JP2005503174A - 放線菌ストレプトミセスflavidovirensDSM14455を用いたプラバスタチンナトリウム塩の製造方法 - Google Patents
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Abstract
本発明は、新しい菌種、放線菌ストレプトミセスflavidovirensを用いて最適な発酵パラメーターのもとで発酵によるプラバスタチンナトリウム塩製造の改良方法を提供する。
Description
【技術分野】
【0001】
本発明は、新種の微生物 放線菌ストレプトミセスflavidovirens BICC 6826を用いたプラバスタチンナトリウム塩の製造及び精製方法 に関する。
【背景技術】
【0002】
ロバスタチン、プラバスタチン、コンパクチン及びその誘導体、同族体はHMG-CoA還元酵素の薬効の高い阻害剤として知られており、抗高コレステロール血症試薬として、使用されている。ロバスタチン、プラバスタチン、コンパクチンは、それぞれ麹かびアスペルギルス、青カビペニシリウム、放線菌ストレプトミセス属に属する異なる種の微生物を使った発酵によって生産される。
【0003】
特に高血漿コレステロールの予防や治療において長期間の条件でとり続けなければならない薬の生産物において、安全で有効な薬を製造するためには、活性成分の純度は、重要な要素である。低純度の薬剤の不純物の蓄積は、薬物治療中のたくさんの副作用をもたらすかもしれない。
【0004】
微生物によって生産されたすべてのスタチンの中で、プラバスタチンは、より強い、かつコレステロール合成の高い組織選択的阻害を行う最適の薬である(Tsujita 等 Biochim Biophy Acta,1986,877,50-60)。プラバスタチンは、その前駆物質コンパクチン(ML−236Bとも呼ぶ)の微生物によるヒドロキシル化によって生産される。この生物変換は多数の微生物例えば、放線菌ストレプトミセス(US5,179,013,US4,448,979)、Nocardia、Amycolata,Saccharopolyspora,Amycolatopsis,Saccharothrix,Gibertella(EP0649907,WO 99/60151),Actinomadura(WO 96/40863),Mortierella(WO 00/46175)Norcardia(US5,830,695),Bacillus sp.(US6,245,535,WO99/07827)によっておこる。放線菌ストレプトミセスのたくさんの種例えばS.carbophilus,S.hastedii(JP4,349,034) S.flavovirens(WO99/10419), S.rosenchromogenous(US4,346,227), S.californicus(EP649907), S.exfoliatus(WO 98/45410)は、この生物変換を起こすことが知られている。
【0005】
生物変換は、チトクロームp450依存系で酵素は培地中のコンパクチンの存在によって誘導される(Matsuoka等, European Journal of Biochemistry, 1989:184:707-713, Serizawa等「抗生物質のバイオ工学」WR Strohl著 1997)。コンパクチンは、効果的な生物変換のために、よく種培地にも添加される(WO 98/45410)。プラバスタチンの生産をはじめから1ステップで行わせるために真菌類の宿主(例えば Penicillium citrinum)に組み換えDNA操作によってこのシステムを発現させ、クローン化する試みが行われた(WO 99/10499)。しかしながら生産は、経済的に実行できなかった。放線菌ストレプトミセス種を用いた生物変換は、現在の所、まだ最も効果的なプラバスタチンの生産方法である。
【発明の開示】
【0006】
現在の目的は、新しい放線菌の新株を用いて、コンパクチンの効果的変換、及び精製により、プラバスタチンナトリウム塩を提供することである。
【0007】
それゆえに本発明は、プラバスタチンナトリウム塩の製造及び精製方法を提供し、
1)式2の化合物を6βーヒドロキシル化できる放線菌ストレプトミセスflavidovirensの1菌種の種となる接種材料を準備する
2)前記種接種材料を生産培養液に植菌する
3)前記生産培養液を発酵させる
4)形質転換させる基質を異なる間隔で前記生産培養液に供給する
5)発酵の間、炭素供給源を供給する事によってPH調製を行う
6)生物変換が終わるまで基質を発酵する
7)すべてのセルブイヨンを抽出し、式1の化合物を分離する
8)式1の化合物を単離する
ことを特徴とする。
【0008】
その工程において、放線菌ストレプトミセスflavidovirens菌種は、放線菌ストレプトミセスflavidovirens BICC 6826であること。
【0009】
その工程において、放線菌ストレプトミセスflavidovirens菌種は、DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH(微生物と細胞培養のドイツの保管有限会社))に受け入れ番号DSM 14455で寄託された放線菌ストレプトミセスflavidovirensであること。
【0010】
その種として使用の前記接種材料は胞子の懸濁液か栄養菌糸体であること。
【0011】
その工程において前記種培地の成分は、麦芽エキスかペプトンから選択されること。
【0012】
その工程において前記種培地のPHは、滅菌前はPH6.0から7.5であること。
【0013】
その工程において前記種培地は、25℃から35℃において40から55時間培養されること。
【0014】
その工程において前記生産培地の成分は、ぶどう糖一水和物、ペプトン又は酵母エキスから選択されること。
【0015】
その工程において前記生産培地のPHは、滅菌前はPH6.0から7.5であること。
【0016】
その工程において前記生産培地は、24℃から35℃において48から148時間培養されること。
【0017】
その工程において供給する基質はコンパクチン、コンパクチン塩又はコンパクチン誘導体であること。
【0018】
その工程において、PH調製のために供給される炭素源はサッカライドかグリセロールから選択されること。
【0019】
本発明は、他の報告された方法に比べ、
1)放線菌ストレプトミセスflavidovirens BICC 6826の新しい菌種であること
2)工程を経済的に、魅力的にする高い生物変換率
3)純粋な生産物を得るために単離と精製の工程が少ないこと
上記のような利点を持つ。
【0020】
放線菌ストレプトミセスは、そのチトクローム系がよく研究されているため(EP 281245,US5,830,695)、最も一般的に微生物として使用されている。ストレプトミセスの中でも、S.flavidovirensは、S.exfoilatus(WO 98/45410)と違って栄養期に誘導を必要としないという生物変換において特異な利点を提供する。ここで生物変換は、コンパクチン濃度が栄養ブイヨン中0.05g/Lから10g/Lの間、多くの場合3g/Lから6g/Lの間の場合、40%から90%、多くの場合60%から80%おこる。
【0021】
先行技術(例えば、Mortielella maculata WO 00/46175)で報告された、生物変換がゆっくりで発酵が12日以上実行される多くの培養株と違って、S.flavidovirensは変換を24時間以内から7日間好ましくは2日から5日の間に実行する。
【0022】
以下に例を述べる。
【実施例1】
【0023】
[種接種材料の調製]
培養斜面へ滅菌水3mlを加えて作製した放線菌ストレプトミセスflavidovirens BICC 6826の胞子懸濁液約100μLを麦芽エキス30g/L、ペプトン5g/Lを含む培地35mlを入れた250ml三角フラスコに加え、滅菌前のPHを6.8に調製する。種フラスコをロータリーシェーカー(回転数200rpm)で48時間28℃で培養する。
【実施例2】
【0024】
[種接種材料の調製]
種接種材料は、胞子懸濁液をグリセロールに貯蔵された栄養菌糸体1mlと置き換えて実施例1と同様の方法で調製された。
【実施例3】
【0025】
[プラバスタチンの生物変換]
実施例2記載の種接種材料約0.5mlを250ml三角フラスコ中のぶどう糖一水和物20g/L、ペプトン10g/L、酵母エキス1g/Lを含む生産培地35mlに移植した。接種前に培地は、PH7,0に調製し、フラスコは121℃で30分滅菌した。
【0026】
フラスコを、ロータリーシェーカー(回転数200rpm)で28℃で培養した。培養2日後滅菌したコンパクチン水溶液のナトリウム塩を滅菌したぶどう糖飼料(50%w/v)と共に加えた。生物変換は、24時間後同条件で行った多数のフラスコの内の一つを採集することによって概算した。この操作は、累積的にコンパクチンが3mg/mlになるまで毎24時間ごとに繰り返された。この実験の終わりに、採集したプラバスタチンの最高量は、約1.5g/mlであった。
【実施例4】
【0027】
[プラバスタチンの生物変換]
24時間ごとにコンパクチン水溶液と一緒に7mg/mlのぶどう糖飼料を加えること以外は実施例3記載と同様な方法で生物変換を250ml三角フラスコ中で行った。約2.0g/mlのプラバスタチンが培養120時間後フラスコ中から得られた。
【実施例5】
【0028】
[プラバスタチンの生物変換]
生物変換を1.7Lの培地を入れた2Lの攪拌タンクバイオリアクターにて行った。実施例3に記載の培地成分に加えて、培地を高圧滅菌する前に0.1%(v/v)のシリコン泡止め剤を加えた。
【0029】
種接種材料(3.5%)は、無菌的にバイオリアクターに移植され、28℃で成長させられる。溶解酸素濃度を25%飽和以上に保った。培養48時間後約1mg/mlコンパクチン飼料を毎日加えた。コンパクチン飼料と一緒に毎回ぶどう糖飼料も加えた。反応混合物のPHは、要求があれば、ぶどう糖飼料を加えることによって7.6から8.0の間に保った。4日後1.6g/Lのプラバスタチンが生産された。
【実施例6】
【0030】
[プラバスタチンの生物変換]
生物変換をコンパクチン飼料と一緒に糖は加えないこと以外は実施例5記載と同様の方法で行った。
【0031】
約0.5mg/mlのコンパクチン飼料を、すべてのショット添加毎に加えた。反応混合物のPHは、要求があれば、ぶどう糖飼料を加えることによって8.4から8.6の間に保った。2.9g/Lのコンパクチン飼料の約46%が発酵されプラバスタチンとして得られた。
【実施例7】
【0032】
[プラバスタチンの生物変換]
生物変換をコンパクチンをアンモニウム塩として加えること以外は実施例3記載方法で行った。総コンパクチン飼料(2.9g/L)の内、0.9gがプラバスタチンとして測定された。
【実施例8】
【0033】
[ブイヨンの抽出]
すべての発酵後のセルブイヨンを手に入れ、PHを12に調節し、一時間保持した。現在の総生産物の90%は、上清に抽出された。
【実施例9】
【0034】
[疎水性相互反応樹脂上でのスケールアップ研究]
疎水性相互反応性樹脂SP825はXK26/70カラム(ファルマシア)に詰められた。実施例8でPH12で抽出され、濾過されたブイヨンを前平衡カラムを通し、プラバスタチンを捕捉した。PH12の水を用いて洗浄し、メタノール溶出を行った。ブイヨン抽出物からの総回収率は92%だった。
【実施例10】
【0035】
[2級アミンを用いたプラバスタチンの分離]
10gのプラバスタチンナトリウム塩を含むHIC樹脂のメタノール抽出物80mlを希塩酸を用いてPH4まで酸性にし、プラバスタチンの酸性型を同量の酢酸エチル中に抽出した。この中に120mole%のジベンジルアミンを加え、半時間攪拌し、4℃で1,2時間冷却した。プラバスタチンのジベンジルアミン塩は、濾過によって分離された。結晶は酢酸エチルで洗浄され、濾過し、乾燥された。9g当量のプラバスタチン酸を含むプラバスタチンのジベンジルアミン塩が得られた。
【実施例11】
【0036】
[カプリル酸ナトリウム塩を用いたプラバスタチンナトリウム塩の沈降]
プラバスタチンアミン塩の約5gを乾燥し、10%水酸化ナトリウム水溶液20mlに溶かした、酢酸エチルで洗浄し、希塩酸を用いてPH4に調節した。その後同量の酢酸エチルで抽出した。
【0037】
酢酸エチル層を食塩水で洗浄し、活性炭を加え、室温で30分攪拌した。その後濾過し、酢酸エチルで洗浄した。酢酸エチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。
【0038】
酢酸エチル溶液にカプリル酸ナトリウム塩1.2gmsを加え、室温で2時間攪拌した。その後12.5mlのアセトニトリルを加え、1時間攪拌した。反応混合物は、5℃に冷却し、1時間攪拌した。
【0039】
プラバスタチンナトリウム塩の沈殿は、濾過され冷却したアセトニトリルで洗浄した。化合物は真空乾燥され、90%の収率で99%以上の分析純度のプラバスタチンナトリウム塩を得た。
【実施例12】
【0040】
[プラバスタチンの精製]
ブイヨン(10000L)を50%オルトリン酸を加えてPH4の酸性にし、同量の酢酸エチルを加えた。層分離し、有機層を水で洗浄し減圧下でトータル量が300Lになるまで濃縮し、24時間還流して攪拌した。室温まで冷やし、5%の重炭酸ナトリウム塩水溶液で洗浄し、減圧下で125Lになるまで濃縮した。残分を0℃まで冷やし、2時間攪拌した。得られた固体を濾過して、ラクトンを得た。
【0041】
前記ステップで得られたラクトン1kgにメタノール(1L)と10%水酸化ナトリウム(2L)を加え、室温で0.5時間攪拌した。水(1L)と酢酸エチル(2L)を加え、内容物を室温で10分攪拌した。酢酸エチル層は分離し、廃棄された。水溶性層のPHは、6Nの塩酸によって注意深くPH4に調節され、酢酸エチル(4L))で抽出された。層は分離され、酢酸エチル層は食塩水で洗浄され、活性炭を加え、濾過し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記濾過物にカプリル酸ナトリウム塩(347g)を加え、内容物を1時間攪拌した。アセトニトリル(2.5L)を加え、さらに2時間攪拌を続け、0℃まで冷却し、プラバスタチンのナトリウム塩の固体沈殿物を濾過し40℃で真空乾燥した。
【0042】
粗ナトリウム塩は、2Lの水に溶かし、アセトニトリル(30L)を2時間以上かけて加えた。内容物を0℃に冷却し、0℃で4時間攪拌し、濾過し、固体をアセトニトリルで洗浄した。固体を40℃で真空乾燥し、製薬級のプラバスタチンナトリウム塩を得た。
【実施例13】
【0043】
[プラバスタチンの精製]
実施例12で得られた酢酸エチル層に、カプリル酸ナトリウム塩の代わりに酢酸ナトリウムを加え、製薬級のプラバスタチンナトリウム塩を得た。
【実施例14】
【0044】
[プラバスタチンの精製]
実施例12と同様の方法で得られた100gmの粗プラバスタチンラクトンを300mlのアルカリメタノリック溶液に加えた。溶液のPHをPH4に調節し、プラバスタチン酸は400mlの酢酸エチルに抽出された。この酢酸エチル溶液に120mole%のジベンジルアミンを加え、一時間攪拌し、4℃に冷却し、濾過した。結晶は、メタノールに溶かされ、PHは希塩酸によってPH4に調節され、プラバスタチンは、酢酸エチルへ抽出された。ここに90mole%のカプリル酸ナトリウム塩を加え、よく攪拌した。溶液にアセトニトリルを加えるとナトリウム塩の結晶が沈殿した。これを一時間冷却した。99%以上の分析純度で回収された生産物は70%であった。
【0045】
【化1】
【0046】
【化2】
【0001】
本発明は、新種の微生物 放線菌ストレプトミセスflavidovirens BICC 6826を用いたプラバスタチンナトリウム塩の製造及び精製方法 に関する。
【背景技術】
【0002】
ロバスタチン、プラバスタチン、コンパクチン及びその誘導体、同族体はHMG-CoA還元酵素の薬効の高い阻害剤として知られており、抗高コレステロール血症試薬として、使用されている。ロバスタチン、プラバスタチン、コンパクチンは、それぞれ麹かびアスペルギルス、青カビペニシリウム、放線菌ストレプトミセス属に属する異なる種の微生物を使った発酵によって生産される。
【0003】
特に高血漿コレステロールの予防や治療において長期間の条件でとり続けなければならない薬の生産物において、安全で有効な薬を製造するためには、活性成分の純度は、重要な要素である。低純度の薬剤の不純物の蓄積は、薬物治療中のたくさんの副作用をもたらすかもしれない。
【0004】
微生物によって生産されたすべてのスタチンの中で、プラバスタチンは、より強い、かつコレステロール合成の高い組織選択的阻害を行う最適の薬である(Tsujita 等 Biochim Biophy Acta,1986,877,50-60)。プラバスタチンは、その前駆物質コンパクチン(ML−236Bとも呼ぶ)の微生物によるヒドロキシル化によって生産される。この生物変換は多数の微生物例えば、放線菌ストレプトミセス(US5,179,013,US4,448,979)、Nocardia、Amycolata,Saccharopolyspora,Amycolatopsis,Saccharothrix,Gibertella(EP0649907,WO 99/60151),Actinomadura(WO 96/40863),Mortierella(WO 00/46175)Norcardia(US5,830,695),Bacillus sp.(US6,245,535,WO99/07827)によっておこる。放線菌ストレプトミセスのたくさんの種例えばS.carbophilus,S.hastedii(JP4,349,034) S.flavovirens(WO99/10419), S.rosenchromogenous(US4,346,227), S.californicus(EP649907), S.exfoliatus(WO 98/45410)は、この生物変換を起こすことが知られている。
【0005】
生物変換は、チトクロームp450依存系で酵素は培地中のコンパクチンの存在によって誘導される(Matsuoka等, European Journal of Biochemistry, 1989:184:707-713, Serizawa等「抗生物質のバイオ工学」WR Strohl著 1997)。コンパクチンは、効果的な生物変換のために、よく種培地にも添加される(WO 98/45410)。プラバスタチンの生産をはじめから1ステップで行わせるために真菌類の宿主(例えば Penicillium citrinum)に組み換えDNA操作によってこのシステムを発現させ、クローン化する試みが行われた(WO 99/10499)。しかしながら生産は、経済的に実行できなかった。放線菌ストレプトミセス種を用いた生物変換は、現在の所、まだ最も効果的なプラバスタチンの生産方法である。
【発明の開示】
【0006】
現在の目的は、新しい放線菌の新株を用いて、コンパクチンの効果的変換、及び精製により、プラバスタチンナトリウム塩を提供することである。
【0007】
それゆえに本発明は、プラバスタチンナトリウム塩の製造及び精製方法を提供し、
1)式2の化合物を6βーヒドロキシル化できる放線菌ストレプトミセスflavidovirensの1菌種の種となる接種材料を準備する
2)前記種接種材料を生産培養液に植菌する
3)前記生産培養液を発酵させる
4)形質転換させる基質を異なる間隔で前記生産培養液に供給する
5)発酵の間、炭素供給源を供給する事によってPH調製を行う
6)生物変換が終わるまで基質を発酵する
7)すべてのセルブイヨンを抽出し、式1の化合物を分離する
8)式1の化合物を単離する
ことを特徴とする。
【0008】
その工程において、放線菌ストレプトミセスflavidovirens菌種は、放線菌ストレプトミセスflavidovirens BICC 6826であること。
【0009】
その工程において、放線菌ストレプトミセスflavidovirens菌種は、DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH(微生物と細胞培養のドイツの保管有限会社))に受け入れ番号DSM 14455で寄託された放線菌ストレプトミセスflavidovirensであること。
【0010】
その種として使用の前記接種材料は胞子の懸濁液か栄養菌糸体であること。
【0011】
その工程において前記種培地の成分は、麦芽エキスかペプトンから選択されること。
【0012】
その工程において前記種培地のPHは、滅菌前はPH6.0から7.5であること。
【0013】
その工程において前記種培地は、25℃から35℃において40から55時間培養されること。
【0014】
その工程において前記生産培地の成分は、ぶどう糖一水和物、ペプトン又は酵母エキスから選択されること。
【0015】
その工程において前記生産培地のPHは、滅菌前はPH6.0から7.5であること。
【0016】
その工程において前記生産培地は、24℃から35℃において48から148時間培養されること。
【0017】
その工程において供給する基質はコンパクチン、コンパクチン塩又はコンパクチン誘導体であること。
【0018】
その工程において、PH調製のために供給される炭素源はサッカライドかグリセロールから選択されること。
【0019】
本発明は、他の報告された方法に比べ、
1)放線菌ストレプトミセスflavidovirens BICC 6826の新しい菌種であること
2)工程を経済的に、魅力的にする高い生物変換率
3)純粋な生産物を得るために単離と精製の工程が少ないこと
上記のような利点を持つ。
【0020】
放線菌ストレプトミセスは、そのチトクローム系がよく研究されているため(EP 281245,US5,830,695)、最も一般的に微生物として使用されている。ストレプトミセスの中でも、S.flavidovirensは、S.exfoilatus(WO 98/45410)と違って栄養期に誘導を必要としないという生物変換において特異な利点を提供する。ここで生物変換は、コンパクチン濃度が栄養ブイヨン中0.05g/Lから10g/Lの間、多くの場合3g/Lから6g/Lの間の場合、40%から90%、多くの場合60%から80%おこる。
【0021】
先行技術(例えば、Mortielella maculata WO 00/46175)で報告された、生物変換がゆっくりで発酵が12日以上実行される多くの培養株と違って、S.flavidovirensは変換を24時間以内から7日間好ましくは2日から5日の間に実行する。
【0022】
以下に例を述べる。
【実施例1】
【0023】
[種接種材料の調製]
培養斜面へ滅菌水3mlを加えて作製した放線菌ストレプトミセスflavidovirens BICC 6826の胞子懸濁液約100μLを麦芽エキス30g/L、ペプトン5g/Lを含む培地35mlを入れた250ml三角フラスコに加え、滅菌前のPHを6.8に調製する。種フラスコをロータリーシェーカー(回転数200rpm)で48時間28℃で培養する。
【実施例2】
【0024】
[種接種材料の調製]
種接種材料は、胞子懸濁液をグリセロールに貯蔵された栄養菌糸体1mlと置き換えて実施例1と同様の方法で調製された。
【実施例3】
【0025】
[プラバスタチンの生物変換]
実施例2記載の種接種材料約0.5mlを250ml三角フラスコ中のぶどう糖一水和物20g/L、ペプトン10g/L、酵母エキス1g/Lを含む生産培地35mlに移植した。接種前に培地は、PH7,0に調製し、フラスコは121℃で30分滅菌した。
【0026】
フラスコを、ロータリーシェーカー(回転数200rpm)で28℃で培養した。培養2日後滅菌したコンパクチン水溶液のナトリウム塩を滅菌したぶどう糖飼料(50%w/v)と共に加えた。生物変換は、24時間後同条件で行った多数のフラスコの内の一つを採集することによって概算した。この操作は、累積的にコンパクチンが3mg/mlになるまで毎24時間ごとに繰り返された。この実験の終わりに、採集したプラバスタチンの最高量は、約1.5g/mlであった。
【実施例4】
【0027】
[プラバスタチンの生物変換]
24時間ごとにコンパクチン水溶液と一緒に7mg/mlのぶどう糖飼料を加えること以外は実施例3記載と同様な方法で生物変換を250ml三角フラスコ中で行った。約2.0g/mlのプラバスタチンが培養120時間後フラスコ中から得られた。
【実施例5】
【0028】
[プラバスタチンの生物変換]
生物変換を1.7Lの培地を入れた2Lの攪拌タンクバイオリアクターにて行った。実施例3に記載の培地成分に加えて、培地を高圧滅菌する前に0.1%(v/v)のシリコン泡止め剤を加えた。
【0029】
種接種材料(3.5%)は、無菌的にバイオリアクターに移植され、28℃で成長させられる。溶解酸素濃度を25%飽和以上に保った。培養48時間後約1mg/mlコンパクチン飼料を毎日加えた。コンパクチン飼料と一緒に毎回ぶどう糖飼料も加えた。反応混合物のPHは、要求があれば、ぶどう糖飼料を加えることによって7.6から8.0の間に保った。4日後1.6g/Lのプラバスタチンが生産された。
【実施例6】
【0030】
[プラバスタチンの生物変換]
生物変換をコンパクチン飼料と一緒に糖は加えないこと以外は実施例5記載と同様の方法で行った。
【0031】
約0.5mg/mlのコンパクチン飼料を、すべてのショット添加毎に加えた。反応混合物のPHは、要求があれば、ぶどう糖飼料を加えることによって8.4から8.6の間に保った。2.9g/Lのコンパクチン飼料の約46%が発酵されプラバスタチンとして得られた。
【実施例7】
【0032】
[プラバスタチンの生物変換]
生物変換をコンパクチンをアンモニウム塩として加えること以外は実施例3記載方法で行った。総コンパクチン飼料(2.9g/L)の内、0.9gがプラバスタチンとして測定された。
【実施例8】
【0033】
[ブイヨンの抽出]
すべての発酵後のセルブイヨンを手に入れ、PHを12に調節し、一時間保持した。現在の総生産物の90%は、上清に抽出された。
【実施例9】
【0034】
[疎水性相互反応樹脂上でのスケールアップ研究]
疎水性相互反応性樹脂SP825はXK26/70カラム(ファルマシア)に詰められた。実施例8でPH12で抽出され、濾過されたブイヨンを前平衡カラムを通し、プラバスタチンを捕捉した。PH12の水を用いて洗浄し、メタノール溶出を行った。ブイヨン抽出物からの総回収率は92%だった。
【実施例10】
【0035】
[2級アミンを用いたプラバスタチンの分離]
10gのプラバスタチンナトリウム塩を含むHIC樹脂のメタノール抽出物80mlを希塩酸を用いてPH4まで酸性にし、プラバスタチンの酸性型を同量の酢酸エチル中に抽出した。この中に120mole%のジベンジルアミンを加え、半時間攪拌し、4℃で1,2時間冷却した。プラバスタチンのジベンジルアミン塩は、濾過によって分離された。結晶は酢酸エチルで洗浄され、濾過し、乾燥された。9g当量のプラバスタチン酸を含むプラバスタチンのジベンジルアミン塩が得られた。
【実施例11】
【0036】
[カプリル酸ナトリウム塩を用いたプラバスタチンナトリウム塩の沈降]
プラバスタチンアミン塩の約5gを乾燥し、10%水酸化ナトリウム水溶液20mlに溶かした、酢酸エチルで洗浄し、希塩酸を用いてPH4に調節した。その後同量の酢酸エチルで抽出した。
【0037】
酢酸エチル層を食塩水で洗浄し、活性炭を加え、室温で30分攪拌した。その後濾過し、酢酸エチルで洗浄した。酢酸エチル溶液を無水硫酸ナトリウムで乾燥した。
【0038】
酢酸エチル溶液にカプリル酸ナトリウム塩1.2gmsを加え、室温で2時間攪拌した。その後12.5mlのアセトニトリルを加え、1時間攪拌した。反応混合物は、5℃に冷却し、1時間攪拌した。
【0039】
プラバスタチンナトリウム塩の沈殿は、濾過され冷却したアセトニトリルで洗浄した。化合物は真空乾燥され、90%の収率で99%以上の分析純度のプラバスタチンナトリウム塩を得た。
【実施例12】
【0040】
[プラバスタチンの精製]
ブイヨン(10000L)を50%オルトリン酸を加えてPH4の酸性にし、同量の酢酸エチルを加えた。層分離し、有機層を水で洗浄し減圧下でトータル量が300Lになるまで濃縮し、24時間還流して攪拌した。室温まで冷やし、5%の重炭酸ナトリウム塩水溶液で洗浄し、減圧下で125Lになるまで濃縮した。残分を0℃まで冷やし、2時間攪拌した。得られた固体を濾過して、ラクトンを得た。
【0041】
前記ステップで得られたラクトン1kgにメタノール(1L)と10%水酸化ナトリウム(2L)を加え、室温で0.5時間攪拌した。水(1L)と酢酸エチル(2L)を加え、内容物を室温で10分攪拌した。酢酸エチル層は分離し、廃棄された。水溶性層のPHは、6Nの塩酸によって注意深くPH4に調節され、酢酸エチル(4L))で抽出された。層は分離され、酢酸エチル層は食塩水で洗浄され、活性炭を加え、濾過し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。前記濾過物にカプリル酸ナトリウム塩(347g)を加え、内容物を1時間攪拌した。アセトニトリル(2.5L)を加え、さらに2時間攪拌を続け、0℃まで冷却し、プラバスタチンのナトリウム塩の固体沈殿物を濾過し40℃で真空乾燥した。
【0042】
粗ナトリウム塩は、2Lの水に溶かし、アセトニトリル(30L)を2時間以上かけて加えた。内容物を0℃に冷却し、0℃で4時間攪拌し、濾過し、固体をアセトニトリルで洗浄した。固体を40℃で真空乾燥し、製薬級のプラバスタチンナトリウム塩を得た。
【実施例13】
【0043】
[プラバスタチンの精製]
実施例12で得られた酢酸エチル層に、カプリル酸ナトリウム塩の代わりに酢酸ナトリウムを加え、製薬級のプラバスタチンナトリウム塩を得た。
【実施例14】
【0044】
[プラバスタチンの精製]
実施例12と同様の方法で得られた100gmの粗プラバスタチンラクトンを300mlのアルカリメタノリック溶液に加えた。溶液のPHをPH4に調節し、プラバスタチン酸は400mlの酢酸エチルに抽出された。この酢酸エチル溶液に120mole%のジベンジルアミンを加え、一時間攪拌し、4℃に冷却し、濾過した。結晶は、メタノールに溶かされ、PHは希塩酸によってPH4に調節され、プラバスタチンは、酢酸エチルへ抽出された。ここに90mole%のカプリル酸ナトリウム塩を加え、よく攪拌した。溶液にアセトニトリルを加えるとナトリウム塩の結晶が沈殿した。これを一時間冷却した。99%以上の分析純度で回収された生産物は70%であった。
【0045】
【化1】
【0046】
【化2】
Claims (6)
- 新種の菌、放線菌ストレプトミセスflavidovirens BICC 6826。
- 請求項2記載の工程において、放線菌ストレプトミセスflavidovirens菌種は、放線菌ストレプトミセスflavidovirens BICC 6826であること。
- 請求項2記載の工程において、放線菌ストレプトミセスflavidovirens菌種は、DSMZ(Deutsche Sammlung von Mikro-organismen und Zellkulturen GmbH(微生物と細胞培養のドイツの保管有限会社))に受け入れ番号DSM 14455で寄託された放線菌ストレプトミセスflavidovirensであること。
- 請求項1記載の種として使用の前記接種材料は胞子の懸濁液か栄養菌糸体であること。
- 請求項1記載の工程において供給する基質はコンパクチン、コンパクチン塩又はコンパクチン誘導体であること。
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