KR20030078722A

KR20030078722A - 파클리탁셀 및 알부민의 나노입자의 제조방법

Info

Publication number: KR20030078722A
Application number: KR10-2003-0019242A
Authority: KR
Inventors: 체노니마우리치오; 마스키오시모네
Original assignee: 에이씨에스 도브파 에스. 피. 에이.
Priority date: 2002-03-29
Filing date: 2003-03-27
Publication date: 2003-10-08
Also published as: ZA200302040B; JP2011132253A; ITMI20020681A1; JP4794115B2; AU2003200920A1; NO20031448L; NZ524605A; MXPA03002543A; IL154762A0; JP2003300878A; CN1911446A; CA2423915A1; US20030185894A1; ITMI20020681A0; NO20031448D0; CN1259902C; EP1348431A1; US20060121119A1; CN1448128A; RU2003108821A

Abstract

본원에서는 분말 형태인 파클리탁셀을 클로로포름을 함유하는 알부민 수용액에 첨가하여 수득된 혼합물을 고압 균질화 처리시켜 항암 특성을 갖는 파클리탁셀 및 알부민의 나노입자를 제조하는 방법이 기술된다.

Description

파클리탁셀 및 알부민의 나노입자의 제조방법{Process for producing nanoparticles of paclitaxel and albumin}

본 발명은 항암 조성물을 수득하는데 유용한 파클리탁셀 및 알부민의 나노입자(nanoparticle)의 제조방법에 관한 것이다.

파클리탁셀은 문헌에 익히 공지된, 중요한 항암 활성을 갖는 천연 물질이며, 파클리탁셀의 불량한 수용해도는 이를 사람에게 투여하기 어렵게 만들기 때문에 이를 주사가능하게 만들기 위한 다양한 시스템이 개발되어 왔다.

상기 시스템 중 하나에 따라, 파클리탁셀은, 생분해성이며 파클리탁셀에 결합하는 상당한 능력을 갖는 사람 혈청 알부민(HSA)과 배합되어 공지된 초음파처리, 고압 균질화 및 미세유동화(microfluidization) 기술[참조문헌: Allemann et al., Eur. J. Pharm. Biopharm. 39(5), 173-191 (1993)]에 의해 알부민과 함께 주사가능한 에멀젼을 형성한다.

이러한 원리에 기초하여 상기한 초음파처리 및 고압 균질화 기술을 사용하여 미국 비복스 파마슈티칼스, 인크(VivoRx Pharmaceuticals, Inc.)는 파클리탁셀 및HSA를 함유하는 제형 CAPXOL^R를 개발하였다.

US 5439686, US 5498421, US 5560933 및 상응하는 WO 94/18954에서, 비복스는 10㎛ 미만의 평균 입자 크기(MPS)를 제공하는 초음파처리 기술을 사용하여 제조한 파클리탁셀 및 HSA의 미립자를 청구하고 있다. 상기 특허들에 기술된 제조방법은 산업적 규모에서는 사용할 수 없으며, 게다가 이렇게 수득된 미립자는 환자에게 투여하기에 부적합하고 유용하지 않게 하는 너무 큰 MPS를 갖는다.

이는 상기 비복스가 익히 잘 알고 있으며, 비복스는 이후에 US 5916596 및 US 6096331 및 WO 98/14174 및 WO 99/00113에서 멸균 0.9% NaCl 수용액으로 MPS가 0.2㎛ 미만인 동결건조된 분말을 재구성함으로써 수득된 파클리탁셀 및 HSA의 멸균 나노에멀젼을 기술하고 청구하였다. 인용된 특허에 기술되어 있는 바와 같이, 고압 균질화를 사용하여 수득된 나노에멀젼은 안정성이 높다고 언급되어 있으며, 여기서 용어 "안정성"은 MPS가 시간에 따라 일정하고 나노입자 침전물이 부재인 것 둘다를 의미한다[참조: US 6096331, 실시예 11].

상기한 비복스 특허[참조: US 5916596의 실시예 1, 5 및 6]의 교시에 따르면, 파클리탁셀의 용액 및 HSA를 함유한 수용액을 먼저 개별적으로 제조한 다음, 이들 상을 함께 혼합하고 이렇게 수득된 혼합물을 실온(0℃ 내지 +40℃)에서 9000 내지 40000psi의 고압으로 초음파처리한다.

용매를 증발시키고 멸균 필터(0.22㎛)를 통해 여과한 후, 상기 혼합물을 -20℃ 내지 -80℃에서 동결시키고 최종적으로 +20℃ 내지 +35℃의 온도에서 가열하여,항암 특성을 갖는 주사가능한 제형을 제조하기에 유용한 분말을 수득한다.

따라서, 2개의 개별적 상(파클리탁셀을 함유하는 하나의 상 및 HSA를 함유하는 다른 상)이 생성되고, 이후에 이들을 고압 균질화시키기 전에 함께 혼합시켜야 한다. 이는 2개 이상의 개별적 반응기의 사용 및 적절한 혼합을 사용한 2개의 개별적 용액의 제조를 요하는데, 모두 멸균 조건하에 달성되며 높은 설비 비용, 혼합 작업을 완료하기 위한 오랜 시간 및 용매의 회전증발기(rotavapor) 증발(균질화 처리 말기)에 이어서 멸균 필터를 통한 여과를 요하며, 이 결과로 총괄 수율이 낮아진다.

따라서, 본 발명의 주요 목적은 균질화 처리하고자 하는 파클리탁셀 및 HSA를 함유하는 액체 혼합물을 형성시키기 위해 단일 반응기의 사용을 요하며 공지된 기술에서보다 저비용으로 단시간내에 완료될 수 있는, 파클리탁셀 및 HSA 나노입자의 멸균 동결건조된 분말의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 및 추가의 목적은 파클리탁셀 및 알부민을 함유하는 수성 혼합물을 0℃ 내지 40℃의 온도에서 9000 내지 40000psi의 고압으로 균질화 처리함으로써 나노에멀젼을 수득하고, 이를 -20℃ 내지 -80℃에서 동결시키고 마지막으로 +20℃ 내지 +35℃에서 가열하여 동결건조시키는 방법으로서, 상기 수성 혼합물이 상기 알부민을 멸균수속에 2% 내지 3%(w/v)의 농도로 용해시킨 다음, 상기 알부민 용액에, 클로로포름 2% 내지 4%(v/v)에 이어서 용액중에 존재하는 알부민의 중량을 기준으로 하여, 멸균 분말 형태의 파클리탁셀 5.4중량% 내지 20중량%을 첨가함으로써 수득되는 방법에 의해 달성된다. 액체 혼합물에 첨가된 멸균 분말 형태의 파클리탁셀의 양은 알부민에 기초하여 바람직하게는 5.6중량% 내지 19.4중량%이다.

당해 방법에서 멸균 분말 형태의 파클리탁셀의 사용이 당해 방법이 공지된 기술과 비교하여 설비 자체 및 당해 방법을 크게 단순화시키고 균질화 처리 전에 다양한 성분의 혼합을 완료하는데 필요한 시간을 상당히 단축시킬 뿐만 아니라, 보다 우수한 최종 수율이 수득되도록 하며 목적하는 멸균 동결건조된 분말을 수득하기 위해 준수해야 하는 조건을 단순화시킨다는 것이 주지될 중요사항이다.

상기한 방식으로 조작함으로써, 상기한 이전의 특허에서 기술된 보다 복잡하고 어려운 고비용의 방법으로 수득될 수 있는 분말과 완전히 유사하거나 동일한, 파클리탁셀 및 HSA의 나노입자의 혼합물에 의해 형성된 분말이 수득된다.

아베스틴(Avestin) 균질화기를 사용하여 US 5916596에서 권장하는 압력 범위내에서 가공할 경우, 이들 혼합물로부터 pH=6.7의 나노에멀젼이 수득되며, 이는 상기 특허에서 보고된 바와 같은 회전증발기에서 증발시킬 경우, 주사가능한 생리학적 용액중의 이의 제형(MPS가 약 0.05㎛로 증가하며 약 12시간 내에 침강되는 경향이 있음) 중에서 거의 안정하지 않으며, 0.22㎛ 필터(이 필터는 쉽게 막히며 파클리탁셀 수율을 매우 낮은 수치(30% 이하 또는 미만)로 감소시킨다)를 통해 여과시키기 어려운, MPS가 약 0.2㎛(증발 후 MPS가 0.02㎛를 초과하여 증가됨)인 나노에멀젼을 제공한다.

상기 정의한 바와 같은 본 발명의 방법 및 이전의 특허에 따르는 방법 둘다를 사용하여 제조된 생성물의 안정성(US 6096331의 실시예의 교시에 따라 평가됨)은 US 5916596 및 US 6096331에 보고되어 있는 바와 같이 동결건조시키고 재구성할 경우 허용가능하나 절대 24시간을 초과하지 않는다.

놀랍게도, 하나 이상의 생적합성 산을 분말 형태인 나노입자의 재구성된 주사가능한 수성 혼합물의 pH를 5.4 내지 5.8(바람직하게는 5.5 내지 5.7)이 되도록 하기에 충분한 양으로, HSA를 함유하는 액체 혼합물(분말 형태인 파클리탁셀이 첨가되기 전)에 첨가할 경우, 주사가능한 형태인 동결건조되고 재구성된 혼합물의 안정성이 24시간 이상으로 상당히 증가됨이 밝혀졌다.

상기한 산의 첨가 또한 본 발명의 일부를 구성한다.

바람직하게는, 이러한 산은 HCl, 시트르산, 인산, 아세트산, 생적합성 유기 및 무기 산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되나, 시트르산이 가장 바람직한 산이다.

본 발명의 특징을 명료화하기 위해, 일부 비제한적 실행 실시예, 생리학적 pH의 액체 혼합물을 사용한 일부 실시예 및 산을 사용한 결과로서 발생하는 차이를 강조하기 위해 산성화시킨 일부 실시예를 기술할 것이다.

실시예 1

pH 6.7에서 제형의 제조

FDA 규격에 따르는 주사가능한 20%(w/v) HSA 수용액(pH=6.9 ±0.5)을 멸균 탈염수로 3%(w/v)까지 희석시킨다.

상기 용액 41.4㎖을 격렬하게 교반하면서 멸균 클로로포름 1.25㎖ 및 분말 형태인 멸균 파클리탁셀 73.6mg(용액중 알부민의 중량을 기준으로 하여, 5.9중량%)(역가 >99%)과 혼합한 다음, 혼합물을 나노에멀젼(약 0.2㎛의 MPS)이 수득될 때까지 고압 균질화기(적합하게는 멸균시킴)에서 처리하고, 상기 나노에멀젼을 진공하에 증발시켜 용매를 제거하고, 동결시키고 멸균 조건하에 48시간 동안 동결건조시킨다.

파클리탁셀 4.60%(w/w)을 함유하는, 수득된 분말을 0.9% NaCl 수용액으로 재구성하여 파클리타셀 농도가 2mg/㎖가 되도록 한다. 수득된 제형은 0.486㎛의 MPS, pH=6.7 및 12시간 미만의 안정성을 갖는다.

수득된 생성물은 US 5916596의 실시예 1에서 사용한 방법으로 제조된 것과 동일한 특징을 갖는다.

실시예 2

pH 6.7에서 제형의 제조

FDA 규격에 따르는 주사가능한 25%(w/v) HSA 수용액(pH=6.9±0.5)을 멸균 탈염수로 2%(w/v)까지 희석시킨다.

상기 용액 49.0㎖을 멸균 클로로포름 1.0㎖ 및 분말 형태 멸균 파클리탁셀 72.5mg(알부민의 7.4%)(역가 >99%)과 혼합한 다음, 혼합물을 나노에멀젼(약 0.2㎛의 MPS)이 수득될 때까지 고압 균질화기(적합하게는 멸균시킴)에서 처리하고, 상기 나노에멀젼을 진공하에 증발시켜 용매를 제거하고 멸균 필터(0.2㎛)를 통해 여과시키고 멸균 조건하에 48시간 동안 동결건조시킨다.

파클리탁셀 0.60%(w/w)을 함유하는, 수득된 분말을 0.9% NaCl 수용액으로 재구성하여 파클리타셀 농도가 2mg/㎖가 되도록 한다. 수득된 제형은 0.25㎛의 MPS, pH=6.7 및 12시간 미만의 안정성을 갖는다.

실시예 3

pH 6.7에서 제형의 제조

FDA 규격에 따르는 주사가능한 20%(w/v) HSA 수용액(pH=6.9±0.5)을 멸균 탈염수로 3%(w/v)까지 희석시킨다.

상기 용액 46.7㎖를 멸균 CHCl₃1.40㎖ 및 분말 형태인 멸균 파클리탁셀 108.5mg(알부민의 7.7%)(역가>99%)와 혼합한 다음, 혼합물을 나노에멀젼(약 0.2㎛의 MPS)이 수득될 때까지 고압 균질화기(적합하게는 멸균시킴)에서 처리하고, 상기 나노에멀젼을 진공하에 증발시켜 용매를 제거하고, 멸균 필터(0.2㎛)를 통해 여과시키고 동결시키고 멸균 조건하에 48시간 동안 동결건조시킨다.

파클리탁셀 0.77%(w/w)을 함유하는, 수득된 분말을 0.9% NaCl 수용액으로 재구성하여 파클리탁셀 농도가 2mg/㎖가 되도록 한다. 수득된 제형은 0.12㎛의 MPS, pH=6.7 및 12시간 미만의 안정성을 갖는다.

초기의 설명 부분에서 이미 언급한 바와 같이, 여과로 파클리탁셀의 상당량 손실된다(동결건조된 분말은 실시예 2의 파클리탁셀 5.2% 대신에 파크리탁셀 0.55%를 함유한다). 이로써 MPS가 0.2㎛ 미만인 제형을 수득할 수 있다.

실시예 4

pH 6.7에서 제형의 제조

FDA 규격에 따르는 주사가능한 25%(w/v) HSA 수용액(pH=6.9±0.5)을 멸균 탈염수로 3%(w/v)까지 희석시킨다.

상기 용액 29.1㎖를 멸균 CHCl₃0.90㎖ 및 분말 형태인 멸균 파클리탁셀 67.0mg(알부민의 7.7%)(역가>99%)와 혼합한 다음, 혼합물을 나노에멀젼(약 0.2㎛의 MPS)이 수득될 때까지 고압 균질화기(적합하게는 멸균시킴)에서 처리하고, 상기 나노에멀젼을 진공하에 증발시켜 용매를 제거하고, 멸균 필터(0.2㎛)를 통해 여과시키고 동결시키고 멸균 조건하에 48시간 동안 동결건조시킨다.

파클리탁셀 0.70%(w/w)을 함유하는, 수득된 분말을 0.9% NaCl 수용액으로 재구성하여 파클리탁셀 농도가 1.5mg/㎖가 되도록 한다. 수득된 제형은 0.25㎛의 MPS, pH=6.7 및 12시간 미만의 안정성을 갖는다.

수득된 생성물은 US 5916596의 실시예에서 사용된 방법으로 제조한 것과 동일한 특징을 갖는다.

실시예 5

pH 6.7에서 제형의 제조

FDA 규격에 따르는 주사가능한 20%(w/v) HSA 수용액(pH=6.9±0.5)을 멸균 탈염수로 2.5%(w/v)까지 희석시키고, 클로로포름(1% v/v)으로 예비포화시킨다.

상기 용액 48.5㎖를 멸균 CHCl₃1.0㎖ 및 분말 형태인 멸균 파클리탁셀 75mg(알부민의 6.2%)(역가>99%)와 혼합한 다음, 혼합물을 나노에멀젼(약 0.2㎛의 MPS)이 수득될 때까지 고압 균질화기(적합하게는 멸균시킴)에서 처리하고, 상기 나노에멀젼을 진공하에 증발시켜 용매를 제거하고, 멸균 필터(0.2㎛)를 통해 여과시키고, 동결시키고 멸균 조건하에 48시간 동안 동결건조시킨다.

파클리탁셀 0.70%(w/w)을 함유하는, 수득된 분말을 0.9% NaCl 수용액으로 재구성하여 파클리탁셀 농도가 2.2mg/㎖가 되도록 한다. 수득된 제형은 0.18㎛의 MPS, pH=6.7 및 12시간 미만의 안정성을 갖는다.

당해 경우에 실시예 3의 종결시에 관찰된 결과는 다시 유효하다.

실시예 6

pH 5.6에서 제형의 제조

FDA 규격에 따르는 주사가능한 25%(w/v) HSA 수용액(pH=6.9±0.5)을 멸균 탈염수로 3%(w/v)까지 희석시키고, pH를 알부민중에 존재하는 일부 염기성 그룹을 염화시키는 1M HCl로 5.6의 수치로 교정한다.

미리 멸균시킨 상기 용액 57㎖를 30분 이상 격렬하게 교반하면서 멸균 클로로포름 1.40㎖ 및 분말 형태인 멸균 파클리탁셀 108mg(알부민의 6.3%)(역가>99%)과 혼합한다.

혼합물을 나노에멀젼(MPS < 0.2㎛)이 수득될 때까지 균질화기(적합하게는 멸균시킴)에서 고압(9000 내지 40000psi)으로 처리하고, 상기 나노에멀젼을 -80℃에서 신속하게 동결시키고 멸균 조건하에 온도를 +30℃로 상승시키면서 55시간 동안 동결시킨다.

파클리탁셀 4.83%(w/w) 및 물 4%(w/w)을 함유하는, 수득된 분말을 0.9% NaCl 수용액으로 재구성하여 파클리탁셀 농도가 2mg/㎖가 되도록 한다. 수득된 제형은 0.175㎛의 MPS, pH=5.6 및 24을 초과하는 안정성을 갖는다.

염산 대신에 인산을 사용해서도 동일한 결과가 수득된다.

실시예 7

pH=5.4에서 제형의 제조

FDA 규격에 따르는 주사가능한 25%(w/v) HSA 수용액을 멸균 탈염수로 3%(w/v)까지 희석시키고, pH를 알부민중에 존재하는 일부 염기성 그룹을 염화시키는 시트르산을 사용하여 5.4의 수치로 교정한다.

미리 멸균시킨 상기 용액 50㎖를 40분 이상 격렬하게 교반하면서 멸균 클로로포름 1.23㎖ 및 분말 형태인 멸균 파클리탁셀 98mg(알부민의 6.5%)(역가>99%)과 혼합한다.

혼합물을 나노에멀젼(MPS < 0.2㎛)이 수득될 때까지 균질화기(적합하게는 멸균시킴)에서 고압(9000 내지 40000psi)으로 처리하고, 상기 나노에멀젼을 -30℃에서 신속하게 동결시키고 멸균 조건하에 온도를 +35℃로 상승시키면서 57시간 동안 동결건조시킨다.

파클리탁셀 4.80%(w/w) 및 물 3.8%(w/w)을 함유하는, 수득된 분말을 0.9% NaCl 수용액으로 재구성하여 파클리탁셀 농도가 2mg/㎖가 되도록 한다. 수득된 제형은 0.19㎛의 MPS, pH=5.4 및 24시간을 초과하는 안정성을 갖는다.

시트르산 대신에 아세트산을 사용해서도 동일한 결과가 수득된다.

실시예 8

pH=5.5에서 제형의 제조

FDA 규격에 따르는 주사가능한 25%(w/v) HSA 수용액을 멸균 탈염수로 3%(w/v)까지 희석시키고, pH를 알부민중에 존재하는 일부 염기성 그룹을 염화시키는 멸균 시트르산을 사용하여 5.5의 수치로 교정한다.

상기 용액 37㎖를 40분 이상 격렬하게 교반하면서 멸균 클로로포름 0.91㎖ 및 분말 형태인 멸균 파클리탁셀 71mg(알부민의 6.4%)(역가>99%)과 혼합한 후, 혼합물을 5 내지 8℃로 냉각시킨다.

혼합물을 나노에멀젼(MPS < 0.2㎛)이 수득될 때까지 균질화기(적합하게는 멸균시킴)에서 고압(9000 내지 40000psi)으로 처리하고, 상기 나노에멀젼을 -80℃에서 신속하게 동결시키고 멸균 조건하에 온도를 +30℃로 상승시키면서 58시간 동안동결건조시킨다.

파클리탁셀 4.70%(w/w) 및 물 4.5%(w/w)을 함유하는, 수득된 분말을 0.9% NaCl 수용액으로 재구성하여 파클리탁셀 농도가 2mg/㎖가 되도록 한다. 수득된 제형은 0.185㎛의 MPS, pH=5.5 및 24시간을 초과하는 안정성을 갖는다.

실시예 9

pH 5.5에서 제형의 제조

FDA 규격에 따르는 주사가능한 20%(w/v) HSA 수용액(pH=6.9±0.5)을 멸균 탈염수로 3%(w/v)까지 희석시키고, pH를 알부민중에 존재하는 일부 염기성 그룹을 염화시키는 시트르산을 사용하여 5.5의 수치로 교정한다.

상기 용액 110㎖를 멸균 CHCl₃4.10㎖ 및 분말 형태인 멸균 파클리탁셀 639mg(알부민의 19.4%)(역가>99%)와 혼합한 다음, 혼합물을 나노에멀젼(약 0.2㎛의 MPS)이 수득될 때까지 고압 균질화기(적합하게는 멸균시킴)에서 처리하고, 상기 나노에멀젼을 멸균 필터(0.2㎛)를 통해 여과시키고, 진공하에 증발시켜 용매를 제거하고, 동결시키고 멸균 조건하에 48시간 동안 동결건조시킨다.

파클리탁셀 10.8%(w/w)을 함유하는, 수득된 분말을 0.9% NaCl 수용액으로 재구성하여 파클리탁셀 농도가 2mg/㎖가 되도록 한다. 수득된 제형은 0.15㎛의 MPS 및 24시간을 초과하는 안정성을 갖는다.

본 발명에 의해, 멸균 분말 형태인 파클리탁셀을 사용함으로써 공지된 기술에서보다 조건이 단순화되고 저비용으로 단시간내에 완료될 수 있는, 파클리탁셀 및 HSA의 나노입자의 멸균 동결건조된 분말을 제조하는 방법이 제공된다.

Claims

파클리탁셀 및 사람 혈청 알부민을 함유하는 수성 혼합물을 0℃ 내지 40℃의 온도에서 9000 내지 40000psi의 고압으로 균질화 처리하여 나노에멀젼을 수득하고, 이를 -20℃ 내지 -80℃에서 동결시키고 마지막으로 +20℃ 내지 +35℃에서 가열하여 동결건조시켜, 파클리탁셀 및 사람 혈청 알부민의 나노입자로 이루어진 멸균 동결건조된 분말을 제조하는 방법으로서, 상기 수성 혼합물이 상기 알부민의 2% 내지 3%(w/v)를 멸균수 속에 용해시킨 다음, 상기 알부민 용액에 멸균 클로로포름 2% 내지 4%(v/v) 및 용액중에 존재하는 알부민의 중량을 기준으로 하여 5.4중량% 내지 20중량%의 양의 분말 형태인 파클리탁셀을 첨가하여 수득됨을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 알부민 용액에 첨가되는 멸균 분말 형태인 파클리탁셀의 양이 알부민 중량을 기준으로 하여, 5.6 내지 19.4%인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 파클리탁셀을 첨가하기 전에 알부민 용액에 분말 형태인 나노입자의 재구성된 주사가능한 수성 혼합물의 pH를 5.4 내지 5.8이 되도록하기에 충분한 양의 하나 이상의 생적합성 산을 첨가함을 특징으로 하는 방법.
제3항에 있어서, 산의 양이, 재구성된 수용액의 pH가 5.5 내지 5.7이 되도록하는 양임을 특징으로 하는 방법.
제3항 또는 제4항에 있어서, 산이 HCl, 시트르산, 인산, 아세트산, 생적합성 유기 및 무기 산으로 이루어진 그룹으로부터 선택됨을 특징으로 하는 방법.
제5항에 있어서, 산이 시트르산임을 특징으로 하는 방법.