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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung
und Reinigung von Pravastatin-Natriumsalz mittels eines neuen Mikroorganismus
Streptomyces flavidovirens DSM 14455.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Lovastatin,
Pravastatin und Compactin sowie Derivate und Analoge davon sind
als potente HMG-CoA-Reductase-Inhibitoren bekannt und werden als
Antihypercholesterinämie-Mittel
verwendet. Lovastatin, Compactin und Pravastatin werden durch Fermentation
unter Verwendung von Mikroorganismen unterschiedlicher Spezies hergestellt,
die zu den Gattungen Aspergillus, Penicillium bzw. Streptomyces
gehören.
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Die
Reinheit des aktiven Bestandteils ist ein bedeutender Faktor bei
der Herstellung des sicheren und wirksamen Pharmazeutikums, insbesondere
wenn das pharmazeutische Produkt bei der Behandlung oder Prävention
von hohem Plasmacholesterin auf Langzeitbasis genommen werden muss.
Die Akkumulation der Verunreinigungen aus den Pharmazeutika geringerer
Reinheit kann viele Nebenwirkungen während der ärztlichen Behandlung verursachen.
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Von
allen durch Mikroorganismen produzierten Statinen ist Pravastatin
das Arzneimittel der Wahl, weil es eine stärkere und hochgewebeselektive
Hemmung der Cholesterinsynthese aufweist (Tsujita et al., Biochim Biophy
Acta, 1986, 877, 50–60).
Pravastatin wird durch mikrobielle Hydroxylierung seines Vorläufers Compactin
(auch ML-236B genannt) hergestellt. Diese Bioumwandlung wird durch
eine Reihe von Mikroorganismen ausgeführt, z. B. Streptomyces (
US 5,179,013 ,
US 4,448,979 ), Nocardia, Amycolata,
Saccharopolyspora, Amycolatopsis, Saccharothrix, Gilbertella (
EP 0 649 907 , WO 99/60151),
Actinomadura (WO 96/40863), Mortierella (WO 00/46175), Nocardia
(
US 5,830,695 ) und Bacillus
sp. (
US 6,245,535 , WO
99/07827). Eine Reihe der Spezies von Streptomyces, z. B. S. carbophilus,
S. hastedii (
JP 4,349,034 ),
S. flavovirens (WO 99/10419), S. rosenchromogenus (
US 4,346,227 ), S. californicus (
EP 649 907 ) und S. exfoliatus
(WO 98/45410) ist dafür bekannt,
diese Bioumwandlung auszuführen.
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Die
Bioumwandlung ist ein von Cytochrom p450 abhängiges System, und die Enzyme
werden durch Anwesenheit von Compactin in dem Medium induziert (Matsuoka
et al., European Journal of Biochemistry, 1989: 184: 707–713; Serizawa
et al. in: Biotechnology of antibiotics; WR Strohl (Herausgeber)
1997). Für
eine effiziente Bioumwandlung muss dem Impfmedium oft Compactin
zugesetzt werden (WO 98/45410). Für Ein-Schritt-de-novo-Herstellung von Pravastatin
sind Versuche gemacht worden, dieses System durch DNA-Rekombinationstechniken
in einen Pilzwirt (z. B. Penicillium citrinum) zu klonieren und
zu exprimieren (WO 99/10419). Die Erträge sind jedoch nicht wirtschaftlich
lebensfähig.
Bioumwandlung mittels der Spezies Streptomyces ist derzeit noch
die effizienteste Methode der Pravastatin-Herstellung.
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Offenbarung
der Erfindung
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Aufgabe
der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens
zur effizienten Umwandlung und Reinigung von Compactin zu Pravastatin-Natrium
mittels eines neuen Stammes von Streptomyces.
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Demgemäß stellt
die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung und Reinigung
von Pravastatin-Natriumsalz bereit, das gekennzeichnet ist durch:
- (i) Zubereiten eines Impfinokulums eines Stammes
von Streptomyces flavidovirens, der in der Lage ist, eine Verbindung
der Formel II an der Position 6β zu
hydroxylieren,
- (ii) Übertragen
dieses Impfinokulums in ein Produktionsmedium,
- (iii) Aussetzen dieses Produktionsmediums an Fermentation,
- (iv) Einspeisen des zu transformierenden Substrates in dieses
Produktionsmedium in unterschiedlichen Intervallen,
- (v) Kontrollieren des pH-Wertes während der Fermentation durch
das Einspeisen von Kohlenstoffquellen,
- (vi) Fermentieren des Substrates bis zum Ende der Bioumwandlung,
- (vii) Extrahieren der Gesamtzellnährlösung und Abscheiden der Verbindung
der Formel I, und
- (viii) Isolieren der Verbindung der Formel I.
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Prozess,
worin der Stamm von Streptomyces flavidovirens der bei der DSMZ
(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) unter
der Zugangsnummer DSM 14455 hinterlegte Streptomyces-flavidovirens-Stamm
ist.
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Prozess,
worin dieses für
das Impfen verwendete Inokulum eine Sporensuspension oder ein vegetatives
Myzel ist.
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Prozess,
worin die Komponenten dieses Impfmediums aus Malzextrakt und Pepton
ausgewählt
werden.
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Prozess,
worin der pH-Wert dieses Impfmediums vor der Sterilisation 6,0 bis
7,5 ist.
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Prozess,
worin das Impfmedium 40 bis 55 Std. bei 25 bis 35°C inkubiert
wird.
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Prozess,
worin die Komponenten des Produktionsmediums aus Dextrosemonohydrat,
Pepton und Hefeextrakt ausgewählt
werden.
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Prozess,
worin dieses Produktionsmedium vor der Sterilisation einen pH-Wert
von 6,0 bis 7,5 aufweist.
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Prozess,
worin dieses Produktionsmedium 48 bis 148 Std. bei 24 bis 35°C inkubiert
wird.
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Prozess,
worin das für
das Einspeisen verwendete Substrat Compactin, ein Compactinsalz
oder ein Compactinderivat ist.
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Prozess,
worin der pH-Wert durch Einspeisen einer Kohlenstoffquelle, ausgewählt aus
einem Saccharid oder Glycerol, kontrolliert wird.
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Die
vorliegende Erfindung weist gegenüber den anderen berichteten
Methoden die folgenden Vorteile auf:
- (i) neuer
Stamm von Streptomyces flavidovirens DSM 14455;
- (ii) höhere
Bioumwandlungsrate, die den Prozess wirtschaftlich attraktiv macht;
- (iii) weniger Schritte bei der Isolierung und Reinigung zum
Erhalt des Reinproduktes.
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Streptomyces
ist bis jetzt der meist verbreitet verwendete Mikroorganismus, weil
sein Cytochromsystem eingehend untersucht ist (
EP 281 245 ,
US 5,830,695 ). Von den Streptomyces
bietet S. flavidovirens einen einzigartigen Vorteil bei der Bioumwandlung.
Anders als S. exfoliatus (WO 98/45410) benötigt er während der vegetativen Phase
keine Induktion. Dabei liegt die Bioumwandlung zwischen 40 und 90
%, aber häufiger
zwischen 60 und 80 %, an den Compactinkonzentrationen in der Wachstumsnährlösung zwischen
0,05 und 10 g/l, aber häufiger
zwischen 3 und 6 g/l.
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Anders
als viele beim Stand der Technik berichtete Kulturen (z. B. Mortierella
maculata, WO 00146175), wo die Bioumwandlung langsam ist und über 12 Fermentationstage
ausgeführt
wird, führt
S. flavidovirens die Umwandlung innerhalb von 24 Std. bis zu 7 Tagen,
aber vorzugsweise in 2 bis 5 Tagen aus.
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Die
Erfindung wird nun mit Bezug auf die folgenden Beispiele beschrieben:
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Beispiel 1
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Impfinokulum-Zubereitung:
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Circa
100 μl Sporensuspension
von Streptomyces flavidovirens DSM 14455, hergestellt durch Zufügen von
3 ml sterilem Wasser zu einer Schrägkultur, werden einem 250-ml-Erlenmeyerkolben
zugegeben, der 35 ml Medium enthält,
das (in g/l) Malzextrakt 30 und Pepton 5 enthält. Der pH-Wert wird vor der
Sterilisation auf 6,8 eingestellt. Die Impfgutkolben werden 48 Std.
bei 28°C
auf einem Rundschüttler
(200 U/min) inkubiert.
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Beispiel 2
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Impfinokulum-Zubereitung:
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Impfinokulum
wurde auf dieselbe Weise zubereitet wie in Beispiel 1, aber die
Sporensuspension wurde durch 1 ml vegetatives Myzel, gelagert in
Glycerol, ersetzt.
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Beispiel 3
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Bioumwandlung zu Pravastatin:
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In
einem 250-ml-Erlenmeyerkolben wurden ca. 0,5 ml Impfinokulum aus
Beispiel 2 in 35 ml Produktionsmedium übertragen, das (in g/l) Dextrosemonohydrat
20, Pepton 10 und Hefeextrakt 1 enthielt. Vor der Beimpfung wurde
der pH-Wert des Mediums auf 7,0 eingestellt, und die Kolben wurden
30 min bei 121 °C
sterilisiert.
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Dann
wurden die Kolben auf einem Rundschüttler (200 U/min) bei 28°C inkubiert.
Nach zwei Tagen Inkubation wurde steriles Natriumsalz von Compactinlösung zusammen
mit steriler Dextrose-Einspeisung (50 % Gewicht pro Volumeneinheit)
zugefügt.
Die Bioumwandlung wurde nach 24 Std. durch Ernten eines von mehreren
der unter gleichen Bedingungen laufenden Kolben bewertet. Diese
Prozedur wurde alle 24 Std. wiederholt, bis 3 mg/ml Compactin kumulativ
eingespeist waren. Die maximal am Ende des Experimentes akkumulierte
Menge Pravastatin betrug ca. 1,5 mg/ml.
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Beispiel 4
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Bioumwandlung zu Pravastatin:
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Die
Bioumwandlung wurde in einem 250-ml-Erlenmeyerkolben auf dieselbe
Weise ausgeführt,
wie in Beispiel 3 beschrieben, aber es wurden alle 24 Std. 7 mg/ml
Dextrose-Einspeisung
zusammen mit Compactinlösung
zugefügt.
Nach 120 Std. Inkubation wurden ca. 2,0 mg/ml Pravastatin in den
Kolben nachgewiesen.
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Beispiel 5
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Bioumwandlung zu Pravastatin:
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Die
Bioumwandlung wurde in einem 2-1-Rührkesselbioreaktor mit 1,7
l Medium ausgeführt.
Zusätzlich zu
den in Beispiel 3 beschriebenen Mediumkomponenten wurde vor Autoklavieren
des Mediums 0,1 % (Volumen pro Volumeneinheit) Silikonentschäumer zugefügt.
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Impfinokulum
(3,5 %) wurde aseptisch in den Bioreaktor übertragen und die Kultur bei
28°C wachsen gelassen.
Die gelöste
Sauerstoffkonzentration wurde über
25 % Sättigung
gehalten. Nach 48 Std. Inkubation wurde jeden Tag ca. 1 mg/ml Compactin-Einspeisung zugefügt. Zusammen
mit jeder Compactin-Einspeisung wurde auch Dextrose-Einspeisung
zugefügt.
Der pH-Wert des Reaktionsgemischs wurde durch bedarfsweise Zugabe
von Dextrose-Einspeisung zwischen 7,6 und 8,0 gehalten. Nach Ablauf
von 4 Tagen waren 1,6 g/l Pravastatin hergestellt.
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Beispiel 6
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Bioumwandlung zu Pravastatin:
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Die
Bioumwandlung wurde auf die gleiche Weise ausgeführt wie in Beispiel 5, aber
kein Zucker zusammen mit der Compactin-Einspeisung zugefügt.
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Bei
jeder Shot-Addition wurden ca. 0,5 mg/ml Compactin-Einspeisung zugefügt. Der
pH-Wert des Reaktionsgemischs wurde durch bedarfsweise Zugabe von
Dextrose-Einspeisung zwischen 8,4 und 8,6 gehalten. Circa 46 % der
dem Fermentor eingespeisten 2,9 g/l Compactin wurden als Pravastatin
nachgewiesen.
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Beispiel 7
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Bioumwandlung zu Pravastatin:
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Die
Bioumwandlung wurde ausgeführt,
wie in Beispiel 3 beschrieben, aber das Compactin wurde als Ammoniumsalz
zugegeben. 0,9 g des gesamten eingespeisten Compactins (2,9 g/l)
wurden als Pravastatin bestimmt.
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Beispiel 8
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Extraktion von Nährlösung:
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Die
Gesamtzellnährlösung nach
der Fermentation wurde gewonnen und der pH-Wert auf 12 eingestellt und
1 Std. lang gehalten. 90 % des gesamten vorhandenen Produktes wurden
in den Überstand
extrahiert.
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Beispiel 9
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Scale-up-Studien an hydrophobem
Wechselwirkungsharz:
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Ein
hydrophobes Wechselwirkungsharz – SP825 (MITSUBISHI CHEMICAL
CORPORATION) wurde in eine XK26/70-(Pharmacia-)Säule gepackt. Die extrahierte
und gefilterte Nährlösung mit
dem pH-Wert 12 aus Beispiel 8 wurde durch eine voräquilibrierte
Säule passiert,
und Pravastatin wurde gebunden. Der Waschschritt wurde mittels Wasser
mit dem pH-Wert 12 durchgeführt.
Die Elution erfolgte mit Methanol. Die Gesamtausbeute aus dem Nährlösungsextrakt
betrug 92 %.
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Beispiel 10
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Abscheidung von Pravastatin
unter Verwendung von sekundärem
Amin:
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80
ml methanolischer Extrakt aus dem HIC-(hydrophobe Interaktionschromatographie-)Harz,
das 10 g Pravastatin-Natriumsalz enthielt, wurde unter Verwendung
von verdünntem
HCl auf den sauren pH-Wert 4 eingestellt, und das Pravastatin wurde
in der sauren Form in die gleiche Menge Ethylacetat extrahiert.
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Dazu
wurden 120 Mol-% eines Dibenzylamins zugefügt, eine halbe Stunde lang
gerührt
und dann 1–2 Std.
bei 4°C
abgekühlt.
Das Dibenzylaminsalz von Pravastatin wurde durch Filtration abgeschieden.
Die Kristalle wurden mit Ethylacetat gewaschen, gefiltert und getrocknet.
Es wurde Dibenzylaminsalz von Pravastatin gewonnen, das 9 g Pravastatinsäure-Äquivalent
enthielt.
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Beispiel 11
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Fällung von Natriumsalz des Pravastatins
mittels Natriumcaprylat:
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Ungefähr 5 g Aminsalz
von Pravastatin wurden getrocknet und in 20 ml 10%iger NaOH-Lösung gelöst und mit Ethylacetat gewaschen
und mittels verdünnter
Salzsäure
auf pH 4 eingestellt. Diese wurde weiter in die gleiche Menge Ethylacetat
extrahiert.
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Die
Ethylacetatschicht wurde mit Sole gewaschen, aktivierter Kohlenstoff
zugefügt
und 30 min lang bei Raumtemperatur gerührt. Sie wurde gefiltert und
mit Ethylacetat gewaschen. Die Ethylacetatlösung wurde über wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet.
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Der
Ethylacetatlösung
wurden 1,2 g Natriumcaprylat zugefügt und 2 Std. bei Raumtemperatur
gerührt. Dann
wurden 12,5 ml Acetonitril zugesetzt und 1 Std. lang gerührt. Das
Reaktionsgemisch wurde auf 5°C
abgekühlt
und 1 Std. lang gerührt.
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Das
Präzipitat
des Natriumsalzes von Pravastatin wurde gefiltert und mit abgekühltem Acetonitril
gewaschen. Die Verbindung wurde unter Vakuum getrocknet, um Pravastatin-Natrium mit einer
Ausbeute von 90 % und einer Nachweisreinheit von mehr als 99 % zu
gewinnen.
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Beispiel 12
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Reinigung von Pravastatin:
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Die
Nährlösung (10000
l) wurde durch Zugeben von 50 % Orthophosphorsäure auf den sauren pH-Wert
4 eingestellt und die gleiche Menge Ethylacetat zugefügt. Die
Schichten wurden getrennt, und die organische Schicht wurde mit
Wasser gewaschen und mit Unterdruck bis zu einem Gesamtvolumen von
ca. 300 l konzentriert und unter Rückfluss 24 Std. lang gerührt. Abkühlen auf
Raumtemperatur und mit 5 % Natriumhydrogencarbonat-Lösung gewaschen, Wässern und
mit Unterdruck auf 125 l konzentriert. Der Rückstand wurde auf 0°C abgekühlt und
2 Std. lang gerührt.
Die erhaltene Trockenmasse wurde gefiltert, um das Lacton zu ergeben.
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Zu
1 kg des ausgehend von dem obigen Schritt erhaltenen Lactons wurden
Methanol (1 l) und 10%iges Natriumhydroxid (2 l) gegeben und 0,5
Std. bei Raumtemperatur gerührt.
Wasser (1 l) und Ethylacetat (2 l) wurden zugefügt und die Inhaltsstoffe 10
min lang bei Raumtemperatur gerührt.
Die Ethylacetatschicht wurde abgetrennt und verworfen. Der pH-Wert der wässrigen
Schicht wurde mittels 6N HCl vorsichtig auf 4 eingestellt und mit
Ethylacetat (4 l) extrahiert. Die Schichten wurden getrennt, die
Ethylacetatschicht wurde mit Sole gewaschen, Aktivkohle zugefügt, gefiltert
und über
Natriumsulfat getrocknet. Dem Filtrat wurde Natriumcaprylat (347
g) zugesetzt und die Inhaltsstoffe 1 Std. lang gerührt, und
Acetonitril (2,5 l) wurde zugegeben und der Rührvorgang weitere 2 Std. fortgesetzt,
auf 0°C
abgekühlt,
und der Feststoffniederschlag des Natriumsalzes von Pravastatin
wurde gefiltert und bei 40°C
unter Vakuum getrocknet.
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Das
Rohnatriumsalz wurde in 2 l Wasser gelöst und über einen Zeitraum von 2 Std.
Acetonitril zugegeben (30 l). Die Inhaltsstoffe wurden auf 0°C abgekühlt und
4 Std. bei 0°C
gerührt,
gefiltert, und die Trockenmasse wurde mit Acetonitril gewaschen.
Die Trockenmasse wurde bei 40°C
unter Vakuum getrocknet, um Pravastatin-Natriumsalz pharmazeutischer
Qualität
zu ergeben.
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Beispiel 13
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Reinigung von Pravastatin:
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Der
wie in Beispiel 12 erhaltenen Ethylacetatschicht wurde Natriumacetat
anstelle von Natriumcaprylat zugegeben und bearbeitet, um Pravastatin-Natriumsalz
pharmazeutischer Qualität
zu ergeben.
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Beispiel 14
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Reinigung von Pravastatin:
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100
g Rohpravastatinlacton, das auf ähnliche
Weise wie in Beispiel 12 erhalten wurde, wurden zu 300 ml alkalischer
methanolischer Lösung
gegeben. Der pH-Wert der Lösung
wurde auf 4 eingestellt, und die Pravastatinsäure wurde in 400 ml Ethylacetat
extrahiert. Dieser Ethylacetatlösung
wurden 120 Mol-% Dibenzylamin zugesetzt, 1 Std. lang gerührt und
bei 4°C
abgekühlt
und gefiltert. Die Kristalle wurden in Methanol gelöst, der
pH-Wert durch verdünnte
Salzsäure
auf 4 eingestellt, und Pravastatin wurde in Ethylacetat extrahiert.
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Dazu
wurden 90 Mol-% Natriumcaprylat gegeben und gut umgerührt. Kristalle
des Natriumsalzes wurden ausgefällt,
als Acetonitril zu der Lösung
gegeben wurde. Diese wurde 1 Std. lang abgekühlt. Das rückgewonnene Produkt betrug
70 % mit mehr als 99 % Nachweisreinheit.
