JP2598676B2 - プロテアーゼの製造方法 - Google Patents
プロテアーゼの製造方法Info
- Publication number
- JP2598676B2 JP2598676B2 JP12501988A JP12501988A JP2598676B2 JP 2598676 B2 JP2598676 B2 JP 2598676B2 JP 12501988 A JP12501988 A JP 12501988A JP 12501988 A JP12501988 A JP 12501988A JP 2598676 B2 JP2598676 B2 JP 2598676B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- protease
- medium
- culture
- adsorbent
- affinity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はプロテアーゼ産生菌の培養によるプロテアー
ゼの製造方法に関し、特に産生菌の培養時におけるプロ
テアーゼの自己消化を抑制し生産性を向上せしめたプロ
テアーゼの製造方法に関する。
ゼの製造方法に関し、特に産生菌の培養時におけるプロ
テアーゼの自己消化を抑制し生産性を向上せしめたプロ
テアーゼの製造方法に関する。
［従来の技術及びその問題点等］ プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）は、皮革工業
（皮なめし工程等）、繊維工業（絹の精練等）、食品工
業（調味料、みそ、しょう油、チーズ、ビール、清酒等
の製造）等の工業的用途、更に近年は洗浄剤配合の用途
に向けて多量に生産されている。
（皮なめし工程等）、繊維工業（絹の精練等）、食品工
業（調味料、みそ、しょう油、チーズ、ビール、清酒等
の製造）等の工業的用途、更に近年は洗浄剤配合の用途
に向けて多量に生産されている。
プロテアーゼは、動、植物体から抽出するか、微生物
を培養して生産するかの方法により製造されるが、需要
が多量のプロテアーゼの場合、専ら微生物の培養により
製造されている。
を培養して生産するかの方法により製造されるが、需要
が多量のプロテアーゼの場合、専ら微生物の培養により
製造されている。
プロテアーゼ産生菌の培養によるプロテアーゼの製造
法では、プロテアーゼの自己分解性（自己消化性）によ
り、菌の培養時あるいはプロテアーゼの分離精製時にプ
ロテアーゼが分解するため取得収量が低下する。
法では、プロテアーゼの自己分解性（自己消化性）によ
り、菌の培養時あるいはプロテアーゼの分離精製時にプ
ロテアーゼが分解するため取得収量が低下する。
そこで菌の培養過程あるいは分離精製過程において塩
化カルシウム、塩化コバルト等の金属塩を安定化剤とし
て添加する方法が提案されているが（特公昭61−108387
号）、その効果には限界がある。
化カルシウム、塩化コバルト等の金属塩を安定化剤とし
て添加する方法が提案されているが（特公昭61−108387
号）、その効果には限界がある。
プロテアーゼの自己消化による失活を防ぐには、プロ
テアーゼをその活性発現の低いpHあるいは温度条件にお
くことが有効であるが、微生物の培養過程でこの様な条
件を設定する事は、微生物の増殖および目的物質の生産
の上から実際的ではない。
テアーゼをその活性発現の低いpHあるいは温度条件にお
くことが有効であるが、微生物の培養過程でこの様な条
件を設定する事は、微生物の増殖および目的物質の生産
の上から実際的ではない。
また、従来、プロテアーゼの分離精製は微生物の培養
後、遠心分離あるいは濾過により菌体その他の浮遊物を
除去後、溶媒沈澱、塩析、又は膜分離等により行われて
いる。
後、遠心分離あるいは濾過により菌体その他の浮遊物を
除去後、溶媒沈澱、塩析、又は膜分離等により行われて
いる。
さらに高純度のプロテアーゼ等の酵素を取得する方法
としてアフィニィティ担体を用いるアフィニィティクロ
マトグラフィー法が知られている［R.B.Dunlap編,Immob
ilized biochemicals and affinity chromatography（P
lenum press,1974,pp123−134）］。
としてアフィニィティ担体を用いるアフィニィティクロ
マトグラフィー法が知られている［R.B.Dunlap編,Immob
ilized biochemicals and affinity chromatography（P
lenum press,1974,pp123−134）］。
アフィニィティ担体を分離、精製に使用する場合には
通常分離しようとする酵素を適当なpHの緩衝能を有する
溶液中で平衡吸着し、未吸着物質を充分洗浄後、pH、イ
オン強度を変えるか、あるいはアフィニィティ担体中の
リガンドに親和性を有する物質を含有する溶離液を用い
て酵素を溶出する。
通常分離しようとする酵素を適当なpHの緩衝能を有する
溶液中で平衡吸着し、未吸着物質を充分洗浄後、pH、イ
オン強度を変えるか、あるいはアフィニィティ担体中の
リガンドに親和性を有する物質を含有する溶離液を用い
て酵素を溶出する。
これまでにプロテアーゼのアフィニィティ担体として
鉱物質担体にプロテアーゼを特異的に吸着するリガンド
を結合した吸着体を使用しプロテアーゼの分離精製を行
なった例が開示されている（PCT/CH86/00081）。
鉱物質担体にプロテアーゼを特異的に吸着するリガンド
を結合した吸着体を使用しプロテアーゼの分離精製を行
なった例が開示されている（PCT/CH86/00081）。
［発明が解決しようとする課題］ 本発明の目的は、プロテアーゼ産生菌の培養時におけ
るプロテアーゼの自己消化による失活を抑制し、プロテ
アーゼ取得収量の高い製造方法を提供することにある。
るプロテアーゼの自己消化による失活を抑制し、プロテ
アーゼ取得収量の高い製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的はプロテアーゼ産生菌の培養時にお
けるプロテアーゼの自己消化による失活を抑制すると共
に、培養液からのプロテアーゼの分離精製を容易に行う
ことのできる製造方法を提供することにある。
けるプロテアーゼの自己消化による失活を抑制すると共
に、培養液からのプロテアーゼの分離精製を容易に行う
ことのできる製造方法を提供することにある。
［課題を解決するための手段］ 本発明者らは、目的とするプロテアーゼに対して親和
性を有する化合物を培地中に存在させると生産されるプ
ロテアーゼの活性中心が保護されプロテアーゼの自己消
化を防止することが可能であることを見出し、また前記
の化合物をリガンドとして保持した吸着体を培地中に存
在させると生成するプロテアーゼが吸着体に吸着され、
プロテアーゼの自己消化が防止されると共にプロテアー
ゼの分離精製が容易に行えることを見出し、本発明を完
成するに至った。
性を有する化合物を培地中に存在させると生産されるプ
ロテアーゼの活性中心が保護されプロテアーゼの自己消
化を防止することが可能であることを見出し、また前記
の化合物をリガンドとして保持した吸着体を培地中に存
在させると生成するプロテアーゼが吸着体に吸着され、
プロテアーゼの自己消化が防止されると共にプロテアー
ゼの分離精製が容易に行えることを見出し、本発明を完
成するに至った。
すなわち、本発明はプロテアーゼに親和性を有する化
合物を含有する培地中で、プロテアーゼ産生菌を培養す
ることを特徴とするプロテアーゼの製造方法、およびプ
ロテアーゼに親和性を有する化合物の吸着体を含有する
培地中でプロテアーゼ産生菌を培養し、前記吸着体を分
離した後、プロテアーゼを単離精製することを特徴とす
るプロテアーゼの製造方法である。
合物を含有する培地中で、プロテアーゼ産生菌を培養す
ることを特徴とするプロテアーゼの製造方法、およびプ
ロテアーゼに親和性を有する化合物の吸着体を含有する
培地中でプロテアーゼ産生菌を培養し、前記吸着体を分
離した後、プロテアーゼを単離精製することを特徴とす
るプロテアーゼの製造方法である。
［発明の構成］ プロテアーゼ親和性化合物 本発明の製造方法で培地に直接添加するか、または担
体に結合させて培地に添加するプロテアーゼに親和性を
有する化合物（リガンド）としては、例えばケイヒ酸、
ケイヒ酸エステル、バシトラシン、フェニルブチルアミ
ン、フェニルホウ酸、アミノフェニルホウ酸、フェニル
アラニン、Ｚ−フェニルアラニン（ここでＺはＮ−カル
ベゼンゾキシ基をいう）、チロシン等が挙げられる。
体に結合させて培地に添加するプロテアーゼに親和性を
有する化合物（リガンド）としては、例えばケイヒ酸、
ケイヒ酸エステル、バシトラシン、フェニルブチルアミ
ン、フェニルホウ酸、アミノフェニルホウ酸、フェニル
アラニン、Ｚ−フェニルアラニン（ここでＺはＮ−カル
ベゼンゾキシ基をいう）、チロシン等が挙げられる。
プロテアーゼ産生菌の培養に際して上記のバチルス属
セリンプロテアーゼに親和性をもつ化合物は、培養開始
時の培地中、またはプロテアーゼ生産の開始する培養後
期の培養液中に通常50〜100mM程度の濃度になるように
添加するが、添加量は用いる微生物によって最適の条件
を選ぶべきであり、使用濃度も上記範囲に限定されるも
のではない。
セリンプロテアーゼに親和性をもつ化合物は、培養開始
時の培地中、またはプロテアーゼ生産の開始する培養後
期の培養液中に通常50〜100mM程度の濃度になるように
添加するが、添加量は用いる微生物によって最適の条件
を選ぶべきであり、使用濃度も上記範囲に限定されるも
のではない。
吸着体 親和性化合物を吸着体として培地に添加する場合に使
用する担体は通常用いられるアフィニィティクロマドグ
ラフィー用の担体であり、例えばシリカ、アルミナ、Zr
O2、TiO2等の鉱物質担体、多糖類［例えばファルマシア
社製のCHセファロース4B及びエポキシ化活性セファロー
ス6B（共に商品名）等］および架橋ポリメタアクリルア
ミド［例えば東洋曹達社製のAFエポキシトヨパール（商
品名）等］等の高分子化合物担体が挙げられる。
用する担体は通常用いられるアフィニィティクロマドグ
ラフィー用の担体であり、例えばシリカ、アルミナ、Zr
O2、TiO2等の鉱物質担体、多糖類［例えばファルマシア
社製のCHセファロース4B及びエポキシ化活性セファロー
ス6B（共に商品名）等］および架橋ポリメタアクリルア
ミド［例えば東洋曹達社製のAFエポキシトヨパール（商
品名）等］等の高分子化合物担体が挙げられる。
これらの担体自体に公知の方法（例えばNature228 13
27〜1328（1970）記載の方法）により、前述のプロテア
ーゼに親和性を有する化合物を化学的に結合させて得ら
れた吸着体を培養液中に培地と共に添加してプロテアー
ゼ生産菌を培養し、その培養液か吸着体に吸着したプロ
テアーゼを単離精製する。
27〜1328（1970）記載の方法）により、前述のプロテア
ーゼに親和性を有する化合物を化学的に結合させて得ら
れた吸着体を培養液中に培地と共に添加してプロテアー
ゼ生産菌を培養し、その培養液か吸着体に吸着したプロ
テアーゼを単離精製する。
プロテアーゼ産生菌の培養 本発明で使用されうる培地はプロテアーゼ産生菌の培
養に通常用いられるものでよく、酵素生産に用いる微生
物が増殖しうる任意のものであり、例えば炭素源として
グルコース、マルトース、スクロース、酢酸、エタノー
ル、グリセリンなど、窒素源としては、ふすま粕、大豆
粕、ごま粕、コーンスティープリカーなどの有機窒素
源、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機
窒素源が用いられる。
養に通常用いられるものでよく、酵素生産に用いる微生
物が増殖しうる任意のものであり、例えば炭素源として
グルコース、マルトース、スクロース、酢酸、エタノー
ル、グリセリンなど、窒素源としては、ふすま粕、大豆
粕、ごま粕、コーンスティープリカーなどの有機窒素
源、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムなどの無機
窒素源が用いられる。
この培地に、さらにプロテアーゼに対して親和性を有
する化合物またはこの化合物を担体に吸着させた吸着体
を添加混合したものを用いる。
する化合物またはこの化合物を担体に吸着させた吸着体
を添加混合したものを用いる。
培養する微生物はプロテアーゼ産生菌として公知の菌
では、例えばバチルス属NKS−21菌株、NCIB10312菌株、
NCIB10302菌株、NCIB10293菌株等が利用できる。
では、例えばバチルス属NKS−21菌株、NCIB10312菌株、
NCIB10302菌株、NCIB10293菌株等が利用できる。
培養は通常一般に行われる好気的条件下に、例えば通
気培養法や振盪培養法によって行う。培養温度は20℃〜
65℃のいづれでもよく、培養pHは培養全期を通じてpH4
〜11で良い。培養時間は15〜60時間で実施する。
気培養法や振盪培養法によって行う。培養温度は20℃〜
65℃のいづれでもよく、培養pHは培養全期を通じてpH4
〜11で良い。培養時間は15〜60時間で実施する。
しかし、これらの条件は用いる微生物によって最適の
条件を選ぶべきであり、上に示した範囲に限定されるも
のではない。
条件を選ぶべきであり、上に示した範囲に限定されるも
のではない。
培地組成、培養条件によりプロテアーゼ産生菌を生産
するプロテアーゼの生産性は大きく変動するが、いかな
る培養条件においても、酵素に親和性を有する化合物ま
たはその吸着体を添加した培地では、無添加同組成培地
より多量の酵素が得られる。
するプロテアーゼの生産性は大きく変動するが、いかな
る培養条件においても、酵素に親和性を有する化合物ま
たはその吸着体を添加した培地では、無添加同組成培地
より多量の酵素が得られる。
培地にプロテアーゼ親和性化合物を添加して培養した
場合には、培養液から菌体を分離した培養上澄に目的酵
素が含まれるので、これを通常行なわれる精製法（液体
クロマトグラフィ等）により単離精製する。
場合には、培養液から菌体を分離した培養上澄に目的酵
素が含まれるので、これを通常行なわれる精製法（液体
クロマトグラフィ等）により単離精製する。
また、プロテアーゼ親和性化合物の吸着体を添加して
培養した場合には培養液を遠心分離し、菌体と吸着体を
分離し、水で充分に洗浄し、この沈澱物にメタノール、
エタノール、イソプロパノール等の脂肪族低級アルコー
ルを含む、食塩、塩化カリウム、硫酸ナトリウム等のア
ルカリ金属塩0.02〜1Mを含む水溶液を用いて溶出分離す
るだけで精製純度が極めて高く、着色度の低い高品質の
酵素が得られる。
培養した場合には培養液を遠心分離し、菌体と吸着体を
分離し、水で充分に洗浄し、この沈澱物にメタノール、
エタノール、イソプロパノール等の脂肪族低級アルコー
ルを含む、食塩、塩化カリウム、硫酸ナトリウム等のア
ルカリ金属塩0.02〜1Mを含む水溶液を用いて溶出分離す
るだけで精製純度が極めて高く、着色度の低い高品質の
酵素が得られる。
［実施例］ 以下、実施例を挙げて本発明を説明する。
プロテアーゼ活性の測定 実施例において、プロテアーゼ活性は以下の公知の方
法により測定した。
法により測定した。
すなわち、検液を0.1M炭酸ナトリウム、ホウ酸、塩化
ナトリウム緩衝液（pH10.0）0.5mlを加えて、30℃で10
分間反応させる。反応停止は0.1Mトリクロル酢酸を含む
0.2M酢酸、0.2M酢酸ナトリウム2mlを加えて行なう。30
℃、20分間放置後、No.2瀘紙を用いて濾過し、瀘液1ml
に0.4M炭酸ナトリウム5mlと６倍希釈のフェノール試薬
水溶液1mlを添加し、30℃、20分間放置して発色させ660
nmにおける吸光度を測定する。酵素単位は、国際酵素委
員会の「エンザイムノーメンクレーチャー」に従い、30
℃でpH10の１％カゼインを基質とし、１秒間にチロシン
１モル相当量の660nmの発色を示すトリクロル酢酸可溶
性物質を遊離するプロテアーゼ量を1katalとする。
ナトリウム緩衝液（pH10.0）0.5mlを加えて、30℃で10
分間反応させる。反応停止は0.1Mトリクロル酢酸を含む
0.2M酢酸、0.2M酢酸ナトリウム2mlを加えて行なう。30
℃、20分間放置後、No.2瀘紙を用いて濾過し、瀘液1ml
に0.4M炭酸ナトリウム5mlと６倍希釈のフェノール試薬
水溶液1mlを添加し、30℃、20分間放置して発色させ660
nmにおける吸光度を測定する。酵素単位は、国際酵素委
員会の「エンザイムノーメンクレーチャー」に従い、30
℃でpH10の１％カゼインを基質とし、１秒間にチロシン
１モル相当量の660nmの発色を示すトリクロル酢酸可溶
性物質を遊離するプロテアーゼ量を1katalとする。
なお、本発明に使用するプロテアーゼに親和性をもつ
化合物は、いわゆるプロテアーゼの拮抗阻害剤である
が、プロテアーゼの活性測定に際して過剰の基質の存在
下（カゼイン１％）においてはプロテアーゼの蛋白質分
解活性を阻害するものではない。
化合物は、いわゆるプロテアーゼの拮抗阻害剤である
が、プロテアーゼの活性測定に際して過剰の基質の存在
下（カゼイン１％）においてはプロテアーゼの蛋白質分
解活性を阻害するものではない。
また、本発明の吸着体添加法で得られた酵素と従来の
吸着体を添加しないで培養して得られた酵素の精製度、
着色度を比較するために280nmの吸光度当りの活性、350
nmの吸光度当りの活性を測定した。
吸着体を添加しないで培養して得られた酵素の精製度、
着色度を比較するために280nmの吸光度当りの活性、350
nmの吸光度当りの活性を測定した。
実施例１ バチルス属NCIB10312菌株を下記培地組成１の斜面培
地で35℃、16時間培養し、その一白金耳量を寒天を含ま
ぬ培地組成１の液体培地をモルトン栓付18mm口径試験管
5ml入れたものに接種した。これを35℃で６時間培養
し、対数増殖期後期に達した培養液を0.1ml採取して下
記培地組成２の液体培地を同寸試験管5ml入れたものに
植え次ぎ、培養開始20時間後にリガンド（Ｚ−D,L−フ
ェニルアラニン）を70mMとなるように添加した。
地で35℃、16時間培養し、その一白金耳量を寒天を含ま
ぬ培地組成１の液体培地をモルトン栓付18mm口径試験管
5ml入れたものに接種した。これを35℃で６時間培養
し、対数増殖期後期に達した培養液を0.1ml採取して下
記培地組成２の液体培地を同寸試験管5ml入れたものに
植え次ぎ、培養開始20時間後にリガンド（Ｚ−D,L−フ
ェニルアラニン）を70mMとなるように添加した。
次いで35℃で振盪培養し、24、30、36及び42時間後に
培養液を遠心分離し、上清について活性測定し、総活性
を求めた結果をリガンドを添加しない場合の結果と共に
表１に示す。
培養液を遠心分離し、上清について活性測定し、総活性
を求めた結果をリガンドを添加しない場合の結果と共に
表１に示す。
培地組成 1: ペプトン １ wt％ 酵母エキス 0.5 塩化ナトリウム 0.5 炭酸ナトリウム 0.3 寒天 ２ 培地組成 2: 大豆粕 2wt％ マルトース ２ 炭酸水素二カリウム 0.5 硫酸マグネシウム 0.05 炭酸ナトリウム １ （各培地はオートクレーブにより120℃で20分間減菌し
たものを使用した。） 実施例２ バチルス属NKS−21菌株（特公昭60−55118号）につい
て実施例１と培養時間、リガンド添加方法を除いて同様
に行った。培養時間は24時間、30時間とした。
たものを使用した。） 実施例２ バチルス属NKS−21菌株（特公昭60−55118号）につい
て実施例１と培養時間、リガンド添加方法を除いて同様
に行った。培養時間は24時間、30時間とした。
リガンドは、培養開始18時間後にＺ−Ｄ−フェニルア
ラニンを100mMになる様に添加した。結果を表２に示
す。
ラニンを100mMになる様に添加した。結果を表２に示
す。
実施例３ バチルス属NKS−21菌株につき、実施例１と同様の培
養条件で、培養時間を26時間とし、リガンドに、Ｚ−D,
L−フェニルアラニン、trans−ケイヒ酸、ｍ−アミノフ
ェニルホウ酸を用い、培養開始後19時間後に最終濃度10
0mMになる様に添加した。結果を表３に示す。
養条件で、培養時間を26時間とし、リガンドに、Ｚ−D,
L−フェニルアラニン、trans−ケイヒ酸、ｍ−アミノフ
ェニルホウ酸を用い、培養開始後19時間後に最終濃度10
0mMになる様に添加した。結果を表３に示す。
実施例４ バチルス属NCIB10312菌株を実施例１に記載した培地
組成１の斜面培地で35℃、16時間培養し、その一白金耳
量を寒天を含まぬ培地組成１の液体培地をモルトン栓付
18mm口径試験管に5ml入れたものに接種した。これを35
℃で６時間培養し、対数増殖期後期に達した培養液を0.
1ml採取して下記組成のリガンド（Ｚ−D,L−フェニルア
ラニン）吸着体を添加した液体培地及び添加しない液体
培地（培地組成３）を同付試験管に5ml入れたものに植
えつけた。
組成１の斜面培地で35℃、16時間培養し、その一白金耳
量を寒天を含まぬ培地組成１の液体培地をモルトン栓付
18mm口径試験管に5ml入れたものに接種した。これを35
℃で６時間培養し、対数増殖期後期に達した培養液を0.
1ml採取して下記組成のリガンド（Ｚ−D,L−フェニルア
ラニン）吸着体を添加した液体培地及び添加しない液体
培地（培地組成３）を同付試験管に5ml入れたものに植
えつけた。
35℃で振盪培養し26、28、45、52時間後に菌体もしく
は菌体と吸着体を遠心分離し、沈澱物を5mlの蒸溜水で
洗浄し遠心分離した。沈澱物に30％イソプロパノール10
0mM Na2SO4水溶液5mlを添加し、充分撹拌後遠心分離し
た。この酵素溶出操作を３回繰り返し抽出した。
は菌体と吸着体を遠心分離し、沈澱物を5mlの蒸溜水で
洗浄し遠心分離した。沈澱物に30％イソプロパノール10
0mM Na2SO4水溶液5mlを添加し、充分撹拌後遠心分離し
た。この酵素溶出操作を３回繰り返し抽出した。
これらの上清液について活性測定し、総活性を求めた
結果を表４に示す。
結果を表４に示す。
培地組成 3: 大豆粕 ２ wt％ マルトース ２ 炭酸水素二カリウム 0.5 硫酸マグネシウム 0.05 炭酸ナトリウム １ Ｚ−D,L−フェニルアラニンをリガントする微粉状シリ
カゲル吸着体 2mg又は0mg （培地はオートクレーフにより120℃で20分間減菌した
ものを使用した。） 実施例５ 実施例４と同一バチルス属NCIB10312菌株を使用して
培地として下記の培地組成４を用いた他は実施例４と同
じ方法で培養し抽出した結果を表５に示す。
カゲル吸着体 2mg又は0mg （培地はオートクレーフにより120℃で20分間減菌した
ものを使用した。） 実施例５ 実施例４と同一バチルス属NCIB10312菌株を使用して
培地として下記の培地組成４を用いた他は実施例４と同
じ方法で培養し抽出した結果を表５に示す。
培地組成 4: 大豆粕 ２ wt％ マルトース ２ 炭酸水素二カリウム 0.5 硫酸マグネシウム 0.05 炭酸ナトリウム １ フェニルホウ酸をリガンドする微粉状AFエポキシトヨパ
ール（東洋曹達社製） 10mg又は0mg 実施例６ バチルス属NKS−21菌株（特公昭60−55118号）につい
て培養時間を30時間としたことを除いて実施例４同様に
行なった。その結果を表６に示す。
ール（東洋曹達社製） 10mg又は0mg 実施例６ バチルス属NKS−21菌株（特公昭60−55118号）につい
て培養時間を30時間としたことを除いて実施例４同様に
行なった。その結果を表６に示す。
実施例７ 実施例４で得られた上清液を用いて精製度、着色度の
比較を行った。無添加系についてはNo.1の培養液上清を
使用し、添加系についてはNo.6の溶出液１の上清を用い
て、その活性と280nm、350nmでの吸光度を測定した。そ
の結果を表７に示す。
比較を行った。無添加系についてはNo.1の培養液上清を
使用し、添加系についてはNo.6の溶出液１の上清を用い
て、その活性と280nm、350nmでの吸光度を測定した。そ
の結果を表７に示す。
表７から、吸着体を添加した方法では、無添加の場合
に比べて280nmでの吸光度当りの活性は約７倍高く、ま
た350nmでの吸光度当りの活性は約50倍高いことがわか
る。すなわち吸着体添加法によれば精製純度が極めて高
く着色度の低い高品質の酵素を容易に得ることができ
る。
に比べて280nmでの吸光度当りの活性は約７倍高く、ま
た350nmでの吸光度当りの活性は約50倍高いことがわか
る。すなわち吸着体添加法によれば精製純度が極めて高
く着色度の低い高品質の酵素を容易に得ることができ
る。
実施例８ 実施例４使用の菌株と培地を用い、30時間培養し以下
の溶出液を用いて総活性を測定した。その結果をリガン
ド無添加の場合の結果と共に表８に示す。
の溶出液を用いて総活性を測定した。その結果をリガン
ド無添加の場合の結果と共に表８に示す。
溶出液1:30％メタノール0.02M NaCl 2:30％イソプロパノール0.02M NaCl 3: 〃 0.1M NaCl 4: 〃 0.02M KCl 5: 〃 0.02M Na2SO4 6:80％ 〃 0.02M Na2SO4 7:50％エタノール0.05M NaCl 8: 〃 0.1M NaCl ［発明の効果］ 本発明はプロテアーゼ産生菌の培地に、プロテアーゼ
に親和性を有する化合物またはその化合物の吸着体を添
加して培養を行うプロテアーゼの製造方法を提供したも
のであり、本発明の方法によれば培養時に生産されるプ
ロテアーゼの自己消化が抑制されるためプロテアーゼの
取得収量が向上する。また吸着体を使用する本発明の方
法によればプロテアーゼの分離精製が容易であり、純度
が極めて高い着色度の低い高品質の酵素を容易に得るこ
とができる。
に親和性を有する化合物またはその化合物の吸着体を添
加して培養を行うプロテアーゼの製造方法を提供したも
のであり、本発明の方法によれば培養時に生産されるプ
ロテアーゼの自己消化が抑制されるためプロテアーゼの
取得収量が向上する。また吸着体を使用する本発明の方
法によればプロテアーゼの分離精製が容易であり、純度
が極めて高い着色度の低い高品質の酵素を容易に得るこ
とができる。
フロントページの続き (72)発明者 ▲高▼間 道裕 東京都大田区多摩川２―24―25 昭和電 工株式会社生化学研究所内 (72)発明者 波々伯部 自克 東京都港区芝大門２丁目10番12号 昭和 電工株式会社内
Claims (2)
- 【請求項１】プロテアーゼに親和性を有する化合物を含
有する培地中で、プロテアーゼ産生菌を培養することを
特徴とするプロテアーゼの製造方法。 - 【請求項２】プロテアーゼに親和性を有する化合物の吸
着体を含有する培地中でプロテアーゼ産生菌を培養し、
前記吸着体を分離した後、プロテアーゼを単離精製する
ことを特徴とするプロテアーゼの製造方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12501988A JP2598676B2 (ja) | 1988-05-24 | 1988-05-24 | プロテアーゼの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP12501988A JP2598676B2 (ja) | 1988-05-24 | 1988-05-24 | プロテアーゼの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01296987A JPH01296987A (ja) | 1989-11-30 |
| JP2598676B2 true JP2598676B2 (ja) | 1997-04-09 |
Family
ID=14899847
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP12501988A Expired - Fee Related JP2598676B2 (ja) | 1988-05-24 | 1988-05-24 | プロテアーゼの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2598676B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3909018A1 (de) * | 1989-03-18 | 1990-09-20 | Roehm Gmbh | Protein-reinigungsverfahren |
| US5582762A (en) * | 1992-08-14 | 1996-12-10 | The Procter & Gamble Company | Liquid detergents containing a peptide trifluoromethyl ketone |
| US5576283A (en) * | 1992-08-14 | 1996-11-19 | The Procter & Gamble Company | Liquid detergents containing a peptide aldehyde |
-
1988
- 1988-05-24 JP JP12501988A patent/JP2598676B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01296987A (ja) | 1989-11-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101189613B1 (ko) | 테아닌의 제조법 | |
| US5407826A (en) | Isolated cultures of microorganisms of Clonostachys Cylindrospora, Gliocladium and Nectria Gliocladioides | |
| JP2598676B2 (ja) | プロテアーゼの製造方法 | |
| JPS6322188A (ja) | 新規なｌ−アミノアシラ−ゼ | |
| CA1050458A (en) | Purification of lipolytic enzymes by adsorption | |
| US4014860A (en) | Plasminostreptin (enzyme inhibitor) and method for producing it from streptomyces | |
| JPS6010718B2 (ja) | メイタンシノ−ル，メイタナシンおよびメイタンシノ−ル・プロピオネ−トの製造法 | |
| US4100028A (en) | Method for purification of proteolytic enzymes | |
| US4066507A (en) | Process for producing l-leupeptins | |
| JPS5934355B2 (ja) | 醗酵方法 | |
| JPH07116374B2 (ja) | 青色系色素組成物の製造法 | |
| JP3005085B2 (ja) | シス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製法 | |
| JPS5831992A (ja) | 新規生理活性物質ｋ−４およびその製造法 | |
| JPS6117475B2 (ja) | ||
| Lin et al. | Improved elution of isoamylase adsorbed on raw starch and the preservation of purified enzyme | |
| JPS6034556B2 (ja) | 抗生物質ｃ−１５００３ | |
| JP2537074B2 (ja) | 酸性プロテア―ゼの精製法 | |
| JPS6219599A (ja) | 新規マクロライド系抗生物質ｍ１１９ | |
| JPS6057833B2 (ja) | Ｌ−トリプトフアンの製造方法 | |
| JPH06172385A (ja) | 新規な環状ペプチド化合物及びその製造法 | |
| JPH05168488A (ja) | マクロライド系抗生物質の製造法 | |
| JPH07289274A (ja) | トランス−４−ヒドロキシ−ｌ−プロリンの製造法 | |
| JPH1028592A (ja) | リゾビウム属細菌によるアクリルアミドの製造方法 | |
| JPS5820596B2 (ja) | コプロボルフイリン ３ ノ セイホウ | |
| KR20020071638A (ko) | Ｈｐ20 수지 및 에탄올을 이용한 프라바스타틴의 정제방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |