KR20040083584A

KR20040083584A - 세리신의 제조방법 및 이를 이용한 마스크 팩

Info

Publication number: KR20040083584A
Application number: KR1020030018086A
Authority: KR
Inventors: 김정호
Original assignee: 김정호
Priority date: 2003-03-24
Filing date: 2003-03-24
Publication date: 2004-10-06
Also published as: KR100494229B1

Abstract

본 발명은 피부에 대한 자극이 없으며 보습력이 우수한 화장품 조성물을 제공하기 위하여 실크를 고온 고압 정련하여 얻은 액을 수용성과 난용성으로 분리하여 수용성은 저분자와 고분자 세리신으로 나누어 채취하고, 난용성 세리신은 단백질 분해 효소를 이용하여 효소 가수분해하여 수용성 세리신으로 채취하는 방법과 상기에서 얻어진 각각의 세리신을 첨가한 마스크팩에 관한 것으로서 본 발명의 화장품 조성물은 피부 수분 보유 능력 및 피부 수분 증발 억제 효과가 뛰어나고, 주름제거와 노화 방지 등의 효과를 나타낸다.

Description

세리신의 제조방법 및 이를 이용한 마스크 팩 {manufacturing process of sericin and sericin mask pack}

본 발명은 세리신 분말의 제조방법과 이를 이용한 세리신 팩에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 피부에 대한 자극이 없으며 흡습성, 방습성 등이 우수한 세리신을 추출하고, 이를 이용하여 마스크 팩 등에 처리함으로써 보습 효과와 노화방지 효과가 우수한 화장품 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 실크는 섬유의 내·외층의 배향정도와 아미노산 구성 물질의 함량과 분자량 및 결정성이 달라 크게 2종류의 단백질로 분류할 수 있다. 그 비율은 대략 25:75로서 세리신과 피브로인으로 규정하고 있으며, 세리신은 용해성이 높아 일반적으로 정련 공정에서 제거되어 피브로인만 남게 되는데 이를 일반적으로 명주라 하여 주로 의류용으로 사용한다. 그렇기 때문에 세리신은 정련과정 이후에는 폐수로 버려지게된다.

이 세리신이라는 물질은 생사 상태에서 외층으로부터 내층으로 갈수록 아미노산 함량이나 용해성 정도가 달라지는데 이러한 특징들로 인하여 여러 학자들에 의해 세리신의 종류를 구분하기도 한다.

Watanabe(1959)는 세리신의 용해도에 따라 세리신을 A, B로 나누고, Komatsu(1966)는 세리신을 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ으로 나누어 중량비를 4:4:2라고 하였으나, 최근에는 4단계로 구분하여 외층으로부터 세리신 Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ라 하고 여러 특징들에 의해 세리신 Ⅰ, Ⅱ는 이용성 세리신이라 하고, 세리신 Ⅱ의 일부와 Ⅲ, Ⅳ는 난용성으로 구분하기도하나, 그 근본적인 특징은 내층으로 갈수록 용해성이 낮다는 것이다.

세리신 Ⅰ, Ⅱ에는 친수성 아미노산기가 많고, 누에의 토사 시에 가장 외층에 위치하여 수분증발이 가장 빠른 위치에 있으므로 기공의 생성이 많아 분자간 수소결합과 같은 결합력이 떨어져 비결정성을 이루기 쉽다. 내부로 갈수록 외부에 비해 친수성 아미노산 함량이 낮으며 피브로인의 성질과 가까워지게 된다. 세리신 Ⅳ 부분과 피브로인 사이에는 약간의 wax층이 존재하고 있어 피브로인을 보호하고 있으며 이것을 경계로 세리신과 피브로인을 구분하기도 한다.

현재 피브로인을 포함한 실크를 분말화하기 위해 가장 많이 사용되고 있는 방법은 산을 이용하여 가수분해하여 중화한 후 탈염하여 건조하는 방식이 주류를 이루며, 알칼리 가수분해의 경우 인체에 유해한 lysinoalanine의 생성 및 일부 아미노산의 파괴로 인하여 그 유해성에 대한 검정의 실험이 되고 있는 상태이며, 고온고압법은 특별한 약제가 필요 없고 장치만 있으면 가능하므로 효율적이나 난용성 세리신의 경우 용해하기가 어렵다. 그러나 이러한 가수분해법의 가장 큰 특징은 실크에 대해 무작위로 가수분해가 일어나기 때문에 분자량을 제어하기가 힘들다는 것이다.

그래서 최근 많이 연구되고 있는, 인체 무해용 효소를 이용하여 수용화하는 효소 가수분해법이 분자량 제어에는 효과가 큰 것으로 보고(특허, 1998-081941; 특허, 1999-0074787; 특허, 1999-0086233)되고 있다. 효소의 일반적인 특징은 기질의 특정 부분만을 절단하므로 특정 말단을 갖거나, 조건을 잘 조절하게되면 일정한 분자량을 가진 수용해물을 얻을 수 있다. 이렇게 분자량을 조절하게 되면 분자량과 특정 말단기에 따른 기능성으로 인해 용도가 다양해질 수 있는 장점이 있다.

실크는 일반적으로 누에가 만든 고치를 풀어 합사하여 정련 후 제직 및 염색가공하여 의류로 사용하게 되는데, 앞에서 설명한 여러 특성들로 인해 섬유로는 불필요한 실의 외층부인 세리신을 정련과정에서 제거하게된다. 이때 버려지는 액 중 세리신은 천연 단백질로 이루어져 있기 때문에 이를 수거하면 여러 용도로 사용할 수 있게된다.

기존에는 세리신을 사용하기 위해 실크를 알칼리 정련(특2001-0038120)하거나 고온고압처리(특2000-0056836) 하거나 효소처리(특1999-0086233)하는 방법으로 하여 그 상태에서 세리신을 추출하여 이를 분말화 하거나 액상으로 각종 화장료와 기능성 식품 및 의약용으로 사용하려 하고있다.

일반적으로 주로 쓰이고 있는 실크의 알칼리 정련방법으로는 비누정련 또는 비누소다 등의 알칼리수에서 적당한 온도를 가하여 일정시간 처리하여 정련하게된다. 이렇게 세리신을 제거한 피브로인을 섬유로 사용하고 나머지 액은 폐수로 버리게된다. 이때 폐수로부터 세리신을 추출하기 위해서는 세리신과 비누 및 다른 투여한 물질들을 분리하기 위하여 상당한 기술과 노력이 필요하고 경제적으로도 그 효율이 낮은 편이어서 일반적으로 행해지고 있는 실크의 알칼리 정련방법으로는 순수한 세리신을 회수하기 어렵다.

이외에 고온고압법과 효소를 이용한 정련방법으로 정련을 할 경우 세리신을 수거하기에는 비누정련에 비해 훨씬 간단하고 쉬워진다.

그러나 종래의 방법은 실크를 고온고압법으로만 처리하여 세리신을 얻게되면 분자량 조절이 어렵고 난용성 세리신을 용해하기 어려워 수용성 세리신 수거율이 낮고, 효소 가수분해법으로만 처리하게되면 피브로인도 단백질로 이루어져 있어 피브로인에도 영향을 미쳐 남은 피브로인을 섬유로 사용할 경우 지장을 줄 수도 있는 문제점이 있었다.

종래의 상기와 같은 문제점들을 해결하기 위해서는 정련 후 피브로인과 세리신 모두를 사용하고 세리신의 분자량을 조절하여 용도에 맞게 사용하는 것뿐만 아니라 수용성 세리신의 수거율도 높일 수 있는 실용적이면서도 간단한 새로운 방법 및 기술이 요구된다.

따라서 본 발명에서는 고치나 생사를 효소나 약품처리 없이 순수한 물만으로 고온고압 처리하여 얻은 피브로인을 섬유로 그대로 사용하고, 남은 세리신 액은 여과막을 이용하여 수용성과 난용성 세리신으로 구분하여 아미노산 조성이 다른 물질로 취급하고, 수용성 세리신은 저분자와 고분자로 나누고, 난용성 세리신은 효소 가수분해하여 수용성 세리신화 하게되면 분자량과 아미노산 조성이 다른 다양한 수용성 세리신을 얻을 수 있고, 또한 수용성 세리신과 난용성 세리신 모두를 이용하기 때문에 세리신의 수거율에 있어서도 기존의 방법보다 높일 수 있을 뿐만 아니라 특히 수용성과 난용성을 분리하여 사용하기 때문에 기존의 세리신과는 다른 다양한 특성들도 기대할 수 있다.

도 1은 본 발명의 수용성 세리신 분말과 세리신 마스크 팩 제조과정을 나타낸 흐름도이다.

도 2는 본 발명의 난용성 세리신을 효소로 가수분해 시 용해도에 대한 pH의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 3은 본 발명의 난용성 세리신을 효소로 가수분해 시 용해도에 대한 처리 온도의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명의 난용성 세리신을 효소로 가수분해 시 용해도에 대한 처리시간의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 5는 본 발명의 난용성 세리신을 효소로 가수분해 시 용해도에 대한 효소 농도의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 본 발명의 난용성 세리신을 kojizyme으로 가수분해 시 용해도에 대한 처리시간과 효소 농도의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 본 발명의 난용성 세리신을 flavourzyme으로 가수분해 시 용해도에 대한 처리시간과 효소 농도의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 본 발명의 난용성 세리신을 protamex로 가수분해 시 용해도에 대한 처리시간과 효소 농도의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 9는 본 발명의 난용성 세리신을 alcalase로 가수분해 시 용해도에 대한 처리시간과 효소 농도의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 10은 본 발명의 난용성 세리신을 kojizyme으로 가수분해 시 수용성 세리신의 흡광도에 대한 처리시간과 효소 농도의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 11은 본 발명의 난용성 세리신을 flavourzyme으로 가수분해 시 수용성 세리신의 흡광도에 대한 처리시간과 효소 농도의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 12는 본 발명의 난용성 세리신을 protamex로 가수분해 시 수용성 세리신의 흡광도에 대한 처리시간과 효소 농도의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 13은 본 발명의 난용성 세리신을 alcalase로 가수분해 시 수용성 세리신의 흡광도에 대한 처리시간과 효소 농도의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 14는 본 발명의 난용성 세리신을 kojizyme으로 가수분해 시 수용성 세리신의 평균중합도에 대한 처리시간과 효소 농도의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 15는 본 발명의 난용성 세리신을 flavourzyme으로 가수분해 시 수용성 세리신의 평균중합도에 대한 처리시간과 효소 농도의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 16은 본 발병의 난용성 세리신을 protamex로 가수분해 시 수용성 세리신의 평균중합도에 대한 처리시간과 효소 농도의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 17은 본 발명의 난용성 세리신을 alcalase로 가수분해 시 수용성 세리신의 평균중합도에 대한 처리시간과 효소 농도의 효과를 나타낸 그래프이다.

도 18은 본 발명의 정련에 의해 얻은 저분자 수용성 세리신의 분자량 분포를 나타낸 그래프이다.

도 19는 본 발명의 정련에 의해 얻은 고분자 수용성 세리신의 분자량 분포를 나타낸 그래프이다.

도 20은 본 발명의 kojizyme으로 가수 분해 된 수용성 세리신의 분자량 분포를 나타낸 그래프이다.

도 21은 본 발명의 protease로 가수 분해 된 수용성 세리신의 분자량 분포를 나타낸 그래프이다.

도 22는 본 발명의 alcalase로 가수 분해 된 수용성 세리신의 분자량 분포를 나타낸 그래프이다.

도 23은 본 발명의 전자공여능에 대한 처리 농도에 따른 효과(30분 처리)를 나타낸 그래프이다.

도 24는 본 발명의 전자공여능에 대한 처리 농도에 따른 효과(24시간 처리)를 나타낸 그래프이다.

도 25는 본 발명의 각 세리신 분말의 백도를 나타낸 그래프이다.

도 26은 본 발명의 각 세리신 용액의 황도를 나타낸 그래프이다.

도 27은 본 발명의 Low가 처리된 마스크 팩으로 얼굴 피부의 팩 처리에 따른 피부표면 사진으로 a는 팩 처리 전 b는 팩 처리 후를 나타낸 사진이다.

도 28은 본 발명의 High가 처리된 마스크 팩으로 얼굴 피부의 팩 처리에 따른 피부표면 사진으로 a는 팩 처리 전 b는 팩 처리 후를 나타낸 사진이다.

도 29는 본 발명의 PK가 처리된 마스크 팩으로 얼굴 피부의 팩 처리에 따른 피부표면 사진으로 a는 팩 처리 전 b는 팩 처리 후를 나타낸 사진이다.

도 30은 본 발명의 PP가 처리된 마스크 팩으로 얼굴 피부의 팩 처리에 따른 피부표면 사진으로 a는 팩 처리 전 b는 팩 처리 후를 나타낸 사진이다.

도 31은 본 발명의 PA가 처리된 마스크 팩으로 얼굴 피부의 팩 처리에 따른 피부표면 사진으로 a는 팩 처리 전 b는 팩 처리 후를 나타낸 사진이다.

본 발명은 종래와 같은 문제점을 해결하고 기능을 확인하기 위하여 각 단계별로 실험 및 측정을 다음과 같이 행하였다.

1. 고온 고압 정련에 의한 수용성 세리신과 난용성 세리신 추출 방법

세리신을 추출하기 위한 고온고압처리는 고온고압 장치에 고치 및 생사를 넣고 고치 및 생사의 중량대비 10∼50배의 물을 가하여 밀폐 후 100℃∼140℃에서 30분∼90분 동안 처리하는 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 정제된 절각견을 130℃에서 욕비 1:20으로 하여 1시간동안 고온 고압 처리하여 정련하는 것으로, 본 발명에서도 이와 같은 조건으로 정련하였다. 정련 액을 한외여과막 장치(U/F & N/F system, 액트라)에서 투과 분자량 크기 20,000인 여과막을 사용하여, 1/2을 농축하여 투과된 용액과, 농축액에 처음 양과 같게 증류수를 첨가하여 1/2로 농축하는 것을 2회 반복하여 투과된 용액을 합하여 수용성 저분자 수용액을 얻었다. 투과 분자량 크기 200,000인 여과막을 사용하여 남은 농축액에 처음 양과 같게 증류수를 첨가하여 1/2로 농축하는 것을 3회 반복하여 투과된 수용성 고분자 수용액을 얻었다. 이 후 남은 농축액은 여과지(Whatman, 5C)로 여과하였다. 여과 후 잔류물은 증류수를 첨가하여 재 여과하고, 같은 방법으로 5반복 여과 후 수용성 세리신을 제거하였다. 이 때 공정상 수용성과 난용성 세리신을 먼저 분리하고 수용성 세리신을 저분자와 고분자로 분리하는 방법도 있다.

잔류물인 난용성 세리신을 수거하여 건조시킨 후 가수분해시의 시료로 사용하였다. 정련 후 얻은 수용성 수용액 2종류와 가수분해 후 얻어진 수용액은 동결건조하여, 이를 데시케이트(desiccator)에 보관 후 필요시에 사용하였다.

2. 난용성 세리신의 효소 가수분해에 의한 수용성 세리신 제조

효소는 일반적으로 특정 기질의 특정 반응만을 촉진하는 기질특이성을 가지고 있으며, 효소의 작용에 영향을 미치는 인자는 크게 온도와 pH로 나눌 수 있다. 효소의 작용은 다른 화학반응과 같이 온도의 상승과 더불어 반응속도가 증대되나, 효소는 그 소재가 단백질이기 때문에 변성이 시작되는 온도를 경과하면 반응 속도는 급격히 저하하며 마침내는 응고하여 활성을 잃게 된다. 이 때 최대 반응속도를 가질 때의 온도를 최적온도라고 한다. 그리고 효소는 단백질이므로 그의 성질은 pH에 따라 영향을 받는다. 극단적인 산성 또는 알칼리성이 되면 변성하여 그 활성을 완전히 상실한다. 대부분의 효소는 일정한 pH에서만 활성을 가지며, 효소활성이 가장 좋은 때의 pH를 최적 pH라 한다.

본 발명에서는 FAO의 식품 첨가물용 효소규격에 적합한 제품을 사용하여 난용성 세리신의 효소 가수분해 시 최적의 가수분해 조건을 알아보기 위하여 다음과 같은 실험을 하였다.

난용성 세리신을 여러 가지 조건에서 아래와 같이 효소 가수분해 후 85℃에서 5분간 처리하여 효소의 활성을 없앤 다음 원심분리기(Beckman, J2-21)로 10,000rpm에서 20분간 원심분리 하였다. 상등액을 취하여 20배 희석한 후 분광광도계(UV,VIS-spectrophotometer, Beckman, DU 650)로 세리신의 최대흡수파장에서 측정한 흡광도 값을 용해도의 척도로 하였다.

가수분해에 사용한 효소의 종류는 다음과 같다.

Alcalase 0.6L (Novo Nordisk, batch no:PMN 00092, Denmark)

Flavourzyme 500 MG (Novo Nordisk, batch no:HP2 02013, Denmark)

Kojizyme 50C MG (Novo Nordisk, batch no:HP2 02011, Denmark)

Protamex (Novo Nordisk, batch no:PW2 A0010, Denmark)

1). pH 변화에 따른 용해도

pH는 1 mol 아세트산과 1 mol 암모니아수를 이용하여 buffer를 만들어 실험중 pH 변화를 최소화하였다. 0.5g의 난용성 세리신 분말을 욕비 1:50, 효소의 양은 분말의 10%, 온도는 50℃, pH(4,5,6,7,8,9)별로 12시간 가수분해하여 pH 변화에 따른 흡광도를 측정하였다.

도 2는 세리신의 가수분해 시 처리 pH 변화에 따른 가수분해물의 흡광도를 나타낸 것으로, kojizyme과 flavourzyme의 경우 pH 변화에 따라 흡광도가 비슷한 경향으로 나타났으며, 최적 pH는 6 부근인 것으로 나타났다.

protamex와 alcalase의 경우도 pH 변화에 따른 흡광도가 서로 비슷한 경향으로 나타났으며, 처리 pH가 높을수록 흡광도도 높게 나타났다. pH 5∼6 부근을 경계로 낮은 pH에서는 protamex가, 높은 pH에서는 alcalase의 흡광도가 높게 나타났으나 큰 차이는 나타나지 않았다. 특이한 것은 kojizyme과 flavourzyme의 경우와 같이, 일반적인 효소의 특징이 일정 pH까지 pH의 증가에 의해 활성이 증가하다가 그 이후에는 활성이 점차 감소하는 경향을 보이는데, protamex와 alcalase의 경우 pH증가에 의해 효소의 활성이 계속 증가한다는 것이다. 이들의 최적 pH는 위에서 언급했듯이 극단적인 산성이나 알칼리를 제외하고 최대한 높은 pH가 최적일 것이나, 이들을 사용하여 각종 식품이나 기타 재료로 사용하기 위해서는 활성이 크게 차이나지 않으면서 중성인 pH가 적정 pH라고 사료되어 이후의 실험에서는 적정 pH를 7로 고정하여 실험하였다.

2). 처리 온도에 따른 용해도

0.5g의 난용성 세리신 분말을 욕비 1:50, 효소의 양은 분말의 10%, kojizyme과 flavourzyme의 pH는 6, 온도는 30, 40, 50, 60℃에서, protamex와 alcalase의 pH는 7, 온도는 30, 40, 50, 60, 70℃에서 각각 12시간 가수분해하여 온도 변화에 따른 흡광도를 측정하였다.

도 3은 세리신의 가수분해 시 적정 pH에서의 온도변화에 따른 가수분해물의 흡광도를 나타낸 것이다. pH의 영향에서와 같이 protamex와 alcalase의 처리가 kojizyme과 flavourzyme의 경우보다 용해도가 크고, 최적온도는 60℃로 나타났다. kojizyme과 flavourzyme의 경우는 최적온도가 50℃ 부근으로 나타났다.

3). 처리 시간에 따른 용해도

0.5g의 난용성 세리신 분말을 욕비 1:50, 효소의 양은 분말의 10%, kojizyme과 flavourzyme의 pH는 6, 온도는 50℃에서, protamex와 alcalase의 pH는 7, 온도는 60℃에서 각각 0.5, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20, 24시간 가수분해하여 처리 시간에 따른 흡광도를 측정하였다.

도 4는 세리신의 효소 가수분해 시 적정 pH와 온도에서, 처리시간에 따른 가수분해물의 흡광도를 나타낸 것이다. 모든 처리에서 초기 2시간까지는 흡광도 변화가 급격히 증가하며, 그 이상의 처리시간 경과에 의해서는 흡광도 증가가 완만하게 나타난 것으로 보아, 가수분해가 2시간 이전에 상당부분 나타나는 것으로 보여지며, 2시간 이후에도 어떤 식으로든 효소가 작용을 계속하여 미미하게나마 흡광도가 증가된 것으로 보인다.

4). 효소 농도에 따른 용해도

0.5g의 난용성 세리신 분말을 욕비 1:50, 효소의 양은 분말의 0.5, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 30%로 하고, kojizyme과 flavourzyme의 pH는 6, 온도는 50℃에서, protamex와 alcalase의 pH는 7, 온도는 60℃에서 각각 4시간 가수분해하여 효소 농도 변화에 따른 흡광도를 측정하였다.

도 5는 세리신의 가수분해 시 효소처리 농도가 가수분해물의 흡광도에 미치는 영향을 나타낸 것이다. 전체적으로 효소농도 3%까지는 흡광도가 급격히 증가하였지만, 그 이상의 농도에서는 흡광도 증가가 완만하게 나타났다. 효소는 최적조건에서 그 활성을 소실하는데 장시간을 요한다. 따라서 최적조건에서의 처리효소 농도가 적당량이고 가수분해 시간이 충분하다면, 효소의 농도가 적정농도 이상인 것에 비해 분해 정도의 차이는 크지 않다는 것과 일치하는 현상이었다.

5). 용해도 및 평균중합도 측정을 위한 효소 가수분해

이상과 같이 효소 가수분해 시 최적의 용해도를 고려하여 처리시간과 농도 변화에 따른 용해도와 흡광도 및 평균중합도를 측정하기 위해서 아래와 같은 조건으로 가수분해하였다.

세리신 분말 : 0.5g

pH : kojizyme과 flavourzyme은 6, protamex와 alcalase는 7

온도 : kojizyme과 flavourzyme은 50℃, protamex와 alcalase는 60℃

욕비 = 1:50

효소농도 : 0.5, 2, 5% on the weight of sericin(o.w.s.)

처리시간 : 1, 2, 4, 8, 12, 24시간

가수분해한 수용액을 실활 시키기 위해 85℃에서 5분간 처리하였다. 처리액을 원심분리(10,000rpm, 20min)한 후 상등액을 취하여, 흡광도를 측정하고, 닌히드린 반응의 시료로 사용하였다. 침전물은 filter paper를 이용하여 수세 후 건조하여 식 (1)과 같은 방법으로 용해도를 구하였다.

용해도(%) =	가수분해 전 무게-가수분해 후 불용해물의 무게	× 100(%) ……(1)
	가수분해 전 무게

일반적으로 효소는 단백질 기질을 분해할 때, 말단기 부분만을 절단하는 exo activity enzyme과 내부를 절단할 수 있는 endo activity enzyme으로 구분할 수 있다. 이 중 endo activity enzyme은 효소분해 시간이 증가함에 따라 가수분해 정도가 증가하지만, 일정 시간 이후에는 그 증가량이 미미하다. 이러한 이유는 특정기와 반응할 수 있는 상태라면 내·외부를 막론하고 무작위로 특정기를 분해하기 때문에 많은 분해가 분해시간 초기에 일어나게 된다. 그 이후는 처리시간이 증가하더라도 기질의 특성상 효소가 내부로 이동할 수 없다면 특정말단기만을 분해하기 때문이다. 지금까지 난용성 세리신의 각 효소 가수분해 시 최적 pH와 온도를 측정하고, 시간과 농도의 변화에 따른 가수분해 경향을 알아보았는데, 최적 pH와 온도로 고정하고 효소의 농도와 처리시간을 조절하게되면 용해도가 달라질 것이며, 이들에 대한 정보를 얻기 위해 실험한 결과를 도 6∼9에 나타내었다.

도 6은 kojizyme의 세리신 가수분해 시 처리시간과 농도변화에 따른 용해도를 나타낸 것이다. 처리농도가 높을수록, 처리시간이 경과할수록 용해도가 높은 것을 알 수 있었다. 4시간 이상 처리했을 때에는 처리시간의 증가에 따라 용해도의 증가폭이 완만한 것으로 나타나 24시간 처리시 효소농도가 0.5%의 경우는 39.5%, 5%의 경우는 53.26%로 13%이상의 용해도 차이를 보였다. 효소농도 5%, 4시간 처리의 경우는 47.57%로, 5%, 24시간의 경우가 5.69%만 더 높게 나타나, kojizyme의 경우 세리신의 용해도를 높이기 위해서는 처리시간의 지속보다는 효소의 농도를 조절하는 것이 더 적당한 것으로 판별되었다.

도 7은 flavourzyme의 세리신 가수분해 시 처리시간과 농도변화에 따른 용해도를 나타낸 것으로, kojizyme의 경우와 비슷한 용해도 경향을 나타내었으나 효소농도 5%, 24시간 처리 시 55.7%의 용해도로 kojizyme 보다는 용해도가 약간 높았다.

도 8은 protamex의 세리신 가수분해 시 처리시간과 농도에 따른 용해도를 나타낸 것으로, 처리시간 4시간까지는 용해도가 급격히 증가하다가 그 이후의 처리에서는 시간의 경과에 따라 증가 정도가 완만하였다. 효소농도 5%의 경우 4시간 처리 시 용해도는 74.39%이고, 24시간 처리 시는 76.98%로, 4시간 처리 이후에는 처리시간 경과에 따른 가수분해 효과가 적었다.

도 9는 alcalase의 세리신 가수분해 시 처리시간과 농도변화에 따른 용해도를 나타낸 것으로, 도 8의 protamex와 비슷한 용해도 경향을 나타내며, 효소농도 5%, 24시간 처리의 경우 용해도가 80.97%로 protamex보다 높게 나타났다.

6). 각종 분석을 위한 효소 가수분해

이상과 같이 효소 가수분해 시 최적의 용해도와 평균 분자량을 고려하여 가수분해한 것과, 수용성 세리신 2종 및 난용성 세리신을 각종 분석과 실험에 이용하였다. 효소 가수분해는 다음과 같은 조건으로 가수분해하여 3종의 세리신을 얻었다.

난용성 세리신 30g을 욕비 1:50으로 하고, kojizyme의 경우는 효소농도 0.5% o.w.s., pH 6, 온도 50℃에서 4시간 처리하였고, protamex의 경우는 효소농도 0.5% o.w.s., pH 7, 온도 60℃에서 8시간 처리하였고, alcalase는 효소농도 5% o.w.s., pH 7, 온도 60℃에서 8시간 처리하였다. 각 시간 처리 후 85℃에서 5분간 처리하여 효소의 활성을 없앤 후 식혀서, filter paper를 이용하여 1차 여과한 후 glass filter(G4)를 이용하여 2차 여과하여 얻은 용액을 동결건조 하였다.

각 sample I.D.는 표 1과 같다

표 1. 각 처리에 따른 세리신의 Sample I.D.

Sample I.D.	처리 조건
IN	난용성 세리신
low	정련 후 얻은 저분자 수용성 세리신
high	정련 후 얻은 고분자 수용성 세리신
PK	IN이 kojizyme으로 가수분해 된 수용성 세리신
PP	IN이 protamex로 가수분해 된 수용성 세리신
PA	IN이 alcalase로 가수분해 된 수용성 세리신

3.흡광도를 이용한 용해도

앞에서 효소농도와 처리시간에 따른 용해도를 알아보았는데, 이들에 대한 흡광도를 측정하여 용해도와 흡광도의 상관관계를 알아보았다.

도 10은 kojizyme의 효소농도와 처리시간에 따른 가수분해 정도를 흡광도로 나타낸 것으로, 처리시간이 증가하고 처리농도가 높을수록 흡광도는 높게 나타났다. 도 6에서 살펴본 용해도에서 4시간 이상 처리에서는 처리시간의 증가에 따라 용해도 증가가 미미하였으나, 도 10의 흡광도에서는 계속해서 증가하는 경향이 나타났다. 일반적으로 동일한 성분의 두 가수분해물이 용해도가 같다면 용해액의 흡광도도 같은 값으로 나타나야 할 것이나 다르게 나타났다는 것은, 흡광도가 곧 용해도의 척도라고 하는 것은 잘못된 것임을 시사한다. 분자량에 차이가 있는 동일한 성분의 두 물질이 같은 무게의 양일 때 분자량이 작은 것이 전체 표면적이 크므로 흡광도가 높게 나타나게된다. 이러한 원리로 비추어볼 때, kojizyme 처리의 경우 처리시간의 증가에 의해 용해도는 거의 일정하나 흡광도가 증가했다는 것은 용해된 세리신이 효소에 의해 계속해서 분해가 진행되어 전체 표면적이 증가했음을 의미하며, 분자량도 점점 작아졌음을 시사한다.

도 11의 flavourzyme과 도 12의 protamex, 도 13의 alcalase 처리의 경우도 흡광도 정도만 차이가 날뿐 용해도와 비교해 처리시간의 경과에 의해 흡광도가 증가하는 경향은 kojizyme과 같은 현상으로 나타났다.

4. 말단기 정량에 의한 평균 중합도 측정

난용성 세리신을 효소 가수분해한 후 닌히드린반응을 시켜 분광광도계(UV,VIS-spectrophotometer, Beckman, DU 650)로 392㎚에서 흡광도를 측정하였다. 난용성 세리신 1g을 6N HCl로 24시간 가수분해하여 감압건조, 수세, 건조 후 증류수를 첨가하여 10㎖로 맞추어 0.45㎛ membrane filter로 여과한 후 닌히드린반응시켜 흡광도를 측정하여 완전 가수분해된 세리신의 mol 흡광도를 기준으로 하였다. 닌히드린반응 시 완전 가수분해 액은 증류수를 첨가하여 0.1% 농도로 하여 0.5㎖, 효소 가수분해한 용액은 가수분해한 용액을 1% 농도로 하여 0.5㎖을 vial에 넣고, 1% 닌히드린 용액 0.5㎖를 첨가한 후 증류수를 첨가하여 10㎖로 맞춘 후 밀폐하여 100℃에서 20분간 처리하였다. 평균중합도는 식 (2)와 같은 방법으로 구하였다.

평균 중합도 =	완전 가수분해한 용액의 mol량 흡광도	……………(2)
	가수분해한 용액의 mol량 흡광도

단백질 분자량을 측정하는 방법에는 일반적으로 SDS-전기영동이나, 분자량 측정기인 GPC를 사용하거나, 각종 말단기를 정량하여 평균 중합도를 측정하는 방법들이 주류를 이룬다. 본 실험에서는 간단하게 알아볼 수 있는 말단기 정량법을 이용하여, 최적 pH와 온도에서 각 효소의 처리시간과 농도 변화에 따라 수용성화 된 세리신의 평균중합도를 측정하였다.

도 14는 kojizyme의 효소농도와 처리시간에 따른 평균중합도를 나타낸 것이다. 효소농도가 높을수록 처리시간이 경과할수록 평균중합도는 낮게 나타났다. 이러한 결과는 도 6의 용해도와 도 10의 흡광도에서 고찰한 것과 같이, 4시간 처리 이후의 경우 용해도 증가는 미미하나 흡광도는 계속 증가하여 효소에 의해 수용화 된 세리신에 대해서 4시간 처리 이후에도 계속 가수분해가 이루어져 평균중합도가 작아진 것을 확인할 수 있었다.

효소농도가 낮을수록 처리시간에 따른 평균중합도 폭이 크게 차이나는 것을 볼 수 있으며, 분자량이 큰 것을 원할 경우에는 효소농도를 0.5%로 사용하는 것이 바람직하다.

도 15는 flavourzyme의 효소농도와 처리시간에 따른 평균중합도를 나타낸 것이다. kojizyme 처리와 비슷한 경향으로 효소농도가 높을수록 처리시간이 경과할수록 평균중합도는 낮게 나타났다. kojizyme과 flavourzyme의 0.5% 농도 4시간 처리 이전의 평균중합도는 30이상으로 나타났으며, 2% 농도 이상의 경우는 1시간 처리이상에서 거의 20이하의 평균중합도를 나타내고, 5% 농도에서는 평균중합도가 10이하로 낮게 나타났다. 이는 일정 효소 농도 이상이면 불용해물의 가용화뿐만 아니라 용해된 세리신에도 계속 작용하여 전체 분자량이 작아지며, 24시간 처리 시 kojizyme 처리의 평균중합도는 3.69, flavourzyme은 2.91로 3개 전후의 아미노산을 가진 저분자 펩타이드로 가수분해할 수 있을 것으로 기대된다.

도 16은 protamex의 효소농도와 처리시간에 따른 평균중합도를 나타낸 것으로 처리시간이 경과하고 효소농도가 높을수록 평균중합도는 낮게 나타났다. 특이한 것은 효소농도 5%로 처리한 경우 도 8에서 보면, 1시간 처리시의 용해도가 67.7%이고, 2시간 처리시의 용해도가 73.99%로서 그 차이가 6.29%밖에 나지 않는데, 도 16에서의 평균중합도는 각각 37.37과 18.41로 두배의 차이가 나고 있다. 이는 이 효소가 endo형이라는 것을 시사하며, 1시간 처리 시에 용해된 세리신에는 난용성 세리신의 내부를 절단하여 분자량이 큰 수용성도 상당부분 있어서 용해도도 높고 중합도도 크나, 계속 처리하여 2시간이 경과하였을 때는 용해된 분자량이 큰 세리신도 더욱 가수분해되고, 난용성 세리신도 일부 용해되어 용해도는 더욱 커지고 중합도는 월등히 작아져 거의 1/2 수준에 이르는 것으로 보여진다.

도 17은 alcalase의 효소농도와 처리시간에 따른 평균중합도를 나타낸 것이다. protamex 처리의 경우와 비슷한 평균중합도 경향을 보이나, 전체적으로 용해도도 높고, 0.5% 농도의 경우 protamex 처리보다 상당히 낮은 평균중합도를 나타내고, 다른 농도에서도 약간 더 낮거나 비슷한 평균중합도를 나타내는 것으로 보아, 사용한 효소 중 난용성 세리신에 대한 가수분해 활성이 가장 높은 것으로 나타났다.

protamex와 alcalase의 효소농도 5%, 4시간 처리시의 평균중합도는 각각5.74, 5.54이었고, 24시간 처리시의 평균중합도는 5.09와 5.19로서, 4시간 처리 이후 계속 처리하여도 비슷한 경향을 나타내는 것은, 일정한 크기로 분해한 후 더 이상 세리신에 영향을 미치지 않는 것으로 판단되며, 이러한 특징은 특정 말단기와 일정한 분자량을 가진 펩타이드로 가수분해하기에 적당한 효소라고 생각된다.

5.아미노산 분석

수용성 세리신과 효소 가수분해로 얻은 분말과 난용성 세리신 분말의 각 1g에 6N HCl을 첨가하여 10㎖로 만들어 ampule에 담아 질소가스를 7분간 충전 후 밀봉하여 110℃에서 24시간 가수분해하여 냉각하고 염산을 감압하여 제거하고 증류수로 2회 세척한 다음 건고시켰다. 건고시킨 시료를 구연산 완충액(pH 2.2)으로 용해 후 10㎖로 맞추어 0.45㎛ membrane filter로 여과한 뒤 자동 아미노산 분석기(Pharmacia Biotech, Co, Biochrom20)로 분리 정량 하였다.

표 2는 세리신 분말의 아미노산 분석을 한 표이다. 전체적으로 17종 아미노산 대부분을 함유하고 있으며, 수용성 세리신인 low와 high의 경우 효소 가수분해된 것들보다 세린과 타이로신의 함량이 높고, 글리신의 양은 적었으며, 프롤린의 경우는 검출되지 않았다.

생사의 외층에서 내층으로 용해되기 어려운 순서인 세리신의 Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ에서 고온고압 정련 시 얻은 low와 high는Ⅰ이나Ⅱ부분에 해당되고, IN은 Ⅲ이나 Ⅳ부분에 해당된다고 할 수 있다. 그리고 IN을 효소 가수분해 한 PK, PP, PA도 수용성이긴 하나 Ⅲ,Ⅳ 부분에서 얻은 것이라 할 수 있다.

그러므로 low와 high에 함량이 높은 세린과 타이로신은 외층인 Ⅰ,Ⅱ에 더 많이 포함되어 있고, 글리신은 내층인 Ⅲ이나 Ⅳ에 더 많이 포함되어 있으며, 프롤린은 내층에만 존재한다는 것을 의미한다.

글리신의 경우 피브로인에 약 40%이상 존재하며 이는 분자량이 작아 결정성을 이루기 쉬운데, 세리신의 경우 내층에 이러한 아미노산이 많이 함유되어 있어 외층보다 단단한 결합을 이루기 쉬워 친수성이 많은 외층보다 용해되기 어렵다는 것을 시사한다.

세린만을 볼 때 수용성 세리신의 경우 IN에 비해 함유량이 평균 13.9%나 더 높았고, IN을 효소 가수분해한 것에서도 평균 3.1% 높았다. 항산화 작용과 노인성 치매에 효과가 있다는 타이로신의 경우, IN보다 수용성 세리신에서 함량이 높았으며, IN의 효소 가수분해물에서도 수용성보다는 낮았지만 함량이 높은 것을 확인할 수 있었다.

이러한 특성은 세린과 타이로신이 외층에 많이 포함되어 있으므로 low나 high가 IN보다 이들의 함량이 높은 것은 당연하나, IN을 가수분해하여 얻은 세리신에서도 세린과 타이로신의 함량이 IN보다 높다는 것은 IN 자체 내에서도 위치에 따라 아미노산 함량이 다르다는 것이며, 중심부로 갈수록 세린과 타이로신의 함량은 낮고 글리신의 함량은 높다는 것이다. 그러므로 효소 가수분해하여도 가수분해되지 않고 남아있는 IN의 중심부에는 결정성이 존재할 가능성도 있다고 예측할 수 있다.

이러한 여러 정황으로 미루어볼 때 생사나 고치의 세리신은 외층에서 내층으로 갈수록 용해성이 높은 친수성 아미노산인 세린과 타이로신의 함량이 낮아지고 분자량이 작은 글리신의 함량은 높고 밀도는 커져서 용해도는 떨어지고 난용성은 증가하는 것으로 판단된다.

체내에서 합성할 수 없어 반드시 음식물로 공급받아야 하는 것을 필수 아미노산이라 하며, 필수 아미노산 중 1가지가 부족해도 단백질 부족현상을 나타내게되는데, 필수 아미노산은 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판, 발린이 있는데 이 중 트립토판을 제외한 모든 필수 아미노산이 본 발명에 의해 제조된 세리신에도 골고루 함유되어있다. 그러므로 세리신을 식품으로 사용할 경우 상당히 유용한 건강식품이 될 수 있을 것이다.

뿐만 아니라 위에서 살펴본 생사나 고치에서 세리신의 위치와 특성에 따른 용해성이나 아미노산 함량의 차로 인해 수용성 세리신과 난용성 세리신으로 분리하여 사용하게되면 특성과 기능이 다양하게 나타날 수 있어 다양한 용도로 사용할 수 있을 것이다.

표 2. 여러 세리신의 아미노산 조성 (단위 : mol%)

Amino acid	low	high	PK	PP	PA	IN
Asp.	16.94	16.54	17.54	16.57	16.02	16.21
Thr.	9.45	9.13	9.12	9.65	9.53	9.38
Ser.	35.21	34.52	31.69	31.36	31.62	30.61
Glu.	4.10	4.07	4.79	4.37	4.10	4.27
Pro.	0	0	0.73	1.10	1.34	1.79
Gly.	13.84	13.72	15.34	15.58	15.01	15.62
Ala.	3.57	3.70	3.66	3.70	3.84	4.89
Cys.	0.78	0.70	0.90	0.74	0.93	0.79
Val.	3.51	3.59	3.64	3.83	3.62	3.51
Met.	0.46	0.55	0.38	0.42	0.52	0.59
Ile.	0.75	0.79	0.96	1.05	0.99	1.20
Leu.	1.14	1.09	1.19	1.55	1.44	1.78
Tyr.	3.00	2.80	2.60	2.21	2.69	1.93
Phe.	0.48	0.47	0.46	0.50	0.55	0.74
His	0.98	1.14	1.05	1.32	1.25	1.37
Lys.	2.78	2.92	2.84	3.10	2.82	2.78
Arg.	3.00	4.28	3.10	2.95	3.74	2.54
total	100	1 00	100	100	100	100

6. 분자량 측정

수용성 세리신 분말 2종과 효소 가수분해로 얻은 분말 3종의 분자량 분포를 알아보기 위해 GPC-MALS(DAWN EOS(S/N:245-E), wyatt)를 이용하여 측정하였다.

도 18∼22는 수용성 세리신과 효소 가수분해된 세리신의 분자량 분포를 나타낸 것이다. 이들의 GPC측정에 의해 얻은 Mn(수평균분자량)과 Mw(중량평균분자량)와 말단기 정량에 의해 구한 DP(평균중합도)와 식(3)과 식(4)에 의해 구한 Mp(중합도평균분자량)를 표 3에 나타내었다.

표 3. 여러 세리신의 분자량과 평균중합도

	low	high	PK	PP	PA
Mn	2,056	2,276	4,903	1,879	734
Mw	2,396	2,886	9,800	2,447	905
DP	12.50	16.70	35.68	11.64	5.32
Mp	1,387	1,832	3,950	1,287	585

평균 아미노산분자량 =	∑(아미노산분자량 × mol)	…………(3)
	∑mol

중합도 평균분자량 = 평균중합도 × 평균 아미노산분자량 ……………(4)

도 18은 low의 분자량 분포를 나타낸 것이다. 전체적으로 저분자로부터 6,000 사이에 분포되어 있고 3,000이하의 것들이 주류를 이루며, Mn은 2,056, Mw는 2,396, Mp는 1,387로 나타났다. 일반적으로 계산방식에 의해 Mn보다 Mw가 약간씩 크게 나타나는데 본 실험에서 측정한 말단기 정량법에 따른 평균분자량인 Mp는 이들 보다도 낮은 값을 갖는 것을 알게되었다.

도 19는 high의 분자량 분포도로서, 1,500부근과 3,500부근에 많이 분포되어 있으며, 전체적으로 1,000∼6,000 사이에 거의 분포되어 있다. Mn은 2,276, Mw는 2,886, Mp는 1,832로 low보다 약간 큰 분자량 구성을 이루고 있으며 DP의 경우는 low를 기준으로 high가 33.6%가 더 크게 나타났다.

처음 분류당시 low는 20,000 이하, high는 200,000 이하의 투과 분자량 크기의 여과막을 사용하여 분류를 하였으나, 분자량 측정결과 둘 다 6,000 이하의 분자량 분포를 이루었다. low의 경우 3,000 이하, high의 경우 3,500 이하에서 상당부분 분포하는 것으로 보아, 고온고압 정련된 세리신의 수용액은 6,000 이하의 저분자를 가지며, Mn이나 Mw가 2,000∼3,000 사이인 것으로 보여진다. 특히 low의 경우 분자량 500 이하인 아미노산 단위에서도 측정 된 것으로 보아, 유리 아미노산도 상당수 포함된 것을 알 수 있다.

도 20은 PK의 분자량 분포로, 저분자로부터 약 60,000까지 넓은 범위에 분포되어 있다. 분자량 10,000 전후에 많이 분포하는 것으로 관찰되며, Mn은 4,903, Mw는 9,800으로 나타났다. Mp는 3,950으로 Mn보다 약간 낮았으나, 세가지 측정 방법 모두에서 3,950 이상의 분자량으로 low와 high보다는 상당히 크다는 것을 확인할 수 있었다.

도 21은 PP의 분자량 분포도인데, Mn은 1,879, Mw는 2,447로 나타났다. low나 high보다는 넓은 범위에서, PK보다는 짧은 범위인, 저분자에서 약 15,000까지의 분포를 보인다. low나 high보다 분자량 분포는 넓으나 Mn은 오히려 작은 것을 볼 수 있는데, 이는 난용성 세리신을 가수분해하였기 때문에 다양한 분자량 분포를 보이며, protamex에 의해 아주 저분자까지 분해된 세리신이 많다는 것을 의미한다.

도 22는 PA의 분자량 분포도로서, Mn은 734, Mw는 905로 나타났다. 다른 종류의 세리신 보다 훨씬 낮은 분자량 분포를 보이며 1,000 이하에 상당부분 분포하는 것을 볼 수 있다. 특히 400 이하의 분자량 분포는 거의 없으며, 400∼700 사이에 분포율이 높은 것으로 보아, 3∼6개 정도의 펩타이드가 많을 것으로 기대된다. 평균 중합도인 DP도 5.32로 측정되어 GPC로 측정한 것과 비슷한 중합도로 보인다. 이것을 종합해볼 때 다른 처리와는 달리 일정한 크기의 펩타이드로 가수분해되었다는 것을 시사하며, 이는 alcalase가 세리신의 일정 아미노산 결합부분만을 분해하며, 이 아미노산 결합부분이 세리신의 내부에 존재하지 않으면 더 이상 분해하지 않아 크기가 일정하고 특정 말단기를 가지는 펩타이드를 만들게되므로, 동일한 말단기에 의한 특정한 성질을 가지는 기능성 펩타이드로서의 효과를 위해 기능성 식품과 의약 소재로의 사용도 기대해 볼만할 것이다.

전체적으로 볼 때 6,000 이상의 고분자 세리신을 얻기 위해서는, 난용성 세리신의 효소 가수분해 중 kojizyme을 사용하고, 분포가 일정한 저분자 세리신을 얻고자 할 때는 alcalase 5% 농도로 처리하는 것이 적당하다고 판단된다. 이렇듯 용도에 따라 세리신의 분자량을 제어하기 위해서는 난용성 세리신을 이용하여 효소 가수분해하는 것이 적절하며, 고온고압 처리 된 수용성 세리신의 경우는 분자량이 6,000 이하인 것을 확인할 수 있었다.

7. 항산화능을 알아보기위한 전자공여능 측정

전자공여 작용(Electro donating abilities, EDA)의 측정은 Blois(1958)의 방법에 따른 1,1,diphenyl-2,picryl hydrazyl(DPPH)용액을 이용하여 다음과 같이 측정하였다.

우선 DPPH 5㎍을 에탄올 50㎖에 녹여 filter paper로 여과한 후 분광광도계로 최대 흡수 파장인 517 ㎚에서 에탄올을 첨가하여 흡광도가 1이 되게 하여 측정에 이용한다. 각 시료는 증류수로 0.1, 0.5, 1, 5% 농도로 만들어 DPPH 용액 5㎖에 시료액 1㎖을 넣어 10초간 진탕하여 30분 후 원심분리(rpm=10,000, time=20 min)한다. 그 후 상등액을 취하여 흡광도를 측정하였다.

처리 시간 경과에 따른 효과를 보기 위해 측정한 액을 밀봉하여 암실에서 24시간 보관 후 흡광도를 재 측정하였다. 비교치로 대표적 천연항산물인 ascorbic acid와 합성항산물인 butylated hydroxyanisole(BHA)을 사용하여 위와 동일한 실험을 행하였으며 BHA는 에탄올에 녹였다. 전자공여 작용 정도는 다음의 식 (5)와 같은 방법으로 측정하였다.

EDA(%)=(1 - sample O.D./control O.D.) × 100(%) …………………(5)

단, sample O.D.는 DPPH 용액 5㎖에 시료액 1㎖을 넣어 측정

control O.D.는 DPPH 용액 5㎖에 증류수 1㎖을 넣어 측정

전자공여 작용은 활성 radical에 전자를 공여하여 식품중의 지방질 산화를 억제하는 목적으로 사용되고 있을 뿐만 아니라, 인체 내에서 활성 radical에 의한 노화를 억제하는 작용의 목적으로 이용되고있다.

생체 내에 있어서 산화반응은 생체의 운동에 있어 필수적이지만 이 반응이 과잉되면 생체에 매우 유해해진다. 즉 산화반응에 의해 생성된 활성 radical이 생체막의 구성성분인 지질을 과산화지질로 변화를 유도하고 그 결과로 생체막에 손상을 주어 노화촉진 혹은 경맥동화 등에 관여하게 되는데 이러한 경우에 radical을 제거하거나 공여하게 하면 생체내의 과산화수소와 과산화지질을 환원시켜 생체막에 대한 보호작용을 하게된다.

현재까지 알려진 천연 항산화 물질로는 아스코르브산, 토코페롤류, 플라보노이드와 그 유도체, 갈변반응 생성물, 아미노산 및 단백질 등이 알려져 있다.

이러한 효과를 알아보기 위해 항산화 반응의 전자공여 작용 실험 결과를 도 23에 나타냈다. 대조군인 ascorbic acid나 BHA에 비해 전체적으로 낮은 효과를 나타냈으며, high〉low〉PK〉PP〉PA의 순서로 크게 나타났다.

high의 1% 농도에서는 84.18%로 높은 전자공여능을 나타내어 거의 BHA 수준에 이르렀다. 수용성 세리신인 low와 high의 경우가 IN을 효소 가수분해한 것들보다 효능이 높았고, 수용성 중에서는 분자량이 큰 high가, 가수분해물 중에서도 분자량이 큰 순서인 PK〉PP〉PA 순서로 그 효능이 높았다는 점을 알 수 있다. 즉, 수용성 물질에서 채취한 세리신의 전자공여능이 크고, 분자량이 큰 것이 또한 효능이 크다는 것이다.

분자량 면에서 low와 high는 PA와 PK의 중간 크기이므로 분자량이 이 활성에 크게 작용한다고 하기는 힘들다. 그렇다면 고온고압 처리 시에 수용성인가 아닌가에 의해 이러한 차이가 나타날 수 있다고 생각할 수 있다.

앞에서 살펴본 아미노산 분석에서 수용성과 IN의 가수분해물들의 큰 차이점은, 세린과 타이로신의 함량에 차이가 있고 프롤린의 유무였다는 것에 착안할 수 있다. 타이로신의 경우 이미 알려진 바와 같이 항산화작용이 있기 때문에 충분히 이러한 효과를 나타낼 수 있을 것이라 사료되지만, 타이로신 자체가 전체 함량의 2∼3%이고 각각의 세리신에 대해서도 큰 함량차이를 보이지 않으며, 큰 차이는 아니지만 PA와 PK의 경우와 low와 high의 경우는 오히려 PA와 low의 함량이 높았으나 활성은 PK와 high가 높게 나타난 것을 보면, 분명히 타이로신이 항산화작용에 관여는 하지만 그것만으로 모든 것을 해석할 수는 없다. 그렇다고 프롤린이 없기 때문에 항산화 작용이 크다는 것도 있을 수 없는 일이다. 그렇다면 효소 가수분해물들보다 수용성 세리신이 전체 함량의 3%이상, 자체적으로는 10%정도 함량이 높은 세린의 영향이 클 것으로 보여진다. 세린의 절대 함량이 많은 수용성 세리신의 전자공여능이 효소 가수분해물들보다 크기는 하나 이 또한 low의 경우가 high의 경우보다 함량이 높으나 활성이 낮아 이것 또한 완전한 해석이라고 할 수는 없다. 세린과 타이로신의 공동작용으로 이러한 효과를 나타낸다고 하더라도, 이 역시 low가 high보다 세린과 타이로신의 절대 함량이 높아 설명하기 어렵다.

이러한 여러 가지 측면을 고려해 볼 때 한가지 생각해 볼 수 있는 것은 분자량이 크고 세린과 타이로신의 함량이 높아 한 분자 내에 이들이 함께 존재하여 활성을 높이는데 상호작용이 있다면 이러한 사실을 설명하는데 큰 무리가 없을 것으로 고려된다.

도 24는 처리시간 경과에 따른 세리신의 전자공여능을 나타낸 것이다. 0.5% 농도의 경우 high는 85.06%로 거의 BHA 수준에 이르렀고, 1% 농도의 경우 low는 50.12, PK는 49.26%로 거의 50% 수준에 이르렀으며, 5% 농도의 경우 low는 76.05, PK는 71.23%로 70% 이상의 전자공여능을 나타내어 효과가 큰 것으로 나타났다. 시간이 지날수록 효소가수분해물의 분자량이 큼에 따라 활성 차가 커지지만, 수용성 세리신보다는 활성이 낮다는 것을 다시 한번 확인 할 수 있었다.

이렇듯 본 발명에 의해 제조된 세리신은 전자공여능이 높아 식품이나 화장품의 첨가제로 사용하게 되면 인체 내에서 활성radical에 의한 노화를 억제하는 작용의 목적으로 사용 가능할 것이다.

8. 백도 및 황도 측정

세리신 분말의 백도를 알아보기 위해 색차계(Minolta, CR-300)를 사용하여 측정한 L^*ab값을 이용하여 식 (6)과 같이 백도를 산출하였다.

백도(Whiteness, %) = 100-((100-L)²+ (a²+b²))^1/2…………………………………(6)

가수분해한 분말의 용액상 황도를 비교하기 위해 4% 용액을 만들어 분광광도계로 580 nm에서 측정하여 비교하였다.

앞에서 살펴본 바와 같이 세리신이 항산화 효과가 높고 각종 아미노산이 함유되어 있어서 화장품류에 첨가하여 사용하거나 물에 녹여 음용하게 되면 노화방지나 건강유지에 효과가 있을 것이다. 이 때 세리신의 특성상 황색을 띠게 되는데 될 수 있는 한 색이 발하지 않는 것이 활용하기에 편리하다. 용도에 따라 굳이 색을 내려한다면, 피부에 무해한 색소나 식용색소가 있으므로 이들을 사용하면 될 것이다. 이때에도 색이 없는 것이 원하는 색을 만들기 쉽기 때문에 가능한 세리신 분말과 용액의 색이 발하지 않는 것이 응용하기에 효과적이라 할 수 있다.

이러한 발색 정도를 파악하기 위해 세리신 분말의 백도를 측정하여 도 25에 나타냈다. IN의 경우 64.12의 값으로 백도가 가장 낮았고, 가수분해하게 되면 백도가 증가하는 것을 알 수 있다. 전체적으로 수용성인 low와 high가 효소 가수분해물보다 높았으며, low의 경우 90.79로 가장 높았고, PK의 경우 80.32로 가장 낮았으나, 전체적으로 80이상의 높은 백도수치를 나타냈다.

도 26은 4% 세리신 용액의 황도를 나타낸 것이다. low와 high의 경우가 효소 가수분해물보다 황도가 낮았다. 도 25의 세리신 분말의 백도와 비교해보면, 대부분 백도가 높은 것이 황도가 낮았으나, low와 high만은 예외로 백도는 low가 높고 황도는 high가 낮아 무색에 가까웠으나 이 둘의 수치 차이는 크지 않았다.

9. 팩 테스트(Pack Test)

세리신 마스크 팩의 제조공정을 살펴보면, 상기 방법에 의해 제조된 각 종류별 세리신을 수용액으로 만들어 팩용 부직포를 세리신 액에 함침 시킨 후 상기 함침 된 부직포를 압착롤러로 압착하여 픽업률이 100∼300%가 되게 형성한 세리신 마스크 팩을 85℃에서 5분간 건조한다. 건조하지 않을 때는 부직포를 세리신 액에 함침 후 꺼내어 세리신이 충전 된 세리신 마스크 팩을 바로 밀봉한다. 상기 제조된 세리신 마스크 팩에 첨가된 세리신 양은 부직포의 무게 대비 0.1∼50중량%인 것을 특징으로 한다. 팩 테스트를 위하여 세리신 농도 4%인 용액을 사용하여 픽업률 100%인 세리신 마스크 팩을 제조 후 건조하였으며, 팩용 부직포는 일반 시판품(ECHO'S)을 사용하였다.

상기 방법에 의해 형성된 세리신이 처리된 부직포의 팩 효과를 보기 위해 세리신이 부착된 부직포로 얼굴 볼 부분에 부착 후 약간 흘러내릴 정도의 물을 뿌려 얼굴에 완전히 밀착시켰다. 20분간 처리 후 현미경(PC Microscope, TTS unlimited, inc. japan)으로 관찰하였으며, 처리전의 피부를 대조로 하였다.

각 sample I.D.는 표 4와 같다

표 4. 각 처리에 따른 세리신 마스크 팩(부직포)의 Sample I.D.

Sample I.D.	처리 조건
N-low	low로 처리한 세리신 마스크 팩
N-high	high로 처리한 세리신 마스크 팩
N-PK	PK로 처리한 세리신 마스크 팩
N-PP	PP로 처리한 세리신 마스크 팩
N-PA	PA로 처리한 세리신 마스크 팩

피부의 가장 바깥에 위치한 각질층은 생명력이 없는 죽은 세포(핵을 잃은 피막상 세포)로서 대략 20∼25개의 층으로 겹겹이 쌓여 있으나 이것은 피부유형과 피부상태에 따라 개인마다 많은 차이를 보인다.

각질층의 세포는 장원세섬유(tonofibrils)로 결합되어 있는데 과립층으로부터 시작한 퇴화과정으로 인하여 피부의 외부로 갈수록 점점 편평한 모양을 지니게 되며 세포핵은 메마른 성분의 작은 비늘 모양을 하고 있다.

각질층은 케라틴 50%, 지방 20%, 수용액 23%, 수분 7%로 구성되어 있는데 각질층의 수분 함유상태에 따라 각질층의 두께가 다르다. 수분양이 적어지면 각질층이 두꺼워져 피부결이 거칠어지며 피부노화를 촉진시킨다. 그러므로 매끄러운 피부를 간직하기 위해서는 햇볕이나 건조한 공기에 피부를 오래 노출시키지 않고 각질층의 수분함량을 적절히 유지하도록 해야 한다.

표피 안쪽에 위치하는 진피 성분 중 90%를 차지하는 콜라겐은 단백질로서 포유동물이 지니고 있는 전체 단백질 중 3분의 1을 차지하며 19가지의 아미노산을 함유하고 있는데 그 아미노산 조성 비율이 세리신과 매우 흡사하다. 이 콜라겐의 주입 주사 방법으로 얼굴의 진피에 투여하면 주름제거에 탁월한 효과가 있는데 이것은 사람의 콜라겐과 유사한 것으로서 송아지의 진피에서 추출된다.

세리신이 콜라겐과 비슷한 성분으로 구성 되어 있으나 콜라겐과 같은 물질은 아니므로 진피에 주입 주사하는데는 좀 더 많은 연구가 있어야하나 각종 필수 아미노산을 비롯한 다양한 아미노산으로 이루어진 단백질이기 때문에 먹거나 피부 접촉 시 최소한 부작용은 없으며 영양분 공급에는 효과가 있을 것이다.

일반적으로 분자량 800이하의 지용성 성분은 피부의 흡수에 용이하고 수용성 성분으로 고분자인 경우는 흡수가 매우 어렵다. 세리신의 경우도 본 발명에 따른 방법으로 분자량을 제어하여 저분자화 하면 피부의 경피 흡수도 가능하리라 생각된다. 저분자의 세리신은 경피 흡수되어 콜라겐 재생 작용을 돕고 분자량 800 이상의 고분자는 표피의 수분 함유량을 증가시켜 피부노화의 방지와 보습 효과에 큰 역할을 하게 될 것으로 판단된다.

팩 처리 시 피부에 막을 형성하게 되면 외부공기와 피부를 차단하여 피부표면 온도를 상승시켜 모공이 확대되므로 피부 노폐물이 쉽게 배출되도록 하고 모공의 더러움이나 각질을 제거하여 주게 되는데 분자량이 큰 세리신은 아교질 성질이 크기 때문에 피부의 외층에서 얇은 막을 형성하여 피부노폐물이 쉽게 배출되도록 도와줄 수 있다. 또한 팩 막은 수분증발을 억제시켜 각질을 유연하게 해줌으로써 영양 성분이 쉽게 흡수되도록 도와준다.

이러한 것을 근거로 팩의 마스크로 사용되는 부직포에 세리신을 처리하여 얼굴 부위에 팩 테스트한 결과를 도 27∼31에 나타내었다.

도 27은 low를 부직포에 처리한 마스크 팩으로 테스트한 그림으로, 팩 처리 전 a의 피부는 번들거림이 있고 피부표면이 거친 반면 처리 후 b의 피부는 a에 비해 번들거림이 많이 줄고 편평한 피부를 나타내었다. 이러한 이유 중 a의 번들거림은 분비된 피지의 양 때문이라 판단되고, 팩을 하면서 처리된 세리신에 물을 뿌려 피부에 접촉하였기 때문에 단백질로 이루어져 피부 친화성이 좋은 세리신이 마스크로부터 피부 쪽으로 이동되어 피부각질층에 침투 및 영향을 주어 수분유지와 영양분을 공급하게되어 처음에 많이 존재했던 피지의 성분에 의한 번들거림이 줄어들고 피부는 매끄러운 상태가 된 것이라 판단된다.

앞에서 살펴본 것과 같이 분자량이 작은 세리신은 피부 내로 침투 및 이동하여 콜라겐 생성과 피부 영양에 영향을 주고, 분자량이 피부 내로 이동할 수 없을 정도로 큰 세리신은 친수성 아미노산의 함량이 높아 피부의 수분 흡수력을 높여 보습효과를 줄 수 있어 전체적으로 피부의 주름살 제거와 보습효과 등의 피부보호와 피부개선이 된 결과라 할 수 있을 것이다.

도 28은 N-high, 도 29는 N-PK, 도 30은 N-PP, 도 31은 N-PA로 테스트한 그림으로 팩 처리 후의 피부상태가 low와 비슷한 경향으로 번들거림이 줄어들고 피부결이 고와져 전체적으로 피부의 개선에 효과가 있었다.

상기의 여러 실험 예에서 확인한 것처럼 본 발명에 의해 제조된 수용성 세리신은 여러 특성과 효과에 의해 화장품 첨가제, 식품 첨가제, 건강 보조식품, 건강 보조음료, 의료용 소재 등으로 다양하게 변형 제조될 수 있다.

본 발명의 기술 사상은 상기 실시예에 국한하지 아니하고, 같은 기술 분야의 통상의 전문가라면 본 발명의 기술 사상의 범위 내에서 다양한 실시예가 가능함을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에 의한 세리신 제조 방법은 실크를 정련 후에도 피브로인과 세리신 모두를 사용할 수 있을 뿐만 아니라 수용성 세리신 수거율도 매우 높다. 이렇게 제조된 세리신은 아미노산 조성과 분자량이 다양하여 필요 용도에 맞게 기능성 식품 및 화장품 첨가제에 사용할 수 있으며 특히 세리신을 마스크 팩에 적용하여 팩을 할 경우 분자량이 작은 세리신은 피부 내로 침투 및 이동하여 피부 영양에 영향을 주고, 분자량이 피부 내로 이동할 수 없을 정도로 큰 세리신은 피부의 수분 흡수력을 높여 보습효과를 줄 수 있어 전체적으로 피부의 주름살 제거와 보습효과 등의 피부보호와 피부개선에 기여할 수 있다.

Claims

실크로부터 수용성 실크 세리신을 제조하는 방법에 있어서,

정제된 고치 및 생사를 고온고압 처리하여 섬유상인 피브로인과 액상인 세리신 액으로 분리하는 단계;

분리된 세리신 액을 여과막을 이용하여 수용성 세리신과 난용성 세리신으로 분리하는 단계;

수용성 세리신 액을 여과막을 이용하여 저분자와 고분자 수용성 세리신으로 분리하는 단계;

난용성 세리신을 단백질 분해효소로 효소 가수분해하여 수용성 세리신을 제조하는 단계;

수용성 세리신을 동결건조 및 스프레이 드라이하여 세리신 분말을 제조하는 단계를 포함하여 이루어진 세리신 제조방법.
실크로부터 수용성 실크 세리신을 제조하는 방법에 있어서,

정제된 고치 및 생사를 고온고압 처리하여 섬유상인 피브로인과 액상인 세리신 액으로 분리하는 단계;

분리된 세리신 액을 여과막을 이용하여 수용성과 난용성 세리신으로 분리하는 단계;

수용성 세리신 액을 여과막을 이용하여 저분자와 고분자 수용성 세리신으로 분리하는 단계;

상기 분리된 저분자와 고분자 수용성 세리신을 동결건조 및 스프레이 드라이하여 제조된 세리신 분말 또는 액을 첨가한 마스크 팩.
실크로부터 수용성 실크 세리신을 제조하는 방법에 있어서,

정제된 고치 및 생사를 고온고압 처리하여 섬유상인 피브로인과 액상인 세리신 액으로 분리하는 단계;

분리된 세리신 액을 여과막을 이용하여 수용성과 난용성 세리신으로 분리하는 단계;

분리된 난용성 세리신을 단백질 분해효소로 효소 가수분해하여 수용성 세리신을 제조하는 단계;

상기 효소가수분해에 의해 제조된 수용성 세리신을 동결건조 및 스프레이 드라이하여 제조된 세리신 분말 또는 액을 첨가한 마스크 팩.
제 1 항 내지 3 항에 있어서, 고온고압처리는 고온고압 장치에 고치 및 생사를 넣고 고치 및 생사의 중량대비 10∼50배의 물을 가하여 밀폐 후 100℃∼140℃에서 30분∼90분 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 세리신 제조방법.
제 1 항에 있어서, 난용성 세리신을 효소 가수분해하여 얻은 수용성 세리신의 평균분자량과 아미노산 조성이 고온고압처리 된 수용성 세리신과 상이한 것을 특징으로 하는 세리신 제조방법.
제 1 항에 있어서, 단백질 분해 효소는 Alcalase, Flavourzyme, kojizyme, Protamex 중에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 세리신 제조방법.
제 1 항에 있어서, 세리신의 아미노산 조성과 분자량 특성을 이용하여 수용액 및 분말의 형태로 화장품 첨가제, 식품 첨가제, 건강 보조식품, 건강 보조음료 또는 의료용 소재 등에 첨가하여 사용할 수 있는 것을 특징으로 하는 세리신의 제조방법.
제 2항 또는 3항에 있어서, 상기 세리신 마스크 팩에 첨가되는 세리신 양이 마스크 팩 부직포의 무게 대비 0.1∼50중량%인 것을 특징으로 하는 세리신 마스크 팩 조성물.