변수들 (즉, 구조, 조성 및 입자의 크기) 중 하나 이상을 변화시킴으로써 구분가능한 공명광 산란 패턴이 유사한 마이크로입자들의 큰 세트의 구성원들 사이에서 실현될 수 있다. 따라서, 본 발명에 의하면 유사한 마이크로입자들의 큰 집단의 구성원 가운데 매우 풍부하고 다양한 산란 패턴의 세트가 만들어지고, 개별 마이크로입자들을 구분하고 식별하는 수단을 제공한다.

기존의 표지화 기법에 대한 주요 결점은 제한된 다중성, 즉 독특한 식별 특징들의 제한된 조합, 코팅된 입자의 제조상 어려움, 디코딩의 속도 및 정확도, 그리고 어떤 경우에는 비용을 포함한다. 그러므로, 다수의 분석물에 적당한 결합 동력학의, 병렬적이고 동시적이며 입자에 기반한 측정의 필요성이 있다. 구체적으로, 다음 하나 이상의 속성을 나타내는 방법이 필요하다: (1) 외부 리포터 잔기의 필요 없이 결합을 측정하는 능력, (2) 실시간으로 표적 분석물의 결합을 정량적으로 측정하는 능력, (3) 결합 신호를 임의로 증폭하는 능력, 및 (4) 개별 마이크로입자를 식별하고 임의로는 추적하는 능력. 이들 각각은 현행의 실시에 비해 확실한 개선을 나타내고, 결합하여 기존 검정법에 대해 속도, 정확도 및 비용 절감뿐 아니라 이전에는 불가능했던 새로운 응용을 가능하게 한다.

본 발명은 현행 실시보다 성능이 우수하고 높은 다중성이 가능한, 신뢰성 있고, 용이하게 제조가능하며, 비용면에서 효율적인 입자 식별 및 결합 검출 방법을 제공함으로써 상기 언급한 문제점들을 해결한다. 본 발명에서는, 독특한 식별 패턴 또는 광학 시그너쳐로서 산란 스펙트럼에서의 구체적 특징을 이용하는 고분해능 광산란의 신규한 적용에 의해 마이크로입자를 식별한다. 구체적으로, 입자의 정체를 결정하고 또한 입자 표면에 대한 결합의 존재 및 임의로는 정도를 측정하기 위한 분석 방법으로서, 본 발명은 공명 미 산란으로도 알려진 공명 광산란을 이용한다. 이들 방법은 함께 사용되거나 개별적으로 사용되어 당해 기술 분야보다 실질적으로 개선된 검정법을 재공한다.

발명의 요약

본 발명은 입자 및 결합 전후의 패턴간의 차이를 식별하는 독특한 광산란 공명 패턴에 기초하여 입자에 결합된 분석물을 식별하는 방법을 제공한다.

따라서 본 발명은

(a) 분석 파장 범위에 걸쳐 빛을 방출하는 광주사원을 제공하는 단계,

(b) 2종 이상의 실질적으로 구형인 식별가능 입자를 제공하는 단계,

(c) (b)의 입자에, 그 표면에 결합하고 1종 이상의 분석물에 대해 친화성을 갖는 1종 이상의 포획 프로브를 적용하는 단계,

(d) (c)의 각 입자를 제1 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 주사하여 (c)의 각 입자에 대해 각 입자를 독특하게 식별시키는 1 이상의 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키는 단계,

(e) 1종 이상의 포획 프로브를 각각의 식별된 (d)의 입자와 연관시키는 단계,

(f) 샘플 내에 분석물이 존재하면 1종 이상의 포획 프로브와 1종 이상의 분석물 사이에 결합이 일어나는, 1종 이상의 분석물을 함유하고 있는 것으로 추측되는 상기 샘플과 (e)의 입자를 접촉시키는 단계,

(g) (f)의 입자를 제2 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 주사하여 (f)의 각 입자에 대해 1 이상의 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키는 단계,

(h) 1 이상의 제1 대조 광산란 시그너쳐 중 임의의 것과 1 이상의 제2 광산란 시그너쳐 중 임의의 것으로 이루어진 군에서 선택된 공명광 산란 시그너쳐들 사이의 차이를 비교하여 1종 이상의 포획 프로브에 대한 1종 이상의 분석물의 결합을 검출하는 단계, 및

(i) 단계 (e)에서 얻어진 연관성 및 1 이상의 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐에 기초하여 1종 이상의 결합 분석물을 식별하는 단계

를 포함하고, 상기 단계 (g)에서

1) 1 이상의 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐 및 1 이상의 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐가 동일하거나 상이할 수 있고,

2) 적어도 제1 및 제2 분석 파장 범위가 동일하거나 상이할 수 있는,

분석물의 식별 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 실시태양에서 본 발명은

(a) 분석 파장 범위에 걸쳐 빛을 방출하는 광주사원을 제공하는 단계,

(b) 2종 이상의 실질적으로 구형인 식별가능 입자를 제공하는 단계,

(c) (b)의 입자에, 그 표면에 결합하고 1종 이상의 분석물에 대해 친화성을 갖는 1종 이상의 포획 프로브를 적용하는 단계,

(d) (c)의 입자들을 각 입자가 소정의 위치를 갖는 소정의 공간 어레이 내에 부착시키는 단계,

(e) (d)의 입자들을 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 임의로 주사하여 (d)의 각 입자에 대해 1 이상의 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키는 단계,

(f) 분석물이 존재하면 1종 이상의 포획 프로브와 1종 이상의 분석물 사이에 결합이 일어나는, 1종 이상의 분석물을 함유하고 있는 것으로 추측되는 샘플과 (e)의 입자를 접촉시키는 단계,

(g) (f)의 입자를 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 주사하여 (f)의 각 입자에 대해 1 이상의 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키는 단계,

(h) 1 이상의 제1 대조 광산란 시그너쳐 중 임의의 것과 1 이상의 제2 광산란 시그너쳐 중 임의의 것으로 이루어진 군에서 선택된 공명광 산란 시그너쳐들 사이의 차이를 비교하여 1종 이상의 포획 프로브에 대한 1종 이상의 분석물의 결합을 검출하는 단계, 및

(i) 부착된 입자 위치에 기초하여 1종 이상의 결합 분석물을 식별하는 단계

를 포함하는, 분석물의 식별 방법을 제공한다.

비슷한 방식으로 본 발명은

(a) 분석 파장 범위에 걸쳐 빛을 방출하는 광주사원을 제공하는 단계,

(b) 2종 이상의 실질적으로 구형인 식별가능 입자를 제공하는 단계,

(c) (b)의 입자에, 그 표면에 결합하고 1종 이상의 분석물에 대해 친화성을 갖는 1종 이상의 포획 프로브를 적용하는 단계,

(d) (c)의 각 입자를 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 주사하여 (c)의 각 입자에 대해 각 입자를 독특하게 식별시키는 1 이상의 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키는 단계,

(e) 1종 이상의 포획 프로브를 각각의 식별된 (d)의 입자와 연관시키는 단계,

(f) 분석물이 존재하면 1종 이상의 포획 프로브와 검출가능한 표지를 포함하는 1종 이상의 분석물 사이에 결합이 일어나는, 1종 이상의 분석물을 함유하고 있는 것으로 추측되는 샘플과 (e)의 입자를 접촉시키는 단계, 및

(g) 단계 (e)의 연관성 및 분석물의 검출가능한 표지에 기초하여 1종 이상의 분석물을 식별하는 단계

를 포함하는, 분석물의 식별 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서 본 발명은

(a) 분석 파장 범위에 걸쳐 빛을 방출하는 광주사원을 제공하는 단계,

(b) 1종 이상의 실질적으로 구형인 식별가능 입자를 제공하는 단계,

(c) (b)의 입자에, 그 표면에 결합하고 1종 이상의 분석물에 대해 친화성을 갖는 1종 이상의 포획 프로브를 적용하는 단계,

(d) (c)의 입자들을 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 임의로 주사하여 (c)의 각 입자에 대해 1 이상의 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키는 단계,

(e) 분석물이 존재하면 1종 이상의 포획 프로브와 1종 이상의 분석물 사이에 결합이 일어나는, 1종 이상의 분석물을 함유하고 있는 것으로 추측되는 샘플과 (d)의 입자를 접촉시키는 단계,

(f) (e)의 입자를 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 주사하여 (e)의 각 입자에 대해 1 이상의 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키는 단계, 및

(g) 1 이상의 제1 대조 광산란 시그너쳐 중 임의의 것과 1 이상의 제2 광산란 시그너쳐 중 임의의 것으로 이루어진 군에서 선택된 공명광 산란 시그너쳐들 사이의 차이를 비교하여 1종 이상의 포획 프로브에 대한 1종 이상의 분석물의 결합을 검출하는 단계

를 포함하는, 포획 프로브에 결합하는 분석물의 검출 방법을 제공한다.

또 다른 실시태양에서 본 발명은

(a) 분석 파장 범위에 걸쳐 빛을 방출하는 광주사원을 제공하는 단계,

(b) 1) 입자에 부착된 1종 이상의 포획 프로브 및 2) 1종 이상의 포획 프로브에 결합된 1종 이상의 분석물을 포함하는, 1종 이상의 실질적으로 구형인 식별가능 입자를 제공하는 단계,

(c) (b)의 입자를 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 주사하여 상기 입자에 대해 1 이상의 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키는 단계,

(d) 1종 이상의 분석물을 단계 (c)의 입자의 1종 이상의 포획 프로브에서 해리하는 단계,

(e) (d)의 입자를 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 주사하여 각 입자에 대한 1 이상의 제2 해리 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키는 단계, 및

(f) 1 이상의 제1 대조 광산란 시그너쳐 중 임의의 것과 1 이상의 제2 광산란 시그너쳐 중 임의의 것으로 이루어진 군에서 선택된 공명광 산란 시그너쳐들 사이의 차이를 비교하여 1종 이상의 포획 프로브로부터 1종 이상의 분석물이 해리하는 것을 검출하는 단계

를 포함하는, 포획 프로브로부터의 분석물 해리의 검출 방법을 제공한다.

본 발명은 추가적으로

(a) 실질적으로 구형인 코어,

(b) 입자의 외부 표면에 부착된 포획 프로브

를 포함하고, 이때,

1) 상기 입자는 약 275 나노미터 내지 약 1900 나노미터의 광파장 범위에 걸쳐 약 1 내지 약 20 나노미터의 분석 파장 범위에 걸쳐 주사되는 경우, 독특한 공명광 산란 시그너쳐를 특징으로 하고,

2) 상기 입자는 약 100 나노미터 이하의 직경이며,

3) 상기 입자는 분석 파장 범위에 걸쳐 약 1.6 내지 약 2.1 사이의 굴절률을 지니고,

4) 상기 입자는 분석 파장 범위에 걸쳐 실질적으로 비형광인 식별가능 입자를 제공한다.

본 발명의 구체적 실시태양에서

(a) 실질적으로 구형인 코어,

(b) 입자의 외부 표면에 부착된 포획 프로브

를 포함하고, 이때,

1) 상기 입자는 약 275 나노미터 내지 약 1900 나노미터의 광파장 범위에 걸쳐 약 1 내지 약 20 나노미터의 분석 파장 범위에 걸쳐 주사되는 경우, 독특한 공명광 산란 시그너쳐를 특징으로 하고,

2) 상기 입자는 약 100 나노미터 이하의 직경이며,

3) 상기 입자는 분석 파장 범위에 걸쳐 약 1.6 내지 약 2.1 사이의 굴절률을 지니고,

4) 상기 입자는 분석 파장 범위에 걸쳐 실질적으로 비형광이며,

이때, 상기 입자는

i) 약 50 나노미터 내지 약 20 마이크로미터 두께를 지닌 하나 이상의 광학 활성층, 및

ii) i)의 층을 둘러싸고, 약 1 나노미터 내지 10 마이크로미터이며 생물학적 활성 또는 화학적 활성인 실질적으로 투명한 외부층

을 포함하는, 식별가능 입자를 제공한다.

추가적으로 본 발명은

(a) 용액 내의 1종 이상의 실질적으로 구형인 식별가능한 입자 (각 입자는 입자의 외부 표면에 부착된 포획 프로브를 포함함),

(b) 분석 파장 범위에 걸쳐 입자를 주사하기 위한 광주사원,

(c) 산란광의 검출을 위해 적당한 위치 및 적당한 환경에서 입자를 제시하는 광학셀,

(d) 입자를 광학셀 내에 위치시키기 위한 입자 조작 수단, 및

(e) 주사된 입자에서 빛을 검출하고 상기 빛을 전기 신호로 전환하기 위한 검출 수단

을 포함하고, 상기 (a)에서,

1) 상기 입자는 약 275 내지 약 1900 나노미터의 광파장 범위에 걸쳐 약 1 내지 약 20 나노미터에 이르는 영역을 갖는 분석 파장 범위에 걸쳐 주사되는 경우, 독특한 공명광 산란 시그너쳐를 특징으로 하고,

2) 상기 입자는 약 75 마이크로미터 이하의 직경이며,

3) 상기 입자는 분석 파장 범위에 걸쳐 약 1.45 내지 약 2.1의 굴절률

을 갖는, 마이크로입자 기반 측정 시스템을 제공한다.

도면의 간단한 설명 및 서열

본 발명은 본 출원의 일부를 이루는 다음의 상세한 설명, 도면 및 서열 기재로부터 더욱 완전히 이해될 수 있다.

도 1은 본 발명에 의한 입자-기반 특이적 결합 검정의 개략적인 표현이며, 다중-분석물 샘플로부터 선택된 표적의 포획 및 프로브 중 하나에 상보적이지 않은 표적의 비-결합을 나타낸다.

도 2는 임의의 m개 층으로 코팅된 코어를 나타내는 층상 마이크로입자의 도면이다. 코어 및 각 층은 반경 R 및 굴절률 n이 특징이다. R 및 n의 입자 대 입자 편차는 본 발명에 의한 각 입자를 식별하는 데 이용될 수 있는 독특한 산란광 패턴을 일으킨다.

도 3은 마이크로입자 고정용 광학셀 및 마이크로입자를 조명하고 산란광의 세기를 측정하기 위한 광학 프로브의 개략도이다.

도 4는 마이크로입자로부터의 산란광을 측정하는 데 이용되는 광학 프로브 검출 시스템의 개략도이다. 구성 요소들은 일정한 비율로 그려지지 않았다.

도 5는 본 발명에 따라 독특한 입자 정체를 확인할 수 있는 상이한 마이크로입자들로부터의 산란광 스펙트럼의 세트이다.

도 6은 마이크로입자 고정용 광학셀 및 입자를 동시에 영상화하고 산란광의 세기를 측정하기 위한 현미경 렌즈의 개략도이다.

도 7은 본 발명에 따라 마이크로입자의 다중성으로부터 산란광을 측정하는데 이용되는 영상 검출 시스템의 개략도이다. 구성 요소들은 일정한 비율로 그려지지 않았다.

도 8은 도 7의 영상 검출 시스템에 의해 단일 파장이 입사광에서 얻어진 마이크로입자 군으로부터의 산란광의 디지털 영상이다. 입사광 및 산란광 모두가 편극되었고, 편극의 방향은 평행하였다. 숫자 12, 3, 6 및 9는 본문에 설명되었 듯이 각 입자에 대한 산란광 영상의 구역을 나타낸다.

도 9는 단일 입자로부터의 파장-연계 산란광 영상 및 관심대상인 두 구역 (편극 12 및 편극 3)으로부터 추출된 산란광 스펙트럼의 세트이다.

도 10a는 실시예 3에 의한 비오티닐화된 유리 마이크로입자로부터의 산란광의 디지털 영상이다.

도 10b는 실시예 3에 의한 비오티닐화된 마이크로입자의 산란광 스텍트럼이다.

도 10c는 실시예 3에 의한 비오티닐화된 마이크로입자 상에 아비딘이 결합하기 전과 결합한 후 산란광의 비교를 나타낸다.

도 11은 실시예 3에 기술된 바와 같이, 에탈론 데이터 및 도 10C에 나타난 산란 스펙트럼에 대한 자기상관 함수를 보여준다.

도 12는 실시예 3에서 기술된 바와 같이, 도10C에 나타난 동일한 마이크로입자 상에 DTT 처리 후에 얻어진 스펙트럼 이동을 나타낸다.

도 13은 실시예 3에 기술된 바와 같이, 에탈론 데이터와 도 12에 나타난 산란 스펙트럼에 대한 자기상관 함수를 나타낸다.

도 14a는 분석물의 결합 전 및 결합 후에 얻어진 두개의 산란광 스펙트럼의 예를 나타낸다. 파장의 눈금은 정확하게 정렬되지 않았다.

도 14b는 도 14A의 스펙트럼 주사 동안 얻어진 두개의 적층된 에탈론으로부터의 간섭 패턴을 나타낸다.

도 14c는 산란광 스펙트럼 (세기) 및 에탈론 패턴(ETALON) 분석의 상관성을 보여준다.

도 14d는 실시예 3에 기술된 바와 같이, 에탈론 정렬된 분석물의 결합 전 및 후의, 파장이 수정된 산란광 스펙트럼을 나타낸다.

도 15는 실시예 4에 기술된 바와 같이, 샌드위치 검정의 후속적인 결합 단계들 및 이후의 DTT로의 분열에 대한 단일 마이크로입자의 산란 스펙트럼을 나타낸다.

도 16은 실시예 6에 기술된 바와 같이, 단백질 G의 마이크로입자에 IgG가 결합한 경우 시간에 따른 공명 파장의 변화를 보여준다.

도 17은 실시예 8에 기술된 바와 같이, 형광 마이크로입자를 나타내기 위한 아르곤 이온 레이져 조명 하의 마이크로입자 군의 영상 (A) 및 동일 구역의 단순 화면을 나타내기 위한 다이오드 레이져 조명 하의 마이크로입자 군의 영상 (B)을 나타낸다.

도 18 및 도 19는 실시예 14에 기술된 마이크로입자의 예측된 공명광 산란 스펙트럼을 나타낸다.

도 20 및 도 21은 실시예 15에 기술된 마이크로입자의 예측된 공명광 산란 스펙트럼을 나타낸다.

도 22 및 도 23은 실시예 16에 기술된 마이크로입자의 예측된 공명광 산란 스펙트럼을 나타낸다.

도 24는 실시예 17에 기술된 마이크로입자의 예측된 공명광 산란 스펙트럼을 나타낸다.

도 25 내지 도 27은 실시예 18에 기술된 마이크로입자의 예측된 공명광 산란 스펙트르럼을 나타낸다.

도 28 및 도 29는 실시예 19에서 기술된 마이크로입자의 예측된 공명광 산란 스펙트럼을 나타낸다.

도 30 및 도31은 실시예 20에서 기술된 마이크로입자의 예측된 공명광 산란 스펙트럼을 나타낸다.

도 32 및 도 33은 실시예 21에서 기술된 마이크로입자의 예측된 공명광 산란 스펙트럼을 나타낸다.

도 34 내지 도 37은 실시예 22에서 기술된 마이크로입자의 예측된 공명광 산란 스펙트럼을 나타낸다.

다음의 서열들은 37 C.F.R. 1.821-1.825 ("뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열 개시를 포함하는 특허 출원을 위한 요구조건-서열 법칙")에 일치하고, 국제 지적 재산 기구 (WIPO) 기준 ST.25 (1998) 및 EPO 및 PCT의 서열 목록 요구조건 (5.2 및 49.5 (a-bis), 및 시행지침의 섹션 208 및 어넥스 C)에 부합한다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이터에 대해 이용한 부호 및 형식은 37 C.F.R. §1.822에 제시된 규칙에 맞는다.

서열 번호 1은 실시예 9에 기술된 합성 족구병 표적의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 2는 실시예 9에 기술된 JBP 올리고뉴클레오티드 프로브의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 3은 실시예 9에 기술된 변형된 JBP S2SP3B 올리고뉴클레오티드 프로브의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 4는 실시예 9에 기술된 N-JBC 올리고뉴클레오티드 프로브의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 5는 실시예 9에 기술된 형광-표지된 올리고뉴클레오티드 표적 JBC-F의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 6은 실시예 9에 기술된 형광-표지된 올리고뉴클레오티드 표적 대조군 Lac2-F의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 7는 실시예 9 및 11에서 기술된 형광-표지된 올리고뉴클레오티드 표적 JBP-F의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 8은 실시예 10에 기술된 족구병 PCR 단편 JB의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 9는 실시예 10에 기술된 Lac2-511 PCR 비특이적 표적 단편의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 10-13은 실시예 10에 기술된 PCR 표적 단편들을 증폭하기 위해 이용되는 올리고뉴클레오티드 프라이머들의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 14는 실시예 11에 기술된 펩티드 핵산 프로브 JBP2C의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 15은 실시예 11에 기술된 변형 펩티드 핵산 프로브 JBP2BC의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 16은 실시예 12에 기술된 JB PCR 산물의 보체의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호 17은 실시에 13에 기술된 형광-표지된 올리고뉴클레오티드 프로브 JBP-S2SP3F의 뉴클레오티드 서열이다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 높은 다중도로 병렬 분석이 가능하고 현행 방법에 비해 성능이 우수한, 신뢰성있고 제조가 용이하며 비용면에서 효율적인 특이적 분석물의 검출 및 입자 식별 방법을 제공한다. 본 발명에서는, 독특한 식별 패턴 또는 광학 시그너쳐로서 산란 스펙트럼에서 특별한 특징을 이용하는, 고-해상도 광산란의 신규한 적용에 의해 마이크로입자를 식별한다. 구체적으로, 본 발명은 입자의 정체를 결정하고, 또한 입자 표면에의 결합의 존재 및 임의로는 결합의 정도를 측정하기 위해 분석 방법으로서 공명광 산란을 이용한다. 본 발명에 의하면, 분석물이 특이적 마이크로입자에 결합하는 경우, 마이크로입자를 식별하기 위한 능력은 유지하면서, 결합 정도의 측정을 가능하게 하는 방식으로 마이크로입자 (따라서 관심대상 분석물)의 광학 특성이 변화한다.

본 발명은 (1) 입자의 구조, 물리적 특성 및 관능성, (2) 외부 리포터 잔기가 필요 없이 결합을 측정하는 능력, (3) 입자를 식별하는 수단, (4) 실시간으로 표적 분석물의 결합을 정량적으로 측정하는 능력, 및 (5) 임의로 신호를 증폭하는 능력에서 특징적인 시스템을 제공함으로써, 당해 기술을 향상시킨다.

하기 정의들이 본원에서 사용되고, 청구항 및 명세서의 해석을 위해 참조되어야 한다.

본 명세서에서, 단수 형태는 구체적으로 다른 언급이 없는 한 복수의 물건을 나타낼 수 있다. 따라서, 예컨대 "입자"를 제조, 유도, 또는 처리하는 방법에 대한 언급은 하나 이상의 입자들의 혼합물을 포함할 수 있다. 또한, "비드", "입자", "마이크로입자" 및 "마이크로구"와 같은 문법적 균등물은 문맥 내에서 구체적으로 지시하지 않는한 이들 용어가 상이하다는 것을 내포하지 않는다.

"입자", "마이크로입자", "비드", "마이크로구"라는 용어 및 문법적 균등물은 작은 별개의 입자들, 바람직하게는 실질적으로 구형인, 약 100 마이크로미터 미만, 바람직하게는 약 75 마이크로미터 미만, 더욱 바람직하게는 약 50 마이크로미터 미만의 직경을 갖는 것을 가리킨다.

"식별가능 마이크로입자"는 식별될수 있고 임의적로는 추적될 수 있는 마이크로입자를 말한다.

"스펙트럼 특징", "광학 공명 구조", "식별 특징", "산란 공명" 및 "공명광 산란 시그너쳐"라는 용어는 피크 위치, 피크 너비, 피크 순서, 상이한 순서의 피크 간의 주기 및 편극 의존성 스펙트럼 특성을 비롯한 (이에 한정되지는 않음) 입자 식별을 위해 사용될 수 있는 공명광 산란 스펙트럼에서의 특징들을 가리키기 위해 본원에서 상호 바뀌어 사용된다.

"단백질", "펩티드", "폴리펩티드" 및 "올리고펩티드"는 2 개 이상의 공유적으로 연결된 천연 또는 합성 아미노산을 나타내기 위해 상호 바뀌어 사용된다.

"분석물"이라는 용어는 본 발명의 방법으로 검출 또는 검정될 물질을 말한다. 전형적인 분석물은 단백질, 펩티드, 핵산, 펩티드 핵산, 항체, 수용체, 분자, 생체 세포, 미생물, 세포 소기관, 세포막 단편, 박테리오파지, 박테리오파지 단편, 바이러스 전체, 바이러스 단편 및 결합쌍의 한 구성원 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

"표적" 및 "표적 분석물"은 본 검정의 대상이 되는 분석물을 말한다. 표적의 공급원은 전형적으로 바이러스 및 박테리아와 같은 유기체 및 병원체에서 분리되거나, 또는 예컨대 피부, 혈장, 혈청, 척수액, 림프액, 윤활액, 소변, 눈물, 혈액 세포, 기관, 종양, 및 또한 시험관내 배양 구성성분 (세포 배양 배지, 재조합 세포 및 세포 성분에서 생장한 세포로 인한 조건 배지를 포함하나 이에 한정되지 않음)을 비롯한 (이에 한정되지는 않음) 개체 또는 개체들에서 분리될 것이다. 추가적으로, 표적은 합성 공급원에서 얻어질 수 있다.

"결합쌍"이라는 용어는 항원/항체, 항원/항체 단편, 또는 합텐/안티합텐 시스템과 같은 면역형 결합쌍들 중 임의의 부류를 포함할 수 있고, 비오틴/아비딘, 비오틴/스트렙타비딘, 엽산/엽산 결합 단백질, 호르몬/호르몬 수용체, 렉틴/특정 탄수화물, 효소/효소, 효소/기질, 효소/억제제, 또는 비타민 B12/내인성 인자 등과 같은 비면역형 결합쌍들 중 임의의 부류를 포함할 수도 있다. 이들은 또한 상보적 핵산 단편 (DNA 서열, RNA 서열 및 펩티드 핵산 서열을 포함) 뿐만 아니라 단백질 A/항체 또는 단백질 G/항체, 및 폴리뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드 결합 단백질을 포함한다. 결합쌍들은 또한 말레이미드 및 할로아세틸 유도체를 비롯한 술프히드릴 활성기, 및 이소티오시아네이트, 숙신이미딜 에스테르, 카르보디이미드, 및 술포닐 할라이드와 같은 아민 활성기와 같이 공유 결합을 형성하는 구성원들을 포함할 수도 있다.

"포획 프로브", "프로브", "결합제", "생활성제", "결합 리간드"라는 용어, 또는 문법적 균등물은 임의의 화학적 또는 생물학적 구조물 또는 잔기, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 항체 또는 항체 단편, 생체 세포, 미생물, 세포 소기관, 세포막 단편, 박테리오파지, 박테리오파지 단편, 바이러스 전체, 바이러스 단편, 유기 리간드, 유기금속 리간드 등으로서, 다수의 분석물에 비특이적으로, 또는 샘플 내의 특정 분석물 또는 분석물의 군에 선택적으로 결합하는 데 이용될 수 있는 것들이다.

"프로브-연결 마이크로입자"는 표면에 부착된 포획 프로브를 갖는 마이크로입자를 말한다.

"리간드" 또는 "활성 리간드"라는 용어는 항체, 렉틴, 수용체, 결합 단백질, 핵산 또는 화학 제제를 비롯한 (이에 한정되지는 않음) 결합쌍의 한 구성원으로서 작용할 수 있는 화학 잔기 또는 "표지"를 말한다.

"표지"라는 용어는 핵산, 단백질 또는 결합쌍의 구성원에 부착될 수 있는 임의의 원자 또는 분자를 말한다. 표지는 화학적으로 활성인 기를 통해 결합쌍 또는 핵산에 연결될 수 있다. 표지는 화학 합성 동안 올리고뉴클레오티드에 부착되거나 핵산 복제 동안 표지화된 뉴클레오티드 상에 결합된다. 표지는 형광 잔기, 화학발광 잔기, 입자, 효소, 방사성 태그, 양자 도트, 발광 잔기, 흡광 잔기와 요오드화 프로피디움 (PI) 및 브롬화 에티디움 (EB)과 시아나인 색소 (예컨대 미국 특허 제 5,563,037 참조)를 비롯한 삽입 색소를 포함하나 이에 한정되지는 않을 것이다.

"리포터"는 검출가능 (바람직하게는 정량적) 신호를 제공하는 "표지"로 사용되고 핵산, 단백질 또는 결합쌍의 구성원에 부착될 수 있는 임의의 원자 또는 분자를 가리킨다. 리포터는 형광, 화학발광, 방사능, 색측정, X-선 회절 또는 흡수, 자성, 효소 활성 등에 의해 검출할 수 있는 신호를 제공한다.

"리포터 컨쥬게이트"라는 용어는 항체, 렉틴, 수용체 또는 결합 단백질, 또는 분석물에 결합할 수 있는 기타 잔기와 같은 결합쌍의 구성원과 연결된 "리포터-표지"를 포함한 접합체를 말한다.

"올리고뉴클레오티드"는 폴리데옥시리보튜클레오티드 (2-데옥시-D-리보스 포함), 폴리리보뉴클레오티드 (D-리보스 포함), 및 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N-글리코시드 또는 변형된 퓨린 또는 피리미딘 염기로 이루어지는 리보 당-포스페이트 주쇄인 임의의 폴리뉴클레오티드을 말한다. "핵산", "폴리뉴클레오티드" 또는 "올리고뉴클레오티드"의 길이간에 의도되는 구분은 없다.

"펩티드 핵산" 또는 "PNA"이라는 용어는 핵산 (DNA 또는 RNA)의 당-포스페이트 주쇄가 아닌 가 (pseudo)-펩티드 주쇄를 갖는 DNA 유사체를 말한다. PNA는 DNA의 거동과 유사하여 상보적인 핵산 스트랜드에 결합한다.

용어 "올리고머"는 두개 이상의 단량체로 만들어지진 임의의 프로브 또는 표적을 말하고 본원에서 핵산, 펩티드, 펩티드 핵산 또는 본 발명의 문맥 내에서 사용되는 임의의 중합체의 구조를 기술하기 위해 사용된다. 바람직한 상기 용어의 사용은 핵산의 리보 당-포스페이트 주쇄를 흉내낸 가-폴리펩티드 주쇄 상에 "뉴클레오염기" 잔기의 서열을 함유한, "올리고뉴클레오티드"와 비슷한 펩티드 핵산 (PNA)의 구조와 관련 있다.

"뉴클레오염기"는 DNA, RNA 또는 PNA의 퓨린 또는 피리미딘 잔기를 말한다.

용어 "프라이머"는 일반적으로 핵산 "복제" 과정 또는 "증폭" 과정을 개시하는 기능을 하는 임의의 서열-결합 올리고 뉴클레오티드를 의미한다.

"복제"라는 용어는 핵산 분자의 핵산 스트랜드의 상보적 스트랜드가 폴리머라제 효소에 의해 합성되는 과정이다. "프라이머-유도" 복제에서, 이 과정은 복제를 개시하기 위해 이중의 "프라이머"의 말단 뉴클레오티드의 (데옥시)리보스 잔기의 3' 위치에 있는 히드록시기 (OH)를 필요로 한다.

용어 "증폭"은 핵산 서열의 카피 수가 선형적 또는 대수적 방식 중 하나로 증가하도록 "복제"가 순환 절차로 반복되는 과정이다. 그러한 복제 과정은 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 리가아제 연쇄 반응 (LCR), 스트랜드 치환 증폭 (SDA) 또는 기타 그러한 효소 반응을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.

"프라이머 유도 핵산 증폭" 또는 "프라이머-유도 증폭"은 프라이머가 핵산 서열의 복제를 보조하기 위해 핵산 분자의 선형적 또는 대수적 증폭에서 이용되는 당업계에 공지된 임의의 방법을 말한다. 출원인은 프라이머 유도 증폭을 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR), 리가아제 연쇄 반응 (LCR) 또는 스트랜드-치환 증폭 (SDA)을 비롯한 (이에 한정되지 않음) 당업계에 공지된 몇몇 반응에 의해 달성할 수 있음을 고려하였다.

"상보적 스트랜드"는, 서열의 5' 말단이 다른 서열의 3' 말단과 역평행하게 짝지어지도록 표적 핵산의 하나의 스트랜드의 핵산 서열과 배열되는 경우 안정한 이중가닥을 형성하는, 핵산 서열 스트랜드 또는 펩티드 핵산 서열 스트랜드를 말한다. 상보성은 완벽할 필요는 없다. 안정한 이중가닥은 불일치하는 뉴클레오티드들로도 형성될 수 있다.

"단편"은 특정 구역의 DNA 또는 RNA 서열의 부분으로 구성된다. "관심대상 핵산 단편"은 표적 핵산 서열의 일부이거나 그 내부에 혼입되고 분석 요소로서 유용한 단편을 말한다.

"특이적 결합" 또는 "특이적-분석물 결합"은 결합쌍의 구성원인 분석물에 대한 결합쌍 시약의 친화성을 의미한다.

용어 "비특이적 결합"은 샘플 매트릭스 성분에 대한 프로브-마이크로입자의 비특이적 친화성을 말한다. 본 발명의 문맥에서, "비특이적 결합"은 표적 분석물이 존재하지 않는 경우 샘플 매트릭스 성분에 대한 프로브-마이크로입자의 비특이적 친화성으로부터 기인하는 공명 이동으로서 측정될 수 있다.

용어 "샘플 매트릭스 성분"은 표적 분석물 이외의 샘플 매트릭스 내의 임의의 성분을 말한다. 샘플 매트릭스 성분은 단백질, 지질, 염, 핵산 및 탄수화물을 포함하지만 이에 한정되지는 않으며, 전형적으로는 분석물을 함유하는 생물학적 샘플의 천연 성분이다.

용어 "염격함"은 핵산 이중 가닥의 형성 또는 안정성에 영향을 미치는 변수들이 엄격한 제어를 것을 말한다. 이는 온도 (Tm), 양이온 농도 ([Na⁺], [K⁺], [Mg²⁺], [Mn²⁺]), 이중 가닥 내의 뉴클레오티드의 조성 및 수, 또는 이중 가닥 탈안정화제 (예컨대 포름아미드)의 농도일 수 있다.

"분석물의 식별"이라는 용어는 정체가 알려져있는 포획 프로브에 대한 결합에 기초하여 분석물의 정체를 결정하는 과정을 말한다.

용어 "분석 파장 범위"는 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키기 위해 본 발명의 마이크로입자가 주사되는 파장 구역을 말한다. 이 구역은 보통 약 275 내지 약 1900 나노미터, 바람직하게는 약 600 내지 약 1650 나노미터의 광파장에 걸쳐 약 1 내지 약 20 나노미터의 폭을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 분석 파장 범위는 약 770 내지 약 780 나노미터의 10 나노미터 구역이다. 본 발명의 입자의 주사의 수는 분석물 또는 분석물 결합을 식별하는 과정 동안 이루어지는 것으로 고려되지만, 구체적 분석 대상에 따라 주사하는 범위가 다르더라도 각각의 이들 주사가 "분석 파장 범위"에 걸칠 것이다.

"광주사원"이라는 용어는 분석 파장 범위에 걸쳐 파장이 변할 수 있는 빛의 공급원을 말한다. 광주사원은 주사 다이오드 레이져 및 동조가능 염료 레이져와 같이 분석 파장 범위에 걸쳐 변할 수 있는 빛을 발생하는 공급원, 및 파장-선별 수단과 함께 사용되는 발광 다이오드, 램프 등과 같은 파장 범위를 갖는 빛을 발생하는 다색성 공급원을 포함한다.

"대조 공명광 산란 시그너쳐"는 포획 프로브가 입자에 적용되고 난 후, 또는 포획 브로브에서의 분석물 해리를 검출하는 경우에는 분석물이 포획 프로브에 결합한 후, 분석 파장 범위에 걸쳐 본 발명의 입자들을 주사하여 얻어지는 공명광 산란 시그너쳐를 말한다. 대조 공명광 산란 시그너쳐는 입자 및 거기에 부착된 프로브를 식별하기 위해 이용될 수 있고, 분석물 결합의 검출을 위한 기준선의 역할을 할 수 있다. 다수의 대조 공명 시그너쳐는 상이한 시각에 입자를 주사함으로써 획득할 수 있다.

"결합 공명광 산란 시그너쳐"는 입자가 분석물과 접촉한 후에 분석 파장 범위에 걸쳐 본 발명의 입자를 주사함으로써 생성되는 공명광 산란 시그너쳐를 말한다. 일련의 결합 공명광 산란 시그너쳐의 시리즈는 실시간으로 결합 후에 얻어질 수 있다. 결합의 측정은 결합 공명광 산란 시그너쳐 중 임의의 하나와 대조 공명광 산란 시그너쳐 중 임의의 하나를 비교하거나, 또는 다수의 결합 공명과 산란 시그너쳐 중 어느 것과 그 시리즈에서 이전의 결합 공명광 산란 시그너쳐를 비교하여 수행된다.

"식별 공명광 산란 시그너쳐"는 포획 프로브를 입자에 적용하기 전에 본 발명의 입자를 분석 파장 범위에 걸쳐 주사함으로써 얻어지는 공명광 산란 시그너쳐를 말한다. 식별 공명광 산란 시그너쳐는 기지의 포획 프로브가 부착될 수 있도록 입자를 식별하고, 프로브의 정체를 식별된 입자와 연관시키는 역할을 한다.

"해리 공명광 산란 시그너쳐"라는 용어는 포획 프로브에서 분석물이 해리된 후 분석 파장 범위에 걸쳐 본 발명의 입자를 주사함으로써 얻어지는 공명광 산란 시그너쳐를 말한다. 해리 공명광 산란 시그너쳐의 시리즈는 실시간으로 해리 후에 획득될 수 있다. 해리의 측정은 해리 공명광 산란 시그너쳐 중 어느 하나와 대조 공명광 산란 시그너쳐 중 어느 하나를 비교하거나, 또는 해리 공명광 산란 시그너쳐 중 어느 것과 그 시리즈에서 이전의 제2 해리 공명광 산란 시그너쳐를 비교하여 수행할 수 있다.

입자 상의 층들에 적용되는 용어 "광학적으로 활성"은 상기 층들이 입자와 관련된 추가적 또는 변화된 광산란 공명을 제공하는 것을 의미한다.

입자 상의 층들에 적용되는 용어 "생물학적으로 활성"은 상기 층들이 생물학적 잔기들 사이의 상호작용에 참여하는 능력이 있음을 의미한다.

입자 상의 층들에 적용되는 "화학적으로 활성"이라는 용어는 화학 잔기들간의 결합 상호작용을 비롯하여 (이에 한정되지는 않음) 화학 잔기들 사이의 상호작용에 참여하는 능력이 있음을 의미한다. 그러한 층들은 부착하는 포획 프로브에 대해 특이적인 연결자 (linker) 화학을 갖고, 또는 입자들의 표면 상에 포획 프로브의 직접 합성을 위해 유도될 수 있는 것으로 고려된다.

본 발명은 마이크로입자-기반 분석법, 시스템, 및 응용을 제공한다. 본 발명의 우선 목적은 하나 이상의 특정 표적 분석물 (예컨대 특이적 뉴클레오티드 서열, 또는 항체 또는 항원과 같은 특정 단백질)의 존재, 임의로는 농도를 검출하는 향상된 방법, 및 외부 리포터기 또는 표지를 도입하지 않고 측정을 수행하는 향상된 방법을 제공하는 것이다. 구체적으로는 결합의 검출, 입자 식별, 검정 다중성, 입자 제조 및 본 발명의 최종 용도와 관련하여 당해 기술분야의 개선 사항을 기술한다.

본 발명의 기본적인 요소는 생물학적 또는 화학적 검정에서 요구되는 측정을 위해 최적화된 특정 물리적, 화학적 특성을 갖는 마이크로입자를 제조하고 이용하는 것이다. 예를 들어 관심대상 분석물에 대한 구체적인 포획 프로브로 작용하는 화학 관능기들이 마이크로입자 군의 구성원 외부 표면에 적용될 수 있다. "포획 프로브", "프로브", "결합제", "생활성제", "결합 리간드", 또는 문법적 균등물은 임의의 화학적 구조물 또는 잔기, 예컨대 단백질, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 항체 또는 항체 단편, 유기 리간드, 유기금속 리간드 등으로서, 다수의 분석물에 비특이적으로, 또는 샘플 내의 특정 분석물 또는 분석물의 군에 선택적으로 결합하는 데 이용될 수 있는 것들을 의미한다. 본 발명의 전형적인 이용에서, 노출된 상보적 포획 프로브를 표면에 갖는 하나 이상의 마이크로입자들의 적절하게 조직된 세트에 관심대상 분석물이 노출된다. 분석물의 결합이 발생하고 본 개시를 통해 나중에 더욱 더 기술되는 신규하고 민감한 기법으로 측정된다.

본 발명에 의해 제공되는 기술의 핵심적 향상은 공명광 산란의 신규한 적용에 의해 입자의 정체를 결정하고 표적 결합을 측정하는 방법이다. 공명광이 입자 정체 및 결합 측정 모두를 위해 이용되는 이러한 단일화된 측정 접근 방식은 본 발명에 있어 독특한 것이다. 그러나, 본 발명의 실질적인 응용이 공명광 산란에 의한 식별 및 결합의 측정의 조합에만 그치는 것은 아니다. 본 발명은 예컨대, 단지 공명광 산란만에 의한 입자 식별, 다른 수단에 의한 결합 검출을 포함한 공명광 산란에 의한 입자 식별, 및 공명광 산란에 의한 결합 검출을 포함한 다른 수단에 의한 입자 식별 등을 이용하여 다양한 응용이 가능하게 한다.

이러한 신규한 요소가 결합된 본 발명의 일 실시태양에서, 각 입자는 독특한 공명광 산란 스펙트럼에 기초하는 식별 코드 및 표지를 부여받는다. 마이크로입자의 제조 동안, 각각의 마이크로입자의 정체와 마이크로입자에 결합된 특정 포획 프로브 사이의 연관성이 만들어진다. 이 연관성은 혼합된 샘플 내의 1종 이상의 분석물의 존재를 식별하게 한다. 특정 표적 잔기가 그의 상보적인 프로브에 결합하는 것은 사전-식별된 입자 또는 표면에 상보적 프로브를 지닌 것으로 알려진 입자의 공명광 산란 스펙트럼의 변화에 의해 측정된다.

본 발명의 또 다른 실시태양으로, 결합의 검출 및 입자 정체의 결정은 독립적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 마이크로입자를 기지의 포획 프로브로 유도할 수 있고, 실험 동안 변화하지 않는 특정한 고정 위치에 위치시킬 수 있다. 따라서, 소정의 입자의 정체 (따라서 그 표면에 노출된 프로브)는 그 위치에 의해 측정된다. 결합 측정은 본 개시에서 이후에 더 충분히 기술되는 공명광 산란 기법에 의해 수행될 수 있다.

또 다른 실시태양으로, 마이크로입자를 입자 정체가 측정되지도 추적되지도 않는 복합적 방법에 의해 유도할 수 있다. 그러면 공명광 산란은 주사 방법에서 검정 "히트"를 찾기 위해 이용될 수 있고, 프로브의 정체는 예를 들어, 질량 분광법, 형광법, 광학 흡수법, 방사능법, 표면 플라스몬 공명법, 또는 검출가능한 표지 (형광 잔기, 화학발광 잔기, 입자, 효소, 방사성 태그, 양자 도트, 발광 잔기, 흡광 잔기, 삽입 색소, 및 결합쌍의 구성원 등)를 이용하는 당업계에 공지된 방법에 의해 독립적으로 결정될 수 있다. 이 방법의 변형은 아래 더욱 충분히 기술되는 공명광 산란 또는 기타 공지된 방법 중 어느 것에 의한, 조합 공정을 통해 입자의 정체를 추적하는 것을 포함할 것이다.

본 발명의 또 다른 실시태양에서, 공명광 산란 방법에 의해, 그리고 검출가능한 표지 (형광 잔기, 화학발광 잔기, 입자, 효소, 방사성 태그, 양자 도트, 발광 잔기, 흡광 잔기, 삽입 색소, 결합쌍의 구성원 등)를 이용하는 결합 측정에 의해 마이크로입자를 식별 및/또는 추적할 수 있다.

입자 구조, 특성 및 제조

본원에서 "입자", "마이크로입자", "비드", "마이크로구" 및 문법적 균등물은 작은 개개의 입자를 나타낸다. 바람직하게는 입자는 실질적으로 구형이다. "실질적으로 구형"이란 본원에서 입자의 형태가 약 10%를 초과하여 완전한 구형으로부터 벗어나지 않는다는 것을 의미한다. 일반적으로, 공명광 산란 패턴의 측정은 광파장 범위 이내에서 분석 파장 범위에 걸쳐 입자를 주사함으로써, 즉, 입자를 변하는 파장의 빛으로 조사함으로써 수행하여, 입자를 식별하는데 이용되는 식별 공명광 산란 시그너쳐를 생성한다. 하기하는 포획 프로브 및 입자 라이브러리 섹션에서 기술되는 바와 같이, 여러가지의 알려진 프로브가 이어서 입자에 적용될 수 있고, 프로브의 정체가 입자의 식별 공명광 산란 시그너쳐와 연관될 수 있다. 이론상, 임의의 광파장 범위가 본 발명의 측정을 위해 적용될 수 있다. 바람직하게는, 광파장 범위는 약 275 내지 약 1900 나노미터, 더욱 바람직하게는 약 600 내지 약 1650 나노미터이다. 바람직하게는, 분석 파장 범위는 약 1 나노미터 내지 약 20 나노미터, 더욱 바람직하게는 약 10 나노미터 너비에 이른다. 더욱 바람직하게는 분석 파장 범위는 약 770 내지 약 780 나노미터의 10 나노미터에 이른다.

바람직한 일 실시태양에서, 입자들은 분석 파장 범위에 걸쳐 실질적으로 비형광이다. 본원에서 사용되는 "실질적으로 비형광"이란 분석 파장 범위에 걸쳐 입자의 평균 형광 신호가 탄력적으로 산란되는 광신호 (즉, 입사광과 동일한 파장의 산란광) 평균의 약 10% 미만인 것을 의미한다.

입자는 전형적으로 실질적으로 구형인 코어 및 임의의 하나 이상의 층으로 구성된다. 아래에 더욱 상세히 기술되는 바와 같이, 코어는 응용에 따라 크기 및 조성이 다양할 수 있다. 코어에 더하여, 입자는 목적하는 응용에 적합한 관능성을 제공하는 하나 이상의 층을 포함할 수 있다. 층이 존재하는 경우 그 두께 및 굴절률은 구체적인 응용 및 필요한 측정을 위해 이용되는 빛의 파장에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, 층들은 추가적인 산란광 공명 특징을 일으키거나 특징들의 상대적인 파장 위치를 변화시키는 것과 같이, 유용한 광학 특성을 부여할 수 있다. 본원에서 "광학적으로 활성인" 층으로 언급되는 광학 특성을 위해 이용되는 이들 층은, 원하는 전체 입자 직경에 따라 전형적으로 약 0.05 마이크로미터 (50 나노미터) 내지 약 20 마이크로미터 이상의 두께를 갖는다.

층들은 또한 본원에서 화학적 활성층 또는 생물학적 활성층으로 언급되는 화학적 또는 생물학적 관능성을 부여할 수 있고, 이들 관능성을 위해 층 또는 층들은 전형적으로 약 0.001 마이크로미터 (1 나노미터) 내지 약 10 마이크로미터 이상 (원하는 입자 직경에 따라)의 두께 범위일 수 있으며, 이들 층들은 일반적으로 입자의 외부 표면상에 적용된다. 이들 층들은 또한 생물학적으로 활성인 다공성 구조를 포함할 수 있다. 본 개시의 실시예들에서, 입자 크기는 적외선 범위에 가까운 가시광의 파장을 이용하는 전형적인 생분석 검정에 적합하지만, 이들 실시예의 조건들이 본 발명을 제한하는 것은 아니다. 약 775 나노미터의 입사 파장을 이용하면, 입자의 직경은 바람직하게는 약 100 마이크로미터 이하이다.

코어 및 층들의 조성, 그에 따른 굴절률은 다양할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 조성은, 소위 "초곡면 (caustic surface)" (예컨대 문헌 [Roll, G. and Schweiger, G.,"Geometrical optics model of Mie resonances, J. Opt. Soc. Am. A 17,1301-1311 (2000)] 참조)의 외부 입자 영역이 관심 파장에서 빛에 실질적으로 투명한 정도이다. 본원에서 사용되는 "실질적으로 투명한"이란 구조적 공명이 생기는 입자의 영역 내의 흡광이 충분히 작아서 입자가 분석 파장 범위 내의 빛으로 조명되는 경우 공명이 관찰가능하게 남아있는 것을 의미한다. 이론적인 계산에 의한 예측 결과, 입자 내에서의 흡광이 충분히 작아서 "k"로 주어지는 입자 또는 광학적 활성층들의 굴절률의 허수 성분이 분석 파장 범위에 걸쳐 약 0.1 이하인 경우 공명 관찰이 가능하다. 770 내지 780 나노미터의 분석 파장 범위에 걸친 0.1 이하의 k 값은 약 1.6 ㎛^-1 이하의 흡수 계수에 해당한다.

더욱 바람직한 실시태양에서, 관심 파장에서의 투명도 이외에, 입자가 실질적으로 수성 매질에 있는 경우 입자의 굴절률은 공명광 산란 (아래서 더 충분히 논의됨)이 관심 파장에서 나타날 정도이다. 바람직하게는, 입자는, 결합 잔기를 부착하는 것과 같은 의도하는 적용에서 요구되거나 또는 심각한 화학적 또는 물리적 저하 없이 생검정 반응하는데 요구되는 조건들에 충분히 견딜만큼 튼튼하다. 광학적인 이유로, 코어가 실질적으로 경질이어서 입자 조작 및 검정 조건 동안 형태를 유지하는 것이 또한 바람직하다.

코어에 적당한 물질은 실질적으로 투명한 (관심 파장에서) 플라스틱 및 기타 중합체, 세라믹, 유리, 광물 등을 포함한다. 일반 및 특수 유리, 실리카, 폴리스티렌, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 아크릴 중합체, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드, 플루오로중합체, 실리콘, 셀룰로스, 실리콘과 같은 반도체 물질, 광학적 흡수 물질, 금 및 은 같은 금속, 루비 등의 광물, 금나노입자 및 양자 도트와 같은 나노입자, 콜로이드 입자, 금속 산화물, 금속 황화물, 금속 셀렌화물, 산화철과 같은 자성 물질, 및 이들의 복합체, 및 앞서 개시한 바람직한 물리적, 광학적 특성을 갖는 기타 물질 등을 포함한다. 코어는 균질한 조성물, 또는 원하는 물리적, 광학적 특성에 따라 2종 이상의 물질의 복합체일 수 있다.

코어는 본 발명에 유용성을 제공하는 많은 기능을 할 수 있다. 예를 들어, 코어는 공명광 산란에 기여하지 않는 특정 광선을 흡수하는 (그렇지 않으면 마이크로입자로부터 굴절되어 미광 및 바람직하지 않은 배경 신호의 원인이 되는) 역할을 하는 흡광 물질로 구성될 수 있다. 코어에 의해 제공되는 또 다른 유용성의 예는 자성 물질의 이용으로, 이는 입자에 자기 특성을 부여하여 외부 자력에 의해 집합, 스크리닝, 이동, 또는 아니면 조작되게 한다. 잠재적으로 유용한 실시태양은, 예를 들어 입자가 수성 매질중에 분산되거나 쉽게 이동하게 하는 것이 바람직하지만 층 물질이 실질적으로 물보다 밀도가 큰 경우, 속이 빈 코어를 갖는 입자를 사용하는 것일 수 있다. 이 예에서, 속이 빈 코어는 전체 입자에 밀도 감소를 부여할 것이다.

바람직한 실시태양에서, 마이크로입자는 균일한 유리 마이크로구를 포함하는 코어로 이루어진다. 더욱 바람직한 실시태양에서, 마이크로입자는 앞서 개시된 관심 파장에서 약 1.45 내지 2.1, 더욱 바람직하게는 약 1.6 내지 2.1의 굴절률을 갖는 광학성 유리 마이크로구로 구성된다. 적당한 입자는 예컨대 Mo-Sci Inc.(미조리주 롤라)에서 상업적으로 이용가능하다.

하기할 내용 및 실시예에서 더욱 상세히 논의되는 바와 같이, 코어의 굴절률 변동은 바람직한 광학적 또는 물리적 특성을 부여할 수 있다. 따라서, 또 다른 바람직한 실시태양에서, 코어는 예컨대 중심에서 반경 거리에 따른 위치에 있어 변화하는 굴절률 또는 기타 특성을 가질 수 있다.

본 개시에서 앞서 개시한 바와 같이, 마이크로입자는 코어에 더하여 하나 이상의 층을 포함할 수 있다. 마이크로입자 내에 층들을 포함하는 목적은 다양할 수 있다. 비특이적 결합을 감소시키고 코어의 물리적, 화학적 일체성을 보호하기 위해, 층은 생활성제 또는 화학 결합 부위를 비롯한 화학 관능기를 부착하기 위한 적절한 표면을 제공할 수 있다. 외부 생활성 또는 화학적 활성 층들의 제조에 관한 자세한 내용은 본 개시의 "포획 프로브 및 입자 라이브러리" 섹션에 제시된다. 아래 더욱 상세하게 개시되는 바와 같이, 입자 집단에 대한 식별 패턴의 다중성을 증가시키기 위해 층들이 추가적인 광학 간섭을 제공할 수도 있다.

층이 존재하는 경우 그의 치수, 조성 및 굴절률은 이전 단락에서 기술한 바와 같이 원하는 기능에 따라 변할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 층들의 조성 및 굴절률은 모든 층이 관심 파장에서 실질적으로 빛에 투명한 정도이다. 층이 존재하는 경우 그 두께는 바람직하게는 약 1 나노미터 내지 20 마이크로미터이다.

따라서, 또 다른 바람직한 실시태양에서, 마이크로입자는 코어에 더하여 하나 이상의 층으로 이루어지고, 층의 결합된 기능은 예컨대, 본 개시의 "포획 프로브 및 입자 라이브러리" 섹션에 기술된 바와 같이 생활성제를 비롯한 화학적 관능성의 부착에 대한 적당한 표면을 제공하는 것이다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 아래서 더욱 상세히 기술되는 바와 같이, 입자가 분석 파장 범위에 걸쳐 주사되는 경우 추가적인 광학 공명 구조가 나타나거나, 또는 광학 공명 구조의 상대 위치가 변하도록 하나 이상의 층이 구성된다.

또 다른 실시태양에서, 마이크로입자는 코어에 더하여 추가적이거나 변화된 식별 특징을 제공하는 기능을 하는 하나의 층, 이에 더하여 예컨대, 본 개시의 "포획 프로브 및 입자 라이브러리" 섹션에 기술되는 바와 같이 생활성제를 비롯한 화학 관능성의 부착을 위한 적당한 표면을 제공하는 결합기능을 하는 하나 이상의 추가적인 층으로 이루어진다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 마이크로입자는 코어에 더하여 코어의 표면에서 또는 근처에서 변하는 굴절률의 구역을 포함하는 층 (추가적인 식별 또는 변화된 특징을 제공함), 이에 더하여 하나 이상의 추가적인 외부 층들로 이루어지고, 추가적인 층들의 결합된 기능은 예컨대 본 개시의 "포획 프로브 및 입자 라이브러리" 섹션에 기술된 바와 같이 생활성제를 비롯한 화학적 관능성의 부착을 위핸 적당한 표면을 제공하는 것이다.

상기 층들이 존재하는 경우 그를 위한 바람직한 물질은, 층들의 바람직한 기능 또는 기능들 (예컨대, 관심 파장에서 투명성)에 의해 부여되는 제약 하에서, 코어용으로 열거된 모든 부류, 및 소듐 폴리(스티렌 술포네이트) 및 폴리(디알릴디메틸암모늄 클로라이드)와 같은 고분자 전해질들을 포함한다.

층들은 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 마이크로입자 상에 생성될 수 있다. 문헌 [ller, R.K., "Chemistry of Silica", John Wiley & Sons (1979); Brinker, C.J., and Scherer, G. W., "Sol-gel Science", Academic Press (1990)]에 기술된 것과 같은 졸-겔 화학 기법이 예이다. 입자 상에 층들을 생성하는 다른 접근법은 문헌들 [Partch, R. and Brown,S., "Aerosol and solution modification of particle-polymer interfaces", J. Adhesion 67, 259-276 (1998); Pekarek, K. et al., "Double-walled polymer microspheres for controlled drug release", Nature 367,258 (1994); Hanprasopwattana, A., "Titania coatings on monodisperse silica spheres", Langmuir 12, 3173-3179 (1996); Davies, R., "Engineered particle surfaces", Advanced Materials 10,1264-1270 (1998)] 및 거기에 포함된 참고문헌들에 기술된 것과 같은 표면 화학 및 캡슐화 기법을 포함한다. 증기 증착 기법이 또한 이용될 수도 있다. 예컨대 문헌들 [Golman, B. and Shinohara, K., "Fine praticle coating by chemical vapor deposition for functional materials", Trends in Chem. Engineering 6,1-6 (2000); Coulter, K. E. et al., "Bright metal flake based pigments", U.S. Patent No. 6,387,498 (2002)]을 참조하라. 또 다른 접근법은 문헌들 [Sukhorukov, G.B. et al., "Stepwise polyelectrolyte assembly on particle surfaces: a novel approach to colloid design", Polymers for Advanced Technologies 9 (10-11), 759-767 (1998); Caruso, F. et al., "Electrostatic self-assembly of silica nanopartilce-polyelectrolyte multilayers on polystyrene latex particles, Journal of the American Chemical Society 120 (33), 8523-8524 (1998); Caruso, F. et al., "Investigation of electrostatic interactions in polyelectrolyte multilayer films: binding of anionic fluorescent probes to layers assembled onto colloids, Macromolecules 32 (7), 2317-2328 (1999); Caruso, F.,"Protein multilayer formation on colloids through a stepwise self-assembly technique, Journal of the American Chemical Society 121 (25), 6039-6046 (1999); Margel, S., and Bamnolker, H., U.S. Patent No. 6,103,379] 및 거기에 언급된 참고문헌들에 기술된 것과 같은 층간 (layer-by-layer) 자가-조립 기법을 포함한다.

본 발명의 유용성은 마이크로입자의 다중성을 이용하여 향상된다. 일 실시태양에서, 마이크로입자는 2차원 형식으로 분포될수 있는데, 예컨대 일련의 튜브, 홈, 채널 또는 기질 내의 기타 구조물로 조직될 수 있고, 또는 그들은 특이적 구조가 없는 표면상에 자가 조립될 수 있다. 그러한 형식에서, 입자들이 검정 내내 그들의 상대적인 위치를 유지한다면, 정체는 위치에 의해 정해지기 때문에 패턴 또는 표지에 의해 개별 입자를 식별하는 것은 선택적일 것이다. 그러나 더 일반적으로, 입자들은 그들의 상대적 위치가 변하는 응용에서 이용될 수 있다. 이런 경우에, 입자 정체는 아래 더욱 상세히 설명되는 공명광 산란 방법, 또는 형광법, 광학 흡수법, 방사능법 및 표면 플라스몬 분광법과 같은 당업계에 공지된 방법으로 정해진다.

본 발명의 목적은 생물학적 검정 및 화학적 검정에서 이용하기 적합한 식별가능 마이크로입자의 집단을 용이하고 비용 효과적으로 생산하는 수단을 제공하는 것이다. 입자들에 대한 임의의 생산 방법에서, 입자들 간에 치수, 및 코어와 층들의 광학 특성들에 있어 자연적인 편차가 있게 될 것이다. 따라서, 본 발명의 목적은 이들 자연적인 편차를 이용하고, 임으로는 편차를 유도하여 입자 식별을 위한 새로운 기초를 제공하는 것이다. 마이크로입자가 유용성을 지니기 위해, 상기 편차는 제어되어야 하거나, 또는 입자들은 그들의 물리적, 광학적 특성에 따라 적절하게 스크리닝되어야 한다. 따라서, 바람직한 실시태양에서, 코어 및/또는 층들 (존재하는 경우)의 치수 및 광학 특성의 편차는 단일 입자에 대해 상기 개시된 바람직한 범위 이내이다. 이것은 몇가지 방법, 예컨대 입자 생산 공정을 적절하게 제어하거나, 또는 본 발명에서 개시되는 이용에 적합한 입자들만 선별하는 품질 제어 스크린을 포함함으로써 달성될 수 있다.

포획 프로브 및 입자 라이브러리

포획 프로브는 관심있는 특정 측정법에 따라 다양한 화학적 부류들을 포함할 수 있다. 일반적으로, 그들은 샘플 내의 표적 분자와 상호작용에 필요한 관능기를 제공하는, 유기적 또는 생물학적 분자이거나 또는 그들의 분자 단편이다. 당해 분야에서 알려진 바와 같이, 프로브는 예컨대 DNA 프로브와 그 표적 간에 상보적인 완전한 염기쌍에서부터 염기쌍들의 덜 엄격한 매칭에 이르기 까지, 다양한 정도의 특이성을 지닐 수 있다. 유사하게, 단백질 또는 펩티드 표적에 대한 프로브들, 예컨대 항체 또는 합성 펩티드는 프로브 및 검정 조건에 따라 매우 특이적이거나 덜 특이적일 수 있다. 하기의 논의에서, "프로브" 또는 "포획 프로브"가 사용되는 경우, 이것은 고도의 특이성을 갖는 화학적 또는 물리적 실체, 또는 다양한 정도의 특이성을 지닌 하나 이상의 실체일 수 있다. 본 발명의 프로브 연결 마이크로입자는 관심대상인 포획 프로브를 마이크로입자의 표면에 적용함으로써 준비될 수 있다. 아래에서 더욱 상세히 기술하는 바와 같이, 상기 프로브는 표면상에 프로브를 직접 합성하거나, 또는 당해 기술분야에서 공지된 방법을 이용하여 천연적으로 생성되거나 개별적으로 합성, 생산 또는 단리된 프로브를 표면에 부착함으로써 적용될 수 있다.

상기 논의한 바와 같이, 본 발명의 유용성은 표면에 노출된 하나 이상의 독특한 포획 프로브를 지닌 마이크로입자들의 세트를 이용함으로써 향상될 수 있다. 그러한 세트를 일반적으로 마이크로입자 또는 프로브의 "라이브러리"라고 부른다. 당해 기술분야에 공지되었 듯이, 입자-기반 생물 검정에서 특이적 포획 프로브를 특이적 입자와 결합시키는 것이 일반적으로 필요하다. 이것은 현행 실시에서 전형적으로 표지 (형광단, 발색단, 나노입자, 에칭된 "바 코드" 등)를 각 입자에 부착하거나 결합시킴으로써 이루어진다. 이들 전형적인 접근법은 본 발명에 의한 공명광 산란에 의한 결합 검출과 결합될 수 있다. 그러나, 본 발명은 또한 각 입자를 식별하기 위해 공명광 산란을 이용함으로써, 문헌에 기술된 방법들과는 실질적으로 동떨어진 신규하고 효과적인 별도의 입자 식별 접근법을 제공한다.

포획 프로브들의 한 부류는 단백질을 포함한다. "단백질"은 두개 이상의 공유적으로 연결된 아미노산을 의미하고, 따라서 "펩티드", "폴리펩티드", "올리고펩티드" 및 당해 분야에서 유사한 용법의 용어들은 모두 본 개시에서 동의어로 해석될 수 있다. 아미노산은 천연적으로 생산되고/되거나 임의의 상대적 순서 및 양으로 합성적으로 제조할 수 있다. 이 실시태양에서, 수소결합, 정전기적 결합, 친수성 상호작용 및 유사한 비공유 결합 메커니즘이 선택된 표적에 대해 증가된 결합 친화성을 제공하기 위해 이용될 수 있다. 결합의 특이성을 증가시키기 위해, 당해 기술분야에 잘 알려진 바와 같이 특정 3-차원 구조가 바람직할 것이다.

바람직한 실시태양에서, 포획프로브들은 단백질 또는 그들의 단편이다. 본 발명에서 사용하기 위한 마이크로입자의 외부 생활성층의 제조는 적정한 프로브가 표면에 부착될 수 있도록 (예컨대 연결자 화학을 이용) 마이크로입자를 유도하는 것을 포함할 수 있다. 단백질 포획 프로브 라이브러리의 준비 및 표면에 프로브를 부착하는 방법이 당해 분야에 잘 알려져 있는데, 예컨대 문헌들 [Johnsson, K. and Ge, L., "Phage display of combinatorial peptide and protein libraries and their applications in biology and chemistry", Current Topics in Microbiology and Immunology 243,87-105 (1999); Ruvo, M. and Fassina, G., "Synthesis and characterization of peptide libraries", in Combinatorial Chemistry Technology, Dekker, New York, pp. 7-21 (1999); Wagner, P. et al., "Arrays of protein-capture agents and methods of use thereof, U. S. Patent No. 6,365, 418 (2002); Wagner, P. et al., "Protein arrays for high-throughput screening", U.S. Patent No. 6,406,921 (2002); McHugh, T. M.,"Flow Microsphere Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes", Methods in Cell Biology 42, Academic Press, 1994; Colvin, et al., in Microspheres: Medical and Biological Applications, 1-13, CRC Press; Illum, L. et al., "Attachment of Monoclonal Antibodies to Microspheres", Methods in Enzymology 112, Academic Press, 1985] 및 거기에 언급된 참조문헌들을 참조하라. 단백질 포획 프로브의 라이브러리는 예컨대 식물 또는 동물 세포 추출물로부터 제조될 수 있다. 특히 유용해서 선호되는 것은 예컨대 인간 항체 등의 인간 단백질의 라이브러리이다.

단백질 포획 프로브는 천연 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 또는 이들 두 유형의 혼합물을 포함할 수 있다. 바람직한 일 실시태양에서, 예컨대 조합 생물학 (combinatorial biology) 및 방향적 진화 (directed evolution) 방법과 같은 당업계에 공지된 기법을 이용하여, 아미노산 서열이 부분적으로 또는 완전히 무작위화되도록 포획 프로브를 합성한다. 예컨대 문헌들 [Brackmannn, S. and Johnsson, K., eds., Directed Molecular Evolution of Proteins, John Wiley & Sons (2002); Short, J. M. and Frey, J. F. "End selection in directed evolution", U.S. Patent No. 6,358,709 (2002); Stuart, W. D., "Methods and compositions for combinatorial-based discovery of new multimeric molecules", U.S. Patent No. 5,683,899 (1997)] 및 거기에 언급된 참고문헌들을 참조하라.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 포획 프로브들은 부분적으로 천연 아미노산 서열을 포함하고 부분적으로 무작위화된 아미노산 서열을 포함하는 단백질들이다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 임의의 무작위화를 포함한 단백질 포획 프로브의 준비는 본 발명의 마이크로입자 상에서 수행된다. 이것은 특히 프로브들의 표시된 라이브러리를 만드는데 효과적인 접근법이다.

단백질에 대한 결합 라이브러리의 최적 크기 또는 다양성은 구체적인 적용에 따라 다를 수 있다. 소정의 샘플에 있어서, 샘플이 독특하게 특징화되도록 통계학적으로 의미있는 수의 결합이 발생할 때 라이브러리가 가장 유용하다. 예를 들어, 10⁷ 내지 10⁸의 상이한 항체들의 다양성이, 대부분의 알려진 항체들과 상호작용하기에 충분한 친화성을 갖는 하나 이상의 조합을 제공하기에 충분한 것으로 생각된다 (예컨대 문헌 [Walt, D.R. and Michael, K.L., "Target analyte sensors utilizing microspheres", U.S. Patent No. 6,327, 410 (2001)] 참조). 항체 스크리닝에 사용되는 단백질 및 펩티드 라이브러리는 그들의 생산에 사용되는 방법에 따라 일반적으로 10⁶ 내지 10⁸ 구성원 또는 그 이상의 수를 갖는다 (예컨대 문헌 [Gavilondo, J.V. and Larrick, J.W., "Antibody Engineering at Millennium", Bio Techniques 29, 128-145 (2000); Hanes, J. and Pluckthun, A., "In vitro selection methods for screening of Peptide and Protein libraries", Curr. Topics Microbiol. Immunol. 243, 107-122 (1999)] 참조). 따라서, 바람직한 일 실시태양에서, 10⁶ 이상, 더욱 바람직하게는 10⁷ 이상, 가장 바람직하게는 10⁸ 이상의 상이한 포획 프로브들이 항원의 존재를 스크리닝하기 위해 사용된다. 반면, 측정 목적이 더 작은 수의 특이적인 분석물의 존재를 측정하는 것이라면 결합 라이브러리의 다양성은 감소할 수 있다. HIV, 간염, 암 등과 같은 질병 상태에 존재하는 제한된 수의 특이적 바이오마커에 대한 검정법이 당업계에 공지되어 있다 (예컨대 문헌 [Petricoin, E. F. , et al., "Use of proteomic patterns in serum to identify ovarian cancer", Lancet 359, 572-577 (2002)] 참조). 따라서, 일반적으로 그러한 상태들에 대한 스크리닝은 대규모 게노믹 또는 프로테오믹 맵핑과 같은 기타 적용에 비해 더 적은 프로브가 필요할 것이다.

포획 프로브의 또 다른 부류는 핵산 또는 핵산 유사체 (아래 기술되는 펩티드 핵산 등)를 포함하는 것으로, 이들은 또한 "DNA 단편", "RNA 단편", "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드", "유전자 프로브", "DNA 프로브" 및 당해 분야에서 사용되는 유사한 용어로 알려져 있으며, 본 개시에서 모두 동의어로 여겨진다. 핵산 프로브는 천연 유전자 단편, 클로닝된 유전자 단편, 합성된 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 임의의 조합으로부터의 뉴클레오티드 서열을 함유할 수 있다. 합성 폴리뉴클레오티드의 염기 서열은 올리고 (Oligo)^TM 4.0 또는 6.0 (미네소타주 프리마우스 내쇼날 바이오사이언스 인크. (National Bioscience Inc.)), 벡터 NTI (매릴렌드주 프레데릭 인포맥스 (Informax)^TM) 또는 올리고뉴클레오티드 서열 및 구조를 디자인하는 것을 지원하는 다른 컴퓨터 프로그램과 같은 상용 소프트웨어를 이용하여 특이적 핵산 표적에 대해 디자인될 수 있다. 당해 기술분야에 알려져 있는 바와 같이, 뉴클레오티드는 천연 당-포스포디에스테르 주쇄, 또는 그의 화학적 변형물들을 포함할 수 있고, 이들 변형물은 천연 유전자 또는 유전자 단편에서는 나타나지 않는 새로운 화학 잔기의 이용을 가능하게 한다.

추가적으로, 포획 프로브는 펩티드 핵산 (PNA) 프로브일 수 있다. PNA는 핵산 (DNA 및 RNA)의 당-포스페이트 주쇄가 아닌 가(pseudo)-펩티드 주쇄를 지닌 DNA의 유사체이다. PNA는 DNA의 거동을 흉내내고 상보적 핵산 스트랜드에 결합한다. PNA 올리고머 프로브들은 뉴클레오염기에 아세틸 연결자를 지닌 아미노에틸글리신 주쇄에 기초할 수 있다. 이들은 Boc 또는 Fmoc 화학 또는 Boc/Cbz 단량체를 이용한 고체상 합성 중 어느 것으로 생성될 수 있다 (문헌 [Dueholm, K. L. et al., J. Org. Chem. 59, 5767-5773 (1994); Christensen, L. et al. J. Peptide Sci. 3, 175-183 (1995); Thomson, S.A. Tetrahedron Lett. 22, 6179-6194 (1995); Ganesh, K. N. Curr. Org. Chem. 4, 931-943 (2000)]). PNA 프로브는 어플라이드 바이오시스템스 (Applied Biosystems; 캘리포니아주 포스터 시티)에서 구입할 수 있다. PNA 올리고머는 핵산 프로브에 관능성을 부여하는 말단 조절인자 (modifier)로 디자인될 수도 있다. 조절인자는 또한 PNA의 분석물 특이적 가변 포획 서열의 내부일 수 있다.

입자 표면에 핵산 프로브 또는 PNA와 같은 가-핵산 프로브를 제조하는 방법이 공지되어 있다. 전형적인 참고문헌은 예컨대 [Fulton, R. J., "Methods and compositions for flow cytometric determination of DNA sequences", U.S. Patent No. 6,057,107 (2000); Chandler, M.B., et al., "Microparticles attached to nanoparcicles labeled with fluorescent dye", U.S. Patent No. 6,268,222 (2001); Chandler, V.S. et al., "Multiplexed analysis of clinical specimens apparatus and methods", U.S. Patent No. 5,981,180 (1999); Mandecki, W., "Multiplex assay for amino acids employing transponders", U.S. Patent No. 6,361,950 (2002); Mandecki, W. "Three-dimensional arrays of microtransponders derivatized with oligonucleotiedes. Proceedings from the IBC Biochip Technologies Conference, San Francisco, June 1998 D & MD Library Series publication # 1941, Drug & Market Development Publications, Southborough, MA 01772, pp. 179-187 (1999); Brenner, S. et al.,"Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing (MPSS) on microbead arrays", Nature Biotechnology 18, 630-634 (2000); Brenner, S. et al., "In vitro cloning of complex mixtures of DNA on microbeads: Physical separation of differentially expressed cDNAs "Proc. Nat. Acad. Sciences USA 97,1665-1670 (2000)] 및 그 안의 인용문헌을 포함한다. 별법으로, 핵산 프로브는 어플라이드 바이오시스템스 (캘리포니아주 포스터 시티)에서 구입할 수 있는 것과 같은 상용 DNA 올리고뉴클레오티드 합성기를 이용하여 제어된 공극 유리 기재 상에 표준 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 결합 화학을 이용하여 제조할 수 있다 (Beaucage et al., Tetrahedron Lett. 22, 1859 (1981)). 합성된 핵산 프로브는 이어서 당업계에 알려져 있는 바와 같이 공유 또는 비공유 결합을 이용하여 마이크로입자에 결합될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프로브의 5' 말단, 3' 말단 또는 양자 모두가 핵산 프로브의 말단에 관능성을 부여하는 β-시아노에틸 포스포르아미다이트 조절인자를 이용하여 유도될 수 있다. 이들 조절인자는 아미노-조절인자, 티오-조절인자, 디티오-조절인자, 카르복시산 N-히드록시숙신이미드 에스테르, 분자 스페이서 조절인자, 친화성 활성 리간드 또는 면역 활성 리간드 등을 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 조절인자의 목적은 핵산 프로브에 관능성을 부여하여 분자 스페이싱, 공유 가교 또는 프로브에의 식별가능 마이크로입자의 친화성 포획을 가능하게 하려는 것이다. 가교 또는 결합 관능성은 마이크로입자 표면에 핵산 프로브의 연결을 가능하게 한다. 당업계에 공지된 많은 상이한 화학적 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법은 일반적으로, 아민기 또는 술프히드릴기와 같은 친핵성 잔기에 쉽게 결합할 수 있는 반응성 친전자성 중간체를 사용한다. 이들 기는 (a) 말레이미드 및 할로아세틸 유도체를 포함하는 (이에 한정되지 않음) 술프히드릴-활성기와 공유 결합을 형성하는 구성원, (b) 이소티오시아네이트, 숙신이미딜 에스테르 및 술포닐 할라이드를 포함하는 (이에 한정되지 않음) 아민-활성기, (c) 아미노기 및 카르복시기를 포함하는 카르보디이미드-활성기, (d) 항원/항체 또는 합텐/안티-합텐 시스템과 같은 면역형 결합쌍의 부류 중 어느 것, (e) 비오틴/아비딘, 비오틴/스트렙타비딘, 엽산/엽산 결합 단백질 또는 비타민 B12/내인성 인자와 같은 비면역형 결합쌍의 부류 중 어느 것, (f) 임의의 상보적 핵산 분절 (DNA 서열, RNA 서열 및 펩티드 핵산 서열을 포함)의 임의의 군 및 (g) 단백질 A 또는 G와 같은 면역글로불린 결합 단백질의 임의의 군을 포함한다. 관능성 잔기들의 결합 특성 및 특질 이외에, 분자 조절인자 역시 검정 시그너쳐 신호의 발생 또는 증폭에 기여한다.

본 발명에 유용한 마이크로입자의 표면 제조는 예컨대 연결자 화학, 혼성화 또는 비오틴/아비딘 친화성에 의한 친화성 포획, 조합 화학, 및 기타 공지된 것들을 포함한다. 일반적으로, 핵산 프로브들은 표적 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 제공하도록 디자인되어, 표적의 결합이 측정 가능한 것이고 샘플의 특징화 또는 스크리닝에 기여하도록 한다. 이런 경우에, 결합은 상보적인 염기 짝지음에 의하며 완벽할 필요는 없다. 당업계에 공지되어 있는 바와 같이, 그러한 결합의 엄격성은 검정 조건을 변경함으로써 제어가능하다. 앞서 단백질에 대해 개시되었 듯이, 핵산 프로브는 구체적 검정의 필요에 따라 서열의 전부 또는 일부를 무작위화할 가능성이 있는, 천연 및 합성 뉴클레오티드 서열의 임의의 조합으로 이루어질 수 있다.

바람직한 일 실시태양에서, 포획 프로브는 예컨대 클로닝된 유전자 또는 유전자 단편과 같은 천연 뉴클레오티드 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드 핵산이다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 포획 프로브는 부분적으로 천연인 뉴클레오티드 서열 및 부분적으로 무작위화된 뉴클레오티드 서열을 포함한 폴리뉴클레오티드 또는 펩티드 핵산이다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 포획 프로브는 여러 유형의 바이오센서에 유용한 더 일반적인 유기 화학 구조, 유기/무기 리간드, 유기금속 리간드 또는 유사한 착물을 포함할 수 있으며, 예컨대 문헌들 [Fitzgerald, D. A., The Scientist 16, 8 (2002); Cravat, B. F., and Sorensen E.J. "Chemical strategies for the global analysis of protein function", Curr. Opin. Chem. Biol. 4, 663-668, 2000; Hergenrother, P.J., et al., "Small-Molecule Microarrays: Covalent Attachment and Screening of Alcohol-Containing Small Molecules on Glass Slides, J. Amer. Chem. Soc. 122(32), 7849-7850 (2000); Korbel, G.A. et al., "Reaction Microarrays: A Method for Rapidly Determining the Enantiomeric Excess of Thousands of Samples", J. Amer. Chem. Soc. 123 (2), 361-362 (2001); MacBeath, G. et al., "Printing Small Molecules as Microarrays and Detecting Protein-Ligand Interactions en Masse", J. Amer. Chem. Soc. 121 (34), 7967-7968 (1999)] 및 거기에 포함된 참고문헌들을 참조하라. 이들 프로브 구조들은 조합 화학, 직접 합성, 세포로부터의 추출 등을 비롯한 많은 방법에서 유도될 수 있다.

일부 적용, 예컨대 소변, 뇌척수액, 혈청, 혈장 등과 같은 복합적인 생물학적 유체의 검정에서 (하기하는 "검정" 섹션 참조), 샘플 매트릭스 성분의 비특이적 결합을 방지하거나 감소시키기 위해 마이크로입자를 처리하는 것이 필수적이다. 이종 검정에서 다양한 고체 지지체에 대한 비특이적 결합을 감소시키는 방법은 당업계에 공지되어 있지만, 소 혈청 알부민 (BSA), 카제인 및 무지방 우유과 같은 단백질로 처리하는 것에 한정되지 않는다. 이들 처리는 일반적으로 포획 프로브가 마이크로입자에 부착된 이후에, 그러나 검정이 유력한 비특이적 결합 부위를 차단하기 이전에 행해진다. 추가적으로, 비특이적 결합에 저항성인 표면은 표면을 합성 중합체, 천연 중합체, 또는 단일 성분 또는 성분들의 혼합물로 구성된 자가 조립 단일층을 포함한 박막으로 코팅함으로써 형성될 수 있다. 박막은 비특이적 결합을 더욱 감소시키기 위해 흡착-반발 잔기로 변형될 수 있다. 예를 들어, 박막은 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 옥시드, 덱스트란, 또는 폴리사카라이드와 같은 친수성 중합체 뿐만 아니라, 친수성이고 수소 결합 받게를 포함하며 (수소 결합 주게는 아님) 전체적으로 전기적 중성인 말단 관능기를 갖는 자가-조립 단일층일 수 있다 (Ostuni, E. et al.,"A Survey of Structure-Property Relationships of Surfaces that Resist the 흡착 of Protein", Languir, 17, 5605-5620, (2001)). 이 접근법에서, 비특이적 결합 저항층은 일반적으로 기질 상에 형성되고 이어서 화학적으로 활성화되어 포획 프로브의 부착을 가능하게 한다. 예를 들어, 본원에 참고문헌으로 포함된 Huang에 의한 미국 특허 출원 제 60/451068호에 기술된 방법은 본 발명의 마이크로입자에 대한 비특이적 흡착을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 그 개시에 기술된 방법에서, 폴리에틸렌 글리콜 알킬 아크릴레이트 박막은 표면 개시 원자 전달 라디칼 중합을 이용하여 고체 기질, 즉 마이크로입자의 표면 상에서 성장한다. 이 방법은 하기하는 실시예 7에 상세히 기술되어 있다. 요약하면, 마이크로입자는 개시 분자로 최초 처리되어 개시제-코팅된 마이크로입자를 형성하고, 이는 이어서 촉매 존재 하의 용액 중에서 1종 이상의 폴리에틸렌 글리콜 알킬 아크릴레이트 단량체와 접촉된다. 생성된 폴리에틸렌 글리콜 알킬 아크릴레이트 코팅은, 트리클로로-s-트리아진 (Abuchowski, A. et al., J. Bio. Chem. 252, 3578-3581, 및 3582-3586 (1977)), N,N'-카르보닐디이미다졸 (Bartling, G. J. et al. Nature (London), 243, 342-344 (1973)) 및 토실 클로라이드 및 트레실 클로라이드 등의 유기 술포닐 클로라이드 (Nilsson, K. and Mosbach, K. Methods in Enzymology, 1984,104, pp 56-69)의 이용을 비롯한 (이에 한정되지는 않음), 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용하여 더욱 활성화되어 포획 프로브에 접합될 수 있다.

앞서 단백질 라이브러리에 대해 기술한 바와 같이, 핵산 또는 유기 분자 라이브러리의 다양성은 최종 사용자의 구체적인 응용에 따라 상당히 다를 수 있다. 바람직한 실시태양으로, 라이브러리 내의 각 입자는 상이한 포획 프로브, 한 부류의 포획 프로브 또는 포획 프로브의 정해진 혼합물을 지닌다. 그러나, 라이브러리 내의 1종 이상의 입자가 동일한 포획 프로브를 지니도록 함으로써 라이브러리가 과잉화될 수 있다. 특이적 분석물의 존재를 측정하는 확실성이 적당히 과잉인 라이브러리 (각 프로브의 3-5 카피)에 대해서 통계적으로 더 클 것이기 때문에, 이것은 때때로 바람직하다. 과잉 (redundancy)에 대한 필요는 표적 분석물의 농도, 이용가능한 샘플의 양 및 기타 인자들에 따라 다르다.

따라서 상업적으로 유용한 라이브러리는 이미 부착된 기지의 포획 프로브를 갖는 미리 제조된 마이크로입자로 구성될 수 있고, 별법으로 마이크로입자는 사용자가 특히 관심있는 라이브러리를 맞춤 합성할 수 있도록 특이적 표면 화학으로 처리될 수 있다. 프로브는 개별적으로 생성되고 이어서 연결자 화학, 가교 화학 또는 기타 공지된 기법을 이용해 별도의 단계에서 부착될 수 있다. 연결기의 예는 히드록시기, 아미노기, 카르복시기, 알데히드, 아미드 및 술포네이트 및 술페이트와 같은 황-함유기를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 가교 화학의 예는 s-트리아진 및 비스-에폭시드를 포함한 히드록시 활성기, 말레이미드 및 할로아세틸 유도체를 포함한 술프히드릴 활성기, 아민 활성기, 예컨대 이소티오시아네이트, 숙시닐이미딘 에스테르 및 술포닐 할라이드 및 카르복실 활성기, 예컨대 카르보이미드를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.

또 다른 접근법으로, 포획 프로브가 본 발명의 입자 표면 상에 직접 합성될 수 있다. 입자 상에 직접 합성될 수 있는 프로브는 핵산 (DNA 또는 RNA), 펩티드 핵산, 폴리펩티드 및 그들의 분자 하이브리드를 포함하지만 이에 한정되지는 않는다. 직접 합성 접근법으로, 입자 상에 직접 프로브를 화학적 또는 생물학적으로 합성하는데 이용되는 활성 잔기로 유도된 입자가 사용된다. 활성 잔기의 화학 연결은 나중의 합성 탈보호 및 최종 프로브 연결 마이크로입자의 정리 (문헌 [Lohrmann et al., DNA 3,1222 (1984); Kadonaga, J. T., Methods of Enzymology 208, 10-23 (1991); Larson et al., Nucleic Acid Research 120, 3525 (1992); Andreadis et al. Nucleic Acid Res. 228, e5 (2000); Chrisey et al. WO/0146471] 참조) 동안 마이크로입자로부터 분리되어서는 안된다. 이 접근법은 라이브러리의 대량 생산 및 조립을 가능하게 한다.

요약하면, 라이브러리를 제조하는 수단은 수행하는 검정, 라이브러리의 유형, 라이브러리의 다양성, 과잉성, 연결자 화학의 유형, 및 기타 인자에 따라 다를 것이다. 입자 라이브러리에 유용한 일반적인 요건은 입자의 정체와 포획 프로브의 정체 간의 연관성이다. 이 연관성은 라이브러리가 합성되는 방법에 무관하게 (조합 방법, 자동화된 유도 합성, 수동 합성 또는 기타 방법이든 간에), 그리고 연관성이 결정되는 방법 및 시기에 무관하게 보존되어야 한다.

일반적으로, 라이브러리 내의 각 마이크로입자는 특이적 포획 프로브의 다수 카피 또는 포획 프로브의 소정의 혼합물을 지닌다. 포획 프로브의 최적 표면 밀도는 응용 및 반응 조건에 따라 다를 수 있다. 예를 들어, DNA 프로브를 고정화하는 DNA 혼성화의 동력학이 연구되어 왔다 (Chan, et al., "The biophysics of DNA hydridization with immobilized oligonucleotide probes", Biophysical Journal 69, 2243-2255 (1995); Livshits, M. A., Theoretical analysis of the kinetics of DNA hybridization with gel-immobilized oligonucleotides, Biophysical Journal 71, 2795-2801 (1996)). 단백질-단백질 상호작용에 대하여 비슷한 연구가 수행되어 왔다 (Stenberg, M. and Nygren, H. ,"Kinetics of Antigen-Antibody reactions at solid-liquid interfaces", Journal of Immunological Methods 113,3 (1998)). 일반적으로, 2 차원 표면 어레이 및 표적분석물을 함유한 용액의 경계에서는 혼합이 나쁘다. 효율적인 특이적 결합이 2 차원 고정 어레이 상에서 일어나게 하기 위해, 일반적으로 몇몇 비특이적 결합이 표면상에서 먼저 발생한 후, 표면을 따라 2 차원 확산이 일어나고, 이어서 혼성화 또는 결합에 이르러야 한다. 2 차원 확산에 대한 필요는 프로브 표면 밀도, 결합 속도, 및 그에 따라, 주어진 시간에서 발생할 수 있는 전체 신호를 제한한다. 반면, 양호하게 혼합된 환경에서 수행되는 입자-기반 검정에서는 (예컨대, 유리 현탁액 또는 마이크로유체 장치에 의해 제공되는 유동장 (flow field) 내), 경계에 있는 주변층이 지속적으로 보충되고 프로브 표면의 고밀도가 더욱 유리하다. 이것은 높은 속도의 결합, 잠재적인 더 큰 결합 신호, 높은 프로브 밀도, 감도 증가, 특이성 향상 및 비특이적 결합 간섭의 감소를 가져온다. 따라서 본 발명에서, 마이크로입자 표면 상의 더 높은 프로브 밀도는 특이적 결합에 악영향을 주지 않고 비특이적 결합을 감소시키는 것을 돕는다. 입자-기반 검정 및 특히 본 발명의 시스템의 추가적인 장점은 검정에 필요한 샘플의 양이 대체로 감소될 수 있다는 것이다. 고정된 어레이 시스템에서, 동력학 반응이 일어나고 긴 확산 거리를 극복하기 위해 분석물은 실질적으로 프로브에 대해 과량이어야 한다. 일반적으로 단지 분석물의 일부만 고정된 어레이 내에서 그의 상보적인 프로브와 상호작용을 할 수 있을 것이다. 양호하게 혼합된 시스템에서의 짧은 확산 거리로 인해, 모든 분석물은 모든 프로브 결합 부위에 동등하게 이용될 수 있다. 이는 감도를 증가시키고 반응 시간 및 검정 회복 시간을 감소시킨다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 마이크로입자 라이브러리가 추가적인 표면 화학 또는 포획 프로브가 없는 식별가능 마이크로입자의 다중성으로서 제공된다. 그러한 라이브러리는 조합 합성을 위해 기질을 표지화하는 것, 맞춤 제작 스크리닝 라이브러리를 위한 출발물질로 이용되는 것을 비롯해 많은 목적으로 이용될 수 있다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 특이적 연결자 화학, 직접 합성 또는 포획 프로브의 부착을 위한 기타 수단에 적합한 유도된 입자 표면이 마이크로입자 라이브러리에 제공된다. 그러면 최종 사용자는 구체적인 검정 필요에 따라 프로브를 포함한 라이브러리를 맞춤 제작할 수 있다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 마이크로입자 라이브러리는 입자 정체의 리스트와 연관성 있는 기지의 포획 프로브를 지닌 입자로 채워진다. 그러면 최종 사용자는 제공되는 전체 라이브러리를 이용하거나 또는 구체적인 검정 필요에 따라 라이브러리를 소단위로 분류할 수 있다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 마이크로입자 라이브러리가 예컨대 조합법으로 생성된 미지의 포획 프로브를 지닌 입자로 채워진다. 그러면 최종 사용자는 공명광 산란 기법을 사용하여 특이적 표적에 대한 "히트"를 위해 라이브러리를 스크리닝할 수 있고, 당업계에 공지된 기법을 이용하여 대응하는 프로브를 특징화할 수 있다.

검정

본 발명과 함께 수행되는 화학적 또는 생물학적 검정은, 마이크로입자의 표면에 위치하는 한 구성원과 ("프로브", "결합 파트너", "수용체", 또는 문법적으로 유사한 용어로 언급함) 샘플 내에 존재하는 다른 구성원의 ("표적", "분석물", 또는 문법적으로 유사한 용어로 언급함) 결합쌍의 특이적인 상호작용을 이용할 수 있다. 일반적으로 분석물은 분석물에 있어 특이하고 상보적인 프로브 부위에 대해 향상된 결합 친화성을 갖는, 하나 이상의 소위 "결정인자" 또는 "에피토프" 부위를 지닌다.

본 발명에 있어 가능한 검정 유형들의 성질은 상당히 다양하다. 프로브/표적 결합쌍은 예컨대 상기 쌍 중 하나의 구성원은 프로브이고 나머지는 분석물인, 항원 및 특이적 항체, 항원 및 특이적 항체 단편, 엽산 및 엽산 결합 단백질, 비타민 B12 및 내인성 인자, 단백질 A 및 항체, 단백질 G 및 항체, 폴리뉴클레오티드 및 상보적 폴리뉴클레오티드, 펩티드 핵산 및 상보적 폴리뉴클레오티드, 호르몬 및 호르몬 수용체, 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 결합 단백질, 합텐 및 안티-합텐, 렉틴 및 특이적 탄수화물, 효소 및 효소, 효소/기질, 효소/억제제, 또는 비오틴 및 아비딘 또는 스트렙타비딘, 및 이들의 하이브리드인 조합들 중 하나, 그리고 당업계에 공지된 기타의 것들 중에서 선택될 수 있다. 결합쌍은 말레이미드 및 할로아세틸 유도체를 포함한 술프히드릴 반응기, 및 아민 활성기, 예컨대 이소티오시아네이트, 숙신이미딜 에스테르, 술포닐 할라이드 및 카르보디이미드 활성기, 예컨대 카르복실 및 아미노기와 같은 공유 결합을 형성하는 구성원들도 포함할 수 있다.

결합 검정의 구체적인 예는 천연 표적, 예컨대 항체, 항원, 효소, 면역글로불린 (Fab) 단편, 렉틴, 세포 표면에서 발견되는 여러가지 단백질, 합텐, 셀 전체, 셀 단편, 소기관, 박테리오파지, 파지 단백질, 바이러스 단백질, 바이러스 입자 등에 대한 것을 포함한다. 이들은 알레르겐, 오염물질, 천연 호르몬, 성장 인자, 천연 약물, 합성 약물, 올리고뉴클레오티드, 아미노산, 올리고펩티드, 화학 중간체 등을 포함할 수 있다. 그러한 검정에 대한 실질적인 응용은 예컨대 건강 상태의 모니터링, 약물 남용의 검출, 임신 및 출생전 테스트, 이식을 위한 제공자 매칭, 치료적 용량 모니터링, 질병의 검출, 예컨대 암 항원, 병원체, 생체방어를 위한 센서, 의학 및 비의학적 진단 테스트, 및 당업계에 공지된 유사한 응용을 포함한다.

단백질은 많은 진단 테스트, 예컨대 혈액형 검사, 세포 오염물질 검출, 병원체 스크리닝, 병원체에 대한 면역반응 스크리닝, 면역 복합체, 렉틴, 모노사카리드 및 폴리사카리드, 생리액, 공기, 공정 흐름, 물과 같은 샘플내의 알레르겐 및 합텐의 존재 등에서 관심대상이다. 마찬가지로, 핵산 또는 폴리뉴클레오티드를 프로브로 사용하는 것은 샘플 내의 상보적 스트랜드의 검출, 유전자 발현을 위한 mRNA의 검출, 게노믹 및 프로테오믹 마이크로 어레이 응용, PCR 산물의 검출, DNA 서열분석, 임상적 진단, 의학적 스크리닝, 다형태 스크리닝, 법의학적 스크리닝, 핵산에 특이적으로 결합한 단백질의 검출 및 기타 당업계에 알려진 분야에 적용될 수 있다.

다양하고 구체적인 프로토콜을 이용하여 검정을 수행할 수 있다. 전형적인 프로토콜의 개략도가 도 1에 나타나 있다. 분석물의 검출 또는 정량화를 위해, 일반적으로 샘플 (113)이 마이크로입자 (110), (111) 등을 함유한 용액과 혼합된다. 특정 검정에 의해 필요하다면 인큐베이션, 세척, 갖가지 시약의 첨가 등과 같은 다양한 추가적 단계들이 수행될 수 있다. 관심대상 분석물이 존재하고 1종 이상의 마이크로 입자가 상보적 포획 프로브를 갖고 존재하면, 마이크로입자 (114) 및 (115)에 의해 도시된 것처럼 그 분석물은 마이크로입자들에 결합할 것이다. 반대로, 도 1에 의하면 특이적 마이크로입자에 상보적인 분석물이 존재하지 않는 경우, 그 입자, 예컨대 마이크로입자 (116)에 결합하지 않을 것이다.

본 발명의 일 실시태양에서, 아래 "입자 식별 방법 및 시스템" 섹션에서 기술되는 것 처럼 공명광 산란이 검정에서 입자 식별을 위해서만 사용된다.

검출은 형광, 화학발광, 나노입자 태그, 및 기타 공지된 기법을 포함한 전형적인 검출 방법을 이용해 수행한다. 이 실시태양에서, 표지는 검출이 가능하도록 결합쌍의 구성원에 부착될 수 있다. 별법으로, 표적 분석물이 마이크로입자에 부착된 프로브에 의해 포획되는 샌드위치 검정이 사용될 수 있다. 그러면 부착된 표지를 갖는 제2 결합 파트너가 포획된 분석물에 결합하는데 사용된다.

또 다른 실시태양으로, 하기하는 "입자-기반 결합 측정" 섹션에 기술된 것 처럼, 공명 산란이 오직 결합의 검출을 위해 사용된다. 이 실시태양에서, 고정된 위치에 입자가 남아있게 하는 것과 같은 기타 수단이나 Chandler 등에 의한 미국 특허 제5,981,180호에 기술된 것과 같은 형광 색소의 이용, 또는 마이크로입자에 부착된 Chandler 등에 의한 미국 특허 제6,268,222호에 기술된 것과 같은 나노입자 표지에 의해 입자식별을 행한다. 더욱이, 단지 한 유형의 프로브 마이크로입자가 검정에서 사용되면 입자 식별이 필요하지 않다.

바람직한 실시태양에서, 입자 식별 및 결합 검출 모두 공명 산란을 이용하여 수행한다. 결합된 분석물의 검출 및 식별은 본 개시의 "입자 식별 방법 및 시스템" 및 "입자-기반 결합 측정" 섹션에 자세히 기술되어 있다. 거기서 더욱 상세히 설명하는 바와 같이, 결합하지 않은 리포터기에 의한 간섭 가능성 때문에 현행 실시에서는 마이크로입자에서 결합하지 않은 샘플 성분을 분리하는 것이 필수적인데 비해, 본 발명에서는 이런 단계가 임의적이다.

본 발명의 입자들을 이용하는 검정은 소변, 복수, 뇌척수액, 윤활액, 세포 추출물, 위액, 대변, 혈액, 혈청, 혈장, 림프액, 간질액, 양수, 조직 균질액, 궤양액, 수포, 및 농양, 타액, 눈물, 점액, 땀, 젖, 정액, 질 분비물 및 정상, 악성 및 의심가는 조직의 생체검사를 비롯한 조직 추출물과 같은 분리되거나 여과되지 않은 생물학적 유체, 및 당업계에 공지된 다른 것들을 포함한 매우 다양한 샘플 매트릭스에서 수행될 수 있다. 샘플은 또한 토양, 물, 또는 공기와 같은 환경원, 또는, 하수, 생산 라인, 리액터, 발효 장치, 세포 배양 배지 또는 소비 제품, 식료품 등으로부터 채취한 것과 같은 공업원으로부터 획득될 수 있다. 검정 (당업자에 의해 공지되었을 기법)의 세부사항에 따라 사용하기 전에 시험 샘플을 미리 처리할 수 있다.

입자 식별 방법 및 시스템

본 발명에 의하면, 공명광 산란 스펙트럼에서의 고 분해능 특징이 마이크로입자 집단의 각 구성원에 대한 독특한 식별 패턴을 제공하는데 유용하다. 산란광 스펙트럼은 특정 파장에서 특정 너비 및 모양의 공명 형태로 정보 내용을 갖는다. 당업계에 알려져 있는 바와 같이, 공명 특징의 위치, 너비 및 상대 강도 모두 입자 크기 및 입자의 굴절률에 따라 다르다. 일반적으로, 공명 특징은 상당히 넓은 입자 크기 및 굴절률 범위에 걸쳐 나타날 수 있다. 하지만 일반적으로, 본 발명에 유용한 공명은 이들 입자 특성의 특정 범위 이내에서 형성된다. 더욱이, 코어에 다양한 굴절률의 층들 및/또는 구역들을 첨가하는 것은 크기 및 굴절률의 특정 변수 내에서 공명광 산란 패턴에 추가적인 풍부함을 발생시키는 것으로 생각된다. 또한 임의의 마이크로입자 생산 공정에서 있어, 공명광 산란 패턴을 결정하는 주요 변수, 즉 입자 크기 및 굴절률에 자연적인 편차 또는 필요한 경우 유발된 편차가 있다는 것이 명백할 것이다. 이러한 가변성은 바꾸어 말하면, 각각의 입자가 입자 식별자로서 이용될 수 있는 뚜렷한 공명광 산란 패턴을 발생시키는, 큰 마이크로입자의 집단을 생성시킬 수 있게 한다.

본 발명에 의한 일반적인 마이크로입자가 도 2에 나타나는데, 이것은 반지름 r 및 굴절률 n_c의 균일한 코어 (100)을 묘사한다. 도 2는 또한 외부 반지름 r₁...r_m 및 굴절률 n₁...n_m을 갖는 최적의 수 m의 층들 (101)...(103)을 묘사한다. 층 m의수는 0일 수 있고, 0 보다 큰 경우는 일반적으로 약 5보다 작다. 이 문맥에서, 용어 "층" 또는 "층들"은 예리한 굴절률 경계를 포함하는 구역, 또는 예리한 경계 없는 가변적인 굴절률의 영역을 포함할 수 있다. 둘 중 어느 경우에서, 굴절률 및 층 크기의 가변성은 공명광 산란 스펙트럼에 풍부함을 제공할 수 있고, 이는 입자 식별에서 유리하게 사용될 수 있다.

파장 λ의 빛으로 조사하는 경우, 입자는 강도 I(λ)를 갖고 검출기에 그 빛의 일부를 산란시킬 것이다. 입사광이 주사됨에 따라, 즉, 분석 파장 범위에 걸쳐 변화함에 따라, 파장의 함수로서 "산란 패턴" 또는 "산란 스펙트럼"이 발생한다. 본 발명에 따라 입자로부터의 공명광 산란 스펙트럼을 측정하기 위해, 입자가 측정 동안 위치하게 되는 적당한 검출 셀이 필요하다. 도 3은 마이크로입자로부터의 고 분해능 공명광 산란 스펙트럼을 측정하는데 유용한 광학셀 (014)의 실시태양을 도시한다. 도 4는 광학셀 (014), 광 검출기 (008) 및 마이크로입자에서 고 분해능의 공명광 산란 스펙트럼을 측정하는데 사용되는 관련 보조 장치를 비롯하여, 관련된 실험 장비의 실시태양을 묘사한다. 그러한 측정의 세부 사항은 실시예 1에 주어지고 여기서 요약된다.

실시예 1의 마이크로입자는 약 40 마이크로미터의 직경 및 약 775 나노미터에서 약 1.9의 굴절률을 갖는다. 당업계에 공지된 바와 같이, 공명 파장에서 산란된 빛은 입자의 내부에서 나오고, 따라서 산란되기 전에 입자의 외부 광학 구역을 통해 투과되어야 한다. 따라서, 입자의 외부 광학 구역 (초곡면 외부 코어의 부분)은 실질적으로 관심 파장에서 투과성이어야 한다. 다음 논의에서, 도 3 및 4를 참조하라. 마이크로입자는 델린 (Delrin) (등록상표) 및 테플론 (Teflon) (등록상표) AF 2400으로 구성되는 광학셀 (014) 내의 수성 현탁액에 수용된다. 물의 굴절률에 가깝게 매칭되는 굴절률을 지니기 때문에 테플론 AF 2400이 바람직한 물질이고, 따라서 물 및 셀의 창 사이의 경계에서 반사 및 굴절로 인한 광학적 배경 및 관련 노이즈를 감소시킨다. 테플론 (등록상표) AF 1000은 테플론 (등록상표) AF 2400보다 물에 더 근접한 굴절률을 지니므로, 또 다른 바람직한 물질이다. 또 다른 바람직한 물질은 포토레지스트 물질에 통상 사용되는 플루오로아크릴레이트로, 관심 파장에서 약 1.38의 굴절률을 갖는다. 디자인 및 물질이 입사광이 충분히 입자 또는 입자들을 조명하고 산란광이 최소화되며 셀 크기가 본 발명이 의도하는 응용에 적합하다면, 당업계의 숙련자는 다른 광학셀 구성이 가능함을 인식할 것이다.

하나의 중심 여기 섬유 (004)를 포함하고 6개의 검출 섬유 (007)에 의해 육각 패턴으로 둘러싸인 다중-섬유 광학 프로브 (005)가 입자 위에 위치하고, 그 끝은 물층으로 뻗어있다. 여기 섬유는 주사 다이오드 레이져 (006)의 출력부에 연결되어 있다. 당업계의 숙련자는 동조가능 염료 레이져 및 다색성 공급원, 예컨대 가스 방출 램프, 발광 다이오드 및 백열등과 같은 다른 입사광원이 사용될 수 있음을 인식할 것이다. 다색성 광원은 더욱 선택적인 파장의 입사광을 생성하기 위해 일반적으로 하나 이상의 파장-선별 수단, 예컨대 비분산 요소 (예컨대, 고정 파장 통과대역 필터, 동조가능 파장 통과대역 필터, 홀로그래픽 필터) 또는 분산 요소 (예컨대, 모노크로매터, 프리즘, 격자)에 연결시킬 필요가 있다 (필요한 스펙트럼 분해능을 얻기 위함).

빛은 렌즈, 거울, 프리즘, 광섬유 디바이스, 빔 확장기, 및 기타 공지된 것을 비롯한 상이한 광 결합 수단에 의해 광학 시스템 내에서 결합될 수 있다.

산란광의 검출은 상이한 방식으로 행해질 수 있다. 실시예에서 보는 바와 같이, 마이크로입자에서 산란된 빛의 검출에 바람직한 실시태양은 입사 파장을 주사하고 파장-선택적이지 않은, 즉 상이한 파장의 빛을 구분하는데 적당하지 않은 검출기 또는 영상 장치로 빛을 검출하는 것이다. 당업계의 숙련가는 또한, 다색성 빛으로 입자를 조명하고 비분산 요소 (예를 들어, 고정 파장 통과대역 필터, 동조가능 파장 통과대역 필터, 홀로그래픽 필터, 파장-선택적 영상 장치, 예컨대 컬러 디지털 카메라) 또는 분산 요소 (예를 들어 모노크로매터, 프리즘, 격자)와 같은 파장-선택적인 검출 수단으로 산란광을 검출하는 것이 원칙적으로 가능하다는 것도 인식할 것이다.

레이져가 파장에서 주사됨에 따라, 빛의 일부가 입자와 상호작용하여 산란된다. 입자와 상호작용하지 않는 빛은 셀 아래의 창 (015)를 통해 빠져나간다. 일부 빛은 입자에서 모든 방향으로 산란되지만, 바람직한 방향은 입사광에서 180 도에 가까운 방향이다 (다르게는, "후방-산란된" 빛이라 부른다). 후방-산란광은 6 개의 검출 섬유 (007)에 의해 수신되고 결합되며 적당한 광검출 수단, 예컨대 실리콘 광검출기, 광증폭기 등과 같은 적당한 광검출 수단으로 보내진다. 이 예에서 다이오드 레이져 (006) 내부에 위치한 초퍼는 입사광을 변조한다. 검출기 출력부로부터의 전기 신호가 변조 신호와 함께 교대로 고정 증폭기 (009)로 전달된다. 고정 증폭기의 출력 및 입사 파장에 비례하는 "램프" 신호는 이어서 퍼스널 컴퓨터 (010)에 장착된 데이터 수신 보드로 보내진다. 소프트웨어가 레이져 주사 및 산란광 스펙트럼의 획득 및 표시를 제어한다. 공명 피크 위치가 검출각에 의존하지 않기 때문에, 산란광 패턴을 정의하기 위한 피크 위치의 이용이 다른 검출 배열에서도 똑같이 유효하다는 것에 주목해야 한다.

본 발명을 설명하기 위해, 스펙트럼 내의 공명 특징의 위치 및 너비에 의해 주어진 입자의 스펙트럼을 특징화하는 것이 유용하다. 이들 특징은 분석되고 특징화될 수 있는 스펙트럼 패턴을 포함한다. 스펙트럼은 피크 탐색, 디컨벌루션 (deconvolution), 피크 피팅 (fitting), 패턴 인식 및 기타 당업계에 공지된 것을 비롯한 다양한 방법에 의해 분석될 수 있고, 이 방법들은 자동화, 컴퓨터화 될 수 있다.

본 발명에 의한 입자 식별의 배후에 있는 원리를 설명하기 위해, 예컨대 도 5에서 처럼 단일 무리의 마이크로입자로부터의 유사한 입자들의 군의 산란 스펙트럼을 고려하는 것이 유용하다. 앞서 언급하였 듯이, 각 무리 내에 크기 및 굴절률의 자연스런 편차가 있을 것이고, 이는 본 발명에 의한 독특한 산란광 스펙트럼을 발생시키는데 유용하게 사용될 수 있다. 동일한 무리로부터의 6 개의 입자들 (무작위 적으로 선택됨) 가운데, 독특하게 구분되는 산란광 스펙트럼이 선택되고 이들 스펙트럼에 기초하여 입자를 식별하는 능력이 매우 뚜렷하다는 것이 쉽사리 확인될 수 있다. 자동화된 스펙트럼 분석 기법 (예컨대, 스펙트럼 코딩, 패턴 인식, 필터링 등)이 피크 위치, 피크 너비, 피크 순서, 상이한 순서의 피크간의 주기, 및 입자들의 집단 내의 각 입자에 대한 독특한 식별 "태그" 또는 "열쇠"를 만드는 데 유용한 편극 의존성 스펙트럼 특성을 비롯한 (이에 한정되지는 않음) 스펙트럼 특징을 추출하기 위해 산란광 스펙트럼에 적용될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다.

미처리된 상용 마이크로입자의 의도하는 변형을 통해 산란광 스펙트럼에 추가적인 풍부함을 더하고 이에 따라 조합의 복합성을 더할 수 있는 기회가 있다는 것에 주목해야 한다. 예를 들어, 각각의 층이 산란 공명 특징을 더하거나 변화시키는 능력이 있는 추가 층 (101)...(103)이 도입될 수 있고, 이것에 의해 식별 코드의 추가적인 조합이 발생한다. 마찬가지로, 자연적이건 의도하여 유도되었건 굴절률의 편차, 두께 또는 두가지 모두에서의 편차는 산란 스펙트럼에서 유용한 편차를 가져올 것이다. 지름만의 편차만이 있는 경우에 스펙트럼 패턴의 이동이 있는 것과는 달리, 이들 편차에 의해 완전히 상이한 스펙트럼 패턴이 발생한다는 것에 주목해야 한다. 공명광 산란 스펙트럼에 풍부함을 더하기 위한 목적으로 층을 추가하는 개념이 실시예 14 내지 19에 설명되어 있다.

본 발명에 의한 마이크로 입자의 식별에 유용하기 위해, 코어 및 층의 크기 및 굴절률은 산란광의 기본적인 미 이론에 의해 부여되는 한계 이내에 해당해야 한다. 간단히 말해, 사실상 어느 크기 및 굴절률의 입자이건 빛과 어느 정도 상호작용을 하지만, 주어진 범위의 파장에 있어서 이들 변수의 특정한 조합만이 본 발명에 따른 식별에 유용한 스펙트럼을 발생시킬 것이다. 또한, 관심대상인 대부분의 검정이 수성 매질에서 행해지기 때문에, 분석을 위해 선택된 파장은 물에 의한 광흡수로부터 최소한의 간섭이 있는 정도여야 한다. 더욱이, 선택된 파장은 아크 램프, 레이져 또는 다이오드 레이져와 같이 이용가능한 광원에 의해 획득할 수 있는 것이어야 한다.

컴퓨터 모델 및 후속적인 실험실적 측정에 의해 본 발명자들은 중요한 변수들 중 몇몇에 대한 유용한 범위를 결정하였다. (1) 추가적인 광학 공명 특징 또는 변화된 특징을 일으키는, 즉 서로에 대해 파장 위치가 변화된 층 (소위 "광학 활성"층)과 (2) 코어의 일체성을 보존하는 역할만을 하거나, 포획 프로브의 부착 또는 비특이적 결합의 억제를 위한 화학적 또는 생물학적으로 적당한 기질로서 작용하는 층 ("화학적 활성" 또는 "생물학적 활성"층) 사이의 구분을 후술한다. 한 층이 "광학적으로 활성"일 뿐만 아니라 적당한 화학적 또는 생물학적 기질인, 두가지 가능을 수행할 수 있는 것도 가능하다. 광학적 활성층의 전형적인 (그러나 비제한적인) 예는 그 층이 약 50 내지 20,000 나노미터 (20 마이크로미터)의 두께를 갖는 것이다.

따라서, 식별가능 마이크로입자의 한가지 바람직한 실시태양은, 약 600 내지 약 1650 나노미터의 파장에서 약 100 마이크로미터 이하, 바람직하게는 약 75 마이크로미터 이하, 더욱 바람직하게는 약 50 마이크로미터 이하의 직경 및 약 1.45 내지 약 2.1, 바람직하게는 약 1.6 및 약 2.1의 굴절률을 갖는 실질적으로 구형이고 투명한 유리 코어를 포함한다.

식별가능 마이크로입자의 또 다른 바람직한 실시태양은 (1) 약 600 내지 약 1650 나노미터의 파장에서 약 100 마이크로미터 이하, 바람직하게는 75 마이크로미터 이하, 더욱 바람직하게는 약 50 마이크로미터 이하의 직경과 약 1.45 내지 약 2.1, 바람직하게는 약 1.6 내지 약 2.1의 굴절률을 갖는, 실질적으로 구형이고 실질적으로 투명한 유리 코어, 및 (2) 추가적인 공명광 산란 특징을 제공할 수 있거나 또는 현존 특징을 변화시킬 수 있는 실질적으로 투명하고 광학 활성인 하나의 층을 포함한다.

식별가능 마이크로입자의 또 다른 바람직한 실시태양은, (1) 약 600 내지 1650 나노미터의 파장에서 약 100 마이크로미터 이하, 바람직하게는 약 75 마이크로미터 이하, 더욱 바람직하게는 약 50 마이크로미터 이하의 직경과 약 1.45 내지 약 2.1, 바람직하게는 약 1.6 내지 약 2.1의 굴절률을 갖는 실질적을 구형이고 실질적으로 투명한 유리 코어, 및 (2) 추가적인 공명광 산란 특징의 제공 및 현존 특징 변화 중 하나 또는 모두가 가능한 실질적으로 투명하고 광학적으로 활성인 층, 및 (3) 앞의 "포획 프로브 및 입자 라이브러리"의 섹션에서 기술한 절차에 유용한 약 1 나노미터 내지 10 마이크로미터의 두께를 갖는, 화학적 또는 생물학적 활성이고 실질적으로 투명한 하나 이상의 층을 포함한다.

식별가능 마이크로입자의 또 다른 바람직한 실시태양은 (1) 약 600 내지 약 1650 나노미터 파장에서 약 100 마이크로미터 이하, 바람직하게는 약 75 마이크로미터 이하, 더욱 바람직하게는 약 50 마이크로미터 이하의 직경 및 약 1.45 내지 2.1, 바람직하게는 약 1.6 내지 약 2.1의 굴절률을 갖는 실질적으로 구형이고 실질적으로 투명한 유리 코어, 및 (2) 추가적인 공명광 산란 특징의 제공 또는 현존 특징의 변화 중 어느 것 또는 모두가 가능한 실질적으로 투명하고 광학적으로 활성인 둘 이상의 층, 및 (3) 앞서 "포획 프로브 및 입자 라이브러리" 섹션에서 기술한 절차에 유용한 약 1 나노미터 내지 10 마이크로미터 두께의 화학적 또는 생물학적 활성인 실질적으로 투명한 하나 이상의 층을 포함한다.

본 발명의 또 다른 바람직한 실시태양은 식별가능 마이크로입자의 다중성 또는 집단인데, 그러한 집단은 생물학적 또는 화학적 검정 등을 비롯한 다수의 응용에서 유용하다. 특정 응용을 위해 선택되는 마이크로입자의 유형 (즉, 코어 및 층들의 수 및 조성)은 샘플의 성질 및 스크리닝되고 검출되는 분석물의 수에 의존한다. 많은 응용, 예컨대 약물 후보에 대한 고출력 스크리닝 또는 질병 바이오마커에 대한 스크리닝에서, 본 발명에 의한 식별가능 마이크로입자 집단의 유용성은 집단 (일반적을 많은 수가 바람직함) 내의 독특한 마이크로입자 수에 직접적으로 연관될 것이다. 상기 실시태양에서 마이크로입자의 집단을 식별하기 위해 사용되는 산란 패턴의 가능한 조합의 수는, 코어의 반경, 층 두께 및 그들 각각의 굴절률이 집단 내에서 다양한 것이 가능하고, 따라서 입자 식별자로 이용되는 산란 패턴의 세트가 매우 풍부하게 생성됨에 따라 매우 커질 수 있다 (약 10⁶ 초과값이 쉽게 얻어짐). 다른 응용, 예컨대 바이오마커 스크리닝 또는 특정 질병 진단에서는, 더 작은 수의 독특한 마이크로입자가 충분할 것이다.

상기 언급되고 도 2 및 3에 묘사된 검출 시스템 및 방법은 한번에 하나의 입자의 고 분해능 산란광 스펙트럼을 측정하는데 적합하다. 이 장치는 본 발명의 원리를 설명하는데 효과적이지만, 광학 프로브와 입자 하나와의 정렬을 필요로하고 일반적으로 수동이며 시간이 소모된다.

단일-입자 검출 수단에 대한 향상은 입자들을 속박하여, 예컨대 튜브 또는 일련의 채널, 만입 (indentation), 또는 기재상의 홈 (groove)에 입자의 선형 또는 장방형의 어레이를 형성하는 것일 것이다. 입자들은 이어서 입자와 입자간에 레이저 빔을 빠르게 이동시킴으로써, 또는 입자를 고정하는 기재를 이동시킴으로써 알려진 순서로 주사될 수 있다. 이런 경우에, 입자들 및 그들의 프로브의 정체는 그들의 스펙트럼 산란 패턴 (또는 다른 임의의 수단)에 의해 우선 정해지고, 이어서 입자들을 알려진 순서로 튜브, 홈, 만곡 또는 채널에 로딩한다. 실시예에서, 입자 조작은 수동 피펫 작업에 의해 이루어진다. 당업자는 자동화되거나 반자동화된 마이크로유체 장치, 및 펌프, 실린지, 제어 밸브 등과 같은 유체 제어 장치의 조합을 비롯한 다른 입자 조작 수단도 적당하다는 것을 인식할 것이다. 입자가 제 자리에 위치한 후, 입자의 정체가 채널 내의 그들의 상대적 위치에 의해 그 이후에 유지되고, 임의로는 그들의 산란 패턴에 의해 확인된다. 유사하게, 검정하는 동안 입자가 정지되어 있는 2 차원 (다른면에서는 비조직화된) 마이크로입자의 배열에서, 입자들의 정체는 그들의 상대적 위치에 의해 유지된다.

훨씬 더 효율적인 검출 수단은 공명광 산란 영상에 기초한다. 이 방법에서, 공명광 산란 스펙트럼은 다수의 입자의 장 (field)으로부터 카메라와 같은 영상화 수단에 의해 동시에 관측된다. 카메라는 입사 파장이 주사됨에 따라 반복하여 입자를 영상화하고, 전형적으로 주사에서 각각의 파장 단계에 대해 하나의 영상을 획득한다. 각 영상은 특정 파장에서 영상 내의 모든 입자로부터의 산란 강도 정보를 포함한다. 그렇게 얻어진 전체 영상 세트를 적절하게 처리함으로써, 각 입자로부터의 산란광이 유도될 수 있다. 카메라는 이 응용에 필요한 속도 및 감도를 얻을 수 있는 임의의 영상 장치일 수 있다. 카메라는 바람직하게는 디지털 카메라이고, 더욱 바람직하게는 2 차원 CCD (전하 결합 장치) 또는 동등한 영상화 수단에 기초한다. 바람직하게는, 카메라 기능 및 데이터 획득은 카메라 및 주사광원에 실시가능하게 연결된 컴퓨터 (이들 목적에 적합한 소프트웨어를 지님)에 의해 제어된다. 추가적으로, 입자를 식별하고 결합을 검출하며 분석물 또는 분석물 군을 식별하기 위해 컴퓨터는 데이터 분석 수단, 즉 피크 탐색, 디컨벌루션, 피크 피팅, 패턴 인식 및 공지된 기타의 것을 비롯한 여러가지 방법을 이용하는 소프트웨어를 포함한다. 전형적인 실험 배치가 도 6 및 7에 도식적으로 나타나 있다. 도 6은 본 발명에 의한 스펙트럼 영상화에 유용한 영상 광학셀 (019)을 나타내고, 도 7은 본 측정을 수행하는데 필요한 관련 구성 요소를 나타낸다. 방법 및 시스템의 세부 사항은 실시예 2에 주어지고 여기에서는 요약이 제시된다. 마이크로입자의 집단은 영상화 광학셀 (019) 내에서 단리되고, 광원으로 주사 다이오드 레이져 (022)를 이용하여 현미경 (021)로 영상화된다. 입자들은 무작위적으로 분포될 수 있거나, 또는 기재상의 홈, 채널 또는 만입 내에 속박됨으로써 튜브 내 또는 선형 또는 장방형 어레이 내에서와 같이 정렬된 형식으로 분포될 수 있다. 관심대상 입자를 영상화 하기 위해 동시에 확대를 한다. 입자 장으로부터의 후방 산란광이 대물 렌즈 (020) 및 디지털 카메라 (026)의 평면 상의 관련 광학 기기에 의해 모이고 영상화된다. 레이져 파장이 주사됨에 따라, 각 파장 단계에서 디지털 영상이 얻어지고 저장되어, 완결된 파장 주사가 모든 입자의 디지털 영상의 시리즈 (각 간격 당 하나의 영상)를 만든다. 소정의 파장에서 입자로부터의 산란 강도는 그 파장에서 그 입자의 산란 영상의 밝기와 관련이 있다. 따라서, 적당한 컴퓨터 영상 처리 및 스펙트럼 분석으로 모든 입자의 완전한 산란 스펙트럼이 주사 동안 획득된 영상 세트로부터 추출될 수 있다. 그러한 영상 세트에서 얻어진 전형적인 하나의 영상의 예가 도 8에 나타나 있다. 관심대상 빛 (산란광) (106)이 입자의 가장자리를 따라 빛의 고리 또는 분절된 고리로부터 발산됨이 나타난다 (문헌 [Lynch, D. K. and Livingston, W., Color and Light in Nature, Cambridge University Press (2001)]에서 이 효과의 논의를 참조). 실시예 2에서 이용된 입사 및 산란광 빔은 서로에 대해 평행한 두개의 편극 축을 갖고 독립적으로 편극된다. 이것은 각각 12, 3, 6 및 9의 숫자에 의해 도 8의 중심 영상에 지시된 바와 같이, 원의 12: 00, 3 :00, 6 :00, 및 9: 00 위치에 대략 중심을 두는 산란광의 부채꼴을 발생시킨다. "2" 및 "6" 구역의 산란광 스펙트럼이 동일하고 "3" 및 "9" 구역의 산란광이 동일하다는 것이 이론으로 예측되고 결과로서 확인된다. 또한, 두 쌍의 부채꼴로부터의 스펙트럼은 서로 상이하다. 이것은 하나의 스펙트럼이 아닌 두개의 실질적으로 독립적인 스펙트럼의 조합에 의해 입자를 식별할 수 있게 하고, 식별가능 입자의 다중성과 또한 식별의 정확도를 향상시킨다.

이 고리로부터의 빛은 영상 처리 기법에 의해 측정하는데, 예컨대 픽셀 (101)의 소단위로부터 영상 세기를 측정하고 각 영상 (102)...(105)에 대해 파장 시리즈에서 반복하는 것이다 (도 9 참조). 픽셀의 소단위는 평균 강도 한계치, 신호/노이즈 또는 기타 스펙트럼 특성 한계치, 기하학적 특징, 중심에 대한 방사상 또는 방위각 위치, 디지털 필터링 등을 비롯한 다양한 수단에 의해 선별될 수 있다. 영상 강도는 당업계에 알려져 있는 바와 같이, 픽셀 평균, 픽셀의 소단위로부터 최대 값을 취하는 것, 신호/노이즈 비와 같은 통계적 기준에 따라 중량 평균하는 것 등을 비롯하여 여러가지 수단에 의해 계산할 수 있다. 실시예 2에 설명된 구체적인 선택 법칙에 의해 획득된, 입자들 중 하나에 대한 그러한 산란광 스펙트럼 (150)의 예가 도 9에 나타나 있다. 이 실시예를 확장함으로써, 큰 마이크로입자의 집단에서 빠르고 효율적으로 산란 스펙트럼을 측정하는 것이 가능할 것이다. 이것은 약물 발견, 고출력 생의학 스크리닝, 게노믹 맵핑 등을 포함하는 응용에 대한 생물학적 또는 화학적 검정에 있어서, 문헌에 보고된 방법보다 특히 유리할 것이다.

분석물의 유용한 검출을 수행하기 위해, 시약을 포함한 입자와 분석물을 효율적으로 접촉시키기에 적당한 수단이 필요하다. 바람직하게는, 입자들은 실험 전반에서 임의의 순서 및 임의의 횟수로 시약 및 분석물과 접촉될 수 있다. 따라서, 검출 셀은 시약 및 분석물이 셀로 흐르게 하는 하나 이상의 포트, 바람직하게는 둘 이상의 포트, 및 시약 또는 분석물 및 흐름 속도의 선택을 가능하게 하는 적당한 흐름 제어 요소들을 필요로 한다. 본 출원의 실시예에서, 입자들이 수동으로 조작되는 피펫을 포함한 검출 셀로 도입되고, 시약 및 분석물이 유연한 튜브로 셀에 연결된 연동 펌프 또는 실린지 펌프에 의한 두개의 포트 ("입구" 및 "출구")를 통해 검출 셀로 운반된다. 펌프 및 임의의 관련된 유동 제어 밸브, 체크 밸브, 유동 측정 장치 등은 수동으로 조작되거나 컴퓨터 제어에 의해 자동으로 조작될 수 있다. 시스템이 입자를 시약 및 분석물과 적당한 방식으로 접촉시키는 것을 가능케 하는 경우, 당업자는 포트, 펌프, 튜브 및 유동 제어 요소의 가능한 많은 배열이 이용될 수 있음을 이해할 것이다.

따라서, 본 발명에 의한 마이크로입자를 식별하는 시스템의 바람직한 실시태양은 (1) 주사 다이오드 레이져광원, (2)분광학적 산란광 영상화 및 미광 차단에 적합한 광학셀, (3) 마이크로입자와 분석물 및 시약의 접촉을 위한 수단, (4) 관심 대상 입자 집단을 함유하는 장을 영상화하기에 적합한 광학 부품을 갖는 현미경, (5) 디지털 카메라 및 모니터, (6) 디지털 영상 획득 하드웨어, (7) 필요한 부품에 실시가능하게 연결된 컴퓨터, 및 (8) 부품을 제어하고 데이터를 획득하며 데이터를 처리하기에 적합한 소프트웨어를 포함하는 영상 시스템을 포함한다.

마이크로입자를 식별하는 방법의 바람직한 실시태양은 (1) 마이크로입자의 집단을 시야 범위에 위치시키고 입자 상에 현미경의 초점을 맞추는 것, (2) 데이터 획득 소프트웨어를 시작하는 것, (3) 시작 파장에서 끝 파장까지 다이오드 레이져를 주사하는 것, (4) 이와 동시에 주사의 각 파장 단계에 대한 시야 범위에서 모든 입자로부터의 산란광을 표현하는 디지털 영상을 포착하는 것, (5) 디지털 영상을 처리하여 각 입자에 대한 산란광 스펙트럼을 생기게 하는 것, (6) 각 입자에 대한 독특한 식별 마커 또는 코드를 발생시키기 위해 스펙트럼 처리 기법을 적용하는 것을 더 포함한다.

분석물의 식별을 위한 방법

분석물의 정체는 그 정체가 알려진 포획 프로브에의 결합을 검출하는 것을 기초하여 결정할 수 있다. 샘플 내의 분석물의 부재 또한 동일한 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 공명광 산란의 측정에 기초한 분석물의 식별을 위해 여러가지 방법이 가능하다.

바람직한 한가지 실시태양에서, 하나 이상의 기지의 포획 프로브가 입자에 적용되고 이어서 입자가 제1 분석 파장 범위에 걸쳐 주사되어 각 입자를 식별하고 포획 프로브의 정체를 식별된 입자와 연관시키는데 이용되는 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐를 발생시킨다. 다른 시각에 주사를 반복함으로써 다수의 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐가 입자들에 대해 생성될 수 있다. 예를 들어, 하나의 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐는 프로브 연결 마이크로입자의 제조시에 획득될 수 있고, 이어서 두번째 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐는 입자가 검정에 사용되기 바로 전에 획득될 수 있다. 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐 중 어느 하나는 마이크로입자 및 부착된 프로브의 식별에 이용될 수 있다. 그러나, 결합을 검출하기 위한 대조 시그너쳐의 역할을 하기 위해 가장 최근에 획득된 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐를 이용하는 것이 바람직하다. 별법으로, 포획 프로브를 적용하기 전에 각 입자에 대한 식별 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키기 위해 입자들은 제1 분석 파장 범위에 걸쳐 주사될 수 있다. 그리고 나서, 하나 이상의 기지의 프로브들이 입자들에 적용된다. 프로브의 정체는 입자의 식별 공명광 산란 시그너쳐와 연관된다. 어느 경우에든 입자들은 1종 이상의 분석물을 함유하고 있는 것으로 예측되는 샘플과 접촉되고, 분석물이 존재하면 포획 프로브와 분석물 사이에 결합이 발생한다. 입자들은 제2 분석 파장 범위에 걸쳐 주사되어 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐를 생성시킨다. 결합 검출을 위해 이용되는 제2 분석 파장 범위는 입자 식별을 위해 이용되는 제1 분석 파장 범위와는 같거나 다를 수 있다. 예를 들어, 특정 피크 또는 다른 스펙트럼 특징에 해당하는 제1 분석 파장 범위의 일부만이 결합을 검출하기 위한 제2 분석 범위로서 이용될 수 있다. 일련의 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐가 결합 후에 연속적으로 입자들을 주사함으로써 실시간으로 생성될 수 있다. 결합의 검출은 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐 중 어느 하나를 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐 중 어느 하나, 바람직하게는 가장 최근에 획득된 것과 비교하거나, 또는 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐 중 어느 하나를 시리즈 내의 이전 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐와 비교함으로써 수행한다. 분석물이 샘플 내에 존재하지 않는 경우, 두개의 비교된 공명 시그너쳐 사이에 실험적 오류 이내에서 차이가 없을 것이다. 그리고 나서, 결합된 각 분석물의 정체는 앞서 기술된 대로 측정된 입자 정체와 하나 이상의 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐를 연관시키는 것에 기초하여 결정할 수 있다. 바람직한 경우, 알맞은 조건 하에서 샘플 내의 분석물의 양에 직접적으로 연관된 결합 분석물의 양은 두개의 비교된 공명광 산란 시그너쳐 사이의 차이, 특히, 결합하면 관찰되는 산란 패턴의 이동 정도를 비교함으로써 측정할 수 있다. 샘플 내의 분석물의 양은 이어서 당업계에 공지되어 있듯이, 기지의 표준을 이용해 준비된 교정 곡선으로부터 결정할 수 있다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 하나 이상의 포획 프로브가 입자들에 적용되는데, 그러면 이들 입자는 튜브 또는 일련의 채널, 만입, 기재상의 홈과 같은 일정한 공간적 어레이로 부착된다. 이런 경우에, 입자 및 부착된 프로브의 정체는 부착된 입자 위치에 의해 결정된다. 그리고 나서, 입자들은 임의적으로 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 주사되어 상기 언급한 바와 같이 하나 이상의 대조 공명광 산란 시그너쳐를 발생시킨다. 상기 입자들은 1종 이상의 분석물을 함유하고 있는 것으로 예측되는 샘플과 접촉되고 입자들은 분석 파장 범위에 걸쳐 한번 이상 주사되어 각 입자에 대한 하나 이상의 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐를 발생시킨다. 결합은 상기 기술한 것 처럼 검출된다. 각 결합 분석물은 부착된 입자 위치에 기초하여 식별된다. 샘플 내에 존재하는 분석물의 양은, 앞서 기술한 바와 같이 두개의 비교된 공명 산란 시그너쳐 사이의 차이를 비교하여 측정할 수 있다.

또 다른 바람직한 실시태양에서, 하나 이상의 포획 프로브가 입자들에 적용되고 입자들은 분석 파장 범위에 걸쳐 주사되어 앞서 언급한 바와 같이, 각 입자에 대하여 하나 이상의 대조 공명광 산란 시그너쳐를 발생시킨다. 앞서 언급하였듯이, 포획 프로브는 각각의 식별된 입자와 연관된다. 상기 입자들은 이어서 검출가능한 표지 (예컨대, 형광 잔기, 화학발광 잔기, 입자, 효소, 방사성 태그, 양자 도트, 발광 잔기, 흡광 잔기 및 삽입 색소)를 포함한 1종 이상의 분석물을 함유하는 것으로 예측되는 샘플과 접촉된다. 각각의 분석물은 상기 기술된 연관성 및 당업계에 공지된 방법을 이용하는 분석물의 검출가능한 표지에 기초하여 식별된다.

입자-기반 결합 또는 해리 측정

앞서 언급한 바와 같이, 생물학 및 화학 검정에서 프로브와 표적 간의 결합을 검출하기 위한 향상된 입자, 방법 및 시스템을 제공하는 것이 본 발명의 목적이다. 이런 관점에서, 현존 입자 기반 검정 시스템에 대한 본 발명의 개선점은, 공명광 산란 패턴이 입자 표면에서 또는 그 근처에서 굴절률 변화에 민감한 현상을 기초로서 갖는다는 것이다. 당해 분야에 알려진 바와 같이 (문헌 [Hightower, R. L. and Richardson, C. B. ,"Resonant Mie scattering from a layered sphere", Appl. Optics 27,4850-4855 (1988)] 및 거기에 언급된 참고문헌 참조), 마이크로입자의 표면에서의 굴절률의 변화는 공명이 발생하는 조건 (구체적으로 파장), 및 유력하게는 측정할 수 있는 현상인 공명의 모양 및 강도를 변화시킨다. 수성 현탁액에서 마이크로입자의 표면에 표적 분석물이 결합하는 것은 물 분자를 일반적으로 물과는 다른 굴절률을 갖는 화학종으로 치환함으로써 관측할 수 있다. 결합된 분자 또는 구조는 일반적으로 물보다 큰 굴절률을 갖을 것이다. 발명자들에 의해 개발된 이론적 모델은 약 40 마이크로미터 직경의 전형적인 마이크로입자에 있어서 단백질 또는 핵산 층의 결합이 대조 또는 비결합 상태에 비해 전체 산란광 패턴의 파장을 이동시키고, 이동의 양은 약 50 나노미터 두께까지의 결합층의 두께에 비례한다는 것을 보여준다. 앞서 확인한 바와 같이, 더 두꺼운 층, 즉 약 10 마이크로미터 이하의 층이 사용될 수 있지만, 약 50 나노미터보다 큰 두께를 갖는 층들은 원래 공명을 변경시킬 것이고, 일부 경우에서는 이동 이외에 추가적인 광 산란 공명을 발생시킬 것이다. 본 현상은 리포터기의 이용을 요하지 않고, 현존 입자-기반 검정 기술에 비해 크게 향상된 점이라는 것에 주목해야 한다. 결합 동안 발생할 수 있는 입자 표면 가까이에서의 다른 변화, 예컨대 프로브 또는 표적의 형태적 변화가 화학적 또는 물리적 기들의 상대적 움직임으로 인한 이동을 초래할 수 있고, 따라서 표면 근처의 질량 분포 변화를 초래할 수 있음을 주목해야 한다. 당업계에 알려져 있듯이, 산란광 스펙트럼이 이버네슨트 광파와 표면 근방의 질량 분포와의 상호 작용에 영향을 받기 때문에, 질량 분포의 변화는 잠재적으로 스펙트럼의 변화를 초래한다. 표적 잔기를 결합했을 때 이버네슨트 광파에 비해 순 질량 분포의 변화는 프로브의 구체적 성질, 표면 전하, 이온성 환경 및 기타 인자에 의해 입자 표면에서 멀어지거나 가까워질 수 있다. 따라서, 생성된 공명광 산란 스펙트럼 이동은 수행되는 검정에 따라 "양" (더 긴 파장 쪽으로)이거나 "음" (더 짧은 파장 쪽으로)일 수 있다.

일반적으로, 공명광 산란법에 의해 분석물의 결합을 측정하는 경우, 앞서 언급하였 듯이 기준선을 설정하기 위해 입자를 분석물에 노출하기 전에 하는 측정과 입자를 분석물에 노출한 후에 하는 측정의 두가지 측정이 행해진다. 결합의 측정은 두 시그너쳐를 비교함으로써 행하므로 일반적으로 "차등" 측정이다. 구체적으로, 분석물이 포획 프로브에 결합하는 것을 검출하기 위해 1종 이상의 포획 프로브가 본 발명의 입자에 적용된다. 앞서 언급한 바와 같이, 입자들은 임의로 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 주사되어 각 입자에 대해 하나 이상의 제1 대조 공명 산란 시그너쳐를 생성시킨다. 이어서 입자들은 분석물을 함유하고 있는 것으로 추측되는 샘플과 접촉된다. 그리고 나서, 입자들은 1회 이상 주사되어 각 입자에 대한 하나 이상의 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐를 발생시킨다. 분석물 결합의 검출은 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐 중 하나 이상을 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐 중 어느 하나, 바람직하게는 가장 최근에 얻어진 것과 비교하거나, 또는 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐와 시리즈 내의 이전의 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐를 비교하여 수행한다. 샘플 내의 분석물의 양은 앞서 기술한 바와 같이 측정한다.

또한, 유사한 차등 측정에 의하여 포획 프로브로부터 분석물의 해리를 검출할 수 있다. 해리를 검출하기 위하여, 프로브 연결 마이크로입자는 1종 이상의 분석물과 접촉하여 분석물이 프로브에 결합하도록 한 후, 입자를 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 주사하여 각 입자마다 하나 이상의 제1 기준 공명광 산란 시그너쳐를 얻었다. 그후, 분석물을 당업계에 공지된 임의의 방법을 사용하여 입자의 포획 프로브로부터 분리한다. 프로브로부터 분석물을 분리하는데 사용되는 방법은 분석물 및 포획 프로브의 정체에 좌우될 것이다. 예를 들어, 핵산 또는 펩티드 핵산 결합 쌍에 있어서, 해리는 이중가닥을 용해하도록 온도를 높이거나 염기를 처리하여 달성할 수 있다. 항체-항원 결합 쌍에 있어서, 분석물을 산 또는 염기 또는 무질서 유발제 (chaotropic agent), 예를 들어 우레아, 구아니딘 히드로클로라이드 또는 소듐 티오시아네이트를 처리하여 해리할 수 있다. 해리 후에, 입자를 분석 파장 범위에 걸쳐서 1회 이상 주사하여 각 입자에 있어서 하나 이상의 제2 해리 공명광 산란 시그너쳐를 얻었다. 해리는 임의의 제1 기준 공명광 산란 시그너쳐에 대한 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐, 또는 임의의 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐를 일련의 이전의 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐와 비교하여 검출한다.

이상적으로, 표적 분석물 분자의 결합 또는 해리로 인하여 임의의 이동이 일어날 수 있다. 본 발명에 사용된 광학 효과는 마이크로입자의 환경에서의 변화 (예를 들어, 매질의 온도, 이온 강도, 굴절률 등)에 민감하기 때문에, 이들 변수의 바람직하지 않은 변화는 그것이 산란광 패턴의 변화에 기여하는 한 "노이즈 (noise)"로 나타난다. 따라서, "신호"로 남는 분석물의 실제 결합으로 인하여 이동만을 일으키는 상기 효과의 보상 수단을 제공하는 것이 본 발명에 있어서 유용할 것이다. 이는 필요한 경우에 예를 들어 비특이적 결합을 최소화하도록 처리되고, 프로브가 부착되지 않은 기준 입자로서 일부의 입자를 사용하여 달성할 수 있다. 이들 기준 입자에서 측정되는 임의의 이동은 환경 변화에 의하여 첫째로 유발되고, 포획 프로브를 함유하는 입자로부터 측정된 이동을 보상하기 위하여 사용될 수 있다.

추가로, 공명광 산란 스펙트럼 이동을 측정할 때, 얻어진 산란 스펙트럼의 파장 부분이 고정밀도로 알려진 것일 것이 필수적이다. 레이져 주사의 개시와 컴퓨터 데이터 획득 사이의 타이밍의 불확실성은 진정한 이동이 일어나지 않았을 때에 데이터의 명백한 스펙트럼 이동을 야기할 수 있다. 그러므로, 스펙트럼 데이터는 임의의 위조의 "타이밍" 이동을 제거하도록 수정되어야 한다. 얼마나 큰 파장 수정이 필요한지를 결정하기 위하여, 파장 등록을 위한 공지되고 안정한 특징을 갖는 기준 스펙트럼을 기록하는 것이 필요하다. 충분한 정밀도를 갖는 파장 수정/등록을 얻기 위하여, 기준 스펙트럼의 스펙트럼 특징을 상당히 예리하게 하는 것이 또한 중요하다. 하기 실시예 3에 상세하게 기재되어 있는 바와 같이, 수정은 에탈론 (etalon) (평행 반-도금 유리 (parallel half-silvered 유리) 또는 석영 플레이트 사이의 다중 반사에 의하여 생성되는 간섭 효과에 의한 파장을 측정하기 위하여 분광기에 사용되는 장치)을 사용하여 매우 정확하게 정렬될 수 있는 파장 기준 신호를 얻을 수 있다.

도 10 내지 16은 본 발명에 따른 에탈론 수정을 사용한 40-마이크로미터 직경 마이크로입자 상의 단백질 층의 검출을 도시한다. 실시예 3-6에서 상세하게 기술한다.

본 발명의 현저한 장점은 입자-기반 분석법에서의 결합-관련 리포터기의 강력한 제거이다. 일부의 비-표지된 결합 방법은 고정된 정렬에 대하여 또한 다른 고정된 표면 상에서 발현하였다 (예를 들어, [Larsson, A. and Persson, B. , "Method for nucleic acid analysis"], 미국 특허 번호 제6,207,381호 및 [Lyon, L. A. et al.,"An improved surface plasmon resonance imaging apparatus", Rev. Scientific Instruments 70, 2076-2081 (1999)]; [Thiel, A. J. et al.,"In situ Surface plasmon resonance imaging detection of DNA hybridization to oligonucleotide arrays on gold surfaces", Anal. Chem. 69, 4948-4956 (1997)]에 따른 평면 바이오센서의 표면 플라스몬 공명을 사용). 그러나, 상기 표지-없는 방법은 입자-기반 분석법을 위한 것이 아니다. 입자-기반 분석법, 형광단, 발색단, 나노입자, 또는 다른 리포터기에 관한 문헌에 기재된 방법은 표적에 결합하거나, 또는 결합 사건의 일부 방법에 연합되어 있다. 그러므로, 통상적인 측정은 입자와 결합된 리포터의 양을 그의 표적과의 연합에 의하여 측정하는 것이다. 측정이 이루어지기 전에, 높은 배경 판독을 제거하기 위하여 과량의 비결합 리포터를 씻어버려야 한다. 이는 본질적으로 말단 지점만이 검출되기 때문에, 시간이 걸리고, 동적 측정의 기회를 없앤다.

본 발명에 있어서, 결합된 물질 만이 산란광 스펙트럼에서의 파장 이동의 수단에 의하여 검출되기 때문에, 비결합 표적의 존재는 어떻게든 측정을 방해하지 않는다. 리포터기는 본 발명에 필요하지 않지만; 표적과 관련된 종은 여전히 결합 상의 입자 표면에 근접한 굴절률의 섭동을 증진함으로써 분석 감도를 증가시키는데 사용될 수 있다. 상기 신호 증폭은 바람직하게는 분석물에 부착된 작은 유전체 입자, 예를 들어 이산화 티탄 또는 실리카 나노입자일 수 있다. 입자는 프로브와 표적 사이의 결합을 방해하지 않을 정도로 충분히 작아야 하고, 또한 산란광 공명의 검출을 방해하지 않을 정도로 충분히 작아야 한다. 통상적으로, 상기 입자는 수 나노미터 내지 수십 나노미터 크기일 것이다.

신호 증폭에 대한 다른 접근법은 화학적 반응, 예를 들어 효소적 반응, 항체/항원 반응, 또는 현위치 핵산 증폭 방법, 예를 들어 회전 원형 (rolling circle) 증폭일 것이다. 상기 방법은 특이적 표적의 결합이 일어날 때 특이적으로 입자 표면에 중량을 추가하도록 야기될 것이다. 신호 증폭종 (signal amplifying species)을 사용하든 사용하지 않든, 임의로 문헌의 방법에 필요한 세척 단계를 수행하고, 가장 중요하게는, 결합의 측정은 또한 실험 과정 중에 실시간으로 할 수 있다. 본 발명의 이러한 특징은 완전히 새로운 종류의 입자-기반 분석 측정, 즉 각각 그 표면 상에 공지된 포획 프로브를 함유하는 식별가능 마이크로입자의 큰 집단 상의 시간-의존적 결합을 신속하고 대량인 평행 측정을 가능하게 한다. 당업자는 약물 표적 스크리닝, 프로테오믹스, 유전자 또는 단백질 발현 분석 등과 같은 상기 다양한 분야에서이 기술을 적용하는 많은 기회를 이해할 것이다.

본 발명의 추가의 장점은, 단일화된 검출 방법 및 시스템이 입자 정체 및 분석물의 결합 정도를 측정하는데 사용될 수 있다는 것이다. 입자의 정체는 스펙트럼 특징의 상대적인 패턴에 함유되고, 특징의 절대적 위치에는 함유되지 않는다는 것을 인식하여야 한다. 표적이 결합하는 경우, 패턴 이동이 분석물 결합의 정도의 지표일 때, 상대적 패턴 (즉, 입자 정체)가 보존된다. 단일화된 검출 방법의 사용은 현재 방법과 비교하여 더 적은 시약, 더 적은 하드웨어 및 간단화된 프로토콜을 갖는 보다 간단한 전체 시스템을 야기하여, 더 신속하고, 비용이 덜 들고, 보다 자동화된 시스템을 야기한다.

소정의 분석물의 존재 및 임의로 농도를 측정하는 최종 단계는 산란 스펙트럼이 이동되는 마이크로입자를 갖는 특이적 프로브 또는 포획 프로브의 연합이다. 앞서 설명한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 이 연합은 공명광 산란 스펙트럼 특징의 패턴에 반사된 마이크로입자의 독특한 정체에 의하여 제공될 수 있다. 이 방법에 의하여, 복합체 샘플의 결합 특성은 복합체 샘플이 결합되는 단일 실험, 및 소정 조건 하에서의 결합 동력학에서 측정할 수 있다. 다르게는, 이하의 실시예에 예시한 바와 같이, 프로브 및 분석물 정체는 당업계에 이미 공지된 다른 기술에 의하여 측정될 수 있고, 소정의 분석물의 존재 및 임의로 농도는 공명광 산란에 의하여 측정될 수 있다.

본 발명은 이하의 실시예에서 추가로 정의된다. 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 실시태양을 나타내며, 단지 예시의 방법이라는 것을 이해하여야 한다. 상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적 특징을 확인할 수 있으며, 그의 취지 및 범위에서 벗어나지 않고, 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 하여 이를 다양한 용도 및 조건에 적용할 수 있다.

일반적 방법

실시예에서 사용된 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 잘 알려져 있고, 문헌 [Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, (1989) (Maniatis) and by T. J. Silhavy, M. L. Bennan, and L. W. Enquist, Expreiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and by Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-interscience, New York, NY (1987)]에 기재되어 있다.

사용된 약어의 의미는 다음과 같다: "min"은 분(들)을 의미하고, "h"는 시간(들)을 의미하고, "μL"은 마이크로리터(들)을 의미하고, "mL"은 밀리리터(들)을 의미하고, "L"은 리터(들)을 의미하고, "nm"는 나노미터(들)을 의미하고, "mm"는 밀리미터(들)을 의미하고, "cm"는 센티미터(들)을 의미하고, "㎛"은 마이크로미터(들)을 의미하고, "Å"는 옹스트롬(들)을 의미하고, "mM"는 밀리몰을 의미하고, "M"은 몰을 의미하고, "mmol"은 밀리몰(들)을 의미하고, "㎛ol"은 마이크로몰(들)을 의미하고, "pmol"은 피코몰(들)을 의미하고, "nmol"은 나노몰(들)을 의미하고, "g"는 그램(들)을 의미하고, "㎍"은 마이크로그램(들)을 의미하고, "mg"은 밀리그램(들)을 의미하고, "V"는 볼트를 의미하고, "dc"는 직류를 의미하고, "g"는 중력 상수를 의미하고, "W"는 와트(들)을 의미하고, "mW"는 밀리와트(들)을 의미하고, "PBS"는 인산-완충 식염수를 의미하고, "rpm"은 분당 회전수를 의미하고, "PEGM"은 폴리(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트를 의미한다.

하기 실시예에 보고된 공명광 산란 스펙트럼 이동은 평균±표준 편차로 주어진다.

실시예 1

공명광 산란에 의한 개별 유리 마이크로입자의 식별

본 발명의 목적은 광학 프로브 시스템을 사용한 공명광 산란 스펙트럼을 사용한 개별 유리 마이크로입자의 식별을 나타내는 것이다.

대략 1.9의 굴절률 및 대략 35-40 ㎛의 직경의 구형 유리 마이크로입자 (Mo-Sci 사, 미주리주 롤라, 제품 번호 GL-0175, Lot 7289552-S1)를 추가의 처리 없이 사용하였다. 대략 0.5 g의 입자를 대략 10 mL의 증류수 중에 위치시키고, 현탁액을 자성 교반 막대를 사용하여 형성하였다. 이 현탁액의 대략 0.1 mL의 샘플을 도 3에 나타난 바와 같이 약 2 mm 두께의 상단 테플론 (Teflon) (등록상표) AF 2400 (델라모어주 윌밍톤 듀폰사 (DuPont Co)) 윈도우(001) 상에 위치시켰다. 현탁액을 임의로 테플론 (등록상표) AF 2400 커버 필름 (약 0.05 내지 0.13 mm 두께)(003)으로 커버하고, 유리 마이크로입자(002)를 상단 윈도우(001)의 상단 표면에 정치하도록 하였다. 그후 셀을 나사로 밀봉하였다. 셀을 도 4의 검출 장치에서 이동 스테이지상에 위치시켰다. 다중-섬유 광학 프로브(005)의 중심 여기 섬유(004) (로마크 인크 (RoMack, Inc.), 버지니아주 윌리암스버그)를 동조가능 (tunable) 다이오드 레이져 광원(006) (Model AQ4321, Ando Electric Co. Ltd. , Germantown, MD)에 연결하였다. 레이져 제어기로의 초퍼 내부를 사용하여 레이져 광을 변조하였다. 외부의 6개의 집속 섬유(007)를 임의로 조합하고, 조합을 광 검출기(008) (모델 2011, 뉴 포커스 인크 (New Focus Inc.), 캘리포니아주 산호세)에 연결하였다. 신호 출력을 차례로 초퍼가 있는 동시 검출 모드에서 사용되는 고정 증폭기(009) (모델 5301A, EG & G 프린스톤 어플라이드 리서치 (EG & G Princeton Applied Research), 테네시주 오크 리지)로 발송하였다. 고정 증폭기의 출력을 퍼스널 컴퓨터(010) (델 프리시젼 420 워크스테이션 (Dell Precision 420 Workstation), 델 컴퓨터 코포레이션 (Dell Computer Corporation), 텍사스주 라운드록)에 장착된 데이터 획득 보드 (PCI-6110E, 내쇼날 인스트루먼트 (National Instruments), 텍사스주 오스틴)로 발송하였다. 통상의 소프트웨어에 기록하여 레이져 주사를 조절하고, 파장의 함수로서 산란광 강도를 획득하고 표시하였다.

단일 입자로부터 산란광 스펙트럼을 획득하기 위하여, 섬유 광학 프로브(005)를 셀 아래에 장착된 현미경-장착된 비디오 카메라(012) (와일드 마크로줌 타입 246634 (Wild Makrozoom Type 246634) 현미경(013) (레이카 마이크로시스템스 (Leica Microsystems), 일리노이주 반노크번)에 연결되어 있는 모델 KP-M2RN CCD 카메라 (히타치 인스트루먼츠 (Hitachi Instruments), 캘리포니아주 산호세))의 보조로 광학셀(014)을 함유하는 이동 스테이지(011)를 이동함으로써 입자 상에 중심을 두었다. 섬유 광학 프로브의 가시 영역의 영상을 비디오 모니터(017) 상에 나타내었다. 추가의 물 층(016)을 사용하여, 임의로 검출 프로브와 샘플 마이크로입자를 연결하였다. 일단 프로브를 단일 입자와 정렬하면, 다이오드 레이져(006)을 파장 (통상적으로 20 초 동안 1570에서 1620 nm)에서 주사하였다. 결과 산란광 스펙트럼을 획득하고, 나타내고, 디스크에 저장하였다. 이 과정을 반복하여 샘플 중의 다른 입자로부터 스펙트럼을 획득하였다. 스펙트럼의 대표적인 세트를 도 5에서 나타내었다. 각 입자가 독특한 산란 스펙트럼을 갖는다고 볼 수 있다. 이들 스펙트럼은 각 입자를 독특하게 식별하는 특징을 추출하기 위하여 추가로 자동화된 스펙트럼 분석을 할 수 있다.

실시예 2

공명광 산란 영상에 의한 유리 마이크로입자의 다중성의 식별

본 실시예의 목적은 스펙트럼 영상 시스템을 사용한 공명광 산란에 의한 유리 마이크로입자의 다중성의 식별을 나타내는 것이다.

표 7에 나타난 스펙트럼 영상 시스템은 다중 유리 마이크로구로부터 동시에 공명광 산란 스펙트럼을 획득하고 처리하기 위하여 사용하였다. 도 3의 광학셀을 도 6에 나타난 바와 같이 상단 테플론 (등록상표) AF 2400 윈도우 아래의 물을 100 부 증류수에 대한 1 부 잉크 (Higgins Fountain Pen India Ink, Item 46030-723, Sanford Co., Bellwood, IL)로 이루어진 잉크 흡수체 용액(018)으로 치환하여 변형하였다. 잉크 용액은 마이크로구와 상호작용하지 않는 임의의 입사광을 흡수하므로, 이로써 산란 및 후방 반사로부터의 광학 노이즈를 감소시켰다. 영상 광학셀(019)은 실시예 1에서와 같이 유리 마이크로입자(002)로 로딩하고, 대물 렌즈(020)가 장착된 시판되는 광학 현미경(021) (모델 DMRXE, 레이카 마이크로시스템스)의 위치에 놓았다. 대략 1.9의 반사율을 갖는 입자를 본 실시예의 입자의 약 70 %를 포함하고; 대략 1.7의 반사율을 갖는 입자는 약 30 %를 포함한다.

광학 시스템으로부터 입자 및 그의 액체 환경을 단리하기 위하여 사용하는 테플론 (등록상표) AF 필름(003)은 임의적이고 분석의 결과에 영향을 주지 않는다. 상기 필름 또는 그의 등가물의 사용은 실험의 길이, 온도, 입자 주위의 용액으로부터의 증발 소실 속도, 실험의 시간 범위, 및 다른 인자에 의하여 결정하였다. 필름(003)을 사용할 때, 추가의 물층을 필름과 광학 프로브 사이에 첨가하여 신호의 효율적인 광학 연결을 제공하였다. 현미경(013)을 광원으로서 다이오드 레이져(022) (Model Velocity 6312, New Focus, Inc.)를 사용한 명시야 조명 (bright field illumination)으로 설치하였다. 레이져의 출력을 4 mm 직경 플라스틱 섬유(023)로 연결하고, 이 섬유의 출력을 현미경의 조명 광학 경로에 위치시키고, 표준 광원을 치환하였다. 섬유를 대략 3 V dc에 의하여 구동되는 소형 "부저 (buzzer)" 모터(024)의 축을 섬유에 직접 부착하여 기계적으로 진동시켰다. 이 진동은 조명 시야의 레이져 반점 패턴을 제거하고, 이는 다르게는 영상 데이터의 획득 및 분석을 방해하지 않을 것이다. 현미경 제조업자에 의하여 장착된 표준 빔 스플리터를 박막-형 빔 스플리터(025) (Edmund Industrial Optics, Barrington, NJ, Item # A39-481)로 치환하여 영상에서 간섭 줄무늬를 추가로 제거하였다.

입자의 다중성로부터 산란 스펙트럼을 동시에 획득하기 위하여, 입자 세트는 첫째로 현미경의 가시 영역에 위치시키고, 대물 렌즈(020)로 초점을 맞추었다. 다이오드 레이져의 파장에 따라서, 이는 레이져 자체 또는 일시적으로 레이져 (예를 들어, 헬륨-네온 레이져)를 대체하는 대체 광원으로 샘플을 조명하여 달성하였다. 일단 목적 입자를 가시 영역에 놓고, 초점을 맞추고, 레이져를 통상적으로 20 초 동안 770 내지 780 nm의 파장에서 주사하였다. 이 주사 동안에, 디지탈 카메라 (026)(모델 KP-M2RN, 히타치 인스트루먼츠)는 각 파장에서 가시 영역의 완전 산란광 영상을 얻었다. 각 영상을 퍼스널 컴퓨터(010) (델 프리시젼 420 워크스테이션)에 장착된 영상 포착 보드(027) (IMAC PCI-1409, 내쇼날 인스트루먼츠)에 의하여 포획하였다. 통상의 소프트웨어에 각 영상을 저장하기 위하여 기록하였다. 파장 주사는 주사 중의 각 파장 마다 하나씩, 한 세트의 연결된 영상을 유발하였다. 통상적인 영상을 도 8에 나타내었다.

파장-연결된 영상의 세트로부터 가시 영역에서 각 입자의 산란 스펙트럼을 결정하기 위하여, 대표 영역 또는 각 입자에 대응하는 영상의 영역, 예를 들어 도 8의 영상에 나타난 각 입자 중심에서 반사광(107)의 밝은 점 주위의 고리-형상 산란광 영상(106)의 부분을 확인하기 위하여 소프트웨어에 기록하였다. 본 실시예에서, 입사광 및 산란광 빔을 독립적으로 서로 평행인 2개의 편극축으로 편극시켰다. 이는 각각 숫자 12, 3, 6, 및 9로 도 8의 중심 영상에 표시되어 있는 바와 같이, 대략 원의 12:00, 3:00, 6:00, 및 9:00 위치에 중심을 갖는 산란광의 부채꼴을 야기한다. "12" 및 "6" 영역으로부터의 산란광 스펙트럼이 등가이고, "3" 및 "9" 영역으로부터의 산란광 스펙트럼이 등가라는 것을 이론적으로 예측하고, 결과로부터 확인하였다. 추가로, 부채꼴의 2쌍으로부터의 스펙트럼은 서로 상이하였다. 이는 단일 스펙트럼 보다, 2개의 실질적으로 독립적인 스펙트럼의 조합으로부터 입자를 확인하는 능력을 야기하여, 식별가능 입자의 다중성을 증가시키고 또한 식별의 정확성을 증가시켰다.

편극-의존 스펙트럼의 개념을 도 9에서 단일 입자에 대하여 도시하였다. "12" 및 "3" 위치에서의 영역은 픽셀이 입자의 산란 스펙트럼을 나타내기 위하여 선택되는, 목적 영역에서 확인되었다. 픽셀은 하기와 같이 선택하였다. 첫째로, 영상의 영역 (예를 들어, 도 9의 12:00)을 보다 큰 영상으로부터 선택하였다. 선택된 구역 내에서, 소프트웨어는 영상 L1, L2, L3... Ln의 적층에서 각 픽셀로 나타나는 스펙트럼을 계산하고, 여기서, 각 영상은 단일 파장에서 필요하였다. 그후, 선택 연산을 사용하여 상응하는 스펙트럼이 선택 기준을 만족하거나 능가하는 픽셀을 선택하였다. 본 실시예에서, 기준은 양 (Max-Min)/Min (Min=0인 경우, 소프트웨어는 Min=1로 설정)이 가장 높도록 선택된 구역에서 10 내지 20 픽셀을 선택하고, 여기서 Max는 스펙트럼 강도의 최대값이고, Min은 스펙트럼 강도의 최소값이다. 그후, 이들 픽셀에 대한 스펙트럼을 평균내었다. 상기 스펙트럼의 예를 도 9의 우측에 나타내었다. "12" 및 "3" 영역에 대한 스펙트럼을 나타내었다. 앞서 표시한 바와 같이, 이들 영역에 대한 스펙트럼은 상이하다.

상기 픽셀 선택 기준을 예로서만 예시하였고, 스펙트럼 피크와 그 아래의 스펙트럼 기준선 사이의 대조의 측정을 나타내었다. 다른 기준 또는 기준의 조합을 또한 보다 큰 세트로부터 특이적 픽셀을 선택하기 위해 사용할 수 있다.

입자의 다중성을 확인하기 위한 독특한 스펙트럼의 용도를 하기 실시예에 의하여 예시하였다. 스펙트럼의 쌍 (각 입자의 "12" 및 "3" 영역에서의 스펙트럼)을 상기 설명한 87개의 상이한 입자로부터 얻었다. 각 스펙트럼은 770 nm 내지 780 nm 파장으로부터 1500 개의 데이터 지점을 함유하였다. 이들 스펙트럼을 입자를 확인하기 위한 "핑거프린트"로서 사용하였다. 각 입자의 "12" 스펙트럼을 세트 중의 모든 다른 입자의 "12" 스펙트럼과 비교하였다. 정량적으로, 상관 계수 제곱 (R-제곱)을 각 입자의 "12" 스펙트럼 및 모든 다른 입자의 "12" 스펙트럼 사이에서 계산하였다. 세트 중의 "3" 스펙트럼 및 모든 다른 "3" 스펙트럼에 대하여 동일한 상관 계산을 수행하였다. 각 입자의 "핑거프린트"의 독특한 정도를, 임의의 입자(즉, 입자 n)가 하기 연산에 따른 세트 중의 임의의 다른 입자 (즉, 입자 m)와 충분히 유사한지 여부를 결정하여 확정하였다.

만일 R-제곱 (Pn, Pm, 12) > T 및 R-제곱 (Pn, Pm, 3) > T

그러면, 입자 매치 = 정확

아니면, 입자 매치 = 오차

여기서:

R-제곱 (Pn, Pm, 12) = 산란광 영상의 "12" 위치로부터의 입자 n 및 입자 m의 산란광 스펙트럼 사이의 상관 계수 제곱

R-제곱 (Pn, Pm, 3) = 산란광 영상의 "3" 위치로부터의 입자 n 및 입자 m의 산란광 스펙트럼 사이의 상관 계수 제곱

T = 역치값

입자 매치 = 입자가 동일한 본질을 갖는다고 간주되는 경우에는 정확하며, 아닌 경우에는 틀림

픽셀 선택 및 입자 유사성 기준을 개발하는 목적은 세트 중의 모든 입자를 독특하게 확인하기 위한 효율적인 수단을 개발하는 것이다. 이상적으로는, 스펙트럼이 충분히 독특하고 역치가 적절하게 선택되는 경우, 상기 연산에 의하여 입자 매치는 존재하지 않아야 한다. 이 실시예에서, 0.75 내지 1.0 사이의 T를 설정하는 것은 모든 87개의 입자에 대하여 완전히 독특한 스펙트럼 기호를 야기한다. 이는 "가성 양성 (false positive)"이 없음을 의미하며, 즉 2 개의 입자는 매치되도록 정렬되었다. 매치의 엄격성이 감소되고 다소 유사한 입자가 현재 동일한 것으로 받아들여지기 때문에, T를 0.60으로 감소시키는 것은 4950개의 조합에서 10 개의 가성 양성을 야기하였다 (정확성은 100 %에서 99.8 %로 감소). 그러므로, 이 실시예에서, 0.75의 역치는 가성 양성을 방지하기에 적절하였다.

또한 "가성 음성"을 시험하는 것이 필요한데, 즉 동일 입자를 다른 시간에 다른 환경 조건 하에서, 또는 픽셀 선택 기준에서 약간 변동을 주어 2회 주사할 때, 선택된 연산에 의하여 매치하지 못하였다. 상기 다양성에도 불구하고 입자를 정확하게 확인할 수 있는 능력을 하기 방법으로 시험하였다. 다른 시간에 또는 픽셀 선택 기준 상의 약간의 변동을 사용하여 입자 중 4개에 있어서, 동일 입자의 상이하고 독립적인 스펙트럼 주사를 영상 데이터 공급원으로서 사용하였다. 이들 입자의 13개의 상이한 변동 전부를 사용하였다. 다시, T = 0.75로 설정하면, 가성 음성이 없는 완벽한 매치를 야기하였다. T를 0.90으로 증가시키면, 4950 조합 중에서 7개의 가성 음성을 야기하고 (정확성은 100 %에서 99.9 %로 감소함), T = 0.95에서 정확성은 100 %에서 99.7 %로 감소한다 (4950 개의 조합 중에서 14 개의 가성 음성 야기). 이는 매우 높은 엄격성 조건을 사용할 때, 약간 다른 조건 하에서 동일한 입자로부터의 스펙트럼의 작은 변동이 매치의 오차를 야기할 수 있다는 사실을 반영한다. 그러나, 본 실시예는 입자의 대표적인 세트에 있어서, 픽셀 선택 기준 및 동일성 기준이 입자 식별의 매우 높은 정확성을 얻을 수 있도록 규정될 수 있다.

여기에 나타내는 실시예는 예시 만을 위한 것이고, 다수의 입자를 확인하고 추적하도록 쉽게 확장되고 자동화될 수 있다. 예를 들어, 개선된 픽셀 선택 기준, 패턴 인식 기술, 및 스펙트럼 코딩 방법은 당업자라면 많은 입자의 장 (field)에서 각 입자를 위치시키고 확인하도록 개발할 수 있다.

실시예 3

공명광 산란을 사용한 비오티닐화 마이크로입자 상의 아비딘의 결합의 검출

본 실시예의 목적은 공명광 산란을 사용한 비오티닐화 유리 마이크로입자로의 아비딘 결합의 검출을 나타내기 위함이다. 아민기를 실란 화학을 사용하여 유리 마이크로입자의 표면에 도입하였다. 그후, 마이크로입자를 술포-NHS-SS 비오틴과의 반응에 의하여 비오티닐화하였다. 비오티닐화 마이크로입자로의 아비딘 결합을 공명광 산란을 사용하여 검출하였다. 입자로부터의 아비딘의 분할 시의 결합 신호의 가역성을 또한 나타내었다.

A. 마이크로입자의 표면 제조:

고-굴절률 유리 마이크로입자 (Mo-Sci사 (Mo-Sci Corp.), 미주리주 롤라, 제품 번호 GL-0175, Lot 7289552-S1, 대략 1.9의 굴절률)을 우선 실온에서 5 분 동안 0.5 M HN0₃로 여과하여 세척하였다. 유리 입자를 그후 하기 일련의 단례로 처리하였다: 탈이온수 헹굼, 실온에서 30 분 동안 5-10 % NaOH 처리, 물 헹굼, 밤새 진공 오븐에서 110 ℃에서 건조.

세척된 유리 마이크로입자를 입자 표면에 아민기를 도입하기 위하여 24 시간 동안 무수 톨루엔 중에서 환류하여 3-아미노프로필 트리에톡시실란 (알드리치 (Aldrich), 위스콘신주 밀워키, 제품 번호 440140, 로트 번호 20515DA)으로 실란화하였다. 반응 혼합물을 여과하여 실란화 마이크로입자를 단리하였다. 그후 실란화 마이크로입자를 차례로 톨루엔 및 아세톤으로 헹구고, 0.5-1 시간 동안 공기 중에서 건조시키고, 4 시간 내지 밤새 오븐에서 110-120 ℃에서 경화하였다.

실란화 마이크로입자 상의 아민기의 표면 커버는 적정에 의하여 결정하였다. 적정 전에, 0.3 g 실란화 마이크로입자를 1 % 아세트산 용액 1 mL을 함유하는 증류수 50 mL에 분산시켰다. 모든 아민기에 적정제가 접근하도록 하여 아세트산을 유리 마이크로입자를 연화하기 위하여 사용하였다. 마이크로입자 분산액을 교반하고, 40 ℃에서 4 시간 동안 가열하였고, 그후 적정 전에 실온으로 냉각하였다. 그후 마이크로입자 상의 표면 아민기를 적정제로서 희석 과염소산 (0.0259 N)을 사용하여 적정하였다. 표면 아민 커버는 마이크로입자의 그램 당 0.045 mmol로 발견되었다. 실란화 마이크로입자는 또한 ESCA (화학 분석을 위한 전자 분광기)를 사용하여 분석하였다. ESCA 결과는 약 5 % 실란화 마이크로입자 표면 원소가 아민기로부터의 질소 원자라는 것을 나타낸다.

B. 마이크로입자 표면 비오틴화:

25 mg/mL 농도의 0.1 M 인산 완충 식염수 (PBS) (pH 7.4)에 용해된 술포숙신이미딜-2-(비오틴아미도)에틸-1,3-디티오프로피오네이트 (술포-NHS-SS-비오틴) (피어스 바이오테크놀로지 인크 (Pierce Biotechnology Inc.), 일리노이주 록포드; 제품 번호 21331, 로트 번호 DD53927)의 2 배 몰 과량 중에 실란화 마이크로입자를 인큐베이션하여 비오틴화를 수행하였다. 마이크로입자를 실온에서 0.5-1 시간 동안 이 용액 중에서 인큐베이션하였다. 표면 아민기는 중성 pH 값에서 N-히드록시술포숙신이미드 (NHS)와 반응시켜서, 마이크로입자 표면으로 비오틴의 공유 결합을 이루었다. 미반응 술포-NHS-SS-비오틴을 마이크로농축기 (Centriplus (등록상표) Centrifugal Filter, Model YM-100, Millipore Corporation, Bedford, MA)를 사용하여 완충액 세척으로 제거하였다. 그후 비오티닐화 마이크로입자를 밤새 실온에서 진공 중에서 건조하였다.

C. 비오틴-아비딘 결합:

실시예 2에 기초한 과정을 사용하여 마이크로입자의 산란광 스펙트럼을 측정하였다. 부분 B의 과정에 의하여 제조된 비오티닐화 마이크로입자를 pH 7.4, 0.4 M (0.1 M 소듐 포스페이트, 0.3 M NaCl) PBS 완충액 중에 분산시켰다. 이 현탁액의 분취량을 광학셀에 위치시켰다. 이 실험에 있어서, 도 6에 나타난 셀(019)을 상단 테플론(등록상표) AF 필름(003)을 제거하고 셀의 측면 상에 유체 유입구 및 배출구 포트를 삽입함으로써 유통 셀 (flow cell)로서 사용하기 위하여 변형하였다. 다수의 마이크로입자를 함유하는 가시 영역을 선택하였다. 그후, 다이오드 레이져 광원(022)을 50 초 동안 770 내지 780 nm에서 주사하였다. 각 파장 간격에서, 가시 영역 내의 모든 입자로부터의 산란광의 디지탈 영상을 영상 포착 보드(027)에 의하여 획득하고, 데이터를 퍼스널 컴퓨터(010)에 장착된 소프트웨어로 저장하고 분석하였다. 가시 영역 내의 몇몇 마이크로입자를, 예를 들어 도 10A에 나타난 바와 같이 순차적인 상세한 스펙트럼 분석을 위하여 선택하였다. 도 10A는 각 파장 단계를 위한 파장 주사 동안에 얻은 1500개의 개별 산란광 영상 중 하나이다. 실시예 2에 기재된 파장-의존적 산란광 영상의 전체 세트를 분석하여, 이 입자로부터의 산란광 스펙트럼을 얻었다. 도 10A의 상단 좌측 마이크로입자로부터의 산란광 스펙트럼을 도 10B에서 나타내었다.

비오티닐화 표면에 아비딘을 결합시키기 위하여, pH 7.4, 0.4 M PBS 완충액 중의 56 ㎍/mL의 플루오르세인 이소티오시아네이트-표지 아비딘 (FITC-아비딘) (시그마 케미칼사 (Sigma Chemical Co.), 미시간주 세인트 루이스, MI, 제품 번호 A2050, Lot091 K4842, FITC/단백질 몰비 = 3.9)으로 이루어진 용액을 약 1.45 mL/분의 유속으로 15 분 동안 비오티닐화 마이크로입자를 통하여 흘렸다. 그후 샘플 셀을 순수 PBS 완충액으로 배수하여 공명광 산란을 결합 전에 사용되는 동일한 매질 중에서 측정하였다. 결합을 플루오르세인 표지의 형광 검출에 의하여 독립적으로 확인하였다.

산란광 스펙트럼 사이의 절대 파장 이동을 정확히 측정하기 위하여, 레이져 주사 유발 타이밍의 변동을 설명하는 것이 필요하다. 이는 매우 정확하게 정렬할 수 있는 파장 기준 신호를 생성하는 2개의 에탈론을 사용하여 수행되며, 이로써 임의의 주사 타이밍 변화를 수정한다. 에탈론 기준 기술은 보다 자세하게 하기 E 부분에서 설명한다. 아비딘 결합 전 후의 파장-정렬된 스펙트럼 비교의 한 예를 도 10C에서 나타내었다. 이동을 스펙트럼 사이의 유도 파장 이동의 함수로서, FITC-아비딘 결합 전 후의 스펙트럼 사이의 상호-상관 계수 제곱 (R-제곱)을 계산하여 정량하였다. 2개의 스펙트럼 중 하나를 다른 것에 대하여 파장을 인공적으로 이동시키고, 그들 사이의 R-제곱값을 계산하였다. 그후 스펙트럼을 다시 이동하고; R-제곱값을 다시 계산하고, 이동와 상관성 사이의 관계를 형성하였다. R-제곱값은 마이크로입자로의 FITC-아비딘 첨가에 의하여 유도되는 자연 이동에 상응하는 파장 이동에서 최대로 예상될 것이다. 이 분석 결과를 이동이 에탈론 상관관계의 최대값과 산란 스펙트럼 상관관계의 최대값 사이의 차이로서 표현되는, 도 11에 나타내었다. 스펙트럼 정렬 후에, 아비딘 결합에 의하여 유도되는 파장 이동은 4개의 독립 입자에 걸친, 또한 2개의 다른 날에 54회의 독립적인 레이져 주사 비교로 이루어진 데이터 세트에 있어서, 0.034±0.007 nm였다.

상기와 같이 동일한 프로토콜을 사용하여 다른 날에 진행한 다른 실험에서 얻은 비교 데이터 세트는, 아비딘의 특이적 결합 시에 0.038±0.010 (N=36 측정, 1개의 입자)의 파장 이동 를 얻어, 스펙트럼 이동 측정의 우수한 일간 (day-to-day)의 재현성을 나타내었다.

비오티닐화 마이크로입자 상의 아비딘 결합을 또한 단백질 측정에 대한 브랜포드 방법 (Bradford method) (Bradford, Anal. Biochem. 72,248-254 (1976))을 사용하여 정량하였다. 비오틴화제로서, 술포-NHS-SS-비오틴을 비오틴-마이크로입자 연결 중의 디술피드 결합에 첨가하고, 전체 아비딘-비오틴 컨쥬게이트를 2-머캅토에탄올 또는 디티오트레이톨 (DTT)과 같은 환원제에 의하여 마이크로입자로부터 분할할 수 있다. 0.4 M PBS (pH 7.4) 중의 50 mM DTT (시그마 케미칼사, 제품 번호 D-9779, 로트 번호 072K0916) 중의 아비딘-결합 마이크로입자의 40 분 인큐베이션 후에, 브랜포드 방법을 사용하여 인큐베이션 상등액에서 아비딘이 유리된 정도를 측정하였다. 결과는 마이크로입자 그램 당 아비딘 2.28 nmol이었고, 이는 마이크로입자 상의 아비딘의 대략 단일층 커버에 해당하였다.

D. DTT 분할:

아비딘 결합으로부터의 공명광 산란 스펙트럼 이동의 가역성을 DTT 처리에 의하여 마이크로입자로부터 비오틴/아비딘 복합체를 제거하여 시험하였다. DTT는 단계 B에서 얻어진 마이크로입자로의 비오틴 연결의 디술피드 결합을 환원시켰다. 0.4 M PBS (pH 7.4) 중의 50 mM DTT 약 40 mL을 광학셀을 통하여 마이크로입자 상으로 통과시키고, 15 분 인큐베이션하였다. 그후 샘플 셀을 0.4 M PBS (pH 7.4)로 배수하고, 공명광 산란을 얻었다. DTT 처리 전 후의 산란 스펙트럼을 도 12에 나타내었고, 상기 설명한 바와 같이 자기상관 함수로서 측정한 상대 이동 (relative shift)를 도 13에 나타내었다. DTT 처리로 유도되는 역이동을 다중 진행 및 다른 마이크로입자에 의하여 확인하였고, 평균은 -0.034±0.007 nm이고, 이는 마이크로입자로부터의 비오틴/아비딘 복합체의 제거를 나타내었다.

이러한 결과는 공명광 산란을 사용하여 마이크로입자의 다중성에서의 단백질 결합 및 유리를 검출할 수 있다는 것을 나타낸다.

E. 에탈론을 사용한 파장 정렬:

공명광 산란 스펙트럼 이동을 측정할 때, 높은 정밀도로 알려진 얻어진 산란 스펙트럼의 파장 성분일 것이 필수적이다. 레이져 주사의 개시 및 컴퓨터 데이터 획득 시작 사이의 타이밍 불확실성은 진짜 이동이 일어나지 않을 때 데이터에서 명백한 스펙트럼 이동을 야기할 수 있다. 그러므로, 스펙트럼 데이터는 임의의 가짜 "타이밍" 이동을 제거하기 위하여 수정되어야 한다. 얼마나 큰 파장 수정이 필요한지 결정하기 위하여, 파장 등록에 있어서 공지되고 안정한 특징을 갖는 기준 스펙트럼을 기록하는 것이 필요하다. 충분한 정밀도를 갖는 파장 수정/등록을 수행하기 위하여, 추가로 기준 스펙트럼의 스펙트럼 특징을 상당히 예리하게 하는 것이 중요하다.

우리는 기준 스펙트럼으로서 평면 에탈론 스펙트럼을 사용할 것을 선택하였다. 에탈론은 평행 반-도금 유리 또는 석영 플레이트 사이의 다중 반사에 의하여 형성되는 간섭 효과에 의한 파장을 측정하기 위한 분광기에 사용되는 장치이다. 우리는 상이한 두께 (특히, 1 mm 및 0.15 mm 두께 보로실리케이트 유리)의 2개의 유리 플레이트를 사용하여, 간섭 패턴에서 높고 낮은 주파수 성분을 얻었다. 이상적인 에탈론의 투과 공식은 하기 에어리 함수 (Airy Function)이다.

여기서,

T = 투과도

R = 거울의 반사도

φ= 광선의 일주 상 변화 (roundtrip phase change)

거울 표면에서 임의의 상 변화를 무시한다면, 하기와 같다:

λ= 빛의 파장

n = 미러 사이의 물질의 굴절률

d = 미러 사이의 거리

θ= 도입광의 빔의 각도

다른 두께의 2개의 에탈론, 및 이로써 상이한 스펙트럼 주파수 (또는 상대적으로 "넓은" 또한 "좁은" 간섭 줄무늬)를 얻게 되는 것을 사용하여, 가성 (false) "타이밍" 이동이 단일의 좁은 간섭 줄무늬 보다 큰 경우, 데이터의 오정렬 (misaligning)의 가능성을 없애게 된다. 레이져 주사를 얻는 각각의 시간에, 에탈론 스펙트럼을 공명광 산란 스펙트럼과 동시에 얻었다. 비교되는 2개의 레이져 주사에 대한 기준 에탈론 스펙트럼을 자기상관 연산에 의하여 분석하여 임의의 가성 스펙트럼 이동의 강도를 결정하였고, 그후 이를 사용하여 공명광 산란 데이터를 수정하였다. 2개의 스펙트럼은 서로 상대적으로 파장이 증가하도록 이동되고, 그 사이의 자기상관 계수를 각 파장 증가에서 평가하였다. 스펙트럼이 가장 잘 정렬할 때 자기상관 계수의 최대값이 발생하고, 기준 에탈론 스펙트럼의 최대 상관관계에 상응하는 파장 이동을 사용하여 상응하는 공명광 산란 스펙트럼에서의 명백한 이동을 수정하였다.

스펙트럼 이동에 대하여 비교될 2개의 산란광 스펙트럼의 예를 도 14A에서 나타내었다. 이와 같이, 이들 스펙트럼은 진짜 스펙트럼 이동을 알 수 없도록 파장-정렬하지 않았다. 각 파장 주사 동안에, 입사광의 일부는 동시에 에탈론으로 발송되고, 이로써 주사 동안에 파장 스케일을 정확하게 반사하는 간섭 패턴을 얻었다. 비교될 2개의 산란광 스펙트럼과 관련된 2개의 에탈론 스펙트럼의 예를 도 14B에 나타내었다. 그후 스펙트럼의 원래 쌍 사이에서 (도 14A), 또한 에탈론 흔적의 쌍 사이에서 (도 14B) 상관관계 분석을 수행하였다. 상기 분석의 예를, 0.185 nm 이동할 원래의 스펙트럼 및 0.145 nm 이동할 에탈론 스펙트럼을 나타내는 도 14C에 나타내었다. 그러므로, 결합으로 인한 산란광 스펙트럼의 순 이동은 이들 2개의 이동 사이의 차이 또는 0.040 nm이다. 파장-수정된 스펙트럼을 도 14D에 나타내었다.

실시예 4

공명광 산란을 이용한 비오틴-아비딘-기반 샌드위치 분석법에서의 다중 단백질 층 결합의 검출

본 실시예의 목적은 공명광 산란을 이용한 유리 마이크로입자 상의 비오틴-아비딘 상호작용에 기초한 다중 단백질 층 결합의 측정을 나타내는 것이다. 비오티닐화 유리 마이크로입자를 아비딘, 비오티닐화 항-소 IgG, 및 소 IgG와 차례로 반응시켰다. 각 단계 후의 결합을 공명광 산란을 사용하여 검출하였다.

A. 표면 제조 및 마이크로입자 표면 비오틴화:

실시예 3 에서 기재한 바와 같이, 동일한 고굴절률 유리 마이크로입자 및 동일한 마이크로입자 표면 비오틴화 프로토콜 (단계 A 및 B)을 사용하였다.

B. 비오틴-아비딘 결합:

공명광 산란을 사용한 현위치 (in situ) 결합 검출에 있어서, 실시예 3에서 기재한 것과 동일한 과정을 사용하였다. 아비딘 결합 전에, 공명광 산란 스펙트럼을 pH 7.4, 0.15 M (0.01M 소듐 포스페이트, 0.14 M NaCl) PBS 중의 비오티닐화 마이크로입자 상에서 얻었다. 그후, pH 7.4, 0.4 M (0.1 M 소듐 포스페이트, 0.3 M NaCl) PBS 완충액 중의 75 ㎍/mL 아비딘 (난백에서 얻음, 시그마 케미칼사, 제품 번호 A9275, 로트 번호 22K7017)으로 이루어진 용액을 약 1.5 mL/분의 유속으로 비오티닐화 마이크로입자를 함유하는 샘플 셀을 통과시켰다. 그후, 셀을 순수 pH 7.4, 0.15 M PBS으로 배수하여, 공명광 산란을 결합 전에 사용되는 동일한 매질 중에서 측정하였다.

C. 아비딘-비오티닐화 항체 결합:

단계 B 후에, pH 7.4, 0.15 M PBS 중의 50 ㎍/mL 비오티닐화 항-소 면역글로불린 G (IgG) [H+L] [염소] (로크랜드 인크 (Rockland Inc.), 펜실베니아주 길버츠빌, 제품 번호 601-1602, 로트 번호 1040, 비오틴화 부위는 전체 IgG 분자에 걸쳐 무작위로, IgG 분자 당 약 10-20개의 비오티닐화 부위로 분포된다)로 이루어진 용액 20 mL을 약 1.5 mL/분 유속으로 샘플 셀을 통과시켰다. 그후 마이크로입자를 비오티닐화 항-소 IgG 용액에 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그후, 샘플 셀을 동일한 PBS로 배수하고, 다중 공명광 산란 스펙트럼을 얻었다.

D. 항체-항원 결합:

단계 C 후에, 0.15 M PBS (pH 7.4) 중의 50 ㎍/mL의 소 IgG (시그마 케미칼사, 제품 번호 1-5506, 로트 번호 042K9023)로 이루어진 용액 20 mL을 약 1.5 mL/분의 유속으로 샘플 셀을 통과시켰다. 그후 마이크로입자를 1 시간 동안 소 IgG 용액 중에서 인큐베이션하였다. 그후, 샘플 셀을 동일한 PBS로 배수하고, 다중 공명광 산란 스펙트럼을 얻었다.

단계 B-D로부터의 스펙트럼의 예를 도 15에서 나타내었다. 모든 스펙트럼을 실시예 3에서 나타낸 바와 같이, 에탈론 수정하여 정렬하였다. 기준 (비결합) 상태와 비교한 단계 B, C 및 D의 스펙트럼 이동은 자기상관 방법 (N=18 측정을 모두 평균)에 의하여 측정하여, 각각 0.031±0.005 nm, 0.069±0.007 nm 및 0.077±0.008 nm이었다. 이러한 결과는 아비딘, 항-IgG, 및 IgG를 개별로 측정할 수 있는 순차적인 결합을 분명하게 나타낸다. 소 IgG 결합에 의하여 유도된 이동 증가는 아비딘 결합 및 비오틴화 항-소 IgG 결합에 의하여 유도된 것보다 작았다. 무작위 배향에서의 아비딘에 결합된 비오티닐화 항-소 IgG 분자 및 그의 항원 결합 말단은 최적으로 정렬되었고, 소 IgG 분자의 결합을 위하여 노출되었다.

E. DTT 분할

마이크로입자로부터 비오틴/아비딘/항-IgG/IgG 복합체를 분할하기 위하여 실시예 3에서 기재한 바와 동일한 DTT 처리를 수행하였다. 역 스펙트럼 이동을 모든 다른 진행 및 마이크로입자에 대하여 관찰하고, 시작 조건에 대한 평균 이동은0.026±0.008 nm (N=18 측정)이었다. 이러한 결과는 DTT 처리 시 대부분의 결합 단백질 층이 마이크로입자로부터 유리되고, 제1 비오틴/아비딘 층의 일부 만이 표면 상에 남아있다는 것을 나타낸다.

실시예 5

공명광 산란을 사용한 단백질 G-기반 샌드위치 분석법에서의 다중 단백질 층 결합의 검출

본 실시예의 목적은 공명광 산란을 이용한 유리 마이크로입자 상의 조절된 배향을 갖는 다중 단백질 층 결합의 측정을 나타내는 것이다. 단백질 G'를 이작용성 가교결합제를 갖는 아민-유도된 마이크로입자와 연결하였다. 단백질 G' 마이크로입자로의 마우스 IgG, 그후 항-마우스 IgG 결합을 공명광 산란을 사용하여 검출하였다.

A. 마이크로입자 표면 상의 단백질 G'의 표면 제조 및 유도:

실시예 3 (단계 A)에 기재된 것과 동일한 고굴절률 유리 마이크로입자 (RI=1.9, Mo-Sci GL-0175) 및 동일한 아미노실란화 프로토콜을 사용하여 마이크로입자 표면 상에 아민기를 도입하였다. 상기 마이크로입자는 본원에서 아민 마이크로입자로 지칭된다. 단백질 G는 그룹 G 스트렙토코커스 (Streptococcal) 균주로부터 만들어지는 박테리아성 막 단백질이다. 이는 포유류 IgG 분자의 불변 영역 (Fc)에 특이적으로 결합한다. 그러므로, 단백질 G를 IgG 분자의 배향을 조절하기 위하여 사용하였다. 단백질 G'는 Fc 결합 부위는 유지하는 반면 알부민, Fab, 및 막 결합 부위가 없는 잘려진 단백질이며, 그러므로 본래 형태 보다 IgG에 더욱 특이적이다. 단백질 G'는 이작용성 링커 디메틸피멜이미데이트-2HCL (DMP)와 아민 마이크로입자로 연결된다. 단백질 G' (시그마 케미칼사 제품 P-4689, Lot 042K15451)를 Tris-HCl 완충액으로부터 동결건조하고, 완충액을 가교결합 완충액 (pH 8.0, 0.1 M PBS)으로 교환하였다. 단백질 G' (1 mg)를 0.5 mL 탈이온수에 용해하고, 완충액 염을 센트리플러스 (Centriplus) (등록상표) YM-10 마이크로농축기 (Millipore Corp., Billerica, MA)을 사용하여 제거하였다. 이 공정을 3회 반복하고, 단백질 G'를 PBS (pH 8.0) 0.5 mL로 다시 녹였다. 동일한 시간에, 약 10 mg의 DMP (피어스 바이오테크놀로지 인크, 일리노이주 록포드; 제품 번호 20666, Lot DH55682)를 pH 8.0, 0.1 M PBS 1 mL에 용해하고, 그후 0.6 g의 아민 마이크로입자를 DMP 용액에 첨가하였다. 이 혼합물을 볼텍스하고, 그후 실온에서 약 0.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 이 시간 후에, 과량의 DMP를 마이크로농축기를 사용하여 PBS 완충액으로 세척해내고, DMP-반응시킨 마이크로입자를 단백질 G' 용액에 전달하였다. 마이크로입자 현탁액을 볼텍스하고, 그후 회전기 상에 장착하고 약 1.5 시간 동안 인큐베이션하였다. 그후, 상등액을 제거하고, 0.2 M Tris 완충액 (pH 8.5)을 첨가하여 반응을 켄칭하고, 용액을 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 그후 마이크로입자를 수집하기 위한 날개 회전자 (swinging-bucket rotor)가 있는 원심분리기르 사용하여, 마이크로입자를 PBS 완충액으로 3회 세척하였다.

단백질 G'가 마이크로입자에 성공적으로 연결되었는지를 확인하고 프로브 밀도를 측정하기 위하여 단백질 G' 마이크로입자를 직접 ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)를 사용하여 시험하였다. ELISA 시험에서, 단백질 G'를 함유하지 않는 일련의 정확하게 칭량한 단백질 G' 마이크로입자 및 대조군 마이크로입자를 다른 농도에서 토끼 항-닭 IgY, (H+L), 퍼옥시다아제 컨쥬게이트 (피어스, 카탈로그 번호 31401, 토끼 IgG 퍼옥시다아제 컨쥬게이트)에서 인큐베이션하였다. 그후, 마이크로입자를 7회 세척하였다. OPD 기질 (피어스, 카탈로그 번호 34006) 용액을 각 단백질 G' 마이크로입자 샘플 및 대조군 마이크로입자 샘플에 첨가하고, 샘플을 15 분 동안 인큐베이션하였다. 이 인큐베이션 후에, 정지 용액 (1 M 황산)을 각 샘플에 첨가하였다. 퍼옥시다아제 컨쥬게이트 표준을 동일한 방식으로 처리하였다. 각 마이크로입자 샘플로부터의 상등액 및 동일 부피의 표준 용액을 96 웰 마이크로타이터 플레이트로 전달하여 흡광도를 측정하였다. 대조군 마이크로입자 샘플로부터의 흡광도는 매우 작았다. 단백질 G' 마이크로입자에 대한 높은 효소 컨쥬게이트 농도에서 얻어진 포화 흡광도를 단백질 G' 표면 밀도를 계산하기 위하여 사용하였다. 각 단백질 G' 분자는 2개의 IgG 분자에 결합한다는 가정 (Akerstrom, B. and Bjorck L. J. Biol. Chem., 261, 10240-10247 (1986)) 하에, 계산된 단백질 G'표면 밀도는 마이크로입자 그램 당 0.44 pmol이었다. 용액 중의 자유 효소의 활성에 비교하여, 고정 효소의 활성은 감소할 수 있다. 그러므로, ELISA 결과는 자유 효소에서 얻어진 표준 곡선에 기초하여 정확하지 않았고, 효소 활성-감소 인자를 측정하여 활성 수정에 대하여 사용하였다. 결합 실험을 토끼 항-닭 IgY, (H+L), 퍼옥시다아제 컨쥬게이트의 매우 희석된 용액 중의 과량의 단백질 G' 마이크로입자와 인큐베이션하여 수행하였다. 입자에 의하여 얻어진 효소 활성은 단백질 G' 마이크로입자로의 결합 전 후에 퍼옥시다아제 컨쥬게이트 용액 중의 효소 활성의 차이로부터 측정하였다. 그후, 입자 상의 효소 활성을 측정하였다. 효소 활성-감소 인자는 입자에서 측정된 효소 활성에 대한 단백질 G' 입자에 의하여 얻어진 효소 활성의 비로서 계산하였다. 효소 활성-감소 인자는 3회의 시험에서 26, 19 및 18로 측정되었다. 19의 중간 활성-감소 인자를 사용하여 단백질 G'표면 밀도를 수정하여, 마이크로입자 그램 당 8.36 pmol의 수정된 단백질 G'표면 밀도를 야기하였다.

두번째 접근법은 또한 프로브 표면 밀도를 측정하기 위하여 사용하였다. 단백질 G'가 DMP를 갖는 아민 마이크로입자와 연결하는 것과 동일한 방법으로, 단백질 G, 알렉사 플루오르 (Alexa Fluor) 488 컨쥬게이트 (몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes), 카탈로그 번호 P-11065)를 분해가능 이작용성 링커 3,3'-디티오비스(술포숙신이미딜프로피오네이트) (DTSSP, 피어스, 카탈로그 번호 21578)를 갖는 아민 마이크로입자와 연결하였다. 그후, 단백질 G, 알렉사 플루오르 488 컨쥬게이트를 37 ℃에서 50 mM DTT로 밤새 분해하여 완전한 분할을 보장하였다. 분할로부터의 상등액을 분광광도계로 조사하고, 494 nm에서의 흡광도를 사용하여 제조업자가 제시한 흡광 계수인 71,000 cm^-1M^-1를 사용하여 알렉사 플루오르 488 염료의 농도를 계산하였다. 그후 단백질 G 농도를 제조업자에 의하여 측정된, 단백질 몰 당 2.3 몰의 염료의 비로부터 계산하였다. 결과는 단백질 G 밀도가 수정된 ELISA 결과 보다 약 150 배 큰, 마이크로입자 그램 당 1.3 nmol이라는 것을 나타낸다. 이 결과는 효소 활성-감소 인자가 마이크로입자 상의 단백질 G 프로브 밀도 측정법에 대한 ELISA 결과를 수정하기에 충분하지 않을 수 있다는 것을 제시하였다. 그러나, ELISA 시험은 모든 연결 화학에서 제조되는 마이크로입자에 적용할 수 있고, 본 개시내용의 대부분의 유도된 마이크로입자 상에서 프로브 밀도 측정에 사용하였다. ELISA 결과는 배치 간의 프로브 유도 효율을 비교하는데 유효하지만, 프로브 밀도의 절대적인 숫자를 결정하는데는 적당하지 않을 수 있다.

B. 마우스 IgG 결합:

실시예 3에서 기재한 바와 동일한 과정을 공명광 산란의 현위치 결합 검출에 대하여 사용하였다. 마우스 IgG 결합 전에, 공명광 산란 스펙트럼을 기준 스펙트럼으로서 25 mM (10 mM 소듐 포스페이트, 15 mM NaCl) PBS 완충액 (pH 7.2) 중의 단백질 G' 마이크로입자에서 얻었다. 그후, 동일한 PBS 완충액 (pH 7.2) 중의 50 ㎍/mL 마우스 IgG (시그마 케미칼사, 제품 번호 15381, 로트 번호 042K9027)로 이루어진 용액 15 mL을 0.5 시간 동안 약 1.5 mL/분의 유속으로 순환하면서 단백질 G'마이크로입자를 함유하는 샘플 셀을 통과시켰다. 그후, 샘플 셀을 순수 pH 7.2 PBS 완충액으로 배수하고, 공명광 산란을 결합 전에 사용된 것과 동일한 매질 중에서 측정하였다.

C. 항 마우스 IgG 결합:

단계 B 후에, pH 7.2, 25 mM PBS 중의 40 ㎍/mL Fab 특이적 염소 항-마우스 IgG (시그마 케미칼사, 제품 M 6898, Lot 012K4811)로 이루어진 용액 15 mL을 0.5 시간 동안 약 1.5 mL/분의 유속으로 순환하면서 샘플 셀을 통과시켯다. 그후, 샘플 셀을 동일한 PBS로 배수하고, 공명광 산란 스펙트럼을 다수회 진행하였다.

상관관계 결과는 단계 B (단백질 G' 마이크로입자 상의 마우스 IgG 결합) 후의 공명 이동이 기준 (비결합) 상태에 비교하여 0.054±0.007 nm이고, 단계 C (마우스 IgG로의 항 마우스 IgG 결합) 후의 이동은 기준 (비결합) 상태에 비교하여 0.111±0.016 nm 였다는 것을 나타낸다. 그러므로, IgG 분자 배향을 조절하면, 이동은 결합 분자의 크기에 비례하였다.

실시예 6

공명광 산란을 사용한 실시간 결합 검출

본 실시예의 목적은 공명광 산란을 사용한 유리 마이크로입자 상의 단백질 결합의 실시간 검출을 나타내는 것이다. 단백질 G' 마이크로입자로의 마우스 IgG의 결합은 시간의 함수로서 측정하였다.

A. 유리 마이크로입자 상의 단백질 G'의 표면 제조 및 유도:

실시예 5 (단계 A)에서 기재한 바와 동일한 고굴절률 유리 마이크로입자 (RI=1.9, Mo-Sci GL-0175) 및 동일한 단백질 G' 유도 프로토콜을 사용하여 단백질 G' 마이크로입자를 제조하였다.

B. 마우스 IgG 결합의 실시간 검출:

공명광 산란으로 현위치 결합 검출을 하기 위하여, 실시예 3에 기재한 바와 동일한 과정을 사용하였다. 마우스 IgG 결합 전에, 기준 스펙트럼으로서 25 mM (10 mM 소듐 포스페이트, 15 mM NaCl) PBS 완충액 (pH 7.2) 중의 단백질 G' 마이크로입자의 공명광 산란 스펙트럼을 얻었다. 그후, 동일한 pH 7.2 PBS 완충액 중의 마우스 IgG (시그마 케미칼사, 제품 번호 15381, 로트 번호 042K9027) 15 mL을 약 30-60 분 동안 약 1.5 mL/분의 유속으로 순환하면서 단백질 G' 마이크로입자 함유 샘플 셀을 통과시켰다. 매 5 분 마다, 순환을 정지하고, 공명광 산란 스펙트럼을 얻고, 순환을 다시 시작하였다. 그러므로, 결합 동력학을 실시간으로 추적할 수 있다. 인큐베이션 마지막에, 샘플 셀을 순수 pH 7.2 PBS 완충액으로 배수하고, 공명광 산란을 결합 전에 사용된 것과 동일한 매질 중에서 측정하였다. 이러한 실시간 결합 검출 실험을 10 ㎍/mL, 50 ㎍/mL 및 500 ㎍/mL의 마우스 IgG 농도에서 수행하였다. 자기상관 분석을 사용하여 공명 파장 이동을 얻었다.

시험된 마우스 IgG 농도에서 시간에 따른 공명 이동의 변화를 나타내는 본 연구의 결과를 표 1에 요약하고, 도 16에서 나타내었다. 각 데이터 지점은 3-4 개의 상이한 마이크로입자의 평균이고, 오차 막대 (error bar)는 측정의 표준 편차를 나타낸다. 데이터에서 볼 수 있는 바와 같이, 보다 높은 마우스 IgG 농도를 시험할수록, 시간에 따라 증가된 공명 이동이 보다 빨라지고, 높은 결합 속도를 나타낸다. 데이터는 공명이동, 및 그 결과 결합이, 마우스 IgG 농도가 50 ㎍/mL를 넘을 때 최대값에 도달하고, 10 ㎍/mL 농도에서는 포화 결합 수준의 약 70 % 만이 관찰되었다. 그러므로, 공명광 산란 검출은 부단일층 (submonolayer) 결합을 검출하기에 충분히 민감하다.

과정 중에 혼합이 포함되지 않았기 때문에, 도 16에 나타난 결합 동력학은 분산 제한된 결합 속도 만을 반영한다. 생물학적 결합 동력학은 질량 전달 속도를 개선하기 위하여 미세유체 혼합 장치를 사용하여 실시간으로 측정할 수 있다.

완충액 배수 후에 측정된 공명 이동은 인큐베이션 말기이며 완충액 배수 전에 얻어진 것과 동일하였다. 이 결과는 완충 식염수 중의 저농도의 단백질 분자가 스펙트럼이 얻어지는 매질로부터의 스펙트럼 상에 거의 영향이 없다는 것을 나타낸다. 그러므로, 마우스 IgG 용액에서 얻어지는 동력학 데이터를 위한 출발 지점 및 0 이동 기준으로서 순수 완충액에서 얻어지는 스펙트럼을 사용할 수 있다. 혈청 또는 세포 추출물과 같은 실제 생물학적 샘플에 있어서, 공명광 산란 스펙트럼은 단지 매질 변화 때문에 공명광 산란 스펙트럼이 이동할 것이다. 이런 경우에, 생물학적 샘플의 출발 지점은 실시간 검출의 0 이동의 기준 지점으로서 사용할 것이다.

실시예 7

공명광 산란 검출을 사용한 혈청 배경에서의 단백질 결합 분석법

본 실시예의 목적은 공명광 산란을 사용한 혈청 배경에서의 특이적 결합 검출을 나타내는 것이다. 마이크로입자를 폴리(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트 (PEGM)로 코팅하여 비특이적 결합을 감소시키고, 그후 형광 염료, 알렉사 플루오르 (등록상표) 488를 PEGM 코팅의 히드록시기로 연결하였다. 형광 염료-연결된 입자에 결합한 항 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 항체를 공명광 산란을 사용하여 희석 토끼 혈청에서 검출하였다.

A. 표면 개시된 ATRP (원자 전달 라디칼 중합)을 사용한 마이크로입자 상의 비특이적 결합 저항성 층의 형성

혈청 및 세포 추출물과 같은 실제 생물학적 샘플은 보통 고농도 단백질 배경 중의 분석물을 함유한다. 마이크로입자로의 배경 단백질의 비특이적 결합은 가성 진단 결과를 야기하므로, 방지되어야 한다. 표면 개시된 ATRP에 의하여 형성된 폴리(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트 (PEGM) 코팅 층을 사용하여 마이크로입자로의 비특이적 결합을 감소시켰다.

허스만 등 (Husseman et al.) (Macromolecules 32, 1424-1431 (1999))에 의하여 기재된 합성 과정을 사용하여 개시제 5-트리클로로실릴 펜틸 2-브로모-2-메틸 프로피오네이트를 제조하였다. 그후, 개시제를 하기와 같이 세척된 유리 마이크로입자와 반응시켰다. 실시예 3 (단계 A)에 기재된 바와 동일한 고굴절률 유리 마이크로입자 (RI=1.9, Mo-Sci GL-0175) 및 동일한 세척 과정을 사용하였고, 마이크로입자를 사용 전에 진공 오븐 중에서 밤새 110 ℃에서 건조하였다. 모든 유리 제품을 세척하고, 2 시간 내지 밤새 오븐에서 110 ℃에서 건조하였다. 100 밀리리터의 건조 톨루엔 (EM Science, 제품 번호 TX0732-6)을 250 mL 둥근 바닥 플라스크에 첨가하고, 45 ㎕의 피리딘 (알드리치, 제품 번호 P57506, 배치 번호 03012LA, 사용 전에 4 Å 분자체에서 밤새 건조)을 첨가하였다. 그후, 8 g의 건조, 세척된 마이크로입자 및 250 ㎕의 5-트리클로로실릴 펜틸 2-브로모-2-메틸 프로피오네이트 개시제를 첨가하였다. 플라스크를 유리 정지제로 밀봉하고, 반응을 4 시간 동안 실온에서 격렬하게 교반하면서 진행하였다. 마이크로입자를 여과에 의하여 단리하고, 100 mL의 톨루엔 및 100 mL의 아세톤으로 차례로 헹구었다. 그후, 마이크로입자를 수집하고, 2 시간에서 밤새 오븐에서 110 ℃에서 건조하고 경화하였다.

그후, 중합을 위하여 개시제-로딩된 마이크로입자를 준비하였다. ATRP를 수용액에서 실온에서 수행하였다. 조성물을 본원에 참조문헌으로 삽입되어 있는, 후앙 (Huang)의 동시 진행 중인 미국 특허 출원 번호 60/451068호의 기재를 기초로 최적화하였다. 46 g의 폴리(에틸렌 글리콜) 메타크릴레이트 (PEGM 단량체, 알드리치, 제품 P409537, 배치 15304CB, 평균 Mn = 360) 및 120 mL의 탈이온수를 250 mL 둥근 바닥 플라스크에 첨가하였다. 용액을 질소 하에서 0.5 시간 동안 교반하였다. 그후, 0.46 g의 바이피리딜 (알드리치, 제품 D216305, 배치 08015CO) 및 28 mg의 CuCl₂ (알드리치, 제품 203149, Lot 04907EA)를 첨가하였고, 무색 용액은 밝은 청색으로 변하였다. 그후, 140 mg의 CuCl (알드리치 224332, Lot 08319 JA)를 첨가하였고, 용액은 암갈색으로 변하였다. 질소 세척을 추가의 15 분 동안 계속하고, 그후 2 g의 개시제-로딩된 마이크로입자를 첨가하였다. 반응을 질소 분위기 하에서 밀봉하였고, 4 시간 동안 진행항ㅆ다. 이 시간 후에, 마이크로 입자를 여과에 의하여 단리하고, 풍부한 양의 탈이온수로 색이 헹구어질 때까지 헹구었다. 그후, 마이크로입자를 수집하고, 실온에서 진공 중에서 밤새 건조하였다.

마이크로입자 상의 PEGM 코팅의 존재를 ESCA (화학 분석을 위한 전자 분광기) 및 ToF-SIMS (비행 시간형 1차 이온 질량 분광기 (Time of Flight Secondary ion Mass Spectroscopy)) 영상을 사용하여 확인하였다. ESCA로, 샘플 표면의 상단 100 Å의 원소 조성물을 얻을 수 있다. ESCA에 의하여 결정한 PEGM 코팅된 마이크로입자의 표면의 원소 퍼센트 및 노출된 (bare) 유리 마이크로입자의 원소 퍼센트를 표 2에 나타내었다. 표의 데이터로부터 볼 수 있는 바와 같이, 노출 유리 마이크로입자에 존재하는 가장 대부분의 원소, 예를 들어 Ba, Ti, B, Ca 및 Si가 PEGM 코팅된 마이크로입자의 표면 상에 현저하게 낮은 수준으로 존재한다는 것을 검출되거나 발견되지 않았으며, C가 발견된 주요 원소였다. 이 결과는 마이크로입자의 표면 상의 PEGM 코팅의 우수한 커버 정도를 나타낸다. ToF-SIMS 영상화는 표면 상의 화학종의 공간 분포를 나타낼 수 있고, 개별 마이크로입자 상의 PEGM 코팅의 균일성을 확인하는데 사용할 수 있다. ToF-SIMS 영상화의 결과는 그 표면 상의 큰 금속 이온의 몇몇의 작은 점을 제외하고는 마이크로입자의 표면의 대부분이 PEGM 코팅으로 커버되어 있다는 것을 나타내었다.

PEGM 코팅된 마이크로입자로의 단백질의 비특이적 흡착을 0.4 M PBS 완충액 (pH 7.4) 중의 50 ㎍/mL 아비딘-FiTC 컨쥬게이트 (시그마 케미칼사, 제품 번호 A2050, Lot: 091K4842)로 이루어진 용액으로 입자를 노출시켜서 시험하였다. 노출 마이크로입자를 대조군과 같이 작용하도록 동일한 방법으로 처리하였다. 마이크로입자의 형광 현미경 조사는 PEGM 코팅된 마이크로입자가 대조군에 비교하여 아비딘의 비특이적 흡착이 현저하게 감소된다고 나타낸다. 비특이적 결합의 감소는 PEGM 코팅된 마이크로입자 및 대조군 마이크로입자 둘다를 아비딘-FITC 용액에 노출하기 전에 0.25% BSA 차단 단계로 처리한 후에 보다 크다.

B. PEGM 코팅된 마이크로입자의 활성화 및 그에 대한 형광 염료 프로브의 연결

PEGM 코팅을 추가로 활성화하고, 트리클로로-s-트리아진 (Abuchowski, A. etal., J. Bio. Chem. 252, 3578-3581, and 3582-3586 (1977)), N, N'-카르보닐디이미다졸 (Bartling, G. J. et al. Nature (London), 243, 342-344 (1973)), 및 유기 술포닐 클로라이드, 예를 들어 토실 클로라이드 및 트레실 클로라이드 (Nilsson, K. and Mosbach, K. Methods in Enzymology, 1984, 104, pp 56-69)의 사용을 포함하는, 많은 다른 화학적 방법을 사용하여 생물학적 리간드로 컨쥬게이션하였다. 이 과정은 통상적으로 PEGM 쇄의 히드록실기와 반응시켜, 단백질 분자 중의 아민 또는 술프히드릴기와 같은 친핵성 잔기와 쉽게 연결할 수 있는 반응성 친전자성 중간체를 생성하여 수행하였다. 중성 pH 및 온화한 조건에서 연결된 제품의 높은 수율을 제공하고, 우수한 안정성을 야기하기 때문에 트레실 클로라이드를 선택하였다.

리간드 예로서 알렉사 플루오르 (등록상표) 488을 사용하는, PEGM 코팅된 마이크로입자의 활성화 및 리간드 연결에 사용하기 위한 프로토콜은 다음과 같다. 상기와 같이 제조된 건조 PEGM 코팅된 유리 마이크로입자 (2 g)를 이하의 각각 50 mL로 연속하여 세척하였다: 30:70 및 70:30의 아세톤: 물 (v/v), 아세톤으로 2회, 건조 아세톤으로 3회 (아세톤 1 리터 당 분자체 25 g의 비율로 밤새 4Å 분자체로 건조). 그후, PEGM 코팅된 유리 마이크로입자를 7 mL of 건조 아세톤 및 350 ㎕ of 건조 피리딘 (사용하기 전에 4Å 분자체로 밤새 건조시킴)을 함유하는 건조 플라스크로 전달하였다. 이 혼합물을 자성 교반기를 사용하여 교반하고, 얼음/물 배쓰에 두었다. 트레실 클로라이드 (360 ㎕) (알드리치, 제품 번호 324787, 배치 번호 01910AB)를 약 10 분에 걸쳐 현탁액에 적가하였다. 그후, 교반하면서 1.5 시간 동안 얼음/물 배쓰에서 반응을 계속하였다. 반응 종결 시에, 마이크로입자를 여과에 의하여 단리하고, 이하의 각 50 mL로 2회 세척하였다: 아세톤; 아세톤 중의 30%, 50%, 및 70% (v/v)의 5 mM HCl; 마지막으로, 1 mM HCl. 활성화된 마이크로입자를 실온에서 진공 중에서 잠시동안 건조시키고, 4 ℃에서 건조기 중에서 보관하였다.

알렉사 플루오르 (등록상표) 488 염료를 하기 과정을 이용하여 연결 완중액으로서 0.2 M 소듐 포스페이트 완충액 (pH 8.2) 중의 트레실화 마이크로입자에 연결하였다. 1 mg의 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 히드라지드, 나트륨 염 (몰레큘라 프로브스 인크, 오레곤주 유겐; 제품 번호 A-10436, lot 34C1)을 연결 완충액 2 mL에 용해하였다. 트레실화 마이크로입자 (0.5 g)를 상기와 같이 마이크로농축기를 사용하여 차가운 연결 완충액으로 잠시동안 세척하고, 그후 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 용액으로 전달하였다. 연결 반응을 36 시간 동안 4 ℃에서 교반하면서 진행하였다. 그후 상등액을 피펫으로 제거하고, 반응을 0.1 M Tris-HCl (pH 8.5) 완충액 중의 0.1 M 머캅토에탄올로 5 시간 동안 켄칭하였다. 마이크로입자를 0.2 M 소듐 아세테이트-0.5M NaCl, pH 3.5 완충액; 0.5 M NaCl 용액; 증류수; 및 0.2 M, pH 7.5 PBS 완충액로 차례로 세척하였다. 마이크로입자를 실온에서 잠시동안 건조시키고, 이후의 사용을 위하여 냉장고에 보관하였다.

알렉사 플루오르 (등록상표) 488 마이크로입자를 실시예 5, 단계 A에 기재된 바와 동일한 과정을 사용하여 연결의 성공을 확인하고 프로브 밀도를 측정하기 위하여 직접 ELISA로 시험하였다. 항-알렉사 플루오르 (등록상표) 488 토끼 IgG 퍼옥시다아제 컨쥬게이트를 활성화 퍼옥시다아제 키트를 더한 이지-링크 (상표) (EZ-Link^TM Plus Activated Peroxidase Kit) (피어스, 카탈로그 번호 31489) 및 항-알렉사 플루오르 (등록상표) 488 토끼 IgG (몰레큘라 프로브스 (카탈로그 번호 A-11094))를 사용하여 제조하였다. 대조군 마이크로입자 샘플로부터 매우 낮은 흡광도가 관찰되었고, 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 마이크로입자에 대한 높은 효소 컨쥬게이트 농도에서 얻어진 포화 흡광도를 사용하여 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 표면 밀도를 계산하였다. 계산된 표면 밀도는 마이크로입자 그램 당 0.42 pmol이었다. 이 경우에, 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 표면 밀도를 수정하기 위하여 효소 활성-감소 인자를 측정하려 하지 않았다.

C. 혈청 배경에서의 항체 결합 검출:

항-알렉사 플루오르 (등록상표) 488 토끼 IgG 분획을 몰레큘라 프로브스, 인크 (제품 번호 A-11094, 로트 번호 7581)에서 얻고, 10 mg/mL 토끼 혈청으로 농도 50 ㎍/mL 농도로 희석하여 단계 B에서 제조된 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 염료 연결된 마이크로입자로의 그의 결합을 시험하였다. 50 mg/mL 단백질을 함유하는 토끼 혈청 (시그마 케미칼사, 제품 R9133, lot 041 K9089)을 pH 7.2, 25 mM (10 mM 소듐 포스페이트, 15 mM NaCl) PBS 완충액으로 희석하여 10 mg/mL 단백질 농도를 얻었다. 공명광 산란으로 결합 검출하기 전에, 약 50 mg의 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 염료 연결된 마이크로입자를 10 mg/mL 토끼 혈청 용액 1.5 mL과 1 시간 동안 인큐베이션하여, 비특이적 결합 부위를 추가로 차단하였다. 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 염료 연결된 마이크로입자를 PBS 완충액으로 2회 세척하고, 그후 PBS 완충액 중에 분산하였다. 이러한 분산된 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 염료 연결된 마이크로입자를 결합 실험을 위하여 샘플 셀에 로딩하였다. 공명광 산란으로 현위치 결합 검출을 하기 위하여, 실시예 3에서 기재한 바와 동일한 과정을 사용하였다. 토끼 IgG 결합 전에, 기준 스펙트럼으로서 25 mM (10 mM 소듐 포스페이트, 15 mM NaCl) PBS 완충액 (pH 7.2)의 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 염료 연결된 마이크로입자에서 공명광 산란 스펙트럼을 얻었다. 그후, 동일한 pH 7.2 PBS 완충액 중의 10 mg/mL 토끼 혈청 단백질을 함유하는 용액 12 mL을 비특이적 결합을 시험하기 위하여 0.5 시간 동안 약 1.5 mL/분의 유속으로 순환하면서 샘플 셀을 통과시켰다. 그후 샘플 셀을 순수 pH 7.2 PBS로 배수하였고, 기준 스펙트럼을 얻은 것과 동일한 매질 중에서 공명광 산란을 측정하였다. 그후, 10 mg/mL 토끼 혈청 중의 50 ㎍/mL의 항-알렉사 플루오르 (등록상표) 488 토끼 IgG 함유 용액 10 mL을 0.5 시간 동안 약 1.5mL/분의 유속으로 순환하면서 샘플 셀을 통과시켰다. 인큐베이션 종결 시에, 샘플 셀을 순수 pH 7.2 PBS로 배수하였고, 기준 스펙트럼을 얻은 것과 동일한 매질에서 공명광 산란을 측정하였다.

자기상관 분석을 사용하여 혈청 배경 시험 단계 및 항-알렉사 플루오르 (등록상표) 488 토끼 IgG 결합 단계를 위한 공명 파장 이동을 얻었다. 배경 시험 단계 및 토끼 IgG 결합 단계를 위한 평균 이동은 각각 0.004±0.004 nm 및 0.037±0.006 nm이었다. 이들 값은 3개의 다른 마이크로입자 및 9개의 다른 전-후 레이져 주사 쌍의 평균이다. 파장 이동 결과는 배경 시험 단계에서 이동이 거의 없었음을 나타내고, 비특이적 결합에 대한 우수한 저항성을 의미한다. 아마도 다른 시스템에서의 보다 낮은 결합 강도 때문에, 토끼 IgG 결합 단계에서의 파장 이동은 단백질 G'-마우스 IgG 결합에서 관찰되는 것 (실시예 5)보다 약간 더 작다.

실시예 8

공명광 산란 검출을 이용한 이 콜라이 (E. coli) 세포 추출물 배경에서의 다중 단백질 결합 분석

본 실시예의 목적은 이 콜라이 세포 추출물 배경에서의 2 종의 프로브 마이크로입자의 혼합물 상의 공명광 산란을 이용한 복합적 분석을 나타내는 것이다. 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 및 마우스 IgG 마이크로입자의 혼합물을 복합적 분석에서 사용하고, 입자의 그의 상응하는 항체로의 결합을 공명광 산란을 사용하여 검출하였다.

A. 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 마이크로입자 및 마우스 IgG 마이크로입자의 제조:

동일한 PEGM 코팅이지만 다른 포획 리간드를 갖는 2종의 프로브 마이크로입자, 즉 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 및 마우스 IgG를 실시예 7에 기재된 과정 (단계 A 및 단계 B)에 따라서 제조하였다. PEGM 코팅을 사용하여 높은 단백질 농도 배경에서 비특이적 결합을 방지하였다. PEGM 코팅에 사용되는 과정, 트레실 클로라이드 활성화 및 알렉사 플루오르 (등록상표) 488을 활성화된 마이크로입자로의 연결을 실시예 7에서 기재하였다. 마우스 IgG를 동일한 방법으로 트레실 클로라이드 활성화된 마이크로입자로 연결하였다. PBS 완충액 (0.2 M, pH 8.2)을 연결 완충액으로 사용하였다. 10 mg의 마우스 IgG (시그마 케미칼사, 제품 I 5381)를 연결 완충액에 용해시켜서 1 mg/mL 용액으로 만들었다. 트레실 클로라이드 활성화된 마이크로입자 (0.5 g)를 잠시동안 차가운 연결 완충액으로 세척하고, 5 mL의 마우스 IgG 용액으로 전달하였다. 마이크로입자 현탁액을 약 36 시간 동안 4 ℃에서 교반하였다. 그후 상등액을 피펫으로 제거하고, 반응을 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5 완충액 중의 0.1 M 머캅토에탄올 (알드리치 케미칼 컴퍼니 인크, 제품 M3701)로 이루어진 용액 5 mL로 5 시간 동안 켄칭하였다. 그후, 마이크로입자를 0.2 M 소듐 아세테이트-0.5 M NaCl, pH 3.5 완충액; 0.5 M NaCl 용액; 증류수; 및 그후 0.2M, pH 7.5 PBS 완충액으로 연속적으로 세척하였다. 마이크로입자를 실온에서 잠시동안 건조시키고, 사용하기 전에 냉장고에서 보관하였다.

B. 이 콜라이 세포 추출물의 제조:

이 콜라이 세포 추출물을 복합적 분석 증명을 위하여 경쟁 단백질 배경으로서 사용하였다. 이 콜라이 박테리아 세포 (0.5 mL, 인비트로젠 사 (Invitrogen Co.), 캘리포니아 칼스배드, DH10BTM cells, 카탈로그 번호 18290-015, Lot: 1172474)를 250 mL 밀러 (Miller)의 LB 브로쓰 (메디아테크 인크 (Mediatech Inc.) 버지니아주 허른돈, 카탈로그 번호 46-050CM Lot: 46050009)에 접종하고, 배양을 37 ℃에서 225 rpm으로 교반 인큐베이터에서 밤새 인큐베이션하였다. 세포를 15 분 동안 5,000 x g에서 원심분리를 이용하여 수집하였다. 세포 펠렛의 양은 약 1.0 g이었다. 상등액을 세포 펠렛에서 제거하고, 15 mL의 셀라이틱 (Cellytic)^TM B 박테리아 세포 용해 시약 (시그마 케미칼사, 제품 B3553, Lot: 052k9319)을 첨가하고, 현탁액을 잘 혼합하여 세포를 완전히 재현탁하였다. 세포 추출물 현탁액을 실온에서 15 분 동안 실온에서 흔들면서 인큐베이션하여 세포를 충분히 추출하였고, 25,000 x g에서 20 분 동안 원심분리하여 불용성 물질을 펠렛화하였다. 가용성 물질을 함유하는 상등액을 조심스럽게 제거하였다. 약 90-95%의 가용성 물질을 이 분획에서 발견하였다. 전체 단백질 농도를 브랜포드 방법 (상기 브랜포드)을 사용하여 4.4 mg/mL으로 측정하였다.

C. 이 콜라이 세포 추출물의 배경의 항체 결합 검출:

공명광 산란을 이용한 복합적 분석을 나타내기 위하여, 단계 A에서 제조된 동일한 중량의 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 마이크로입자 및 마우스 IgG 마이크로입자를 혼합하였다. 이 마이크로입자 혼합물을 10 mM, pH 7.4 PBS 완충액 중의 1 % BSA (시그마, 제품 B4287) 1.5 mL 중에서 3 시간 동안 실온에서 인큐베이션하여 비특이적 결합 부위를 추가로 차단하였다. 이 인큐베이션을 1.5 mL의 PBS 완충액으로 2회 세척하고, PBS 완충액 중에서 재현탁하였다. 그후, 현탁 마이크로입자를 결합 실험을 위하여 샘플 셀에 로딩하였다. 알렉사 플루오르 (등록상표) 488로 표지된 마이크로입자를 측정하기 위하여, 488 nm Ar 이온 레이져 (25 mW, Omnichrome Corp., Carlsbad, CA)를 사용하여 형광 염료를 여기하고, 여기 컷오프 고주파 여과기 (excitation cutoff high-pass filter)를 형광 발광을 조사하기 위하여 출력 광학 경로로 삽입하였다. 형광 마이크로입자 및 비-형광 마이크로입자를 함유하는 장 (field)를 공명광 산란 실험을 위하여 선택하였다. 형광 마이크로입자는 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 표지된 마이크로입자이고, 비-형광 마이크로입자는 마우스 IgG-표지된 마이크로입자로 추측되었다. 이 영상의 형광 영상 및 단순 영상을 도 17에서 비교를 위하여 나타내었다. 공명광 산란 식별을 가능하게 하기 위하여 요구되는 자동화 패턴 인식 소프트웨어를 이용할 수 없기 때문에, 마이크로입자를 식별하기 위하여 본 연구에서 형광을 사용하였다는 것을 주지하여야 한다. 마이크로입자는 실험 중에 적절하게 남아있고, 그의 위치를 그를 추적하기 위하여 사용하였다. 그러나, 실시예 1 및 2에 나타난 바와 같이, 필요한 소프트웨어로 입자 식별 및 추적을 위하여, 또한 결합의 검출을 위하여 공명광 산란을 사용하는 것이 가능할 것이다.

공명광 산란으로 현위치 결합 검출을 위하여, 실시예 3에 기재된 바와 동일한 과정을 사용하였다. 첫째로 기준 스펙트럼으로서 25 mM (10 mM 소듐 포스페이트, 15 mM NaCl) PBS 완충액 (pH 7.2) 중의 선택된 마이크로입자 상에서 공명광 산란을 얻었다. 그후, 3개의 결합 단계 측정을 수행하여, 경쟁 배경 단백질로부터 비특이적 결합이 있는지를 확인하고, 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 프로브와 토끼 항-마우스 IgG 사이에, 또한 마우스 IgG 프로브와 항 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 토끼 IgG 사이에 교차-반응성이 있는지를 시험하였다. 단계 1에서, 배경 시험으로서, 동일한 PBS 완충액 중의 2.2 mg/mL 이 콜라이 세포 추출물 단백질로 이루어진 용액 12 mL를 0.5 시간 동안 약 1.5 mL/분의 유속으로 순환하면서 샘플 셀을 통과시켰다. 단계 2에서, 항-알렉사 488 토끼 IgG (몰레큘라 프로브스, 인크 제품 번호 A-11094, 로트 번호 7581)를 단계 1에서 사용된 동일한 세포 추출물 용액에 첨가하여 50 ㎍/mL의 작업 농도를 얻었고, 용액을 약 0.5 시간 동안 약 1.5 mL/분의 유속으로 순환하면서 샘플 셀을 통과시켜서 마이크로입자로의 항-알렉사 488 토끼 IgG의 결합을 시험하였다. 단계 3에서, 토끼 항-마우스 IgG (H+L) (컨쥬게이션되지 않음, 피어스, 제품 31188, lot EE761527)를 단계 2에서 사용되는 용액에 첨가하여 50 ㎍/mL의 작업 농도를 얻었고, 용액을 0.5 시간 동안 약 1.5 mL/분의 유속으로 순환하면서 샘플 셀을 통과시켜서 마이크로입자로의 항-마우스 IgG의 결합을 시험하였다. 각 단계 후에 PBS 완충액 세척하였고, 스펙트럼을 각 세척 단계 후에 얻었다.

자기상관 분석을 사용하여 세포 추출물 배경 시험 단계, 항-알렉사 플루오르 (등록상표) 488 토끼 IgG 결합 단계 및 토끼 항-마우스 IgG 결합 단계 후에 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 마이크로입자 및 마우스 IgG 마이크로입자 둘다에 대하여 공명 파장 이동을 얻었다. 결과를 표 3에서 요약하였다 (모든 이동은 시작 때에 얻어진 스펙트럼을 기준으로 하였다). 표의 값은 3개의 다른 마이크로입자 및 9회의 전-후 레이져 주사 진행 쌍의 평균이다.

3-단계 결합 실험에서의 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 마이크로입자 및 마우스 IgG 마이크로입자의 공명광 산란 스펙트럼에서의 공명 파장 이동

마이크로입자	공명 파장 이동 (nm), 단계 1-2.2mg/mL 단백질 세포 추출물 배경	공명 파장 이동 (nm), 단계 2-단계 1 배경의 50㎍/mL 항-알렉사 토끼 IgG	공명 파장 이동 (nm), 단계 3-단계 2 배경의 50㎍/mL 항-마우스 토끼 IgG
알렉사 플루오르 (등록상표) 488 마이크로입자	0.004±0.004	0.034±0.006	0.030±0.005
마우스 IgG 마이크로입자	-0.005±0.006	-0.004±0.004	0.056±0.007

표 3의 데이터에서 나타난 바와 같이, 2종의 마이크로입자에 대한 배경 시험 단계에서 평균 이동은 거의 0이고, 이는 배경 단백질의 비특이적 결합이 없음을 나타낸다. 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 마이크로입자에 있어서, 제2 단계에서 항-알렉사 플루오르 (등록상표) 488 토끼 IgG 결합 시에 상응하는 공명 파장 이동이 0.034±0.006 nm이고, 이동은 제3 단계에서 거의 변화하지 않았다. 마우스 IgG 마이크로입자에 있어서, 제2 단계에서의 이동은 거의 0이었고, 제3 단계에서는 0.056±0.007 nm 이동였다. 이러한 결과는 2개의 항체와 2개의 리간드 사이에 교차-반응성이 없지만, 알렉사 플루오르 (등록상표) 488 프로브로의 항-알렉사 플루오르 (등록상표) 488 토끼 IgG의 배타적 결합 및 마우스 IgG 프로브로의 항-마우스 IgG의 배타적 결합이 있음을 명백하게 나타낸다. 이러한 결과는 복합적 분석에서 검출을 위한 공명광 산란의 용도를 나타낸다.

실시예 9

공명광 산란을 사용한 특이적 DNA 분석물의 검출을 위한 DNA 프로브 연결 마이크로입자

본 실시예의 목적은 핵산 프로브에 연결된 마이크로입자를 이용한 핵산 분석물을 특이적으로 검출하기 위한 공명광 산란의 용도를 나타내는 것이다. 형광-표지된 분석물을 분석 대조군으로 사용하여 분석물의 DNA 프로브-마이크로입자로의 특이적 결합을 확인하였다.

A. 마이크로입자 제조:

고굴절률 유리 마이크로입자 (카탈로그 번호 GL-0175, Mo-Sci 사, Rolla, MO)를 실시예 3에서 기재한 바와 같이 제조하였다. 실시예 3에 기재된 바와 같이, 세척된 유리 마이크로입자를 핵산 올리고머 프로브로 연결하기 위하여 실란화하여 표면 반응성 아민기를 제조하였다. 아민-유도된 유리 마이크로크로입자를 아민기로 술포숙신이미딜 (NHS) 4-[N-말레이미도메틸] 시클로헥산-1-카르복실레이트 (술포-SMCC)를 연결하여 말레이미드기로 추가로 유도하였다. 아민-유도된 유리 마이크로입자 400 mg의 분취량을 130 mM 카르보네이트/바이카르보네이트 완충액, pH 9.6, 13.3 mg/mL 술포-SMCC (피어스 바이오테크놀로지 인크, 일리노이주 록포드; 제품 번호 22322) 및 33.3% 디메틸포름아미드 (DMF)로 이루어진 반응 혼합물로 첨가하였다. 이 혼합물을 표면 아민이 술포-SMCC 상의 NHS 기와 반응하도록 실온에서 1 시간 동안 회전하는 1.5 mL 둥근-바닥 튜브로 위치시켰다. 말레이미드-유도된 마이크로입자를 100 mM 소듐 포스페이트, 150 mM NaCl 완충액, pH 7.2 (PBS) 500 ㎕로 실온에서 세척하였다. 완충액을 12,000 rpm에서 실온에서 소르발 마이크로스핀 (Sorvall Microspin) 마이크로원심분리기 (켄드로 레보러토리 프로덕츠 (Kendro Laboratory Products), 코네티컷주 뉴타운)에서 마이크로농축기 (마이크로콘 (Microcon) 100, Amicon, W. R. 메사추세스주 비버리 그레이스사 (Grace Co.))를 사용하여 현탁 마이크로입자를 원심분리하여 제거하였다. 마이크로입자를 마이크로농축기를 사용하여 PBS 완충액으로 2회 세척하였다. 말레이미드-유도된 마이크로입자 펠렛을 두번째 1.5 mL 둥근-바닥 반응 튜브로 전달하고, 4 ℃에서 보관하였다.

제2 마이크로입자 세트를 실시예 7에 기재된 바와 같이 PEGM 코팅을 사용한 비특이적-결합 저항성 층으로 제조하였다. PEGM 표면을 실시예 7에 기재한 바와 같이 티오-활성화 올리고뉴클레오티드로 컨쥬게이션하기 위하여 트레실 클로라이드로 활성화하였다.

B. 올리고뉴클레오티드 프로브 및 올리고뉴클레오티드 프로브 연결 마이크로입자의 제조:

올리고뉴클레오티드 프로브 서열을 본원에 참조문헌으로 삽입된 미국 특허 출원 번호 60/434974호로 계속 중인 에버솔 등 (Ebersole et al.)에 의하여 개시된 서열 번호 1인, 합성 족구병 (FMD) 표적 핵산 서열을 특이적으로 검출하도록 고안하였다. 분석에 사용된 FMD 올리고뉴클레오티드 프로브 특이적 서열 (JBP)는 서열 번호 2인 5' TCAACCAGATGCAGGAGGACATGTCAACAAAACACGGACCCGACTTAA 3'였다. 이 서열은 하기와 같이 5' 및 3' 말단에서 변형하여 서열 번호 3인, 변형된 FMD 프로브 (JBP S2SP3B): C₆-S-S(SP)₂-TCAACCAGATGCAGGAGGACATGTCAACAAAACACGGACCCGACTTAA-B 3'을 얻었다. "B"는 β-시아노에틸 포스포라미디트 합성 화학 (비오틴 CPG, 글렌 리서치 (Glen Research), 버지니아 스텔링)에 사용되는 대조군-공극 유리 고체 지지체에 부착된 3' 커플화제로서 DNA 합성 중에 서열에 첨가된 3' 비오틴기이다. "Sp"는 18-원자 스페이서 암 (18-atom spacer arm) 포스포라미디트, 18-O-디메톡시트리틸헥사에틸렌글리콜, 1-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포라미디트 (글렌 리서치, 버지니아 스텔링)를 지칭한다. 이들 스페이서 잔기 중의 2개는 프로브 서열과 프로브 가교결합 잔기 사이의 5' 말단에 연결되어 β-시아노에틸 화학을 사용한 분자 스페이서로서 작용하였다. "C₆-S-S" (1-O-디메톡시트리틸헥실-디술피드, 1-[(2-시아노에틸)-(N,N-디이소프로필)]-포스포라미디트, 글렌 리서치, 버지니아 스텔링)는 가교결합 티올-조절인자로서 사용되는 디술피드 잔기이다.

말레이미드-유도된 마이크로입자로 연결하기 위한 변형된 JBP S2SP3B 프로브를 제조하기 위하여, 디술피드 조절인자를 0.2 M Tris 완충액 (pH 8.3) 중의 100 mM 디티오트레이톨 (DTT) 400 ㎕를 사용하여 70 nmol의 프로브로부터 분리하여 티올-활성화된 프로브를 생성하였다. 티올-활성화된 프로브를 100 ㎕의 3 M 소듐 아세테이트 (pH 5.4) 및 1000 ㎕의 100% 에탄올을 첨가하여 에탄올 침전을 사용하여 C6-티오기 및 DTT로부터 정제하고, 잘 혼합하였다. DNA 침전물을 실온에서 12,000 rpm에서 소르발 마이크로스핀 마이크로원심분리기에서 원심분리에 의하여 펠렛으로 원심분리하였다. 올리고뉴클레오티드 펠렛을 70 % 에탄올로 2회 세척하고, 200 ㎕의 이중-증류수 (double-distilled water)에 용해하였다.

부분 A에서 기재된 바와 같이 제조된 말레이미드-유도된 마이크로입자 (400 ㎍)를 티올-활성화된 JBP S2SP3B 프로브와 연결하기 위하여 1.5 mL 둥근-바닥 반응 튜브로 전달하였다. 상기와 같이 제조된 티올-활성화된 JBP S2SP3B 프로브 (70 nmol)를 튜브에 첨가하였다. 그후, 마이크로입자를 혼합하고 현탁하기 위하여 500 ㎕의 PBS (pH 7.4)를 첨가하고, 실온에서 2 시간 동안 튜브를 회전시켜서 표면 말레이미드기가 티올-활성화된 프로브와 반응하도록 하였다. DNA 프로브 연결 마이크로입자를 실온에서 500 ㎕ PBS로 세척하였다. PBS를 실온에서 12,000 rpm에서 소르발 마이크로스핀 마이크로원심분리기에서 마이크로콘 100 마이크로농축기를 사용하여 현탁된 마이크로입자를 원심분리하여 제거하였다. 마이크로입자를 PBS 완충액으로 2회 세척하고, 그후 JBP S2SP3B 프로브 연결 마이크로입자 펠렛을 1.5 mL 마이크로-튜브로 전달하고, 4 ℃에서 보관하였다.

서열 번호 4인 추가적인 프로브, N-JBC (5' NH₂-TTAAGTCGGGTCCGTGTTTTGTTGACATGTCCTCCTGCATCT GGTTGA-B 3')를 MWG 바이오텍 인크 (MWG Biotech, Inc) (High Point, NC)로 합성하였다. 이 프로브는 5' 아민기 및 3' 비오틴기를 함유하였다. 프로브를 5' 아민을 통하여 트레실 활성화된 PEGM 마이크로입자로 연결하였다. 특히, 100 μM N-JBC DNA 100 ㎕을 0.2 M PBS 완충액 (pH 8.2) 중의 40 mg의 트레실화 PEGM 마이크로입자와 3 일 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 그후, N-JBC 프로브 연결 마이크로입자를 마이크로콘 (등록상표) 100 마이크로농축기를 사용하여 0.1 M PBS (pH 7.2)에서 2회 세척하였다. 마이크로입자 펠렛을 1.5 mL 마이크로-튜브로 전달하였다. N-JBC 프로브 연결 마이크로입자를 JBC-PEGM로 표시하고, 4 ℃에서 보관하였다.

C. 형광을 사용한 DNA 프로브 연결 마이크로입자 상으로 FMD 올리고뉴클레오티드 표적 DNA의 혼성화 포획의 검출:

JBP 프로브 서열 (서열 번호: 2 및 서열 번호: 3)에 상보적인 서열 번호 5인 3' 플루오르세인 표지 (JBC-F)로 표지된 FMD 특이적 DNA 올리고뉴클레오티드 표적, 특히 5' TTAAGTCGGGTCCGTGTTTTGTTGACATGTCCTCCTGCATCTGGTTGA-F 3'을 사용하여 마이크로입자 프로브의 작용성을 시험하였다. 제2 올리고뉴클레오티드를 서열 번호 6인 플루오르세인-표지된, 비특이적 표적 대조군 (Lac2-F), 5' TGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGAC-F 3'으로서 작용하는 JBP S2SP3B 프로브에 상보적인 서열을 갖지 않도록 고안하였다.

JBP S2SP3B 프로브-변형된 마이크로입자 (2 ㎕)를 0.3 M NaCl, PBS 완충액 20 ㎕ 중의 10 μM JBC-F (서열 번호: 5) 또는 Lac2-F (서열 번호: 6) 2 ㎕과 혼합하고, 회전 혼합기에서 실온에서 1 시간 동안 혼성화하였다. 튜브를 마이크로입자를 펠렛화하기 위하여 잠시동안 원심분리하고, 상등액을 제거하였다. 그후, 분석 마이크로입자를 잠시동안 볼텍스하고 원심분리하면서 0.3 M NaCl, PBS 완충액 200 ㎕ 분취량으로 3회 세척하였다. 최종 세척 후에, 마이크로입자를 0.3 M NaCl, PBS 완충액 50 ㎕에서 현탁하였다. 각 샘플로부터의 현탁된 마이크로입자 1 ㎕를 2 ㎕의 VECTASHIELD (등록상표) 고정 매질 (Mounting Medium) (벡터 레보러토리즈 인크 (Vector Laboratories, Inc.), 캘리포니아주 불링게임) 중의 슬라이드에 고정하였다. 샘플을 Spot RTKE CCD 카메라 (다이아그노스틱 인스트루먼츠 인크 (Diagnostic Instruments, Inc.), 미시간주 스텔링 하이츠)가 장착된 형광 현미경 (제이스 액시오스코프 40 (Zeiss Axioskop 40), 칼 제이스 마이크로이메이징 인크 (Carl Zeiss Microimaging, Inc.), 뉴욕주 토르우드) 하에서 관찰하였다.

결과 현미경 사진은 JBC-F DNA 표적이 JBP S2SP3B-연결된 마이크로입자 상으로 포획되고, Lac2-F 비특이적 대조군 표적이 포획되지 않는다는 것을 나타낸다. 표적이 없는 JBP S2SP3B-연결된 마이크로입자의 배경 자가형광을 또한 시험하였다. 자가형광은 플루오르세인-표지된 JBC-F 표적의 결합으로 인한 형광에 비교하여 작았다. 이러한 결과는 JBP S2SP3B-연결된 마이크로입자가 JBC-F 표적 서열에 특이적이라는 것을 나타낸다.

D. 공명광 산란을 사용한 DNA 프로브 연결 마이크로입자 상으로의 FMD 올리고뉴클레오티드 표적 DNA의 혼성화 포획의 검출:

다음으로, 공명광 산란을 사용하여 DNA 프로브 연결 마이크로입자로의 DNA 표적의 결합을 검출하였다. 이용된 과정은 실시예 2 및 3에서 기재된 것과 유사하였다. 부분 A 및 B에 기재된 바와 같이 제조된 JBP S2SP3B 프로브 연결 마이크로입자를 0.3 M NaCl, 0.1 M 소듐 포스페이트 완충액, pH 7.4 (0.3 M NaCl, PBS 완충액)에서 분산하였다. 이 현탁액 2 ㎕ 분취량을 실시예 3에 기재되고 도 6에 나타난 것과 유사하게 광학 유통 셀에 위치시켰다. 마이크로입자의 작은 숫자 (2-6)을 함유하는 가시 영역을 선택하였다. 분석 배경 스펙트럼을 측정하기 위하여 "프리스캔 (prescan)" 측정하였다. 그후 실시예 3에 기재된 바와 같이, 다이오드 레이져 광원을 50 초 동안 770와 780 nm 사이에서 주사하고, 1500 영상을 포획하고 픽셀 스택 파일 (pixel stack file)로서 저장하고 시스템의 퍼스널 컴퓨터에 장착된 소프트웨어에 의하여 분석하였다. 가시 영역의 몇몇 마이크로입자를 실시예 3에 기재되고 도 8에 나타난 바와 유사한, 순차적인 상세한 스펙트럼 분석을 위하여 선택하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같은 파장-의존적 산란광 영상의 전체 세트를 분석하여, 이 입자로부터의 산란광 스펙트럼을 얻었다. JBP S2SP3B 프로브 연결 마이크로입자로부터 획득한 산란광 스펙트럼을 실시예 2에 기재되고 도 9에 나타난 것과 유사하였다.

공명광 산란 분석을 하기와 같이 수행하고, 각 인큐베이션/세척 단계 후에 스펙트럼 측정하였다. 0.3 M NaCl, PBS 완충액 중의 1 μM 농도에서 대조군 Lac2-F 표적 DNA의 대략 5 mL을 약 1 mL/분 유속으로 JBP S2SP3B 프로브 연결 마이크로입자을 통과하여 계속적으로 흘렸고, 폐기물로 수집하였다. 그후 방출물 튜브를 원래 샘플로 다시 전달하였고, 표적 DNA의 잔여 5 mL을 폐쇄 루프 시스템에서 1 시간 동안 재순환하였다. 그후 JBP S2SP3B 프로브 연결 마이크로입자를 0.3 M NaCl, PBS 완충액 10 mL로 세척하고, 방출물을 폐기하였다. 세척 후에 JBP S2SP3B 프로브 연결 마이크로입자의 공명광 산란 스펙트럼 주사를 얻었다. 그후, 0.3 M NaCl, PBS 완충액 중의 프로브 특이적 JBC-F 올리고뉴클레오티드 표적 1 μM 샘플 대략 5 mL를 유통 셀에 첨가하고, 1 시간 동안 마이크로입자로 계속적으로 흘렸다. 그후, 마이크로입자를 0.3 M NaCl, PBS 완충액 10 mL로 세척하였다. 다시, 세척 후에 JBP S2SP3B 프로브 연결 마이크로입자의 공명광 산란 스펙트럼을 얻었다.

결과를 표 4에 나타내었다. 공명광 산란의 음성 이동을 마이크로입자로의 Lac2-F 표적 올리고뉴클레오티드의 비특이적 결합에서 관찰하였다. 공명광 산란 패턴의 현저한 음성 이동을 JBP S2SP3B 프로브 연결 마이크로입자로의 특이적 JBC-F 표적 올리고뉴클레오티드의 결합에서 관찰하였다. 이러한 결과는 비-특이적 또는 특이적 올리고뉴클레오티드 표적으로의 올리고뉴클레오티드 프로브 연결 마이크로입자의 결합이 입자의 공명광 산란 스펙트럼에서의 음성 공명 파장 이동을 유발한다는 것을 나타내었다. 이러한 결과는 또한 마이크로입자와 연결된 특이적 DNA 올리고뉴클레오티드 프로브로의 올리고뉴클레오티드 DNA 표적의 결합을 검출하기 위한 공명광 산란의 용도를 나타낸다.

올리고뉴클레오티드 표적으로의 결합 시 올리고뉴클레오티드 DNA 프로브 연결 마이크로입자의 공명광 산란 스펙트럼의 공명 파장 이동

마이크로입자	공명 파장 이동 (nm), 단계 1-배경: 0.3 M NaCl, PBS 완충액, pH 7.4	공명 파장 이동 (nm), 단계 2-비특이적 분석물 표적: Lac2-F 올리고뉴클레오티드 비-특이적 결합	공명 파장 이동 (nm), 단계 3-특이적 분석물 표적: JBC-F 올리고뉴클레오티드 특이적 결합
JBP S2SP3B 프로브-연결된 마이크로입자	0.0±0.004	-0.01426±0.007	-0.02634±0.009(JBC-F 표적)
JBC-PEGM 마이크로입자	0.0±0.0007	-0.00136±0.0006	-0.01910±0.0011(JBP-F 표적)

E. 형광을 이용한 DNA 프로브 연결된 PEGM-코팅된 마이크로입자로의 FMD 올리고뉴클레오티드 표적 DNA의 혼성화 포획의 검출:

서열 번호 7인, 3' 플루오르세인 표지 (JBP-F)로 표지된 FMD 특이적 DNA 올리고뉴클레오티드 표적 (5' TCAACCAGATGCAGGAGGACATGTCAACAAAACACGGACCCGACTTAA-F 3')을 사용하여 마이크로입자 프로브의 작용성을 시험하였다. 플루오르세인-표지된, 비특이적 표적 (Lac2-F), 서열 번호 6을 대조군으로서 사용하였다.

N-JBC 프로브 연결된, PEGM-코팅된 마이크로입자 (JBC-PEGM) 2 ㎕를 0.3 M NaCl, PBS 완충액 20 ㎕ 중의 2 ㎕의 10 μM JBP-F 또는 Lac2-F (서열 번호: 6) 와 혼합하고, 회전 혼합기 상에서 실온에서 1 시간 동안 혼성화하였다. 마이크로입자를 잠시동안 원심분리에 의하여 펠렛화하고, 상등액을 제거하였다. 그후, 마이크로입자를 잠시동안 볼텍스하고 원심분리하면서 0.3 M NaCl, PBS 완충액 200 ㎕으로 3회 세척하였다. 그후 마이크로입자를 0.3 M NaCl, PBS 완충액 50 ㎕ 중에서 현탁하였다. 각 샘플로부터의 현탁된 마이크로입자 1 ㎕를 슬라이드에 고정하고, 상기와 같이 형광 현미경 하에서 관찰하였다.

결과 형광 현미경 사진은 특이적 JBP-F DNA 표적이 마이크로입자 상으로 포획되고, Lac2-F 비특이적 대조군 표적은 그렇지 않다는 것을 나타내었다. 이러한 결과는 N-JBC 프로브 연결된 PEGM-코팅된 마이크로입자가 JBP-F 표적 DNA에 특이적이라는 것을 나타내었다.

F. 공명광 산란을 이용한 DNA 프로브 연결된, PEGM-코팅된 마이크로입자 상으로의 FMD 올리고뉴클레오티드 표적 DNA의 혼성화 포획의 검출:

공명광 산란을 사용하여 N-JBC 프로브 연결된, PEGM-코팅된 마이크로입자로의 표적 DNA의 결합을 검출하였다. 사용된 과정은 실시예 2 및 3에서 기재된 것과 유사하였다. JBC-PEGM 마이크로입자를 0.3 M NaCl, 0.1 M 소듐 포스페이트 완충액, pH 7.4 (0.3 M NaCl, PBS 완충액)에 분산하였다. 이 현탁액의 2 ㎕ 분취량을 광학 유통 셀에 위치시켰다. 분석 배경 스펙트럼을 결정하기 위하여 "프리스캔" 측정을 하였고, 가시 영역의 몇몇 마이크로입자를 앞서 기재되고 실시예 3에 기술되고 도 8에서 나타낸 것과 유사한 순차적인 상세한 스펙트럼 분석을 위하여 선택하였다. JBC-PEGM 마이크로입자로부터 획득된 산란 스펙트럼은 실시예 2에 기재되고 도 9에 나타난 것과 유사하였다.

공명광 산란 분석을 하기와 같이 수행하였고, 각 인큐베이션/세척 단계 후에 스펙트럼을 측정하였다. 0.3 M NaCl, PBS 완충액 중의 농도 1 μM에서 대조군 Lac2-F 표적 DNA 대략 5 mL를 약 1 mL/분의 유속으로 JBC-PEGM 마이크로입자를 통하여 계속 흘리고, 폐기물로 수집하였다. 그후 방출물 튜브를 원래 샘플로 다시 전달하고, 표적 DNA의 잔여 5 mL를 1 시간 동안 폐쇄 루프 시스템에서 재순환하였다. 그후 마이크로입자를 0.3 M NaCl, PBS 완충액 10 mL로 세척하고, 방출물을 폐기하였다. 세척 후에 마이크로입자의 공명광 산란 스펙트럼 주사를 얻었다.

이전의 마이크로입자를 셀로부터 제거하고, 신선한 JBC-PEGM 마이크로입자로 교환하였다. 다시, 분석 배경 스펙트럼을 "프리스캔" 측정에 의하여 측정하였다. 그후, 0.3 M NaCl, PBS 완충액 중의 프로브 특이적 JBP-F 올리고뉴클레오티드 표적의 1 μM 샘플 대략 5 mL를 유통 셀에 첨가하고, 마이크로입자로 계속 흘렸다. 그후, 방출물 튜브를 원래의 샘플로 다시 전달하고, 표적 DNA의 잔여 5 mL를 폐쇄 루프 시스템에서 1 시간 동안 재순환하였다. 그후 마이크로입자를 0.3 M NaCl, PBS 완충액 10 mL로 세척하였다. 다시, 세척 후에 마이크로입자의 공명광 산란 스펙트럼 주사를 얻었다.

결과를 표 4에 나타내었다. 공명광 산란 패턴의 현저한 음성 이동을 JBC-PEGM 마이크로입자로의 Lac2-F 표적 올리고뉴클레오티드의 비특이적 결합에서 관찰하였다. 공명광 산란 패턴의 현저한 음성 이동을 JBC- PEGM 마이크로입자로의 특이적 JBP-F 표적올리고뉴클레오티드 결합에서 관찰하였다. 이러한 결과는 DNA 프로브 연결된, PEGM-코팅된 마이크로입자가 코팅되지 않은 DNA 프로브 연결 마이크로입자와 유사하게 거동하지만, 비특이적 표적에 대하여 배경 공명이 적다는 것을 나타내었다 (표 4).

실시예 10

공명광 산란을 이용한 DNA 프로브 연결 마이크로입자로의 PCR 산물 표적의 혼성화 포획의 검출

본 실시예의 목적은 핵산 프로브에 연결된 마이크로입자를 이용한 PCR 산물 DNA 분석물을 검출하기 위한 공명광 산란의 용도를 나타내는 것이다.

A. 마이크로입자 제조 및 올리고뉴클레오티드 프로브 연결:

JBP S2SP3B 프로브 연결 마이크로입자를 실시예 9에 기재한 바와 같이 제조하였다.

B. PCR 표적의 제조:

서열 번호 8인 206 bp 증폭된 FMD DNA 단편 (JB), 및 서열 번호 9인 511 bp 증폭된 Lac1Q 단편 (Lac2-511)을 하기와 같이 표준 PCR 프로토콜을 사용하여 제조하였다. 서열 번호 10인 전방 프라이머, P2FWD, 5' GAGTCCAACCCTGGGCCCTTCTTCTTC3' 2 pmol, 및 서열 번호 11인 역행 프라이머, P33-4, 5' ATGAGCTTGTACCAGGGTTTGGC 3' 20 pmol을 사용하여, pCR4-TOPO 플라스미드 벡터 (Invitrogen, Carlsbad, CA)로 클로닝된 516 bp 합성 FMD 표적 (서열 번호: 1)로부터의 비대칭 PCR 산물로서 206 bp PCR 단편을 제조하였다. 그후, 5 ㎕의 산물을 5 pmol의 P2FWD 및 50 pmol의 P33-4의 존재 시에 다시 증폭하였다.

서열 번호 12인, 전방 프라이머, Lac1 pst,5'ATACTGCAGAACGCGTCAGTGGGCTGATCA 3' 2 pmol, 및 서열 번호 13인 역행 프라이머, Lac4eco, 5' ACAGAATTCCATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTA 3' 20 pmol을 사용하여 pCR4-TOPO 플라스미드 벡터로 클로닝된 이 콜라이 LaclQ 삽입물로부터 비대칭 PCR 산물로서 511 bp PCR 단편을 제조하였다. 그후 5 ㎕의 산물을 5 pmol의 Lac1 pst 및 50 pmol의 Lac4eco 존재 시에 다시 증폭하였다. 비대칭 PCR 반응 혼합물은 최종 부피 50 ㎕ PCR 완충액 (10X: 100 mM KCl, 100 mM (NH4)₂SO₄, 200 mM Tris-HCl pH 8.75, 20 mM MgS0₄, 1 % 트리톤 X-100, 1 mg/mL BSA) 중의 200 μM dNTPs 및 2.5 유니트의 Pfu 터보 DNA 폴리머라아제 (스트라타겐 (Stratagene), 캘리포니아주 라 졸라)를 함유하였다. 증폭을 GeneAmpM9600 열 순환기 (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, CT)에서 수행하였다. 샘플을 94 ℃에서 2 분 동안 변성하고, 94 ℃에서 20 초 동안 변성하면서 35 순환하고, 55 ℃에서 20 초 동안 결합시키고, 72 ℃에서 1 분 동안 연장하였다. 증폭 주기가 종결된 후, 72 ℃에서 5 분 동안 최종 쇄 연장하였다. 그후 샘플을 4 ℃로 바꾸고, 온도를 샘플 분석까지 유지하였다.

증폭된 DNA 산물을 아가로오스 겔 전기영동에 의하여 비대칭 증폭된 산물의 수율을 분석하였다. PCR 산물을 0.5 ㎍/mL of 에티듐 브로마이드 함유 0.5 X TBE 완충액 (디겐 다이아그노스틱스 인크 (Digene Diagnostics, Inc.), 메인주 실버 스프링) 중에 1.5% SeaKem (등록상표) LE 아가로오스 (FMC 바이오프로덕츠 (FMC Bioproducts), 메인주 록랜드) 상에서 분리하였다. 증폭된 샘플로부터의 4 ㎕ 분취량을 겔 로딩 완충액 1 ㎕과 혼합하고, 아가로오스 겔 상으로 로딩하였다. 겔 전기영동을 겔에 1 시간 동안 100 V (또는 5.9 V/cm)를 적용하여 수행하였다. 에티듐 브로마이드-염색된 DNA 띠를 이글 아이 II 스틸 비디오 시스템 (이글 아이 II 스틸 비디오 시스템 (Eagle Eye II Still Video System)) (스트라타겐, 캘리포니아주 라 졸라)를 사용하여 가시화하고 디지탈 방식으로 기록하였다.

공명광 산란을 이용한 DNA 프로브 연결 마이크로입자로의 FMD PCR 산물 표적 DNA의 혼성화 포획의 검출:

공명광 산란 검출을 실시예 3 및 9에 기재된 바와 같이 수행하였고, 도 9에서 나타내었다. 각 인큐베이션/세척 단계 후에 공명광 산란을 측정하였다. 실시예 9에 기재된 바와 같이, JBP S2SP3B 프로브 연결 마이크로입자 현탁액 2 내지 3 ㎕의 작은 분취량을 광학셀에 위치시켰다. 도 8에서 나타난 것과 유사하고 작은 숫자 (2 내지 6)의 마이크로입자를 함유하는 가시 영역을 선택하였다. 분석 배경을 기록하기 위하여 프리스캔 측정을 얻었다. 비특이적 대조군 PCR 표적 단편, Lac2-511 DNA (0.3 M NaCl, PBS 완충액 5 mL 중의 PCR 산물 5 pmol) 대략 5.0 mL을 약 1 mL/분 유속으로 마이크로입자를 통하여 계속적으로 흘렸고, 폐쇄 루프 시스템에서 1 시간 동안 재순환하였다. 그후, JBP S2SP3B 프로브 연결 마이크로입자를 0.3 M NaCl, PBS 완충액 10 mL로 세척하고, 방출물을 폐기하였다. 세척 후에 JBP S2SP3B 프로브 연결 마이크로입자의 공명광 산란 스펙트럼 주사를 얻었다. 특이적 JB PCR 표적 단편 (0.3 M NaCl, PBS 완충액 5 mL중의 5pmol)의 대략 5.0 mL를 마이크로입자를 통하여 1 시간 동안 흘리고, 이어서 0.3 M NaCl, PBS 완충액 10 mL로 세척하였다. 다시, 세척 후에 JBP S2SP3B 프로브 연결 마이크로입자의 공명광 산란 스펙트럼 주사에서 얻었다.

결과를 표 5에 나타내었다. 마이크로입자로의 Lac2-F PCR 단편의 비특이적 결합에서 공명광 산란 패턴의 음성 이동을 관찰하였다. 특이적 PCR 표적, JB PCR 제품을 분석물로서 사용한 경우, JBP S2SP3B 프로브 연결 마이크로입자로의 결합에서 현저한 공명광 산란 패턴의 음성 이동을 관찰하였다. 이러한 결과는 올리고뉴클레오티드 프로브 연결 마이크로입자가 PCR 특이적 분석물로의 결합 시에 그의 그의 공명광 산란 스펙트럼의 음성 공명 파장 이동을 나타낸다는 것을 나타내었다. 이러한 결과는 또한 PCR 제조된 DNA분석물을 검출하기 위한 마이크로입자에 연결된 공명광 산란 및 DNA 올리고뉴클레오티드 프로브의 용도를 나타내었다.

PCR 제조된 DNA 분석물로의 올리고뉴클레오티드 DNA 프로브-연결 마이크로입자의 공명광 산란 스펙트럼에서의 공명 파장 이동

마이크로입자	공명 파장 이동 (nm), 단계 1-배경: 0.3 M NaCl, PBS 완충액, pH 7.4	공명 파장 이동 (nm), 단계 2-비특이적 분석물 표적: Lac2-511 PCR 단편 비-특이적 결합	공명 파장 이동 (nm), 단계 3-특이적 분석물 표적: JBC-PCR 단편 특이적 결합
JBP S2SP3B 프로브-연결된 마이크로입자	0.0±0.002	-0.0026±0.009	-0.0200±0.006

실시예 11

공명광 산란에 의한 PNA 프로브 연결 마이크로입자로의 DNA 결합의 검출

본 실시예의 목적은 펩티드 핵산 (PNA) 프로브에 연결된 마이크로입자로의 핵산 분석물의 결합을 검출하기 위하여 공명광 산란의 용도를 나타내는 것이다. PNA는 핵산 (DNA 및 RNA)의 당-포스페이트 주쇄가 아니라, 모조-펩티드 주쇄를 갖는 DNA의 유사체이다. PNA는 DNA의 거동과 유사하며, 상보적인 핵산 스트랜드와 결합하였다. PNA의 독특한 화학적, 물리적 및 생물학적 특성은 강력한 생물분자 수단, 안티센스 및 항원 제제, 분자 프로브 (몰레큘라 프로브스) 및 바이오센서를 제조하도록 이용되었다. 중성 펩티드-형 주쇄는 염 농도에 독립적인 표적 핵산으로의 더 강하고 특이적인 결합을 제공하였다. 그러므로, PNA 프로브 연결 마이크로입자를 사용하는 DNA 분석물의 혼성화 포획의 가능성에 접근하고자 하였다. 형광-표지된 올리고뉴클레오티드 분석물을 PNA 마이크로입자로의 DNA 분석물의 특이적인 결합을 확인하기 위하여 분석 대조군으로서 사용하였다.

A. 마이크로입자 제조

고굴절률 유리 마이크로입자 (카탈로그 번호 GL-0175, Mo-Sci 사, Rolla, MO)를 실시예 3에 기재된 바와 같이 제조하였다. 세척된 유리 마이크로입자를 실란화하여 PNA 올리고머 프로브로 연결하기 위한 표면 반응성 아민기를 제조하였다. 실시예 9에 기재한 바와 같이, 아민-유도된 유리 마이크로입자를 추가로 말레이미드기로 유도하였다. 말레이미드-유도된 마이크로입자 펠렛을 두번째 1.5 mL 둥근-바닥 반응 튜브로 전달하고, 4 ℃에서 보관하였다.

B. 마이크로입자로의 PNA 올리고머 프로브의 연결:

PNA 프로브 염기 서열을, 공명광 산란 분석 프로브로서 PNA 올리고머의 용도를 나타내기 위하여 실시예 9 및 10에 기재된 FMD 서열을 특이적으로 검출하기 위하여 고안하였다. 선택된 서열은 서열 번호 14인 5' TCCGTGTTTTGTTGAC 3' (JBP2C)였다. 서열 번호 15인, 이 실시예에 사용된 변형된 JBP2C PNA 올리고머 프로브 서열, 5' B-00-TCCGTGTTTTGTTGAC-Cy 3' (JBP2BC)을 어플라이드 바이오시스템스 (Applied Biosystems (Foster City, CA))로 합성하였다. JBP2BC PNA 올리고머를 5' 말단 (N-말단)에서 비오틴 잔기 (B)로 변형하였다. "00"은 PNA 올리고머와 비오틴 잔기 사이의 링커를 나타내었다. 시스테인 잔기 (Cy) 아미노산 잔기를 사용하여 3' 말단 (C-말단)에서 JBP2BC PNA 올리고머를 변형하였다. 시스틴 상의 자유 티올기를 사용하여 PNA 올리고머를 말레이미드-유도된 마이크로입자로 연결하였다.

마이크로입자로 PNA 올리고머 프로브를 연결하기 위하여, 100 μM JBP2BC PNA 올리고머 20 ㎕를 pH 7.4 PBS 중의 말레이미드-유도된 마이크로입자 40 mg로 첨가하였다. 반응 혼합물을 회전 혼합기 상에서 2 시간 동안 실온에서 인큐베이션하였다. 반응하지 않은 JBP2BC PNA 올리고머 및 PBS를 실온에서 12,000 rpm에서 소르발 마이크로스핀 마이크로원심분리기에서 마이크론 (등록상표) 100을 사용하여 현탁된 마이크로입자를 원심분리하여 제거하였다. 마이크로입자를 PBS로 2회 세척하였다. JBP2BC PNA 프로브 연결 마이크로입자 펠렛을 1.5 mL 마이크로-튜브로 전달하고, 4 ℃에서 보관하였다.

C. 형광을 이용한 PNA 프로브 연결 마이크로입자 상으로의 FMD 올리고뉴클레오티드 표적 DNA의 혼성화 포획의 검출:

JBP2BC PNA 프로브의 상보적인 서열로서 서열 번호 7인, 3' 플루오르세인 표지된 FMD 특이적 DNA 올리고뉴클레오티드 표적 (JBP-F), 5' TCAACCAGATGCAGGAGGACATGTCAACAAAACACGGACCCGACTTAA-F 3'를 사용하여 PNA 프로브 연결 마이크로입자의 작용성을 시험하였다. 실시예 9에 기재된 바와 같이, 플루오르세인-표지된 Lac2-F 올리고뉴클레오티드 (서열 번호: 6)를 JBP2BC PNA 프로브에 상보적인 서열을 갖지 않는 비특이적 대조군으로서 사용하였다.

JBP2BC PNA 프로브 연결 마이크로입자 (2 ㎕)를 10 μM JBP-F 분석 표적 2 ㎕ 또는 0.3 M NaCl, PBS 완충액 20 ㎕ 중의 10 μM의 Lac2-F 대조군 표적과 혼합하고, 회전 혼합기에서 실온에서 1 시간 동안 혼성화하였다. 실시예 9에서 기재한 바와 같이, 마이크로입자를 펠렛화하고 0.3 M NaCl, PBS 완충액 200 ㎕ 부분으로 3회 세척하였다. 최종 세척 후에, 0.3 M NaCl, PBS 완충액 50 ㎕으로 현탁하였다. 샘플 (1 ㎕)을 VECTASHIELD (등록상표) 고정 매질 (Mounting Medium) (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA)의 2 ㎕의 슬라이드 상에 고정하였다. 실시예 9에 기재한 바와 같이, 샘플을 형광 현미경 하에서 관찰하였다.

형광 현미경 사진은 특이적 JBP-F 분석 표적이 PNA 프로브 연결 마이크로입자 상으로 포획되고, Lac2-F 비특이적 대조군 표적이 포획되지 않았다는 것을 나타내었다. 표적이 없는 PNA 프로브 연결 마이크로입자의 배경 자가형광을 또한 시험하였다. 자가형광은 플루오르세인-표지된 JBP-F 표적의 결합에 의한 형광에 비교하여 작았다. 이러한 결과는 JBP2BC PNA 프로브 연결 마이크로입자가 각각의 표적 JBP-F 서열에 특이적이라는 것을 나타내었다.

D. PNA 프로브 연결 마이크로입자를 사용한 공명광 산란 검출:

공명광 산란을 사용하여 PNA 프로브 연결 마이크로입자로의 DNA 표적의 결합을 검출하였다. 사용된 과정은 실시예 2, 3 및 9에 기재된 것과 유사하였다. 부분 A 및 B에 기재된 바와 같이 제조된 JBP2BC PNA 프로브 연결 마이크로입자를 0.3 M NaCl, PBS 완충액 (pH 7.4) 중에서 분산시키고, 결과 마이크로입자 현탁액의 작은 분취량 (2 내지 3 ㎕)을 실시에 3에 기재되고 도 6에 나타난 것과 유사한 광학셀에 위치시켰다. 작은 숫자 (2 내지 6)의 마이크로입자를 함유하는, 도 8에 나타나고 실시예 9에 기재된 것과 같은 가시 영역을 선택하였다. 영상을 포획하여 픽셀 스택 파일로 저장하고, 시스템의 퍼스널 컴퓨터에 장착된 소프트웨어로 분석하였다. 실시예 9에 기재된 바와 같이, 분석 배경을 기록하기 위하여 프리스캔 측정을 얻었다.

0.3 M NaCl, PBS 완충액 중의 1 μM Lac2-F 비특이적 표적 DNA 대략 5 mL를 약 1 mL/분의 유속으로 JBP2BC PNA 프로브 연결 마이크로입자를 통하여 계속적으로 흘리고, 수집하고 폐쇄 루프 시스템에서 1 시간 동안 재순환하였다. 그후 JBP2BC PNA 프로브 연결 마이크로입자를 0.3 M, PBS 완충액 10 mL으로 세척하고, 방출물을 폐기하였다. 세척 후에 공명광 산란 측정을 얻었다. 그후 0.3 M NaCl, PBS 완충액 중의 1 μM JBP-F 특이적 표적 DNA 대략 5 mL를 유통 셀에 첨가하고, 마이크로입자를 통하여 1 시간 동안 계속 적으로 흘리고, 0.3 M NaCl, PBS 완충액 10 mL로 세척하였다. 다시, 세척 후에 실시예 3에서 기재한 바와 같이 JBP2BC PNA 프로브 연결 마이크로입자의 공명광 산란 스펙트럼 주사를 얻었다.

이 결과를 표 6에서 나타내었다. 공명광 산란 패턴의 음성 이동을 마이크로입자로의 Lac2-F 표적 올리고뉴클레오티드의 비특이적 결합에서 관찰하였다. 이 결과는 또한 JBP2BC PNA 프로브 연결 마이크로입자로의 특이적 JBP-F 올리고뉴클레오티드 DNA 표적의 결합 시에 보다 큰 공명광 산란 패턴의 음성 이동이 관찰되고, 이는 PNA 올리고머-연결된 마이크로입자로의 DNA 올리고뉴클레오티드 결합을 검출하기 위한 공명광 산란의 용도를 나타내었다. 공명광 산란 스펙트럼의 음성 공명 파장 이동은, 비특이적 또는 특이적 분석물으로서 올리고뉴클레오티드 DNA 표적이 PNA 올리고머-연결된 마이크로입자으로 결합하였을 때 관찰되었다.

올리고뉴클레오티드 표적으로의 결합 시 PNA 프로브 연결 마이크로입자의 공명광 산란 스펙트럼의 공명 파장 이동

마이크로입자	공명 파장 이동 (nm), 단계 1-배경: 0.3 M NaCl, PBS 완충액, pH 7.4	공명 파장 이동 (nm), 단계 2-비특이적 분석물 표적: Lac2-F 올리고뉴클레오티드 비-특이적 결합	공명 파장 이동 (nm), 단계 3-특이적 분석물 표적: JBC-F 올리고뉴클레오티드 특이적 결합
JBP2BC PNA 프로브-연결된 마이크로입자	0.0±0.003	-0.0127±0.005	-0.0222±0.009

실시예 12

공명광 산란을 이용한 PNA 프로브 연결 마이크로입자 상으로의 PCR 산물 표적의 혼성화 포획의 검출

본 실시예의 목적은 공명광 산란으로 PNA 프로브 연결 마이크로입자를 사용한 PCR 산물 분석물의 검출을 나타내는 것이다.

A. 마이크로입자 제조 및 올리고뉴클레오티드 프로브 연결:

JBP2BC PNA 프로브 연결 마이크로입자는 실시예 11에서 사용된 것과 동일하다.

B. PCR 표적의 제조:

JBP2BC PNA 프로브 연결 마이크로입자에 대한 비특이적 PCR 시험 표적은 실시예 10의 JBP S2SP3B 프로브 연결 마이크로입자를 시험하기 위하여 사용된 동일한 511 bp 증폭된 Lac2-511 비대칭 PCR 산물 (서열 번호: 9)이었다. 실시예 10에서와 같이 증폭되었으나 20 pmol의 전방 프라이머 (P2FWD, 서열 번호: 10) 및 2 pmol의 역행 프라이머 (P33-4, 서열 번호: 11)가 있는 서열 번호 16인 206 bp 증폭된 JB 비대칭 PCR 산물의 상보체이다. 그후 산물 5 ㎕를 50 pmol의 전방 프라이머 및 5 pmol의 역행 프라이머 존재 시에 다시 증폭하였다.

C. 공명광 산란을 이용한 JBP2BCPNA 프로브 연결 마이크로입자 상으로의 FMD PCR 산물 표적 DNA의 혼성화 포획의 검출:

실시예 10에서 기재된 바와 같이, JBP2BC PNA 프로브 연결 마이크로입자 현탁액의 작은 분취량 2 내지 3 ㎕을 광학셀에 위치시켰다. 작은 수 (2 내지 6)의 마이크로입자를 함유하며, 도 8에 나타나고 실시예 9, 10 및 11에서 기재된 것과 유사한 가시 영역을 선택하였다. 공명광 산란 검출을 실시예 10에 기재된 바와 같이 수행하였고, 각 인큐베이션/세척 단계 후에 스펙트럼 검출을 얻었다. Lac2-511 PCR 단편 및 JB PCR 표적 단편을 각각 대조군 및 분석 표적으로서 사용하였다.

표 7의 결과는, JBP2BC PNA 프로브 연결 마이크로입자로의 JB PCR 산물의 결합 시의 공명광 산란 패턴에서 현저한 음성 이동이 관찰되었고, 이는 PNA 올리고머-연결된 마이크로입자에 결합된 특이적 PCR DNA 표적을 검출하기 위한 공명광 산란의 용도를 나타내는 것을 나타낸다.

PCR 제조된 DNA 분석물로의 PNA 프로브-연결 마이크로입자의 공명광 산란 스펙트럼에서의 공명 파장 이동

마이크로입자	공명 파장 이동 (nm), 단계 1-배경: 0.3 M NaCl, PBS 완충액, pH 7.4	공명 파장 이동 (nm), 단계 2-비특이적 분석물 표적: Lac2-511 PCR 단편	공명 파장 이동 (nm), 단계 3-특이적 분석물 표적: JB PCR 단편 특이적 결합
JBP2BC PNA 프로브-연결된 마이크로입자	0.0±0.00013	-0.0029±0.0016	-0.0158±0.0016

실시예 13

공명광 산란을 이용한 DNA 프로브 오프 마이크로입자의 분할의 검출

본 실시예의 목적은, DNA 표적 분석물이 DNA 프로브 연결 마이크로입자 상으로 포획될 때 관찰되는 음성 공명광 산란 스펙트럼 이동이 DNA-프로브로의 핵산의 결합에 기인한다는 것을 나타내는 것이다. 형광-표지된 분석물을 핵산-연결된 마이크로입자로의 분석물의 특이적 결합을 증명하기 위한 분석 대조군으로서 사용하고, 연결 교차-링커가 분할될 때 형성된 혼성화 복합체가 제거되었다.

A. 마이크로입자 제조:

고굴절률 유리 마이크로입자를 실시예 3, 9 및 10에서 기재된 바와 같이 제조하고 실란화하여 표면 반응성 아민기를 제조하였다. 이러한 아민-유도된 유리 마이크로입자를 하기와 같이 디술피드 결합을 형성하기 위하여 티올-변형된 올리고뉴클레오티드에 연결되는 피리딜디티오기로 추가로 유도하였다. 디술피드 결합은, 마이크로입자로부터 핵산 혼성화 복합체 또는 올리고뉴클레오티드 프로브를 제거하기 위하여 사용될 수 있는 DTT로 분해가능하였다.

피리딜디티오기로 마이크로입자를 변형하기 위하여 사용되는 연결화제는 술포숙신이미딜 6-[3'-(2-피리딜디티오)-프로피온아미도]헥사노에이트 (술포-LC-SPDP) (피어스 바이오테크놀로지 인크, 일리노이주 록포드)이었다. 이 커플화제는 마이크로입자의 표면 상에 아민기로 술포-LC-SPDP 교차-링커를 연결하는 분자의 한 말단에서 NHS기를 갖는다. 아민-유도된 유리 마이크로입자의 100 ㎍의 분취량을 100 mM 카르보네이트/바이카르보네이트 완충액 (pH 9.6), 122 mg/mL의 술포-LC-SPDP 및 25 % 디메틸포름아미드 (DMF)로 이루어진 반응 혼합물로 첨가하였다. 혼합물을 표면 아민이 술포-LC-SPDP 상에서 NHS기와 반응하도록 실온에서 2 시간 동안 회전하는 1.5 mL 둥근-바닥 튜브로 위치하였다. 결과 피리딜디티오-유도된 마이크로입자를 PBS (pH 7.4) 500 ㎕로 실온에서 세척하였다. 완충액 및 술포-LC-SPDP을 실온에서 12,000 rpm에서 소르발 마이크로스핀 마이크로원심분리기에서 마이크로콘 (등록상표) 100 마이크로농축기를 사용하여 현탁된 마이크로입자를 원심분리함으로써 제거하였다. 마이크로입자를 PBS 완충액으로 2회 세척하였다. 피리딜디티오-유도된 마이크로입자 펠렛을 두번째 1.5 mL 둥근-바닥 튜브로 전달하고, 4 ℃에서 보관하였다.

B. 올리고뉴클레오티드 프로브:

올리고뉴클레오티드 프로브는 실시예 9에서 기재되고 서열 번호 2로 주어진 JBP S2SP3B이다. JBP S2SP3B는 하기와 같이 피리딜디티오-유도된 마이크로입자로 연결하였다. 또한, 서열 번호 17인 3' 표지된 플루오르세인 프로브 (JBP S2SP3F) C₆-S-S(Sp)₂-TCAACCAGATGCAGGAGGACATGTCAACAAAACACGGACCCGACTTA A-F 3'를 피리딜디티오-유도된 마이크로입자로 연결하였다. 이 프로브를 또한 유도된 마이크로입자 상에서 피리딜디티오기와 반응시키기 위하여 디술피드 잔기에 의하여 5' 말단에서 변형하였다.

피리딜디티오-유도된 마이크로입자로 연결하기 위하여 변형된 JBP 프로브, JBP S2SP3F 및 JBP S2SP3B를 제조하기 위하여, 디술피드 조절인자를 개별 반응 혼합물에서 각 JBP 프로브 상에서 분리하였다. 반응 혼합물은 600 ㎕의 PBS 완충액 중의 JBP 프로브 70 nmol, 및 100 mM 디티오트레이톨 (DTT)을 함유하였다. 티올-변형된 올리고뉴클레오티드를 에탄올 침전에 의하여 C6-티오기 및 DTT로부터 정제하였다. 3 M 소듐 아세테이트 (pH 5.4) 100 ㎕, 및 100 % 에탄올 1000 ㎕를 각 반응에 첨가하고, 용액을 잘 혼합하였다. DNA 침전물을 12,000 rpm에서 실온에서 소르발 마이크로스핀 마이크로원심분리기에서 펠렛으로 원심분리하였다. JBP 프로브 펠렛을 70 % 에탄올로 2회 세척하고, 그후 개별 반응 튜브에서 이중-증류수 200 ㎕에 용해하였다. 양 올리고뉴클레오티드를 PBS (pH 7.4) 500 ㎕를 첨가하여 1.5 mL 둥근-바닥 튜브 중의 100 ㎍의 피리딜디티오-유도된 마이크로입자로 연결하고, 실온에서 2 시간 동안 회전시켜 표면 피리딜디티오-기가 티올-활성화된 JBP 프로브와 반응하도록 하였다. 양 유형의 JBP 프로브 연결 마이크로입자의 제제를 실온에서 500 ㎕ PBS로 세척하였다. PBS, DTT 및 반응하지 않는 JBP 프로브를 12,000 rpm에서 실온에서 소르발 마이크로스핀 마이크로원심분리기에서 마이크로콘 (등록상표) 100 마이크로농축기를 사용하여 현탁된 마이크로입자를 원심분리하여 제거하였다. 마이크로입자를 PBS로 2회 세척하였다. JBP 프로브 연결 마이크로입자 펠렛를 1.5 mL 마이크로-튜브로 전달하고, 4 ℃에서 보관하였다.

C. DNA-프로브 연결된 마이크로입자 상으로의 JBP 올리고뉴클레오티드 표적 DNA의 혼성화 포획의 형광 검출:

술포-LC-SPDP를 사용하여 마이크로입자로의 JBP 프로브의 가교-결합으로부터 형성된 디술피드 결합이 분해가능하다는 것을 나타내기 위하여, 디술피드 결합을 DTT로 환원하였다. PBS 완충액 (pH 7.4) 중의 JBP S2SP3F 프로브 연결 마이크로입자의 50 ㎕ 분취량을 10 분 동안 0.2 M DTT 50 ㎕로 처리하였다. 그후, 마이크로입자를 실시예 9에서 기재한 바와 같이 제이스 형광 현미경 하에서 관찰하였다. 결과 형광 현미경 사진은, 형광 마이크로입자는 더 이상 형광이 아니고, 피리딜디티오 교환 반응에 의하여 제조된 디술피드 결합이 DTT로 분해된다는 것을 나타내었다.

JBP 특이적 JBC-F (서열 번호: 5) 표적 및 비특이적 대조군 Lac2-F (서열 번호: 6)를 실시예 9에서 기재한 바와 같이 사용하여, 술포-LC-SPDP 교차-링커로 마이크로입자와 연결된 JBP 프로브, 즉 상기 JBP S2SP3B 프로브 연결 마이크로입자가 JBC-F DNA 표적에 특이적으로 결합할 수 있는지를 시험하였다.

실시예 9에 기재된 바와 같이 현상한 현미경 사진은 JBC-F DNA 표적이 형광 JBP 프로브/JBC 표적 혼성화 복합체를 형성함으로써 JBP 프로브 연결 마이크로입자 상으로 포획된다는 것을 나타내었다. Lac2-F 대조군 표적은 포획되지 않았다. 이러한 결과는 JBP/디술피드-연결된 마이크로입자가 JBC-F 표적 서열에 특이적이라는 것을 나타내었다. 그후, JBP 프로브/JBC 표적 혼성화 복합체를 상기와 같이 0.2 M DTT로 마이크로입자로부터 분리하였다. 결과 현미경 사진은 혼성화 복합체-분리된 마이크로입자가 덜 형광이고, 이것이 적어도 약간의 혼성화 복합체가 JBP-연결된 마이크로입자로부터 분리된다는 것을 나타내었다.

JBP 프로브-연결된 (w/술포-LC-SPDP) 마이크로입자를 이용한 공명광 산란 검출:

공명광 산란을 사용하여 JBP-연결된 마이크로입자로의 JBC-F (서열 번호: 5) 표적 DNA의 결합을 검출하였다. 과정은 실시예 2, 3 및 9에서 사용된 것과 유사하였다. 상기 부분 A 및 B에서 기재된 바와 같이 제조된 JBP-연결된 마이크로입자를 0.3 M NaCl, PBS 완충액, pH 7.4에서 분산하고, 결과 마이크로입자 현탁액의 작은 분취량 (2-3 ㎕)을 실시예 3에 기재되고 도 6에 기재된 것과 유사하게 광학셀에 위치시켰다. 작은 수 (2 내지 6)의 마이크로입자를 함유하는 도 8에 나타난 바와 유사한 가시 영역을 선택하였다. 영상을 포획하고, 픽셀 스택 파일로서 저장하고, 시스템의 퍼스널 컴퓨터에 장착된 소프트웨어로 분석하였다. 실시예 9에서와 같이, 분석 배경을 기록하기 위하여 프리스캔을 얻었다.

특이적 표적 JBC-F DNA (0.3 M NaCl, PBS (pH 7.4)의 1 μM)의 대략 5 mL를 약 1 mL/분의 유속으로 마이크로입자를 통하여 계속적으로 흘렸고, 1 시간 동안 폐쇄 루프 시스템에서 재순환하였다. 그후, 마이크로입자를 0.3 M NaCl, PBS (pH 7.4) 10 mL로 세척하고, 방출물을 폐기하였다. 세척 후에 공명광 산란 스펙트럼 측정을 얻었다. 그후, 환원제 (0.1 M 포스페이트 완충액 (pH 8.4) 중의 0.1 M DTT)를 30 분 동안 첨가하고, 0.3 M NaCl, PBS (pH 7.4) 10 mL로 세척하였다. 다시, 세척 후에 공명광 산란 스펙트럼 측정을 얻었다.

표 8에서 얻은 결과는, DNA 표적의 첨가 후 공명광 산란 패턴의 현저한 음성 이동이 있고, 일단 프로브-표적 복합체가 마이크로입자를 분리한 후 추가의 음성 이동이 있다는 것을 나타내었다. 데이터는 음성으로 나타난 이동이 가교결합제를 통하여 마이크로입자로 연결된 DNA (핵산) 프로브의 결과라는 것을 나타내었다. 데이터로부터, 마이크로입자로 연결된 핵산의 영향은 공명광 산란 분석에서의 핵산 분석물의 결합 시에 생성된 공명 파장 이동이 음성이라는 것을 나타내었다.

올리고뉴클레오티드 표적으로의 결합 시의 올리고뉴클레오티드 DNA 프로브 연결 마이크로입자의 공명광 산란 스펙트럼의 공명 파장 이동

마이크로입자	공명 파장 이동 (nm), 단계 1-배경: 0.3 M NaCl, PBS 완충액, pH 7.4	공명 파장 이동 (nm), 단계 3-특이적 분석물 표적: JBC-F 올리고뉴클레오티 결합	공명 파장 이동 (nm), 단계 3-프로브의 DTT 분리-마이크로입자로부터의 표적 복합체
JBP S2P3B 프로브-연결된 마이크로입자	0.0±0.005	-0.0161±0.004	-0.0275±0.006

실시예 14

1층을 더한 고굴절률을 갖는 마이크로입자에 대하여 예측되는 공명광 산란 스펙트럼, 공명 1 세트

본 실시예의 목적은 하나의 다른 층을 더한 고굴절률의 균일한 코어를 갖는 마이크로입자에 대한 공명광 산란 스펙트럼을 예측하기 위한 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하는 것이다. 10 nm 두께 단백질 층의 효과를 또한 예측하였다.

다층 구형 마이크로입자로부터의 공명광 산란의 컴퓨터 모델을 사용하여 시뮬레이션을 구성하였다. 사용된 모델은 참조 문헌, 예를 들어 [Kaiser, T. and Schweiger, G., Computers in Physics 7 (6), 682-686 (1993)]으로부터 잘 알려진 개념 및 원칙을 확장하였다. 모델은 직경 (코어) 또는 두께 (층) 및 굴절률 (RI)로 특정될 10 이하의 층을 가능하게 하였다. 하기 변수를 시뮬레이션에서 사용하였다:

매질 굴절률(RI) 1.33

출발 파장 770

종결 파장 780

산란각 180 도

검출 전체 수용 각도 21.7 도

코어의 직경 및 굴절률 및 층의 두께 및 굴절률은 다양하였다. 단백질 층의 결합을 마이크로입자 외측의 굴절률 1.45의 일정한 10 nm 두께의 층을 첨가하여 설계하였다.

입자-입자 규격:

입자 수는 시뮬레이션에 사용된 변수에 의하여 표 9에 나열하였다: 코어 직경 (도 18의 코어), 코어 굴절률 (도 18의 RI_코어), 층 1 두께 (도 18의 T1), 및 층 1 굴절률 (도 18의 RI_L1).

실시예 14의 예측되는 스펙트럼을 계산하는데 사용되는 입자 변수

입자 번호	코어 직경 (㎛)	코어 RI	층 1 두께 (㎛)	층 1 RI	단백질 층 (㎛)	단백질 층 RI
1 (기준 입자)	40	1.8	0.5	1.65	-	-
2	40.8	1.8	0.5	1.65	-	-
3	40	1.78	0.5	1.65	-	-
4	40	1.8	0.8	1.65	-	-
5	40	1.8	0.5	1.62	-	-
6	39.4	1.83	0.4	1.63	-	-
7	40	1.8	0.5	1.9	-	-
8	40	1.8	0.5	1.65	0.01	1.45

예측되는 산란 패턴을 도 18-19에서 나타내었다. 코어 및 층의 직경, 및 코어 및 층의 굴절률 (RI)의 변동은 입자의 식별 마커로서 사용하기에 적합한 산란 패턴의 변동을 유발하였다. 이러한 결과는 식별가능 마이크로입자로서 1 층을 더한 균일한 코어의 용도를 예시하였다.

10 nm 두께 단백질 층의 첨가는 표적 단백질 (입자 8)의 결합을 검출하는데 적합한 전체 산란 패턴의 이동을 유도하였다. 결합의 효과를 도 19에 나타난 바와 같이, 단백질 층을 함유하는 입자의 산란 곡선과 기준 입자의 산란 곡선을 비교하여 도표로 나타낼 수 있었다. 편의를 위하여, 결합 시에 일어나는 패턴 이동을 보다 쉽게 보여주는 확대된 파장 스케일로 결합 대 비결합 입자를 비교하는 2개의 곡선을 나타내었다. 기준 입자로의 결합 만에 대한 비교를 나타내었지만, 실시예에서 임의의 다른 입자에서도 동일한 효과를 볼 수 있었다.

실시예 15

1 층을 더한 낮은 굴절률 코어를 갖는 마이크로입자에 대한 예측되는 공명광 산란, 공명 1 세트

본 실시예의 목적은 보다 높은 굴절률의 다른 층을 더한 낮은 굴절률의 균일한 코어를 갖는 마이크로입자에 대한 공명광 산란 스펙트럼을 예측하는 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하는 것이다. 10 nm 두께 단백질 층의 효과를 또한 예측하였다.

시뮬레이션된 스펙트럼을 매질 RI, 출발 및 종결 파장, 산란각, 및 검출 전체 수용 각도에 대한 실시예에서 주어진 동일한 값을 사용하여 실시예 5에 기재된 바와 같이 계산하였다. 코어의 직경 및 굴절률, 및 층의 두께 및 굴절률은 다양하였다. 단백질 층의 결합은 마이크로입자의 외측 상에 굴절률 1.45의 일정한 10 nm 두께 층을 첨가하여 설계하였다.

입자-입자 규격:

입자 수는 시뮬레이션에 사용된 변수에 의하여 표 10에 나열하였다: 코어 직경 (도 20의 D_코어), 코어 굴절률 (도 20의 RI_코어), 층 1 두께 (도 20의 T1), 및 층 1 굴절률 (도 20의 RI_L1). 이 실시예에서, 입자 1은 기준을 위한 단지 균일한 코어였다. 잔여 입자에서, 코어 및 층 두께는 전체 입자 크기가 입자 1에 대한 것과 동일하였다. 단백질의 첨가는 입자 2에 대하여 이루어졌고, 단백질 결합의 검출을 예시하는 목적에 있어서, 입자 2를 기준 입자로서 사용하여야 한다.

실시예 15의 예측되는 스펙트럼을 계산하는데 사용되는 입자 변수

입자 번호	코어 직경 (㎛)	코어 RI	층 1 두께 (㎛)	층 1 RI	단백질 층 (㎛)	단백질 층 RI
1	40	1.5	0	-	-	-
2 (기준 입자)	20	1.5	10	1.7	-	-
3	19.1	1.5	10	1.7	-	-
4	20	1.6	10	1.7	-	-
5	20	1.5	9	1.7	-	-
6	20	1.5	10	1.74	-	-
7	20.3	1.57	8	1.67	-	-
8	20	1.5	10	1.7	0.01	1.45

예측되는 산란 패턴을 도 20-21에서 나타내었다. 이러한 결과는 식별가능 마이크로입자로서의 높은 굴절률의 층을 더한 낮은 굴절률의 균일한 코어의 용도를 예시한다. 상기 마이크로입자는 층과 매질 사이의 높은/낮은 굴절률 전이에 의하여 형성되는 산란 공명의 세트를 유발하였다. 초곡면 (초곡면의 정의는 예를 들어 [Roll, G. and Schweiger, G., J. Opt. Soc. Am. A 17 (7), 1301-1311 (2000)] 참조)외측의 코어의 직경의 변동, 층의 두께의 변동, 및 코어 및 층의 굴절률 (RI)에서의 변동은 입자 (번호 1-7)의 식별 마커로서 사용하기에 적합한 산란 패턴에서의 변동을 야기하였다. 10 nm 두께 단백질 층의 첨가는 도 21에 나타난 바와 같이, 표적 단백질 (번호 8)의 결합을 검출하는데 적합한 전체 산란 패턴에서의 이동을 유도하였다.

실시예 16

1 층을 더한 고굴절률 코어를 갖는 마이크로입자에 대한 예측되는 공명광 산란 스펙트럼, 공명 2 세트

본 실시예의 목적은, 낮은 굴절률의 다른 층을 더한 고굴절률의 균일한 코어의 마이크로입자에 대한 공명광 산란 스펙트럼을 예측하기 위한 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하는 것이다. 10 nm 두께 단백질 층의 효과를 또한 예측하였다.

시뮬레이션된 스펙트럼을 매질 RI, 출발 및 종결 파장, 산란각, 및 검출 전체 수용 각도에 대하여 실시예에서 주어진 동일한 값을 이용하여 실시예 5에서 기재된 바와 같이 계산하였다. 코어의 직경 및 굴절률 및 층의 두께 및 굴절률은 다양하였다. 단백질 층의 결합은 마이크로입자의 외측의 굴절률 1.45의 일정한 10 nm 두께 층의 첨가에 의하여 설계하였다.

입자-입자 규격:

입자 수는 시뮬레이션에 사용된 변수에 의하여 표 11에 나열하였다: 코어 직경 (도 22의 D_코어), 코어 굴절률 (도 22의 RI_코어), 층 1 두께 (도 22의 T₁), 및 층 1 굴절률 (도 22의 RI_L1). 이 실시예에서, 입자 1은 기준을 위한 단지 균일한 코어였다. 잔여 입자에서, 코어 및 층 두께는 전체 입자 크기가 입자 1에 대한 것과 동일하였다. 단백질의 첨가는 입자 2에 대하여 이루어졌고, 단백질 결합의 검출을 예시하는 목적에 있어서, 입자 2를 기준 입자로서 사용하여야 한다.

실시예 16의 예측되는 스펙트럼을 계산하는데 사용되는 입자 변수

입자 번호	코어 직경 (㎛)	코어 RI	층 1 두께 (㎛)	층 1 RI	단백질 층 (㎛)	단백질 층 RI
1	40	1.65	-	-	-	-
2 (기준 입자)	30	1.85	10	1.65	-	-
3	31.1	1.85	10	1.65	-	-
4	30	1.87	10	1.65	-	-
5	30	1.85	10.9	1.65	-	-
6	30	1.85	10	1.67	-	-
7	29.5	1.82	9.7	1.63	-	-
8	1.85	10	1.65	0.01	0.01	1.45

예측되는 산란 패턴을 도 22-23에서 나타내었다. 이러한 결과는 식별가능 마이크로입자로서의 낮은 굴절률의 층을 더한 고굴절률의 균일한 코어의 용도를 예시하였다. 상기 마이크로입자는 실시예 6의 입자에 비교한 추가의 산란 공명을 유발하였다. 전이가 공명의 제2 세트를 성립시키기에 충분하기 때문에, 코어와 층 사이의 높은/낮은 굴절률 전이에 의하여 이러한 추가의 공명을 형성하였다. 코어 및 층의 직경의 변동, 코어 및 층의 굴절률 (Rl)의 변동은 입자 (번호. 1-7)에 대한 식별 마커로서 사용하기에 적합한 산란 패턴의 변동을 유발하였다. 10 nm 두께 단백질 층의 첨가는 도 23에 나타난 바와 같이, 표적 단백질 (번호 8)의 결합을 검출하기에 적합한 전체 산란 패턴의 이동을 유도하였다.

실시예 17

2층을 더한 저굴절률 코어를 갖는 마이크로입자에 대한 예측되는 공명광 산란 스펙트럼, 공명의 제2 세트

본 실시예의 목적은 다른 것보다 높은 굴절률을 갖는 2 층을 더한 낮은 굴절률의 균일한 코어를 갖는 입자에 대한 공명광 산란 스펙트럼을 예측하기 위한 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하는 것이다. 10 nm 두께 단백질 층의 효과를 또한 예측하였다.

시뮬레이션된 스펙트럼을 매질 RI, 출발 및 종결 파장, 산란각, 및 검출 전체 수용 각도에 대한 실시예에서 주어진 동일한 값을 사용하여 실시예 5에서 기재된 바와 같이 계산하였다. 단백질 층의 결합을 마이크로입자의 외측에 굴절률 1.45의 일정한 10 nm 두께 층의 첨가에 의하여 설계하였다.

입자-입자 규격:

입자 수는 시뮬레이션에 사용된 변수에 의하여 표 12에 나열하였다: 코어 직경 (도 24의 D_코어), 코어 굴절률 (도 24의 RI_코어), 층 1 및 2 두께 (각각 도 24의 T₁ 및 T₂), 및 층 1 및 층 2 굴절률 (각각 도 24의 RI_L1 및 RI_L2). 이 실시예에서, 입자 1은 기준을 위한 단지 균일한 코어였다. 잔여 입자에서, 코어 및 층 두께는 전체 입자 크기가 입자 1에 대한 것과 동일하였다. 단백질의 첨가는 입자 2에 대하여 이루어졌고, 단백질 결합의 검출을 예시하는 목적에 있어서, 입자 2를 기준 입자로서 사용하여야 한다.

실시예 17의 예측되는 스펙트럼을 계산하는데 사용되는 입자 변수

입자 번호	코어 직경 (㎛)	코어 RI	층 1 두께 (㎛)	층 1 RI	층 2 두께 (㎛)	층 2 RI	단백질 층 (㎛)	단백질 층 RI
1	40	1.7	-	-	-	-	-	-
2 (기준 입자)	20	1.7	10	1.85	10	1.7	-	-
3	20	1.7	10	1.85	10	1.7	0.01	1.45

예측되는 산란 패턴을 도 24에서 나타내었다. 이러한 결과는 식별가능 마이크로입자로서, 하나가 다른 것 보다 높은 굴절률을 갖는 것인, 2 층을 더한 낮은 굴절률의 균일한 코어의 용도를 예시하였다. 상기 마이크로입자는, 제2 층과 매질 사이의 높은/낮은 굴절률 전이에 의하고, 또한 코어와 제1 층 사이의 높은/낮은 굴절률 전이에 의하여 형성된 다중 산란 공명을 유발하였다. 코어 및 층의 직경의 변동, 및 코어 및 층의 굴절률 (RI)의 변동은 입자의 식별 마커로서 사용하기에 적합한 산란 패턴의 변동을 유발하였다. 이 실시예에서, 기준 입자 만을 나타내었다. 한번에 한가지 또는 한가지 이상으로 5 종의 변수를 변화시켜, 이전의 실시예에서와 같이 독특한 스펙트럼을 형성하였다. 10 nm 두께 단백질 층의 첨가는 표적 단백질의 결합을 측정하기에 적합한 전체 산란 패턴의 이동을 유도하였다. 간결함을 위하여, 염기 경우만을 나타내었다. 어느 조합에서든 변수의 변화는 산란광 패턴의 변화를 야기하였고, 이는 입자 집단에 대한 식별 마커의 높은 다중성을 형성하는데 유용함을 나타내었다.

실시예 18

흑색 중심을 갖는 코어를 갖는 마이크로입자에 대한 예측되는 공명광 산란 스펙트럼

본 실시예의 목적은 2-부분 코어를 갖는 입자에 대한 공명광 산란 스펙트럼을 예측하기 위한 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하는 것이다. 내측 부분은 광학적으로 불투명한 구이고, 외측 부분은 광학적으로 투명한 쉘이다. 10 nm 두께 단백질 층의 효과를 또한 예측하였다.

시뮬레이션된 스펙트럼을 매질 RI, 출발 및 종결 파장, 산란각, 및 검출 전체 수용 각도에 대하여 실시예에서 주어진 것과 동일한 값을 이용하여 실시예 5에서 기재된 바와 같이 계산하였다. 단백질 층의 결합을 마이크로입자 외측 상에서 굴절률 1.45의 일정한 10 nm 두께 층을 첨가하여 설계하였다.

입자-입자 규격:

입자 수는 시뮬레이션에 사용된 변수에 의하여 표 13에서 나열하였다: 코어 직경 (도 25의 D_{내측 코어}), 외측 코어 직경 (도 25의 D_외측코어), 및 외측 코어 굴절률 (도 25의 RI_외측코어). 이 실시예에서, 입자 1은 기준을 위한 단지 균일한 코어였다. 잔여 입자에서, 내측 및 외측 코어 직경은 전체 입자 크기가 입자 1에 대한 것과 동일하였다. 단백질의 첨가는 입자 11에 대하여 이루어졌고, 단백질 결합의 검출을 예시하는 목적에 있어서, 입자 11을 기준 입자로서 사용하여야 한다.

실시예 18의 예측되는 스펙트럼을 계산하는데 사용되는 입자 변수

입자 번호	코어 직경 (㎛)	코어 RI	흑색 코어 직경(㎛)	흑색 코어 실제 RI	흑색 코어 영상 RI	층 두께 (㎛)	층 RI	단백질 층 (㎛)	단백질 층 RI
1	40	1.8	-	-	-	-	-	-	-
2-6	-	-	5씩 5에서 25로 증가	1.8	0.01	40 ㎛ 전체 직경을 형성	1.8	-	-
7-18	-	-	1씩 26에서 37로 증가	1.8	0.01	40 ㎛전체 직경을 형성	1.8	-	-
19	-	-	30	1.8	0.01	10	1.8	0.01	1.45

예측되는 산란 패턴을 도 25-27에서 나타내었다. 도 26에서, 흡수 코어의 존재로부터 약 29 ㎛ 미만의 코어 직경에 대하여 효과가 없음이 나타났다. 이러한 코어 직경은 초곡면의 직경보다 작았다. 광학 공명이 사라지는 것은 흡수 코어의 직경이 초곡면의 직경으로 도달하는 것으로 나타났다. 이 실시예에서, 초곡면은 직경 31 내지 32 ㎛였다. 효과는 코어 직경이 증가함에 따라서 매우 급속하였다. 일부 공명 구조는 31 ㎛ 코어 입자에서 여전히 나타났으며, 코어가 32 ㎛에 도달하였을 때, 공명은 실질적으로 파괴되었다. 내부 흡수 코어가 커질수록, 그것은 결국 대부분의 입자를 포함하였다. 흡수 코어 직경의 일부 값이 공명 패턴의 물결 구조를 천천히 변화시키고, 이전의 실시예에서 나타난 예리한 공명 구조는 회복되지 않았다. 도 27은 2-층 코어의 외측 상에 단백질 결합의 검출을 나타내고, 코어는 흡수 구를 포함하였다. 이 실시예에서, 코어 직경은 초곡면의 직경보다 작고, 그러므로 공명 특징의 형성을 간섭하지 않았다.

이 실시예의 결과는 화선 표면의 내측이 광학 공명의 형성을 간섭하지 않는다는 것을 나타내었다. 그러므로, 예를 들어 코어는 고도의 광-흡수 내측 입자, 예를 들어 자성 또는 채색된 마이크로구로 이루어질 수 있고, 단 내측 입자의 직경은 초곡면의 직경보다 작다. 이 실시예의 13 내지 18에 나타난 바와 같이, 내측 흡수 코어의 직경이 초곡면의 직경에 도달할 때, 공명 산란 특징의 형성부은 더이상 가능하지 않았다. 물리적으로, 이는 광선이 입자의 외측 표면 내부의 궤도에서 공명 산란 특징부 이송을 유발하고, 전체 내측 반사에 의하여 막혔다. 초곡면은 입자의 물리적 외측 표면의 내부에 위치하고, 이송을 발사하는 영역을 한정하였다. 흡수 코어가 이 영역으로 침식하기에 충분히 큰 경우, 그것은 광선을 흡수하고, 공명을 일으키는 능력을 파괴하였다.

"흑색-중심의" 2-층 마이크로입자의 표면 상의 단백질 층의 결합은, 코어가 공명의 형성을 가능하게 하도록 충분히 작은 입자에 대한 산란 패턴의 이동로서 검출되었다.

실시예 19

광선이 다양한 굴절률 코어를 갖는 마이크로입자에 대하여 예측되는 공명광 산란 스펙트럼

본 실시예의 목적은 굴절률이 중심으로부터의 거리의 함수인 코어를 갖는 입자에 대한 공명광 산란 스펙트럼을 예측하기 위한 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하는 것이다. 10 nm 두께 단백질 층의 효과를 또한 예측하였다.

시뮬레이션된 스펙트럼을 매질 RI, 출발 및 종결 파장, 산란각, 및 검출 전체 수용 각도에 대한 실시예에서 주어진 것과 동일한 값을 사용하여 실시예 5에 기재된 바와 같이 계산하였다. 굴절률 변화는 9층을 더한 코어로서 설계하였고, 층의 굴절률은 그의 반경에 따라서 변화하였다. 선형 및 비-선형 변화를 포함하는, 반경의 굴절률의 변화의 몇몇 유형을 사용하였다. 단백질 층의 결합은 마이크로입자 외측 상의 굴절률 1.45의 일정한 10 nm 두께 층의 첨가에 의하여 설계하였다.

입자-입자 규격:

기준 입자인, 입자 1을 제외하고는, 입자 수는 시뮬레이션에서 사용되는 변수에 따라서 표 14에 나열하였다: 코어 굴절률 (도 28의 RI_코어), 및 층 1, 2, 3,... 9 굴절률 (도 28에서 각각 RI_L1-RI_L9). 이 실시예에서, 입자 1은 기준을 위한 단지 균일한 코어였다. 잔여 입자에 있어서, 코어 및 층 두께는 전체 입자 크기가 입자 1과 동일하였다. 잔여 입자에, 단백질의 첨가를 입자 5에 대하여 수행하였고, 단백질 결합의 검출을 예시하기 위한 목적에 있어서, 입자 5를 기준 입자로서 사용하여야 한다. 간결함을 위하여, 모든 층을 도면에 나타내지는 않았다. 균일한 구조를 위한 기준 입자인 입자 1은 40 ㎛의 코어 직경 및 1.8의 코어 RI를 갖는다. 입자 2-8에 있어서, 코어 직경은 8 ㎛이며 층 두께는 2 ㎛였고, 입자 2-8의 전체 직경을 입자 1과 동일하도록 40 ㎛가 되도록 하였다.

예측되는 산란 패턴을 도 28-29에서 나타내었다. 이러한 결과는 굴절률이 중심으로부터의 거리의 함수로서 변화하는 코어의 용도를 예시한다. 이 실시예의 결과는 광선이 변화하는 굴절률을 유도하는 방식으로 입자를 제조하여 식별가능 마이크로입자의 집단을 구성하는 가능성을 나타내었다. 입자 집단을 위한 어떤 형성 방법에서 자연적 변동이 일어날 것이고, 이러한 변동은 그의 광학 산란 패턴의 방법으로 독특하게 구별가능한 입자를 유발하였다. 광선 변화 코어의 표면에서의 단백질 층의 결합은 산란 패턴의 이동로서 검출되었다.

실시예 20

공명광 산란 스펙트럼 상에서의 매질 굴절률의 예측되는 효과

본 실시예의 목적은 공명광 산란 스펙트럼 상에 위치한 마이크로입자의 매질의 굴절률의 변화를 예측하기 위하여 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하는 것이다. 본 실시예는 추가의 광학 활성 층을 갖지 않는 균일한 구에 대한 것이다. 매질의 굴절률 변화의 효과는 단백질 층 결합의 효과와 비교하였다.

시뮬레이션된 스펙트럼을 출발 및 종결 파장, 산란각, 및 검출 전체 수용 각도에 대한 실시예에서 주어진 것과 동일한 값을 사용하여 실시예 5에서 기재한 바와 동일하게 계산하였다. 매질의 굴절률은 다양하였다. 단백질 층의 결합은 마이크로입자의 외측 상에서 굴절률 1.45의 일정한 10 nm 두께 층의 첨가에 의하여 설계되었다.

입자-입자 규격:

입자 수는 시뮬레이션에서 사용되는 변수에 따라서 표 15에서 나열하였다: 코어 직경 (도 30의 D_코어), 코어 굴절률 (도 307의 RI_코어), 및 매질 굴절률 (RI).

실시예 20의 예측디는 스펙트럼을 계산하는데 사용되는 입자 변수

입자 번호	코어 직경 (㎛)	코어 RI	매질 RI	단백질 층 (㎛)	단백질 층 RI
1 (기준 입자)	40	1.8	1.33	-	-
2	40	1.8	1.33665	-	-
3 (단백질을 더한 코어, 초기 RI)	40	1.8	1.33	0.01	1.45
4 (단백질을 더한 코어, 변화된 RI)	40	1.8	1.33665	0.01	1.45

예측되는 산란 스펙트럼을 도 30-31에서 나타내었다. 도 31에서 나타낸 바와 같이 (스펙트럼의 상단 및 하단 쌍), 상대적인 피크 강도에 변화가 있었으며, 매질 굴절률이 변화할 때 파장의 시스템 이동이 변화하였다. 도 31 (스펙트럼의 중간 쌍)에서 나타난 바와 같이, 단백질 층을 기준 입자에 첨가하였을 때 상대적인 피크 강도에 변화가 없는 스펙트럼에서의 이동이 있었다.

실시예 21

굴절률 2.5 물질을 이용한 신호 증폭의 예측되는 효과

본 실시예의 목적은 마이크로입자의 표면 상의 표적으로의 결합 시에 파장 이동을 증진하기 위한, 표적 분자에 부착된 고굴절률 구조 (예를 들어, TiO₂ 나노입자)의 사용 효과를 예측하기 위한 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하는 것이다.

시뮬레이션된 스펙트럼을 매질 RI, 출발 및 종결 파장, 산란각, 및 검출 전체 수용 각도에 대하여 실시예에서 주어진 동일한 값을 사용하여 실시예 5에 기재된 바와 같이 계산하였다. 증폭 효과는 두께가 나노입자의 주어진 질량에 상응하는 고굴절률 물질의 박층을 단백질층이 첨가되는 2-층 마이크로입자의 외측으로 첨가함으로써 설계하였다. 본 실시예에서, 증폭 구조는 2.5 굴절률로 정해졌다.

입자-입자 규격:

입자 수를 시뮬레이션에 사용된 변수에 따라서 표 16에 나열하였다: 코어 직경 (도 32의 D_코어), 코어 굴절률 (도 32의 RI_코어), 층 1 두께 (도 32의 T₁), 층 1 굴절률 (도 32의 RI_L1), 단백질 층 두께 (도 32의 T₂), 단백질 층 굴절률 (도 32의 RI_L2), 증폭 층 두께 (도 32의 T₃), 및 증폭 층 굴절률 (도 32의 RI_L3).

실시예 21의 예측되는 스펙트럼을 계산하는데 사용되는 입자 변수

입자 번호	코어 직경 (㎛)	코어 RI	층 1 두께 (㎛)	층 1 RI	단백질 층 (㎛)	단백질 층 RI	증폭 층 두께 (nm)	증폭 층 RI
1 (기준 입자)	40	1.7	0.4	1.6	-	-	-	-
2	40	1.7	0.4	1.6	0.01	1.45	-	-
3-5	40	1.7	0.4	1.6	0.01	1.45	2씩 2에서 6nm로 증가	2.5

증폭 층 두께의 증가 효과를 도 32-33에서 나타내었다. 증폭 물질을 첨가함에 따라, 증폭 물질을 사용하지 않은 것에 비하여 파장 이동이 증가하였다. 이러한 결과는 마이크로입자의 표면으로의 표적의 결합 시에 파장 이동을 증진하기 위하여 표적 분자에 부착된 고굴절률 구조 (예를 들어, Ti0₂ 나노입자)의 용도를 예시하였다. 이는 결합 신호의 on-마이크로입자 증폭의 개념이다. 표적 만이 측정되기 때문에 부착된 증폭제 구조를 갖는 비결합 표적 분자가 산란 스펙트럼에 간섭 효과가 없을 것이라는 것을 주지하여야 한다.

실시예 22

굴절률 2.2 물질을 사용한 신호 증폭의 예측되는 효과

본 실시예의 목적은 마이크로입자의 표면으로의 표적의 결합시 파장 이동을 증진하기 위하여 표적 분자에 부착된 고굴절률 구조 (예를 들어, 금속 또는 산화 금속 또는 기타 나노입자의 조성물)의 사용 효과를 예측하기 위한 컴퓨터 시뮬레이션을 사용하는 것이다.

시뮬레이션된 스펙트럼을 매질 RI, 출발 및 종결 파장, 산란각, 및 검출 전체 수용 각도에 대하여 실시예에서 주어진 것과 동일한 값을 사용하여 실시예 5에서 기재된 바와 같이 계산하였다. 증폭 효과를 단백질 층이 첨가된 2-층 마이크로입자의 외측으로의 나노입자의 주어진 질량에 상응하는 두께를 갖는 고-굴절률 물질의 박층을 첨가하여 설계하였다. 본 실시예에서, 증폭 구조가 실시예 12의 것보다 약간 적은 2.2의 굴절률을 가졌다.

입자-입자 규격:

입자 수를 시뮬레이션에 사용딘 변수에 의하여 표 17에서 나열하였다: 코어 직경 (도 34의 D_코어), 코어 굴절률 (도 34의 RI_코어), 층 1 두께 (도 34의 T₁), 층 1 굴절률 (도 34의 RI_L1), 단백질 층 두께 (도 34의 T₂), 단백질 층 굴절률 (도 34의 RI_L2), 증폭 층 두께 (도 34의 T₃), 및 증폭 층 굴절률 (도 34의 RI_L3).

실시예 22의 예측되는 스펙트럼을 계산하는데 사용되는 입자 변수

입자 번호	코어 직경 (㎛)	코어 RI	층 1 두께 (㎛)	층 1 RI	단백질 층 (㎛)	단백질 층 RI	증폭 층 두께 (nm)	증폭 층 RI
1 (기준 입자)	40	1.7	0.4	1.6	-	-	-	-
2	40	1.7	0.4	1.6	0.01	1.45	-	-
3-7	40	1.7	0.4	1.6	0.01	1.45	2씩 2에서 10nm로 증가	2.2

증폭 층 두께의 증가 효과를 도 34-37에서 나타내었다. 증폭 물질을 더 첨가할수록, 파장 이동은 증폭 물질을 사용하지 않았을 때에 비교하여 증가하였다. 증폭 효과는 실시예 12의 보다 높은 굴절률 물질에 대한 것 보다 실시예 13의 보다 낮은 굴절률 물질에서 약간 낮다는 것으로 나타났다.

이러한 결과는 마이크로입자의 표면으로의 표적의 결합 시에 파장 이동을 증진하기 위하여, 표적 분자에 부착된 고굴절률 구조 (예를 들어, 금속, 산화 금속 또는 기타 나노입자의 조성물)의 용도를 예시하였다. 이는 결합 신호의 on-마이크로입자 증폭의 일반적인 개념이다. 부착된 증폭제 구조를 갖는 비결합 표적 분자는 결합 표적 만이 측정되기 때문에 산란 스펙트럼 상에 간섭 효과가 없을 것이라는것을 주지하여야 한다.

스펙트럼의 좁은 공명 피크의 모양 및 강도가 계산에 사용되는 파장 단계 크기에 영향을 받을 수 있다는 것을 주지하여야 한다. 모든 전술한 컴퓨터 시뮬레이션 실시예, 즉 실시예 5-13에서, 2000 파장 단계를 사용하였다. 일부 경우에, 단계 크기의 감소는 표시되는 추가의 좁은 공명을 유발할 수 있지만; 이는 이들 실시예에 의하여 도시되는 결과를 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 실시 측정에서, 검출 장치의 분해능은 공명이 입자를 확인하고 결합을 측정하는데 사용될 것을 지시할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> E.I. du Pont de Nemours and Co. <120> Microparticle-Based Methods and Systems and Applications Thereof <130> CL1665 PCT <160> 17 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 516 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic FMD target <400> 1 gcggccgcgc ccccggccac ttttggccat tcacccgagc gaagctagac acaaacaaaa 60 gattgtggca ccggtgaaac agcttttgag ctttgacctg ctcaagttgg caggggacgt 120 cgagtccaac cctgggcctt tcttcttctc tgacgttagg tcaaattttt ccaagttggt 180 tgaaaccatc aaccagatgc aggaggacat gtcaacaaaa cacggacccg actttaaccg 240 gttggtgtct gcatttgagg aactggccac cggagtgaag gctatcagga ccggtctcga 300 tgaggccaaa ccctggtaca agctcatcaa gctcttgagc cgcctgtcat gtatggccgc 360 tgtagcagca cggtcaaagg acccagtcct tgtggccatc atgctggctg acaccggcct 420 tgagattctg gacagtacct ttgtcgtgaa gaagatctcc gactcgctct ccagtctctt 480 tcacgtaccg gcccccgtct tcagtttcgg gaattc 516 <210> 2 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide probe JBP <400> 2 tcaaccagat gcaggaggac atgtcaacaa aacacggacc cgacttaa 48 <210> 3 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified oligonucleotide probe JBP S2SP3B <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> C6-S-S(Sp)2, where C6-S-S is 1-O-dimethoxytritylhexyl-disulfide, 1-[(2-cyanoethyl)-N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite and Sp is the spacer 18-O-dimethoxytritylhexaethyleneglycol, 1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite <220> <221> modified_base <222> (48)..(48) <223> Biotinylated <400> 3 tcaaccagat gcaggaggac atgtcaacaa aacacggacc cgacttaa 48 <210> 4 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide probe N-JBC <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> amine group <220> <221> modified_base <222> (48)..(48) <223> biotinylated <400> 4 ttaagtcggg tccgtgtttt gttgacatgt cctcctgcat ctggttga 48 <210> 5 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fluorescein-labeled oligonucleotide target JBC-F <220> <221> modified_base <222> (48)..(48) <223> Fluorescein labeled <400> 5 ttaagtcggg tccgtgtttt gttgacatgt cctcctgcat ctggttga 48 <210> 6 <211> 49 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fluorescein-labeled oligonucleotide target control Lac2-F <220> <221> modified_base <222> (49)..(49) <223> Fluorescein labeled <400> 6 tgaatttgat tgcgagtgag atatttatgc cagccagcca gacgcagac 49 <210> 7 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Fluorescein-labeled oligonucleotide target JBP-F <220> <221> modified_base <222> (48)..(48) <223> Fluorescein labeled <400> 7 tcaaccagat gcaggaggac atgtcaacaa aacacggacc cgacttaa 48 <210> 8 <211> 206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FMD PCR fragment JB <400> 8 gagtccaacc ctgggccctt cttcttctct gacgttaggt caaatttttc caagttggtt 60 gaaaccatca accagatgca ggaggacatg tcaacaaaac acggacccga ctttaaccgg 120 ttggtgtctg catttgagga actggccacc ggagtgaagg ctatcaggac cggtctcgat 180 gaggccaaac cctggtacaa gctcat 206 <210> 9 <211> 511 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Lac2-511 PCR nonspecific target fragment <400> 9 atactgcaga acgcgtcagt gggctgatca ttaactatcc gctggatgac caggatgcca 60 ttgctgtgga agctgcctgc actaatgttc cggcgttatt tcttgatgtc tctgaccaga 120 cacccatcaa cagtattatt ttctcccatg aagacggtac gcgactgggc gtggagcatc 180 tggtcgcatt gggtcaccag caaatcgcgc tgttagcggg cccattaagt tctgtctcgg 240 cgcgtctgcg tctggctggc tggcataaat atctcactcg caatcaaatt cagccgatag 300 cggaacggga aggcgactgg agtgccatgt ccggttttca acaaaccatg caaatgctga 360 atgagggcat cgttcccact gcgatgctgg ttgccaacga tcagatggcg ctgggcgcaa 420 tgcgcgccat taccgagtcc gggctgcgcg ttggtgcgga tatctcggta gtgggatacg 480 acgataccga agacagctca tggaattctg t 511 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 gagtccaacc ctgggccctt cttcttc 27 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 atgagcttgt accagggttt ggc 23 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 atactgcaga acgcgtcagt gggctgatca 30 <210> 13 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 acagaattcc atgagctgtc ttcggtatcg tcgta 35 <210> 14 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Peptide nucleic acid probe JBP2C <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Nucleotide bases are joined by peptide bonds instead of phosphodiester bonds <400> 14 tccgtgtttt gttgac 16 <210> 15 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified Peptide Nucleic Acid Probe JBP2BC <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> Biotinylated <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Nucleotide bases are joined by peptide bonds instead of phosphodiester bonds <220> <221> modified_base <222> (16)..(16) <223> Cysteine residue <400> 15 tccgtgtttt gttgac 16 <210> 16 <211> 206 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Compliment of PCR product JB <400> 16 atgagcttgt accagggttt ggcctcatcg agaccggtcc tgatagcctt cactccggtg 60 gccagttcct caaatgcaga caccaaccgg ttaaagtcgg gtccgtgttt tgttgacatg 120 tcctcctgca tctggttgat ggtttcaacc aacttggaaa aatttgacct aacgtcagag 180 aagaagaagg gcccagggtt ggactc 206 <210> 17 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified fluorescein-labeled oligonucleotide probe JBP S2SP3F <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> C6-S-S-(Sp)2, where C6-S-S is 1-O-dimethoxytritylhexyl-disulfide, 1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite, and Sp is the spacer 18-O-dimethoxytritylhexaethyleneglycol, 1-[(2-cyanoethyl)-(N,N-diisopropyl)]-phosphoramidite <220> <221> modified_base <222> (48)..(48) <223> Fluorescein labeled <400> 17 tcaaccagat gcaggaggac atgtcaacaa aacacggacc cgacttaa 48

Claims (70)

1. (a) 분석 파장 범위에 걸쳐 빛을 방출하는 광주사원을 제공하는 단계,

   (b) 2종 이상의 실질적으로 구형인 식별가능 입자를 제공하는 단계,

   (c) (b)의 입자에, 그 표면에 결합하고 1종 이상의 분석물에 대해 친화성을 갖는 1종 이상의 포획 프로브를 적용하는 단계,

   (d) (c)의 각 입자를 제1 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 주사하여 (c)의 각 입자에 대해 각 입자를 독특하게 식별시키는 1 이상의 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키는 단계,

   (e) 1종 이상의 포획 프로브를 각각의 식별된 (d)의 입자와 연관시키는 단계,

   (f) 샘플 내에 분석물이 존재하면 1종 이상의 포획 프로브와 1종 이상의 분석물 사이에 결합이 일어나는, 1종 이상의 분석물을 함유하고 있는 것으로 추측되는 상기 샘플과 (e)의 입자를 접촉시키는 단계,

   (g) (f)의 입자를 제2 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 주사하여 (f)의 각 입자에 대해 1 이상의 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키는 단계,

   (h) 1 이상의 제1 대조 광산란 시그너쳐 중 임의의 것과 1 이상의 제2 광산란 시그너쳐 중 임의의 것으로 이루어진 군에서 선택된 공명광 산란 시그너쳐들 사이의 차이를 비교하여 1종 이상의 포획 프로브에 대한 1종 이상의 분석물의 결합을 검출하는 단계, 및

   (i) 단계 (e)에서 얻어진 연관성 및 1 이상의 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐에 기초하여 1종 이상의 결합 분석물을 식별하는 단계

   를 포함하고, 상기에서

   1) 1 이상의 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐 및 1 이상의 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐가 동일하거나 상이할 수 있고,

   2) 적어도 제1 및 제2 분석 파장 범위가 동일하거나 상이할 수 있는,

   분석물의 식별 방법.
2. (a) 분석 파장 범위에 걸쳐 빛을 방출하는 광주사원을 제공하는 단계,

   (b) 2종 이상의 실질적으로 구형인 식별가능 입자를 제공하는 단계,

   (c) (b)의 입자에, 그 표면에 결합하고 1종 이상의 분석물에 대해 친화성을 갖는 1종 이상의 포획 프로브를 적용하는 단계,

   (d) (c)의 입자들을 각 입자가 소정의 위치를 갖는 소정의 공간 어레이 내에 부착시키는 단계,

   (e) (d)의 입자들을 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 임의로 주사하여 (d)의 각 입자에 대해 1 이상의 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키는 단계,

   (f) 분석물이 존재하면 1종 이상의 포획 프로브와 1종 이상의 분석물 사이에 결합이 일어나는, 1종 이상의 분석물을 함유하고 있는 것으로 추측되는 샘플과 (e)의 입자를 접촉시키는 단계,

   (g) (f)의 입자를 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 주사하여 (f)의 각 입자에 대해 1 이상의 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키는 단계,

   (h) 1 이상의 제1 대조 광산란 시그너쳐 중 임의의 것과 1 이상의 제2 광산란 시그너쳐 중 임의의 것으로 이루어진 군에서 선택된 공명광 산란 시그너쳐들 사이의 차이를 비교하여 1종 이상의 포획 프로브에 대한 1종 이상의 분석물의 결합을 검출하는 단계, 및

   (i) 부착된 입자 위치에 기초하여 1종 이상의 결합 분석물을 식별하는 단계

   를 포함하는, 분석물의 식별 방법.
3. (a) 분석 파장 범위에 걸쳐 빛을 방출하는 광주사원을 제공하는 단계,

   (b) 2종 이상의 실질적으로 구형인 식별가능 입자를 제공하는 단계,

   (c) (b)의 입자에, 그 표면에 결합하고 1종 이상의 분석물에 대해 친화성을 갖는 1종 이상의 포획 프로브를 적용하는 단계,

   (d) (c)의 각 입자를 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 주사하여 (c)의 각 입자에 대해 각 입자를 독특하게 식별시키는 1 이상의 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키는 단계,

   (e) 1종 이상의 포획 프로브를 각각의 식별된 (d)의 입자와 연관시키는 단계,

   (f) 분석물이 존재하면 1종 이상의 포획 프로브와 검출가능한 표지를 포함하는 1종 이상의 분석물 사이에 결합이 일어나는, 1종 이상의 분석물을 함유하고 있는 것으로 추측되는 샘플과 (e)의 입자를 접촉시키는 단계, 및

   (g) 단계 (e)의 연관성 및 분석물의 검출가능한 표지에 기초하여 1종 이상의 분석물을 식별하는 단계

   를 포함하는, 분석물의 식별 방법.
4. (a) 분석 파장 범위에 걸쳐 빛을 방출하는 광주사원을 제공하는 단계,

   (b) 1종 이상의 실질적으로 구형인 식별가능 입자를 제공하는 단계,

   (c) (b)의 입자에, 그 표면에 결합하고 1종 이상의 분석물에 대해 친화성을 갖는 1종 이상의 포획 프로브를 적용하는 단계,

   (d) (c)의 입자들을 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 임의로 주사하여 (c)의 각 입자에 대해 1 이상의 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키는 단계,

   (e) 분석물이 존재하면 1종 이상의 포획 프로브와 1종 이상의 분석물 사이에 결합이 일어나는, 1종 이상의 분석물을 함유하고 있는 것으로 추측되는 샘플과 (d)의 입자를 접촉시키는 단계,

   (f) (e)의 입자를 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 주사하여 (e)의 각 입자에 대해 1 이상의 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키는 단계, 및

   (g) 1 이상의 제1 대조 광산란 시그너쳐 중 임의의 것과 1 이상의 제2 광산란 시그너쳐 중 임의의 것으로 이루어진 군에서 선택된 공명광 산란 시그너쳐들 사이의 차이를 비교하여 1종 이상의 포획 프로브에 대한 1종 이상의 분석물의 결합을 검출하는 단계

   를 포함하는, 포획 프로브에 결합하는 분석물의 검출 방법.
5. (a) 분석 파장 범위에 걸쳐 빛을 방출하는 광주사원을 제공하는 단계,

   (b) 1) 입자에 부착된 1종 이상의 포획 프로브 및 2) 1종 이상의 포획 프로브에 결합된 1종 이상의 분석물을 포함하는, 1종 이상의 실질적으로 구형인 식별가능 입자를 제공하는 단계,

   (c) (b)의 입자를 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 주사하여 상기 입자에 대해 1 이상의 제1 대조 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키는 단계,

   (d) 1종 이상의 분석물을 단계 (c)의 입자의 1종 이상의 포획 프로브에서 해리하는 단계,

   (e) (d)의 입자를 분석 파장 범위에 걸쳐 1회 이상 주사하여 각 입자에 대한 1 이상의 제2 해리 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키는 단계, 및

   (f) 1 이상의 제1 대조 광산란 시그너쳐 중 임의의 것과 1 이상의 제2 광산란 시그너쳐 중 임의의 것으로 이루어진 군에서 선택된 공명광 산란 시그너쳐들 사이의 차이를 비교하여 1종 이상의 포획 프로브로부터 1종 이상의 분석물이 해리하는 것을 검출하는 단계

   를 포함하는, 포획 프로브로부터의 분석물 해리의 검출 방법.
6. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 포획 프로브를 적용하기 전에 상기 분석 파장 범위에 걸쳐 상기 입자를 주사하여 식별 공명광 산란 시그너쳐를 발생시키는 방법.
7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 분석 파장 범위가 약 275 내지 약 1900 나노미터 범위의 광파장 내의 약 1 내지 약 20 나노미터에 이르는 영역인 방법.
8. 제4항에 있어서, 상기 분석물이 분석 방법들에 의해 임의로 식별되는 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 분석 방법이 질량 분광법, 형광법, 광학 흡수법, 방사능법 및 표면 플라스몬 공명법으로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
10. 제8항에 있어서, 상기 분석 방법이 형광 잔기, 화학발광 잔기, 입자, 효소, 방사성 태그, 양자 도트, 발광 잔기, 흡광 잔기, 삽입 색소 및 결합쌍의 구성원으로 이루어진 군에서 선택되는 검출가능한 표지를 포함하는 방법.
11. 제1항, 제2항 또는 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 결합된 분석물의 양을 제1 대조 광산란 시그너쳐 및 1 이상의 제2 광산란 시그너쳐 중 임의의 것으로 이루어진 군에서 선택된 공명광 산란 시그너쳐들 사이의 차이를 비교하여 결정하는 방법.
12. 제5항에 있어서, 해리된 분석물의 양을 제1 대조 광산란 시그너쳐 및 1 이상의 제2 광산란 시그너쳐 중 임의의 것으로 이루어진 군에서 선택된 공명광 산란 시그너쳐들 사이의 차이를 비교하여 측정하는 방법.
13. 제3항에 있어서, 상기 검출가능한 표지가 형광 잔기, 화학발광 잔기, 입자, 효소, 방사성 태그, 발광 잔기, 흡광 잔기, 삽입 색소 및 결합쌍의 구성원으로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
14. 제7항에 있어서, 상기 광파장이 약 600 내지 약 1650 나노미터 범위인 방법.
15. 제7항에 있어서, 상기 광파장이 약 770 내지 약 780 나노미터 범위인 방법.
16. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자는 직경이 약 100 마이크로미터 이하인 방법.
17. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자는 직경이 약 75 마이크로미터 이하인 방법.
18. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자는 직경이 약 50 마이크로미터 이하인 방법.
19. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자가 분석 파장 범위에 걸쳐 실질적으로 빛에 투명한 방법.
20. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자는

    a) 실질적으로 구형인 코어, 및

    b) 상기 코어를 둘러싸는 하나 이상의 층을 포함하고,

    상기 하나 이상의 층은 분석 파장 범위에 걸쳐 실질적으로 빛에 투명한 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 하나 이상의 층이 광학적으로 활성인 방법.
22. 제20항에 있어서, 상기 하나 이상의 층이 생물학적으로 활성인 방법.
23. 제20항에 있어서, 상기 하나 이상의 층이 화학적으로 활성인 방법.
24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 층이 약 1 나노미터 내지 약 10 마이크로미터 범위의 두께를 갖는 방법.
25. 제21항에 있어서, 상기 코어가 흡광성인 방법.
26. 제20항에 있어서, 상기 하나 이상의 층이 약 1 나노미터 내지 약 20 마이크로미터의 두께를 갖는 방법.
27. 제21항에 있어서, 상기 하나 이상의 층이 약 50 나노미터 내지 약 20 마이크로미터의 두께를 갖는 방법.
28. 제20항에 있어서, 상기 코어가 유리, 실리카, 폴리스티렌, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 아크릴 중합체, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드, 플루오로중합체, 실리콘, 셀룰로스, 반도체성 물질, 광학적 흡수 물질, 금속, 자성 물질, 광물, 나노입자, 콜로이드 입자, 금속 산화물, 금속 황화물, 금속 셀렌화물 및 이들의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 물질을 포함하는 방법.
29. 제28항에 있어서, 상기 자성 물질이 산화철인 방법.
30. 제20항에 있어서, 상기 코어가 공동 (hollow)인 방법.
31. 제20항에 있어서, 상기 층들이 유리, 실리카, 폴리스티렌, 폴리에스테르, 폴리카보네이트, 아크릴 중합체, 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴로니트릴, 폴리아미드, 플루오로중합체, 실리콘, 셀룰로스, 고분자 전해질, 광물, 나노입자, 콜로이드 입자, 금속 산화물, 금속 황화물, 금속 셀렌화물, 및 이들의 복합체로 이루어진 군에서 독립적으로 선택되는 물질을 포함하는 방법.
32. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자가 분석 파장 범위에 걸쳐 약 1.45 내지 약 2.1의 굴절률을 갖는 유리를 포함하는 방법.
33. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 포획 프로브가 단백질, 핵산, 펩티드 핵산, 결합쌍의 한 구성원, 항체, 생체 세포, 미생물, 세포막 단편, 세포 소기관, 수용체, 바이러스, 바이러스 단편, 박테리오파지, 박테리오파지 단편, 유기 리간드, 및 유기금속 리간드로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
34. 제33항에 있어서, 상기 1종 이상의 분석물이 샘플 매트릭스 성분을 포함하는 샘플에 존재하는 방법.
35. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 분석물이 단백질, 핵산, 펩티드 핵산, 생체 세포, 미생물, 세포막 단편, 세포 소기관, 항체, 수용체, 바이러스, 바이러스 단편, 박테리오파지, 박테리오파지 단편, 및 결합쌍의 한 구성원으로 이루어진 군에서 선택되는 방법.
36. 제10항에 있어서, 상기 결합쌍의 한 구성원이 항원/항체, 항원/항체 단편, 단백질 A/항체, 단백질 G/항체, 합텐/안티-합텐, 비오틴/아비딘, 비오틴/스트렙타비딘, 엽산/엽산 결합 단백질; 호르몬/호르몬 수용체, 렉틴/탄수화물, 효소/효소 보조인자, 효소/기질, 효소/억제제, 펩티드 핵산/상보적 핵산, 폴리뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드 결합 단백질, 비타민 B12/내인성 인자; 상보적 핵산 분절; 술프히드릴 활성기를 포함한 쌍, 카르보디이미드 활성기를 포함한 쌍, 및 아민 활성기를 포함한 쌍으로 이루어지는 결합쌍 조합에서 선택되는 방법.
37. 제33항에 있어서, 상기 결합쌍의 한 구성원이 항원/항체, 항원/항체 단편, 단백질 A/항체, 단백질 G/항체, 합텐/안티-합텐, 비오틴/아비딘, 비오틴/스트렙타비딘, 엽산/엽산 결합 단백질; 호르몬/호르몬 수용체, 렉틴/탄수화물, 효소/효소 보조인자, 효소/기질, 효소/억제제, 펩티드 핵산/상보적 핵산, 폴리뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드 결합 단백질, 비타민 B12/내인성 인자, 상보적 핵산 분절; 술프히드릴 활성기를 포함한 쌍, 카르보디이미드 활성기를 포함한 쌍, 및 아민 활성기를 포함한 쌍으로 이루어지는 결합쌍 조합에서 선택되는 방법.
38. 제35항에 있어서, 상기 결합쌍의 한 구성원이 항원/항체, 항원/항체 단편, 단백질 A/항체, 단백질 G/항체, 합텐/안티-합텐, 비오틴/아비딘, 비오틴/스트렙타비딘, 엽산/엽산 결합 단백질; 호르몬/호르몬 수용체, 렉틴/탄수화물, 효소/효소 보조인자, 효소/기질, 효소/억제제, 펩티드 핵산/상보적 핵산, 폴리뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드 결합 단백질, 비타민 B12/내인성 인자, 상보적 핵산 분절, 술프히드릴 활성기를 포함한 쌍, 카르보디이미드 활성기를 포함한 쌍, 및 아민 활성기를 포함한 쌍으로 이루어지는 결합쌍 조합에서 선택되는 방법.
39. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 프로브를 입자의 표면 상에서 합성하는 방법.
40. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포획 프로브를 입자의 표면에 첨가하기 전에 천연 공급원에서 단리하거나 또는 별도로 합성하는 방법.
41. 제34항에 있어서, 상기 포획 프로브를 입자에 적용한 후에 샘플 매트릭스 성분의 비특이적 결합을 막기 위해 상기 입자를 처리하는 방법.
42. 제34항에 있어서, 샘플 매트릭스 성분의 비특이적 결합을 막기 위해 상기 입자를 박막으로 코팅한 후 포획 프로브를 부착하기 위해 상기 박막 코팅을 활성화하는 방법.
43. 제1항 또는 제3항에 있어서, 상기 제1 대조 또는 제2 결합 공명광 산란 시그너쳐 중 하나가 피크 파장 위치, 피크 너비, 피크 사이의 파장 간격, 피크 진폭, 및 편극 의존 특성으로 이루어지는 군에서 선택된 스펙트럼 특징을 포함하는 방법.
44. 제1항, 제2항 제4항 및 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대조 및 결합 공명광 산란 시그너쳐를 피크 파장 위치, 피크 너비, 피크 사이의 파장 간격, 피크 진폭, 및 편극 의존 특성으로 이루어지는 군에서 선택되는 스펙트럼 특징에 기초하여 비교하는 방법.
45. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자가 하나 이상의 광학적 활성층을 포함하는 방법.
46. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자가 하나 이상의 생물학적 활성층을 포함하는 방법.
47. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 입자가 하나 이상의 화학적 활성층을 포함하는 방법.
48. (a) 실질적으로 구형인 코어,

    (b) 입자의 외부 표면에 부착된 포획 프로브

    를 포함하고, 이때,

    1) 상기 입자는 약 275 나노미터 내지 약 1900 나노미터의 광파장 범위에 걸쳐 약 1 내지 약 20 나노미터의 분석 파장 범위에 걸쳐 주사되는 경우, 독특한 공명광 산란 시그너쳐를 특징으로 하고,

    2) 상기 입자는 직경이 약 100 나노미터 이하이며,

    3) 상기 입자는 분석 파장 범위에 걸쳐 약 1.6 내지 약 2.1 사이의 굴절률을 지니고,

    4) 상기 입자는 분석 파장 범위에 걸쳐 실질적으로 비형광인 식별가능 입자.
49. 제48항에 있어서, 상기 코어를 둘러싸는 하나 이상의 층을 임의로 갖는 입자.
50. 제49항에 있어서, 상기 하나 이상의 층이 광학적으로 활성인 입자.
51. 제49항에 있어서, 상기 하나 이상의 층이 생물학적으로 활성인 입자.
52. 제49항에 있어서, 상기 하나 이상의 층이 화학적으로 활성인 입자.
53. 제51항 또는 제52항에 있어서, 상기 층이 약 1 나노미터 내지 약 10 마이크로미터 범위의 두께를 갖는 입자.
54. 제49항에 있어서, 상기 하나 이상의 층이 약 50 나노미터 내지 약 20 마이크로미터의 두께를 갖는 입자.
55. (a) 실질적으로 구형인 코어,

    (b) 입자의 외부 표면에 부착된 포획 프로브

    를 포함하고, 이때,

    1) 상기 입자는 약 275 나노미터 내지 약 1900 나노미터의 광파장 범위에 걸쳐 약 1 내지 약 20 나노미터의 분석 파장 범위에 걸쳐 주사되는 경우, 독특한 공명광 산란 시그너쳐를 특징으로 하고,

    2) 상기 입자는 직경이 약 100 나노미터 이하이며,

    3) 상기 입자는 분석 파장 범위에 걸쳐 약 1.6 내지 약 2.1 사이의 굴절률을 지니고,

    4) 상기 입자는 분석 파장 범위에 걸쳐 실질적으로 비형광이며,

    이때, 상기 입자는

    i) 약 50 나노미터 내지 약 20 마이크로미터 두께를 지닌 하나 이상의 광학 활성층, 및

    ii) i)의 층을 둘러싸고, 약 1 나노미터 내지 10 마이크로미터이며 생물학적 활성 또는 화학적 활성인 실질적으로 투명한 하나 이상의 외부층

    을 포함하는, 식별가능 입자.
56. 제48항에 있어서, 상기 코어가 유리, 반도체성 물질, 광학적 흡수 물질, 금속, 자성 물질 및 이들의 복합체로 이루어지는 군에서 선택되는 물질을 포함하는 입자.
57. 제48항에 있어서, 상기 포획 프로브가 단백질, 핵산, 펩티드 핵산, 결합쌍의 한 구성원, 항체, 생체 세포, 미생물, 세포막 단편, 세포 소기관, 수용체, 바이러스, 바이러스 단편, 박테리오파지, 박테리오파지 단편, 유기 리간드, 및 유기금속 리간드로 이루어지는 군에서 선택되는 입자.
58. 제57항에 있어서, 상기 결합쌍의 한 구성원이 항원/항체, 단백질 A/항체, 단백질 G/항체, 합텐/안티-합텐, 비오틴/아비딘, 비오틴/스트렙타비딘, 엽산/엽산 결합 단백질; 호르몬/호르몬 수용체, 렉틴/탄수화물, 효소/효소 보조인자, 효소/기질, 효소/억제제, 펩티드 핵산/상보적 핵산, 폴리뉴클레오티드/폴리뉴클레오티드 결합 단백질, 비타민 B12/내인성 인자; 상보적 핵산 분절, 술프히드릴 활성기를 포함한 쌍, 카르보디이미드 활성기를 포함한 쌍, 및 아민 활성기를 포함한 쌍으로 이루어진 결합쌍 조합에서 선택되는 입자.
59. 제48항에 따른 식별가능 입자들의 집단.
60. (a) 용액 내의 1종 이상의 실질적으로 구형인 식별가능한 입자 (각 입자는 입자의 외부 표면에 부착된 포획 프로브를 포함함),

    (b) 분석 파장 범위에 걸쳐 입자를 주사하기 위한 광주사원,

    (c) 산란광의 검출을 위해 적합한 위치 및 적당한 환경에서 입자를 제시하는 광학셀,

    (d) 입자를 광학셀 내에 위치시키기 위한 입자 조작 수단, 및

    (e) 주사된 입자에서 빛을 검출하고 상기 빛을 전기 신호로 전환하기 위한 검출 수단

    을 포함하고, 상기 (a)에서,

    1) 상기 입자는 약 275 내지 약 1900 나노미터의 광파장 범위에 걸쳐 약 1 내지 약 20 나노미터에 이르는 영역을 갖는 분석 파장 범위에 걸쳐 주사되는 경우, 독특한 공명광 산란 시그너쳐를 특징으로 하고,

    2) 상기 입자는 직경이 약 75 마이크로미터 이하이며,

    3) 상기 입자는 분석 파장 범위에 걸쳐 약 1.45 내지 약 2.1의 굴절률

    을 갖는, 마이크로입자 기반 측정 시스템.
61. 제60항에 있어서, 상기 입자를 시약 및 분석물과 접촉시키는 수단을 임의로 포함하는 시스템.
62. 제60항에 있어서, 상기 광주사원에 실시가능하게 연결된 컴퓨터 및 상기 검출 수단에 의해 발생되는 상기 전기 신호의 획득 및 분석을 위한 검출 수단을 임의로 포함하는 시스템.
63. 제60항에 있어서, 상기 전기 신호를 입자의 정체, 및 임의로는 분석물 또는 분석물 군의 상기 입자에 대한 결합의 존재 또는 정도로 전환하기 위한 데이터 분석 수단을 임의로 포함하는 시스템.
64. 제60항에 있어서, 상기 분석물 또는 분석물 군의 결합을 검출하거나 또는 그들을 식별하기 위한 데이터 분석 수단을 임의로 갖는 시스템.
65. 제60항에 있어서, 상기 주사광이 주사 다이오드 레이져, 동조가능 다이오드 레이져, 및 다색성 광원으로 이루어지는 군에서 선택된 공급원에 의해 발생되는 시스템.
66. 제65항에 있어서, 상기 주사광원이 파장-선택 장치와 함께 이용되는 시스템.
67. 제60항에 있어서, 상기 주사광원이 광섬유 광 결합 수단으로 변형된 시스템.
68. 제66항에 있어서, 상기 파장-선택 장치가 분산 요소, 비분산 요소, 모노크로매터, 동조가능 필터, 프리즘, 격자 및 고정 필터로 이루어지는 군에서 선택된 부품을 임의로 포함하는 시스템.
69. 제60항에 있어서, 하나 이상의 입자로부터의 상기 산란광이 영상 수단으로 검출되는 시스템.
70. 제66항에 있어서, 상기 영상 수단이

    (a) 주사 다이오드 레이져 광원,

    (b) 분광학적 산란광 영상화 및 미광 차단에 적합한 광학셀,

    (c) 마이크로입자를 분석물 및 시약과 접촉시키기 위한 수단,

    (d) 현미경,

    (e) 디지털 카메라 및 모니터,

    (f) 디지털 영상 획득 하드웨어,

    (g) 필요에 따라 상기 요소 (a)-(f)에 실시가능하게 연결된 컴퓨터, 및

    (h) 상기 요소 (a)-(f)를 제어하고 데이터를 획득하며 데이터를 가공하는데 적합한 소프트웨어

    를 포함하는, 마이크로입자 기반 측정 시스템.