DE60116787T2

DE60116787T2 - Verfahren zur herstellung von pravastatin-natriumsalz mittels streptomyces flavidovirens dsm 14455

Info

Publication number: DE60116787T2
Application number: DE60116787T
Authority: DE
Inventors: Ramavana Bangalore 561 229 GURURAJA; Anuj Bangalore 561 229 GOEL; Madhavan B angalore 561 229 SRIDHARAN; Ramakrishnan Bangalore 561 229 MELARKODE; Madhav Bangalore 561 229 KULKARNI; Acharya Bangalore 561 229 POORNAPRAJNA; Deepthy Bangalore 561 229 SATHYANATHAN; Sambasivam Bangalore 561 229 GANESH; Shrikumar Bangalore 561 229 SURYANARAYAN
Original assignee: Biocon Ltd
Current assignee: Biocon Ltd
Priority date: 2001-09-27
Filing date: 2001-09-27
Publication date: 2006-08-24
Anticipated expiration: 2021-09-28
Also published as: WO2003027302A1; ATE316146T1; HU225432B1; US20040209335A1; EP1430138B1; ES2254499T3; HUP0401918A3; HUP0401918A2; IL161079A; DE60116787D1; JP2005503174A; EP1430138A1; WO2003027302A9; BRPI0117138B1; BR0117138A; SI1430138T1; AU2001295867A1; CA2461951A1; KR20040062551A; MXNL04000022A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Pravastatin-Natriumsalz mittels eines neuen Mikroorganismus Streptomyces flavidovirens DSM 14455.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Lovastatin, Pravastatin und Compactin sowie Derivate und Analoge davon sind als potente HMG-CoA-Reductase-Inhibitoren bekannt und werden als Antihypercholesterinämie-Mittel verwendet. Lovastatin, Compactin und Pravastatin werden durch Fermentation unter Verwendung von Mikroorganismen unterschiedlicher Spezies hergestellt, die zu den Gattungen Aspergillus, Penicillium bzw. Streptomyces gehören.
Die Reinheit des aktiven Bestandteils ist ein bedeutender Faktor bei der Herstellung des sicheren und wirksamen Pharmazeutikums, insbesondere wenn das pharmazeutische Produkt bei der Behandlung oder Prävention von hohem Plasmacholesterin auf Langzeitbasis genommen werden muss. Die Akkumulation der Verunreinigungen aus den Pharmazeutika geringerer Reinheit kann viele Nebenwirkungen während der ärztlichen Behandlung verursachen.
Von allen durch Mikroorganismen produzierten Statinen ist Pravastatin das Arzneimittel der Wahl, weil es eine stärkere und hochgewebeselektive Hemmung der Cholesterinsynthese aufweist (Tsujita et al., Biochim Biophy Acta, 1986, 877, 50–60). Pravastatin wird durch mikrobielle Hydroxylierung seines Vorläufers Compactin (auch ML-236B genannt) hergestellt. Diese Bioumwandlung wird durch eine Reihe von Mikroorganismen ausgeführt, z. B. Streptomyces ( US 5,179,013 , US 4,448,979 ), Nocardia, Amycolata, Saccharopolyspora, Amycolatopsis, Saccharothrix, Gilbertella ( EP 0 649 907 , WO 99/60151), Actinomadura (WO 96/40863), Mortierella (WO 00/46175), Nocardia ( US 5,830,695 ) und Bacillus sp. ( US 6,245,535 , WO 99/07827). Eine Reihe der Spezies von Streptomyces, z. B. S. carbophilus, S. hastedii ( JP 4,349,034 ), S. flavovirens (WO 99/10419), S. rosenchromogenus ( US 4,346,227 ), S. californicus ( EP 649 907 ) und S. exfoliatus (WO 98/45410) ist dafür bekannt, diese Bioumwandlung auszuführen.
Die Bioumwandlung ist ein von Cytochrom p450 abhängiges System, und die Enzyme werden durch Anwesenheit von Compactin in dem Medium induziert (Matsuoka et al., European Journal of Biochemistry, 1989: 184: 707–713; Serizawa et al. in: Biotechnology of antibiotics; WR Strohl (Herausgeber) 1997). Für eine effiziente Bioumwandlung muss dem Impfmedium oft Compactin zugesetzt werden (WO 98/45410). Für Ein-Schritt-de-novo-Herstellung von Pravastatin sind Versuche gemacht worden, dieses System durch DNA-Rekombinationstechniken in einen Pilzwirt (z. B. Penicillium citrinum) zu klonieren und zu exprimieren (WO 99/10419). Die Erträge sind jedoch nicht wirtschaftlich lebensfähig. Bioumwandlung mittels der Spezies Streptomyces ist derzeit noch die effizienteste Methode der Pravastatin-Herstellung.
Offenbarung der Erfindung
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur effizienten Umwandlung und Reinigung von Compactin zu Pravastatin-Natrium mittels eines neuen Stammes von Streptomyces.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung von Pravastatin-Natriumsalz bereit, das gekennzeichnet ist durch:

(i) Zubereiten eines Impfinokulums eines Stammes von Streptomyces flavidovirens, der in der Lage ist, eine Verbindung der Formel II an der Position 6β zu hydroxylieren,
(ii) Übertragen dieses Impfinokulums in ein Produktionsmedium,
(iii) Aussetzen dieses Produktionsmediums an Fermentation,
(iv) Einspeisen des zu transformierenden Substrates in dieses Produktionsmedium in unterschiedlichen Intervallen,
(v) Kontrollieren des pH-Wertes während der Fermentation durch das Einspeisen von Kohlenstoffquellen,
(vi) Fermentieren des Substrates bis zum Ende der Bioumwandlung,
(vii) Extrahieren der Gesamtzellnährlösung und Abscheiden der Verbindung der Formel I, und
(viii) Isolieren der Verbindung der Formel I.

Prozess, worin der Stamm von Streptomyces flavidovirens der bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) unter der Zugangsnummer DSM 14455 hinterlegte Streptomyces-flavidovirens-Stamm ist.
Prozess, worin dieses für das Impfen verwendete Inokulum eine Sporensuspension oder ein vegetatives Myzel ist.
Prozess, worin die Komponenten dieses Impfmediums aus Malzextrakt und Pepton ausgewählt werden.
Prozess, worin der pH-Wert dieses Impfmediums vor der Sterilisation 6,0 bis 7,5 ist.
Prozess, worin das Impfmedium 40 bis 55 Std. bei 25 bis 35°C inkubiert wird.
Prozess, worin die Komponenten des Produktionsmediums aus Dextrosemonohydrat, Pepton und Hefeextrakt ausgewählt werden.
Prozess, worin dieses Produktionsmedium vor der Sterilisation einen pH-Wert von 6,0 bis 7,5 aufweist.
Prozess, worin dieses Produktionsmedium 48 bis 148 Std. bei 24 bis 35°C inkubiert wird.
Prozess, worin das für das Einspeisen verwendete Substrat Compactin, ein Compactinsalz oder ein Compactinderivat ist.
Prozess, worin der pH-Wert durch Einspeisen einer Kohlenstoffquelle, ausgewählt aus einem Saccharid oder Glycerol, kontrolliert wird.
Die vorliegende Erfindung weist gegenüber den anderen berichteten Methoden die folgenden Vorteile auf:

(i) neuer Stamm von Streptomyces flavidovirens DSM 14455;
(ii) höhere Bioumwandlungsrate, die den Prozess wirtschaftlich attraktiv macht;
(iii) weniger Schritte bei der Isolierung und Reinigung zum Erhalt des Reinproduktes.

Streptomyces ist bis jetzt der meist verbreitet verwendete Mikroorganismus, weil sein Cytochromsystem eingehend untersucht ist ( EP 281 245 , US 5,830,695 ). Von den Streptomyces bietet S. flavidovirens einen einzigartigen Vorteil bei der Bioumwandlung. Anders als S. exfoliatus (WO 98/45410) benötigt er während der vegetativen Phase keine Induktion. Dabei liegt die Bioumwandlung zwischen 40 und 90 %, aber häufiger zwischen 60 und 80 %, an den Compactinkonzentrationen in der Wachstumsnährlösung zwischen 0,05 und 10 g/l, aber häufiger zwischen 3 und 6 g/l.
Anders als viele beim Stand der Technik berichtete Kulturen (z. B. Mortierella maculata, WO 00146175), wo die Bioumwandlung langsam ist und über 12 Fermentationstage ausgeführt wird, führt S. flavidovirens die Umwandlung innerhalb von 24 Std. bis zu 7 Tagen, aber vorzugsweise in 2 bis 5 Tagen aus.
Die Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben:
Beispiel 1
Impfinokulum-Zubereitung:
Circa 100 μl Sporensuspension von Streptomyces flavidovirens DSM 14455, hergestellt durch Zufügen von 3 ml sterilem Wasser zu einer Schrägkultur, werden einem 250-ml-Erlenmeyerkolben zugegeben, der 35 ml Medium enthält, das (in g/l) Malzextrakt 30 und Pepton 5 enthält. Der pH-Wert wird vor der Sterilisation auf 6,8 eingestellt. Die Impfgutkolben werden 48 Std. bei 28°C auf einem Rundschüttler (200 U/min) inkubiert.
Beispiel 2
Impfinokulum-Zubereitung:
Impfinokulum wurde auf dieselbe Weise zubereitet wie in Beispiel 1, aber die Sporensuspension wurde durch 1 ml vegetatives Myzel, gelagert in Glycerol, ersetzt.
Beispiel 3
Bioumwandlung zu Pravastatin:
In einem 250-ml-Erlenmeyerkolben wurden ca. 0,5 ml Impfinokulum aus Beispiel 2 in 35 ml Produktionsmedium übertragen, das (in g/l) Dextrosemonohydrat 20, Pepton 10 und Hefeextrakt 1 enthielt. Vor der Beimpfung wurde der pH-Wert des Mediums auf 7,0 eingestellt, und die Kolben wurden 30 min bei 121 °C sterilisiert.
Dann wurden die Kolben auf einem Rundschüttler (200 U/min) bei 28°C inkubiert. Nach zwei Tagen Inkubation wurde steriles Natriumsalz von Compactinlösung zusammen mit steriler Dextrose-Einspeisung (50 % Gewicht pro Volumeneinheit) zugefügt. Die Bioumwandlung wurde nach 24 Std. durch Ernten eines von mehreren der unter gleichen Bedingungen laufenden Kolben bewertet. Diese Prozedur wurde alle 24 Std. wiederholt, bis 3 mg/ml Compactin kumulativ eingespeist waren. Die maximal am Ende des Experimentes akkumulierte Menge Pravastatin betrug ca. 1,5 mg/ml.
Beispiel 4
Bioumwandlung zu Pravastatin:
Die Bioumwandlung wurde in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben auf dieselbe Weise ausgeführt, wie in Beispiel 3 beschrieben, aber es wurden alle 24 Std. 7 mg/ml Dextrose-Einspeisung zusammen mit Compactinlösung zugefügt. Nach 120 Std. Inkubation wurden ca. 2,0 mg/ml Pravastatin in den Kolben nachgewiesen.
Beispiel 5
Bioumwandlung zu Pravastatin:
Die Bioumwandlung wurde in einem 2-1-Rührkesselbioreaktor mit 1,7 l Medium ausgeführt. Zusätzlich zu den in Beispiel 3 beschriebenen Mediumkomponenten wurde vor Autoklavieren des Mediums 0,1 % (Volumen pro Volumeneinheit) Silikonentschäumer zugefügt.
Impfinokulum (3,5 %) wurde aseptisch in den Bioreaktor übertragen und die Kultur bei 28°C wachsen gelassen. Die gelöste Sauerstoffkonzentration wurde über 25 % Sättigung gehalten. Nach 48 Std. Inkubation wurde jeden Tag ca. 1 mg/ml Compactin-Einspeisung zugefügt. Zusammen mit jeder Compactin-Einspeisung wurde auch Dextrose-Einspeisung zugefügt. Der pH-Wert des Reaktionsgemischs wurde durch bedarfsweise Zugabe von Dextrose-Einspeisung zwischen 7,6 und 8,0 gehalten. Nach Ablauf von 4 Tagen waren 1,6 g/l Pravastatin hergestellt.
Beispiel 6
Bioumwandlung zu Pravastatin:
Die Bioumwandlung wurde auf die gleiche Weise ausgeführt wie in Beispiel 5, aber kein Zucker zusammen mit der Compactin-Einspeisung zugefügt.
Bei jeder Shot-Addition wurden ca. 0,5 mg/ml Compactin-Einspeisung zugefügt. Der pH-Wert des Reaktionsgemischs wurde durch bedarfsweise Zugabe von Dextrose-Einspeisung zwischen 8,4 und 8,6 gehalten. Circa 46 % der dem Fermentor eingespeisten 2,9 g/l Compactin wurden als Pravastatin nachgewiesen.
Beispiel 7
Bioumwandlung zu Pravastatin:
Die Bioumwandlung wurde ausgeführt, wie in Beispiel 3 beschrieben, aber das Compactin wurde als Ammoniumsalz zugegeben. 0,9 g des gesamten eingespeisten Compactins (2,9 g/l) wurden als Pravastatin bestimmt.
Beispiel 8
Extraktion von Nährlösung:
Die Gesamtzellnährlösung nach der Fermentation wurde gewonnen und der pH-Wert auf 12 eingestellt und 1 Std. lang gehalten. 90 % des gesamten vorhandenen Produktes wurden in den Überstand extrahiert.
Beispiel 9
Scale-up-Studien an hydrophobem Wechselwirkungsharz:
Ein hydrophobes Wechselwirkungsharz – SP825 (MITSUBISHI CHEMICAL CORPORATION) wurde in eine XK26/70-(Pharmacia-)Säule gepackt. Die extrahierte und gefilterte Nährlösung mit dem pH-Wert 12 aus Beispiel 8 wurde durch eine voräquilibrierte Säule passiert, und Pravastatin wurde gebunden. Der Waschschritt wurde mittels Wasser mit dem pH-Wert 12 durchgeführt. Die Elution erfolgte mit Methanol. Die Gesamtausbeute aus dem Nährlösungsextrakt betrug 92 %.
Beispiel 10
Abscheidung von Pravastatin unter Verwendung von sekundärem Amin:
80 ml methanolischer Extrakt aus dem HIC-(hydrophobe Interaktionschromatographie-)Harz, das 10 g Pravastatin-Natriumsalz enthielt, wurde unter Verwendung von verdünntem HCl auf den sauren pH-Wert 4 eingestellt, und das Pravastatin wurde in der sauren Form in die gleiche Menge Ethylacetat extrahiert.
Dazu wurden 120 Mol-% eines Dibenzylamins zugefügt, eine halbe Stunde lang gerührt und dann 1–2 Std. bei 4°C abgekühlt. Das Dibenzylaminsalz von Pravastatin wurde durch Filtration abgeschieden. Die Kristalle wurden mit Ethylacetat gewaschen, gefiltert und getrocknet. Es wurde Dibenzylaminsalz von Pravastatin gewonnen, das 9 g Pravastatinsäure-Äquivalent enthielt.
Beispiel 11
Fällung von Natriumsalz des Pravastatins mittels Natriumcaprylat:
Ungefähr 5 g Aminsalz von Pravastatin wurden getrocknet und in 20 ml 10%iger NaOH-Lösung gelöst und mit Ethylacetat gewaschen und mittels verdünnter Salzsäure auf pH 4 eingestellt. Diese wurde weiter in die gleiche Menge Ethylacetat extrahiert.
Die Ethylacetatschicht wurde mit Sole gewaschen, aktivierter Kohlenstoff zugefügt und 30 min lang bei Raumtemperatur gerührt. Sie wurde gefiltert und mit Ethylacetat gewaschen. Die Ethylacetatlösung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.
Der Ethylacetatlösung wurden 1,2 g Natriumcaprylat zugefügt und 2 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Dann wurden 12,5 ml Acetonitril zugesetzt und 1 Std. lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 5°C abgekühlt und 1 Std. lang gerührt.
Das Präzipitat des Natriumsalzes von Pravastatin wurde gefiltert und mit abgekühltem Acetonitril gewaschen. Die Verbindung wurde unter Vakuum getrocknet, um Pravastatin-Natrium mit einer Ausbeute von 90 % und einer Nachweisreinheit von mehr als 99 % zu gewinnen.
Beispiel 12
Reinigung von Pravastatin:
Die Nährlösung (10000 l) wurde durch Zugeben von 50 % Orthophosphorsäure auf den sauren pH-Wert 4 eingestellt und die gleiche Menge Ethylacetat zugefügt. Die Schichten wurden getrennt, und die organische Schicht wurde mit Wasser gewaschen und mit Unterdruck bis zu einem Gesamtvolumen von ca. 300 l konzentriert und unter Rückfluss 24 Std. lang gerührt. Abkühlen auf Raumtemperatur und mit 5 % Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen, Wässern und mit Unterdruck auf 125 l konzentriert. Der Rückstand wurde auf 0°C abgekühlt und 2 Std. lang gerührt. Die erhaltene Trockenmasse wurde gefiltert, um das Lacton zu ergeben.
Zu 1 kg des ausgehend von dem obigen Schritt erhaltenen Lactons wurden Methanol (1 l) und 10%iges Natriumhydroxid (2 l) gegeben und 0,5 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Wasser (1 l) und Ethylacetat (2 l) wurden zugefügt und die Inhaltsstoffe 10 min lang bei Raumtemperatur gerührt. Die Ethylacetatschicht wurde abgetrennt und verworfen. Der pH-Wert der wässrigen Schicht wurde mittels 6N HCl vorsichtig auf 4 eingestellt und mit Ethylacetat (4 l) extrahiert. Die Schichten wurden getrennt, die Ethylacetatschicht wurde mit Sole gewaschen, Aktivkohle zugefügt, gefiltert und über Natriumsulfat getrocknet. Dem Filtrat wurde Natriumcaprylat (347 g) zugesetzt und die Inhaltsstoffe 1 Std. lang gerührt, und Acetonitril (2,5 l) wurde zugegeben und der Rührvorgang weitere 2 Std. fortgesetzt, auf 0°C abgekühlt, und der Feststoffniederschlag des Natriumsalzes von Pravastatin wurde gefiltert und bei 40°C unter Vakuum getrocknet.
Das Rohnatriumsalz wurde in 2 l Wasser gelöst und über einen Zeitraum von 2 Std. Acetonitril zugegeben (30 l). Die Inhaltsstoffe wurden auf 0°C abgekühlt und 4 Std. bei 0°C gerührt, gefiltert, und die Trockenmasse wurde mit Acetonitril gewaschen. Die Trockenmasse wurde bei 40°C unter Vakuum getrocknet, um Pravastatin-Natriumsalz pharmazeutischer Qualität zu ergeben.
Beispiel 13
Reinigung von Pravastatin:
Der wie in Beispiel 12 erhaltenen Ethylacetatschicht wurde Natriumacetat anstelle von Natriumcaprylat zugegeben und bearbeitet, um Pravastatin-Natriumsalz pharmazeutischer Qualität zu ergeben.
Beispiel 14
Reinigung von Pravastatin:
100 g Rohpravastatinlacton, das auf ähnliche Weise wie in Beispiel 12 erhalten wurde, wurden zu 300 ml alkalischer methanolischer Lösung gegeben. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 4 eingestellt, und die Pravastatinsäure wurde in 400 ml Ethylacetat extrahiert. Dieser Ethylacetatlösung wurden 120 Mol-% Dibenzylamin zugesetzt, 1 Std. lang gerührt und bei 4°C abgekühlt und gefiltert. Die Kristalle wurden in Methanol gelöst, der pH-Wert durch verdünnte Salzsäure auf 4 eingestellt, und Pravastatin wurde in Ethylacetat extrahiert.
Dazu wurden 90 Mol-% Natriumcaprylat gegeben und gut umgerührt. Kristalle des Natriumsalzes wurden ausgefällt, als Acetonitril zu der Lösung gegeben wurde. Diese wurde 1 Std. lang abgekühlt. Das rückgewonnene Produkt betrug 70 % mit mehr als 99 % Nachweisreinheit.

Claims

Einen Stamm Streptomyces flavidovirens DSM 14455.
Einen mikrobiologischen Prozess für die Zubereitung der Verbindung der Formel I aus einer Substratverbindung der allgemeinen Formel II, worin R für ein Alkalimetall oder Ammoniumion steht, umfassend die folgenden Schritte: (i) Zubereiten eines Impfinokulums eines Stammes von Streptomyces flavidovirens, der in der Lage ist, eine Verbindung der Formel II an der Position 6β zu hydroxylieren,
(ii) Übertragen dieses Impfinokulums in ein Produktionsmedium, (iii) Aussetzen dieses Produktionsmediums an Fermentation, (iv) Einspeisen des zu transformierenden Substrates in dieses Produktionsmedium in unterschiedlichen Intervallen, (v) Kontrollieren des pH-Wertes während der Fermentation durch das Einspeisen von Kohlenstoffquellen, (vi) Fermentieren des Substrates bis zu dem Ende der Bioumwandlung, (vii) Extrahieren der Gesamtzellnährlösung und Abscheiden der Verbindung der Formel I, und (viii) Isolieren der Verbindung der Formel I.
Prozess nach Anspruch 2, worin der Stamm von Streptomyces flavidovirens der bei der DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) unter der Zugangsnummer DSM 14455 hinterlegte Streptomyces-flavidovirens-Stamm ist.
Prozess nach Anspruch 2, worin dieses für das Impfen verwendete Inokulum eine Sporensuspension oder ein vegetatives Myzel ist.
Prozess nach Anspruch 2, worin das für das Einspeisen verwendete Substrat Compactin, ein Compactinsalz oder ein Compactinderivat ist.