KR20040065092A

KR20040065092A - 흡착제를 이용한 세팔로스포린ｃ 배양액의 정제방법

Info

Publication number: KR20040065092A
Application number: KR1020030002664A
Authority: KR
Inventors: 김정우; 신상규; 윤종찬; 윤인균
Original assignee: 종근당바이오 주식회사
Priority date: 2003-01-15
Filing date: 2003-01-15
Publication date: 2004-07-21
Also published as: CN1272445C; KR100479404B1; CN1517442A

Abstract

본 발명은 7-아미노세팔로스포란산 (7-ACA)의 제조를 위한 세팔로스포린C (CPC) 배양액의 정제방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 흡착제를 이용하여 CPC 배양액 중의 디아세틸세팔로스포린C (디아세틸 CPC)를 분리, 제거하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 의하는 경우에는 종래의 기술에 비해 순도가 매우 높은 7-ACA를 제조할 수 있다.

Description

흡착제를 이용한 세팔로스포린Ｃ 배양액의 정제방법 {Method for purification of cephalosporin C broth using absorbent}

본 발명은 7-아미노세팔로스포란산 (7-ACA)의 제조를 위한 세팔로스포린C (CPC) 배양액의 정제방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 흡착제를 이용하여 CPC 배양액 중의 디아세틸세팔로스포린C (디아세틸CPC)를 분리, 제거하는 방법에 관한 것이다.

CPC로부터 7-ACA를 제조하는 방법은 크게 화학적인 방법과 효소적인 방법으로 나눌 수 있다.

화학적인 제조방법에 따르면, CPC 배양액으로부터 CPC염 형태의 결정을 얻은 후, 이를 가수분해하여 7-ACA를 합성한다(벨기에 특허 제615955호). 화학적인 방법은 독성이 강한 공해 반응물(예를들어, 염소계용매, 클로로실란, 디메틸아닐린 등)을 사용하며 엄격한 공정조건(-50℃와 같은 매우 저온)이 요구된다는 단점이 있다.

효소적인 제조방법에 따르면, CPC 배양액을 정제한 후 정제된 여액을 하기 반응식 1의 과정을 거쳐 7-ACA를 제조한다.즉, CPC와 D-아미노산옥시다아제 (DAOD)를 반응시켜 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산 (Gl-7-ACA)을 제조한 후, 생성된 Gl-7-ACA를 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산 아실라제(Gl-7-ACA 아실라제)와 반응시켜 7-ACA를 제조한다.

효소적인 방법은 CPC염 형태로의 결정화하는 과정이 생략되므로 수율면에서 화학적 합성법에 비하여 유리하다. 그러나, 정제된 여액중에 포함되어 있는 디아세틸CPC가 하기 반응식 2에서와 같이 CPC와 반응하여 부생성물인 디아세틸7-ACA를 생산하기 때문에 높은 순도로 7-ACA를 제조하기 어렵다는 단점이 있다.

CPC 배양액 중의 디아세틸CPC는 결정화시켜 얻은 CPC염에도 존재하나, 화학적인 제조방법에서는 하기 반응식 3에서와 같이 반응과정중에 락톤화 반응이 일어나 제거되므로 최종산물인 7-ACA의 품질에 큰 영향을 주지 않는다. 그러나 효소적인 방법에서 디아세틸CPC가 직접적으로 7-ACA내에 디아세틸7-ACA 형태로 존재하므로, CPC 배양액중의 디아세틸CPC를 제거하는 과정이 필수적으로 요구된다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 도출된 것으로서, CPC 배양액 중에 포함되어 있는 디아세틸CPC를 효과적으로 제거하여 높은 수율로 7-ACA를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 발효가 완료된 세팔로스포린C (CPC)배양액을 여과한 후, 여액을 폴리스타이렌 계열의 수지를 이용하여 흡착하여 용리하는 경우의 전형적인 용출곡선 형태를 나타낸다 (디아세틸CPC(), CPC(◇)).

도 2는 실시예 1의 결과로서, SEPABEADS SP-700 수지를 이용하여 세팔로스포린C 배양액의 여액을 흡착, 용리한 결과를 나타내는 용출곡선이다 (디아세틸CPC(), CPC(◇)).

도 3은 실시예 2의 결과로서, SEPABEADS SP-825수지를 이용하여 세팔로스포린C 배양액의 여액을 흡착, 용리한 결과를 나타내는 용출곡선이다 (디아세틸CPC(), CPC(◇)).

도 4는 실시예 3의 결과로서, SEPABEADS SP-850 수지를 이용하여 세팔로스포린C 배양액의 여액을 흡착, 용리한 결과를 나타내는 용출곡선이다 (디아세틸CPC(), CPC(◇)).

도 5는 실시예 4의 결과로서, AmberliteXAD 1600 수지를 이용하여 세팔로스포린C 배양액의 여액을 흡착, 용리한 결과를 나타내는 용출곡선이다(디아세틸CPC(), CPC(◇)).

즉, (1)세팔로스포린C (CPC) 배양액과 D-아미노산옥시다아제 (DAOD)를 반응시켜 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산 (Gl-7-ACA)을 제조하는 단계와 (2) 생성된 Gl-7-ACA를 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산 아실라제 (Gl-7-ACA 아실라제)와 반응시켜 7-아미노세팔로스포란산 (7-ACA)을 제조하는 단계를 포함하는 7-아미노세팔로스포란산의 제조방법에 있어서, 상기 단계(1)이 CPC 배양액을 여과하고, 흡착제를 이용한 흡착 및 용리과정을 거쳐 상기 여액 중의 디아세틸CPC를 제거한 후, DAOD와 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

CPC 배양액은 발효공정에 의한 아크레모늄크리소제늄 (Acremonium chrysogenium)의 발효산물로서, pH 5.0 내지 6.0인 것을 사용하는 것이 바람직하다.

상기 CPC 배양액은 통상적인 여과 (filtering) 과정을 거쳐 불순물, 예를 들어 배지 등을 제거한다. 또한, 상기의 여과과정은 필요에 따라 CPC 배양액에 산을 첨가한 후에 이루어질 수도 있다. 한편, 여과 후 얻어진 용액을 CPC 배양액의 여액이라 한다.

상기 여액의 정제는 흡착제를 사용하여 이루어지며, 여액의 흡착과 용리과정을 통해 디아세틸CPC가 제거된다. 상기 흡착제로서는 폴리스타이렌 계열의 수지가 적합하다. 상기 폴리스타이렌 계열의 수지는 특별히 제한되지는 않지만, 예를들어 고다공성의 폴리스타이렌계 중합체, 고다공성의 스타이렌 단량체와 에틸렌성 단량체와의 공중합체, 또는 이들을 거대그물모양으로 가교화시킨 중합체가 사용될 수 있다. 한편, 상기 스타이렌의 벤젠고리의 수소는 다른 치환기로 치환되어 있어도무방하다. 상기 치환기는 특별히 제한되지는 않으나, 예를들어 알킬기 또는 할로겐으로 치환된 알킬기가 사용될 수 있다. 상용화된 수지로서는 예를들어, 일본 미쯔비시사 (三菱化學(株); Mitsubishi Chemical Corporation)의 SEPABEADSSP 시리즈, 특히, SEPABEADSSP-700, SEPABEADSSP-825, SEPABEADSSP-850을 들 수 있고, 또한 롬앤하스사 (Rohm and Hass)의 AmberliteXAD 시리즈, 특히, AmberliteXAD 16, AmberliteXAD 1600을 사용할 수 있다.

흡착제를 이용하여 CPC 배양액의 여액으로부터 디아세틸CPC를 분리, 정제하는 경우 CPC 배양액의 여액의 유속은 0.1 내지 10 BVH (bed volume/hour; 베드용적/시간), 바람직하게는 0.5 내지 5 BVH이다. 그 후, pH 6 내지 9의 인산완충액, 아세테이트 완충액, 카보네이트 완충액 또는 약알카리용액을 용출액으로서 사용하여 수지로부터 CPC 용액을 용출시킨다. 상기 용출액의 유속은 0.1 내지 10 BVH, 바람직하게는 0.5 내지 6 BVH이다. 흡착 및 용출시의 온도는 2 내지 25℃, 바람직하게는 5 내지 15℃이다.

발효가 완료된 CPC 배양액을 여과한 후, 폴리스타이렌 계열의 수지를 이용하여 그 여액을 흡착하여 용리하면 도 1과 같은 용출곡선을 얻을 수 있다. 도 1로부터 디아세틸CPC와 CPC를 서로 분리할 수 있음을 알 수 있다. 이때, 흡착후 용출에 따른 색제거 효과에 의하여 생성된 7-ACA의 투과도가 향상된다.

한편, 전처리된 CPC 배양액을 사용한 7-ACA의 제조방법을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다. 먼저, 전처리과정을 거친 CPC 용액을 직접 DAOD와 반응시켜 Gl-7-ACA를 제조한다. CPC 용액중의 기질의 농도는 25 내지 50g/L, 바람직하게는 30 내지 40g/L이다. 반응시 pH는 6.5 내지 8.0, 바람직하게는 7 내지 7.5로 조절하며, 온도는 15 내지 30℃, 바람직하게는 20 내지 25℃로 한다. 이때 반응기의 압력은 0.5 내지 1.5kgf/cm²으로 하고, 산소를 0.1 내지 0.5vvm (용적/용액용적/분)으로 주입한다.

다음으로, 상기 얻어진 Gl-7-ACA용액을 pH 7.0 내지 9.0, 바람직하게는 7.5 내지 8.5, 온도 15 내지 30℃, 바람직하게는 20 내지 25℃, 압력은 대기압의 조건하에서 Gl-7-ACA 아실라제와 반응시켜 7-ACA를 제조할 수 있다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명의 범위는 아래의 실시예에 의해 한정되지는 않는다.

실시예 1 : SEPABEADS SP-700 수지를 이용한 세팔로스포린C 배양액의 여액의 흡착 및 용리

SEPABEADSSP-700 수지가 들어있는 칼럼(지름: 6cm , 높이 : 40cm , 베드용적 : 3,000mL)에 CPC 배양액을 여과한 여액(디아세틸CPC 함량: 6 %)을 3 BVH의 속도로 흡착시킨 후 용리시켰다. 흡착 및 용리시 CPC와 디아세틸CPC의 분포는 도 2와 같았다.

도 2의 분리선 이후에 용출액을 취할 경우 CPC 용액내 디아세틸CPC의 함량은0.9 %이며, 분리선상에서 디아세틸CPC의 함량은 3.5 %였다.

실시예 2 : SEPABEADS SP-825 수지를 이용한 세팔로스포린C 배양액의 여액의 흡착 및 용리

SEPABEADSSP-700 수지 대신에 SEPABEADSSP-825 수지를 이용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 CPC 배양액의 여액을 흡착 및 용리시켰다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

실시예 3 : SEPABEADS SP-850 수지를 이용한 세팔로스포린C 배양액의 여액의 흡착 및 용리

SEPABEADSSP-700 수지 대신에 SEPABEADSSP-850 수지를 이용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 CPC 배양액의 여액을 흡착 및 용리시켰다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

실시예 4 : Amberlite XAD 1600 수지를 이용한 세팔로스포린C 배양액의 여액의 흡착 및 용리

SEPABEADSSP-700 수지 대신에 AmberliteXAD 1600 수지를 이용한 것을 제외하고는 실시예 1과 동일한 방법으로 CPC 배양액의 여액을 흡착 및 용리시켰다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.

실시예 5 : Gl-7-ACA의 제조

실시예 1에서 얻어진 디아세틸CPC가 제거된 CPC 용액을 역삼투압에 의해 75mM의 농도로 농축시킨 후, 이중 1,000mL를 반응기에 넣었다. D-아미노산옥시다아제(DAOD) 2kU을 넣고 20℃를 유지하면서 5% 암모니아를 주입하여 pH를 7.2로 유지시켰다. 이때 산소를 0.1vvm(air volume/working volume/min)로 주입하여 반응기 내부의 압력이 1kgf/cm²이 되게 하였다. 45분이면 99%의 전환이 이루어졌으며, 완전히 전환된 후의 생성물의 조성은 표 1에 나타내었다.

화합물	조성비 (%)
CPC	0.0
Gl-7-ACA	90.8
디아세틸 Gl-7-ACA	1.2

실시예 6 : 7-ACA의 제조

실시예 5에서와 같이 Gl-7-ACA로 전환이 이루어진 용액에 Gl-7-ACA 아실라제 5kU을 넣고 20℃ 대기압하에서 반응시켰다. 이때 5% 암모니아를 이용하여 pH를 8.0으로 유지시켰다. 7-ACA로의 최대 변환 수율은 95%로서 50분 후에 수득되었다. 반응완료액에 10% HCl을 가하여 pH를 3.5로 조절한 후 여과에 의해 결정을 회수하였다. 결정화 수율은 88%이었다. 7-ACA 결정의 조성비는 표 2와 같았다.

화합물	조성비 (%)
7-ACA	97.8
디아세틸 7-ACA	1.00

비교예 1 : Gl-7-ACA의 제조

세팔로스포린C 배양액을 여과한 후, 실시예 1에서와 같은 별도의 분리과정 없이 세팔로스포린 C 여액 75 mM 1000mL를 반응기에 넣고 실시예 5와 동일하게 반응시켰다. 반응완료후 조성비는 표 3에 나타내었다.

화합물	조성비 (%)
CPC	0.0
Gl-7-ACA	85.6
디아세틸 Gl-7-ACA	4.7

비교예 2 : 7-ACA의 제조

비교예 1에서 Gl-7-ACA로 전환된 반응액을 실시예 6에서와 동일하게 반응시켰다. 반응완료 후 7-ACA 결정을 회수하였으며, 7-ACA 결정의 조성비는 표 4에 나타내었다.

화합물	조성비 (%)
7-ACA	95.7
디아세틸 7-ACA	2.5

본 발명에 따라 흡착제를 이용하여 CPC 배양액 중에 포함되어 있는 디아세틸CPC를 분리하면 종래의 기술에 비해 순도가 매우 높은 7-ACA를 제조할 수 있다.

Claims

(1) 세팔로스포린C (CPC) 배양액과 D-아미노산옥시다아제 (DAOD)를 반응시켜 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산 (Gl-7-ACA)을 제조하는 단계와 (2) 생성된 Gl-7-ACA를 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산 아실라제 (Gl-7-ACA 아실라제)와 반응시켜 7-아미노세팔로스포란산 (7-ACA)을 제조하는 단계를 포함하는 7-아미노세팔로스포란산의 제조방법에 있어서, 상기 단계(1)이 CPC 배양액을 여과하고, 흡착제를 이용한 흡착 및 용리과정을 거쳐 상기 여액 중의 디아세틸CPC를 제거한 후, DAOD와 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 CPC 배양액의 pH가 5.0 내지 6.0임을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 흡착제가 폴리스타이렌 계열의 수지인 것을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 상기 수지가 고다공성의 폴리스타이렌계 중합체, 고다공성의 스타이렌 단량체와 에틸렌성 단량체와의 공중합체, 또는 이들을 거대그물모양으로 가교화시킨 중합체인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계(1)의 흡착과정 중 여액의 유속이 0.1 내지 10 BVH인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계(1)의 용리과정이 pH 6 내지 9의 인산완충액, 아세테이트 완충액, 카보네이트 완충액 또는 약알카리용액을 용출액으로 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 용출액의 유속이 0.1 내지 10 BVH인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (1)의 반응시의 pH가 6.5 내지 8.0인 방법.
제1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (2)의 반응시의 pH가 7.0 내지 9.0인 방법.
제1항에 있어서, 얻어진 7-ACA 결정에 포함된 디아세틸 7-ACA의 함량이 1.0 % 이하인 것을 특징으로 하는 방법.