KR20040062551A

KR20040062551A - 스트렙토마이세스 플라비도비렌스 ｄｓｍ 14455를 이용한프라바스타틴 나트륨염의 제조 방법

Info

Publication number: KR20040062551A
Application number: KR10-2004-7004495A
Authority: KR
Inventors: 구루라자라마바나; 고엘아뉴이; 스리다란마드하반; 멜라르코데라마크리쉬난사드하나; 쿨카르니마드하브; 푸르나프라즈나아차르야; 사티야나탄디프티; 가네쉬삼바시밤; 수리야나라얀슈리쿠마르
Original assignee: 바이오콘 리미티드
Priority date: 2001-09-27
Filing date: 2001-09-27
Publication date: 2004-07-07
Also published as: HU225432B1; BR0117138A; IL161079A; JP2005503174A; WO2003027302A9; US7189558B2; IL161079A0; US20040209335A1; HUP0401918A3; CA2461951A1; KR100725559B1; CA2461951C; BRPI0117138B1; EP1430138B1; MXNL04000022A; ATE316146T1; HUP0401918A2; ES2254499T3; AU2001295867A1; EP1430138A1

Abstract

본 발명은 스트렙토마이세스 플라비도비렌스의 새로운 균주를 이용하여 최적의 발효 조건 하에서 발효시킴으로써 프라바스타틴 나트륨염을 제조하는 개선된 방법을 제공한다.

Description

스트렙토마이세스 플라비도비렌스 ＤＳＭ 14455를 이용한 프라바스타틴 나트륨염의 제조 방법 {PROCESS FOR PRODUCING PRAVASTATIN SODIUM SALT USING STREPTOMYCES FLAVIDOVIRENS DSM 14455}

로바스타틴(lovastatin), 프라바스타틴, 콤팍틴(compactin), 이들의 유도체 및 동족체는 HMG-CoA 환원효소의 강력한 억제제로 알려져 있고, 콜레스테롤 과다 억제제로서 이용된다. 로바스타틴, 콤팍틴 및 프라바스타틴은 각각 아스페르질러스(Aspergillus)속, 페니실리움(Penicillium)속 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)속에 속하는 여러 가지 종의 미생물을 이용한 발효에 의해 제조된다.

안전하고 효과적인 의약품의 제조를 위해, 특히 그 의약품이 고혈장(high plasma) 콜레스테롤의 치료 또는 예방을 위해 장기적으로 복용되어야 할 경우에는 활성 성분의 순도가 중요한 인자이다. 순도가 낮은 의약품 유래의 불순물이 축적되면 의학적 치료를 진행하는 동안 많은 부작용이 초래될 수 있다.

미생물에 의해 생성되는 상기 스타틴류 중에서, 프라바스타틴은 콜레스테롤 합성에 대해 강하고 조직 선택성이 높은 억제제이므로 가장 좋은 약물이다(Tsujita et. al., Biochim Biophy Acta, 1986, 877, 50-60). 프라바스타틴은 그의 전구체인 콤팍틴(ML-236B라고도 칭함)의 미생물에 의한 하이드록시화(hydroxylation)에 의해 생성된다. 이러한 생물학적 전환은 많은 미생물에 의해 수행되는데, 그러한 미생물의 예를 들면, 스트렙토마이세스(US 5,179,013, US 4,448,979), 노카르디아(Nocardia), 아미콜라타(Amycolata), 사카로폴리스포라 (Saccharopolyspora), 아미콜라톱시스(Amycolatopsis), 사카로트릭스 (Saccharothrix), 길베르텔라 (Gilbertella)(EP 0649907, WO 99/60151), 악티노마두라(Actinomadura)(WO 96/40863), 모르티에렐라(Mortierella)(WO 00/46175), 노카르디아(Nocardia)(US 5,830,695), 및 바실러스 종(Bacillussp.)(US 6,245,535, WO 99/07827) 등이다. 스트렙토마이세스의 많은 종, 예를 들면 스트렙토마이세스 카르도필루스(S. cardophilus), 스트렙토마이세스 하스테디이(S. hastedii)(JP 4,349,034), 스트렙토마이세스 플라보비렌스(WO 99/10419), 스트렙토마이세스 로젠크로모게너스(S. rosenchromogenous)(US 4,346,227), 스트렙토마이세스 칼리포르니쿠스(S. californicus)(EP 649907) 및 스트렙토마이세스 엑스폴리아투스(S.exfoliatus)(WO 98/45410)가 이러한 생물학적 전환을 수행하는 것으로 알려져 있다.

상기 생물학적 전환은 사이토크롬 p450 의존형 시스템이며, 효소는 배지 내에 콤팍틴의 존재에 의해 유도된다(Matsuoka et al., European Journal ofBiochemistry, 1989: 184: 707-713; Serizawa et. al., In: Biotechnology of antibiotics; WR Strohl(editor) 1997). 효율적인 생물학적 전환을 위해 시드 배지에 콤팍틴을 첨가해야 하는 경우도 종종 있다(WO 98/45410). 새롭게 단일 단계로 프라바스타틴을 생성하기 위해 진균류 숙주(예; 페니실리움 시트리눔(Penicillium citrinum))에서 재조합 DNA 기술에 의해 이 시스템을 클로닝하고 발현하려는 시도가 행해져 왔다(WO 99/10499). 그러나, 수율이 경제적으로 실용성이 없다. 현재로는 스트렙토마이세스 종을 이용한 생물학적 전환이 여전히 프라바스타틴을 생성하는 가장 효율적인 방법이다.

본 발명은 신규 미생물인 스트렙토마이세스 플라비도비렌스(Streptomyces flavidovirens) BICC 6826을 사용한 프라바스타틴(Pravastatin) 나트륨염의 제조 및 정제 방법에 관한 것이다.

본 발명의 목적은 스트렙토마이세스의 신규의 균주를 이용하여 콤팍틴을 프라바스타틴 나트륨염으로 전환시키고 정제하는 효과적인 방법을 제공하는 것이다.

따라서, 본 발명은,

(i) 하기 일반식 II의 화합물을 6β-하이드록시화할 수 있는 스트렙토마이세스 플라비도비렌스 균주의 시드 접종물을 제조하는 단계:

,

(ⅱ) 상기 시드 접종물을 제조용 배지에 옮기는 단계,

(ⅲ) 상기 제조용 배지를 발효시키는 단계,

(ⅳ) 상기 제조용 배지에서 전환될 기질을 여러 가지 시간 간격으로 공급하는 단계,

(ⅴ) 발효 과정중에 탄소 공급원(carbon source)을 공급함으로써 pH를 조절하는 단계,

(ⅵ) 생물학적 전환이 완료될 때까지 상기 기질을 발효시키는 단계,

(ⅶ) 세포 배양액 전체를 추출하여 하기 일반식 I의 화합물을 분리하는 단계:

, 및

(ⅷ) 상기 일반식 I의 화합물을 단리(isolation)하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 프라바스타틴 나트륨염의 제조 및 정제 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 상기 스트렙토마이세스 플라비도비렌스 균주가 스트렙토마이세스 플라비도비렌스 BICC 6826인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법은 상기 스트렙토마이세스 플라비도비렌스 균주가 수탁번호 DSM 14455로 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH)에 기탁된 스트렙토마이세스 플라비도비렌스 균주인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법은 상기 시드용으로 사용된 상기 접종물이 포자 현탁액 또는 영양 균사체(vegetative mycelium)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법은 상기 시드 배지의 구성 성분이 맥아 추출물 및 펩톤 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법은 상기 시드 배지의 pH가 멸균 전에 6.0 내지 7.5인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법은 상기 시드 배지가 25∼35℃에서 40∼55시간 동안 배양되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법은 상기 제조용 배지의 구성 성분이 덱스트로오스 모노하이드레이트, 펩톤 및 효모 추출물 중에서 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법은 상기 제조용 배지의 pH가 멸균 전에 6.0 내지 7.5인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법은 상기 제조용 배지가 24∼35℃에서 48∼148시간 동안 배양되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법은 상기 공급되는 기질이 콤팩틴, 콤팩틴의 염 또는 콤팩틴의 유도체인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 방법은 상기 pH가 사카라이드 또는 글리세롤 중에서 선택되는 탄소 공급원을 공급함으로써 조절되는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 공개된 다른 방법에 비해 하기와 같은 이점을 갖는다:

(i) 스트렙토마이세스 플라비도비렌스 BICC 6826가 새로운 균주이다.

(ⅱ) 높은 생물학적 전환율은 공정을 경제적으로 유망하게 만든다.

(ⅲ) 단리 및 정제 단계의 공정수를 감소시키면서 순수한 제품을 얻을 수 있다.

스트렙토마이세스는 그의 사이토크롬 시스템이 충분히 연구되었기 때문에 가장 통상적으로 사용되어 왔다(EP 281245, US 5,830,695). 스트렙토마이세스 중에서 스트렙토마이세스 플라비도비렌스가 생물학적 전환에 대해 특이한 이점을 제공한다. 스트렙토마이세스 엑스포일라투스와 달리(WO 98/45410) 스트렙토마이세스 플라비도비렌스는 성장 과정(vegetative phase)중에 유도(induction)를 필요로 하지 않는다. 여기서, 생물학적 전환율은 성장 배양액에서의 콤팍틴 농도가 0.05∼10g/ℓ, 더 보편적으로 3∼6g/ℓ일 때 40% 내지 90%, 더 보편적으로는 60% 내지 80%이다.

생물학적 전환이 느려서 12일 이상의 발효로 이루어지는 종래에 공개된 많은 배양균(예; 모르티에렐라 마쿨라타(Mortierella maculata), WO 00/46175)과 달리, 스트렙토마이세스 플라비도비렌스는 24시간 내지 7일 이내, 바람직하게는 2일 내지 5일 동안에 전환이 이루어진다.

다음에 제시하는 실시예를 참고하여 본 발명을 설명한다.

실시예 1

시드 접종물 제조:

사면 배지(culture slant)에 멸균수 3㎖를 첨가하여 만든, 스트렙토마이세스 플라비도비렌스 BICC 6826의 포자 현탁액 약 100㎕를, 맥아 추출물 30g/ℓ 및 펩톤 5g/ℓ를 함유하며 멸균 처리에 앞서 pH를 6.8로 맞춘 배지 35㎖가 담긴 250㎖ 용량의 엘렌마이어 플라스크에 넣는다. 상기 시드 플라스크를 회전식 진탕기(200rpm)에서 28℃에서 48시간 동안 배양시킨다.

실시예 2

시드 접종물 제조:

포자 현탁액을 글리세롤에 저장시킨 영양 균사체 1㎖로 대체한 것 이외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 시드 접종물을 제조했다.

실시예 3

프라바스타틴으로의 생물학적 전환:

250㎖ 용량의 엘렌마이어 플라스크에서, 실시예 2로부터의 시드 접종물 약 0.5㎖를 덱스트로오스 모노하이드레이트 20g/ℓ, 펩톤 10g/ℓ 및 효모 추출물 1g/ℓ를 함유하는 제조용 배지 35㎖에 옮겼다. 접종하기 전에 배지의 pH를 7.0으로 조절하고 플라스크를 121℃에서 30분 동안 멸균했다.

이어서, 상기 플라스크를 회전식 진탕기(200rpm)에서 28℃에서 배양시켰다. 배양 진행 2일 후, 콤팩틴의 나트륨염의 멸균 용액을 멸균 포도당 공급액(50%w/v)과 함께 첨가했다. 유사한 조건 하에 배양되는 다수의 플라스크 중 하나를 수확하여 24시간 후 생물학적 전환을 추정하였다. 누적량으로 3mg/㎖의 콤팩틴이 공급될 때까지 이 절차를 24시간 마다 반복했다. 실험 종료 시에 누적되어 있는 프라바스타틴의 최대량은 약 1.5mg/㎖였다.

실시예 4

프라바스타틴으로의 생물학적 전환:

포도당 공급액 7mg/㎖를 콤팩틴 용액과 함께 24시간 마다 첨가한 것 이외에는 실시예 3과 동일한 방법으로 250㎖ 용량의 엘렌마이어 플라스크에서 생물학적 전환을 수행했다. 배양 진행 120시간 후 상기 플라스크에서 약 2.0mg/㎖의 프라바스타틴이 검출되었다.

실시예 5

프라바스타틴으로의 생물학적 전환:

1.7ℓ 배지를 수용한 2ℓ 용량의 교반탱크형 바이오리액터에서 생물학적 전환을 수행했다. 실시예 3에 기재된 배지 성분에 부가하여, 배지를 오트클레이브 처리하기 전에 0.1%(v/v)의 실리콘 소포제를 첨가했다.

시드 접종물(3.5%)을 멸균상태로 상기 바이오리액터에 옮기고 28℃에서 배양균을 성장시켰다. 용존 산소 농도는 포화치의 25% 이상으로 유지했다. 배양 진행 48시간 후, 매일 약 1mg/㎖의 콤팩틴 공급액을 첨가했다. 매회 콤팩틴 공급액과 함께 포도당 공급액도 첨가했다. 필요에 따라 포도당 공급액을 첨가함으로써 반응 혼합물의 pH를 7.6∼8.0 범위로 유지했다. 4일 경과 시점에 1.6g/ℓ의 프라바스타틴이 생성되었다.

실시예 6

프라바스타틴으로의 생물학적 전환:

콤팩틴 공급액과 함께 첨가했던 당류를 첨가하지 않는 것 이외에는 실시예 5와 동일한 방법으로 생물학적 전환을 수행했다.

매회 첨가 시에 약 0.5mg/㎖의 콤팩틴 공급액을 가했다. 필요에 따라 포도당 공급액을 첨가함으로써 반응 혼합물의 pH를 8.4∼8.6 범위로 유지했다. 발효조에 공급된 콤팩틴 2.9g/ℓ 중 약 46%가 프라바스타틴으로서 검출되었다.

실시예 7

프라바스타틴으로의 생물학적 전환:

콤팩틴을 암모늄염으로서 첨가한 것 이외에는 실시예 3과 동일한 방법으로 생물학적 전환을 수행했다. 콤팩틴 총공급액(2.9g/ℓ) 중 0.9g이 프라바스타틴으로서 분석되었다.

실시예 8

배양액의 추출:

발효 후의 세포 배양액 전부를 획득하고 pH를 12로 조절하여 1시간 동안 유지시켰다. 존재하는 총생성물의 90%가 상청액(supernatant) 중으로 추출되었다.

실시예 9

소수성 작용(hydrophobic interaction) 수지에 대한 스케일업(scale up) 연구:

소수성 작용 수지인 SP825를 XK 26/70(Pharmacia) 칼럼에 충전했다. 실시예 8로부터 pH 12에서 추출되고 여과된 배양액을 사전 평형화된 칼럼에 통과시켜 프라바스타틴을 잔류시켰다. pH 12인 물을 사용하여 세척 단계를 행하고, 메탄올로 용리시켰다. 배양액 추출물로부터 총회수율은 92%였다.

실시예 10

2급 아민을 사용한 프라바스타틴의 분리:

프라바스타틴 나트륨염 10g을 함유하는, HIC 수지로부터의 메탄올계 추출물 80ml를 묽은 HCl을 사용하여 pH 4로 산성화하고, 산 형태의 프라바스타틴을 동일 체적의 에틸아세테이트로 추출했다. 여기에 디벤질아민 120 몰%를 첨가하고 30분동안 교반한 다음, 4℃에서 1∼2시간 동안 냉각시켰다. 여과에 의해 프라바스타틴의 디벤질아민염을 분리했다. 얻어진 결정을 에틸아세테이트로 세척하고 여과 후 건조했다. 프라바스타틴산 9g 당량을 함유하는 프라바스타틴의 디벤질아민염이 얻어졌다.

실시예 11

카프릴산나트륨을 사용한 프라바스타틴의 나트륨염의 침전:

프라바스타틴의 아민염 약 5g을 건조시키고, 10% NaOH 용액 20ml에 용해하고 에틸아세테이트로 세척한 후, 묽은 염산을 사용하여 pH를 4로 조절했다. 이것을 다시 동일 체적의 에틸아세테이트로 추출했다.

상기 에틸아세테이트층을 소금물로 세척하고, 활성탄을 첨가하여 실온에서 30분간 교반했다. 활성탄을 여과하고 에틸아세테이트로 세척했다. 에틸아세테이트 용액을 무수 황산나트륨으로 건조시켰다.

상기 에틸아세테이트 용액에 카프릴산나트륨 1.2g을 첨가하고 실온에서 2시간 동안 교반했다. 이어서, 아세토니트릴 12.5ml을 가하고 1시간 동안 교반했다. 반응 혼합물을 5℃로 냉각하고 1시간 동안 교반했다.

침전물인 프라바스타틴의 나트륨염을 여과하고 냉각시킨 아세토니트릴로 세척했다. 생성물을 진공 하에 건조하여 얻어진 프라바스타틴나트륨의 수율은 90%이고 분석 결과 순도는 99% 이상이었다.

실시예 12

프라바스타틴의 정제:

50% 오르토 인산을 첨가하여 배양액(10000ℓ)을 pH=4가 되도록 산성화하고 동일 체적의 에틸아세테이트를 첨가했다. 층분리를 행하고 유기층을 물로 세척한 후, 감압 하에 농축하여 약 300ℓ의 총체적을 얻고, 환류 상태에서 24시간 동안 교반했다. 실온으로 냉각하고 5% 중탄산나트륨 용액 및 물로 세척하고, 감압 하에 125ℓ가 되도록 농축했다. 잔류물을 0℃까지 냉각하고 2시간 동안 교반했다. 얻어진 고체를 여과하여 락톤을 얻었다.

상기 단계에서 얻은 락톤 1kg에 메탄올(1ℓ) 및 10% 수산화나트륨(2ℓ)를 첨가하고 실온에서 0.5시간 동안 교반했다. 물(1ℓ) 및 에틸아세테이트(2ℓ)를 첨가하고 내용물을 실온에서 10분간 교반했다. 에틸아세테이트층을 분리하여 폐기했다. 수층의 pH를 6N HCl을 사용하여 조심스럽게 4로 조절하고 에틸아세테이트(4ℓ)로 추출했다. 층분리를 행하고, 에틸아세테이트층을 소금물로 세척하고, 활성탄을 첨가하여 여과하고 황산나트륨으로 건조시켰다. 여과액에 카프릴산나트륨(347g)을 첨가하고 내용물을 1시간 동안 교반한 후 아세토니트릴(2.5ℓ)을 가하고, 계속해서 추가로 2시간 동안 교반한 다음 0℃까지 냉각하고 고체 침전물인 프라바스타틴의 나트륨염을 여과하여 진공 하에 40℃에서 건조시켰다.

조산물(crude)인 상기 나트륨염을 물 2ℓ에 용해하고 2시간 동안에 걸쳐 아세토니트릴(30ℓ)을 가했다. 내용물을 0℃까지 냉각하고, 0℃에서 4시간 동안 교반한 후 여과하고, 고체를 아세토니트릴로 세척했다. 얻어진 고체를 진공 하에 40℃에서 건조하여 의약품 등급의 프라바스타틴 나트륨염을 얻었다.

실시예 13

프라바스타틴의 정제:

실시예 12에서 얻어진 에틸아세테이트층에 카프릴산나트륨 대신 소듐아세테이트를 첨가하고 처리함으로써 의약품 등급의 프라바스타틴 나트륨염을 얻었다.

실시예 14

프라바스타틴의 정제:

실시예 12에서와 유사한 방법으로 얻은 조산물 프라바스타틴 락톤 100g을 알칼리성 메탄올 용액 300ml에 첨가했다. 상기 용액의 pH를 4로 조절하고 프라바스타틴산을 400ml의 에틸아세테이트로 추출했다. 상기 에틸아세테이트 용액에 120 몰%의 디벤질아민을 가하고 1시간 동안 교반한 다음 4℃로 냉각하고 여과했다. 얻어진 결정을 메탄올에 용해하고, 묽은 염산으로 pH를 4로 조절한 후 에틸아세테이트로 프라바스타틴을 추출했다. 여기에 90 몰%의 카프릴산나트륨을 가하고 잘 교반했다. 상기 용액에 아세토니트릴을 첨가했을 때 나트륨염의 결정이 침전되었다. 이것을 1시간 동안 냉각시켰다. 제품 회수율은 70%였고 분석 결과 순도는 99% 이상이었다.

Claims

새로운 균주인 스트렙토마이세스 플라비도비렌스(Streptomyces flavidovirens) BICC 6826.
하기 일반식 II(식에서, R은 알칼리 금속 또는 암모늄 이온을 나타냄)의 기질 화합물로부터 하기 일반식 I의 화합물을 제조하는 미생물에 의한 제조 방법으로서,

(i) 상기 일반식 II의 화합물을 6β-하이드록시화할 수 있는 스트렙토마이세스 플라비도비렌스(Streptomyces flavidovirens) 균주의 시드 접종물(seed inoculum)을 준비하는 단계,

(ⅱ) 상기 시드 접종물을 제조용 배지에 옮기는 단계,

(ⅲ) 상기 제조용 배지를 발효시키는 단계,

(ⅳ) 상기 제조용 배지에서 전환될 기질을 여러 가지 시간 간격으로 공급하는 단계,

(ⅴ) 발효 과정중에 탄소 공급원을 공급함으로써 pH를 조절하는 단계,

(ⅵ) 생물학적 전환이 완료될 때까지 상기 기질을 발효시키는 단계,

(ⅶ) 세포 배양액 전체를 추출하여 상기 일반식 I의 화합물을 분리하는 단계, 및

(ⅷ) 상기 일반식 I의 화합물을 단리(isolation)하는 단계

를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제2항에 있어서,

상기 스트렙토마이세스 플라비도비렌스 균주가 스트렙토마이세스 플라비도비렌스 BICC 6826인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제2항에 있어서,

상기 스트렙토마이세스 플라비도비렌스 균주가 수탁번호 DSM 14455로 DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH)에 기탁된 스트렙토마이세스 플라비도비렌스 균주인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제1항에 있어서,

상기 시드용으로 사용되는 접종물이 포자 현탁액(spore suspension) 또는 영양 균사체(vegetative mycelium)인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
제1항에 있어서,

상기 영양 공급용 기질이 콤팩틴(compactin), 콤팩틴의 염 또는 콤팩틴의 유도체인 것을 특징으로 하는 제조 방법.