KR100512774B1

KR100512774B1 - 7-아미노세팔로스포란산의 제조를 위한 세팔로스포린ｃ배양액의 전처리방법

Info

Publication number: KR100512774B1
Application number: KR10-2002-0060679A
Authority: KR
Inventors: 김정우; 신상규; 최상용; 윤종찬; 김진욱
Original assignee: 종근당바이오 주식회사
Priority date: 2001-10-06
Filing date: 2002-10-04
Publication date: 2005-09-07
Also published as: KR20030029508A

Abstract

본 발명은 7-아미노세팔로스포란산의 제조를 위한 세팔로스포린C 배양액의 전처리방법에 관한 것이다. 본 발명에 의한 제조방법에 의하면 결정화공정 없이 효소반응을 진행함으로써 공정을 단축시키고 높은 수율로 7-ACA를 제조할 수 있다.

Description

7-아미노세팔로스포란산의 제조를 위한 세팔로스포린Ｃ 배양액의 전처리방법{Preparation of cephalosporin C broth for manufacturing 7-aminocephalosporanic acid}

본 발명은 7-아미노세팔로스포란산 (7-ACA)의 제조를 위한 세팔로스포린C (CPC) 배양액의 전처리방법에 관한 것이다.

7-ACA는 다양한 세팔로스포린계 항생제들의 합성을 위한 중간체로 사용되고 있다. 세팔로스포린계 항생제는 CPC로부터 제조되는 항생제를 말하며, CPC는 일반적으로 아크레모늄크리소제늄(Acremonium chrysogenium)의 발효산물에서 분리된다. CPC를 원료로 하여 7-ACA를 제조하는 방법은 화학공정에 의한 방법과 효소공정에 의한 방법으로 대별된다. 화학공정에 의한 7-ACA 합성은 다단계의 초저온 반응이 필요하며, 반응 중에 사용되는 유독성 용매가 최종제품에 잔존하거나 또는 환경을 오염시키는 등의 문제점이 있어 최근에는 효소적인 방법이 개발되어 이용되고 있다. 효소공정의 대표적인 방법은 먼저 반응식 1에서와 같이 CPC를 D-아미노산옥시다아제(DAOD)와 반응시켜 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산 (Gl-7-ACA)으로 전환시키고, 이를 다시 반응식 2에서와 같이 Gl-7-ACA 아실라제와 반응시켜 7-ACA를 수득하는 것이다.

상기 CPC를 Gl-7-ACA로 전환시키는 반응은 세부적으로 볼 때 하기 반응식 3에서와 같이 CPC가 5-케토아디필-7-ACA (5-Ketoadipyl-7-ACA)로 전환되는 단계와, 이 과정에서 생성되는 과산화수소가 5-케토아디필-7-ACA와 반응하여 Gl-7-ACA가 제조되는 단계로 나누어진다.

이때, CPC 배양액에 자연적으로 존재하는 과산화수소 분해효소인 카탈라제가 Gl-7-ACA 제조에 필요한 과산화수소를 분해하게 된다. 따라서 CPC 배양액을 그대로 반응에 이용하는 경우 5-케토아디필-7-ACA로부터 Gl-7-ACA로의 완전한 전환이 이루어지지 않아 높은 수율로 7-ACA를 제조할 수 없다는 문제점이 있다.

상기의 문제점을 해결하기 위하여 CPC 배양액으로부터 먼저 CPC 결정을 얻고 , 상기 결정을 Tris완충액, 포스페이트완충액 또는 인산칼륨완충액등에 용해한 후, DAOD와 반응시켜 Gl-7-ACA를 제조하는 방법이 연구되고 있다 (한국특허출원 제1991-701280호, 한국특허출원 제1991-023834호). 그러나, 상기의 방법은 고농도의 농축공정 및 별도의 결정화 공정이 요구되기 때문에 공정의 효율성이 떨어지고 생성물의 수율이 낮다는 문제점이 있다.

본 발명은 상기한 바와 같은 종래의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 결정화공정 없이 효소반응을 진행함으로써 공정을 단축시키고 높은 수율로 7-ACA를 제조하는 방법을 제공하는 데 있다.

즉, (1) 세팔로스포린C 배양액과 D-아미노산옥시다아제를 반응시켜 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 제조하는 단계와 (2) 생성된 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 Gl-7-ACA아실라제와 반응시켜 7-아미노세팔로스포란산을 제조하는 단계를 포함하는 7-아미노세팔로스포란산의 제조방법에 있어서, 상기 단계 (1)이 세팔로스포린C 배양액에서 카탈라제를 제거한 후 D-아미노산옥시다아제와 반응시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법에 관한 것이다.

CPC 배양액은 발효공정에 의한 아크레모늄크리소제늄(Acremonium chrysogenium)의 발효산물로서, pH가 5.0 내지 6.0인 것을 사용하는 것이 바람직하다.

CPC 배양액으로부터 카탈라제를 제거하는 전처리과정은 CPC 배양액을 pH 1 내지 4로 산성화 한 후, 카탈라제를 여과하여 제거함으로써 이루어진다. 즉, 발효가 완료된 CPC 배양액 (pH 5.0 내지 6.0)을 황산, 염산 등의 산을 이용하여 산성화시킨 후 여과를 한다. 이때 온도는 0 내지 20℃, 바람직하게는 2 내지 10℃로 하며, 산성화에 소요되는 시간은 0.5 내지 5시간이다.

상기 CPC 배양액의 전처리과정은 상기 CPC 배양액에서 카탈라제를 제거한 후 흡착수지 또는 이온교환수지 등을 이용한 정제 및 용출단계를 더 추가하여 이루어지는 것이 바람직하다. 상기의 정제과정을 통하여 CPC 배양액속에 존재하는 CPC 유도체 등의 불순물을 제거할 수 있다. 즉, CPC 배양액의 산성화 및 여과를 거쳐 카탈라제를 제거한 CPC 여액을 Amberlite AXD 1600T(ROHM AND HASS, 독일) Diaion HP 20, HP21(MITSUBISHI CHEMICAL, 일본) Sepabeads SP 850(MITSUBISHI CHEMICAL, 일본)같은 흡착수지나 Amberlite IRA-93(SIGMACHEMICAL, 미국) 같은 이온교환 수지 등을 통하여 정제한다. 그 후, pH 6 내지 9의 인산완충액, 아세테이트 완충액, 카보네이트 완충액 또는 약알카리용액을 용출액으로서 사용하여 수지로부터 CPC 용액을 용출시킨다. 용출액으로서 메탄올, 에탄올 또는 이소프로필 알코올 등의 유기용매를 사용하는 경우에는 용출시간은 빨라지나, 효소반응시 DAOD의 역가를 급격히 떨어뜨리게 되어 바람직하지 않다.

한편, 전처리된 CPC 배양액을 사용한 7-ACA의 제조방법을 보다 상세히 설명하면 다음과 같다. 먼저, 전처리과정을 거친 CPC 용액을 직접 DAOD와 반응시켜 Gl-7-ACA를 제조한다. CPC 용액중의 기질의 농도는 25 내지 50g/L, 바람직하게는 30 내지 40g/L이다. 반응시 pH는 6.5 내지 8.0, 바람직하게는 7 내지 7.5로 조절하며, 온도는 15 내지 30℃, 바람직하게는 20 내지 25℃로 한다. 이때 반응기의 압력은 0.5 내지 1.5kgf/cm²으로 하고, 산소를 0.1 내지 0.5vvm (용적/용액용적/분)으로 주입한다. 이때, Gl-7-ACA로의 전환율은 90 내지 93%정도이다. 반응생성물 중 소량의 5-케토아디필-7-ACA를 과산화수소로 처리하여 93 내지 96%의 전환율로 Gl-7-ACA를 얻는다.

다음으로, 상기 얻어진 Gl-7-ACA용액을 pH 7.0 내지 9.0, 바람직하게는 7.5 내지 8.5, 온도 15 내지 30℃, 바람직하게는 20 내지 25℃, 압력은 대기압의 조건하에서 Gl-7-ACA 아실라제와 반응시켜 7-ACA를 배양액 대비 66%의 몰수율로 수득할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예를 통해 더욱 상세히 기술하고자 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하는 것으로서, 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되지는 않는다.

실시예 1 : pH에 따른 전환율의 변화

CPC 배양액(30g/L)에 50% 황산 또는 15% 암모니아를 가하여 pH를 0.5 내지 7.0으로 조절한 다음, 10℃에서 2시간동안 교반한 후, 다시 15% 암모니아를 가하여 pH를 7.2로 조절하였다. 이 용액에 용액부피대비 5%(w/v)의 규조토를 넣고, 부흐너(Buchner) 판넬상에서 여과지로 여과하였다. 이 여액 1L를 반응기에 넣고 DAOD 2kU을 투입한 후, 산소를 0.2vvm으로 주입하고, 내압을 0.5㎏f/cm²으로 유지시켰다. 반응온도는 20℃를 유지시켰고, 5% 암모니아로 반응액의 pH를 7.2로 유지시켰다. 반응 40분 후, 반응액을 HPLC를 이용하여 분석하였다. 결과는 표 1에서와 같다.

	전환율 (%)
여액 pH	5-케토아디필-7-ACA	Gl-7-ACA
7	81.1	9.9
5.5	45.4	47.1
4.0	5.8	88.3
2.5	5.3	90.2
1.0	1.0	85.1
0.5	0.1	40.3

표 1에서 알 수 있듯이, 여액의 pH가 1.0 내지 4.0인 경우에 Gl-7-ACA로의 전환율이 높다는 것을 알 수 있었다.

실시예 2 : 용출액의 종류에 따른 전환율 및 효소역가의 변화

CPC 배양액에 50% 황산을 가하여 pH를 2.5로 조절하고, 10℃에서 2시간동안 교반한 다음 CPC 배양액을 규조토 여과후 Amberlite AXD 1600 수지에 흡착시키고, 각기 다른 용리액을 사용하여 용출한 후, 실시예 2에서와 같은 조건으로 50분 동안 반응시켰다. 연속해서 5회 실시하였으며, 효소의 역가는 다음과 같은 방법으로 측정하였다.

- DAOD 역가측정

100mL 엘렌마이어 플라스크에 기질 100mL[100mM KPO₄ 완충액에 용해된 20mM CPC용액(pH8.0)]을 넣고, 산소를 주입하여 포화시킨 후, DAOD 300㎎을 넣고 교반하였다. 25℃에서 DAOD에 의한 산소소모량을 측정하여 DAOD의 활성도를 측정하였다. 산소소모량은 D.O meter를 이용하여 측정하였다. DAOD의 활성도 단위(U)는 분당 1μmole의 Gl-7-ACA를 생산하는 효소의 양을 나타낸다.

Gl-7-ACA로의 5회 평균전환율과 DAOD 효소의 역가는 표 2와 같다.

	평균전환율 (%)	초기대비 DAOD역가 (%)
인산완충액	91	96
아세테이트완충액	93	98
이소프로필알콜(5% 수용액)	7	5
메탄올(5% 수용액)	4	3

상기 표 2에서 볼 수 있듯이, 용출액으로서 인산완충액과 아세테이트완충액을 사용한 경우 90% 이상의 평균전환율과 95% 이상의 DAOD 역가를 나타내었다. 반면, 이소프로필알콜과 메탄올을 사용한 경우 효소역가의 급격한 하락으로 반응이 거의 진행되지 않았다.

실시예 3 : CPC 무결정화 공정에 의한 7-ACA의 제조

CPC 배양액(30g/L) 3L에 15% 염산을 가하여 pH를 3.0으로 조절한 다음, 8℃에서 3시간동안 교반한 후, 이 용액에 용액부피대비 5%(w/v)의 규조토를 넣고, 부흐너(Buchner) 판넬상에서 여과지로 여과하였다. 이 여액을 Amberlite AXD 1600 수지에 흡착시킨 후, 인산염완충액으로 용리시켜 얻어진 CPC 용액(75mM) 1,000mL를 반응기에 넣고, DAOD 2kU을 넣은 후, 20℃에서 5% 암모니아를 이용하여 pH를 7.0으로 조절하며 반응시켰다. 반응기에는 산소를 0.2vvm으로 주입하고, 반응기의 내부 압력이 1.0kgf/cm²이 되게 하였다. CPC가 완전히 전환된 후 생성물의 조성은 표 3과 같다.

화합물	조성비
CPC	0.0%
Gl-7-ACA	90.8%
5-케토아디필-7-ACA	4.6%

7.5% 과산화수소수 4.5㎖를 반응액에 가한 후, 20분동안 교반하여 5-케토아디필-7-ACA을 Gl-7-ACA로 전환시킨 후의 생성물의 조성은 표 4과 같다. Gl-7-ACA는 64.4g이 생성되었고, 반응수율은 89.9% (이하 몰수율임)이었다. 이는 CPC 배양액 대비 76.9%의 수율이다.

화합물	조성비
CPC	0.0%
Gl-7-ACA	93.9%
5-케토아디필-7-ACA	0.6%

Gl-7-ACA로의 전환이 완료된 반응액(Gl-7-ACA 24.2g/L, 2,660mL)에 Gl-7-ACA 아실라제 12.2kU을 넣고, 20℃ 대기압하에서 5% 암모니아를 이용하여 pH를 8.0으로 유지하면서 반응시켜 표 5과 같은 조성을 갖는 반응액을 얻을 수 있었다. 7-ACA는 42.5g이 생성되었고, 반응수율은 93.6%이었다. 이는 배양액대비 72.0%의 수율이다.

화합물	조성비
Gl-7-ACA	2.1%
7-ACA	94.9%

반응완료액(7-ACA 15.5g/L, 2,750mL)에 10% 염산을 가하여 pH를 3.5로 조절한 후, 여과, 진공건조 과정을 거쳐 38.9g의 7-ACA를 수득하였다. 결정화 수율은 91%이었고, 이는 배양액 대비 65.9%의 수율이다.

비교예 1. CPC 결정화 공정에 의한 7-ACA의 제조

CPC 배양액(30g/L) 3L에 15% 염산을 가하여 pH를 3.0으로 조절한 다음, 8℃에서 3시간동안 교반한 후, 다시 15% 암모니아를 가하여 pH를 7.0으로 조절하였다. 이 용액에 용액부피대비 5%(w/v)의 규조토를 넣고, 부흐너(Buchner) 판넬상에서 여과지로 여과하였다. pH 3.0으로 산성화시킨 후, 여액을 Amberlite AXD 1600 수지를 이용하여 정제한 후, 스프레이 드라이어(Spray dryer)를 이용하여 결정화하여 82g의 CPC 결정을 얻었다. CPC의 순도는 82%였다.

반응기에 75mM CPC 2,160mL(순도 82% CPC 82g을 pH 7.2인 0.1M 인산염 완충액으로 용해) DAOD 4.3kU을 넣고 교반하였다. 20℃에서 5% 암모니아를 주입하여 pH를 7.2로 조절하며 반응시켰다. 이때 산소를 0.1vvm으로 주입하고, 반응기 내부의 압력이 1kgf/cm²이 되게 하였다. CPC가 완전히 전환된 후 생성물의 조성은 표 6과 같다.

화합물	조성비
CPC	0.0%
Gl-7-ACA	91.7%
5-케토아디필-7-ACA	4.1%

7.5% 과산화수소수 4mL을 반응액에 가한 후, 20분동안 교반하여 5-케토아디필-7-ACA을 Gl-7-ACA로 전환시킨 후의 생성물의 조성은 표 7과 같다. Gl-7-ACA는 56.9g이 생성되었고, 반응수율은 91%이었다. 이는 CPC 배양액 대비 67.9%의 수율이다.

화합물	조성비
CPC	0.0%
Gl-7-ACA	94.1%
5-케토아디필-7-ACA	0.5%

Gl-7-ACA로의 전환이 완료된 반응액(Gl-7-ACA 24.3g/L, 2,340mL)에 Gl-7-ACA 아실라제 10.7kU을 넣고, 20℃ 대기압하에서 5% 암모니아를 이용하여 pH를 8.0으로 유지하였다. 7-ACA로의 반응수율은 95%이며, 용액의 조성비는 표 8과 같다. 7-ACA는 38.0g이 생성되었고, 반응수율은 94.8%이었다. 이는 배양액대비 64.4%의 수율이다.

화합물	조성비
Gl-7-ACA	1.8%
7-ACA	95.3%

반응완료액(7-ACA 15.6g/L, 2,430mL)에 10% 염산을 가하여 pH를 3.5로 조절한 후, 여과, 진공건조 과정을 거쳐 34.8g의 7-ACA 결정을 수득하였다. 결정화 수율은 91%이었고, 이는 배양액 대비 59.0%의 수율이다.

본 발명에 따라 CPC 배양액을 산성화하고 여과하여 카탈라제를 제거함으로써 결정화 공정을 거치지 않고도 높은 수율로 7-ACA를 제조할 수 있다.

Claims

(1) 세팔로스포린C 배양액과 D-아미노산옥시다아제를 반응시켜 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 제조하는 단계와 (2) 생성된 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산을 글루타릴-7-아미노세팔로스포란산 아실라제와 반응시켜 7-아미노세팔로스포란산을 제조하는 단계를 포함하는 7-아미노세팔로스포란산의 제조방법에 있어서,

상기 단계 (1)이 세팔로스포린C 배양액을 pH 1 내지 4로 산성화 한 후, 카탈라제를 여과하여 카탈라제를 제거한 후 D-아미노산옥시다아제와 반응시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 세팔로스포린C 배양액의 pH가 5.0 내지 6.0임을 특징으로 하는 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 산성화가 0 내지 20℃의 온도에서 0.5 내지 5시간에 걸쳐 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 (1)이 세팔로스포린C 배양액에서 카탈라제를 제거하고, 흡착수지 또는 이온교환수지등에 의한 정제 및 용출단계를 더 거친 후 D-아미노산옥시다아제와 반응시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법
제5항에 있어서, 상기 용출액이 인산완충액, 아세테이트 완충액, 카보네이트 완충액 또는 약알칼리성 용액인 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 용출액의 pH가 6 내지 9인 방법.
제1항, 제2항 또는 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (1)의 반응시의 pH가 6.5 내지 8.0인 방법.
제1항, 제2항 또는 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (1)의 반응시의 온도가 15 내지 30℃인 방법.
제1항, 제2항 또는 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (2)의 반응시의 pH가 7.0 내지 9.0인 방법.
제1항, 제2항 또는 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 (2)의 반응시의 온도가 15 내지 30℃인 방법.