WO2023080575A1 - 입도분포 유지 안정성이 개선된 알부민 결합 탄산 나노입자 제조방법 - Google Patents

입도분포 유지 안정성이 개선된 알부민 결합 탄산 나노입자 제조방법 Download PDF

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WO2023080575A1
WO2023080575A1 PCT/KR2022/016812 KR2022016812W WO2023080575A1 WO 2023080575 A1 WO2023080575 A1 WO 2023080575A1 KR 2022016812 W KR2022016812 W KR 2022016812W WO 2023080575 A1 WO2023080575 A1 WO 2023080575A1
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WO
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solution
nanoparticles
albumin
particle size
present
Prior art date
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PCT/KR2022/016812
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박영환
박상만
홍순석
조우람
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주식회사 에스엔바이오사이언스
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    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/335—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin
    • A61K31/337—Heterocyclic compounds having oxygen as the only ring hetero atom, e.g. fungichromin having four-membered rings, e.g. taxol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to a method for preparing albumin-bound taxane nanoparticles with improved particle size distribution maintenance stability.
  • a poorly soluble drug refers to a drug that is poorly soluble in water because the compound contains a hydrophobic site in its structure, and its practicality is often limited due to its poor solubility. For example, about 41% or more of drugs developed as new drugs are abandoned due to poor solubility, and about 1/3 or more of drugs listed in the US Pharmacopeia are classified as poorly soluble drugs. In order to use these poorly soluble drugs, additional substances to solve the poor solubility must be added, but there are many cases in which use is limited due to the toxicity of the substances added. For example, in general, emulsification using emulsifiers and capture using liposomes are widely used to solubilize poorly soluble substances in water. The situation is.
  • Paclitaxel is a drug containing a diterpenoid derivative extracted from the bark of Taxus brevifolia. It is basically composed of a taxane ring and an ester side chain. It has an alkaloid structure. Paclitaxel is known to have anti-cell division activity that promotes the conversion of tubulin complexes into stable microtubules, and is known to be effective against various cancers such as lung cancer and breast cancer. As such, paclitaxel showed excellent potential as an anticancer drug, but its wide use in the field of cancer treatment has been limited due to its low solubility in water.
  • paclitaxel was previously used by dissolving it in ethanol, but recently, in order to increase delivery efficiency, paclitaxel is combined with albumin and used as an injection.
  • Cremophor EL which is a mixture of polyoxyethylated castor oil and absolute ethanol
  • Taxol TM A commercially available formulation in this form is Taxol TM .
  • side effects such as cardiotoxicity, neurotoxicity, neurological disorder and hypersensitivity appear when such solvents are clinically administered in excess.
  • Abraxane TM is a formulation of paclitaxel combined with human serum albumin in the form of nanoparticles in order to overcome the disadvantages of Taxol such as side effects caused by the solvent, and improved tumor response through human and animal experiments. It has been used as a successful anti-cancer treatment to date.
  • Prior Patent Document 1 PCT/US1998/013272 relating to Abraxane
  • a mixture of paclitaxel and albumin must be homogenized under high pressure and then quickly dried under reduced pressure. If not performed, the particle size of the nanoparticles containing paclitaxel and albumin significantly increases over time.
  • the concentrations of the starting material, the paclitaxel solution and the albumin solution are 7.5% (w / v) and 3% (w / v), respectively, based on Example 5, so scale-up equipment is configured as it is.
  • the volume of the equipment such as the mixing tank must be large, and furthermore, since the concentration process must be performed in order to reduce the volume of the final dispersion, a problem in that the production of nanoparticles is significantly reduced occurs.
  • an object of the present invention is to provide a method for preparing nanoparticles containing taxanes and albumin with improved particle size distribution maintenance stability.
  • Another object of the present invention is to provide nanoparticles containing taxane and albumin prepared by the above preparation method.
  • Another object of the present invention is to provide a method for maintaining and stabilizing the particle size distribution of nanoparticles containing taxane and albumin.
  • the term "about” as used herein includes numerical limitations, e.g., temperature, time, pressure, amount, concentration, etc., including ranges (+) or (-) 10%, 5%, 4% , 3%, 2%, 1%, or ranges or specific values therebetween.
  • nanoparticle means a particle having a particle size dimension of less than 1 ⁇ m.
  • the nanoparticles of the present invention are intended for intravenous injection, the nanoparticles preferably have a size of 500 nm or less.
  • the nanoparticles are 50-500 nm, 50-400 nm, 50-300 nm, 50-200 nm, 50-190 nm, 50-180 nm, 50-170 nm, 50-160 nm, 50-150 nm , 80-500 nm, 80-400 nm, 80-300 nm, 80-200 nm, 80-190 nm, 80-180 nm, 80-170 nm, 80-160 nm, 80-150 nm, 100-500 nm , 100-400 nm, 100-300 nm, 100-200 nm, 100-190 nm, 100-180 nm, 100-170 nm, 100-160 nm, 100-150 nm, 110-500 nm, 110-400 nm , 110-300 nm, 110-200 nm, 110-190 nm, 110-180 nm, 110-170 nm, 110-160 nm,
  • the size of the population of particles can be represented by means and/or percentiles.
  • D 10 means that 10% of the particles are smaller than that size
  • D 50 means that 50% of the particles are smaller than that size
  • D 90 means that 90% of the particles are smaller than that size.
  • the average particle size can be expressed as D 50 .
  • the concentration of taxanes in the first solution is 55 to 75% (w/v), 60 to 75% (w/v), 65 to 75% (w/v), 70 to 75% (w/v). 75% (w/v), 55 to 70% (w/v), 55 to 65% (w/v), 55 to 60% (w/v), 60 to 70% (w/v), 64 to 60% 68% (w/v), or 65 to 67% (w/v).
  • the solvent of the first solution is ethanol, methanol, isopropyl alcohol, butanol, dimethyl sulfoxide (DMSO), dimethylformamide (DMF), tetrahydrofuran (THF), acetonitrile, It is selected from the group consisting of dichloromethane, ethyl acetate, hexane, diethyl ether, benzene, chloroform, acetone, and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • DMF dimethylformamide
  • THF tetrahydrofuran
  • acetonitrile It is selected from the group consisting of dichloromethane, ethyl acetate, hexane, diethyl ether, benzene, chloroform, acetone, and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • the solvent of the first solution is a mixed solvent of ethanol and chloroform.
  • the ethanol:chloroform volume ratio is 1:5 to 1:20, 1:6 to 1:20, 1:7 to 1:20, 1:8 to 1:20, 1:9 to 1:20, 1:10 to 1:20, 1:12 to 1:20, 1:14 to 1:20, 1:15 to 1:20, 1:5 to 1:18, 1:6 to 1:18, 1:7 to 1 :18, 1:8 to 1:18, 1:9 to 1:18, 1:10 to 1:18, 1:12 to 1:18, 1:14 to 1:18, 1:15 to 1:18 , 1:5 to 1:16, 1:6 to 1:16, 1:7 to 1:16, 1:8 to 1:16, 1:9 to 1:16, 1:10 to 1:16, 1 :12 to 1:16, 1:16, 1:14 to 1:16, 1:15 to 1:16, 1:5 to 1:15, 1:6 to 1:15, 1:7 to 1:15, 1:8 to 1:15, 1:9 to 1:15, 1:10 to 1:15, 1:12 to 1:15,
  • the injectable formulation when the taxane concentration of the first solution is less than the lower limit of the range of 55 to 75% (w/v) defined in the present invention, even if the water dilution step is performed, the injectable formulation is effective before drying under reduced pressure. There is a problem that the particle size rises rapidly to 200 nm or more to the extent that it cannot be used as a component.
  • the taxane concentration of the first solution exceeds the upper limit of the range of 55 to 75% (w/v) defined in the present invention
  • paclitaxel is precipitated during the nanoparticle manufacturing process, making normal operation of the high-pressure homogenizer impossible, and nanoparticles
  • the particle size also increases, causing a problem that nanoparticles of uniform particle size cannot be produced at a concentration exceeding 75% (w / v).
  • the taxane may be paclitaxel, docetaxel, or a combination thereof, but is not limited thereto.
  • the concentration of albumin in the second solution is 15 to 25% (w / v), 18 to 25% (w / v), 22 to 25% (w / v), 15 to 25% (w / v) It may be 22% (w/v), 15 to 18% (w/v), 18 to 22% (w/v), or 19 to 21% (w/v).
  • the solvent of the second solution is water, distilled water, sterile water, phosphate buffered saline (PBS), methanol, purified water, ethanol, 1-propanol, 2-propanol, 1-pentanol,
  • An aqueous solvent selected from the group consisting of 2-butoxyethanol, ethylene glycol, acetone, 2-butanone, 4-methyl-2-propanone, chloroform, and combinations thereof, but is not limited thereto.
  • the weight ratio of paclitaxel:albumin in the final nanoparticles is 1:9, the same as that of Abraxane TM .
  • the volume of the dispersion must be excessively increased, and as a result, an additional concentration process is required outside the usual filling volume range, resulting in a problem that is practically difficult for industrial use.
  • albumin concentration of the second solution exceeds the upper limit of the range of 15 to 25% (w / v) defined in the present invention, even if the water dilution step is performed, the average is not usable as an active ingredient of the injectable formulation before drying under reduced pressure. A problem arises in which the particle size rapidly rises above 200 nm.
  • the albumin may be human serum albumin (HSA), bovine serum albumin (BSA), ovalbumin (OVA), or a combination thereof.
  • HSA human serum albumin
  • BSA bovine serum albumin
  • OVA ovalbumin
  • the mixing volume ratio of the first solution and the second solution in step (c) is 1:20 to 1:45, but is not limited thereto.
  • the mixing volume ratio of the first solution and the second solution is 1:20 to 1:43, 1:20 to 1:41, 1:20 to 1:39, 1:20 to 1:37, 1:20 to 1:35, 1:20 to 1:33, 1:20 to 1:31, 1:20 to 1:29, 1:20 to 1:27, 1:20 to 1:25, 1:20 to 1 :23, 1:20 to 1:21, 1:22 to 1:45, 1:24 to 1:45, 1:26 to 1:45, 1:28 to 1:45, 1:30 to 1:45 , 1:32 to 1:45, 1:34 to 1:45, 1:36 to 1:45, 1:38 to 1:45, 1:40 to 1:45, 1:42 to 1:45, 1 :44 to 1:45, 1:22 to 1:40, 1:25
  • the weight ratio of paclitaxel:albumin in the final nanoparticles is prepared to be about 1:9, the same as that of Abraxane TM . .
  • the weight ratio of paclitaxel:albumin is not necessarily limited to about 1:9, and may be in the range of 1:7 to 11, 1:8 to 10, or 1:8.5 to 9.5.
  • the preparation of the suspension in step (c) is performed by high pressure homogenization.
  • the high pressure homogenization is performed at a temperature condition of 10 to 40 ° C, 15 to 40 ° C, 20 to 40 ° C, 30 to 40 ° C, or 35 to 40 ° C, but is not limited thereto .
  • the high pressure homogenization is 10,000 to 30,000 psi, 12,000 to 30,000 psi, 15,000 to 30,000 psi, 16,000 to 30,000 psi, 17,000 to 30,000 psi, 18,000 to 30,000 psi, 10,000 to 25,000 psi, 12,000 to 25,000 psi, 15,000 to 25,000 psi, 16,000 to 25,000 psi, 17,000 to 25,000 psi, 18,000 to 25,000 psi, 10,000 to 20,000 psi, 12,000 to 20,000 psi, 15, 000 to 20,000 psi, 16,000 to 20,000 psi, 17,000 to 20,000 psi, or 18,000 to 20,000 psi, but is not limited thereto.
  • the high-pressure homogenization is performed one or more times, more specifically 1 to 5 times, 1 to 4 times, or 1 to 3 times, but is not limited thereto.
  • the dilution in step (d) is 3 to 12 times, 5 to 12 times, 7 to 12 times, 10 to 12 times, 3 to 10 times, or 3 to 7 times based on the volume of the suspension. , It may be diluted 3 to 5 times, 5 to 10 times, or 5 to 7 times, but is not limited thereto.
  • the particle size is 200 nm or more to the extent that it cannot be used as an active ingredient of an injectable formulation before drying under reduced pressure even after performing the water dilution step.
  • the increase in particle size may be due to agglomeration between nanoparticles. Aggregation of nanoparticles can block blood vessels in the case of nanoparticles for intravenous injection. Therefore, aggregation of nanoparticles and stability of nanoparticles may affect the efficacy and safety of a pharmaceutical composition containing nanoparticles.
  • the amount of the aqueous solvent used exceeds the upper limit of the range of 3 to 12 times defined in the present invention, the free fraction of paclitaxel, that is, the unencapsulated rate increases (when diluted with 5.3 times water, the unencapsulated rate 0.72% ⁇ 13 6.24% of non-encapsulation rate when diluting with double volume water), and water more than necessary for stabilizing the particle size of nanoparticles causes problems that are not efficient and economical in terms of scale-up process.
  • the average particle size of the nanoparticles in the diluted solution in step (d) is 100 to 200 nm, or 110 to 190 nm, but is not limited thereto.
  • the preparation method may further include (e) drying the diluted solution to obtain nanoparticles.
  • the drying may be reduced pressure drying, freeze drying, or heat drying, but is not limited thereto.
  • the drying according to one embodiment of the present invention is reduced pressure drying, it can be carried out by adopting a conventional reduced pressure drying method such as using a rotary evaporator, and is not limited to specific reduced pressure drying conditions.
  • the reduced pressure drying is 10 to 70 °C, 20 to 70 °C, 30 to 70 °C, 40 to 70 °C, 10 to 60 °C, 10 to 50 °C, 10 to 40 °C, 20 to 60 °C, 30 to 50 °C, 35 to 45 °C, 38 to 42 °C, or 39 to 41 °C, but may be made under temperature conditions in the range, but is not limited thereto.
  • the vacuum drying is 10 to 110 hPa, 20 to 110 hPa, 30 to 110 hPa, 40 to 110 hPa, 50 to 110 hPa, 10 to 100 hPa, 10 to 90 hPa, 10 to It may be made under pressure conditions ranging from 80 hPa, 10 to 70 hPa, 20 to 100 hPa, 30 to 90 hPa, 40 to 80 hPa, 50 to 70 hPa, or 55 to 65 hPa, but is not limited thereto.
  • the nanoparticles present in the diluted solution may maintain an average particle size of 100 to 200 nm, preferably 110 to 190 nm, from before drying to completion of drying.
  • the average size of nanoparticles in the dilution solution with water before drying under reduced pressure compared to the conventional process of quickly drying under reduced pressure after high-pressure homogenization without performing a dilution step with water is maintained uniformly over time, showing remarkable effects in structural stability and particle size distribution, and these effects of the present invention are supported by Examples, Comparative Examples, and Experimental Examples to be described later.
  • nanoparticles containing taxane and albumin prepared by the method according to one aspect of the present invention are provided.
  • the nanoparticles containing the taxane and albumin prepared by the manufacturing method according to one aspect of the present invention are reconstituted in an aqueous solvent (including in vivo and in vitro ). Upon reconstitution, it has substantially the same therapeutic activity and particle properties as the properties of the nanoparticles before drying (eg, the nanoparticles in the diluted solution in step (d)).
  • the average particle size and particle size distribution are substantially the same as those of the nanoparticles before drying.
  • the meaning of substantially the same means that the parameters for the nanoparticles immediately after freeze-drying compared to the parameters for the nanoparticles before freeze-drying are in the range of ⁇ 10%, more specifically in the range of ⁇ 7%, in the range of ⁇ 5%, in the range of ⁇ 4%, or within the ⁇ 3.5% range.
  • the dried nanoparticles are stored at room temperature for at least 3 months, 4 months, 5 months, 6 months, 7 months, 8 months, 9 months, 10 months, 11 months, 12 months, or more.
  • the nanoparticles are stable for the above period, and even after being stored at room temperature for the above period and reconstituted in an aqueous solvent, the nanoparticles show therapeutic activity and particle characteristics before drying.
  • the drying is lyophilization.
  • the freeze-drying refers to a process in which nanoparticles, which are materials to be dried, are frozen, and then the frozen solvent is removed by sublimation in a vacuum environment.
  • an excipient or cryoprotectant is optionally included to enhance the storage stability of the lyophilized product.
  • excipients or cryoprotectants include polymers such as dextran and polyethylene glycol; sugars such as sucrose, glucose, trehalose, and lactose; surfactants such as polysorbates; and amino acids such as glycine, arginine, and serine.
  • the nanoparticle may further include one or more additional therapeutic agents in addition to the taxane of the present invention.
  • the nanoparticles can be pharmaceutically formulated for administration to patients.
  • a variety of formulations and drug delivery systems are available in the art. See, for example, Gennaro, A.R., ed. (1995) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.
  • nanoparticles of the present invention can be administered as a pharmaceutical composition by one of the following routes: orally; Parenteral, such as transdermal, intranasal, intramuscular, intravenous, subcutaneous, intradermal, intratumoral, etc.
  • the nanoparticles of the present invention may include the following solid, liquid, semi-solid, or gaseous excipients.
  • the solid pharmaceutical excipients are starch, cellulose, talc, glucose, lactose, sucrose, gelatin, malt, rice, flour, silica gel, magnesium stearate, sodium stearate, glycerol monostearate, sodium chloride, dried skim milk, and the like.
  • the liquid and semi-solid excipients may be glycerol, propylene glycol, water, ethanol and various oils including oils of petroleum, animal, vegetable or synthetic origin, such as peanut oil, soybean oil, mineral oil. , sesame oil, and the like.
  • Preferred liquid carriers, particularly liquid carriers for injectable solutions include water, saline, aqueous dextrose, and glycols.
  • Other suitable pharmaceutical excipients and their formulations are described in Remington's Pharmaceutical Sciences edited by E. W. Martin (Mack Publishing Company, 18th ed., 1990).
  • the nanoparticles are formulated for intravenous injection. In another specific embodiment of the invention, the nanoparticles are formulated for direct injection or perfusion into a tumor.
  • the present invention provides a method for maintaining and stabilizing the particle size distribution of nanoparticles, comprising the steps of:
  • the method for maintaining and stabilizing the particle size distribution of nanoparticles according to one aspect of the present invention includes the same steps (a) to (d) as the method for producing nanoparticles according to one aspect of the present invention described above, Common content is omitted to avoid redundant description in this specification.
  • the method for producing nanoparticles containing taxane and albumin of the present invention maintains a uniform average size of nanoparticles over time, resulting in excellent structural stability and particle size distribution. Therefore, it can be usefully used as an improved method for preparing nanoparticles containing taxanes and albumin.
  • % used to indicate the concentration of a particular substance is (weight/weight) % for solids/solids, (weight/volume) % for solids/liquids, and liquid/liquid is (volume/volume) %.
  • Nanoparticles containing paclitaxel and albumin were prepared according to the method of Example 4 of Prior Patent Document 1 (PCT/US1998/013272). Specifically, 30 mg of paclitaxel was dissolved in chloroform/ethanol solvent (11:1 v/v) in which 0.55 ml of chloroform and 0.05 ml of ethanol were mixed to obtain a 5% (w/v) concentration of paclitaxel solution (first solution). prepared. In addition, 29.4 ml of a 1% (w/v) human serum albumin (HSA) solution (second solution) previously saturated with 1% chloroform was prepared.
  • HSA human serum albumin
  • the first solution and the second solution prepared above were mixed, and the mixture was mixed in an IKA homogenizer (T-25) at 5,600 rpm for 5 minutes to form a crude emulsion, then the mixture was transferred to a Micronox (MN400BF), 22 ° C and 2 cycles, high pressure homogenization under the condition of 18,000 psi.
  • the mixed solution after high pressure homogenization was transferred to a rotary evaporator and dried under reduced pressure at 40° C. and 60 hPa to quickly remove chloroform for 15 to 30 minutes to prepare nanoparticles containing paclitaxel and albumin.
  • Nanoparticles containing paclitaxel and albumin were prepared according to the method of Example 5 of Prior Patent Document 1 (PCT/US1998/013272). Specifically, 225 mg of paclitaxel was dissolved in a chloroform/ethanol solution (9:1 v/v) in which 2.7 ml of chloroform and 0.3 ml of ethanol were mixed to obtain a 7.5% (w/v) paclitaxel solution (first solution). prepared. In addition, 97 ml of a 3% (w/v) human serum albumin (HSA) solution (second solution) was prepared.
  • HSA human serum albumin
  • the first solution and the second solution prepared above were mixed, and the mixture was mixed in an IKA homogenizer (T-25) at 5,600 rpm for 5 minutes to form a crude emulsion, then the mixture was transferred to a Micronox (MN400BF), 22 ° C and 2 cycles, high pressure homogenization under the condition of 18,000 psi.
  • the mixed solution after high pressure homogenization was transferred to a rotary evaporator and dried under reduced pressure at 40° C. and 60 hPa to quickly remove chloroform for 15 to 30 minutes to prepare nanoparticles containing paclitaxel and albumin.
  • the present inventors prepared nanoparticles containing paclitaxel and albumin as follows.
  • the experimental protocol below corresponds to Example 3 in Table 1 below.
  • paclitaxel solution 1 g was dissolved in 1.5 ml chloroform/ethanol solvent (14:1 v/v) in which chloroform and ethanol were mixed at a volume ratio of 14:1 to obtain a 66.7% (w/v) paclitaxel solution (first solution).
  • first solution 1 g was dissolved in 1.5 ml chloroform/ethanol solvent (14:1 v/v) in which chloroform and ethanol were mixed at a volume ratio of 14:1 to obtain a 66.7% (w/v) paclitaxel solution (first solution).
  • first solution 66.7% (w/v) paclitaxel solution
  • second solution Green Cross Albumin 20%, Greencross Human Serum Albumin Inj. 20%
  • the mixture was transferred to Micronox (MN400BF) and homogenized under high pressure for 2 cycles at 22°C and 18,000 psi.
  • the mixed solution after high-pressure homogenization was diluted with 5.3-fold volume of water.
  • the diluted mixed solution was dried under reduced pressure at 40 ° C. and 60 hPa using a rotary evaporator to prepare nanoparticles containing paclitaxel and albumin.
  • nanoparticles were prepared by varying the concentration of the first solution, the concentration of the second solution, or the water used for dilution, and the specific variable conditions for each example are shown in Table 1 below. shown in Table 1 below.
  • the mixed volume ratio of the first solution and the second solution was determined according to the concentration of the first solution and the second solution, which is the weight ratio of paclitaxel: albumin in the nanoparticles finally prepared Abraxane ® This is to be prepared in the same way as 1:9.
  • Example First solution concentration, % (w/v) Second solution concentration, % (w/v) water use Doubling 1st, 2nd solution mixing volume ratio One 55.0 20 5.3 1:24.8 2 60.0 1:27.0 3 66.7 1:30.0 4 70.0 1:31.5 5 75.0 1:33.8 6 66.7 15 5.3 1:40.0 7 18 1:33.4 8 22 1:27.3 9 25 1:24.0 10 66.7 20 3.0 1:30.0 11 5.0 12 7.0 13 10.0 14 12.0 Comparative Example 1 5 One - 1:49.0 Comparative Example 2 7.5 3 - 1:32.3
  • Examples 1 to 14 described in Table 1 and the manufacturing methods described in Examples 4 and 5 of Prior Patent Document 1 are: i) the first The concentrations of the first solution and the second solution are different, and ii) there is a difference in whether or not a step of diluting with water is additionally included before the step of drying the mixed solution after high pressure homogenization under reduced pressure.
  • nanoparticles containing paclitaxel and albumin were prepared in the same manner as in Examples 1 to 14 except for the water dilution step before drying under reduced pressure. manufactured. Variable conditions for each comparative example are shown in Table 2 below.
  • first solution concentration % (w / v)
  • second solution concentration % (w / v)
  • the present inventors set i) the first solution concentration (% (w / v)), ii) the second solution concentration (% (w / v)), and iii) dilution set in Examples 1 to 14 of the present invention
  • Experiments of Comparative Examples 13 to 24 were performed in order to determine how the amount of water used in was affected on the quality of nanoparticles containing paclitaxel and albumin.
  • the mixing volume ratio of the first and second solutions in the table below was determined according to the concentrations of the first solution and the second solution, which is the ratio of paclitaxel:albumin in the nanoparticles finally prepared. This is to ensure that the weight ratio is 1:9, the same as that of Abraxane®.
  • the stability of the particle size of the nanoparticle product during the manufacturing process is secured, making it economical, efficient and scaleable. It can be actively utilized as a technology suitable for business.
  • the particle size distribution of nanoparticles in the mixture (water dilution in the case of the examples) before drying under reduced pressure, prepared in the conventional method of manufacturing Comparative Examples 1 and 2 and the manufacturing method of Examples 1 to 14 of the present invention, is It was compared and evaluated whether it remained stable over time.
  • Example 1 146.5 156.8 157.8 158.9 157.5 159.3 160.2
  • Example 2 151.1 151.2 151.8 152.3 151.7 152.8 151.8
  • Example 3 155.3 156.4 154.8 155.2 155.3 154.8 154.6
  • Example 4 156.7 156.2 155.8 157.8 156.8 157.2 158.4
  • Example 5 160.6 159.8 160.1 160.8 161.2 160.8 159.8
  • Example 6 153.5 153.2 153.9 154.2 154.8 153.2 153.8
  • Example 7 154.1 153.8 154.5 156.5 155.8 154.2 155.7
  • Example 8 153.3 153.1 152.8 154.7 154.2 154.7 154.3
  • Example 9 153.3 161.2 163.5 164.2 163.2 164.2 163.2
  • Example 10 150.3 175.4 178.6 179.2 178.6 179.5 178.8
  • Example 11 155.2 154.8 154.9 155.4 155.8 154.1 153.7
  • Example 12 153.6 154.8 153.4 155.2 153.8 154.2 152.6
  • Example 13 149.8
  • the manufacturing method of the present invention (Examples 1 to 14), which includes the step of diluting with water after high pressure homogenization and before vacuum drying, quickly dried under reduced pressure after high pressure homogenization without performing the dilution step with water
  • the manufacturing method of the present invention (Examples 1 to 14), which includes the step of diluting with water after high pressure homogenization and before vacuum drying, quickly dried under reduced pressure after high pressure homogenization without performing the dilution step with water
  • Comparative Examples 1 and 2 it can be seen that the size of the nanoparticles is maintained for a long time over time, and thus the structural stability and particle size distribution of the nanoparticles are relatively excellent.
  • the nanoparticles of Comparative Examples 1 and 2 corresponding to Examples 4 and 5 of PCT/US1998/013272 had a Z-average (nm) of 430.1 nm to such an extent that they could not be used as an active ingredient of an injectable formulation in 20 minutes after high-pressure homogenization. , it was confirmed that it grew larger than 458.6 nm.
  • the nanoparticles of Examples 1 to 14 of the present invention maintain a Z-average (nm) of ⁇ 200 nm even after 120 minutes, and thus the particle size distribution is very excellent.
  • the concentrations of the starting material, the paclitaxel solution and the albumin solution are 7.5% (w/v) and 3% (w/v), respectively, based on Example 5, so scale-up facilities remain as they are.
  • the volume of equipment such as a mixing tank must be large, and furthermore, since a concentration process must be performed in order to reduce the volume of the final dispersion, a problem in that the production of nanoparticles is significantly reduced occurs.
  • the nanoparticle manufacturing method provided in one aspect of the present invention solves the limitation of the process disclosed in PCT/US1998/013272, that is, the problem of rapidly increasing the size of nanoparticles after high-pressure homogenization before vacuum drying.
  • an environment suitable for scale-up can be provided in terms of economic feasibility and efficiency.
  • Example Z-average (nm) comparative example Z-average (nm) 0 minutes 60 minutes 120 minutes 0 minutes 60 minutes 120 minutes
  • One 146.5 158.9 160.2 3 142.2 601.6 687.3 2 151.1 152.3 151.8 4 152.6 586.9 651.2 3 155.3 155.2 154.6 5 154.8 526.2 631.9 4 156.7 157.8 158.4 6 154.2 523.1 625.1 5 160.6 160.8 159.8 7 157.9 503.8 594.2 6 153.5 154.2 153.8 8 152.1 581.8 648.3 7 154.1 156.5 155.7 9 155.8 572.9 637.2 8 153.3 154.7 154.3 10 154.2 598.8 647.3 9 153.3 164.2 163.2 11 155.8 618.9 662.1 10 150.3 179.2 178.8 12 154.8 526.4 631.9 11 155.2 155.4 153.7 12 153.6 155.2 152.6 13 149.8 151.4 152.8 14 151.3 150.2 153.7
  • the nanoparticles in the diluted solutions of Examples 1 to 14 of the present invention in which the water dilution step was performed before the drying under reduced pressure after high pressure homogenization, maintained a uniform particle size distribution over time.
  • the size of the nanoparticles in the mixed solutions of Comparative Examples 3 to 12, which do not include a water dilution step, rapidly increases over time to the extent that they cannot be used as an active ingredient in an injectable formulation.
  • the present inventors determined the particle size distribution of the nanoparticles of the present invention by i) the concentration of the first solution (% (w / v)), ii) the concentration of the second solution (% (w / v)), and iii) the water used for dilution
  • nanoparticles were prepared according to Comparative Examples 13 to 24 described above, and the particle size distribution was measured in the same manner as in Experimental Example 1.
  • comparative example First solution concentration, % (w/v) Second solution concentration, % (w/v) water use Doubling 1st, 2nd solution mixing volume ratio 21 66.7 20 1.0 1:30.0 22 2.0 23 13.0 24 14.0
  • the unencapsulated rate of paclitaxel was confirmed by the following method:
  • Example 3 Samples prepared in Example 3 (5.3-fold water dilution) or Comparative Example 23 (13-fold water dilution) were ultrafiltered, and the lower layer was analyzed by HPLC.
  • Example 3 when diluted with 5.3-fold amount of water as in Example 3, the unencapsulated rate of paclitaxel was 0.72%, and when diluted with 13-fold amount of water as in Comparative Example 23, the unencapsulated rate of paclitaxel was 6.24%.
  • the difference in the manufacturing method between Example 3 and Comparative Example 23 is only in the water dilution factor, and it can be seen that the water dilution factor is an important component in introducing a scale-up process for producing nanoparticles of good quality.
  • the nanoparticle manufacturing method according to Examples 1 to 14 of the present invention is typically organically linked to the concentration of the first and second solutions and the step of diluting with water before drying under reduced pressure. , it can be seen that a remarkable effect of maintaining a constant particle size distribution of the nanoparticles in the high-pressure homogenized dilution solution is achieved, and as a result, nanoparticles containing paclitaxel and albumin can be produced with a high yield.
  • the dispersion from which the organic solvent was removed through drying under reduced pressure was filtered through a 0.22 ⁇ m pore size filter (Sartorius).
  • the filtered liquid was filled in a glass vial for lyophilization and freeze-dried for 72 hours. After lyophilization, 20 ml of tertiary distilled water or 0.9% saline was added to a vial containing the lyophilized powder obtained and redispersed.
  • the particle size distribution measurement results are shown in Table 12 below.
  • Example Z-average (nm) before freeze drying Re-dissolution after freeze-drying One 146.5 151.6 2 151.1 150.9 3 155.3 154.2 4 156.7 155.4 5 160.6 159.3 6 153.5 153.6 7 154.1 154.8 8 153.3 153.9 9 153.3 154.8 10 150.3 151.4 11 155.2 154.7 12 153.6 153.0 13 149.8 150.4 14 151.3 151.6

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Abstract

본 발명은 입도분포 유지 안정성이 개선된 탁산 및 알부민을 포함하는 나노입자 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 나노입자의 제조방법은, 종래 공정으로 제조된 탁산 및 알부민을 포함하는 나노입자와 비교하여, 시간이 경과하여도 나노입자의 평균 크기가 균일하게 유지되어 구조 안정성과 입도분포가 매우 우수하므로, 상기 나노입자의 개선된 제조방법으로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

입도분포 유지 안정성이 개선된 알부민 결합 탄산 나노입자 제조방법
본 특허출원은 2021년 11월 33일에 대한민국 특허청에 제출된 대한민국 특허출원 제10-2021-0150107호에 대하여 우선권을 주장하며, 상기 특허출원의 개시사항은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
본 발명은 입도분포 유지 안정성이 개선된 알부민 결합 탁산 나노입자 제조방법에 관한 것이다.
난용성 약물은 화합물의 구조상 소수성 부위를 포함하고 있어 물에 잘 녹지 않는 약물을 의미하며, 난용성으로 인해 그 실용성이 제한되는 경우가 많다. 예를 들어, 신약으로 개발되는 약물 중 약 41% 이상이 난용성으로 인하여 중도에 포기되고 있으며, 미국 약전(US Pharmacopeia)에 등재된 약물의 약 1/3 이상이 난용성 약물로 분류되고 있다. 이러한 난용성 약물을 사용하기 위해서는 난용성을 해결하기 위한 부가적인 물질이 첨가되어야 하나, 부가되는 물질의 독성으로 인하여 사용이 제한되는 사례가 다수 보고되고 있다. 예컨대, 일반적으로 난용성 물질을 수가용화하기 위해서는 유화제를 이용한 유화, 리포좀을 이용한 포집 등이 널리 이용되고 있는데, 이러한 방법들은 인체에서 유래되지 않은 이물질의 혼입과 물리적 불안정성 등으로 인해 사용이 제한되고 있는 실정이다.
파클리탁셀(paclitaxel, PTX)은 주목나무(Taxus brevifolia)의 껍질로부터 추출한 디테르페노이드(diterpenoid) 유도체를 포함하는 약물로서 기본적으로 탁산 고리(taxane ring)와 에스테르 측쇄(ester side chain)로 구성되어 있는 알카로이드(alkaloid) 구조를 가지고 있다. 파클리탁셀은 튜불린(tubulin) 조합체를 안정된 마이크로튜불(microtubules)로의 전환을 촉진하는 항-세포분열 활성이 있는 것으로 알려져 있으며 폐암, 유방암 등 다양한 암에 대해 효능이 알려져 있다. 이와 같이 파클리탁셀은 항암성 약물로서 탁월한 잠재적 능력을 보였지만, 물에 대한 용해도가 낮아 암 치료 분야에서의 광범위한 이용은 제한되어 왔다. 파클리탁셀의 난용성을 해결하기 위하여, 기존에는 파클리탁셀을 에탄올에 녹여 사용하였으나 최근에는 전달 효율을 높이기 위해서 파클리탁셀을 알부민과 결합시켜 주사제로 사용하고 있다. 또한, 폴리옥시에틸화 피마자유(polyoxyethylated castor oil)와 무수에탄올(absolute ethanol)의 혼합물인 크레모포 EL(Cremophor EL)이라는 용제를 사용하여 파클리탁셀의 수용해도를 개선함으로써 전신투여에 이용하는 방법이 알려져 있다. 이러한 형태로 상용화된 제제가 탁솔(TaxolTM)이다. 그러나 임상적으로 이러한 용제가 과량 투여되면 심장독성, 신경독성, 신경장애 및 과민증 등의 부작용이 나타나는 것으로 보고되었다.
아브락산(AbraxaneTM)은 상기 용제에 의해 부작용이 나타나는 등의 탁솔의 단점을 극복하기 위하여 인간 혈청 알부민과 결합된 파클리탁셀을 나노입자의 형태로 제제화한 것으로, 인간 및 동물 실험을 통해 향상된 종양반응을 나타내어 현재까지 성공적인 항암 치료제로 사용되고 있다. 그러나, 아브락산에 관한 선행 특허문헌 1(PCT/US1998/013272)에 개시된 제조방법은, 파클리탁셀 및 알부민 혼합액을 고압 균질화한 후 곧바로 빠르게 감압 건조를 수행해야만 하며, 고압 균질화 후 곧바로 빠르게 감압 건조가 연속적으로 수행되지 못할 경우, 파클리탁셀 및 알부민을 포함하는 나노입자의 입도가 시간이 경과함에 따라 대폭 증가하게 된다. 이처럼, 고압 균질화 후 나노입자의 입도분포가 균일하게 유지되지 못하고 빠르게 증가하면, 복잡한 연속공정을 반드시 채택하여야 하여 스케일업에 매우 불리하고, 감압 건조도 빠르게 진행하여야 하며, 필요에 따라 약물로 사용 불가능할 정도로 응집된 나노입자를 제거하는 추가 공정을 수행하여야 한다. 뿐만 아니라, 특허문헌 1에 개시된 공정은 출발 물질인 파클리탁셀 용액과 알부민 용액 농도가 Example 5 기준으로 각각 7.5%(w/v), 3%(w/v)로 묽으므로, 이대로 스케일업 설비를 구성할 경우 혼합조와 같은 설비의 부피가 커야만 하고, 나아가, 최종 분산액의 부피를 줄이기 위해 농축 공정을 필수적으로 수행해야 하므로, 나노입자 생산량이 대폭 떨어지는 문제가 발생한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 상기 특허문헌 1의 문제점 극복이 가능한 알부민 결합 탁산 나노입자 제조방법을 도출하기 위해 연구를 거듭한 결과, 본 발명의 일 양태에 따른 탁산 및 알부민을 포함하는 나노입자 제조방법이 특허문헌 1에 개시된 공정이 갖는 한계점, 즉, 고압 균질화 이후 감압 건조 이전 및/또는 감압 건조 과정에서 나노입자의 크기가 빠르게 증가하는 문제를 해소하였음을 확인하였다. 또한, 경제성 및 효율성 측면에서도 본 발명의 제조방법이 스케일업에 적합한 환경을 제공할 수 있음을 입증하고, 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 입도분포 유지 안정성이 개선된 탁산 및 알부민을 포함하는 나노입자 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 제조방법으로 제조되는 탁산 및 알부민을 포함하는 나노입자를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 탁산 및 알부민을 포함하는 나노입자의 입도분포 유지 안정화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 명세서에서 사용된 수치한정, 예를 들어 범위를 포함한, 온도, 시간, 압력, 양, 농도 등에 사용되는 용어 "약(about)"은 (+) 또는 (-) 10%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 사이의 범위 또는 특정 수치를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "나노입자"는 1 μm 미만의 입도 크기(dimension)를 갖는 입자를 의미한다. 본 발명의 나노입자가 정맥 내 주사를 위한 것일 경우, 상기 나노입자는 500 nm 이하의 크기를 갖는 것이 바람직하다. 구체적으로 상기 나노입자는 50-500 nm, 50-400 nm, 50-300 nm, 50-200 nm, 50-190 nm, 50-180 nm, 50-170 nm, 50-160 nm, 50-150 nm, 80-500 nm, 80-400 nm, 80-300 nm, 80-200 nm, 80-190 nm, 80-180 nm, 80-170 nm, 80-160 nm, 80-150 nm, 100-500 nm, 100-400 nm, 100-300 nm, 100-200 nm, 100-190 nm, 100-180 nm, 100-170 nm, 100-160 nm, 100-150 nm, 110-500 nm, 110-400 nm, 110-300 nm, 110-200 nm, 110-190 nm, 110-180 nm, 110-170 nm, 110-160 nm, 또는 110-150 nm의 크기를 가지는 것이 바람직하다.
입자의 집단에 있어서, 집단적 입자의 크기는 평균 및/또는 백분위수에 의해 나타낼 수 있다. 예컨대 D10은 입자의 10%가 그보다 작은 크기이고, D50은 입자의 50%가 그보다 작은 크기이며, D90은 입자의 90%가 그보다 작은 크기이다. 입자의 평균 크기는 D50으로 표현될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제1용액의 탁산의 농도는 55 내지 75 %(w/v), 60 내지 75 %(w/v), 65 내지 75 %(w/v), 70 내지 75 %(w/v), 55 내지 70 %(w/v), 55 내지 65 %(w/v), 55 내지 60 %(w/v), 60 내지 70 %(w/v), 64 내지 68 %(w/v), 또는 65 내지 67 %(w/v)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제1 용액의 용매는 에탄올, 메탄올, 이소프로필알콜, 부탄올, 디메틸설폭사이드(DMSO), 디메틸포름아미드(DMF), 테트라하이드로퓨란(THF), 아세토니트릴, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 헥산, 디에틸에테르, 벤젠, 클로로포름, 아세톤 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 제1용액의 용매는 에탄올 및 클로로포름의 혼합용매이다. 상기 에탄올:클로로포름의 부피비는 1:5 내지 1:20, 1:6 내지 1:20, 1:7 내지 1:20, 1:8 내지 1:20, 1:9 내지 1:20, 1:10 내지 1:20, 1:12 내지 1:20, 1:14 내지 1:20, 1:15 내지 1:20, 1:5 내지 1:18, 1:6 내지 1:18, 1:7 내지 1:18, 1:8 내지 1:18, 1:9 내지 1:18, 1:10 내지 1:18, 1:12 내지 1:18, 1:14 내지 1:18, 1:15 내지 1:18, 1:5 내지 1:16, 1:6 내지 1:16, 1:7 내지 1:16, 1:8 내지 1:16, 1:9 내지 1:16, 1:10 내지 1:16, 1:12 내지 1:16, 1:14 내지 1:16, 1:15 내지 1:16, 1:5 내지 1:15, 1:6 내지 1:15, 1:7 내지 1:15, 1:8 내지 1:15, 1:9 내지 1:15, 1:10 내지 1:15, 1:12 내지 1:15, 또는 1:14 내지 1:15일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제1 용액의 탁산 농도가 본 발명에서 정의한 55 내지 75 %(w/v) 범위의 하한값 미만일 경우 물 희석 단계를 수행하여도 감압 건조 이전에 주사제형의 유효성분으로 사용 불가능할 정도로 입자 크기가 200 nm 이상으로 빠르게 상승하는 문제가 발생한다.
또한, 제1 용액의 탁산 농도가 본 발명에서 정의한 55 내지 75 %(w/v) 범위의 상한값 초과일 경우 나노입자 제조과정에서 파클리탁셀이 석출되어 고압 균질화기의 정상적인 작업이 불가능하고, 나노입자의 입자도도 증가하여 75 %(w/v) 농도 초과로는 균일한 입도의 나노입자를 생산할 수 없는 문제가 발생한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 탁산은 파클리탁셀, 도세탁셀, 또는 이들의 조합일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제2용액의 알부민의 농도는 15 내지 25 %(w/v), 18 내지 25 %(w/v), 22 내지 25 %(w/v), 15 내지 22 %(w/v), 15 내지 18 %(w/v), 18 내지 22 %(w/v), 19 내지 21 %(w/v)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제2 용액의 용매는 물, 증류수, 멸균수, 인산완충식염수(PBS), 메탄올, 정제수, 에탄올, 1-프로판 올, 2-프로판올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올, 에틸렌 글라이콜, 아세톤, 2-부타논, 4-메틸-2-프로파논, 클로로포름 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 수성용매이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 제2 용액 알부민 농도가 본 발명에서 정의한 15 내지 25 %(w/v) 범위의 하한값 미만일 경우, 최종 제조되는 나노입자에서 파클리탁셀:알부민의 중량비가 아브락산(AbraxaneTM)과 동일하게 1:9로 제조되게 하기 위해 분산액의 부피가 과도하게 증가할 수밖에 없으며, 결과적으로 통상적인 충전 부피 범위가 벗어나 농축 공정이 추가로 요구되어 산업적 활용이 현실적으로 어려운 문제점이 발생한다. 또한, 제2 용액의 알부민 농도가 본 발명에서 정의한 15 내지 25 %(w/v) 범위의 상한값 초과일 경우, 물 희석 단계를 수행하여도 감압 건조 이전에 주사 제형의 유효성분으로 사용 불가능할 정도로 평균 입자 크기가 200 nm 이상으로 빠르게 상승하는 문제가 발생한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 알부민은 인간 혈청알부민(human serum albumin, HSA), 소 혈청알부민(bovine serum albumin, BSA), 난 알부민(ovalbumin, OVA), 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (c)에서 제1 용액과 제2 용액의 혼합 부피비는 1:20 내지 1:45이나, 이에 제한되는 것은 아니다. 예를 들면, 제1 용액과 제2 용액의 혼합 부피비는 1:20 내지 1:43, 1:20 내지 1:41, 1:20 내지 1:39, 1:20 내지 1:37, 1:20 내지 1:35, 1:20 내지 1:33, 1:20 내지 1:31, 1:20 내지 1:29, 1:20 내지 1:27, 1:20 내지 1:25, 1:20 내지 1:23, 1:20 내지 1:21, 1:22 내지 1:45, 1:24 내지 1:45, 1:26 내지 1:45, 1:28 내지 1:45, 1:30 내지 1:45, 1:32 내지 1:45, 1:34 내지 1:45, 1:36 내지 1:45, 1:38 내지 1:45, 1:40 내지 1:45, 1:42 내지 1:45, 1:44 내지 1:45, 1:22 내지 1:40, 1:25 내지 1:40, 1:25 내지 1:35, 1:25 내지 1:30, 1:30 내지 1:40 또는 1:30 내지 1:35 일 수 있다.
통상의 기술자가 최종 제조되는 나노입자에서 파클리탁셀:알부민의 중량비가 아브락산(AbraxaneTM) 과 동일하게 약 1:9로 제조되게 하기 위해, 및/또는 반응성을 고려해 적절한 비율을 채택해 수행할 수 있다. 상기 파클리탁셀:알부민의 중량비도 반드시 약 1:9로 한정되는 것은 아니고, 중량비 1:7 내지 11 범위, 1:8 내지 10, 또는 1:8.5 내지 9.5 범위일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 단계 (c)에서 현탁액의 제조는 고압 균질화(homogenization)에 의해 이루어진다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 고압 균질화는 10 내지 40℃, 15 내지 40℃, 20 내지 40℃, 30 내지 40℃, 또는 35 내지 40℃의 온도 조건에서 수행되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 고압 균질화는 10,000 내지 30,000 psi, 12,000 내지 30,000 psi, 15,000 내지 30,000 psi, 16,000 내지 30,000 psi, 17,000 내지 30,000 psi, 18,000 내지 30,000 psi, 10,000 내지 25,000 psi, 12,000 내지 25,000 psi, 15,000 내지 25,000 psi, 16,000 내지 25,000 psi, 17,000 내지 25,000 psi, 18,000 내지 25,000 psi, 10,000 내지 20,000 psi, 12,000 내지 20,000 psi, 15,000 내지 20,000 psi, 16,000 내지 20,000 psi, 17,000 내지 20,000 psi, 또는 18,000 내지 20,000 psi 조건에서 수행되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 고압 균질화는 1회 이상, 보다 구체적으로 1회 내지 5회, 1회 내지 4회, 또는 1회 내지 3회 수행되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (d) 단계의 희석은 현탁액의 부피 기준 3 내지 12배량, 5 내지 12배량, 7 내지 12배량, 10 내지 12배량, 3 내지 10배량, 3 내지 7배량, 3 내지 5배량, 5 내지 10배량, 또는 5 내지 7배량으로 희석될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
희석에 사용되는 수성용매의 사용 배량이 본 발명에서 정의한 3 내지 12배 범위의 하한값 미만일 경우 물 희석 단계를 수행하여도 감압 건조 이전에 주사 제형의 유효성분으로 사용 불가능할 정도로 입자 크기가 200 nm 이상으로 빠르게 상승하는 문제가 발생한다. 상기 입자크기의 증가는 나노입자 간의 응집(agglomeration)에 의한 것일 수 있다. 나노입자가 응집되면 정맥내 주사용 나노입자의 경우 혈관을 막을 수 있으므로, 나노입자의 응집 및 나노입자의 안정성은 나노입자를 포함하는 약제학적 조성물의 효능 및 안전성에 영향을 미칠 수 있다.
또한, 수성용매의 사용 배량이 본 발명에서 정의한 3 내지 12배 범위의 상한값 초과일 경우 파클리탁셀의 Free Fraction, 즉, 미봉입율이 증가할 뿐만 아니라(5.3배량 물 희석시 미봉입율 0.72% → 13배량 물 희석시 미봉입율 6.24%), 나노입자 입도 안정화에 필요 이상의 물을 사용하므로 스케일업 공정 측면에서 효율적 및 경제적이지 못한 문제가 발생한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (d) 단계의 희석액 내 나노입자는 평균 입도가 100 내지 200 nm, 또는 110 내지 190 nm 이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 제조방법은 (e) 상기 희석된 용액을 건조하여 나노입자를 수득하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 건조는 감압건조, 동결건조, 또는 가열건조일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 따른 상기 건조가 감압건조인 경우, 회전증발기(Rotary evaporator)를 사용하는 등 통상적인 감압 건조 방법을 채택하여 수행할 수 있으며, 특정 감압 건조 조건에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 감압 건조는 10 내지 70℃, 20 내지 70℃, 30 내지 70℃, 40 내지 70℃, 10 내지 60℃, 10 내지 50℃, 10 내지 40℃, 20 내지 60℃, 30 내지 50℃, 35 내지 45℃, 38 내지 42℃, 또는 39 내지 41℃ 범위의 온도 조건 하에서 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 감압 건조는 10 내지 110 hPa, 20 내지 110 hPa, 30 내지 110 hPa, 40 내지 110 hPa, 50 내지 110 hPa, 10 내지 100 hPa, 10 내지 90 hPa, 10 내지 80 hPa, 10 내지 70 hPa, 20 내지 100 hPa, 30 내지 90 hPa, 40 내지 80 hPa, 50 내지 70 hPa, 또는 55 내지 65 hPa 범위의 압력조건 하에서 이루어질 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 희석된 용액 내 존재하는 나노입자는, 건조를 수행하기 이전부터 건조를 완료하기까지 평균 입도가 100 내지 200 nm, 바람직하게는 110 내지 190 nm를 유지할 수 있다.
본 발명의 일 측면에서 제공하는 탁산 및 알부민을 포함하는 나노입자 제조방법은, 물로 희석하는 단계를 수행하지 않고 고압 균질화 후 빠르게 감압 건조하는 종래 공정 대비, 감압 건조 이전 물 희석액 내 나노입자의 평균 크기가 시간이 경과하여도 균일하게 유지되어 구조 안정성과 입도분포가 매우 우수한 현저한 효과를 나타내며, 이러한 본 발명의 효과는 후술하는 실시예, 비교예, 실험예에 의해 뒷받침된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 상술한 본 발명의 일 양태에 따른 제조방법에 의하여 제조된 탁산 및 알부민을 포함하는 나노입자를 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 일 양태에 따른 제조방법에 의해 제조된 상기 탁산 및 알부민을 포함하는 나노입자는 건조된 나노입자를 수성용매(in vivo 및 in vitro 포함)에 재구성(reconstitution)시, 건조되기 전의 나노입자(예컨대, 상기 (d) 단계의 희석액 내의 나노입자)의 특성과 실질적으로 동일한 치료활성 및 입자 특성을 가진다.
상기 건조된 나노입자를 수성 용매에 재구성시, 건조 전의 나노입자와 평균 입자의 크기, 입자의 크기 분포가 실질적으로 동일하다. 상기 실질적 동일의 의미는 동결 건조 전의 나노입자에 대한 파라미터에 비하여 동결 건조 직후의 나노입자에 대한 파라미터가 ±10% 범위, 보다 구체적으로는 ±7% 범위, ±5% 범위, ±4% 범위, 또는 ±3.5% 범위에 포함됨을 의미한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 건조된 나노입자는 실온에서 적어도 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 7개월, 8개월, 9개월, 10개월, 11개월, 12개월, 또는 그 이상의 기간동안 안정하여, 상기 기간 동안 실온에서 보관 후 수성 용매에 재구성하여도 건조 전 나노입자의 치료활성 및 입자 특성을 나타낸다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 건조는 동결건조이다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 동결건조는 건조 대상 물질인 나노입자를 동결시키고, 그 후 동결된 용매가 진공 환경에서 승화에 의해 제거되는 과정을 의미한다. 상기 동결건조 과정에는 동결건조된 제품의 보관 안정성을 강화하기 위하여 선택적으로 부형제 또는 동결보호제가 포함된다.
상기 부형제 또는 동결 보호제는 폴리머, 예컨대 덱스트란 및 폴리에틸렌 글리콜; 당류, 예컨대, 수크로오스, 글루코오스, 트레할로오스, 및 락토오스; 계면활성제, 예컨대, 폴리소르베이트; 및 아미노산, 예컨대, 글리신, 아르기닌, 및 세린을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 본 발명의 탁산 외에 1종 이상의 추가적인 치료제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 환자에게 투여되기 위하여 약제학적으로 제제화될 수 있다. 다양한 제형 및 약물 전달 시스템이 당해 기술 분야에서 이용가능하다. 예를 들면, Gennaro, A.R., ed. (1995) Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Co.를 참조할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 나노입자는 다음 경로 중 하나에 의해 약제학적 조성물로서 투여될 수 있다: 경구; 비경구, 예컨대 경피, 비강내(intranasal), 근육내, 정맥내, 피하, 피내, 종양내, 등.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 나노입자는 다음과 같은 고체, 액체, 반-고체, 또는 기체 부형제를 포함할 수 있다.
상기 고체 약제학적 부형제는 전분, 셀룰로오스, 탈크(talc), 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 맥아, 쌀, 밀가루(flour), 실리카겔, 마그네슘 스테아레이트, 소디움 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 염화 나트륨, 건조 탈지유(dried skim milk), 등을 포함한다.
상기 액체 및 반고체 부형제는 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 및 페트롤리움, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 오일을 포함한 다양한 오일, 예를 들면, 땅콩유(peanut oil), 대두유, 광유(mineral oil), 참기름 등 으로부터 선택될 수 있다. 바람직한 액체 담체, 특히, 주사용액용 액체 담체는 물, 염수, 덱스트로오스 수용액(aqueous dextrose), 및 글리콜을 포함한다. 기타 적합한 약제학적 부형제 및 그들의 제형이 E. W. Martin에 의해 편집된 Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company, 18th ed., 1990)에 기재된다.
본 발명의 구체적인 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 정맥내 주사를 위하여 제제화된다. 본 발명의 다른 구체적인 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 종양으로의 직접 주사 또는 관류를 위해 제제화된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 나노입자의 입도분포 유지 안정화 방법을 제공한다:
(a) 탁산이 55 내지 75 %(w/v)로 용해된 제1 용액을 준비하는 단계;
(b) 알부민이 15 내지 25 %(w/v)로 용해된 제2 용액을 준비하는 단계;
(c) 제1 용액과 제2 용액을 혼합하여 현탁액을 제조하는 단계; 및
(d) 상기 현탁액 부피 기준, 3 내지 12배량의 수성용매로 희석하는 단계.
상기 본 발명의 일 양태에 따른 나노입자의 입도분포 유지 안정화 방법은, 상술한 본 발명의 일 양태에 따른 나노입자의 제조방법과 (a) 내지 (d) 단계를 동일하게 포함하므로, 양 발명간에 공통된 내용은 본 명세서의 중복기재를 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 탁산 및 알부민을 포함하는 나노입자의 제조방법은, 종래 공정으로 제조된 나노입자와 비교하여, 시간이 경과하여도 나노입자의 평균 크기가 균일하게 유지되어 구조 안정성과 입도분포가 매우 우수하므로, 탁산 및 알부민을 포함하는 나노입자의 개선된 제조방법으로 유용하게 사용할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
본 명세서 전체에 걸쳐, 특정 물질의 농도를 나타내기 위하여 사용되는 "%"는 별도의 언급이 없는 경우, 고체/고체는 (중량/중량) %, 고체/액체는 (중량/부피) %, 그리고 액체/액체는 (부피/부피) %이다.
<비교예 1>
종래 방법에 따른, 파클리탁셀 및 알부민을 포함하는 나노입자 제조 1
선행특허문헌 1 (PCT/US1998/013272)의 Example 4의 방법에 따라 파클리탁셀 및 알부민을 포함하는 나노입자를 제조하였다. 구체적으로, 클로로포름 0.55 ml 및 에탄올 0.05 ml을 혼합한 클로로포름/에탄올 용매(11:1 v/v)에 파클리탁셀 30 mg을 용해시켜, 5%(w/v) 농도의 파클리탁셀 용액(제1 용액)을 준비하였다. 또한, 1 % 클로로포름으로 미리 포화시킨 1 ％ (w/v)인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 용액(제2용액) 29.4 ml을 준비하였다. 상기 준비한 제1용액과 제2용액을 혼합하고, 혼합물을 IKA homogenizer (T-25)에서 5,600 rpm으로 5분 동안 혼합하여 조 에멀젼을 형성시키고, 이어서 혼합물을 Micronox (MN400BF)에 옮기고, 22℃ 및 18,000 psi 조건에서 2 cycle, 고압 균질화 하였다. 고압 균질화가 완료된 혼합액을 회전 증발기(rotary evaporator)로 옮기고, 40℃, 60 hPa 조건으로 감압 건조하여 클로로포름을 15 내지 30분 동안 재빨리 제거하여 파클리탁셀 및 알부민을 포함하는 나노입자를 제조하였다.
<비교예 2>
종래 방법에 따른, 파클리탁셀 및 알부민을 포함하는 나노입자 제조 2
선행특허문헌 1 (PCT/US1998/013272)의 Example 5의 방법에 따라 파클리탁셀 및 알부민을 포함하는 나노입자를 제조하였다. 구체적으로, 클로로포름 2.7 ml 및 에탄올 0.3 ml을 혼합한 클로로포름/에탄올 용액(9:1 v/v)에 파클리탁셀 225 mg을 용해시켜, 7.5%(w/v) 농도의 파클리탁셀 용액(제1용액)을 준비하였다. 또한, 3 % (w/v) 인간 혈청 알부민(human serum albumin, HSA) 용액(제2용액) 97 ml를 준비하였다. 상기 준비한 제1용액과 제2용액을 혼합하고, 혼합물을 IKA homogenizer (T-25)에서 5,600 rpm으로 5분 동안 혼합하여 조 에멀젼을 형성시키고, 이어서 혼합물을 Micronox (MN400BF)에 옮기고, 22℃ 및 18,000 psi 조건에서 2 cycle, 고압 균질화 하였다. 고압 균질화가 완료된 혼합액을 회전 증발기(rotary evaporator)로 옮기고, 40℃, 60 hPa 조건으로 감압 건조하여 클로로포름을 15 내지 30분 동안 재빨리 제거하여 파클리탁셀 및 알부민을 포함하는 나노입자를 제조하였다.
<실시예 1 내지 실시예 14 >
본 발명의 파클리탁셀 및 알부민을 포함하는 나노입자 제조
본 발명자들은 파클리탁셀 및 알부민을 포함하는 나노입자를 하기와 같이 제조하였다. 하기 실험 프로토콜은 하기 표 1에서 실시예 3에 해당한다.
클로로포름 및 에탄올이 14:1 부피비로 혼합된 1.5 ml 클로로포름/에탄올 용매(14:1 v/v)에 파클리탁셀 1 g을 용해시켜, 66.7 %(w/v) 농도의 파클리탁셀 용액(제1 용액)을 준비하였다. 또한, 20 %(w/v) 농도의 알부민 수용액(제2 용액, 녹십자알부민주20%, Greencross Human Serum Albumin Inj. 20%) 45 ml를 준비하였다. 상기 준비한 제1 용액과 제2 용액을 혼합하고, 혼합물을 IKA homogenizer (T-25)에서 5,600 rpm으로 5분 동안 혼합하였다. 이어서, 혼합물을 Micronox (MN400BF)에 옮기고, 22℃ 및 18,000 psi 조건에서 2 cycle, 고압 균질화 하였다. 고압 균질화가 완료된 혼합액을, 부피 기준 5.3배량의 물로 희석하였다. 희석된 혼합액은 Rotary evaporator를 사용하여 40℃, 60 hPa 조건으로 감압 건조하여, 파클리탁셀 및 알부민을 포함하는 나노입자를 제조하였다.
전술한 방법을 동일하게 수행하되, 제1 용액의 농도, 제2 용액의 농도, 또는 희석에 사용한 물 사용 배량 조건을 다양하게 변화시키며 나노입자를 제조하였으며, 실시예 별 구체적인 변수 조건을 하기 표 1에 나타내었다.
하기 표 1에서 제1 용액 및 제2 용액의 혼합 부피 비는, 제1 용액과 제2 용액의 농도에 따라 결정하였으며, 이는 최종 제조되는 나노입자에서 파클리탁셀:알부민의 중량비가 아브락산(Abraxane)®과 동일하게 1:9로 제조되게 하기 위함이다.
실시예 제1 용액 농도, % (w/v) 제2 용액 농도, % (w/v) 물 사용
배량		 제1, 2 용액
혼합 부피 비
1 55.0 20 5.3 1 : 24.8
2 60.0 1 : 27.0
3 66.7 1 : 30.0
4 70.0 1 : 31.5
5 75.0 1 : 33.8
6 66.7 15 5.3 1 : 40.0
7 18 1 : 33.4
8 22 1 : 27.3
9 25 1 : 24.0
10 66.7 20 3.0 1 : 30.0
11 5.0
12 7.0
13 10.0
14 12.0
비교예 1 5 1 - 1 : 49.0
비교예 2 7.5 3 - 1 : 32.3
상기 표 1에 기재된 실시예 1 내지 실시예 14의 제조방법과, 선행 특허문헌 1 (PCT/US1998/013272)의 Example 4 및 5에 기재된 제조방법(비교예 1 및 2)은, i) 상기 제1 용액 및 제2 용액의 농도가 상이하고, ii) 고압 균질화가 완료된 혼합액을 감압 건조하는 공정 이전에 물로 희석하는 공정을 추가로 포함하는지 여부에 차이가 있다.
<비교예 3 내지 12>
희석 단계를 생략한, 파클리탁셀 및 알부민을 포함하는 나노입자 제조
본 발명자들은 비교예 1 및 2의 제조방법과 비교하여 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 14의 제조방법이 추가적으로 포함하는 '고압 균질화가 완료된 혼합액을 감압 건조하는 공정 이전에 물로 희석하는 공정'이, 제조되는 파클리탁셀 및 알부민을 포함하는 나노입자의 품질에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 비교예 3 내지 12의 실험을 수행하였다.
구체적으로, 제1 용액 및 제2 용액을 혼합하고 고압 균질화 한 후, 감압 건조 이전에 물 희석 단계만을 제외하고, 전술한 실시예 1 내지 14와 동일한 제조방법으로 파클리탁셀 및 알부민을 포함하는 나노입자를 제조하였다. 구체적인 비교예 별 변수 조건은 하기 표 2에 나타내었다.
비교예 제1 용액 농도, %(w/v) 제2 용액 농도, %(w/v) 물 사용
배량		 제1, 2 용액
혼합 부피 비
3 55.0 20 X
(실시예와 비교하여 물 희석 단계만 수행하지 않음)		 1 : 24.8
4 60.0 1 : 27.0
5 66.7 1 : 30.0
6 70.0 1 : 31.5
7 75.0 1 : 33.8
8 66.7 15 1 : 40.0
9 18 1 : 33.4
10 22 1 : 27.3
11 25 1 : 24.0
12 66.7 20 1 : 30.0
<비교예 13 내지 24>
i) 제1 용액 농도(%(w/v)), ii) 제2 용액 농도(%(w/v)), 및 iii) 희석에 사용되는 물 사용 배량 별, 파클리탁셀 및 알부민을 포함하는 나노입자 제조
본 발명자들은 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 14에서 설정한 i) 제1 용액 농도(%(w/v)), ii) 제2 용액 농도(%(w/v)), 및 iii) 희석에 사용되는 물 사용 배량이, 제조되는 파클리탁셀 및 알부민을 포함하는 나노입자의 품질에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위하여, 비교예 13 내지 24의 실험을 수행하였다.
구체적으로, 전술한 실시예 1 내지 14에서 설정한 제1 용액 농도(%(w/v)), 제2 용액 농도(%(w/v)), 및 희석에 사용되는 물 사용 배량 범위를 벗어나는 조건에서, 파클리탁셀 및 알부민을 포함하는 나노입자를 동일한 방법으로 제조하였다. 구체적인 비교예 별 변수 조건은 하기 표 3에 나타내었다.
전술한 실시예 1 내지 14에서와 마찬가지로, 하기 표에서 제1, 2 용액의 혼합 부피 비는, 제1 용액과 제2 용액의 농도에 따라 결정하였으며, 이는 최종 제조되는 나노입자에서 파클리탁셀:알부민의 중량비가 아브락산(Abraxane)®과 동일하게 1:9로 제조되게 하기 위함이다.
비교예 제1 용액 농도, %(w/v) 제2 용액 농도, %(w/v) 물 사용
배량		 제1, 2 용액
혼합 부피 비
13 45.0 20 5.3 1 : 20.3
14 50.0 1: 22.5
15 80.0 1 : 36.0
16 85.0 1 : 38.3
17 66.7 5 5.3 1 : 120.0
18 10 1 : 60.0
19 30 1: 20.0
20 35 1 : 17.1
21 66.7 20 1.0 1 : 30.0
22 2.0
23 13.0
24 14.0
<실험예 1>
종래 공정(PCT/US1998/013272) 대비, 본 발명의 나노입자의 입도분포 유지 우수성 비교평가
고압 균질화 이후 감압 건조 단계에서 용매가 완전히 제거될 때까지, 고압 균질화된 혼합액 내 나노입자의 입도분포(Particle Size Distribution, PSD)가 일정하게 유지되는 효과가 달성되면, 결과적으로 높은 생산량으로 파클리탁셀 및 알부민을 포함하는 나노입자를 제조할 수 있다.
여기서 더 나아가, 고압 균질화 이후 감압 건조 이전에 일정 시간이 경과하여도 나노입자의 입도분포가 일정하게 유지되는 효과가 달성되면, 제조공정 중 나노입자 제품의 입자도에 안정성이 확보되어 경제적이고 효율적이며 스케일업에도 적합한 기술로 적극 활용될 수 있다.
이에, 종래 방법인 비교예 1 및 2의 제조방법과, 본 발명의 실시예 1 내지 14의 제조방법에서 제조된, 감압 건조 이전 혼합액(실시예의 경우, 물 희석액) 내 나노입자의 입도분포가 시간이 경과함에 따라 안정하게 유지되는지 비교 평가하였다.
보다 구체적으로, 제타사이저 (Malvern Zetasizer, Malvern Instruments Ltd.)를 사용하여, 시간 경과에 따른 비교예 1 내지 2에서 고압 균질화한 혼합액, 및 실시예 1 내지 14에서 물로 희석한 희석액 내 나노입자의 입도분포를 비교 평가하였다. 제타사이저 상에서 현탁액의 측정 방법은 하기 인자의 조절을 포함하였다: 온도 25.0℃ 산란각 90°, 굴절율 분산 1.33, 점도 (자동) 0.8872cP. 상기 재분산된 각각의 현탁액 1 ml을 3차 증류수 10 ml로 희석하고, 그 중 1 ml을 큐벳으로 옮긴 뒤 제타사이저의 큐벳 홀더에 위치시킨 후 입자도 분석을 시작하였다. 다중모드 분석을 통해 3회 반복 분석 후 평균 값을 얻었다.
그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
구분 Z-average (nm)
0분 20분 40분 60분 80분 100분 120분
실시예 1 146.5 156.8 157.8 158.9 157.5 159.3 160.2
실시예 2 151.1 151.2 151.8 152.3 151.7 152.8 151.8
실시예 3 155.3 156.4 154.8 155.2 155.3 154.8 154.6
실시예 4 156.7 156.2 155.8 157.8 156.8 157.2 158.4
실시예 5 160.6 159.8 160.1 160.8 161.2 160.8 159.8
실시예 6 153.5 153.2 153.9 154.2 154.8 153.2 153.8
실시예 7 154.1 153.8 154.5 156.5 155.8 154.2 155.7
실시예 8 153.3 153.1 152.8 154.7 154.2 154.7 154.3
실시예 9 153.3 161.2 163.5 164.2 163.2 164.2 163.2
실시예 10 150.3 175.4 178.6 179.2 178.6 179.5 178.8
실시예 11 155.2 154.8 154.9 155.4 155.8 154.1 153.7
실시예 12 153.6 154.8 153.4 155.2 153.8 154.2 152.6
실시예 13 149.8 150.2 150.8 151.4 150.8 151.8 152.8
실시예 14 151.3 151.8 150.9 150.2 150.6 152.8 153.7
비교예 1 151.3 430.1 472.7 562.8 696.1 798.5 805.3
비교예 2 158.2 458.6 508.4 578.3 689.4 781.6 813.6
표 4에 나타낸 바와 같이, 고압 균질화 이후 감압 건조 이전에 물로 희석하는 단계가 포함된 본 발명의 제조방법(실시예 1 내지 14)은, 물로 희석하는 단계를 수행하지 않고 고압 균질화 후 빠르게 감압 건조하는 종래 제조방법(비교예 1 및 2) 대비, 나노입자의 크기가 시간이 경과하여도 오랫동안 유지되어 나노입자의 구조 안정성과 입도분포가 상대적으로 매우 우수함을 알 수 있다.
구체적으로, PCT/US1998/013272의 Example 4 및 5에 해당하는 비교예 1 및 2의 나노입자는, 고압 균질화 후 20분만에 주사 제형의 활성성분으로 사용 불가능할 정도로 Z-average (nm)가 430.1 nm, 458.6 nm 이상으로 커지는 것을 확인할 수 있었다. 반면, 본 발명의 실시예 1 내지 14의 나노입자는 모두 120분이 경과하여도 Z-average (nm)가 < 200 nm를 유지하여 입도분포가 매우 우수함을 알 수 있다.
감압 건조 이전 혼합액(실시예의 경우, 물 희석액) 내 나노입자의 입도분포가 우수하게 유지됨은 스케일업 공정을 구성함에 있어서도 매우 큰 이점이 있다.
보다 구체적으로, PCT/US1998/013272에 개시된 공정처럼 고압 균질화 후 나노입자의 입도분포가 균일하게 유지되지 못하고 빠르게 증가하면, 복잡한 연속공정을 반드시 채택하여야 하여 스케일업에 매우 불리하고, 감압 건조도 빠르게 진행하여야 하며, 필요에 따라 약물로 사용 불가능할 정도로 응집된 나노입자를 제거하는 추가 공정을 수행하여야 한다. 뿐만 아니라, PCT/US1998/013272에 개시된 공정은 출발 물질인 파클리탁셀 용액과 알부민 용액 농도가 Example 5 기준으로 각각 7.5%(w/v), 3%(w/v)로 묽으므로, 이대로 스케일업 설비를 구성할 경우 혼합조와 같은 설비의 부피가 커야만 하고, 나아가, 최종 분산액의 부피를 줄이기 위해 농축 공정을 필수적으로 수행해야 하므로, 나노입자 생산량이 대폭 떨어지는 문제가 발생한다.
반면, 본 발명에 따른 <실시예 1-14> 방법과 같이, 희석 단계로 인해 희석액 내 나노입자의 입도분포가 균일하게 유지되면 복잡한 연속공정을 채택할 필요가 없고, 감압 건조를 빠르게 수행할 필요도 없으며, 약물로 사용 불가능할 정도로 응집된 나노입자를 제거하는 추가 공정도 불필요하고, 이에 최종 나노입자 생산량이 대폭 개선되는 현저한 효과가 발생한다. 뿐만 아니라, 본 발명에서 제공하는 제조방법은 원료인 상기 제1, 제2 용액을 높은 농도로 사용하여 원료의 부피가 작으므로, 스케일업을 고려할 때 작업성이 개선될 수 있는 효과도 발생한다.
이로부터, 본 발명의 일 측면에서 제공하는 나노입자 제조방법은, PCT/US1998/013272에 개시된 공정이 갖는 한계점, 즉, 고압 균질화 이후 감압 건조 이전까지 나노입자의 크기가 빠르게 증가하는 문제를 해소하였을 뿐만 아니라, 경제성 및 효율성 측면에서도 스케일업에 적합한 환경을 제공할 수 있음을 알 수 있다.
<실험예 2>
물 희석 단계 유무에 따른, 본 발명의 나노입자의 입도분포 유지 우수성 비교평가
전술한 실시예 1 내지14 및 비교예 3 내지 12는, 각각 고압 균질화 이후 감압 건조 수행 이전에 물 희석 단계를 수행하는지 생략하는지에 공정상 차이가 있고, 나머지 조건은 모두 동일하다.
상기 실험예 1과 동일한 방법으로, 본 발명의 실시예 1 내지 14와 비교예 3 내지 12에서 제조된, 감압 건조 이전 혼합액(실시예의 경우, 물 희석액) 내 나노입자의 입도분포가 시간이 경과함에 따라 안정하게 유지되는지 비교 평가하였다.
결과는 하기 표 5에 나타내었다.
실시예 Z-average (nm) 비교예 Z-average (nm)
0분 60분 120분 0분 60분 120분
1 146.5 158.9 160.2 3 142.2 601.6 687.3
2 151.1 152.3 151.8 4 152.6 586.9 651.2
3 155.3 155.2 154.6 5 154.8 526.2 631.9
4 156.7 157.8 158.4 6 154.2 523.1 625.1
5 160.6 160.8 159.8 7 157.9 503.8 594.2
6 153.5 154.2 153.8 8 152.1 581.8 648.3
7 154.1 156.5 155.7 9 155.8 572.9 637.2
8 153.3 154.7 154.3 10 154.2 598.8 647.3
9 153.3 164.2 163.2 11 155.8 618.9 662.1
10 150.3 179.2 178.8 12 154.8 526.4 631.9
11 155.2 155.4 153.7
12 153.6 155.2 152.6
13 149.8 151.4 152.8
14 151.3 150.2 153.7
표 5에 나타낸 바와 같이, 고압 균질화 이후 감압 건조 수행 이전에 물 희석 단계를 수행한 본 발명의 실시예 1 내지 14의 희석액 내 나노입자는 시간이 경과하여도 입도분포가 균일하게 유지되었다. 반면, 물 희석 단계를 포함하지 않는 비교예 3 내지 12의 혼합액 내 나노입자는 시간이 경과함에 따라 나노입자의 크기가 주사 제형의 활성성분으로 사용 불가능할 정도로 빠르게 커짐을 알 수 있다.
상기 결과로부터, 본 발명의 실시예가 포함하는 물 희석 단계를 반드시 수행해야만, 스케일업 공정을 구성함에 있어 실험예 1에서 설명한 이점이 확보될 수 있음을 알 수 있다.
<실험예 3>
i) 제1 용액 농도(%(w/v)), ii) 제2 용액 농도(%(w/v)), 및 iii) 희석에 사용되는 물 사용 배량 별, 본 발명의 나노입자의 입도분포 유지 우수성 비교평가
본 발명자들은 본 발명의 나노입자의 입도분포에 i) 제1 용액 농도(%(w/v)), ii) 제2 용액 농도(%(w/v)), 및 iii) 희석에 사용되는 물 사용 배량에 따라 어떤 문제점이 발생하는지 확인하기 위하여, 상술한 비교예 13 내지 24에 따라 나노입자를 제조하고, 실험예 1과 같은 방법으로 입도 분포를 측정하였다.
실험예 3-1. 제1 용액 농도(%(w/v))
전술한 비교예 13 내지 16의 제조 조건은 표 6에 나타내었고, 입도분포 데이터는 표 7에 나타내었다.
비교예 제1 용액 농도, %(w/v) 제2 용액 농도, %(w/v) 물 사용
배량		 제1, 2 용액
혼합 부피 비
13 45.0 20 5.3 1 : 20.3
14 50.0 1 : 22.5
15 80.0 1 : 36.0
16 85.0 1 : 38.3
비교예 Z-average (nm)
0분 20분 40분 60분 80분 100분 120분
13 149.9 189.5 205.6 227.6 231.5 236.6 231.5
14 148.4 180.9 196.8 218.6 218.1 220.8 225.9
15 - - - - - - -
16 - - - - - - -
-: 나노입자 제조과정에서 파클리탁셀이 석출되어 고압 균질화기의 정상적인 작업이 불가능하였고, 나노입자의 입자도가 측정 불가능할 정도로 증가함
상기 표 7에 나타낸 바와 같이, 제1 용액 농도가 본 발명에서 정의한 55-75% (w/v) 범위의 하한값 미만일 경우(즉, 비교예 13, 14의 경우), 물 희석 단계를 수행하여도 감압 건조 이전에 주사제형의 유효성분으로 사용 불가능할 정도로 입자 크기가 200 nm 이상으로 빠르게 상승하는 문제가 발생하였다.
또한, 제1 용액 농도가 본 발명에서 정의한 55-75% (w/v) 범위의 상한값 초과일 경우(즉, 비교예 15, 16의 경우) 나노입자 제조과정에서 파클리탁셀이 석출되어 고압 균질화기의 정상적인 작동이 불가능하였다. 또한 나노입자의 입자도도 증가하여 제1 용액 농도가 75% (w/v)를 초과하는 경우에는 균일한 입도의 나노입자를 생산할 수 없음을 확인하였다.
실험예 3-2. 제2 용액 농도(%(w/v))
전술한 비교예 17 내지 20의 제조 조건은 표 8에 나타내었고, 입도분포 데이터는 표 9에 나타내었다.
비교예 제1 용액 농도, %(w/v) 제2 용액 농도, %(w/v) 물 사용
배량		 제1, 2 용액
혼합 부피 비
17 66.7 5 5.3 1 : 120.0
18 10 1 : 60.0
19 30 1: 20.0
20 35 1 : 17.1
비교예 Z-average (nm)
0분 20분 40분 60분 80분 100분 120분
19 166.4 204.2 216.8 226.5 221.5 228.8 226.7
20 167.8 216.8 226.1 239.1 240.5 241.6 245.8
상기 표 8 및 9에 나타낸 바와 같이, 제2 용액 농도가 본 발명에서 정의한 15-25% (w/v) 범위의 하한값 미만일 경우(즉, 비교예 17, 18의 경우), 상기 표 8의 제1, 2 용액 혼합 부피 비에 1 : 120.0, 1 : 60.0으로 제시된 바와 같이, 최종 제조되는 나노입자에서 파클리탁셀:알부민의 중량비가 아브락산 (AbraxaneTM)과 동일하게 1:9로 제조되게 하기 위한 분산액의 부피가 과도하게 증가할 수밖에 없었다. 그 결과, 혼합용액의 부피비가 통상적인 충전 부피 범위를 벗어나 농축 공정이 추가로 요구되어 산업적 활용이 현실적으로 어렵다는 문제점이 발생하였다.
또한, 15-25% (w/v) 범위의 상한값 초과일 경우(즉, 비교예 19, 20의 경우), 물 희석 단계를 수행하여도 감압 건조 이전에 주사 제형의 유효성분으로 사용 불가능할 정도로 입자 크기가 200 nm 이상으로 빠르게 상승하는 문제가 발생함을 확인하였다.
실험예 3-3. 물 사용 배량
전술한 비교예 21 내지 24의 제조 조건은 표 10에 나타내었고, 입도분포 데이터는 표 11에 나타내었다.
비교예 제1 용액 농도, %(w/v) 제2 용액 농도, %(w/v) 물 사용
배량		 제1, 2 용액
혼합 부피 비
21 66.7 20 1.0 1 : 30.0
22 2.0
23 13.0
24 14.0
비교예 Z-average (nm)
0분 20분 40분 60분 80분 100분 120분
21 153.8 242.5 268.8 278.5 271.5 289.5 281.5
22 154.2 202.7 223.8 235.8 234.6 239.5 248.1
상기 표 11에 나타낸 바와 같이, 희석을 위한 물 사용 배량이 본 발명에서 정의한 3-12배 범위의 하한값 미만일 경우(즉, 비교예 21, 22의 경우) 물 희석 단계를 수행하여도 감압 건조 이전에 주사 제형의 유효성분으로 사용 불가능할 정도로 입자 크기가 200 nm 이상으로 빠르게 상승하는 문제가 발생하였다.
또한, 물 사용 배량이 본 발명에서 정의한 3-12 배 범위의 상한값 초과일 경우(즉, 비교예 23, 24의 경우) 파클리탁셀의 Free Fraction, 즉, 미봉입율이 증가할 뿐만 아니라(5.3배량 물 희석시 미봉입율 0.72% → 13배량 물 희석시 미봉입율 6.24%), 나노입자 입도 안정화에 필요 이상의 물을 사용하므로 스케일업 공정 측면에서 효율적 및 경제적이지 못한 문제가 발생한다.
상기 파클리탁셀의 미봉입율은 다음과 같은 방법으로 확인하였다:
실시예 3(5.3배량 물 희석) 또는 비교예 23(13배량 물 희석)에서 제조된 검체를 한외여과 하여 하층액을 HPLC로 분석하였다.
<미봉입 파클리탁셀의 HPLC 분석>
크로마토그래피계
HPLC: 애질런트테크놀로지스 (Agilent Technologies) G7111A 용매 전달계
애질런트테크놀로지스 G7129A 자동 주입기
애질런트테크놀로지스 G7114A 가변형 파장 검출기
애질런트테크놀로지스 G7116A 칼럼 오븐
칼럼: FluoroSep-RP Phenyl, 5 μm, 4.6 mm x 25 cm, 퍼킨엘머 (Perkin Elmer®)
칼럼 온도: 25℃
이동상: 물/아세토니트릴 11:9
유동 속도: 1.5mL/분
검출: 227 nm
주입량: 10 μL
분석 시간: 20분
그 결과 실시예 3과 같이 5.3배량의 물로 희석한 경우에 파클리탁셀의 미봉입율은 0.72%였고, 비교예 23과 같이 13배량의 물로 희석시 파클리탁셀의 미봉입율은 6.24%였다. 실시예 3과 비교예 23의 제조방법상의 차이는 오직 물 희석 배량에만 있는 바, 물 희석 배량은 양질의 나노입자를 제조하기 위한 스케일업 공정 도입에 중요한 구성임을 알 수 있다.
상기 실험예 2 및 실험예 3의 결과로부터, 본 발명의 실시예 1 내지 14에 따른 나노입자 제조방법은 대표적으로 제1 및 제2 용액의 농도와 감압 건조 이전 물로 희석하는 단계가 유기적으로 연결되어, 고압 균질화된 희석액 내 나노입자의 입도분포가 일정하게 유지되는 현저한 효과가 달성되고, 결과적으로 높은 생산량으로 파클리탁셀 및 알부민을 포함하는 나노입자를 제조할 수 있음을 알 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명과 같이 고압 균질화 후 나노입자의 입도분포가 일정 시간이 경과하여도 일정하게 유지되면, 종래 공정의 한계점인 스케일업(Scale-up)에 불리하고 복잡한 연속공정을 채택할 필요가 없고, 나아가 약물로 사용 불가능할 정도로 응집된 나노입자를 제거하는 추가 단계를 수행할 필요도 없어, 경제적이고 효율적이며 스케일업에도 적합한 기술로 적극 활용될 수 있음을 알 수 있다.
<실험예 4>
동결건조 및 재용해시의 입도 분포 평가 (입도 균일성 및 재생 용이성)
상기 실시예 1 내지 14의 파클리탁셀 및 알부민을 포함하는 나노입자 제조과정 수행 후 이어서, i) 나노입자의 동결건조 전, 그리고 ii) 동결건조 후 재용해시 입도가 균일하게 유지되는지 확인하였다.
보다 구체적으로, 감압건조를 통해 유기용매가 제거된 분산액을 0.22 μm pore size 여과기(Sartorius)를 통해 여과하였다. 여과된 액은 동결건조용 유리 바이알에 충전 후 72시간 동결건조 시켰다. 동결건조 후 얻어진 동결건조 분말이 들어있는 바이알에 3차 증류수 또는 0.9% 식염수 20 ml을 넣어 재분산 하였다. 입도 분포 측정 결과는 하기 표 12에 나타내었다.
실시예 Z-average (nm)
동결건조 전 동결건조 후 재용해시
1 146.5 151.6
2 151.1 150.9
3 155.3 154.2
4 156.7 155.4
5 160.6 159.3
6 153.5 153.6
7 154.1 154.8
8 153.3 153.9
9 153.3 154.8
10 150.3 151.4
11 155.2 154.7
12 153.6 153.0
13 149.8 150.4
14 151.3 151.6
표 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 따른 실시예 1 내지 14에서 제조한 나노입자는 동결건조 전, 그리고 동결건조 후 재용해시 입도가 균일하게 유지됨을 확인하였다.

Claims (12)

  1. 다음 단계를 포함하는 탁산 및 알부민을 포함하는 나노입자 제조방법:
    (a) 탁산이 55 내지 75 %(w/v)로 용해된 제1 용액을 준비하는 단계;
    (b) 알부민이 15 내지 25 %(w/v)로 용해된 제2 용액을 준비하는 단계;
    (c) 제1 용액과 제2 용액을 혼합하여 현탁액을 제조하는 단계; 및
    (d) 상기 현탁액 부피 기준, 3 내지 12배량의 수성용매로 희석하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, (e) 상기 희석된 용액을 건조하여 나노입자를 수득하는 단계를 추가적으로 포함하는, 제조방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 희석된 용액 내 존재하는 나노입자는, 건조를 수행하기 이전부터 건조를 완료하기까지 평균 입도가 100 내지 200 nm를 유지하는, 제조방법.
  4. 제2항에 있어서, 상기 희석된 용액 내 존재하는 나노입자는, 건조를 수행하기 이전부터 건조를 완료하기까지 평균 입도가 110 내지 190 nm를 유지하는, 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 탁산은 파클리탁셀, 도세탁셀, 또는 이들의 조합인, 제조방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 알부민은 인간 혈청알부민(human serum albumin, HSA), 소 혈청알부민(bovine serum albumin, BSA), 난 알부민(ovalbumin, OVA), 또는 이들의 조합인, 제조방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 제1 용액과 제2 용액의 혼합 부피비는 1:20 내지 1:45인, 제조방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 단계 (c)에서 현탁액의 제조는 고압 균질화(homogenization)에 의해 이루어지는 것인, 제조방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 고압 균질화는 10 내지 40℃의 온도 조건에서 수행되는 것인, 제조방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 고압 균질화는 10,000 내지 30,000 psi의 압력 조건에서 수행되는 것인, 제조방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 제조되는, 탁산 및 알부민을 포함하는 나노입자.
  12. 다음 단계를 포함하는 탁산 및 알부민을 포함하는 나노입자의 입도분포 유지 안정화 방법:
    (a) 탁산이 55 내지 75 %(w/v)로 용해된 제1 용액을 준비하는 단계;
    (b) 알부민이 15 내지 25 %(w/v)로 용해된 제2 용액을 준비하는 단계;
    (c) 제1 용액과 제2 용액을 혼합하여 현탁액을 제조하는 단계; 및
    (d) 상기 현탁액 부피 기준, 3 내지 12배량의 수성용매로 희석하는 단계.
PCT/KR2022/016812 2021-11-03 2022-10-31 입도분포 유지 안정성이 개선된 알부민 결합 탄산 나노입자 제조방법 WO2023080575A1 (ko)

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