DE102004044048A1

DE102004044048A1 - Biochemische Charakterisierung mit zellulären Systemen

Info

Publication number: DE102004044048A1
Application number: DE200410044048
Authority: DE
Inventors: Kilian Dr. Hennes; Walter Dr. Zwisler
Original assignee: QUALIS LAB GmbH; QUALIS LABORATORIUM GmbH
Current assignee: QUALIS LAB GmbH; QUALIS LABORATORIUM GmbH
Priority date: 2004-09-09
Filing date: 2004-09-09
Publication date: 2006-03-30

Abstract

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden Zellen als Bioindikator für zu charakterisierende Substanzen verwendet. Die Zellen erzeugen Indikatorsubstanzen, welche an magnetische Festphasen gebunden und über Enzymreaktionen quantifiziert werden. DOLLAR A Im ersten erfindungsgemäßen Anwendungsbeispiel sind auf einem mikrofluidischen Blisterchip die Zellen und alle Reagenzien bis auf eine Pufferlösung enthalten. Dieser Einweg-Chip wird bei -80 DEG C gelagert und beim Einsatz in ein Kompaktgerät eingeführt, daß die Inkubationsbedingungen reguliert, über Blister-Stempel die Reagenzien dorsiert, die Festphase magnetisch immobilisiert und die Enzymreaktionsprodukte optisch quantifiziert werden. DOLLAR A Im zweiten Anwendungsbeispiel werden die zellulären Systeme mit den Indikatorsubstanzen über einem Autosampler einem Gerät zugeführt, daß für eine Mehrzahl von verschiedenen Indikatorsubstanzen die entsprechend immunologisch konditionierte magnetisierbare Festphase und ein entsprechend immunologisch konditioniertes Enzym sowie das Enzymsubstrat enthält. In diesem Hochdurchsatz-Gerät erfolgt die Enzymreaktion kontinuierlich beim Durchfluß einer Kapillare, an deren Ende ein Sensor positioniert ist.

Description

Verschidene Ansätze sind beschrieben, worden um mittels Blutzellen als Bioindikatorsystem Fieber erregende Substanzen an/in Produkten nachzuweisen. Diese erlauben aber bisher weder die Untersuchung in Hochdurchsatzsystemen noch in kompakten handheld-Apperaten. Diese Nachteile werden mit dem erfindungsgemäßen Verfahren überwunden.
In einem ersten Anwendungsbeispiel werden in der Blistertechnologie, wie sie zum Verpacken von Pillen eingesetzt wird, mikrofluidische Einweg-Chips hergestellt (B), die in einzelnen Blistern (A) die erforderlichen Reagenzien enthalten: Beads mit Antikörpern zur Bindung von Indikatormolekülen beschichtet (B26), Enzyme zur Umsetzung von Substraten mit komplementären Antikörpern zu den selben Indikatormolekülen für einen Sandwich-Immuno-Assay (B24), spezifisches Substrat (B22). Im Reaktionsschuh (B23) wird die zu untersuchende Substanz oder der zu untersuchende Gegenstand mit dem aufgetauten Cryoblut (B28) in Kontakt gebracht. Der Chip befindet sich beim Charakterisierungsverfahren in einem Einschubschlitz, in welchem die Zuführung (B21) über ein Ventil (F54) und eine Peristaltikpumpe (F52) mit einem Reaktionspuffer-Behälter (F50) in Verbindung steht. Während der Inkubation des Cryoblutes mit dem Gegenstand wird durch das hand-held Gerät, welches das erfindungsgemäße Verfahren implementiert, die Temperatur im Reaktionsschuh (B23) auf 37°C gehalten. Nach etwa 4 bis 12 Stunden wird über die Peristaltik-Pumpe (F52) das Blut, ggf. mit Indikatormolekülen, in die Reaktionskammer (B20) gesogen. Wenn ein optischer Sensor (C30) die weitgehende Befüllung der Kammer meldet, wird das Ventil (F54) geschlossen und ein zu allen Reagenzienblistern beweglicher, Elektromagnetisch aktuierter Stempel (F56) drückt die magnetisierbare Festphase in die Reaktionskammer (B20). Nach einer Inkubationsdauer im Minutenbereich wird ein Permanent- oder Elektromanget (C34) unter die Reaktionskammer geführt. Innerhalb einer Wartezeit von einigen Minuten werden die Festphasen-Partikel an die Blisterwand gezogen und nach öffnen des Ventils und anschalten der Peristaltik-Pumpe (F52) kann die immobilisierte Festphase mit dem Reaktionspuffer aus Behälter (F50) gewaschen werden; Reaktionspuffer fließt nun und auch bei den folgenden Waschschritten über den Reaktionsschuh (B23) ab. Dann wird das Ventil wieder geschlossen und der Blisterinhalt (B24) wird in die Reaktionskammer gedrückt. Nach. einer entsprechenden Inkubationsdauer wird wieder mit Reaktionspuffer gewaschen. Dann wird die Festphase durch entfernen des Magnetfeldes von der Reaktionskammer (B20) wieder mobilisiert und über den Stempel (F56) das Enzym-Substrat in die Kammer gedrückt. Nun wird die Kinetik der Substratumsetzung mittels einer Lichtquelle (C32) und einem Lichtsensor (C30) aufgenommen. Aus dieser wird mittels Vergleich mit Kontrollmessungen von Referenzsubstanzen die Konzentration Fieber erregenden Substanzen im Prozessor des Gerätes errechnet und auf einem Display angezeigt.
Die Reagenzienblister (A10) sind über Verschweißungsflächen (A12) mit einer Basalfolie (A18) verbunden. Beim erhöhten Druck auf den Blister wird der Inhalt (A16) an der Sollbruchstelle der Verschweißung zum Kanal (A14) herausgedrückt. Die Kanäle zwischen den Blistern sind als Rillen im der oberen Blisterfolie ausgebildet und dann durch aufschweißen der Basalfolie zu mikrofluidischen Rohrleitungen vervollständigt.
Je nach Anwendungsgebiet können auf einem Chip auch mehrere Reaktionssysteme parallel angeordnet sein (D). Die Inkubation des Cryoblutes mit den zu charakterisierenden Gegenständen und Substanzen kann auch in einer Umhausung (E48) erfolgen, in die CO₂ aus einen Druckbehälter (E40) in die Nähe der gasdurchlässigen Folie (E42) geblasen wird (drosselung über Ventil). Auf dem Chip kann so zum Beispiel ein Luftfilter (E44) mit Aerosol-Proben derart über Klebestreifen (E46) eingeschlossen werden, daß dieser mit Cryoblut in Verbindung gebracht und unter definierter CO₂-Begasung inkubiert wird.
In einem 2. Anwendungsbeispiel werden Proben (G60) mit einem primären Antikörper (G62) in die Reaktionskammer (G20) überführt, nach Spülen mit Puffer (G66) mit der magnetisierbaren Festphase (G64) in einer Kapillare in einem Elektromagneten (G68) festgehalten und gespült, während gebrauchter Puffer in dem Abfallbehältnis (G70) gesammelt wird. Nach der Mobilisierung der Festphase wird diese mit dem Substrat (G72) im eine Reaktionskapilare (G74) geführt und die Reaktionsprodukte werden im Elektrochemischen Sensor (G76) quantitativ erfasst. Danach wird Puffer bis in das Auffanggefäß (G78) gespült. Die Messung mehrerer Proben kann in dieser Vorrichtung kontinuierlich hintereinander in Hochdurchsatz erfolgen.

Claims

Verfahren zum biochemischen Charakterisieren von Gegenständen (Organismen oder Substanzen) mittels Nachweis und Quantifizierung von Reaktionsprodukten zellulärer Systeme, dadurch gekennzeichnet dass a) in den zellulären Systemen durch Kontakt mit den Gegenständen die Produktion von spezifischen Molekülen induziert wird, die mittels Antikörpern an suspendierte magnetisierbare Mikropartikel gebunden werden, b) die immunologisch gebundenen Moleküle durch magnetische Fixierung der Mikropartikel und gleichzeitiges Waschen mit Pufferlösungen von den Bestandteilen des jeweiligen zellulären System oder von Resten der Gegenstände gereinigt werden, c) diese Reinigung in der Reaktionskammer einer Vorrichtung für den ein- oder mehrmaligen Gebrauch erfolgt, welche zusätzlich in getrennten Reagenzienkammern die genannten Mikropartikel, Enzyme mit Funktionen zur immunologischen Kopplung und spezifische Enzymsubstrate beinhalten, und dass diese Reagenzienkammern über verschließbare Zuleitungen mit der Reaktionskammer verbunden sind, d) die gebundenen spezifischen Moleküle durch weitere immunologische Kopplung mit Enzymen, anschließende erneute Waschung unter magnetischer Fixierung und Remobilisierung (durch Entfernen des Magnetischen Feldes) eine ihrer Konzentration proportionale Enzymsubstrat-Umsetzung induzieren, welche anhand von Indikatormolekülen (Farbstoffe, Redoxaktive Substanzen) mittels Detektoren (Photozelle, feinstrukturierte Elektroden) optisch oder elektrisch messbar ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass die konditionierten spezifischen Moleküle nach Zuleitung von Enzymsubstraten aus weiteren Reagenzienkammern während des zeitlichräumlich definierten Durchflusses einer Kapillarleitung Indikatormoleküle produzieren (Farbstoffe) die mittels Detektoren (Photozelle) am Ende der Kapillarleitung quantifiziert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet dass die beschriebenen Verfahrensschritte in einem mikrofluidischen System integriert sind, welches als Einwegartikel alle oder einen Teil der Reagenzien vordosiert enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet dass a) das zelluläre Systeme Bestandteil eines zu charakterisierenden Organismus ist und die spezifischen Moleküle den gesundheitlichen Zustand des Organismus charakterisieren und b) erst nach der Entnahme von Körperflüssigkeiten des Organismus in denen die spezifischen Moleküle gelöst sind, diese mit Antikörpern an suspendierte magnetisierbare Mikropartikel gebunden werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet dass mit der besagten Vorrichtung inklusive Reaktionskammer ein Behälter verbunden ist der das zelluläre System in konservierter Form enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet dass als zelluläres Systeme menschliches oder tierische Vollblut verwendet wird, welches durch Kontakt mit Substanzen eine Fieberreaktion auslöst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet dass das die zellulären Systeme durch Konservierung mittels Tiefgefrieren, Gefriertrocknen oder Kultivierung reaktionsfähig gehalten werden bis die entsprechenden Gegenstände charakterisiert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet dass die zu charakterisierenden Gegenstände zuvor mittels Filtration aus Aerosolen, Stäuben oder Suspensionen angereichert werden.