KR20050070032A

KR20050070032A - 치료제

Info

Publication number: KR20050070032A
Application number: KR1020057005757A
Authority: KR
Inventors: 히로무 오노기; 가츠미 스기야마; 노부코 무라키; 히로아키 사가와; 이쿠노신 가토
Original assignee: 다카라 바이오 가부시키가이샤
Priority date: 2002-10-01
Filing date: 2003-09-29
Publication date: 2005-07-05
Also published as: US20060039998A1; WO2004030683A1; EP1563841A1; TW200501933A; AU2003272902A1; EP1563841A4; US20080008773A1; JPWO2004030683A1; CA2500527A1

Abstract

본 발명은, 식물 유래 처리물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는, 골형성 촉진 또는 골형성 단백질 생성 증강을 필요로 하는 질환의 치료제 또는 예방제, 골형성 촉진제 또는 골형성 단백질 생성 증강제, 그리고 골형성 촉진용 또는 골형성 단백질 생성 증강용의 식품, 음료 또는 사료에 관한 것이다. 또, 본 발명은 특정한 세포를 사용하는, 골형성 단백질 생성 증강 작용의 측정방법, 골형성 단백질 생성 증강 작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법, 그리고 골형성 단백질 생성 증강 작용을 갖는 물질의 제조방법에 관한 것이다.

Description

치료제{REMEDIES}

본 발명은, 골형성 촉진 또는 골형성 단백질 생성 증강을 필요로 하는 질환, 예를 들어 골다공증이나 골절 등의 치료 또는 예방에 유용한 의약, 식품, 음료 또는 사료에 관한 것이다.

골조직으로서는, 항상 골형성과 골흡수가 일정한 밸런스를 유지하면서 반복되고 있고, 이러한 영위가 골강도나 혈중의 칼슘농도를 조절하고 있다. 골형성에는 골아세포가, 골흡수에는 파골세포가 중심적인 역할을 하고 있고, 골형성과 골흡수의 밸런스가 어떠한 요인으로 무너졌을 때에, 골다공증이 야기되는 것으로 생각되고 있다. 골다공증은 에스트로겐의 분비저하를 요인으로 하는 폐경후 골다공증과, 연령증가를 요인으로 하는 노인성 골다공증으로 크게 구별되는데, 이들 이외에도 당뇨병이나 갑상선 기능 항진증 등의 내분비·대사질환이나 스테로이드 등의 약제 투여, 소화기·간질환, 비타민 C결핍, 부동성, 난소적출, 관절 류머티즘 등을 요인으로 하는 속발성 골다공증도 알려져 있다.

현재 시점에서, 골다공증의 치료약으로는, 에스트로겐제, 칼시토닌, 비스포스포네이트 등의 주로 골흡수를 저해함으로써 골의 양적 감소를 억제하는 약제가 사용되고 있다. 그러나, 에스트로겐제 치료에서는 유방암이나 자궁암, 심질환의 리스크가 상승되는 등 부작용이 강하고, 칼시토닌에서는 약제의 내성이 생기기 쉽고, 경구투여가 불가능하고, 비스포스포네이트는 흡수율이 나쁘고, 잔류성이 높아 골대사의 과도한 불활성화를 초래한다는 결점이 있다. 또한, 골대사를 활성화시킬 목적으로 비타민 D₃제제가 사용되고 있지만, 다른 약제에 비교하고 치료효과가 낮은 것에 비해, 고칼슘증 등의 부작용이 크다. 이들 종래의 골다공증의 치료약은, 이미 진행된 골의 결실 (缺失) 을 원래대로 회복시킬 수 없어, 참된 골다공증의 치료제로서 충분한 것이라고는 말하기 어렵다.

골형성과 밀접히 관계하는 세포는 골아세포이다. 골아세포는, 연골세포, 근육세포, 지방세포, 힘줄 세포 등과 공통의 간엽계 줄기세포를 기원으로 하고 있고, 분획의 과정에서 골아세포를 거쳐 성숙 골아세포가 된다. 골아세포는 성숙과정에서 골의 구성성분인 콜라겐을 비롯한 대량의 세포외 매트릭스를 생성하고, 또한 알칼리성 포스파타아제를 발현하여 인산칼슘의 매트릭스에 대한 침착을 일으킨다. 일부의 골아세포는 이렇게 해서 석회화한 매트릭스 중에 매립되어, 다시 골세포로 분획된다.

인간의 골량은 20∼30세에 최대를 나타내고 이후는 감소되어 간다. 년령증가와 동시에 골조직 중의 골아세포수는 감소되고, 또한 간엽계 줄기세포로부터의 골아세포로의 분획능도 저하된다. 반면, 같은 간엽계 줄기세포를 유래로 하는 지방세포수가 연령증가와 함께 증식하는 것으로도 말해지고 있다. 따라서 골의 성장기에 골아세포, 골세포량을 높여 놓는 것이나, 노년기나 폐경후에 있어서 간엽계 줄기세포로부터의 골아세포로의 분획을 보다 선택적으로 촉진시켜, 골형성을 높이는 것은, 골다공증의 예방, 치료면에서도 유효하다고 생각된다.

최근이 되어, 골의 형성을 촉진하는 약제에 관한 개발이 행해지고 있고, 벤조피란유도체 (예를 들어, 일본 공개특허공보 평7-291983호 참조), 페닐 치환 히드록시시클로펜테논 유사체 (예를 들어, 일본 공개특허공보 평11-43460호 참조), 프로스타글란딘 A1 유연체 (예를 들어, 일본 공개특허공보 평11-43461호 참조), 벤조티에핀 유도체 (예를 들어, 일본 공개특허공보2000-109480호 참조), 크로몬 유도체 (예를 들어, 일본 공개특허공보2001-139571호 참조) 에 의한 골형성 촉진 작용이 개시되어 있다. 그러나, 유효성, 안전성의 평가는 아직 충분하지 않고, 실용 단계에는 도달하고 있지 않다.

골기질 중에 골형성을 유도하는 단백성 인자가 함유되어 있는 것이 발견되고, 골형성 단백질 (bone morphogenetic protein, 이하, BMP 라 칭하는 경우가 있다) 로 명명되었다. 그 본체는 오랫동안 불명하였지만, 4종의 BMP 유전자가 클로닝된 것을 계기로, 현재에는 수십 종의 분자종이 종을 초월하여 널리 동물에 존재하는 것을 알게 되었다. BMP 는, 골아세포에 작용하여, 알칼리성 포스파타아제 활성, 부갑상선 호르몬에 대한 응답성, 오스테오칼신 생성, 콜라겐 합성 등을 상승시켜 골아세포로의 분화를 할당한다. BMP 는, 다분화능을 갖는 미분화 간엽계 세포의 분화단계에 따라 연골세포, 골아세포, 지방세포로의 분획을 배분한다. BMP 는 근아세포의 근육으로의 분화를 억제하여, 골아세포로의 분획로 변환시킨다. 또한, BMP 에는 골아세포로부터의 인슐린양 증식인자 등의 2차적 증식인자의 유도활성이 알려져 있다. BMP 를 담체와 함께 피하 또는 근육 내에 투여함으로써 골형성이 유도된다. 재조합 인간 BMP 중 BMP-2, -4, -5, -6, -7 에는 단독으로 골형성을 유도하는 활성이 관찰되고 있다. 그 중에서도 재조합 인간 BMP-2 는 강력한 골형성 활성을 갖고, 래트, 양, 개, 원숭이 등의 골 결손 모델에 있어서 결손조직을 회복하는 것이 알려져 있다. 또한, BMP-4, -5 에는 골절 치유과정으로의 관여가, BMP-6 에는 연골내 골화로의 관여가 보고되어 있고, BMP-12 에는 인대, 힘줄 형성 활성이, BMP-13 에는 연골형성 활성이 있는 것이 알려져 있다. 또한, 노령 동물이나 고령자에서는 골기질 중의 BMP량의 저하나, 골아세포의 BMP 에 대한 감수성의 저하가 관찰되는 점에서, BMP 의 노인성 골다공증으로의 관계가 지적되고 있다.

BMP 는 골형성 뿐만 아니라, 발생과정에서도 중요한 기능을 하고 있고, BMP-2, -4, -7, -8, -11 등은 배복축 형성이나 중배엽 형성, 심장 형성, 신장 형성, 눈 형성, 정자 형성 등에 관여하고 있다. BMP 의 넉아웃 동물은 치사 또는 중독인 장애를 나타낸다. 이와 같이 BMP 는 생체에 있어서 필수적이고 다채로운 생리활성을 갖고 있는 것이 알려져 있다.

BMP 는 상기 각종 작용을 나타내는 것으로부터, BMP 자체를 직접, 단백제제로서 골다공증이나 골절 치료 등에 이용하는 것이 시도되고 있다. 그러나, BMP 는 단백질이기 때문에, 투여방법의 제한이나 내성의 출현 등이 문제가 된다. 또한 BMP 의 수용체는 많은 조직에 널리 발현되어 있기 때문에, 전신투여한 경우에는 골 이외의 조직으로의 영향이 생길 우려가 있다. 이들의 결점에 의해, BMP 그 자체를 치료약으로서 실용화하기 위해서는 여러 가지의 제한이 수반된다. 그러나, BMP 를 외부로부터 투여하는 것이 아니라, 원하는 조직부위에서 임의로 BMP 의 생성을 증강시킬 수 있는 것이면, 골다공증이나 골절 등, BMP 생성 증강을 필요로 하는 질환의 치료, 예방에 유효하다고 생각된다. 최근, 2개의 방향족계를 포함하는 특정한 화합물 (예를 들어, 국제공개 제97/15308호 팜플렛 참조) 나 네바스타틴, 로바스타틴, 프라바스타틴 및 심바스타틴 등의 스타틴계 화합물 (예를 들어, 국제공개 제98/25460호 팜플렛 참조) 이 BMP-2 생성 증강 활성을 갖는 것이 개시되어 있다. 또한, 헬리옥산틴 (예를 들어, 일본 공개특허공보 평8-245386호 참조) 이나 축합 티오펜 유도체 (예를 들어, 일본 공개특허공보 평9-151132호 참조) 에 BMP 의 작용을 증강하는 활성이 있는 것이 개시되어 있다. 다만, 이들에 관해서는 안전성, 유효성의 평가는 아직 충분하지 않아, 실용 단계에는 도달해 있지 않다.

최근, BMP 를 골 재생 의료에 이용하는 개발이 행하여지고 있고, BMP 와 담체의 복합체를 임플란트재와 조합하여 골절 개소에 매립함으로써 치료 효과를 얻으려고 하는 것이 시도되고 있다. .그러나, 대량의 BMP 를 생체 내에 넣게 되기 때문에, 안전성, 경제성의 면에서도 문제가 생긴다. BMP 대신에, BMP 의 생성을 증강하거나, 골형성을 촉진하기도 하는 물질을 사용함으로써 그 결점을 회피할 수 있는 것으로 생각되지만, 아직 실용에 충분한 수단은 알려져 있지 않다.

이와 같이, 골형성을 촉진하거나, BMP 생성을 증강함으로써, 그것들이 관련되는 여러 가지의 질환의 치료 또는 예방이 가능해질 것으로 생각하지만, 독성이나 부작용을 나타내지 않고 원하는 대로 적절하게 골형성 촉진이나 BMP 생성 증강을 실시할 수 있는, 물질, 수단 등은 아직 알려져 있지 않다.

신선초는 미나리과의 대형 다년성 초목이고, 여러가지의 건강 촉진 효과가 알려져 있다. 예를 들어, 신선초가 갖는 생리활성으로는, 고혈압 예방 효과, 항균 작용, 항궤양작용, 위산분비억제작용, 항암효과, 신경 성장 인자 생성 증강 효과, 간세포 증식 인자 생성 증강 작용이 알려져 있다 (예를 들어, 국제공개 제01/76614호 팜플렛 참조). 그러나, 골형성 촉진 작용, BMP 생성 증강 작용에 관해서는 알려져 있지 않다.

셀러리는 미나리과에 속하는 여러가지의 생리 작용이 알려져 있는 식물이다. 셀러리의 생리 작용으로는, 항혈액 응고작용, 제암작용 등이 알려져 있다. 그러나, 골형성 촉진 작용, BMP 생성 증강 작용에 관해서는 알려져 있지 않다.

백합은 백합과에 속하는 여러가지의 생리 작용이 알려져 있는 식물이다. 백합의 생리 작용으로는, 소염, 이뇨작용, 진해작용, 진정작용 등이 알려져 있다. 그러나, 골형성 촉진 작용, BMP 생성 증강 작용에 관해서는 알려져 있지 않다.

알로에는 백합과에 속하는 여러가지의 생리 작용이 알려져 있는 식물이다. 알로에의 생리 작용으로서는, 항종양작용, 마이토젠 활성, 면역 증강 활성, 동상 치유 작용, 항균 작용, 항앨러지 작용, 항염증 작용, 화상의 치유 작용, 혈당치 강하 작용, 보습 작용 등이 알려져 있다. 그러나, 골형성 촉진 작용, BMP 생성 증강 작용에 관해서는 알려져 있지 않다.

쑥은 국화과에 속하는 여러가지의 생리 작용이 알려져 있는 식물이다. 쑥의 생리 작용으로는, 항균 작용, 진정 작용, 활성 산소 소화 작용, 지혈 작용, 항히스타민 작용 등이 알려져 있다. 그러나, 골형성 촉진 작용, BMP 생성 증강 작용에 관해서는 알려져 있지 않다.

도 1 은, 화합물 a 의 질량 스펙트럼을 나타내는 도이다.

도 2 는, 화합물 a 의 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타내는 도이다.

도 3 은, 화합물 a 의 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타내는 도이다.

발명을 실시하기 위한 최선의 형태

본 명세서에 있어서, 「BMP 생성 증강 작용」및「BMP 생성 증강 활성」은 각각 BMP 생성 증강을 가져오는 것 및 BMP 생성을 증강하는 기능을 말하지만, 그 의미에 있어서 특히 엄밀하게 구별하는 것이 아니다. 「증강」에는, 본 발명에 관련되는 유효성분의 작용 전에 비하여, 작용 후에 있어서 목적물질의 양이 증가한다고 하는 양태과 함께, 본 발명에 관련되는 유효성분을 작용시킴으로써 목적물질을 생기시킨다고 하는 양태 (유도) 을 포함한다. 또한 본 명세서에 있어서, 유효성분으로서 드는 어느 물질도 단독으로 또는 2종 이상 혼합하여 본 발명에서 사용할 수 있다.

본 발명의 유효성분으로는, 미나리과 식물 유래 처리물, 백합과 식물 유래 처리물, 및 국화과 식물 유래 처리물로부터 선택되는 식물 유래 처리물이 사용된다.

본 발명에 있어서, 미나리과 식물이란, 속씨식물류 미나리과에 속하는 식물이고, 예를 들어 신선초, 셀러리, 미나리, 파드득나물, 땅두릅, 당근 등이 예시된다. 본 발명에 있어서는, 미나리과의 대형 다년생 초목인 신선초, 셀러리를 특히 바람직하게 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 백합과 식물로는, 알로에, 백합, 두견이, 백사초, 오제소우(Japonolirion ozense), 처녀치마, 큰원추리, 비비추속, 파, 마늘, 부추, 흑백합, 튜울립, 얼레지, 산자고, 둥글레, 왕죽대아재비, 나도옥잠화, 풀솜대, 무학초, 애기나리, 큰연영초, 쯔크바네소우(paris tetraphylla), 만년청, 소엽맥문동, 맥문동, 쥐꼬리풀, 콜히쿰, 무릇, 수선, 군자란, 피안화, 문주란 등이 예시된다. 본 발명에 있어서는 알로에 및 백합이 특히 바람직하게 사용된다.

또, 알로에는, 알로에속으로 분류되는 것, 예를 들어 케이프 알로에, 기다치 알로에, 알로에베라 등의 어느것이나 사용할 수 있다. 또한, 기다치 알로에는 식물분류학상, 기다치로카이라 칭해지는 경우도 있지만, 이것도 본 명세서중의 알로에에 포함되는 것이다. 또한, 백합이란, 백합속에 분류되는 것, 예를 들어 나팔나리, 점박이나리, 투명 나리 (Lilium maculatum), 산나리, 참나리 등의 어느 것이나 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 국화과 식물로서는, 쑥, 사자발쑥, 엉겅퀴, 우엉, 쑥갓, 봄망초, 탱알, 쑥부쟁이, 등골이나물, 호그위드, 도꼬마리, 달리아, 코스모스, 해바라기, 떡쑥, 왜솜다리, 거베라, 머위, 아르니카, 금방망이, 베로니카, 씀바귀, 왕고들빼기, 민들레, 고들빼기 등이 예시된다. 본 발명에서는 특히 바람직하게는 쑥, 사자발쑥이 사용된다.

또한, 본 발명에 사용되는 식물은, 특별히 한정되지 않지만, 그 과실, 종자, 종피, 꽃, 잎, 줄기, 뿌리, 근경 및/또는 식물체 그대로를 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, 식물 유래 처리물로서는, 골형성 촉진 작용 또는 BMP 생성 증강 작용을 갖고 있으면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 추출물, 분쇄물, 착즙액, 파쇄물, 화학처리물, 효소처리물을 말하고, 특히 바람직하게는 추출물, 분쇄물 및 착즙액이 예시된다. 본 발명의 유효성분으로서 사용될 수 있는 것이면, 식물 유래 처리물의 형태에 특별히 한정은 없다.

본 발명에 있어서, 추출물이란 추출용매를 사용하여 추출조작을 하는 공정을 거쳐 얻어지는 물질의 것을 말한다. 추출은, 공지된 추출방법에 의해 아래와 같이 실시할 수 있다. 예를 들어 원료를 분쇄 또는 세단한 후, 용매를 사용하여 배치식 또는 연속식으로 추출할 수 있다. 추출물을 얻을 때의 추출용매로는 특별히 한정되지 않지만, 물, 헥산, 클로로포름, 에탄올, 메탄올, 이소프로필알코올 등의 알코올류, 아세톤, 메틸에틸케톤 등의 케톤류, 아세트산메틸, 아세트산에틸 등의 친수성 또는 친유성의 용매를 들 수 있고, 필요에 따라 단독으로, 또는 적절히 혼합액으로서 사용할 수 있다. 추출용매의 양은 적절히 결정하면 되지만, 통상, 추출조작에 제공할 때의 원료의 중량에 대하여, 바람직하게는 0.1∼100배량의 추출용매를 사용하면 된다. 추출온도도 적절히, 목적에 따라 결정하면 되지만, 물 추출의 경우는 통상, 바람직하게는 4∼130℃, 보다 바람직하게는 25∼100℃ 이다. 또한, 용매 중에 에탄올이 함유되는 경우는 4∼60℃ 의 범위가 바람직하다. 추출시간이나 추출효율을 고려하여 결정하면 되지만, 통상, 바람직하게는 몇 초간∼몇 일간, 보다 바람직하게는 5분간∼24시간의 범위가 되도록, 원료, 추출용매, 추출온도를 설정하는 것이 바람직하다. 추출시의 압력은, 특별히 한정되지 않고, 필요에 따라 적절히 결정할 수 있다. 추출조작은 예를 들어 상압 하에서나 가압 하에서나 흡인여과 등에 의한 감압 하에서도 필요에 따라 조건을 선택하여 사용할 수 있다. 추출조작은, 예를 들어, 교반하면서 또는 정치하여 실시하면 되고, 또한, 필요에 따라 복수회 반복해도 된다. 이상의 조작에 의해, 본 발명에서 사용되는 식물 유래의 추출물 (이하, 본 발명의 추출물이라 칭하는 경우가 있다) 이 얻어진다. 추출물은 필요에 따라, 여과, 원심분리, 농축, 한외여과, 분자체 등의 처리를 하여, 목적하는 골형성 촉진 작용 또는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 성분 (이하, 각각 골형성 촉진 성분 또는 BMP 생성 증강 성분이라고 한다) 이 농축된 추출물을 조제할 수 있다. 추출물이나 농축 추출물의 골형성 촉진 작용 또는 BMP 생성 증강 작용은, 후술하는 실시예 2 또는 4 에 기재된 방법에 준하여 간편하게 측정할 수 있다. 또한, 본 발명에서 사용되는 식물을 공지된 방법으로 차엽 형상으로 하여, 이것을 사용하여 얻어진 추출물도 골형성 촉진 작용 또는 BMP 생성 증강 작용을 갖고 있으면, 본 발명의 추출물로서 사용할 수 있다. 또, 본 발명에 있어서는 다른 추출법으로 얻어진 추출물을 2종 이상 병용할 수도 있다.

또한, 본 발명에 있어서는, 본 발명에서 사용되는 식물 유래의 추출물을 공지된 방법으로 분획함으로써 얻어지는 획분이나, 분획 조작을 복수회 반복함으로써 얻어지는 획분도 본 발명의 추출물에 포함된다. 상기 분획 수단으로는, 추출, 분별 침전, 칼럼 크로마토그래피, 박층 크로마토그래피 등을 들 수 있다. 얻어진 분획의 정제를, 골형성 촉진 작용 또는 BMP 생성 증강 작용을 지표로서 더욱 진행시킴으로써, 골형성 촉진 성분 또는 BMP 생성 증강 성분을 단리할 수도 있다. 그들 성분도 본 발명의 유효성분에 포함된다.

또한, 식물 유래의 추출물 이외의 식물 유래 처리물로는, 식물 유래의 분쇄물을 들 수 있다. 분쇄물의 제조방법으로는, 예를 들어 식물을 건조시켜, 분쇄함으로써 분말 형상의 식물 유래의 분쇄물을 얻을 수 있다.

또한, 식물 유래의 착즙액의 제조방법으로는, 공지된 식물의 착즙 방법을 들 수 있고, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 스크류식, 기어식, 커터식 등의 착즙기나 쥬서를 사용하는 방법을 들 수 있다. 또한, 전처리로서 원료를 세단 또는 갈아 으깬 후, 상기 서술한 쥬서 또는 천 등으로 짜서 착즙액을 얻을 수도 있다.

파쇄물이란 유효성분의 원료로서 사용되는 식물을 파쇄하여 부순 것으로, 일반적으로는 분쇄물보다도 조직편이 크고, 예를 들어, 파쇄기를 사용함으로써 제조할 수 있다. 또한, 화학처리물이란 특별히 한정되지 않지만, 그 식물을 산처리, 알칼리처리, 산화처리, 환원처리 등에 제공하여 얻어진 것을 말하고, 예를 들어, 염산, 황산, 질산, 시트르산, 아세트산 등의 무기산이나 유기산, 또는 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아 등의 무기 염기나 유기 염기를 함유하는 수용액에 그 식물을 침지함으로써 제조할 수 있다. 화학처리물에는 상기한 바와 같은 화학처리된 식물체에서 유래되는 모든 것을 포함한다. 효소처리물이란 예를 들어, 펙티나아제, 셀룰라아제, 자일라나아제, 아밀라아제, 만나나아제, 글루코시다아제 등에 의한 효소처리물, 미생물에 의한 효소반응물 (예를 들어, 발효물) 을 말하고, 예를 들어, 그 식물에 대하여 상기 효소를 적당한 완충액 중에서 작용시킴으로써 제조할 수 있다. 효소처리물에는, 상기한 바와 같은 효소처리를 받은 식물체에 유래되는 모든 것을 포함한다. 또한, 본 발명의 식물 유래 처리물로는, 예를 들어, 상기 식물의 줄기를 절단하고, 그 절단면에서 얻어지는 즙액도 포함된다.

본 발명에 있어서, 식물 유래 처리물의 형상으로는, 골형성 촉진 작용 또는 BMP 생성 증강 작용을 갖고 있으면 특별히 한정되지 않지만, 분말형상, 고형상, 액상의 어느 형상이어도 된다. 또, 당해 처리물을 공지된 방법으로 조립 (造粒) 하여 입상의 고형물로서, 본 발명의 식물 유래 처리물로서 사용할 수 있다. 조립방법으로는, 특별히 한정되지 않지만, 전동 조립, 교반 조립, 유동층 조립, 기류 조립, 압출하여 조립, 압축성형 조립, 해쇄 조립, 분사 조립 또는 분무 조립 등이 예시된다. 분말형상의 당해 식물 유래 처리물을 액체, 예를 들어 물이나 알코올 등에 용해하여 액상으로 하여, 본 발명의 식물 유래 처리물로서 사용할 수도 있다.

본 발명에 있어서의 식물 유래 처리물은, 원료인 식물체 자체와 비교하여 골형성 촉진 성분 또는 BMP 생성 증강 성분을 고농도 및/또는 고순도로 함유하는 것이 특히 바람직하다. 여기서 고농도란 원료인 식물체의 단위중량당의 골형성 촉진 성분 또는 BMP 생성 증강 성분의 중량보다도 식물 유래 처리물의 단위중량당 골형성 촉진 성분 또는 BMP 생성 증강 성분의 중량 쪽이 많은 것을 의미한다. 또한, 고순도란, 원료인 식물체와 비교하여, 골형성 촉진 성분 또는 BMP 생성 증강 성분의 함유율이 식물 유래 처리물에서 높은 것을 의미한다.

또한, 본 발명은 식물 유래 처리물을 고농도 및/또는 고순도로 함유하는 식품, 음료 또는 사료를 제공하지만, 이것은 종래의 식품, 음료 또는 사료와 비교하여, 본 발명의 식품, 음료 또는 사료 중에 골형성 촉진 성분 또는 BMP 생성 증강 성분이 고농도 및/또는 고순도로 함유되어 있는 식품, 음료 또는 사료를 제공하는 것을 의미한다.

또한, 본 발명에 있어서는, 미나리과 식물 유래 처리물로부터 얻어질 수 있는 상기 식 (A) 로 표시되는 화합물, 그 유도체 또는 그들의 염 (이하, 본 발명의 화합물이라고 하는 경우가 있다)을, 본 발명의 치료제, 예방제, 골형성 촉진제, BMP 생성 증강제, 식품, 음료 또는 사료의 유효성분으로서 사용할 수도 있다. 본 발명의 화합물은, 각각 단독으로 또는 2종 이상을 혼합하여 사용할 수 있다. 당해 화합물은, 상기 서술한 공지의 분획방법에 의해 미나리과 식물로부터 정제한 것이어도 되고, 또한 화학적으로 반합성 또는 합성된 것이어도 된다.

식 (A) 로 표시되는 화합물의 구체적인 제조방법으로는, 하기 실시예 1 에 기재된 방법이 예시된다. 또한, 예를 들어, 천연물 유래의 칼콘류 화합물을 원료로 하여 유기 합성함으로써 반합성품이 얻어지고, 전체를 유기 합성함으로써 합성품이 얻어진다. 유기 합성 방법은, 예를 들어, Alessandra Lattanzi et al., Synlett. 2002, No.6, p942-946:L. Claisen A. et al., Ber. 1881, No.14, p2460 등을 참조하면 된다.

본 명세서에 있어서 상기 식 (A) 로 표시되는 화합물의 유도체란, 그 화합물을 원화합물로 하여 합성되는 화합물이고, 식 (A) 로 표시되는 화합물과 동등한 작용, 즉, 골형성 촉진 작용 또는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 화합물이다. 이러한 유도체로서는, 예를 들어 상기 식 (A) 로 표시되는 화합물의 에스테르체, 에테르체, 배당체 등, 체내에서 용이하게 가수분해하여, 원하는 효과를 발휘할 수 있는 화합물 (프로드러그) 를 들 수 있다. 이러한 프로드러그의 조제는 공지된 방법에 따르면 된다. 또, 이러한 유도체는, 그들 염이어도 된다.

또한, 본 발명의 화합물에 있어서, 염으로는 약리학적으로 허용되는 염이 바람직하다. 본 발명에서 사용되는 염으로는, 예를 들어, 알칼리금속염, 알칼리토금속염, 유기 염기라는 염 등이 예시된다. 이러한 염으로는 약리학적으로 허용되는 염이 바람직하다. 또, 본 발명에 있어서 사용되는 약리학적으로 허용되는 염이란 생물에 대하여 실질적으로 무독인 염을 의미한다. 당해 염으로는, 예를 들어, 나트륨, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 암모늄 또는 프로톤화된 벤자틴(N,N'-디-벤질에틸렌디아민), 콜린, 에탄올아민, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, 메그라민(N-메틸글루카민), 베네타민(N-벤질페네틸아민), 피페라진 또는 톨로메타민(2-아미노-2-히드록시메틸-1,3-프로판디올) 과의 염을 들 수 있다.

또, 본 발명에 있어서, 본 발명에서 사용되는 식물 유래 처리물 및/또는 본 발명의 화합물을 본 발명의 유효성분이라 칭하고, 본 발명의 유효성분을 함유하는 골형성 촉진 또는 BMP 생성 증강을 필요로 하는 질환의 치료제 또는 예방제를 본 발명의 치료제 또는 예방제라 칭하는 경우가 있다.

본 발명에 관련되는 유효성분에는, 후술하는 바와 같이 특히 독성은 관찰되지 않는다. 또한, 부작용이 발생할 우려도 없다. 그러므로, 그 유효성분을 사용하면, 안전하고 또한 적절하게 질환의 치료 또는 예방을 할 수 있다. 따라서, 당해 유효성분을 함유하여 이루어지는 본 발명의 치료제, 예방제, 골형성 촉진제, BMP 생성 증강제, 식품, 음료 또는 사료는, 골형성 촉진 또는 BMP 생성 증강을 필요로 하는 질환의 치료 또는 예방에 유효하다.

본 발명에 있어서 골형성 촉진 작용이란, 골이나 연골의 형성작용을 촉진하는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들어, 간엽계 줄기세포로부터의 골아세포로의 분화 촉진 작용, 미분화 간엽계 세포로부터의 골아세포로의 분화 촉진 작용, 전골아세포로부터의 골아세포로의 분화 촉진 작용, 골기질의 형성 촉진 작용, 골기질의 석회화 작용, 골아세포로부터의 골세포로의 분화 촉진 작용, 연골내 골화 유도 작용 등이 예시된다. 또한, 골형성 촉진 작용의 유무에 관해서는, 특별히 한정되지 않지만, 후술하는 실시예 2 에 기재된 방법에 의해, 예를 들어, 간엽계 줄기세포로부터의 골아세포로의 분획촉진 작용으로서 간편하게 측정할 수 있다. 여기서, 「촉진」에는「유도」를 포함한다.

본 발명에 있어서, BMP 로는, 예를 들어 BMP-1, BMP-2, BMP-3, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10, BMP-11, BMP-12, BMP-13, BMP-14, BMP-15 등이 예시되고, 특히 바람직하게는 BMP-2, BMP-4 또는 BMP-7 이 예시된다. 또한, BMP 생성 증강 작용의 유무에 관해서는, 특별히 한정은 없지만, 후술하는 실시예 4 에 기재된 방법에 의해 간편하게 측정할 수 있다.

BMP 는 골, 연골, 인대, 힘줄 등의 형성을 강하게 촉진시키는 인자이고, 전골아세포에 작용하여 골아세포로의 분화를 촉진시켜, 골의 발생, 성장, 리모델링, 골절의 치유과정에 관여하는 것으로 생각된다. 또한, BMP 는 미분화 간엽계 세포에 작용하여, 분화 단계에 따라 연골아세포, 골아세포, 지방세포로의 분화의 할당을 실시함으로써, 널리 간엽계 유래 세포의 성숙과 증식에 관여하고 있다. 또한, BMP 는 개체의 발생과정에서도, 배복축 형성이나 중배엽 형성 등에 중요한 기능을 하고 있다. BMP 중에서도 BMP-2, -4, -7 은 특히 골형성 활성이 강하고, 재조합 인간 BMP-2 는 골 결손 동물에 작용하여 골 결손을 회복할 수 있다. 재조합 인간 BMP-2 의 상세한 것에 관해서는, 예를 들어, J. M. Wozney et aI., Science Vol.242 p1528-1534 (1988) 을 참조하면 된다. 또한, 치과 영역에서는, BMP-2 에 의한 치조골 시멘트질이나 치근막조직 등의 치주조직의 재생이 확인되어 있다.

본 발명에 있어서, 골형성 촉진 또는 BMP 생성 증강을 필요로 하는 질환으로는, 예를 들어, 골다공증 (예를 들어, 만성골다공증, 폐경후의 호르몬 밸런스 이상에 의해 일어나는 골다공증, 당뇨병이나 스테로이드제 등의 부작용에 따른 속발성 골다공증 등), 골절, 재골절, 골 결손, 골형성 부전증, 골 연화증, 골 페체트병, 경직성 척수염, 만성 관절 류머티즘, 변형성 관절염, 연골이 관여하는 변형성 관절증, 치주병, 치주질환에 있어서의 치주 조직 결손, 치근·치조결손, 악제 (顎堤) 형성, 구개열이 예시된다. 또한, 본 발명의 치료제 또는 예방제는, 다발성 골수종, 폐암, 유방암 등의 외과 수술 후의 골조직 수복제로서 사용할 수도 있다. 나아가서는, 본 발명의 치료제 또는 예방제는 재생 의료 분야에서의 골 재생 목적으로도 사용할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 치료제 또는 예방제는, 인공 골이나 인공 치근의 활성화·안정화에 사용할 수 있고, 또한 질환을 갖기 전의, 또는 질환을 가진 환자의 생체 내에서 세포를 취해, 체외에서 본 발명의 치료제 또는 예방제를 작용시켜, 재생 골조직을 형성시킨 후, 다시 환자의 생체내로 되돌릴 수도 있다.

본 발명의 치료제 또는 예방제로는, 본 발명에 관련되는 상기 유효성분을 공지된 의약과 조합하여 제제화한 것을 들 수 있다. 본 발명의 유효성분은, 예를 들어, 골의 흡수를 저해하는 약제, 예를 들어 에스트로겐, 칼시토닌, 활성형 비타민 D₃, 비스포스포네이트 등과 함께 사용할 수 있다. 기타, 본 발명의 유효성분을 BMP 와 함께 사용할 수도 있다. 이에 의해, 실시예 13 에 기재된 대로, 골형성 촉진에 관해서 상승효과를 기대할 수 있다. 여기서, BMP로는, 상기 재조합 인간 BMP-2 가 바람직하게 사용된다. 따라서, 본 발명의 치료제 또는 예방제의 바람직한 양태로서, 상기 식물 유래 처리물 및/또는 본 발명의 화합물과 재조합 인간 BMP-2 를 함유하여 이루어지는 것을 들 수 있다. 또, 이러한 구성은, 본 발명의 골형성 촉진제, BMP 생성 증강제, 식품, 음료, 사료에 있어서도 바람직한 양태가다.

본 발명의 치료제 또는 예방제의 제조는, 통상, 상기 유효성분을 약학적으로 허용할 수 있는 액상 또는 고체상의 담체와 배합함으로써 실시되고, 필요에 따라 용제, 분산제, 유화제, 완충제, 안정제, 부형제, 결합제, 붕괴제, 활택제 등을 첨가하여, 정제, 과립제, 산제, 분말제, 캡슐제 등의 고형제, 통상 액제, 현탁제, 유제 등의 액제로 할 수 있다. 또한, 사용 전에 적당한 담체의 첨가에 의해 액상으로 이룰 수 있는 건조품이나, 기타, 외용제로 할 수도 있다.

의약용 담체는, 치료제 또는 예방제의 투여형태 및 제형에 따라 선택할 수 있다. 고체 조성물로 이루어지는 경구제로 하는 경우는, 정제, 환제, 캡슐제, 산제, 세립제, 과립제 등으로 할 수 있고, 예를 들어, 전분, 유당, 백당, 만니톨, 카르복시메틸셀룰로오스, 콘스타치, 무기 염 등이 이용된다. 또한 경구제의 조제에 있어서는, 추가로 결합제, 붕괴제, 계면활성제, 윤택제, 유동성촉진제, 교미제, 착색제, 향료 등을 배합할 수도 있다. 예를 들어, 정제 또는 환제로 하는 경우는, 필요에 따라 자당, 젤라틴, 히드록시프로필셀룰로오스 등의 당의 또는 위용성 또는 장용성 물질의 필름으로 피복해도 된다. 액체 조성물로 이루어지는 경구제로 하는 경우는, 약리학적으로 허용되는 유탁제, 용액제, 현탁제, 시럽제 등으로 할 수 있고, 예를 들어, 정제수, 에탄올 등이 담체로서 이용된다. 또한, 추가로 필요에 따라 습윤제, 현탁제와 같은 보조제, 감미제, 풍미제, 방부제 등을 첨가해도 된다.

한편, 비경구제로 하는 경우는, 통상적인 방법에 따라서 본 발명의 상기 유효성분을 희석제로서의 주사용 증류수, 생리식염수, 포도당 수용액, 주사용 식물유, 참기름, 낙화생유, 대두유, 옥수수유, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등에 용해 내지 현탁시켜, 필요에 따라, 살균제, 안정제, 등장화제, 무통화제 등을 첨가함으로써 조제할 수 있다. 또한, 고체 조성물을 제조하여, 사용 전에 무균수 또는 무균의 주사용 용매에 용해하여 사용할 수도 있다.

외용제로는, 경피투여용 또는 경점막 (구강내, 비강내) 투여용의, 고체, 반고체상 또는 액상의 제제가 포함된다. 또한, 좌제 등도 포함된다. 예를 들어, 유제, 로션제 등의 유탁제, 외용 덩크제, 경점막 투여용 액제 등의 액상 제제, 유성 연고, 친수성 연고 등의 연고제, 필름제, 테이프제, 파프제 등의 경피투여용 또는 경점막 투여용의 첩부제 등으로 할 수 있다.

이상의 각종 제제는, 각각 공지의 의약용 담체 등을 이용하여, 적절히, 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다. 또한, 이러한 제제에 있어서의 유효성분의 함유량은, 그 투여형태, 투여방법 등을 고려하여, 바람직하게는 후술하는 투여량 범위에서 당해 유효성분을 투여할 수 있는 양이면 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 본 발명에서 원료로 사용되는 식물의 건조물 1g 으로부터, 추출용매로서 20㎖ 의 물을 사용한 추출조작으로 얻어지는 추출물을 5㎖ 로 농축시킨 것을 유효성분으로 한 경우, 치료제 또는 예방제 100중량% 중, 통상 0.001∼100중량%, 바람직하게는 0.01∼90중량%, 보다 바람직하게는 0.1∼80중량% 이다. 또한, 유효성분으로서 본 발명의 화합물을 사용하는 경우, 특별히 한정되지 않지만, 치료제 또는 예방제 100중량% 중, 통상 0.000001∼100중량%, 바람직하게는 0.00001∼90중량%, 보다 바람직하게는 0.0001∼80중량% 이다.

또, 본 발명의 유효성분을 상기 재조합 BMP-2 와 병용하는 경우, 재조합 BMP-2 는, 유효성분 100중량부에 대하여, 통상 0.1∼100000중량부 정도 사용하는 것이 바람직하다. 이러한 유효성분과 재조합 BMP-2 와의 병용시의 비율은, 후술하는 골형성 촉진제, BMP 생성 증강제, 식품, 음료, 사료에 관해서도 동일하다.

본 발명의 치료제 또는 예방제는, 제제형태에 따른 적당한 투여경로로 투여된다. 투여방법도 특별히 한정되지 않고, 내용, 외용 및 주사에 의해 실행할 수 있다. 주사제는, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피하, 피내 등에 투여할 수 있고, 외용제로는 예를 들어, 좌제를 그 적절한 투여방법에 의해 투여하면 된다.

본 발명의 치료제 또는 예방제로서의 투여량은, 그 제제형태, 투여방법, 사용목적 및 당해 치료제 또는 예방제의 투여대상인 환자의 연령, 체중, 증상에 따라 적절히 설정되어 일정하지 않다. 일반적으로는, 제제 중에 함유되는 상기 유효성분의 투여량으로, 예를 들어 본 발명에서 원료로서 사용되는 식물의 건조물 1g 으로부터, 추출용매로서 20㎖ 의 물을 사용한 추출조작으로 얻어지는 추출물을 5㎖ 로 농축한 것을 유효성분으로 한 경우, 인간 (예를 들어 성인) 1일 당 0.0001㎎∼2000㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.001㎎∼1000㎎/㎏ 체중, 보다 바람직하게는 0.01㎎∼100㎎/㎏ 체중이다. 또한, 유효성분으로서 본 발명의 화합물을 사용하는 경우, 특별히 한정되지 않지만, 인간 (예를 들어 성인) 1일 당 0.0001㎍∼2000㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.001㎍∼1000㎎/㎏ 체중, 보다 바람직하게는 0.01㎍∼100㎎/㎏ 체중이다. 물론 투여량은, 여러 가지의 조건, 예를 들어 추출용매의 종류, 사용한 용매의 사용량 등에 따라서도 변동하기 때문에, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 범위를 초과하여 필요한 경우도 있다. 투여는, 원하는 투여량 범위내에서, 1일 중에서 1회로, 또는 복수회로 나눠 행해도 되고, 소정 기간에 걸쳐 행해도 된다. 또, 본 발명의 치료제 또는 예방제는 그대로 경구투여하는 것 외에, 임의의 음식품에 첨가하여 일상적으로 섭취시킬 수도 있다.

또한, 본 발명은 상기 유효성분을 함유하는 골형성 촉진제 및 BMP 생성 증강제를 제공할 수도 있다. 당해 골형성 촉진제 및 BMP 생성 증강제로서는, 상기 유효성분 그 자체이어도 되고, 또한, 상기 유효성분을 포함하는 조성물 이어도 된다. 골형성 촉진제 및 BMP 생성 증강제는, 예를 들어, 상기 유효성분을 당해 유효성분과 동일한 용도에 사용가능한 다른 성분 등과 배합하고, 상기 치료제 또는 예방제의 제조방법에 준하여 통상 사용되는 시약의 형태로 제조하면 된다. 이러한 골형성 촉진제 또는 BMP 생성 증강제에 있어서의 상기 유효성분의 함유량은, 당해 골형성 촉진제 또는 BMP 생성 증강제의 투여방법, 사용목적 등을 고려하여, 본 발명의 원하는 효과의 발현이 얻어질 수 있는 양이면되고, 특별히 한정되는 것이 아니다. 예를 들어, 본 발명에서 원료로서 사용되는 식물의 건조물 1g 에서, 추출용매로서 20㎖ 의 물을 사용한 추출조작으로 얻어지는 추출물을 5㎖ 로 농축한 것을 유효성분으로 한 경우, 골형성 촉진제 또는 BMP 생성 증강제 100중량% 중, 통상 0.001∼100중량%, 바람직하게는 0.01∼90중량%, 보다 바람직하게는 0.1∼80중량% 이다. 또한, 유효성분으로서 본 발명의 화합물을 사용하는 경우, 특별히 한정되지 않지만, 골형성 촉진제 또는 BMP 생성 증강제 100중량% 중, 통상 0.000001∼100중량%, 바람직하게는 0.00001∼90중량%, 보다 바람직하게는 0.0001∼80중량% 이다.

그 골형성 촉진제 또는 BMP 생성 증강제의 사용량도, 본 발명의 원하는 효과의 발현이 얻어질 수 있으면 특별히 한정되지 않는다. 특히, 생체에 투여하여 사용하는 경우에는, 바람직하게는 상기 치료제 또는 예방제에 있어서의 유효성분의 투여량 범위내에서 유효성분을 투여할 수 있는 양으로 사용하면 된다. 본 발명의 골형성 촉진제 또는 BMP 생성 증강제는, 골형성 촉진 또는 BMP 생성 증강에 관여하는 질환에 있어서 유용하다.

또한, 본 발명의 골형성 촉진제 또는 BMP 생성 증강제는, 임플란트에 함유시켜 사용할 수 있다. 이에 의해, 예를 들어 골절에 있어서는, 당해 임플란트를 사용함으로써, 골접합을 촉진시키기 때문에 골절의 치유 또는 임플란트와 골조직과의 통합을 가속시킬 수 있다. 또, 여기서 임플란트란 외과수술의 과정에서 체내에 적어도 부분적으로 도입되는 기구를 의미하여, 관절, 골, 치아, 인대 혹은 힘줄 등의 절단이나 손상에 대하여 사용되는 것이다. 또 임플란트는 체내에 영구히 남아 있어도 되고, 또한 생물에 따라 재흡수되어도 된다. 여기서, 본 발명의 골형성 촉진제 또는 BMP 생성 증강제는 임플란트의 내부에 함유시켜도 된고, 또한 임플란트 표면에 코팅하여 함유시켜도 된다. 본 발명의 골형성 촉진제 또는 BMP 생성 증강제의 함유량은 원하는 효과가 얻어지도록 적절히 설정하면 된다. 임플란트는, 본 발명의 유효성분을 사용하여 공지된 방법에 의해 제작할 수 있다.

또한, 본 발명의 골형성 촉진제 또는 BMP 생성 증강제는, 치약에 함유시켜 사용할 수도 있다. 당해 치약은 본 발명의 골형성 촉진 작용 또는 BMP 생성 증강 작용에 의해, 치주 조직을 재생하여, 치주염의 예방이나 치아의 재석회화를 촉진시킬 수 있다. 본 발명의 골형성 촉진제 또는 BMP 생성 증강제의 함유량은 원하는 효과가 얻어지도록 적절히 설정하면 된다. 치약은, 본 발명의 유효성분을 사용하여 공지된 방법에 의해 제작할 수 있다.

또한, 당해 골형성 촉진제 또는 BMP 생성 증강제는, 골에 관여하는 질환에 대한 약품의 스크리닝에도 유용하다. 또한 당해 골형성 촉진제 또는 BMP 생성 증강제는, 골의 물리적 변화에 관한 기능연구에도 유용하다.

본 발명에 관련되는 유효성분에는, 후술하는 바와 같이 특별히 독성은 관찰되지 않는다. 또한, 부작용이 발생할 우려도 없다. 그러므로, 그 유효성분에 의하면, 안전하고 또한 적절하게 골형성 촉진 작용 또는 BMP 생성 증강 작용을 발현시킬 수 있다. 따라서, 당해 유효성분을 포함하여 이루어지는 본 발명의 의약, 식품, 음료 또는 사료는, 골형성 촉진 또는 BMP 생성 증강을 필요로 하는 질환의 치료 또는 예방에 유효하다.

또한, 본 발명은, 상기 유효성분을 함유하여 이루어지는 골형성 촉진용 또는 BMP 생성 증강용의 식품, 음료 또는 사료를 제공한다. 여기서, 「함유」는 함유, 첨가 및/또는 희석을 의미한다. 본 발명의 식품, 음료 또는 사료는, 그 골형성 촉진작용 또는 BMP 생성 증강 작용에 의해, 골형성 촉진 또는 BMP 생성 증강을 필요로 하는 질환의 증상개선, 예방에 매우 유용하다.

또, 본 명세서에 있어서, 상기「함유」는 식품, 음료 또는 사료 중에 본 발명에서 사용되는 유효성분이 포함된다고 하는 양태를, 상기「첨가」는 식품, 음료 또는 사료의 원료에, 본 발명에서 사용되는 유효성분을 첨가한다고 하는 양태를, 상기「희석」 은 본 발명에서 사용되는 유효성분에, 식품, 음료 또는 사료의 원료를 첨가한다고 하는 양태를 말하는 것이다.

본 발명의 식품, 음료 또는 사료의 제조법에 특별히 한정은 없다. 예를 들어, 배합, 조리, 가공 등은 일반의 식품, 음료 또는 사료에 따르면 되고, 그들 제조법에 의해 제조할 수 있고, 얻어진 식품, 음료 또는 사료에 골형성 촉진 작용 또는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 본 발명에 관련되는 상기 유효성분이 함유되어 있으면 된다.

본 발명의 식품 또는 음료로서는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어, 본 발명에 관련되는 상기 유효성분이 함유되어 이루어지는, 곡물가공품 (소맥분 가공품, 전분류 가공품, 프리믹스 가공품, 면류, 마카로니류, 빵류, 팥소류, 메밀류, 밀기울, 쌀국수, 당면 및 포장떡 등), 유지 가공품 (가소성 유지, 튀김 기름, 샐러드유, 마요네즈류, 드레싱 등), 대두 가공품 (두부류, 된장, 대두발효품 등), 식육 가공품 (햄, 베이컨, 압축햄, 소시지 등), 수산제품 (냉동 다진 어육, 어묵, 관 모양의 어묵, 다진 어육, 기름에 튀긴 어육, 어육 볼, 시뉴 (sinew), 어육 햄, 소시지, 가다랭이포, 어란 가공품, 수산 통조림, 해산물을 간장으로 조린 반찬 (쯔구다니) 등), 유제품 (원료유, 크림, 요구르트, 버터, 치즈, 연유, 분유, 아이스크림 등), 야채·과일 가공품 (페이스트류, 잼류, 절임채소류, 과일음료, 야채음료, 믹스음료 등), 과자류 (껌, 엿, 초컬릿, 비스켓류, 과자빵류, 케이크, 떡과자, 쌀과류 등), 알코올 음료 (정종, 중국술, 와인, 위스키, 소주, 보드카, 브랜디, 진, 럼주, 맥주, 청량 알코 음료, 과일주, 리큐어 등), 기호 음료 (녹차, 홍차, 우롱차, 커피, 청량음료, 락트산 음료 등), 조미료 (간장, 소스, 식초, 미림 등), 통조림ㆍ병조림ㆍ백 포장 식품 (쇠고기 야채 덮밥, 쇠고기 야채 솥밥, 팥밥, 카레라이스, 기타 각종 조리 식품), 반건조 또는 농축식품 (리버페이스트, 기타 스프레드, 메밀국수ㆍ우동의 다시, 농축 스프류), 건조 식품 (즉석면류, 즉석 카레, 인스턴트 커피, 분말쥬스, 분말 스프, 즉석 된장국 (미소), 조리 식품, 조리 음료, 조리 스프 등), 냉동식품 (스끼야끼, 차완무시(일식 계란찜), 장어구이, 햄버그 스테이크, 슈마이, 교자 (만두), 각종 스틱, 후루츠 칵테일 등), 고형식품, 액체식품 (스프 등), 향신료류 등의 농산ㆍ임산가공품, 축산가공품, 수산가공품 등을 들 수 있다. 또한, 본 발명의 식품으로는, 특히 껌, 엿류 등이 바람직하다. 이러한 식품은, 입안에서 일정 시간 저작되는 점에서, 그들에 본 발명의 유효성분이 함유되어 있으면, 본 발명의 유효성분에 의해 나타나는 효과, 예를 들어, 치주 조직의 재생효과, 치아의 재석회화 촉진효과를 보다 효과적으로 발현시킬 수 있다.

본 발명의 식품 또는 음료에는 상기 유효성분이 단독 또는 복수 함유, 첨가 및/또는 희석되어 있고, 그 골형성 촉진 작용 또는 BMP 생성 증강 작용을 발현하기 위한 필요량이 포함되어 있으면 특히 그 형상에 한정은 없고, 태블릿 형상, 과립형상, 캡슐형상 등의 형상의 경구적으로 섭취가능한 형상물도 포함한다.

또한, 본 발명의 음료에 관해서는, 본 발명의 유효성분과, 미나리과, 백합과 및 국화과 이외의 식물, 예를 들어 이들 이외의 야채나 과일 등의 착즙액과 혼합 또는, 이들과 동시에 착즙하여 건강음료로 할 수도 있다. 예를 들어, 신선초, 셀러리, 백합, 알로에 또는 쑥의 착즙액을 물로 희석하거나, 소송엽, 순무, 청경채, 토마토, 귤, 레몬, 그레이프후르츠, 키위, 시금치, 래디쉬, 무, 배추, 양배추, 샐러드채, 양상추, 오크라, 피망, 오이, 강낭콩, 가지콩, 완두, 옥수수, 아구룰라, 비파, 여름밀감, 갈귤 등의 착즙액, 우유, 두유 등과 혼합하거나 하여 골형성 촉진 작용 또는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 건강음료로 할 수 있다.

또, 본 발명의 음료의 일 양태인 알코올 음료로서는, 본 발명에서 사용되는 미나리과 식물, 백합과 식물 및/또는 국화과 식물, 예를 들어 신선초, 셀러리, 백합, 알로에 및/또는 쑥을 음용의 알코올류에 침지한 것을, 그대로 또는 공지의 알코올 음료의 제조방법에 준하여 얻어지는 알코올 음료로서 음용에 제공할 수도 있다.

또한, 본 발명에서 유효성분으로서 사용되는 식물 유래 처리물, 예를 들어, 분쇄물이나 파쇄물을 공지된 방법에 따라서 정제 등의 형태로 성형한 것도 본 발명의 식품에 포함된다.

본 발명의 식품 또는 음료 중의 상기 유효성분의 함유량은 특별히 한정되지 않고, 그 관능과 활성 발현의 관점에서 적절히 선택할 수 있지만, 예를 들어 본 발명에서 원료로서 사용되는 식물의 건조물 1g 으로부터, 추출용매로서 20㎖ 의 물을 사용한 추출조작으로 얻어지는 추출물을 5㎖ 로 농축한 것을 유효성분으로 한 경우, 식품 100중량% 중, 0.1중량% 이상, 바람직하게는 1∼100중량%, 보다 바람직하게는 6∼100중량% 이고, 음료 100중량% 중, 0.1중량% 이상, 바람직하게는 1∼100중량%, 보다 바람직하게는 6∼100중량% 이다. 또한, 유효성분으로서 본 발명의 화합물을 사용하는 경우, 특별히 한정되지 않지만, 식품 100중량% 중, 0.0001중량% 이상, 바람직하게는 0.001∼50중량%, 보다 바람직하게는 0.006∼10중량% 이고, 음료 100중량% 중, 0.0001중량% 이상, 바람직하게는 0.001∼50중량%, 보다 바람직하게는 0.006∼10중량% 이다. 또한 본 발명의 식품 또는 음료는, 바람직하게는 그들에 함유되는 유효성분이, 예를 들어 본 발명에서 원료로서 사용되는 식물의 건조물 1g 으로부터, 추출용매로서 20㎖ 의 물을 사용한 추출조작으로 얻어지는 추출물을 5㎖ 로 농축한 것을 유효성분으로 한 경우, 인간 (예를 들어 성인) 1일 당 0.0001㎍∼2000㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.001㎍∼1000㎎/㎏ 체중, 보다 바람직하게는 0.01㎍∼100㎎/㎏ 체중이 되 도록 섭취하면 된다. 또한, 유효성분으로서 본 발명의 화합물을 사용한 경우, 특별히 한정되지 않지만, 인간 (예를 들어 성인) 1일 당 0.0001㎍∼2000 ㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.001㎍∼1000㎎/㎏ 체중, 보다 바람직하게는 0.01㎍∼100㎎/㎏ 체중이다. 물론 섭취량은, 여러 가지의 조건, 예를 들어 추출용매의 종류, 사용한 용매의 사용량 등에 따라서도 변동되기 때문에, 상기 섭취량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 범위를 초과하여 필요한 경우도 있다.

또한, 본 발명은, 상기 유효성분을 함유하여 이루어지는, 골형성 촉진 작용 또는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 생물용의 사료를 제공하는 것이고, 또한, 별도의 일 양태로서, 상기 유효성분을 생물에 투여하는 것을 특징으로 하는 생물의 사육방법도 제공한다. 또한, 본 발명의 별도의 일 양태로서, 상기 유효성분을 함유하는 것을 특징으로 하는 생물사육용제가 제공된다. 여기서, 「함유」 는, 상기의 함유, 첨가 및/또는 희석을 의미한다.

이들 발명에 있어서, 생물이란 예를 들어 양식동물, 애완동물 등이고, 양식동물로는 가축, 실험동물, 가금, 어류, 갑각류 또는 조개류가 예시된다. 사료로는 몸상태의 유지 및/또는 개선용 사료가 예시된다. 생물사육용제로는 침지용제, 사료첨가제, 음료용 첨가제가 예시된다.

이들 발명에 의하면, 그들을 적용하는 상기 예시하는 것 같은 생물에 있어서, 본 발명에 사용되는 상기 유효성분의 골형성 촉진 작용 또는 BMP 생성 증강 작용에 근거하여, 본 발명의 상기 치료제 또는 예방제에 의한 것과 동일한 효과의 발현을 기대할 수 있다. 즉, 당해 생물에 있어서의 골형성 촉진 또는 BMP 생성 증강을 필요로 하는 질환의 치료 또는 예방효과가 발휘될 수 있다.

본 발명에 사용되는 상기 유효성분은 통상, 예를 들어 본 발명에서 원료로서 사용되는 식물의 건조물 1g 으로부터, 추출용매로서 20㎖ 의 물을 사용한 추출조작으로 얻어지는 추출물을 5㎖ 로 농축한 것을 유효성분으로 한 경우, 대상 생물 1일 당 0.0001㎎∼2000㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.001㎎∼1000㎎/㎏ 체중, 보다 바람직하게는 0.01㎎∼100㎎/㎏ 체중 투여된다. 또한, 유효성분으로서 본 발명의 화합물을 사용하는 경우, 특별히 한정은 없지만, 대상 생물 1일 당 0.0001㎍∼2000㎎/㎏ 체중, 바람직하게는 0.001㎍∼1000㎎/㎏ 체중, 보다 바람직하게는 0.01㎍∼100㎎/㎏ 체중이다. 물론 투여량은, 여러 가지의 조건, 예를 들어 추출용매의 종류, 사용한 용매의 사용량 등에 따라서도 변동하기 때문에, 상기 투여량보다 적은 양으로 충분한 경우도 있고, 또는 범위를 초과하여 필요한 경우도 있다. 투여는, 예를 들어, 당해 유효성분을, 대상 생물에 재공하는 인공 배합 사료의 원료 중에 첨가, 혼합하여 두거나, 인공 배합 사료의 분말 원료와 혼합한 후, 그 밖의 원료에 추가로 첨가, 혼합함으로써 실시할 수 있다. 또한, 상기 유효성분의 사료 중의 함유량은 특별히 한정되지 않고, 목적에 따라 적절히 설정하면 되는데, 예를 들어 본 발명에서 원료로서 사용되는 식물의 건조물 1g 으로부터, 추출용매로서 20㎖ 의 물을 사용한 추출조작으로 얻어지는 추출물을 5㎖ 로 농축한 것을 유효성분으로 한 경우, 사료 100중량% 중, 0.1중량% 이상, 바람직하게는 1∼100중량%, 보다 바람직하게는 6∼100중량% 이다. 또한, 유효성분으로서 본 발명의 화합물을 사용하는 경우, 특별히 한정되지 않지만, 사료 100중량% 중, 0.0001중량% 이상, 바람직하게는 0.001∼50중량%, 보다 바람직하게는 0.006∼10중량% 이다.

본 발명의 사료의 제조법에 특별히 한정은 없고, 또한 배합도 일반의 사료에 준하는 것이면 되고, 제조된 사료 중에 골형성 촉진 작용 또는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 본 발명에 관련되는 상기 유효성분이 포함되어 있으면 된다.

생물사육용제는, 상기 사료의 경우에 준하여, 제조, 사용하거나 하면 된다.

본 발명이 적용할 수 있는 생물로는 한정되지 않지만, 양식동물로는, 말, 소, 돼지, 양, 염소, 낙타, 라마 등의 가축, 마우스, 래트, 몰모트, 토끼 등의 실험동물, 닭, 집오리, 칠면조, 타조 등의 가금, 애완동물로서는 개, 고양이 등을 들 수 있고, 널리 적용할 수 있다.

골형성 촉진 작용 또는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 본 발명에 사용되는 상기 유효성분을 포함하여 이루어지는 사료를 섭취시키는 것, 또는 골형성 촉진 작용 또는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 본 발명에 사용되는 상기 유효성분의 함유액에 대상 생물을 침지함으로써, 가축, 실험동물, 가금, 애완동물 등의 몸상태를 양호하게 유지하거나, 또는 개선시키거나 할 수 있다. 또, 이들 양태는, 본 발명에 의해 제공되는 생물의 사육방법의 일 양태를 이룬다.

계속해서, 본 발명의 BMP 생성 증강 작용의 측정방법, BMP 생성 증강 작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법 및 그 물질의 제조방법에 관해서 설명한다. 이들 방법은 모두 본 발명에서 원료로서 사용하는 식물의 선별이나 본 발명의 유효성분의 취득, 본 발명의 유효성분 및 그 유효성분을 포함하는, 치료제, 식품 등의 조성물이 갖는 BMP 생성 증강 작용을 평가하는 데 바람직하게 사용된다.

본 발명의 다른 양태로서, 피험물질의 BMP 생성 증강 작용의 측정방법이고, (a) 피험물질과 접촉시킨 조건 하에서, HuO9 세포 또는 그 아주, 또는 이들 중 어느 하나의 세포주를 사용하여 얻어진 하이브리드머 (이하, 이들 세포를 일괄하여 본 발명의 세포주라 칭하는 경우가 있다) 를 배양하는 공정, 및 (b) 공정 (a) 에서 얻어진 배양액 중의 BMP량을 피험물질의 BMP 생성 증강 작용의 지표로서 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 BMP 생성 증강 작용의 측정방법 (본 발명의 측정방법이라 칭하는 경우가 있다) 이 제공된다.

본 발명의 측정방법은, 여러 가지의 BMP 생성세포 중에서도 본 발명의 세포주를 사용함으로써 비로소 세포의 BMP 생성량을 안정적으로 측정할 수 있는 것을 밝히고 완성된 것이다. 또, 후술하는, 본 발명의 BMP 생성 증강 작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법 및 그 물질의 제조방법에 관해서도 동일하다.

상기 HuO9 세포 (인간 골육종 세포) 는 시판되고 있고 입수가능하다. 또한, HuO9 세포의 아주로는, 자연변이주, 인공변이주 등의 변이주가 예시된다. 상기 인공변이주는, 예를 들어 변이유기제나 자외선조사와 같은 공지의 변이처리에 의해 제작할 수 있다. 또한 이들 중 어느 하나의 세포주를 사용하여 얻어진 하이브리드머로는, 공지의 세포 융합 조작에 의해 제작할 수 있고, 예를 들어 미엘로머 세포와의 세포 융합 등의 방법에 의해 얻어진 세포주가 예시된다.

본 발명의 측정방법에 있어서, 본 발명에 사용되는 세포주의 배양에 사용되는 배지에는, 특별히 한정되지 않고, 당해 세포가 생육가능한 배지를 선택하면 되고, 공지인 시판의 배지를 사용해도 된다. 본 발명에 사용되는 세포주의 배양시간으로서는, 피험물질에 의한 작용에 의해 세포의 BMP 생성량이 상승되는 데에 필요로 하는 시간 이상이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 수분간∼10일간, 바람직하게는 1시간∼5일간, 보다 바람직하게는 12시간∼3일간을 들 수 있다. 배양온도에 관해서도, 특별히 한정되지 않고, 본 발명에 사용되는 세포주의 생육에 적합한 온도, 예를 들어 0∼100℃, 바람직하게는 10∼60℃, 보다 바람직하게는 20∼50℃ 에서 배양할 수 있다.

공정 (a) 에 있어서의, 피험물질과 접촉시킨 조건 하에서의 본 발명의 세포주의 배양은, 예를 들어, 본 발명의 세포주의 배양개시와 함께, 또는 배양 중에, 그 세포주를 함유하는 배양액에 대하여 피험물질을 첨가, 혼합하여, 배양을 개시 또는 계속함으로써 실행할 수 있다. 피험물질의 첨가량은, 특별히 한정되지 않고, 원하는 효과가 얻어지도록 적절히 설정하면 된다. 피험물질을 첨가할 때의 배양액 중의 본 발명의 세포주의 양으로서는 1×10³∼1×10⁶세포/㎖ 정도인 것이 바람직하다.

일정시간 배양후, 공정 (b) 에 있어서, 본 발명의 세포주로부터 생성된 BMP량을 측정한다. 배양액 중의 BMP량의 측정은, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 효소 면역 분석법, 방사성 면역 분석법, 웨스턴블롯팅법, 또는 BMP 의 생물학적인 작용, 예를 들어 골아세포로의 분화유도능을 지표로 한 바이오분석에 의해 사용할 수 있다 (예를 들어, Katagiri et al. BBRC Vol.172, No.1, p295-299(1990);Yamaguchi et al., BBRC Vol.120, No.2, p366-371 (1996);Takuwa et al., BBRC Vol.174 No.1, p96-101 (1991) 참조).

본 발명의 측정방법에 있어서는, BMP 생성 증강 작용을 본 발명의 세포주로부터 생성된 BMP량을 지표로 하여 측정한다. 예를 들어, 후술하는 실시예 4 와 같이, 피험물질과 접촉시키고 있지 않은 경우에 본 발명의 세포주로부터 생성되는 BMP량을 100% 로 하여, 피험물질과 접촉시킨 경우의 BMP량을 상대적으로 나타냄으로써, 피험물질의 BMP 생성 증강 작용을 정량적으로 측정 (평가) 할 수 있다. 즉, BMP량이 100% 를 초과하는 경우, 피험물질은 BMP 생성 증강 작용을 갖는 것으로 판정할 수 있고, 또한 BMP량은 상대량으로서 수치로 표시되는 점에서, 그 작용을 정량적으로 평가할 수 있다.

또한 본 발명의 다른 양태로서, (a) 피험물질과 접촉시킨 조건 하에서 본 발명의 세포주를 배양하는 공정, 및 (b) 공정 (a) 에서 얻어진 배양액 중의 BMP량을 측정하는 공정, 여기서, 피험물질과 접촉시키지 않은 조건 하 또는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 대조물질과 접촉시킨 조건 하에서 상기 세포주를 배양하였을 때와 비교하여, BMP량이 많은 경우, 피험물질이 BMP 생성 증강 작용을 갖는 것으로 판정한다, 를 포함하는 것을 특징으로 하는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법 (이하, 본 발명의 스크리닝 방법이라 칭하는 경우가 있다) 이 제공된다.

본 발명의 스크리닝 방법은, 상기의 본 발명의 측정방법과 동일하게 하여 실시할 수 있다.

예를 들어, 상기와 같이, 피험물질과 접촉시키고 있지 않은 경우의 본 발명의 세포주로부터 생성되는 BMP량을 100% 로 하여, 피험물질과 접촉시킨 경우의 BMP량을 상대적으로 나타냄으로써, 피험물질의 BMP 생성 증강 작용을 정량적으로 나타내어, BMP량이 100% 를 초과하는 경우, 피험물질은 BMP 생성 증강 작용을 갖는다고 판정한다. 또한, 예를 들어, 피험물질 및 일정한 BMP 생성 증강 작용을 갖는 대조물질 (예를 들어, 상기 식 (A) 로 표시되는 화합물) 의 각각에 의한 BMP 생성 증강 작용을 측정하여, 대조물질의 경우의 BMP량을 100% 로 하여 피험물질의 BMP량을 상기의 경우에 준하여 정량적으로 나타내고, 양자를 비교함으로써, 보다 우수한 BMP 생성 증강 작용을 갖는 물질을 스크리닝할 수 있다. 여기서 BMP 생성 증강 작용의 측정에는, 상기한 본 발명의 측정방법을 사용할 수 있다.

또한 본 발명의 다른 양태로서, (a) BMP 생성 증강 작용을 갖는 물질을 얻는 공정 및 (b) 본 발명의 측정방법을 사용하여, 공정 (a) 에서 얻어진 물질의 BMP 생성 증강 작용을 측정하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 물질의 제조방법 (이하, 본 발명의 제조방법 1 이라 칭하는 경우가 있다)이 제공된다. 본 발명의 제조방법 1 은, BMP 생성 증강 작용이 검정된 BMP 생성 증강물질의 제조에 있어서 유용하다.

공정 (a) 는, 예를 들어, 상기 본 발명의 스크리닝 방법에 따라 BMP 생성 증강 물질을 취득함으로써 사용할 수 있다.

공정 (b) 에서는, 예를 들어, 얻어진 BMP 생성 증강 물질로부터 BMP 생성 증강 성분을 단리 정제할 수 있다. 즉, 공정 (b) 에 있어서 본 발명의 측정방법을 사용하여, 공정 (a) 에서 얻어진 물질의 BMP 생성 증강 작용을 측정함으로써, 그 작용을 지표로 하여 BMP 생성 증강 성분의 정제의 정도를 확인하면서 단리 정제 조작함으로써, 원하는 성분을 취득할 수 있다. BMP 생성 증강 성분의 단리 정제는, 본 발명의 유효성분인 식물 유래 처리물에 적용될 수 있는 방법으로서 상기한 바와 같은 공지된 방법에 따라서 실시하면 된다.

또한, 본 발명의 제조방법의 일 양태로서, (a) 피험물질과 접촉시킨 조건 하에서 본 발명의 세포주를 배양하는 공정, 및 (b) 공정 (a) 에서 얻어진 배양액 중의 BMP량을 측정하는 공정, 여기서, 피험물질과 접촉시키지 않은 조건 하 또는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 대조물질과 접촉시킨 조건 하에서 상기 세포주를 배양하였을 때와 비교하여, BMP량이 많은 경우, 피험물질이 BMP 생성 증강 작용을 갖는 것으로 판정하여, 그 피험물질을 BMP 생성 증강 작용을 갖는 물질로서 취득하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 물질의 제조방법 (이하, 본 발명의 제조방법 2 라고 한다) 이 제공된다.

이러한 본 발명의 제조방법 2 는, 상기 본 발명의 스크리닝 방법과 동일하게 하여 실시할 수 있다. 본 발명의 제조방법 2 에 있어서는, 피험물질이 BMP 생성 증강 작용을 갖는다고 판정된 경우, 그 피험물질을 BMP 생성 증강 작용을 갖는 물질로서 취득한다. 얻어진 BMP 생성 증강 작용을 갖는 물질을, 다시 본 발명의 제조방법 1 에 제공하고, BMP 생성 증강 성분의 단리 정제를 실시해도 된다.

본 발명에서 사용되는 상기 유효성분은, 그 작용발현에 있어서의 유효량의 투여를 생물에 대하여 실시해도 독성은 관찰되지 않는다. 예를 들어 경구투여의 경우, 신선초, 셀러리, 백합, 알로에 또는 쑥의 물 추출물을 1g/㎏ 체중으로 마우스에게 1회 투여하여도 사망예는 보이지 않는다. 또한, 상기 유효성분은, 래트에 대하여 1g/㎏ 체중을 경구 단회 투여해도 사망예는 관찰되지 않는다.

본 발명의 목적은, 천연물 유래로 안전하고, 간편하게 섭취 가능한, 식품소재, 의약품 소재로서 알맞은 골형성 촉진 작용 또는 골형성 단백질 생성 증강 작용을 갖는 조성물을 개발하여, 당해 조성물을 사용한, 의약, 식품, 음료 또는 사료를 제공하는 것에 있다.

본 발명을 개략적으로 설명하면, 본 발명의 제 1∼3 의 발명은, 하기 (a)∼(c) 로부터 선택되는 식물 유래 처리물을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 골형성 촉진 또는 골형성 단백질 생성 증강을 필요로 하는 질환의 치료제 또는 예방제, 골형성 촉진제 또는 BMP 생성 증강제, 골형성 촉진용 또는 BMP 생성 증강용의 식품, 음료 또는 사료에 관한 것이다.

(a) 미나리과 식물 유래 처리물

(b) 백합과 식물 유래 처리물

(c) 국화과 식물 유래 처리물

본 발명의 제 1∼3 의 발명에 있어서, 식물로서는 신선초, 셀러리, 백합, 알로에 또는 쑥이 바람직하게 사용된다.

본 발명의 제 4∼6 의 발명은 이하의 식 (A) 로 표시되는 화합물, 그 유도체 또는 그들의 염을 유효성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는 골형성 촉진 또는 BMP 생성 증강을 필요로 하는 질환의 치료제 또는 예방제, 골형성 촉진제 또는 BMP 생성 증강제, 골형성 촉진용 또는 BMP 생성 증강용의 식품, 음료 또는 사료에 관한 것이다.

본 발명의 제 7 발명은, 하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 BMP 생성 증강 작용의 측정방법에 관한 것이다.

(a) 피험물질과 접촉시킨 조건 하에서, HuO9 세포 또는 그 아주 (亞侏, substrain), 또는 이들 중 어느 하나의 세포주를 사용하여 얻어진 하이브리드머를 배양하는 공정, 및

(b) 공정 (a) 에서 얻어진 배양액 중의 BMP량을 피험물질의 BMP 생성 증강 작용의 지표로서 측정하는 공정

본 발명의 제 8 의 발명은, 하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

(a) 피험물질과 접촉시킨 조건 하에서, HuO9 세포 또는 그 아주, 또는 이들 중 어느 하나의 세포주를 사용하여 얻어진 하이브리드머를 배양하는 공정, 및

(b) 공정 (a) 에서 얻어진 배양액 중의 BMP량을 측정하는 공정, 여기서, 피험물질과 접촉시키지 않은 조건 하 또는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 대조물질과 접촉시킨 조건 하에서 상기 세포를 배양하였을 때와 비교하여, BMP량이 많은 경우, 피험물질이 BMP 생성 증강 작용을 갖는다고 판정한다.

본 발명의 제 9 의 발명은, 하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 물질의 제조방법에 관한 것이다.

(a) BMP 생성 증강 작용을 갖는 물질을 얻는 공정, 및

(b) 본 발명의 제 7 발명의 측정방법을 사용하여, 공정 (a) 에서 얻어진 물질의 BMP 생성 증강 작용을 측정하는 공정

또, 본 발명은, 하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 물질의 제조방법에 관한 것이다.

(b) 공정 (a) 에서 얻어진 배양액 중의 BMP량을 측정하는 공정, 여기서, 피험물질과 접촉시키지 않은 조건 하 또는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 대조물질과 접촉시킨 조건 하에서 상기 세포를 배양하였을 때와 비교하여, BMP량이 많은 경우, 피험물질이 BMP 생성 증강 작용을 갖는 것으로 판정하여, 그 피험물질을 BMP 생성 증강 작용을 갖는 물질로서 취득한다.

이하, 실시예를 들어, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 기재에 조금도 한정되는 것이 아니다. 또, 특별한 사정이 없는 한, 실시예에 있어서의 % 는 용량% 를 의미한다.

실시예 1 (E)-1-(5,6,7,8,8a,10a-헥사히드로-I,7-디히드록시-8,8,1Oa-트리메틸-9H-크산텐-4-yl)-3-(4-히드록시페닐)-2-프로펜-1-온 의 조제

(1) 신선초 (Angelica keiskei Koidz.) 뿌리부의 건조분말 5.8㎏ 에 24ℓ의 아세트산에틸을 첨가하여, 실온에서 교반 하, 3시간 추출하여, 흡인 여과 후, 아세트산에틸 추출액과 잔사로 나누었다. 아세트산에틸 추출액을 로터리증발기로 감압농축 후, 클로로포름에 용해하여, 전량을 실리카 겔 BW-300 SP (후지실리시아화학사 제조:750㎖) 에 흡착시켰다. 이어서, 헥산:클로로포름=2:5 (750㎖), 클로로포름 (1000㎖), 클로로포름:메탄올=10:1 (1100㎖) 을 순차로 사용하여 흡착물을 단계적으로 용출하였다.

(2) 실시예 1-(1) 에서 얻어진 클로로포름:메탄올=10:1 용출 분획을 농축건고 후, 클로로포름 30㎖ 에 용해하여, 그 중 반용 (半容) 을 실리카 겔 (BW-300 SP, 300㎖) 에 흡착시켰다. 이어서, 클로로포름 (1800㎖), 클로로포름:메탄올=500:7 (300㎖), 아세트산에틸 (300㎖) 을 순차로 사용하여 흡착물을 단계적으로 용출하였다.

(3) 실시예 1-(2) 에서 얻어진 아세트산에틸 용출 획분을 농축 건고 후, 클로로포름:메탄올=50:1 (20㎖) 에 용해하고, 실리카 겔 (BW-300 SP, 300㎖) 에 흡착시켰다. 계속해서, 클로로포름:메탄올=500:10 (1200㎖), 클로로포름:메탄올=500:13 (500㎖), 클로로포름:메탄올=500:19 (500㎖), 클로로포름:메탄올=500:22 (800㎖), 아세트산에틸 (500㎖) 을 순차로 사용하여 단계적으로 용출하여, 1 프랙션에 18㎖씩 분취하였다.

(4) 실시예1-(3) 에서 얻어진 실리카 크로마토 플렉션의 번호 115 로부터 155 를 모아 감압농축하고, 7㎖ 의 디메틸술폭시드에 용해하였다. 그 중 절반 용액을 역상 크로마토그래피를 사용하여 분획하였다. 수지는 코스모실14 O C18-OPN (나카라이테스크사 제조:수지량 50㎖) 을 사용하였다. 계속해서, 증류수 (40㎖), 20% 에탄올 수용액 (50㎖), 30% 에탄올 수용액 (50㎖), 50% 에탄올 수용액 (1회째 용출 50㎖, 그 후 2회째 용출 50㎖), 에탄올 (50㎖) 을 순차로 사용하여 용출하였다.

(5) 실시예 1-(4) 의 50% 에탄올 수용액 용출 분획 중 1회째 용출 부분 50㎖ 를 감압농축한 후, 3㎖ 의 50% 에탄올 수용액에 용해하여, 역상 크로마토그래피를 사용하여 분획하였다. 이하에 그 조건에 관해서 서술한다. 칼럼은 TSK gel ODS-80Ts (21.5㎜×30㎝:도소사 제조) 를 사용하였다. 용매로서 증류수와 아세토니트릴을 용량비 1 대 1 로 혼합한 것을 사용하고, 용출 속도는 5㎖/분, 검출은 215nm 에서 실시하였다. 용출액의 자외선 흡수를 지표로 역상 크로마토 프랙션 1∼5 를 채취하였다.

(6) 실시예 1-(5) 에서 얻은 역상크로마토 프랙션 2 (유지시간 24.1분의 검출의 피크를 포함하는 프랙션) 의 질량 스펙트럼 (MS) 을 질량분석계 (DX302 :일본전자사 제조) 에 의해 FAB-MS 의 수법으로 측정하였다. 매트릭스에는 m-니트로벤질알코올을 사용하였다. 그 결과, m/z 407 (M-H)^-의 피크를 검출하였다. 도 1 에 질량 스펙트럼을 나타낸다. 도 1 에서 가로축은 m/z치, 세로축은 상대강도를 나타낸다. 이어서, 역상 크로마토 프랙션 2 를 핵자기공명 (NMR) 스펙트럼 장치 (AVANCE600형: 브루카·바이오스핀사 제조) 를 사용하여, 각종 NMR 스펙트럼을 측정하여 구조 해석하였다. 이하에 NMR 의 귀속 신호를 나타낸다. 또, 피크의 귀속 번호는 이하의 식 (B) 와 같다.

다만, ¹H-NMR 에서 샘플은 중디메틸술폭시드에 용해하고, 중디메틸술폭시드 중의 잔류 프로톤의 화학 시프트치를 2.51ppm 으로 나타내었다. 도 2 에 ¹H-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 2 에서 가로축은 화학 시프트치, 세로축은 시그널의 강도를 나타낸다.

다만, ¹³C-NMR 에서 샘플은 중디메틸술폭시드에 용해하고, 중디메틸술폭시드의 화학 시프트치를 40.2ppm 으로 나타내었다. 도 3 에 ¹³C-NMR 스펙트럼을 나타낸다. 도 3 에서 가로축은 화학 시프트치, 세로축은 시그널의 강도를 나타낸다.

이상, 역상 크로마토 프랙션 2 에 관해서 실시한 질량 스펙트럼, NMR 스펙트럼 해석의 결과, 역상 크로마토 프랙션 2 가 (E)-1-(5,6,7,8,8a,10a-헥사히드로-1,7-디히드록시-8,8,10a-트리메틸-9H-크산텐-4-yl)-3-(4-히드록시페닐)-2-프로펜-1-온 (분자량 408, 이하 화합물 a) 인 것을 확정하였다.

실시예 2 화합물 a 에 의한 ST-2 세포의 골아세포에 대한 분화 유도 작용

(1) 마우스 간질계 세포주 ST-2 를 10% 소태아혈청 (바이오위태커사 제조) 를 포함하는 DMEM 배지 (바이오위태커사 제조) 에 3×10⁴세포/㎖ 가 되도록 현탁하고, 96웰 플레이트에 0.1㎖ 씩 뿌려 무균적으로 배양하였다. 2일간 배양 후, 새로운 배지로 바꿔 놓았다. 여기에 시료로서 실시예 1 에서 얻어진 신선초 뿌리 유래 화합물 a 를 첨가하여, 3일간 배양하였다. 계속해서, ST-2 세포의 골아세포로의 분화를 알칼리성 포스파타아제를 지표로 하여 측정하였다. 세포를 PBS 로 1회 세정하고, 반응기질액 (100mM 디에탄올아민 완충액 pH10.0, 2mM 염화마그네슘, 1mM p-니트로페닐인산) 100㎕ 을 첨가하여, 37℃ 에서 30분간 반응하였다. 다음에, 0.2N 의 수산화나트륨 100㎕ 을 첨가하여 반응을 정지하여, 유리한 p-니트로페놀량을 흡광도 405nm 로 측정하였다. 대조는 시료 무첨가로 하고, 대조 알칼리성 포스파타아제 활성을 100% 로 하여, 골아세포로의 분화유도활성을 나타내었다. 시료의 첨가량은 표 1 에 나타내는 바와 같이 하였다. 실험은 2벌로 실시하여, 그 평균치를 채용하였다. 그 결과, 화합물 a 가 농도의존적으로 골아세포로의 분화를 유도하는 것이 분명해졌다. 표 1 에 그 결과를 나타낸다.

화합물 a 에 의한 ST-2 세포의 골아세포로의 분화 유도 활성

첨가량 (μM)	알칼리성 포스타파제 활성 (%)
00.3130.6251.25	100219.4259.6358.3

실시예 3 화합물 a 에 의한 MC3T3-E1 세포의 골아세포로의 분화 유도 작용

마우스 골아세포주 MC3T3-E1 을 10% 소태아혈청을 포함하는 DMEM 배지에 3×10⁴세포/㎖ 가 되도록 현탁하고, 96 웰 플레이트에 0.1㎖ 씩 뿌려 무균적으로 배양하였다. 2일간 배양후, 새로운 배지로 바꿔 놓았다. 여기에 시료로서 실시예 1 에서 얻어진 신선초 뿌리 유래 화합물 a 를 첨가하여, 5일간 배양하였다. 계속해서, 실시예 2 와 같은 방법으로 골아세포로의 분화를 알칼리성 포스파타아제를 지표로서 측정하였다. 그 결과, 화합물 a 가 농도의존적으로 골아세포로의 분화를 유도하는 것이 밝혀졌다. 표 2 에 그 결과를 나타낸다.

화합물 a 에 의한 MC3T3-E1 세포의 골아세포로의 분화 유도 활성

첨가량 (μM)	알칼리성 포스타파제 활성 (%)
01.252.5	100171.0292.2

실시예 4 신선초의 BMP-2 생성 증강 작용

(1) 신선초 뿌리 건조물을 분쇄한 것 2g 에 대하여 40㎖ 의 물을 첨가하여, 교반 하, 60℃ 에서 30분간 추출하였다. 계속하여 원심분리하여 상청과 침전으로 나누었다. 침전에 대하여 동일한 추출조작을 2회 반복하였다. 얻어진 상청을 모아, 10㎖ 까지 농축하여, 신선초 뿌리 물 추출물을 조제하였다.

(2) 인간 골육종 세포주 HuO9 를 10% 소태아혈청을 포함하는 DMEM 배지에 1×10⁵세포/㎖ 가 되도록 현탁하고, 96 웰 플레이트에 0.1㎖ 씩 뿌려 무균적으로 배양하였다. 2일간 배양후, 새로운 배지로 바꿔 놓았다. 이것에 시료로서 실시예 4-(1) 에서 얻어진 신선초 뿌리 물 추출물을 첨가하여, 48시간 배양하였다. 다음에, 배양액 중의 골형성 단백질-2 (BMP-2) 의 농도를 효소 면역 분석법 (BMP-2 Immunoassay:GT사 제조) 으로 측정하였다. 대조는 시료 무첨가로 하고, 이 세포배양액 중의 BMP-2 농도 (세포의 BMP-2 생성량) 를 100% 로 하여, BMP-2 생성 증강 활성을 나타내었다. 시료의 첨가량은 표 3 에 나타내는 바와 같이 하였다. 실험은 2벌로 실시하여, 그 평균치를 채용하였다. 그 결과, 실시예 4-(1) 에서 얻어진 신선초 뿌리 물 추출물이 농도의존적으로 BMP-2 의 생성을 증강하는 것이 밝혀졌다. 표 3 에 그 결과를 나타낸다.

신선초 뿌리 물 추출물의 BMP-2 생성 증강 작용

첨가량 (%)	BMP-2 생성 증강 활성(%)
00.6251.252.5	100.0192.8277.7405.0

단, 대조의 BMP-2 생성량은 0.270ng/㎖ 이었다.

실시예 5 신선초의 골아세포로의 분화 유도 작용

마우스 배세포주 C3Hl0T1/2 를 10% 소태아혈청을 포함하는 DMEM 배지에 3×10⁴세포/㎖ 가 되도록 현탁하고, 96 웰 플레이트에 0.1㎖ 씩 뿌려 무균적으로 배양하였다. 3일간 배양후, 새로운 배지로 바꿔 놓았다. 여기에 시료로서 실시예 4-(1) 에서 얻어진 신선초 뿌리 물 추출물을 첨가하여, 6일간 배양하였다. 계속해서, 실시예 2 와 동일한 방법으로 골아세포로의 분화를 알칼리성 포스파타아제를 지표로서 측정하였다. 그 결과, 실시예 4-(1) 에서 얻어진 신선초 뿌리 물 추출물이 농도의존적으로 골아세포로의 분화를 유도하는 것이 밝혀졌다. 표 4 에 그 결과를 나타낸다.

신선초 뿌리 물 추출물의 골아세포로의 분화 유도 작용

첨가량 (%)	알칼리성 포스파타아제 활성(%)
00.0250.050.10.2	100.0137.1153.4159.4202.9

실시예 6 신선초 뿌리 물 추출물 유래 코스모실 분획물의 BMP-2 생성 증강 작용

(1) 신선초 뿌리부 건조물을 분쇄한 것 3㎏ 에 대하여 30ℓ의 물을 첨가하여, 교반 하, 60℃ 에서 60분간 추출하였다. 계속해서 원심분리하여 상청과 침전으로 나누었다. 침전에 대하여 20ℓ의 물을 첨가하여, 교반 하, 실온에서 60분간 추출하였다. 계속해서 원심분리하여 상청과 침전으로 나누었다. 상청을 합쳐 신선초 뿌리 물 추출액 451 을 조제하였다.

(2) 실시예 6-(1) 에서 얻어진 신선초 뿌리 물 추출액을 역상 크로마토그래피를 사용하여 분획하였다. 이하에 그 조건을 나타낸다. 수지는 코스모실 140 C18-OPN (수지량 700㎖) 을 사용하였다. 신선초 뿌리 유래 물 추출액 1.5ℓ를 제공하고, 전개용매로서 물 (2.1ℓ), 10% 에탄올 (2ℓ), 20% 에탄올 (2.3ℓ), 40% 에탄올 (2ℓ), 60% 에탄올 (3.5ℓ) 을 순차로 사용하여 용출하여 각 코스모실 분획물을 얻었다.

(3) 실시예 6-(2) 에서 얻어진 각 코스모실 분획물의 1/50량을 10㎖ 까지 농축하였다. 각 농축물의 BMP-2 생성 증강 활성을 실시예 4-(2) 와 같은 방법으로 측정하였다. 그 결과, 수용출 획분, 10% 에탄올 용출 획분, 20% 에탄올 용출 획분에 BMP-2 생성 증강 활성이 있는 것이 밝혀졌다. 표 5 에 그 결과를 나타낸다.

획분	시료 농도(%)	BMP-2 생성 증강 활성 (%)
	0	100
수용출 획분	1.252.5510	438.5753.710791064
10% 에탄올 용출 획분	1.252.5510	198.2283.5394.6637.5
20% 에탄올 용출 획분	1.252.5510	180.1167.2244.7376.5

단, 대조의 BMP-2 생산량은 0.126ng/㎖ 이었다.

실시예 7 신선초 뿌리 물 추출물 유래 실리카 칼럼 분획물의 BMP-2 생성 증강 작용

(1) 실시예 6-(1) 에서 얻어진 신선초 뿌리 물 추출액 중 411 을 191 로 까지 농축하여, 신선초 뿌리 물 추출 농축액을 조제하였다.

(2) 실시예 7-(1) 에서 얻어진 신선초 뿌리 물 추출 농축액 300㎖ 에 200㎖ 의 에탄올을 첨가하여, 실온에서 1시간 정치 후, 원심분리하여 상청과 침전으로 나누었다. 침전에 증류수 300㎖ 를 첨가한 것에 대하여, 동일한 조작을 반복하였다. 얻어진 상청을 합쳐, 농축건고한 후, 증류수 108㎖ 에 용해하여 신선초 뿌리 물 추출물 유래 에탄올 침전처리물을 조제하였다.

(3) 실시예 7-(2) 에서 얻어진 신선초 뿌리 물 추출물 유래 에탄올 침전 처리물을 실리카 크로마토그래피를 사용하여 분획하였다. 이하에 그 조건을 나타낸다. 신선초 뿌리 물 추출물 유래 에탄올 침전 처리물 25㎖ 를 농축건고 후, 클로로포름과 에탄올을 용량비 6 대 3 으로 혼합한 것에 용해하여, 실리카 겔 BW-300 SP (수지량 300㎖) 에 흡착시켰다. 이어서, 클로로포름:에탄올=6:3(600㎖), 클로로포름:에탄올:물=30:15:1(900㎖), 클로로포름:에탄올:물=12:8:1(500㎖), 에탄올:물=10:1(600㎖), 에탄올:물=20:3(200㎖), 에탄올:물=4:1(250㎖), 에탄올:물=1:1 (300㎖) 를 순차로 사용하여 흡착물을 단계적으로 용출하였다.

클로로포름:에탄올:물=12:8:1 의 후반 용출 부분 (200㎖) 과 에탄올:물=10:1의 전반 용출부분 (200㎖) 을 모아, 실리카 칼럼 용출 분획 1 을 얻었다. 에탄올:물=10:1 의 후반 용출 부분 (400㎖) 과 에탄올:물=20:3 용출 부분, 에탄올:물=4:1 용출 부분을 모아, 실리카 칼럼 용출 분획 2 를 얻었다. 에탄올:물=1:1 용출 부분을 실리카 칼럼 용출 분획 3 으로서 얻었다.

(4) 실시예 7-(3) 에서 얻어진 각 실리카 칼럼 분획물의 1/5량을 1.25㎖ 까지 농축하였다. 각 농축물의 BMP-2 생성 증강 활성을 실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과, 표 6 에 나타내는 분획에 BMP-2 생성 증강 활성이 있는 것이 밝혀졌다.

획분(용출 용매 조성)	시료 농도(%)	BMP-2 생성 증강 활성 (%)
	0	100
획분 1(클로로포름:에탄올:물=12:8:1, 에탄올:물=10:1)	0.6251.252.5	152.2185.1307.5
획분 2(에탄올:물=10:1, 20:3, 4:1)	0.6251.252.55	191.0310.4492.5558.2
획분 3(에탄올:물=1:1)	0.6251.252.55	244.8420.9671.6803.0

단, 대조의 BMP-2 생산량은 0.096ng/㎖ 이었다.

실시예 8 셀러리잎부 물 추출물의 BMP-2 생성 증강 작용

(1) 셀러리 잎부 건조물을 분쇄한 것 2g 에 대하여 40㎖ 의 물을 첨가하여, 교반 하, 60℃ 에서 30분간 추출하였다. 계속해서 원심분리하여 상청과 침전으로 나누었다. 침전에 대하여 같은 추출조작을 2회 반복하였다. 얻어진 상청을 합쳐, 10㎖ 까지 농축하여, 셀러리 잎부 물 추출물을 조제하였다.

(2) 실시예 8-(1) 에서 조제한 셀러리 잎부 물 추출물의 BMP-2 생성 증강 활성을 실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과, 셀러리 잎부 물 추출물에 BMP-2 생성 증강 활성이 있는 것이 밝혀졌다.

셀러리 잎부 물 추출물의 BMP-2 생성 증강 작용

첨가량(%)	BMP-2 생성 증강 활성 (%)
02.55.0	100171.8527.0

단 대조의 BMP-2 의 생산량은 0.119ng/㎖ 이었다.

실시예 9 알로에 물 추출물의 BMP-2 생성 증강 작용

(1) 알로에 건조물을 분쇄한 것 2g 에 대하여 40㎖ 의 물을 첨가하여, 교반하, 60℃ 에서 30분간 추출하였다. 계속해서 원심분리하여 상청과 침전으로 나누었다. 침전에 대하여 같은 추출조작을 2회 반복하였다. 얻어진 상청을 합쳐, 10㎖ 까지 농축하여, 알로에 물 추출물을 조제하였다.

(2) 실시예 9-(1) 에서 조제한 알로에 물 추출물의 BMP-2 생성 증강 활성을 실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과, 알로에 물 추출물에 BMP-2 생성 증강 활성이 있는 것이 밝혀졌다.

알로에 물 추출물의 BMP-2 생성 증강 작용

첨가량(%)	BMP-2 생성 증강 활성 (%)
05.0	100238.5

단 대조의 BMP-2 의 생산량은 0.274ng/㎖ 이었다.

실시예 10 쑥 물 추출물의 BMP-2 생성 증강 작용

(1) 쑥 건조물을 분쇄한 것 2g 에 대하여 40㎖ 의 물을 첨가하여, 교반하, 60℃ 에서 30분간 추출하였다. 계속해서 원심분리하여 상청과 침전으로 나누었다. 침전에 대하여 같은 추출조작을 2회 반복하였다. 얻어진 상청을 합쳐, 10㎖ 까지 농축하여, 쑥 물 추출물을 조제하였다.

(2) 실시예 10-(1) 에서 조제한 쑥 물 추출물의 BMP-2 생성 증강 활성을 실시예 4-(2) 와 동일한 방법으로 측정하였다. 그 결과, 쑥 물 추출물에 BMP-2 생성 증강 활성이 있는 것이 밝혀졌다.

알로에 물 추출물의 BMP-2 생성 증강 작용

첨가량(%)	BMP-2 생성 증강 활성 (%)
00.250.5	100383.4461.5

단 대조의 BMP-2 의 생산량은 0.119ng/㎖ 이었다.

실시예 11 알로에 물 추출물의 골아세포로의 분화 유도 작용

실시예 9-(1) 에서 조제한 알로에 물 추출물의 골아세포로의 분화 유도 작용을 실시예 5 와 같은 방법으로 측정하였다. 그 결과, 실시예 9-(1) 에서 얻어진 알로에 물 추출물이 농도의존적으로 골아세포로의 분화를 유도하는 것을 알 수 있었다. 표 10 에 그 결과를 나타낸다.

알로에 물 추출물의 골아세포로의 분화 유도 작용

첨가량(%)	알칼리성 포스파타아제 활성 (%)
00.1250.250.512	100118.3125.4131.7184.6249.6

실시예 12 백합꽃 물 추출물의 골아세포로의 분화 유도 작용

(1) 백합꽃부 건조물을 분쇄한 것 2g 에 대하여 40㎖ 의 물을 첨가하여, 교반 하, 60℃ 에서 30분간 추출하였다. 다음에, 원심분리하여 상청과 침전으로 나누었다. 침전에 대하여 같은 추출조작을 2회 반복하였다. 얻어진 상청을 합쳐, 10㎖ 까지 농축하여, 백합꽃 물 추출물을 조제하였다.

(2) 실시예 12-(1) 에서 조제한 백합꽃 물 추출물의 골아세포로의 분화 유도 작용을 실시예 5 와 같은 방법으로 측정하였다. 그 결과, 실시예 12-(1) 에서 얻어진 백합꽃 물 추출물이 농도의존적으로 골아세포로의 분화를 유도하는 것을 수 있었다. 표 11 에 그 결과를 나타낸다.

알로에 물 추출물의 골아세포로의 분화 유도 작용

첨가량(%)	알칼리성 포스파타아제 활성 (%)
00.0130.0250.050.10.2	10097.9137.5175.7280.8290.4

실시예 13 신선초 뿌리 물 추출물과 재조합 인간 BMP-2의 골아세포로의 분화 유도 작용의 상승효과

마우스 배세포주 C3 Hl0T1/2 를 10% 소태아혈청을 포함하는 DMEM 배지에 3×10⁴세포/㎖ 로 되도록 현탁하고, 96웰 플레이트에 0.1㎖ 씩 뿌려 무균적으로 배양하였다. 4일간 배양후, 새로운 배지로 바꿔 놓았다. 이것에 시료로서 실시예 4-(1) 에서 얻어진 신선초 뿌리 물 추출물 및 재조합 인간 BMP-2 (GT사 제조) 를 첨가하여 11일간 배양하였다. 계속해서, 실시예 5 와 같은 방법으로 골아세포로의 분화를 알칼리성 포스파타아제 활성을 지표로 하여 측정하였다. 그 결과, 재조합 인간 BMP-2 는 농도의존적으로 골아세포로의 분화를 유도하였지만, 신선초뿌리 물 추출물을 병용함으로써 골아세포로의 분화 유도 작용이 증강되는 것이 밝혀졌다. 표 12 에 그 결과를 나타낸다.

신선초 뿌리 물 추출물과 인간 BMP-2 의 골아세포로의 분화 유도 작용

재조합 인간 BMP-2(ng/㎖)	신선초 뿌리 물 추출물(%)	알칼리성 포스파타아제 활성(%)
0050050010001000	00.0500.0500.05	100.0190.5379.6745.6687.11404.1

실시예 14 신선초 뿌리 물 추출물에 의한 간엽계 줄기세포의 골아세포로의 분화 유도 작용

인간 간엽계 줄기세포 (타카라바이오사 제조) 를 10% 소태아혈청을 포함하는 DMEM 배지 (타카라바이오사 제조) 에 1.2×10⁴세포/㎖ 가 되도록 현탁하여, 48웰 플레이트에 0.5㎖ 씩 뿌려 무균적으로 배양하였다. 5일간 배양후, 5mM β-글리셀로인산, 100nM 덱사메타존을 함유하는 새로운 배지로 바꿔 놓았다. 이것에 시료로서 실시예 4-(1) 에서 얻어진 신선초 뿌리 물 추출물을 첨가하여 배양하였다. 배지는 3, 4일 마다 교환하였다. 인간 간엽계 줄기세포의 골아세포로의 분화는 알칼리성 포스파타아제 활성 및 세포에 대한 칼슘의 축적을 지표로 하였다. 알칼리성 포스파타아제 활성은 실시예 2 와 같은 방법으로 측정하여, 1 웰 당 1분간에 유리되는 p-니트로페놀량으로서 나타내었다. 세포에 축적된 칼슘량은 PBS 세정한 세포에 6N 염산을 첨가하여, 초음파 파쇄한 용액에 관해서, 칼슘 정량 키트 (칼슘 E-테스트와코; 와코쥰야쿠공업사 제조) 를 사용하여 측정하였다.

그 결과, 신선초 뿌리 물 추출물은 인간 간엽계 줄기세포의 골아세포로의 분화에 따르는 알칼리성 포스파타아제 활성 및 골아세포의 성숙에 따르는 칼슘의 축적을 경시적으로 강하게 촉진시켰다. 표 13 에 알칼리성 포스파타아제 활성을, 표 14 에 세포에 대한 칼슘축적의 측정결과를 나타낸다.

신선초 뿌리 물 추출물(%)	세포의 알칼리성 포스파타아제 활성(P㏖ p-니트로페놀/분/웰)
	배양시간 (일)
	0	7	14	21
00.1	50.550.5	786.52277.7	2490.25022.9	3656.04724.1

신선초 뿌리 물 추출물(%)	세포에 대한 칼슘의 축적(㎍ 칼슘/웰)
	배양시간 (일)
	0	14	21	28
00.1	0.9100.910	2.1402.575	2.2884.832	3.19258.127

본 발명에 의해, 미나리과, 백합과 또는 국화과 식물 유래 처리물을 함유하는 골형성 촉진 또는 BMP 생성 증강을 필요로 하는 질환의 치료용 또는 예방용의 의약, 골형성 촉진제, BMP 생성 증강제, 식품, 음료 또는 사료가 제공된다. 그 의약은 골다공증이나 골절 등의 골에 관련되는 질환의 치료제 또는 예방제로서 유용하다. 또한, 골, 형성 촉진제 및 BMP 생성 증강제는, 골절치료나 이의 치료에 사용되는 임플란트나 치약으로서 사용할 수 있다. 또한, 당해 제 (劑) 는 골의 기능연구, BMP 생성 증강제의 스크리닝에도 유용하다. 또한, 그 식품 또는 음료는, 일상의 음식품으로서 섭취함으로써, 골형성 촉진 또는 BMP 생성 증강을 필요로 하는 질환의 증상개선 등이 가능해진다. 또한, 그 사료도 동물에게 섭취시킴으로써 같은 효과를 기대할 수 있다.

Claims

하기 (a)∼(c) 로부터 선택되는 식물 유래 처리물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 골형성 촉진 또는 골형성 단백질 생성 증강을 필요로 하는 질환의 치료제 또는 예방제.

(a) 미나리과 식물 유래 처리물

(b) 백합과 식물 유래 처리물

(c) 국화과 식물 유래 처리물
제 1 항에 있어서, 식물이 신선초, 셀러리, 백합, 알로에 또는 쑥인 치료제 또는 예방제.
하기 (a)∼(c) 로부터 선택되는 식물 유래 처리물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 골형성 촉진제 또는 골형성 단백질 생성 증강제.

(a) 미나리과 식물 유래 처리물

(b) 백합과 식물 유래 처리물

(c) 국화과 식물 유래 처리물
제 3 항에 있어서, 식물이 신선초, 셀러리, 백합, 알로에 또는 쑥인 골형성 촉진제 또는 골형성 단백질 생성 증강제.
하기 (a)∼(c) 로부터 선택되는 식물 유래 처리물을 함유하는 것을 특징으로 하는 골형성 촉진용 또는 골형성 단백질 생성 증강용의 식품, 음료 또는 사료.

(a) 미나리과 식물 유래 처리물

(b) 백합과 식물 유래 처리물

(c) 국화과 식물 유래 처리물
제 5 항에 있어서, 식물이 신선초, 셀러리, 백합, 알로에 또는 쑥인 식품, 음료 또는 사료.
이하의 식 (A) 로 표시되는 화합물, 그 유도체 또는 그들 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 골형성 촉진 또는 골형성 단백질 생성 증강을 필요로 하는 질환의 치료제 또는 예방제.
제 7 항에 기재된 식 (A) 로 표시되는 화합물, 그 유도체 또는 그들 염을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 골형성 촉진제 또는 골형성 단백질 생성 증강제.
제 7 항에 기재된 식 (A) 로 표시되는 화합물, 그 유도체 또는 그들 염을 함유하는 것을 특징으로 하는 골형성 촉진용 또는 골형성 단백질 생성 증강용의 식품, 음료 또는 사료.
하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 골형성 단백질 생성 증강작용의 측정방법.

(a) 피험물질과 접촉시킨 조건 하에서, HuO9 세포 또는 그 아주, 또는 이들 중 어느 하나의 세포주를 사용하여 얻어진 하이브리드머를 배양하는 공정, 및

(b) 공정 (a) 에서 얻어진 배양액 중의 BMP량을 피험물질의 BMP 생성 증강 작용의 지표로서 측정하는 공정
하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 골형성 단백질 생성 증강작용을 갖는 물질의 스크리닝 방법.

(a) 피험물질과 접촉시킨 조건 하에서, HuO9 세포 또는 그 아주(亞侏, substrain), 또는 이들 중 어느 하나의 세포주를 사용하여 얻어진 하이브리드머를 배양하는 공정, 및

(b) 공정 (a) 에서 얻어진 배양액 중의 BMP량을 측정하는 공정, 여기서, 피험물질과 접촉시키지 않은 조건 하 또는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 대조물질과 접촉시킨 조건 하에서 상기세포를 배양하였을 때와 비교하여, BMP량이 많은 경우, 피험물질이 BMP 생성 증강 작용을 갖는다고 판정한다
하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 골형성 단백질 생성 증강작용을 갖는 물질의 제조방법.

(a) 골형성 단백질 생성 증강작용을 갖는 물질을 얻는 공정, 및

(b) 청구항 10 기재의 측정방법을 사용하여, 공정 (a) 에서 얻어진 물질의 골형성 단백질 생성 증강작용을 측정하는 공정.
하기 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 골형성 단백질 생성 증강작용을 갖는 물질의 제조방법.

(a) 피험물질과 접촉시킨 조건 하에서, HuO9 세포 또는 그 아주, 또는 이들 중 어느 하나의 세포주를 사용하여 얻어진 하이브리드머를 배양하는 공정, 및

(b) 공정 (a) 에서 얻어진 배양액 중의 BMP량을 측정하는 공정, 여기서, 피험물질과 접촉시키지 않은 조건 하 또는 BMP 생성 증강 작용을 갖는 대조물질과 접촉시킨 조건 하에서 상기 세포를 배양하였을 때와 비교하여, BMP량이 많은 경우, 피험물질이 BMP 생성 증강 작용을 갖는다고 판정하여, 그 피험물질을 BMP 생성 증강 작용을 갖는 물질로서 취득한다