WO2017142164A1 - 항암제 약물전달체 및 이의 제조방법 - Google Patents

항암제 약물전달체 및 이의 제조방법 Download PDF

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WO2017142164A1
WO2017142164A1 PCT/KR2016/011977 KR2016011977W WO2017142164A1 WO 2017142164 A1 WO2017142164 A1 WO 2017142164A1 KR 2016011977 W KR2016011977 W KR 2016011977W WO 2017142164 A1 WO2017142164 A1 WO 2017142164A1
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drug
polymer
diglycidyl ether
anticancer drug
anticancer
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PCT/KR2016/011977
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English (en)
French (fr)
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김상진
배진건
김정용
올리니크세르게이
최명
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㈜메디프레소
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    • A61K9/70—Web, sheet or filament bases ; Films; Fibres of the matrix type containing drug

Definitions

  • the present invention relates to an anticancer drug carrier and a method for preparing the same, and more particularly, to an anticancer drug carrier and a method for preparing the same, which are applied to a tumor tissue site or a tumor removal site to be converted into a gel and firmly adhered to release the anticancer drug. It is about.
  • the anticancer administration method developed to date is made in an extremely limited range, and the anticancer agent acts on normal cells and has many side effects. Therefore, research is being conducted to develop anticancer drugs that selectively act on cancer cells without affecting normal cells.
  • the first research direction is to prepare and use anticancer-polymer complexes that connect anticancer agents to polymers, and the second research direction is to use transmucosal delivery systems.
  • the anticancer agent-polymer complex may treat cancer cells by using pathophysiological characteristics of cancer tissues different from normal cells.
  • cancerous tissues produce more blood vessels than normal tissues in order to receive more nutrients than normal tissues, and have large and sloppy structures. Therefore, the polymer constituting the complex is more easily penetrated into the cancer tissue than normal tissue or organ, and is not easily discharged from the cancer tissue.
  • the characteristic phenomenon of the cancer tissue is called an enhanced permeability and retention (EPR) effect.
  • EPR enhanced permeability and retention
  • the anticancer agent-polymer complex has a limited molecular weight range and a mode of administration of the polymer to be applied, and most of them have to react in an organic solvent, which may cause toxicity, and may cause various inflammatory reactions due to problems in biocompatibility. If you do not have a disadvantage is not easy to remove from the body.
  • the transmucosal delivery system is a method of administering a drug, which not only rapidly exerts drug efficacy systemically or locally, but also exhibits rapid drug clearance, thus ultimately increasing bioavailability of the drug.
  • Most anticancer drugs work by inhibiting the synthesis of hexane, the body of intracellular genetic factors, or by directly binding to hexane and impairing its function.
  • current anticancer drugs do not selectively act on cancer cells during vascular transmucosal injection, but also damage normal cells, especially tissue cells with active cell division, resulting in various side effects such as bone marrow function, gastrointestinal mucosal damage, and hair loss. . In other words, the same problem occurs because the precise injection and release is not made to the target site.
  • Non-Patent Documents 1 and 2 Studies have been reported to develop micelles or emulsions using surfactants such as polysorbate 80 or polysamers to develop them as transmucosal carriers or injections to increase the solubility and absorption of anticancer agents and to prevent crystallization in solution. have. [See Non-Patent Documents 1 and 2] However, still no satisfactory results have been obtained.
  • Non-Patent Document 1 Gao et al., Drug Dev. Ind. Pharm., 34 (11), 1227-1237 (2008)
  • Non-Patent Document 2 Chen et al., Drug Dev. Ind. Pharm., 34 (6), 588-594 (2008)
  • the present invention provides an anticancer drug delivery agent of a new formulation having a function of preventing cancer metastasis through microvascularity by forming an artificial barrier and applying an artificial barrier to the affected area such as a tumor tissue site or a tumor removal site. It aims to do it.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preparing the anticancer drug carrier.
  • the present invention is an anticancer drug; Hydrogel polymer containing the drug inside the core; And a temperature sensitive polymer which is converted into a gel in the body. Characterized in that it contains an anticancer drug carrier.
  • the drug carrier comprises 0.6-2.2% by weight of an anticancer drug; 6.2 to 21.7 wt% of a hydrogel polymer containing the drug in the core; And 76.1 to 93.2% by weight of a temperature sensitive polymer which is converted into a gel in the body; May be included.
  • the anticancer drug is cyclophosphamide, Ifosfamide, Procarbazine, Busulfan, Carmustine, Romustine ( Lomustine, dacarbazine, Cisplatin, Mesotrexate, 5-Fluorouracil, Capecitabine, Cytosine Arabinoside, Gemcitabine ), Vinblastine, Vincristine, Paclitaxel, Docetaxel, Etoposide, Topotecan, Irinotecan, Mitomycin-C ), Daunorubicin, Doxorubicin, Bleomycin, L-asparaginase, Hydroxyurea, Rituximab, Trastuzumab, Trastuzumab, Imatinib, Pitti nip (Gefitinib), Ilo tinip (Erlotinib), may be at least one member selected from the group consisting of pharmaceutically acceptable salts and hydrates.
  • the hydrogel polymer may be prepared by hydrogelation of a crosslinked polymer formed by crosslinking a hydrophilic polymer having a hydroxy functional group and a crosslinking agent having an epoxy functional group.
  • the hydrophilic polymer having a hydroxy functional group has a weight average molecular weight of 10,000 to 1,000,000 g / mol, alginic acid, hyaluronic acid, dextran, hydroxypropyl methyl cellulose, carboxymethyl cellulose and their It may be at least one selected from the group consisting of salts of alkali metals or alkaline earth metals.
  • the crosslinking agent having the epoxy functional group is epichlorohydrin, epibromohydrin, butanediol diglycidyl ether, ethylene glycol diglycidyl ether, hexanediol diglycidyl ether, propylene Glycol diglycidyl ether, polyethylene glycol diglycidyl ether, polypropylene glycol diglycidyl ether, polytetramethylene glycol diglycidyl ether, neopentyl glycol diglycidyl ether, polyglycerol polyglycidyl ether , Diglycerol polyglycidyl ether, polyglycerol polyglycidyl ether, glycerol polyglycidyl ether, trimethyl propane polyglycidyl ether, bis (epoxypropoxy) ethylene, pentaerythritol polyglycidyl ether and It may be at least
  • the temperature-sensitive polymer is a polymer having a weight average molecular weight of 500 to 500,000 g / mol and containing an ether functional group, a poly (ethylene oxide), poly (ethylene oxide-propylene oxide) random copolymer , Polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide triblock copolymer, poly (ethylene glycol) -poly (L-lactic acid) -poly (ethylene glycol), alkylated polyethylene oxide block copolymer and poly (vinyl methyl ether) It may be at least one selected from the group consisting of.
  • the drug carrier may be applied directly to the tumor tissue site or tumor removal site.
  • the drug carrier may be applied to the tumor removal site, and at the same time may have a function of the anticancer agent and the artificial barrier to prevent the metastasis of cancer through the microvascular vessel.
  • the drug carrier may be formulated as a liquid, powder or film.
  • Another aspect of the present invention relates to a method for producing an anticancer drug carrier
  • (First step) a first step of preparing a crosslinked polymer having an ether crosslink by reacting a hydrophilic polymer having a hydroxy functional group with a crosslinking agent having an epoxy functional group;
  • Step 2 a second step of pretreatment of the anticancer drug by mixing the anticancer drug and the temperature sensitive polymer which is converted into the gel in the body and stirred at a temperature of 40 to 60 ° C;
  • (Third step) a third step of preparing an anticancer drug carrier by mixing the crosslinked polymer prepared in the first step with the anticancer drug pretreated in the second step and hydrogelling at a temperature of 60 to 110 ° C .; It may be characterized in that for producing a drug carrier by performing a process comprising a.
  • the drug delivery system of the present invention is applied to the affected areas such as the tumor tissue site or tumor removal site is slowly released anti-cancer drug contained in the hydrogel polymer and has little effect on normal cells, thereby reducing the side effects of the anti-cancer drug have.
  • the drug carrier of the present invention is applied to the affected area is converted into a gel by the body temperature to form an artificial barrier, thereby preventing the metastasis of cancer through the micro-vessels.
  • Figure 1 is a cryo-TEM analysis of the anticancer drug carrier of the present invention.
  • Figure 2 is a view showing the process of the anticancer drug delivery agent of the present invention is changed from a sol (sol) to a gel (gel) to release the anticancer drug.
  • Figure 3 is a graph showing the result of confirming the growth of the precipitate (crystallization of anticancer drug) while the anticancer drug carrier of the present invention is stored for 14 days in aqueous solution conditions.
  • Figure 4 is a photograph comparing the change of the reaction solution state before and after the hydrogelation reaction.
  • Figure 5 compares the concentration of docetaxel with blood in the method of directly administering the anticancer drug carrier of the present invention (5 mg / kg) to the tumor removal site and the method of intravenously administering the anticancer drug (5 mg / kg) One graph.
  • Figure 6 is a graph comparing the results of MTT analysis of drug carrier, positive control (Teflon) and sodium carboxymethyl cellulose (SCMC) polymer eluate from which the anticancer drug was removed.
  • the present invention relates to an anticancer drug carrier and a preparation method thereof.
  • the anticancer drug delivery agent according to the present invention is an anticancer drug; Hydrogel polymer containing the drug inside the core; And a temperature sensitive polymer which is converted into a gel in the body. It includes.
  • the anticancer drug is contained in the core of the hydrogel to transport the anticancer drug to the affected area such as a tumor tissue site or a tumor removal site.
  • the temperature-sensitive polymer is gelated by body temperature in the affected area, and serves to concentrate the anticancer drug at the target site.
  • the anticancer drug carrier according to the present invention is a drug carrier that targets the anticancer drug to the affected part, and achieves 'passive targeting' by a hydrogel polymer having a core capable of containing the drug, and the temperature 'Active targeting' can be achieved by sensitizing polymers.
  • the crosslinked polymer in the present invention is prepared by crosslinking a hydrophilic polymer having a hydroxy functional group and a crosslinking agent having an epoxy functional group.
  • the crosslinked polymer consists of a hydrophobic portion of the carbon chain constituting the backbone and a hydrophilic portion in which hydroxy functional groups are distributed. Accordingly, the anticancer drug having hydrophobicity during the hydrogelation of the crosslinked polymer is concentrated inside the hydrophobic portion of the crosslinked polymer, and the hydrophilic group is directed outward to wrap the anticancer drug with the crosslinked polymer by a hydrophobic-hydrophobic interaction therebetween. Core-shell 'structure.
  • the anti-cancer drug forms a core by the hydrogelation reaction and surrounds the core with a crosslinked polymer to form a shell, thereby achieving passive targeting.
  • the hydrogel polymer of the present invention is hydroxy functional groups are distributed on the surface of the shell to be hydrophilic, thereby protecting the anticancer drug from various immune mechanisms in the human body.
  • 'Active targeting' in the present invention can be achieved by a temperature-sensitive polymer having the property of being gelled and adhered by body temperature in the affected area.
  • the temperature-sensitive polymer In addition to the active targeting role of fixing the anticancer drug to the affected area, the temperature-sensitive polymer also plays a passive targeting role of releasing the anticancer drug by physical force to intensively administer the affected area.
  • the temperature-sensitive polymer is gelled by body temperature, the overall volume of the drug carrier is gradually reduced, and by this contraction pressure, the anticancer drug contained in the core of the hydrogel polymer is slowly released through the gel wall.
  • the anticancer drug carrier according to the present invention releases the anticancer drug to the affected area by a physical and chemical double sustained release system.
  • the temperature sensitive polymer is first gelled by body temperature, and the anticancer drug contained in the hydrogel core is gradually released by physical force.
  • the hydrogel polymer is secondarily hydrolyzed to slowly release the anticancer drug contained in the core. Therefore, the anticancer drug carrier according to the present invention has a dual sustained release system.
  • the anticancer drug delivery agent according to the present invention can be applied to lesions from which tumors are removed, thereby increasing the probability of cure through continuous chemotherapy, and also forming an artificial barrier to prevent cancer from metastasis due to microvascularization. Can be.
  • the anticancer drug delivery agent of the present invention has great significance in that it possesses a function of inhibiting cancer metastasis in addition to an anticancer therapeutic function.
  • the anticancer drug carriers according to the present invention may be formulated into pharmaceutical preparations by conventional formulation methods.
  • the anticancer drug carrier according to the present invention may be formulated as a liquid, powder or film, and the formulation of the anticancer drug carrier according to the present invention is not limited thereto.
  • anticancer drug in the present invention. Any anticancer drug well known in the art is applicable.
  • the anticancer agent is an alkylating agent (Alkylating agents) cyclophosphamide (Cyclophosphamide), ifosfamide (Ifosfamide), Procarbazine (Procarbazine), Busulfan (Busulfan), Carmustine, Lomustine (Lomustine) , dacarbazine, cisplatin, and the like may be included.
  • Antitimetabolites may include Methotrexate, 5-Fluorouracil, Capecitabine, Cytosine Arabinoside, Gemcitabine, and the like.
  • Vinca Alkaloid-based natural materials may include vinblastine (Vinblastine), vincristine (Vincristine) and the like.
  • Taxane drugs may include paclitaxel, docetaxel, and the like.
  • Epitopophyllotoxin drugs may include etoposide and the like.
  • Camptothecin drugs may include Topotecan, Iranonotecan, and the like.
  • Antitumor antibiotics may include mitomycin-C, daunorubicin, doxorubicin, bleomycin, and the like.
  • Enzyme-based drugs may include asparaginase (L-asparaginase) and the like. As the urea-based drug, hydroxyurea may be included.
  • tyrosine kinase inhibitor Rituximab, Trastuzumab, Imatinib, Gefitinib, Erlotinib, and the like may be included.
  • the anticancer drugs exemplified above may be used in the form of their pharmaceutically acceptable salts or hydrates. In addition, one or more of the above anticancer drugs may be used.
  • the anticancer drug may be included in the drug delivery range of 0.6 to 2.2% by weight.
  • the anticancer drug content may vary depending on the drug's efficacy. Typically, less than 0.6% by weight of the anticancer effect may not be properly exhibited, and an excess of 2.2% by weight may cause drug side effects. It may be.
  • the hydrogel polymer acts as a carrier containing an anticancer drug.
  • the hydrogel polymer is a hydrophilic polymer having a hydroxyl functional group and a crosslinking agent having an epoxy functional group are prepared by hydrogelling a crosslinked polymer crosslinked through an ether (-O-) covalent bond, thereby forming a stabilized network structure.
  • the hydrogel polymer has a micellar core-shell structure in which the core portion of the gel is hydrophobic and the surface of the gel is hydrophilic. Accordingly, when the crosslinked polymer is hydrogelized in the presence of the anticancer drug, the anticancer drug may be included in the core of the micelle type hydrogel by the hydrophobic portion of the crosslinked polymer and the hydrophobic anticancer drug. The anticancer drug contained in the core portion of the hydrogel polymer may be released reliably in the affected area stably without crystallization even under aqueous solution conditions.
  • the hydrogel polymer has a hydrophilic outer surface, which may protect the anticancer drug safely from various immune mechanisms in the body.
  • the hydrogel polymer may achieve a sustained release effect in which the ether cross-linking is hydrolyzed in an aqueous solution to slowly release the anticancer drug contained in the core.
  • the hydrogel polymer may be included in the range of 6.2 to 21.7% by weight in the drug carrier. If the content of the hydrogel polymer is less than 6.2 wt% or more than 21.7 wt%, it may be difficult to contain the anticancer drug in the core of the hydrogel polymer.
  • the hydrophilic polymer constituting the hydrogel polymer is a polymer having a hydroxy functional group and having a weight average molecular weight in the range of 10,000 to 1,000,000 g / mol, specifically, alginic acid, hyaluronic acid, dextran, hydroxypropylmethylcellulose, and carboxymethyl
  • alginic acid, hyaluronic acid, dextran, hydroxypropylmethylcellulose, and carboxymethyl One or more selected from the group consisting of cellulose and salts of alkali metals or alkaline earth metals thereof may be included.
  • the crosslinking agent constituting the hydrogel polymer is a compound having an epoxy functional group, specifically, epichlorohydrin, epibromohydrin, butanediol diglycidyl ether, ethylene glycol diglycidyl ether, hexanediol diglyci Dyl ether, propylene glycol diglycidyl ether, polyethylene glycol diglycidyl ether, polypropylene glycol diglycidyl ether, polytetramethylene glycol diglycidyl ether, neopentyl glycol diglycidyl ether, polyglycerol poly Glycidyl ether, diglycerol polyglycidyl ether, polyglycerol polyglycidyl ether, glycerol polyglycidyl ether, trimethyl propane polyglycidyl ether, bis (epoxypropoxy) ethylene, pentaerythritol polyglycol At least one selected from the group consist
  • the temperature-sensitive polymer is phase converted from a sol to a gel by body temperature.
  • the temperature-sensitive polymer When the drug carrier of the present invention is applied to the affected part, the temperature-sensitive polymer is gelled by the body temperature and the drug carrier is adhered to the affected part to fix it. Then, as the gel of the temperature-sensitive polymer proceeds, the volume of the drug carrier gradually contracts, and the anticancer drug contained in the core of the hydrogel polymer penetrates the gel wall gradually by the contraction pressure. Therefore, the temperature-sensitive polymer is gelled in the body to play an active targeting role to accurately fix the drug carrier to the affected area, and simultaneously plays a role of passive targeting to intensively release the anticancer drug contained in the hydrogel core at the affected site.
  • the temperature-sensitive polymer is a polymer having an ether functional group and having a weight average molecular weight in the range of 500 to 500,000 g / mol, specifically, a poly (ethylene oxide), a poly (ethylene oxide-propylene oxide) random copolymer, a polyethylene oxide-polypropylene oxide Polyethylene oxide triblock copolymer, poly (ethylene glycol) -poly (L-lactic acid) -poly (ethylene glycol), alkylated polyethylene oxide block copolymer and poly (vinyl methyl ether) It may be abnormal.
  • the temperature sensitive polymer may be included in the range of 76.1 to 93.2% by weight in the drug carrier.
  • the content of the temperature-sensitive polymer is less than 76.1% by weight, there may be a problem in that it cannot properly serve as an active targeting agent for immobilizing the drug carrier to the affected part, and may not help physical release of the anticancer agent contained in the core of the hydrogel.
  • the content of the temperature-sensitive polymer exceeds 93.2% by weight, there is a problem that the initial release of the anticancer drug may be excessive.
  • the present invention features a method for producing an anticancer drug carrier.
  • Method for producing an anticancer drug delivery agent according to the present invention is:
  • (First step) a first step of preparing a crosslinked polymer having an ether crosslink by reacting a hydrophilic polymer having a hydroxy functional group with a crosslinking agent having an epoxy functional group;
  • Step 2 a second step of pretreatment of the anticancer drug by mixing the anticancer drug and the temperature sensitive polymer which is converted into the gel in the body and stirred at a temperature of 40 to 60 ° C;
  • (Third step) a third step of preparing an anticancer drug carrier by mixing the crosslinked polymer prepared in the first step with the anticancer drug pretreated in the second step and hydrogelling at a temperature of 60 to 110 ° C .; It includes.
  • the first step is a process of preparing a crosslinked polymer by reacting a hydrophilic polymer having a hydroxy functional group with a crosslinking agent having an epoxy functional group.
  • the hydrophilic polymer having a hydroxy functional group has a weight average molecular weight of 10,000 to 1,000,000 g / mol, consisting of alginic acid, hyaluronic acid, dextran, hydroxypropylmethyl cellulose, carboxymethyl cellulose and salts of alkali or alkaline earth metals thereof. At least one selected from the group may be included.
  • the crosslinking agent having the epoxy functional group is epichlorohydrin, epibromohydrin, butanediol diglycidyl ether, ethylene glycol diglycidyl ether, hexanediol diglycidyl ether, propylene glycol diglycidyl ether, polyethylene glycol Diglycidyl ether, polypropylene glycol diglycidyl ether, polytetramethylene glycol diglycidyl ether, neopentyl glycol diglycidyl ether, polyglycerol polyglycidyl ether, diglycerol polyglycidyl ether, Polyglycerol polyglycidyl ether, glycerol polyglycidyl ether, trimethyl propane polyglycidyl ether, bis (epoxypropoxy) ethylene, pentaerythritol polyglycidyl ether and sorbitol polyglycidyl ether
  • the content ratio of the hydrophilic polymer and the crosslinking agent ranges from 1/1 to 1/20 of the functional group molar ratio of [OH] / [epoxy], preferably from 1/8 to 1/20 of the functional group molar ratio. It is better to use it after adjusting. If the functional group molar ratio of [OH] / [epoxy] is less than 1/1, there may be a problem that the yield of crosslinked polymer is lowered, and if the functional group molar ratio of [OH] / [epoxy] exceeds 1/20, A large amount of unreacted hydroxy functional groups remain in the crosslinked polymer, causing unwanted side reactions, which may result in partial gelation, which may lower the yield of the hydrogel.
  • the crosslinking reaction may be performed under a mixed solution of one or more dispersion aids selected from the group consisting of water, acetone and alcohols having 1 to 6 carbon atoms.
  • the dispersion aid is excellent in compatibility with water, lower boiling point than water, it is preferable to use an organic solvent that does not dissolve the hydrophilic polymer having a hydroxy functional group.
  • the dispersing aid may preferably be used at least one selected from the group consisting of acetone and alcohols having 1 to 6 carbon atoms.
  • the alcohol may include one or more selected from the group consisting of methanol, ethanol, propanol, isopropanol, butanol, pentanol and hexanol.
  • the dispersion aid in the range of 1 to 20 parts by weight based on 1 part by weight of water. If the content of the dispersing aid is less than 1 part by weight based on 1 part by weight of water, the hydrophilic polymer having a hydroxy functional group may be partially agglomerated in the solution, and thus the crosslinking reaction may not occur uniformly in the whole solution. This can be On the other hand, based on 1 part by weight of water, when the content of the dispersing aid exceeds 20 parts by weight, the solubility of the hydrophilic polymer having a hydroxy functional group is low so that the smooth crosslinking reaction cannot be progressed, so that the yield of the crosslinked polymer can be lowered.
  • a hydrophilic polymer having a hydroxy functional group and a crosslinking agent having an epoxy functional group react to prepare a polymer having an ether crosslink. Therefore, it may be important to control the pH and reaction temperature suitable to form ether crosslinks.
  • Suitable pH for ether crosslinking according to the invention is in the range from 9 to 13, and the reaction temperature is in the range from 25 to 60 ° C.
  • the crosslinking reaction solution In order to adjust the pH of the crosslinking reaction solution, it may be mixed with water to adjust acid or base strength, and a conventional pH adjuster used to prepare a buffer solution may be used.
  • the present invention does not particularly limit the selection of the pH adjusting agent, and specifically, an acid such as hydrochloric acid, nitric acid, or a base such as sodium hydroxide may be used.
  • an acid such as hydrochloric acid, nitric acid, or a base such as sodium hydroxide may be used.
  • the pH of the crosslinking reaction solution is less than 9, ester bonds and ether bonds may be simultaneously formed by carboxyl groups in the molecular structure, and when pH exceeds 13, partial etherification may occur rapidly, thereby making it difficult to obtain a uniform polymer. Therefore, it is preferable to adjust the pH of the crosslinking reaction solution to the range of 9-13.
  • the crosslinking reaction temperature is lower than 25 ° C.
  • the crosslinking reaction rate may be slow, resulting in a long reaction time, and when the crosslinking reaction temperature is higher than 60 ° C., the solvent may rapidly evaporate to induce uniform crosslinking. Therefore, the temperature of crosslinking reaction is good to maintain 25-60 degreeC range.
  • the present invention is not particularly limited with respect to the order of addition of water, a dispersion aid, a hydrophilic polymer having a hydroxy functional group and a crosslinking agent.
  • a crosslinking reaction may be performed by simultaneously adding a hydrophilic polymer having a hydroxy functional group and a crosslinking agent to a mixed solution of a dispersion aid and water.
  • the hydrophilic polymer having a hydroxy functional group in the dispersion aid may be added first, and then water and a crosslinking agent may be added.
  • the prepared crosslinked polymer is a water-insoluble gel, which has high solubility in a dispersion aid but low solubility in water. Therefore, if the dispersion aid lower in boiling point than water is selectively removed by a conventional solvent removal method, a crosslinked polymer in a water-insoluble gel state can be easily obtained.
  • Solvent removal methods that may be applied to remove the dispersion aid may include a pressurization method, a reduced pressure method, a heating method, a cooling method, a lyophilization method, a membrane permeation method, and the like. It is also possible to use rotary distillation apparatus or similar equipment. The solvent removal method or removal apparatus may be appropriately selected in consideration of the characteristics of the dispersion aid used. In addition, it is preferable to continuously stir to maintain the concentration of the reaction solution even while removing the dispersion aid. Rotary distillation apparatus or similar equipment may be useful to remove the dispersion aid while maintaining constant stirring. Removal of the dispersion aid is performed until the reaction solution is converted to a transparent solution state.
  • reaction solution from which the dispersion aid is removed is left to stand at room temperature for 1 to 72 hours to obtain a crosslinked polymer in a water-insoluble gel state.
  • the obtained crosslinked polymer is dried appropriately. The drying may be performed under reduced pressure.
  • the dried cross-linked polymer may be further washed with distilled water or phosphate buffered solution (PBS), and the pH is adjusted to neutral, followed by drying.
  • PBS phosphate buffered solution
  • the second step is to pretreat the anticancer drug with a temperature sensitive polymer.
  • the anticancer drug may be mixed and stirred in advance with the temperature-sensitive polymer.
  • Anticancer drugs are hydrophobic drugs that are poorly soluble in water and can be easily crystallized or phase separated in aqueous solution.
  • the anticancer drug may be difficult to partially form crystals during the hydrogelation reaction of the crosslinked polymer and to be embedded in the core of the hydrogel polymer.
  • a pretreatment process of mixing and stirring the anticancer drug with a temperature-sensitive polymer in advance is performed to achieve stabilization of the anticancer drug.
  • the anticancer agent is an alkylating agent (Alkylating agents) cyclophosphamide (Cyclophosphamide), ifosfamide (Ifosfamide), Procarbazine (Procarbazine), Busulfan (Busulfan), Carmustine, Lomustine (Lomustine) , dacarbazine, cisplatin, and the like may be included.
  • Antitimetabolites may include Methotrexate, 5-Fluorouracil, Capecitabine, Cytosine Arabinoside, Gemcitabine, and the like.
  • Vinca Alkaloid-based natural materials may include vinblastine (Vinblastine), vincristine (Vincristine) and the like.
  • Taxane drugs may include paclitaxel, docetaxel, and the like.
  • Epitopophyllotoxin drugs may include etoposide and the like.
  • Camptothecin drugs may include Topotecan, Iranonotecan, and the like.
  • Antitumor antibiotics may include mitomycin-C, daunorubicin, doxorubicin, bleomycin, and the like.
  • Enzyme-based drugs may include asparaginase (L-asparaginase) and the like. As the urea-based drug, hydroxyurea may be included.
  • tyrosine kinase inhibitor Rituximab, Trastuzumab, Imatinib, Gefitinib, Erlotinib, and the like may be included.
  • the anticancer drugs exemplified above may be used in the form of their pharmaceutically acceptable salts or hydrates. In addition, one or more of the above anticancer drugs may be used.
  • the temperature-sensitive polymer is an polymer having an ether functional group and having a weight average molecular weight in the range of 500 to 500,000 g / mol, specifically, a poly (ethylene oxide), a poly (ethylene oxide-propylene oxide) random copolymer, a polyethylene oxide-poly Selected from the group consisting of propylene oxide-polyethylene oxide triblock copolymer, poly (ethylene glycol) -poly (L-lactic acid) -poly (ethylene glycol), alkylated polyethylene oxide block copolymers and poly (vinyl methyl ether) It may be one or more.
  • the third step is a process for preparing an anticancer drug carrier by hydrogelling the crosslinked polymer.
  • the step of mixing the crosslinked polymer prepared in the first step and the anticancer drug pretreated in the second step and hydrogelation reaction can be prepared in a state in which the anticancer drug is evenly dispersed in the hydrogel polymer and the temperature sensitive polymer contained in the core.
  • the hydrophobic portion of the anticancer drug and the hydrophobic portion of the crosslinked polymer may be effectively hydrophobic, so that the reaction temperature is maintained at 60 to 110 ° C. If the hydrogelation reaction temperature is less than 60 °C the partial gelling and anticancer drug is not completely melted can not form the core of the hydrogel, when maintaining a high temperature above 110 °C hydrogel ether bonds decompose As a result, the anticancer drug is not contained in the core and is released out of the hydrogel, so eventually, the sustained release efficacy cannot be achieved.
  • Figure 1 is attached to the cryo-TEM analysis of the anticancer drug delivery agent according to the present invention.
  • the anticancer drug carrier is a hydrogel polymer and a temperature-sensitive polymer is dispersed evenly, it can be seen that the anti-cancer drug is stably contained in the core of the hydrogel polymer.
  • Figure 2 shows the process of releasing the anticancer drug by applying the anticancer drug carrier according to the present invention in the body is changed from a sol (gel) to a gel (gel).
  • the anti-cancer drug is contained in the inside of the hydrogel polymer, but when applied to the body treatment will release the contained anti-cancer drug as the hydrogel polymer shrinks.
  • Example 1 it is for determining the mixing ratio of water and dispersion aid used in crosslinking a hydrophilic polymer having a hydroxy functional group.
  • hydrophilic polymer having a hydroxy functional group sodium carboxymethyl cellulose (hereinafter abbreviated as 'SCMC') was typically used.
  • 'SCMC' sodium carboxymethyl cellulose
  • dispersion aid acetone, ethanol or a mixed solution thereof was used.
  • distilled water and a dispersion aid were added to a 500 mL reaction vessel equipped with a stirring device at a composition ratio of the following Tables 1, 2, or 3, and sodium carboxymethylcellulose (SCMC) was stirred while stirring the mixed solution at 80 rpm at a normal temperature. After the addition and stirring for 10 minutes, the mixture was allowed to stand for 1 hour. The viscosity of the stagnant solution and the state of SCMC particles were visually confirmed and evaluated by the following criteria. The evaluation results are shown in Tables 1, 2 or 3 below.
  • Dispersion aid solution composition (weight ratio, g) Distilled water One 2 6 8 10 12 15 Acetone 19 18 14 12 10 8 5 Solution change after 1 g of SCMC ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • Dispersion aid solution composition (weight ratio, g) Distilled water 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 ethanol 5 8 10 15 20 50 100 200 250 Solution change after 1 g of SCMC ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • Dispersion aid solution composition (weight ratio, g) Distilled water 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 Acetone 2 4 5 7 10 25 50 100 150 ethanol 3 4 5 8 10 25 50 100 100 Solution change after 1 g of SCMC ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇
  • Example 2 it is for determining the mixing ratio of water and dispersion aid used when crosslinking a hydrophilic polymer having a hydroxy functional group and a crosslinking agent.
  • a dispersion aid in the composition ratio of Table 4 was added as a dispersion aid in the composition ratio of Table 4 to prepare a mixed solution.
  • Sodium carboxymethyl cellulose (SCMC) was added while stirring the mixed solution at room temperature at a stirring speed of 80 rpm.
  • butanediol diglycidyl ether (BDDE) was added as a crosslinking agent and stirred at room temperature for 24 hours.
  • the mixing ratio of sodium carboxymethyl cellulose (SCMC) and butanediol diglycidyl ether (BDDE) was such that the molar ratio of [OH] / [epoxy] functional group was 1/8.
  • the cloudy solution was distilled in a reduced pressure distillation apparatus maintained at 25 ° C. and ⁇ 0.5 MPa to remove acetone. The distillation was performed until the reaction solution was completely transparent. When the reaction solution became transparent, the pressure was terminated.
  • the prepared crosslinked polymer was freeze-dried to obtain a powder form.
  • the crosslinked polymer powder was washed three times for 24 hours using distilled water. Each time one wash was completed, a gel was obtained using a filter paper, and the gel obtained after drying three times was dried in a vacuum oven. The gel yield was calculated by measuring the weight of the dried gel.
  • Example 3 the crosslinking reaction of a hydrophilic polymer having a hydroxy functional group with a crosslinking agent is used to determine the [OH] / [epoxy] functional group that can maximize the gel yield.
  • the crosslinking reaction was carried out by the method of Example 2 to obtain a crosslinked gel.
  • the mixing ratio of sodium carboxymethyl cellulose (SCMC) and butanediol diglycidyl ether (BDDE) was [OH] / [ Epoxy] Functional molar ratio.
  • Example 4 the condition of the drug carrier prepared according to the composition ratio of the anticancer drug, the hydrogel polymer and the temperature-sensitive polymer constituting the drug carrier.
  • Docetaxel was used as an anticancer drug
  • crosslinking sample 3-5 of Example 3 was used as a crosslinking polymer to form a hydrogel
  • polyethylene oxide-polypropylene oxide-polyethylene oxide (PEP-PPO- PEO) triblock copolymer was used.
  • docetaxel and PEP-PPO-PEO copolymer were added to 70 mL of water at a content ratio of the following Table 6, and the anticancer drug was pretreated by stirring at 60 rpm at 100 rpm.
  • SCMC-BDDE crosslinked polymer was mixed in the pretreated docetaxel at the content ratio of the following Table 6 under a nitrogen stream and stirred at a temperature of 60 ° C. for 24 hours.
  • the reaction solution was allowed to stand for 24 hours at 25 W 2 ° C to remove bubbles. After standing for 24 hours, the presence of the precipitate was visually confirmed and shown in Table 6 below.
  • drug carriers 6 to 11 are completely solubilized in water to obtain a transparent solution. But. Drug carriers 1 and 5 were not dissolved in water but were prepared as a milky white dispersion, and docetaxel drug was not contained in the core of the hydrogel. Drug carriers 2 to 4 and 12 to 14 were not completely solubilized in water and partially contained precipitates.
  • the optimal content of the anticancer drug is 0.6 to 2.2% by weight
  • the optimal content of the hydrogel polymer is 6.2 to 21.7% by weight
  • the optimal content of the temperature-sensitive polymer is 76.1 to 93.2 weight
  • the anticancer drug is stably contained in the core of the hydrogel polymer and is nano-ized so that the anticancer drug is precipitated in water.
  • Figure 3 shows the result of observing the growth of the precipitate (crystal of docetaxel) while preserving the drug carrier 9 prepared in Example 4 in an aqueous solution for 14 days.
  • the drug carrier of the present invention had little crystal growth even when stored in an aqueous solution for 14 days, and could be safely present in the core of the gel without release of the anticancer drug out of the hydrogel.
  • Figure 4 is attached with a sample photograph of the drug carrier 9 prepared in Example 4 dissolved in water.
  • FIG. 4 shows a reaction solution state before heat treatment
  • the state of the pre-reaction solution in which the anticancer drug, the crosslinked polymer and the temperature sensitive polymer were mixed was a cloudy cloudy dispersion, but after the crosslinked polymer was hydrogelized by heating, the reaction solution became transparent after embedding the anticancer drug in the core. Therefore, even by confirming the state change of the reaction solution, it can be seen that the anticancer drug delivery agent of the present invention is stably contained in the hydrogel core.
  • Example 5 the present invention compares the in vivo pharmacokinetics of the drug delivery system of the present invention using an injection method of direct injection through a blood vessel and a DDST (Drur Delivery System Therapie) method directly injected into a tumor incision site It is for.
  • DDST Drur Delivery System Therapie
  • drug delivery agent 9 (containing 2.2 wt% of docetaxel) prepared in Example 4 was used, and as a control, Taxoteel (Taxotere TM) product commercialized as a docetaxel injection was used. It was. Male Sparague Dawley rats were used as experimental animals.
  • the anticancer drug carrier of the present invention was directly administered to the tumor removal site (5 mg / kg), and the conventional Taxotere TM injection was administered intravenously (5 mg / kg).
  • FIG. 5 shows the results of measuring blood concentration (ng / mL) for 24 hours for the method of directly administering the anticancer drug delivery agent of the present invention to the tumor removal site and the method of administering the conventional anticancer drug injection.
  • the values obtained by calculating the average of the pharmacokinetic parameters through non-compartmental analysis of the measured blood concentration and time data for 24 hours are shown in Table 7 below.
  • PK parameters Docetaxel Drug Delivery Docetaxel Injection AUC24h 387 ⁇ 55 281 ⁇ 71 AUCINF 453 ⁇ 93 301 ⁇ 82 Average AUC 281 379 Cmax 1850 ⁇ 358 901 ⁇ 192 T1 / 2 6 ⁇ 3 4 ⁇ 1 CL 11 ⁇ 2 17 ⁇ 4 Vdss 105 ⁇ 38 103 ⁇ 36
  • the half-life of the drug delivery carrier was 6 hours, and the half-life of the injection was 4 hours.
  • AUC area under the curve
  • drug delivery was 387 ng.hr/mL and injection was 281 ng.hr/mL.
  • Cmax the drug carrier was 1850 ng / mL and the injection was about twofold, 901 ng / mL.
  • AUC24h and Cmax were significantly increased by 35% and 105%, respectively, when the drug carrier was directly administered to the tumor removal site rather than by injection. Therefore, the pre-application rate (CL) was administered as the drug carrier compared to the injection. When it was found to decrease significantly.
  • docetaxel anticancer drugs have a longer residence time when administered directly to the anticancer site with drug carriers, and significantly higher AUC and Cmax when administered at the same dose. It can be seen that this is improved.
  • Example 6 to confirm the cytotoxicity of the drug carrier of the present invention, the cytotoxicity was confirmed for the drug carrier consisting of a hydrogel polymer and a temperature-sensitive polymer except the anticancer drug.
  • the drug carrier from which the anticancer drug was removed and the positive control group Teflon (1cm ⁇ 1cm) were eluted in the cell culture medium at 37 ° C. for 3 days to obtain an eluate.
  • Fibroblasts were plated at a density of 1 ⁇ 10 ⁇ s cells in 96-well plates and cultured in vitro at 5% CO 2 , 37 ° C. for one day.
  • the fibroblast culture medium was dispensed with a drug carrier, a positive control group (Teflon) and a hydrogel polymer eluate from which the anticancer drug was removed.
  • the next day 20 MTT Solution (2 mg / mL in PBS) was dispensed and further incubated for 4 hours.
  • the culture was then removed, 100 uL of dimethyl sulfoxide (DMSO) was added and the absorbance at 570 nm wavelength was measured using a Microplate reader.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • Figure 6 shows the results of MTT analysis of the drug carrier, the positive control group (Teflon) and sodium carboxymethyl cellulose (SCMC) polymer eluate from which the anticancer drug was removed.
  • the drug carrier, the positive control group (Teflon) and the hydrogel polymer eluate from which the anticancer drug was removed all had a high cell survival rate, in particular, the anticancer drug carrier of the present invention is superior to the positive control group (Teflon) Confirmed.
  • the anticancer drug carrier of the present invention and the polymer used in the preparation thereof can be identified as a safe substance without cytotoxicity.
  • Example 7 to confirm the cancer metastasis inhibitory effect by the artificial barrier effect on the drug carrier of the present invention, the artificial barrier efficacy was confirmed through gross observation during the autopsy of the animal.
  • New Zealand rabbits aged 2-3 months were used as experimental animals.
  • Anesthesia was anesthetized by intraperitoneal injection of 1 cc per 100 g of body weight using lidocaine. After anesthesia, the hair is cut in the abdomen and sterilized with povidone. The abdomen is opened 4 cm along the midline of the abdomen. The peritoneal layer is removed to the right peritoneum with a size of 1 ⁇ 1 cm2. It burst and rubbed to a slight bleeding, causing abrasions.
  • the drug carrier of the present invention with the anticancer drug removed was evenly applied in 0.5 mL intraperitoneal. After the operation, animals were given enough water and food, and after 10 days, a new incision was made in the left lower abdomen, and the pathologic examination was performed by gross findings.
  • Example 8 in order to confirm the anticancer efficacy of the anticancer drug delivery agent according to the present invention, the survival rate of cancer cells was measured using the MTT assay.
  • the drug carrier 9 (containing 2.2 wt% of docetaxel) prepared in Example 4 was inserted. 150 uL was added to each gel and added. Incubated for 12, 24, 48 and 72 hours, 100 ⁇ L of MTT solution (50 ug / mL, manufactured by Sigma) was added and incubated in a 37 ° C. incubator for 4 hours. When purple crystals were formed, 500 uL of DMSO solution was added thereto, stirred for 30 minutes, and dissolved. The cell viability was confirmed by measuring absorbance at 520 nm using an ELISA reader. The results are shown in Table 9 below.
  • Cancer cell Cell line Cancer cell death time Human breast cancer cells MCF-7 Within 72 hours Lung cancer cells H-460 Within 72 hours Stomach cancer cells SNU601 Within 72 hours Colorectal Cancer Cells HCT-116 Within 72 hours Head and Neck Cancer Cells SNU-1041 Within 72 hours Esophageal cancer cells TE-11 Within 72 hours Liver cancer cells Hep3B Within 72 hours Kidney cancer cells CAKI-1 Within 72 hours Pancreatic cancer cell Capan-1 Within 72 hours Bladder cancer cells T24 Within 72 hours Prostate cancer cells PC-3 Within 72 hours Testicular cancer cells T98G Within 72 hours Cervical cancer cells MES-SA Within 72 hours Endometrial cancer cells HEC-1-B Within 72 hours Ovarian Cancer Cell CP70 Within 72 hours

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Abstract

본 발명은 항암제 약물전달체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 종양조직 부위 또는 종양 제거부위에 도포되어 겔로 전환되어 견고하게 부착되어 항암제 약물을 방출하게 되는 항암제 약물전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

Description

항암제 약물전달체 및 이의 제조방법
본 발명은 항암제 약물전달체 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 종양조직 부위 또는 종양 제거부위에 도포되어 겔로 전환되어 견고하게 점착되어 항암제 약물을 서서히 방출하게 되는 항암제 약물전달체와 이의 제조방법에 관한 것이다.
현재까지 개발된 항암투여 방식은 극히 제한된 범위에서 이루어지고 있으며, 항암제가 정상세포에도 작용하여 많은 부작용을 수반하고 있다. 이에 정상세포에는 영향을 미치지 않고 암세포에만 선택적으로 작용하는 항암제 개발을 위한 연구가 시도되고 있다. 첫 번째 연구방향은 항암제를 고분자에 연결하는 항암제-고분자 복합체를 제조하여 사용하는 것이고, 두 번째 연구방향은 경점막 운반 시스템을 이용하는 것이다.
상기 항암제-고분자 복합체는 정상세포와는 다른 암조직의 병태 생리학적인 특성을 이용하여 암세포를 치료할 수 있다. 일반적으로 암 조직은 정상 조직에 비하여 많은 양분을 공급받기 위해 정상 조직에서보다 많은 혈관이 생성되며, 그 크기도 크고 엉성한 구조를 가지고 있다. 따라서 복합체를 구성하는 고분자는 정상 조직이나 기관보다 암 조직에 좀 더 용이하게 침투되고, 암 조직으로부터 쉽게 배출되지 않는데, 이러한 암조직의 특징적인 현상을 EPR(enhanced permeability and retention)효과라 한다. 그러나 항암제-고분자 복합체는 적용되는 고분자의 분자량 범위 및 투여방식이 제한적이며, 대부분 유기용매에서 반응해야 하므로 독성을 나타낼 우려가 있고, 생체적합성에 문제가 있어 각종 염증반응을 유도할 수 있으며, 생분해성이 없는 경우 몸에서 제거하기가 쉽지 않은 단점이 있다.
상기 경점막 운반 시스템(transmucosal delivery system)은 약물을 투여하는 방식으로, 전신성 또는 국소성으로 약물 효능을 신속하게 발휘할 뿐만 아니라 빠른 약물 청소율(clearance)을 나타내기 때문에, 결국 약물의 생체이용율(bioavailability)을 증가시키는 효과가 있다. 대부분의 항암제는 세포내 유전인자의 본체인 헥산의 합성을 억제하거나 헥산에 직접 결합하여 그 기능을 손상시킴으로써 효과를 나타낸다. 그러나, 현재 항암제 투여 방식은 혈관 경점막 투입과정에서 암세포에만 선택적으로 작용하는 것이 아니라 정상세포, 특히 세포분열이 활발한 조직세포에도 손상을 입히기 때문에 골수기능 저하, 위장관 점막손상, 탈모 등 여러 부작용이 나타난다. 즉, 표적 부위에 정확한 투입 및 방출이 이루어지지 않아 상기와 같은 문제점이 발생한다.
또한, 항암제의 용해도 및 흡수성을 높이고, 용액상태에서 결정화 방지를 위해 폴리소르베이트80 또는 폴리사머 등의 계면활성제를 사용하여 미셀 또는 에멀젼을 형성하여 경점막 운반체나 주사제로 개발하려는 연구가 보고된 바 있다. [비특허문헌 1, 2 참조] 하지만 여전히 만족할만한 성과를 얻지 못하고 있다.
(선행기술문헌)
(비특허문헌)
(비특허문헌 1) Gao et al., Drug Dev. Ind. Pharm., 34 (11), 1227-1237 (2008)
(비특허문헌 2) Chen et al., Drug Dev. Ind. Pharm., 34 (6), 588-594 (2008)
본 발명은 종양조직 부위 또는 종양 제거부위와 같은 환부에 도포되어서는 항암치료제로의 기능과 인공장벽을 형성하여 미세혈관을 통한 암의 전이를 방지하는 기능을 동시에 가지는 새로운 제형의 항암제 약물전달체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기한 항암제 약물전달체의 제조방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.
상기한 과제 해결을 위하여, 본 발명은 항암제 약물; 상기 약물을 코어 내부에 내포하는 하이드로겔 고분자; 및 체내에서 겔로 전환되는 온도감응 고분자; 가 포함된 항암제 약물전달체를 특징으로 한다.
본 발명의 적절한 실시 형태에 따르면, 상기 약물전달체는 항암제 약물 0.6 ∼ 2.2 중량%; 상기 약물을 코어 내부에 내포하는 하이드로겔 고분자 6.2 ∼ 21.7 중량%; 및 체내에서 겔로 전환되는 온도감응 고분자 76.1 ∼ 93.2 중량%; 가 포함될 수 있다.
본 발명의 적절한 실시 형태에 따르면, 상기 항암제 약물은 사이클로포스파마이드(Cyclophosphamide), 이포스파마이드(Ifosfamide), 프로카바진(Procarbazine), 부설판(Busulfan), 카무스틴(Carmustine), 로무스틴(Lomustine), 다카바진(Dacarbazine), 시스플라틴(Cisplatin), 메소트렉세이트(Methotrexate), 플루오로우실라(5-Fluorouracil), 카페시타빈(Capecitabine), 시토신 아라비노사이드(Cytosine Arabinoside), 젬시타빈(Gemcitabine), 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine), 파클리탁셀(Paclitaxel), 도세탁셀(Docetaxel), 에토포사이드(Etoposide), 토포테칸(Topotecan), 이라노테칸(Irinotecan), 마이토마이신(Miitomycin-C), 다우노루비신(Daunorubicin), 독소루비신(Doxorubicin), 블레오마이신(Bleomycin), 아스파라기나제(L-asparaginase), 하이드록시우레아(Hydroxyurea), 리툭시맵(Rituximab), 트라스투주맵(Trastuzumab), 이마티닙(Imatinib), 게피티닙(Gefitinib), 엘로티닙(Erlotinib), 이들의 약학적 허용 가능한 염 및 수화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 적절한 실시 형태에 따르면, 상기 하이드로겔 고분자는 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자와 에폭시 관능기를 가지는 가교제가 가교결합되어 형성된 가교고분자를, 하이드로겔화하여 제조된 것일 수 있다.
본 발명의 적절한 실시 형태에 따르면, 상기 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자는 중량평균분자량이 10,000 ∼ 1,000,000 g/mol이며, 알긴산, 히알루론산, 덱스트란, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 및 이들의 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 적절한 실시 형태에 따르면, 상기 에폭시 관능기를 가지는 가교제는 에피클로로히드린, 에피브로모히드린, 부탄디올디글리시딜에테르, 에틸렌글리콜디글리시딜에테르, 헥산디올디글리시딜에테르, 프로필렌글리콜디글리시딜에테르, 폴리에틸렌글리콜디글리시딜에테르, 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르, 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르, 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르, 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르, 디글리세롤폴리글리시딜에테르, 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르, 글리세롤폴리글리시딜에테르, 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르, 비스(에폭시프로폭시)에틸렌, 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르 및 소르비톨폴리글리시딜에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 적절한 실시 형태에 따르면, 상기 온도감응 고분자는 중량평균분자량이 500 ∼ 500,000 g/mol이며 에테르 관능기를 포함하는 고분자로서, 폴리(에틸렌옥사이드), 폴리(에틸렌옥사이드-프로필렌옥사이드) 랜덤 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드 트라이블록 공중합체, 폴리(에틸렌글리콜)-폴리(L-락틱에시드)-폴리(에틸렌글리콜), 알킬화된 폴리에틸렌옥사이드 블록 공중합체 및 폴리(비닐메틸에테르)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 적절한 실시 형태에 따르면, 상기 약물전달체는 종양조직 부위 또는 종양 제거부위에 직접 도포될 수 있다.
본 발명의 적절한 실시 형태에 따르면, 상기 약물전달체는 종양 제거부위에 도포되어 항암치료제의 기능과 인공장벽을 형성하여 미세혈관을 통한 암의 전이를 방지하는 기능을 동시에 가질 수 있다.
본 발명의 적절한 실시 형태에 따르면, 상기 약물전달체는 액제, 분말제 또는 필름제로 제형화될 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 태양은 항암제 약물전달체의 제조방법에 관한 것으로서,
(제 1단계) 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자와 에폭시 관능기를 가지는 가교제를 반응시켜, 에테르 가교결합을 가지는 가교고분자를 제조하는 제 1단계;
(제 2단계) 항암제 약물과 체내에서 겔로 전환되는 온도감응 고분자를 혼합하고 40 ∼ 60℃ 온도에서 교반하여, 항암제 약물을 전처리하는 제 2단계; 및
(제 3단계) 상기 제 1단계에서 제조된 가교고분자와 제 2단계에서 전처리된 항암제 약물을 혼합하고 60 ∼ 110℃ 온도에서 하이드로겔화 반응시켜, 항암제 약물전달체를 제조하는 제 3단계; 를 포함하는 공정을 수행하여 약물전달체를 제조하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 약물전달체는 종양조직 부위 또는 종양 제거부위와 같은 환부에 도포되어서는 하이드로겔 고분자에 내포된 항암제 약물이 서서히 방출되고 정상세포에는 거의 영향을 미치지 않으므로, 항암제 약물의 부작용을 감소시키는 효과가 있다.
본 발명의 약물전달체는 환부에 도포되어서는 체온에 의해 겔로 전환되어 인공장벽을 형성함으로써, 미세 혈관을 통한 암의 전이를 방지하는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 항암제 약물전달체를 cryo-TEM 분석한 사진이다.
도 2는 본 발명의 항암제 약물전달체가 졸(sol)에서 겔(gel)로 변화되어 항암제 약물이 방출되는 과정을 보여주기 위한 그림이다.
도 3은 본 발명의 항암제 약물전달체를 수용액 조건에서 14일 동안 보존하면서 침전물(항암제 약물의 결정)의 성장을 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 하이드로겔화 반응 전 후의 반응용액 상태 변화를 비교한 사진이다.
도 5는 본 발명의 항암제 약물전달체를 종양제거 부위에 직접투여(5 mg/kg)하는 방식과 항암제 약물을 정맥투여(5 mg/kg)하는 방식에서의, 시간에 따른 도세탁셀의 혈중 농도를 비교한 그래프이다.
도 6은 항암제 약물이 제거된 약물전달체, 양성대조군(테프론) 및 소듐 카르복시메틸셀룰로오스(SCMC) 고분자 용출액을 MTT 분석한 결과를 비교한 그래프이다.
본 발명은 항암제 약물전달체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 항암제 약물전달체는 항암제 약물; 상기 약물을 코어 내부에 내포하는 하이드로겔 고분자; 및 체내에서 겔로 전환되는 온도감응 고분자; 를 포함한다.
본 발명에 따른 항암제 약물전달체를 구성하는 하이드로겔 고분자의 경우는 하이드로겔의 코어(core)에 항암제 약물을 내포시켜 종양조직 부위 또는 종양 제거부위와 같은 환부까지 항암제 약물을 운반하는 역할을 한다. 그리고 온도감응 고분자는 환부에서 체온에 의해 겔화(gelation)되어 항암 약물이 표적 부위에 집중적으로 투입되도록 하는 역할을 한다.
즉, 본 발명에 따른 항암제 약물전달체는 환부까지 항암제 약물을 표적화하는 약물전달체로서, 약물이 내포될 수 있는 코어를 가지고 있는 하이드로겔 고분자에 의해 '수동 표적화 (passive targeting)'를 달성하고, 그리고 온도감응 고분자에 의해 '능동 표적화 (active targeting)'를 달성할 수 있다.
본 발명에서의 '수동 표적화'는 가교고분자가 하이드로겔화 반응됨으로써 달성할 수 있다. 본 발명에서의 가교고분자는 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자와 에폭시 관능기를 가지는 가교제를 가교반응시켜 제조된다. 상기 가교고분자는 주골격(backbone)을 구성하는 탄소사슬의 소수성 부분과 하이드록시 관능기가 분포된 친수성 부분으로 이루어져 있다. 이에, 가교고분자의 하이드로겔화 반응 중에 소수성을 띄는 항암제 약물이 가교고분자의 소수성 부분 내측으로 밀집되고, 친수기를 외측으로 향하게 하여 이들 간의 소수성-소수성 상호작용에 의해 항암제 약물을 가교고분자로 감싸게 되어 일종의 '코어-쉘' 구조를 이루게 된다. 즉, 하이드로겔화 반응에 의해 항암제 약물이 코어(core)를 구성하고, 상기 코어를 가교고분자로 둘러싸서 쉘(shell)을 구성하게 됨으로써, 수동 표적화를 달성하게 된다. 또한 본 발명의 하이드로겔 고분자는 쉘의 표면에 하이드록시 관능기가 분포되어 있어 친수성을 띄게 되고, 이로써 인체 내의 여러 면역기작들로부터 항암제 약물을 보호하는 역할도 하게 된다.
본 발명에서의 '능동 표적화'는 환부에서 체온에 의해 겔화되어 점착되는 특성을 가지고 있는 온도감응 고분자에 의해 달성할 수 있다.
또한, 상기 온도감응 고분자는 원하는 환부에 항암제 약물을 고정시키는 능동 표적화 역할이외에도 항암제 약물을 물리적인 힘에 의해 방출시켜 환부에 집중적으로 투약하도록 하는 수동 표적화 역할도 한다. 온도감응 고분자가 체온에 의해 겔화되면 약물전달체의 전체적인 부피가 점점 줄어들게 되고, 이러한 수축압에 의해 하이드로겔 고분자의 코어에 내포된 항암제 약물이 겔 벽을 뚫고 서서히 방출하게 된다.
이로써 본 발명에 따른 항암제 약물전달체는 물리적 및 화학적인 2중 서방화 시스템에 의해 항암제 약물을 환부에 방출하게 된다. 예를 들면, 항암제 약물전달체가 환부에 도포되어서는 일차적으로 온도감응 고분자가 체온에 의해 겔화되면서 하이드로겔 코어에 내포된 항암제 약물이 물리적인 힘에 의해 서서히 방출된다. 그리고, 온도감응 고분자가 체외로 배출될 때쯤에 이르렀을 때 이차적으로 하이드로겔 고분자가 가수분해되어 코어에 내포된 항암제 약물이 서서히 방출된다. 따라서 본 발명에 따른 항암제 약물전달체는 2중 서방화 시스템을 갖추고 있다.
또한, 본 발명에 따른 항암제 약물전달체는 종양이 제거된 병변에 도포되어서는 지속적인 항암치료를 통해 완치 확률을 높일 수 있고, 또한 인공장벽을 형성하여 미세혈관에 의한 암의 전이를 방지하는 효과도 기대할 수 있다.
수술을 통해 암 부위를 불완전하게 절제한 경우 신생 혈관 안으로 암세포가 침투하여 다른 장기 또는 조직으로 이동하여 정착하게 되면, 그 곳에서 암세포는 다시 분열과 증식을 시작하여 일정 시간이 지난 후 암 덩어리를 만들게 된다. 따라서 암 질환에 있어 항암 치료도 중요하지만, 암세포가 다른 장기 또는 조직으로 전이되는 것을 억제하는 것도 매우 중요하다. 이러한 관점에서 볼 때 본 발명의 항암제 약물전달체는 항암치료 기능 외에도 암의 전이를 억제하는 기능도 동시에 보유하고 있다는 점에서 큰 의미가 있다.
또한, 본 발명에 따른 항암제 약물전달체는 통상의 제제화 방법에 의해 약제학적 제제로 제형화될 수 있다. 구체적으로 본 발명에 따른 항암제 약물전달체는 액제, 분말제 또는 필름제로 제형화될 수 있으며, 본 발명에 따른 항암제 약물전달체의 제형이 이에 국한되는 것은 결코 아니다.
본 발명에 따른 항암제 약물전달체의 구성에 대해 보다 구체적으로 설명하면 하기와 같다.
(1) 항암제 약물
본 발명에서는 항암제 약물의 선택에 특별한 제한을 두지 않는다. 당분야에서 널리 알려진 항암제 약물이라면 모두 적용이 가능하다.
상기 항암제로는 알킬화 약물(Alkylating agents)로서 사이클로포스파마이드(Cyclophosphamide), 이포스파마이드(Ifosfamide), 프로카바진(Procarbazine), 부설판(Busulfan), 카무스틴(Carmustine), 로무스틴(Lomustine), 다카바진(Dacarbazine), 시스플라틴(Cisplatin) 등이 포함될 수 있다. 항 대사 물질(Antimetabolites)로서 메소트렉세이트(Methotrexate), 플루오로우실라(5-Fluorouracil), 카페시타빈(Capecitabine), 시토신 아라비노사이드(Cytosine Arabinoside), 젬시타빈(Gemcitabine) 등이 포함될 수 있다. 빈카알칼로이드(Vinca Alkaloid)계 천연물질로서 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine) 등이 포함될 수 있다. 탁센(Taxane) 약물로서 파클리탁셀(Paclitaxel), 도세탁셀(Docetaxel) 등이 포함될 수 있다. 에피포도필로톡신(Epipodophyllotoxin) 약물로서 에토포사이드(Etoposide) 등이 포함될 수 있다. 캠토테신(Camptothecin) 약물로서 토포테칸(Topotecan), 이라노테칸(Irinotecan) 등이 포함될 수 있다. 항종양성 항생물질(Antitumor Antibiotics)로서 마이토마이신(Miitomycin-C), 다우노루비신(Daunorubicin), 독소루비신(Doxorubicin), 블레오마이신(Bleomycin) 등이 포함될 수 있다. 효소계 약물로서 아스파라기나제(L-asparaginase) 등이 포함될 수 있다. 우레아(Urea)계 약물로서 하이드록시우레아(Hydroxyurea) 등이 포함될 수 있다. 티로신 키나제(Tyrosine Kinase) 억제제로서 리툭시맵(Rituximab), 트라스투주맵(Trastuzumab), 이마티닙(Imatinib), 게피티닙(Gefitinib), 엘로티닙(Erlotinib) 등이 포함될 수 있다. 이상에서 예시된 항암제 약물은 이들의 약학적 허용 가능한 염 또는 수화물 형태로 사용될 수 있다. 또한, 상기한 항암제 약물은 1종 이상이 사용될 수 있다.
상기 항암제 약물은 약물전달체 중에 0.6 ∼ 2.2 중량% 범위로 포함될 수 있다. 항암제 약물의 함량은 해당 약물의 약효에 따라 차이가 있을 수 있는데, 통상적으로 0.6 중량% 미만으로 적으면 항암효과가 제대로 발휘되지 않을 수 있고, 2.2 중량%를 초과하여 과량이 포함되면 약물 부작용을 유발할 수도 있다.
(2) 하이드로겔 고분자
본 발명에서 하이드로겔 고분자는 항암제 약물을 내포하는 운반체로 작용한다.
상기 하이드로겔 고분자는 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자와 에폭시 관능기를 가지는 가교제가 에테르(-O-) 공유결합을 통해 가교된 가교고분자를 하이드로겔화 반응시켜 제조된 것으로, 안정화된 그물망 구조를 이루고 있다.
또한, 상기 하이드로겔 고분자는 겔의 코어 부분이 소수성을 띄고, 겔의 표면이 친수성을 띄고 있는 미셀형 코어-쉘 구조를 가지고 있다. 이에, 항암제 약물이 존재하는 조건에서 가교고분자를 하이드로겔화 반응시키면 가교고분자의 소수성 부분과 소수성인 항암제 약물이 서로 상호작용에 의해 미쉘형 하이드로겔의 코어에 항암제 약물이 내포될 수 있다. 이렇게 하이드로겔 고분자의 코어 부분에 내포된 항암제 약물은 수용액 조건에서도 결정화되지 않고 안정하게 환부에 집중적으로 방출될 수 있다.
또한, 상기 하이드로겔 고분자는 외표면이 친수성을 띄고 있어 체내의 여러 면역기작들로부터 항암제 약물을 안전하게 보호할 수도 있다.
또한, 하이드로겔 고분자는 수용액상에서 에테르 가교결합이 가수분해되어 코어에 내포된 항암제 약물이 서서히 방출되는 서방화 효과를 달성할 수 있다.
상기 하이드로겔 고분자는 약물전달체 중에 6.2 ∼ 21.7 중량% 범위로 포함될 수 있다. 하이드로겔 고분자의 함량이 6.2 중량% 미만이거나 21.7 중량%를 초과하면 항암제 약물을 하이드로겔 고분자의 코어에 내포하기가 어려울 수 있다.
상기 하이드로겔 고분자를 구성하게 되는 친수성 고분자는 하이드록시 관능기를 가지고 중량평균분자량이 10,000 ∼ 1,000,000 g/mol 범위인 고분자로서, 구체적으로는 알긴산, 히알루론산, 덱스트란, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 및 이들의 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 포함될 수 있다.
상기 하이드로겔 고분자를 구성하게 되는 가교제는 에폭시 관능기를 가지는 화합물로서, 구체적으로는 에피클로로히드린, 에피브로모히드린, 부탄디올디글리시딜에테르, 에틸렌글리콜디글리시딜에테르, 헥산디올디글리시딜에테르, 프로필렌글리콜디글리시딜에테르, 폴리에틸렌글리콜디글리시딜에테르, 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르, 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르, 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르, 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르, 디글리세롤폴리글리시딜에테르, 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르, 글리세롤폴리글리시딜에테르, 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르, 비스(에폭시프로폭시)에틸렌, 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르 및 소르비톨폴리글리시딜에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 포함될 수 있다.
(3) 온도감응 고분자
본 발명에서 온도감응 고분자는 체온에 의해 졸(Sol)에서 겔(Gel)로 상(phase)이 전환된다.
본 발명의 약물전달체를 환부에 적용하게 되면, 온도감응 고분자가 체온에 의해 겔화(gelation)되면서 환부에 약물전달체가 점착되어 고정화된다. 그리고, 온도감응 고분자의 겔화가 진행되면서 약물전달체의 부피가 서서히 수축되고, 이러한 수축압력에 의해 하이드로겔 고분자의 코어에 내포된 항암제 약물이 겔 벽을 뚫고 서서히 방출하게 된다. 따라서 온도감응 고분자는 체내에서 겔화되어 약물전달체를 환부에 정확히 고정시키는 능동 표적화 역할과, 환부 표적 부위에서 하이드로겔 코어에 내포된 항암제 약물을 집중적으로 방출시키는 수동 표적화 역할을 동시에 하게 된다.
상기 온도감응 고분자는 에테르 관능기를 가지고 중량평균분자량이 500 ∼ 500,000 g/mol 범위인 고분자로서, 구체적으로 폴리(에틸렌옥사이드), 폴리(에틸렌옥사이드-프로필렌옥사이드) 랜덤 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드 트라이블록 공중합체, 폴리(에틸렌글리콜)-폴리(L-락틱에시드)-폴리(에틸렌글리콜), 알킬화된 폴리에틸렌옥사이드 블록 공중합체 및 폴리(비닐메틸에테르)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
상기 온도감응 고분자는 약물전달체 중에 76.1 ∼ 93.2 중량% 범위로 포함될 수 있다. 온도감응 고분자의 함량이 76.1 중량% 미만으로 적으면 약물전달체를 환부에 고정화하는 능동 표적화 역할을 제대로 할 수 없고, 하이드로겔의 코어에 내포된 항암제의 물리적 방출을 도울 수 없는 문제가 있을 수 있다. 반면에 온도감응 고분자의 함량이 93.2 중량%를 초과하여 과량이 포함되면 항암제 약물의 초기방출량이 과다할 수 있는 문제가 있다.
또한, 본 발명은 항암제 약물전달체의 제조방법을 특징으로 한다. 본 발명에 따른 항암제 약물전달체의 제조방법은 :
(제 1단계) 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자와 에폭시 관능기를 가지는 가교제를 반응시켜, 에테르 가교결합을 가지는 가교고분자를 제조하는 제 1단계;
(제 2단계) 항암제 약물과 체내에서 겔로 전환되는 온도감응 고분자를 혼합하고 40 ∼ 60℃ 온도에서 교반하여, 항암제 약물을 전처리하는 제 2단계; 및
(제 3단계) 상기 제 1단계에서 제조된 가교고분자와 제 2단계에서 전처리된 항암제 약물을 혼합하고 60 ∼ 110℃ 온도에서 하이드로겔화 반응시켜, 항암제 약물전달체를 제조하는 제 3단계; 를 포함한다.
본 발명에 따른 항암제 약물전달체의 제조방법을 각 단계별로 구체적으로 설명하면 하기와 같다.
제 1단계는, 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자와 에폭시 관능기를 가지는 가교제를 반응시켜 가교고분자를 제조하는 과정이다.
상기 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자는 중량평균분자량이 10,000 ∼ 1,000,000 g/mol이며, 알긴산, 히알루론산, 덱스트란, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 및 이들의 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 포함될 수 있다.
상기 에폭시 관능기를 가지는 가교제는 에피클로로히드린, 에피브로모히드린, 부탄디올디글리시딜에테르, 에틸렌글리콜디글리시딜에테르, 헥산디올디글리시딜에테르, 프로필렌글리콜디글리시딜에테르, 폴리에틸렌글리콜디글리시딜에테르, 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르, 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르, 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르, 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르, 디글리세롤폴리글리시딜에테르, 폴리글리세롤폴리글리시딜에테르, 글리세롤폴리글리시딜에테르, 트리메틸프로판폴리글리시딜에테르, 비스(에폭시프로폭시)에틸렌, 펜타에리쓰리톨폴리글리시딜에테르 및 소르비톨폴리글리시딜에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상이 포함될 수 있다.
상기 가교반응을 진행함에 있어, 친수성 고분자와 가교제의 함량비는 [OH]/[에폭시]의 관능기 몰비가 1/1 ∼ 1/20 범위, 바람직하기로는 관능기 몰비가 1/8 내지 1/20 범위가 되도록 조절하여 사용하는 것이 좋다. 만약, [OH]/[에폭시]의 관능기 몰비가 1/1 미만이면 가교고분자의 수율이 낮아지는 문제가 있을 수 있고, [OH]/[에폭시]의 관능기 몰비가 1/20을 초과하면 제조된 가교고분자 중에 다량의 미반응 하이드록시 관능기가 잔류하여 원하지 않는 부반응을 일으켜서 결국엔 부분적인 겔화가 일어나 하이드로겔의 수율을 저하시킬 수 있다.
상기 가교반응은 물과 아세톤 및 탄소수 1 내지 6의 알콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 분산보조제의 혼합용액 하에서 수행할 수 있다. 상기 분산보조제는 물과 상용성이 우수하면서 물보다 비점이 낮고, 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자를 용해시키지 않는 유기용매를 선정하여 사용하는 것이 좋다. 상기 분산보조제는 바람직하기로는 아세톤 및 탄소수 1 내지 6의 알콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상을 사용할 수 있다. 상기 알콜은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올, 펜탄올 및 헥산올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
또한, 혼합용액을 제조함에 있어, 물 1 중량부를 기준으로 분산보조제는 1 ∼ 20 중량부 범위로 혼합하는 것이 좋다. 물 1 중량부를 기준으로, 분산보조제의 함량이 1 중량부 미만으로 너무 적으면 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자가 용액 내에서 부분적으로 뭉침현상이 발생하여 전체 용액내에서 가교반응이 균일하게 일어나지 못하는 원인이 될 수 있다. 반면에 물 1 중량부를 기준으로, 분산보조제의 함량이 20 중량부를 초과하여 과량 사용되면 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자의 용해도가 낮아서 원활한 가교반응을 진행시킬 수 없으므로 가교고분자의 수율이 낮아질 수 있다.
상기 가교반응에서는 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자와 에폭시 관능기를 가지는 가교제가 반응하여 에테르 가교결합이 형성된 고분자를 제조하게 된다. 따라서 에테르 가교결합을 형성하기에 적합한 pH와 반응온도를 조절하는 것이 중요할 수 있다. 본 발명에 따른 에테르 가교결합에 적합한 pH는 9 ∼ 13 범위이고, 반응온도는 25 ∼ 60℃ 범위이다.
가교반응액의 pH를 조절하기 위하여, 물과 혼합되어 산 또는 염기 강도를 조절할 수 있고, 완충 용액을 제조하기 위해 사용되는 통상의 pH 조절제를 사용할 수 있다. 본 발명은 pH 조절제의 선택에 특별히 제한을 두지 않으며, 구체적으로 염산, 질산 등의 산, 또는 수산화나트륨 등의 염기가 사용될 수 있다. 다만, 가교반응액의 pH가 9 미만이면 분자구조내 카르복실기에 의해 에스테르 결합과 에테르 결합이 동시에 형성될 수 있고, pH가 13을 초과하면 부분적으로 에테르화가 급격히 일어나 균일한 고분자를 얻기 어려울 수 있다. 따라서 가교반응액의 pH를 9 ∼ 13 범위로 조절하는 것이 좋다.
그리고, 가교반응 온도가 25℃ 미만으로 낮으면 가교반응 속도가 느려서 반응시간이 길어짐으로써 부반응을 초래할 수 있고, 60℃를 초과하면 용매가 급격히 증발되어 균일한 가교결합을 유도하기 어려울 수 있다. 따라서 가교반응의 온도는 25 ∼ 60℃ 범위를 유지하는 것이 좋다.
또한, 상기 가교반응을 수행함에 있어, 물, 분산보조제, 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자 및 가교제의 투입 순서에 대해서 본 발명은 특별한 제한을 두지 않는다. 예컨대, 분산보조제와 물을 혼합한 혼합용액에 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자와 가교제를 동시에 투입하여 가교반응을 진행할 수 있다. 또한, 분산보조제에 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자를 먼저 투입하고, 이 후에 물과 가교제를 투입하여 진행될 수 있다. 다만, 분산보조제와 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자를 먼저 투입하는 경우에는 물을 매우 천천히 투입하면서 분산보조제와 투입된 조성물을 격렬하게 교반할 필요가 있다. 그렇게 하지 아니하면 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자가 국소적으로 용액 상태로 존재할 수 있기 때문이다.
제조된 가교고분자는 수불용성 겔로서, 분산보조제에는 용해도가 높지만 물에 대한 용해도는 낮다. 따라서 물보다 비점이 낮은 분산보조제를 통상의 용매제거 방법에 의해 선택적으로 제거하면 수불용성 겔 상태의 가교고분자를 쉽게 수득할 수 있다.
상기 분산보조제를 제거하기 위해 적용될 수 있는 용매 제거방법으로는 가압법, 감압법, 가열법, 냉각법, 동결건조, 막 투과법 등이 포함될 수 있다. 또한, 회전식 증류 장치 또는 그 유사 장비를 이용할 수도 있다. 용매 제거방법이나 제거장치는 사용된 분산보조제의 특성을 고려하여 적절히 선택될 수 있다. 또한, 분산보조제를 제거하는 동안에도 반응용액의 농도를 균일하게 유지시키기 위해 지속적으로 교반하는 것이 좋다. 지속적인 교반을 유지하면서 분산보조제를 제거하기 위해서는 회전식 증류 장치 또는 이와 유사한 장비가 유용할 수 있다. 상기 분산보조제의 제거는 반응용액이 투명한 용액 상태로 전환될 때까지 수행한다.
또한, 분산보조제가 제거된 반응용액은 실온에서 1 내지 72시간 정도 방치시킨 후에 수불용성 겔 상태의 가교고분자를 분리 수득한다. 분리 수득된 가교고분자는 적절히 건조한다. 상기 건조는 감압 상태에서 이루어질 수도 있다. 또한, 건조된 가교고분자는 증류수 또는 인산완충용액(PBS)으로 세척하고, pH를 중성으로 조절한 후에 건조하는 단계를 더 수행할 수도 있다.
제 2단계는, 항암제 약물을 온도감응 고분자로 전처리하는 과정이다.
항암제 약물이 수용액 상에서 쉽게 결정화되어 침전되거나 또는 상 분리되지 않도록 하기 위하여, 항암제 약물을 미리 온도감응 고분자와 혼합 교반하여 사용하는 것이 좋다. 항암제 약물은 소수성 약물로서 물에 잘 용해되지 않는 특성이 있으므로 수용액 상에서 쉽게 결정화되거나 상 분리될 수 있다. 이에 항암제 약물은 가교고분자의 하이드로겔화 반응 중에 부분적으로 결정을 형성하여, 하이드로겔 고분자의 코어에 내포시키는 것이 어려울 수 있다. 이를 해결하기 위하여, 본 발명에서는 항암제 약물을 온도감응 고분자와 미리 혼합 교반하는 전처리 과정을 진행시켜, 항암제 약물의 안정화를 달성하였다.
상기 항암제로는 알킬화 약물(Alkylating agents)로서 사이클로포스파마이드(Cyclophosphamide), 이포스파마이드(Ifosfamide), 프로카바진(Procarbazine), 부설판(Busulfan), 카무스틴(Carmustine), 로무스틴(Lomustine), 다카바진(Dacarbazine), 시스플라틴(Cisplatin) 등이 포함될 수 있다. 항 대사 물질(Antimetabolites)로서 메소트렉세이트(Methotrexate), 플루오로우실라(5-Fluorouracil), 카페시타빈(Capecitabine), 시토신 아라비노사이드(Cytosine Arabinoside), 젬시타빈(Gemcitabine) 등이 포함될 수 있다. 빈카알칼로이드(Vinca Alkaloid)계 천연물질로서 빈블라스틴(Vinblastine), 빈크리스틴(Vincristine) 등이 포함될 수 있다. 탁센(Taxane) 약물로서 파클리탁셀(Paclitaxel), 도세탁셀(Docetaxel) 등이 포함될 수 있다. 에피포도필로톡신(Epipodophyllotoxin) 약물로서 에토포사이드(Etoposide) 등이 포함될 수 있다. 캠토테신(Camptothecin) 약물로서 토포테칸(Topotecan), 이라노테칸(Irinotecan) 등이 포함될 수 있다. 항종양성 항생물질(Antitumor Antibiotics)로서 마이토마이신(Miitomycin-C), 다우노루비신(Daunorubicin), 독소루비신(Doxorubicin), 블레오마이신(Bleomycin) 등이 포함될 수 있다. 효소계 약물로서 아스파라기나제(L-asparaginase) 등이 포함될 수 있다. 우레아(Urea)계 약물로서 하이드록시우레아(Hydroxyurea) 등이 포함될 수 있다. 티로신 키나제(Tyrosine Kinase) 억제제로서 리툭시맵(Rituximab), 트라스투주맵(Trastuzumab), 이마티닙(Imatinib), 게피티닙(Gefitinib), 엘로티닙(Erlotinib) 등이 포함될 수 있다. 이상에서 예시된 항암제 약물은 이들의 약학적 허용 가능한 염 또는 수화물 형태로 사용될 수 있다. 또한, 상기한 항암제 약물은 1종 이상이 사용될 수 있다.
또한, 상기 온도감응 고분자는 에테르 관능기를 가지고 중량평균분자량이 500 ∼ 500,000 g/mol 범위인 고분자로서, 구체적으로 폴리(에틸렌옥사이드), 폴리(에틸렌옥사이드-프로필렌옥사이드) 랜덤 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드 트라이블록 공중합체, 폴리(에틸렌글리콜)-폴리(L-락틱에시드)-폴리(에틸렌글리콜), 알킬화된 폴리에틸렌옥사이드 블록 공중합체 및 폴리(비닐메틸에테르)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.
제 3단계는, 가교고분자를 하이드로겔화 반응시켜 항암제 약물전달체를 제조하는 과정이다.
구체적으로, 상기 제 1단계에서 제조된 가교고분자와 제 2단계에서 전처리된 항암제 약물을 혼합하고 하이드로겔화 반응시키는 단계이다. 이로써 항암제 약물전달체는 항암제 약물이 코어에 내포된 하이드로겔 고분자와 온도감응 고분자가 고르게 분산되어 있는 상태로 제조할 수 있다.
상기 하이드로겔화 반응은 항암제 약물의 소수성 부분과 가교고분자의 소수성 부분이 효과적으로 소수성 상호작용을 할 수 있도록, 반응온도는 60 ∼ 110℃로 유지하는 것이 좋다. 상기 하이드로겔화 반응온도가 60℃ 미만이면 부분적인 겔화 및 항암제 약물이 완전하게 용융되지 않아 하이드로겔의 코어가 형성되지 않을 수 있고, 110℃를 초과하여 높은 온도를 유지하면 하이드로겔의 에테르 결합이 분해되어 항암제 약물이 코어에 내포되지 못하고 하이드로겔 밖으로 방출되므로 결국엔 서방화 효능을 달성할 수 없게 된다.
도 1에는 본 발명에 따른 항암제 약물전달체에 대해 cryo-TEM 분석한 사진이 첨부되어 있다. 도 1에 의하면, 항암제 약물전달체는 하이드로겔 고분자와 온도감응 고분자가 고르게 분산되어 있으며, 상기 하이드로겔 고분자의 코어에는 항암제 약물이 안정적으로 내포되어 있음을 확인할 수 있다.
또한, 도 2에는 본 발명에 따른 항암제 약물전달체를 체내에 도포하여 졸(sol)에서 겔(gel)로 변화되어 항암제 약물이 방출되는 과정이 도시되어 있다. 도 2에서처럼 졸(sol) 상태에서는 하이드로겔 고분자의 내부에 항암제 약물이 내포되어 있으나, 체내에 도포 처리하게 되면 하이드로겔 고분자가 수축되면서 내포된 항암제 약물을 밖으로 방출하게 된다.
이상에서 설명한 바와 같은 본 발명은 하기의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하기로 한다.
그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 물과 분산보조제의 혼합비에 따른 친수성 고분자 용액의 상태 평가
본 실시예 1에서는 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자를 가교반응시킬 때 사용되는 물과 분산보조제의 혼합비를 결정하기 위한 것이다.
하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자로서는 대표적으로 소듐 카르복시메틸셀룰로오스(이하, 'SCMC'로 약칭함)를 사용하였다. 분산보조제로는 아세톤, 에탄올 또는 이의 혼합용액을 사용하였다.
구체적으로 교반 장치가 장착된 500 mL 반응용기에 하기 표 1, 2 또는 3의 조성비로 증류수와 분산보조제를 투입하고, 혼합용액을 상온에서 80 rpm 교반속도로 교반하면서 소듐 카르복시메틸셀룰로오스(SCMC)를 투입하고 10분 동안 교반한 후에, 1시간동안 정체하였다. 정체된 용액의 점도와 SCMC 입자 상태를 육안으로 확인하고, 하기의 판단 기준에 의해 평가하였다. 평가 결과는 하기 표 1, 2 또는 3에 나타내었다.
[SCMC 용액의 판단 기준]
● : SCMC 투입 후 점도에 큰 변화 없으며, SCMC의 입자 상태가 유지됨
▲ : SCMC 투입 후 점도에 큰 변화 없으며, SCMC가 뭉치는 현상을 보임
× : SCMC 투입 후 점도가 증가하고, SCMC가 용액으로 전환됨
분산보조제 용액 조성(중량비, g) 증류수 1 2 6 8 10 12 15
아세톤 19 18 14 12 10 8 5
SCMC 1 g 투입후 용액 변화 ● ● ● ● ● × ×
분산보조제 용액 조성(중량비, g) 증류수 10 10 10 10 10 10 10 10 10
에탄올 5 8 10 15 20 50 100 200 250
SCMC 1g 투입후 용액 변화 × × ● ● ● ● ● ● ▲
분산보조제 용액 조성(중량비, g) 증류수 10 10 10 10 10 10 10 10 10
아세톤 2 4 5 7 10 25 50 100 150
에탄올 3 4 5 8 10 25 50 100 100
SCMC 1 g 투입후 용액 변화 × × ▲ ● ● ● ● ● ▲
상기 표 1, 2 및 3에서 확인되고 있듯이, 물 : 분산보조제의 중량비가 1 : 1 미만인 경우 SCMC 투입 후 조성물의 점도가 증가하고, 또한 SCMC가 부분적으로 뭉침현상이 발생하여 용액 자체의 균일한 혼합을 이룰 수 없다. 분산보조제 용액의 점도가 증가하면 조성물의 혼합 균일성을 저하시키므로 균일한 겔 조성물을 얻기 위해서는 물 : 분산보조제의 중량비는 1 : 1 이상, 좋기로는 1 : 1 ∼ 20 범위를 유지하도록 한다.
실시예 2. 물과 분산보조제의 혼합비에 따른 가교고분자의 겔 수율 평가
본 실시예 2에서는 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자와 가교제를 가교반응시킬 때 사용되는 물과 분산보조제의 혼합비를 결정하기 위한 것이다.
구체적으로 교반 장치가 장착된 500 mL 반응용기에 하기 표 4의 조성비로 증류수와 분산보조제로서 아세톤을 투입하여 혼합용액을 제조하였다. 혼합용액을 상온에서 80 rpm 교반속도로 교반하면서 소듐 카르복시메틸셀룰로오스(SCMC)를 투입한 다음, 가교제로서 부탄디올디글리시딜에테르(BDDE)를 투입하고 상온에서 24시간 동안 교반하였다. 이때, 소듐 카르복시메틸셀룰로오스(SCMC)와 부탄디올디글리시딜에테르(BDDE)의 혼합비율은 [OH]/[에폭시] 관능기 몰비가 1/8이 되도록 하였다. 뿌옇게 흐린 반응용액을 25℃ 및 -0.5 MPa이 유지되는 감압 증류장치에 증류시켜 아세톤을 제거하였으며, 상기 증류는 반응용액이 완전히 투명해질 때까지 실시하였다. 반응용액이 투명해지면 감압을 종료하였다. 제조된 가교고분자를 동결 건조하여 분말 형태로 수득하였다. 가교고분자 분말은 증류수를 사용하여 24시간 동안 3회의 세척과정을 실시하였다. 1회 세척과정이 종료될 때마다 거름종이를 이용해 겔을 수득하고, 3회 세척이 종료된 후 수득된 겔을 진공 오븐에서 건조시켰다. 건조된 겔의 중량을 측정하여 겔 수율을 계산하였다.
[수학식 1]
Figure PCTKR2016011977-appb-I000001
구 분 혼합용액(중량비) [OH]/[에폭시] 몰비 겔수율(%)
증류수 아세톤
가교샘플 2-1 1 21 1/8 -
가교샘플 2-2 1 20 1/8 12
가교샘플 2-3 1 19 1/8 35
가교샘플 2-4 2 18 1/8 48
가교샘플 2-5 6 14 1/8 57
가교샘플 2-6 8 12 1/8 74
가교샘플 2-7 10 10 1/8 80
가교샘플 2-8 12 8 1/8 -
상기 표 4에서 확인되고 있듯이, 증류수 : 아세톤의 중량비가 1 : 1 내지 20일 때(가교샘플 2-2 ∼ 2-7)는 가교 겔이 형성될 수 있었고, 그리고 1 : 1 내지 9 범위일 때(가교샘플 2-4 ∼ 2-7)는 가교 겔의 수율이 보다 향상되었다는 것을 확인할 수 있다. 이에 반하여, 증류수 : 아세톤의 중량비가 1 : 1 미만이거나 또는 1 : 20을 초과할 때(가교샘플 2-1, 2-8)는 가교 겔을 수득할 수 없었다.
실시예 3 : [OH]/[에폭시] 관능기 몰비에 따른 가교고분자의 겔 수율 평가
본 실시예 3에서는 하이드록시 관능기를 가지는 친수성 고분자와 가교제를 가교반응시킬 때, 겔 수율을을 극대화시킬 수 있는 [OH]/[에폭시] 관능기의 결정하기 위한 것이다.
상기 실시예 2의 방법으로 가교반응을 수행하여 가교 겔을 수득하였으며, 다만 소듐 카르복시메틸셀룰로오스(SCMC)와 부탄디올디글리시딜에테르(BDDE)의 혼합비율은 하기 표 5에 나타낸 [OH]/[에폭시] 관능기 몰비가 되도록 하였다.
구 분 혼합용액(중량비) [OH]/[에폭시] 몰비 겔수율(%)
증류수 아세톤
가교샘플 3-1 4 16 1/1 6
가교샘플 3-2 4 16 1/4 32
가교샘플 3-3 4 16 1/8 51
가교샘플 3-4 4 16 1/12 87
가교샘플 3-5 4 16 1/16 95
가교샘플 3-6 4 16 1/20 80
가교샘플 3-7 4 16 1/21 -
상기 표 5에서 확인되고 있듯이, [OH]/[에폭시] 관능기 몰비가 1/1 내지 1/20일 때 가교 겔이 형성될 수 있었고, 그리고 [OH]/[에폭시] 관능기 몰비가 1/8 내지 1/20 범위일 때 가교 겔의 수율이 보다 향상되었다는 것을 확인할 수 있다. 이에 반하여, [OH]/[에폭시] 관능기 몰비가 1/20을 초과할 때(가교샘플 3-7)는 가교 겔 수율이 매우 낮아서 측정이 불가하였다.
실시예 4 : 조성비에 따른 항암제 약물전달체의 상태 평가
본 실시예 4에서는 약물전달체를 구성하는 항암제 약물, 하이드로겔 고분자 및 온도감응 고분자의 조성비에 따라 제조된 약물전달체의 상태를 비교 평가하기 위한 것이다. 항암제 약물로는 도세탁셀을 사용하였으며, 하이드로겔을 형성하는 가교고분자로는 실시예 3의 가교샘플 3-5를 사용하였으며, 온도감응 고분자로는 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드(PEP-PPO-PEO) 트라이블록 공중합체를 사용하였다.
구체적으로, 물 70 mL에 도세탁셀과 PEP-PPO-PEO 공중합체를 하기 표 6의 함량비로 투입하고, 60℃에서 100 rpm 속도로 교반하여 항암제 약물을 전처리하였다. 전처리된 도세탁셀에 하기 표 6의 함량비로 SCMC-BDDE 가교고분자를 질소 기류하에서 혼합하고, 60℃ 온도에서 24시간동안 교반하였다. 반응용액을 25ㅁ2℃에서 24시간 방치하여 거품을 제거하였다. 24시간 방치 후에 침천물의 생성 여부를 육안으로 확인하여 하기 표 6에 나타내었다.
구 분 약물전달체의 조성비 (g) 상태
항암제약물 하이드로겔 고분자 온도감응 고분자
약물전달체 1 17.9 6.1 76 ×
약물전달체 2 18.0 6.2 76 ▲
약물전달체 3 14.0 10 76 ▲
약물전달체 4 2.3 21.7 76 ▲
약물전달체 5 2.2 21.8 76 ×
약물전달체 6 1.0 6.2 92.8 ●
약물전달체 7 1.0 10 89 ●
약물전달체 8 1.0 21.7 77.3 ●
약물전달체 9 2.2 6.2 91.6 ●
약물전달체 10 2.2 10 87.8 ●
약물전달체 11 2.2 21.7 76.1 ●
약물전달체 12 2.3 6.2 91.5 ▲
약물전달체 13 2.3 10 87.7 ▲
약물전달체 14 2.3 21.7 76 ▲
[항암제 약물전달체의 상태 판단 기준]
● : 약물전달체가 물에 완벽히 가용화되어 투명한 용액으로 제조됨
▲ : 약물전달체가 부분적으로 입자로 남아있음
× : 약물전달체가 용해되지 않고 유백색 분산액으로 제조됨
상기 표 6에 의하면, 약물전달체 6 ∼ 11은 물에 완전히 가용화되어 투명한 용액 상태로 얻어진다. 그러나. 약물전달체 1과 5는 물에 용해되지 못하고 유백색 분산액으로 제조되었으며, 하이드로겔의 코어에 도세탁셀 약물이 내포되지 못하고 겔 밖에서 침전되어 존재하는 것으로 확인되었다. 약물전달체 2 ∼ 4 및 12 ∼ 14는 물에 완벽하게 가용화되지 않고 부분적으로 침전물이 존재하고 있었다.
따라서 본 발명의 항암제 약물전달체를 구성함에 있어, 항암제 약물의 최적 함량은 0.6 내지 2.2 중량%이고, 하이드로겔 고분자의 최적 함량은 6.2 내지 21.7 중량%이고, 온도감응 고분자의 최적 함량은 76.1 ∼ 93.2 중량%이며, 상기의 조성비 범위에서는 항암제 약물이 하이드로겔 고분자의 코어에 안정적으로 내포되어 나노화되어 수용액 조건에서 존재하므로 항암제 약물이 물에 침전될 염려가 없다.
도 3에는 상기 실시예 4에서 제조된 약물전달체 9를 수용액 상태로 14일 동안 보존하면서 침전물(도세탁셀의 결정)의 성장을 관찰한 결과를 그래프로 나타내었다. 도 3에 의하면, 본 발명의 약물전달체는 수용액 상태로 14일 동안 보존하여도 결정의 성장이 거의 없었으며, 또한 하이드로겔 밖으로 항암제 약물이 방출되지 않고 안전하게 겔의 코어에 존재할 수 있었다.
또한, 도 4에는 상기 실시예 4에서 제조된 약물전달체 9가 물에 용해된 샘플 사진을 첨부하였다. 도 4에서 (a)는 가열처리하기 전의 반응용액 상태이고, (b)는 가열처리 후의 반응용액 상태를 보여준다. 항암제 약물, 가교고분자 및 온도감응 고분자가 혼합된 반응전 용액의 상태는 뿌옇게 흐린 분산액이었지만, 가열에 의해 가교고분자가 하이드로겔화 되면서 코어에 항암제 약물을 내포하게 된 후에는 반응용액이 투명하게 변화된다. 따라서, 반응용액의 상태 변화를 확인하는 것으로도 본 발명의 항암제 약물전달체는 항암제 약물이 하이드로겔 코어에 안정적으로 내포되어 있다는 것을 알 수 있다.
실시예 5 : 항암제 약물전달체의 생체 내(in vivo) 약물동태 평가
본 실시예 5에서는 현재 혈관을 통해 직접 투입하는 방식의 주사제와 종양절개 부위에 직접 투입하는 DDST(Drur Delivery System Therapie)방식을 이용한 본 발명의 약물전달체의 생체 내(in vivo) 약물동태를 비교하기 위한 것이다.
본 발명을 대표하는 DDST 투여용 약물전달체로는 상기 실시예 4에서 제조된 약물전달체 9(도세탁셀 2.2 중량% 함유)를 사용하였고, 대조군으로는 도세탁셀 주사제로 상품화되어 있는 탁소텔(Taxotere™) 제품을 사용하였다. 실험동물으로는 숫컷의 스프래그-다우리 랫트(Male Sparague Dawley rats)를 사용하였다.
본 발명의 항암제 약물전달체는 종양제거 부위에 직접투여(5 mg/kg)하였고, 기존의 탁소텔(Taxotere™) 주사제는 정맥투여(5 mg/kg)하였다.
도 5에는 본 발명의 항암제 약물전달체를 종양제거 부위에 직접 투여하는 방식과 기존의 항암제 주사제를 정맥투여하는 방식에 대하여, 24시간 동안의 혈중 농도(ng/mL)를 측정한 결과를 도시하였다. 그리고, 24시간 동안의 측정된 혈중 농도와 시간 데이터를 비구획분석(non-compartmental analysis)을 통하여 약동학적 파라미터의 평균을 산출한 값을 하기 표 7에 나타내었다.
PK 파라미터 도세탁셀 약물전달체 도세탁셀 주사제
AUC24h 387±55 281±71
AUCINF 453±93 301±82
평균AUC 281 379
Cmax 1850±358 901±192
T1/2 6±3 4±1
CL 11±2 17±4
Vdss 105±38 103±36
상기 표 7에 의하면, 약물전달체의 반감기는 6시간이고, 주사제의 반감기는 4시간으로 확인되었다. 24시간까지의 평균 AUC(area under the curve)의 경우, 약물전달체는 387 ng.hr/mL이고, 주사제는 281 ng.hr/mL로 확인되었다. 평균 Cmax의 경우, 약물전달체는 1850 ng/mL이고, 주사제는 901 ng/mL로 약 2배의 차이를 보였다.
주사제로 투입하는 방식보다는 약물전달체로 종양 제거부위에 직접 투여하였을 경우 AUC24h 및 Cmax 가 각각 35% 및 105%가 유의적으로 증가되었으며, 이에 따라 전신청소율(CL)이 주사제에 비해 약물전달체로 투여하였을 때 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다.
이 결과로 도세탁셀 항암제 약물은 주사제로 정맥투입하는 것에 비교하여, 약물전달체로 항암제거 부위에 직접 투여할 때 체내 체류시간이 길며, 같은 용량을 투여하였을 때 AUC 및 Cmax가 확연히 높아 동일 용량 대비 생체 이용률이 향상됨을 알 수 있다.
*실시예 6 : 약물전달체의 세포 독성도 평가
본 실시예 6에서는 본 발명의 약물전달체에 대한 세포 독성을 확인하기 위한 것으로, 항암제 약물을 제외한 하이드로겔 고분자와 온도감응 고분자로 구성된 약물전달체에 대해 세포 독성을 확인하였다.
구체적으로 항암제 약물이 제거된 약물전달체와 양성대조군인 테프론(1cm×1cm)을 37℃에서 3일 동안 세포배양 배지에서 용출시켜 용출액을 얻었다. 96웰 플레이트에 섬유아세포를 1×10⁴cell 밀도로 분주하고 하루 동안 5% CO2, 37℃ 조건에서 생체 내(in vitro) 세포배양하였다. 상기 섬유아세포 배양액에, 항암제 약물이 제거된 약물전달체, 양성대조군(테프론) 및 하이드로겔 고분자 용출액을 분주하였다. 다음날 20 MTT Solution (2 mg/mL in PBS)을 분주하고 4시간 동안 추가 배양하였다. 그 후, 배양액을 제거하고 디메틸술폭사이드(DMSO) 100 uL를 첨가하고 마이크로플레이트 판독기(Microplate reader)를 이용하여 570 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다.
도 6에는 항암제 약물이 제거된 약물전달체, 양성대조군(테프론) 및 소듐 카르복시메틸셀룰로오스(SCMC) 고분자 용출액 각각을 MTT 분석한 결과를 그래프로 나타내었다. 도 6에 의하면, 항암제 약물이 제거된 약물전달체, 양성대조군(테프론) 및 하이드로겔 고분자 용출액은 모두 세포 생존률이 높았으며, 특히 본 발명의 항암제 약물전달체는 양성대조군(테프론)보다 세포생존율이 우수한 것으로 확인되었다. 이로써 본 발명의 항암제 약물전달체 및 이의 제조에 사용된 고분자는 세포독성이 없는 안전한 물질임을 확인할 수 있다.
실시예 7 : 약물전달체의 인공장벽 효과 평가
본 실시예 7에서는 본 발명의 약물전달체에 대한 인공장벽 효과에 의한 암전이 억제 효능을 확인하기 위한 것으로, 동물의 부검 시 육안소견을 통해 인공장벽 효능을 확인하였다.
구체적으로, 실험동물로는 생후 2 ∼ 3개월 된 뉴질랜드 토끼를 사용하였다. 마취는 리도카인을 사용하여 체중 100 g당 1 cc를 복강내 주사하여 마취하였다. 마취가 되면 복부에 털을 깎고 포비돈으로 소독하여 복부 정중선을 따라 4 cm 정도 개복하여 우측 복막에 1×1 ㎠ 크기로 복막의 전층을 제거하고, 복막 상처부위에 맞닿은 막창자장막에 의료용 사포로 실핏줄이 터져 약간의 출혈이 맺힐 정도로 문질러서 찰과상을 유발하였다.
항암제 약물이 제거된 본 발명의 약물전달체를 0.5 mL 복강 내에 골고루 도포하였다. 수술이 끝난 동물은 물과 먹이를 충분히 주었고, 10일 후 좌하복부에 새로운 절개선을 가하여 육안적 소견으로 병리검사를 실시하고 개체별로 유착정도, 유착세기를 기록하여 수치화 하였다.
평균 유착 정도 = Σ(등급별 개체수×등급)/총개체수
Figure PCTKR2016011977-appb-I000002
평가는 Knightly 등의 방법에 따라 0에서 4까지 분류하며, 또한 Hooker 등의 방법에 따라 0에서 3까지 분류하였다. 그 결과는 하기 표 8에 나타내었다.
구 분 약물전달체의 조성비(중량%) K-score1 H-score2
항암제약물 하이드로겔 고분자 온도감응 고분자
샘플 6-1 1.0 6.2 92.8 1.00±0.81 0.60±0.84
샘플 6-2 1.0 10 89 0.63±0.35 0.40±0.64
샘플 6-3 1.0 21.7 77.3 0.60±0.30 0.42±0.53
샘플 6-4 2.2 6.2 91.6 1.21±0.71 0.82±0.74
샘플 6-5 2.2 10 87.8 1.32±0.75 0.90±0.76
샘플 6-6 2.2 21.7 76.1 2.10±0.81 1.71±0.64
1) Adhesion grading scale (Knightly score)
2) Adhesion grading scale (Hooker score)
상기 표 8에서 확인되고 있듯이, 본 발명의 약물전달체는 유착장지 효능이 우수하였음을 확인할 수 있다.
실시예 8 : 항암제 약물전달체의 항암효과 평가
본 실시예 8에서는 본 발명에 따른 항암제 약물전달체에 대한 항암 효능을 확인하기 위하여, MTT 분석법을 이용하여 암세포의 생존율을 측정하였다.
24웰 플레이트에 하기 표 9에 나타낸 암세포주를 2×10⁴cells/plate로 접종하여 70%의 암세포가 플레이트를 채웠을 때, 상기 실시예 4에서 제조된 약물전달체 9(도세탁셀 2.2 중량% 함유)를 insert 부분에 150 uL씩 넣고 겔화시켜 첨가 해주었다. 12, 24, 48, 72시간 배양하고 MTT 용액(50 ug/mL, 시그마사 제품)을 100 uL씩 넣고 4시간 동안 37℃ 인큐베이터에서 배양하였다. 보라색 결정이 생성되면 DMSO 용액 500 uL를 넣고 30분 동안 교반하여 녹여 주었다. ELISA 판독기를 이용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하여 세포의 생존율을 확인하였다. 그 결과는 하기 표 9에 나타내었다.
암 세포 세포주 암세포 사멸 시간
인간 유방암 세포 MCF-7 72 시간 이내
폐암 세포 H-460 72 시간 이내
위암 세포 SNU601 72 시간 이내
대장직장암 세포 HCT-116 72 시간 이내
두경부암 세포 SNU-1041 72 시간 이내
식도암 세포 TE-11 72 시간 이내
간암 세포 Hep3B 72 시간 이내
신장암 세포 CAKI-1 72 시간 이내
췌장암 세포 Capan-1 72 시간 이내
방광암 세포 T24 72 시간 이내
전립선암 세포 PC-3 72 시간 이내
고환암 세포 T98G 72 시간 이내
자궁암 세포 MES-SA 72 시간 이내
자궁 내막암 세포 HEC-1-B 72 시간 이내
난소암 세포 CP70 72 시간 이내
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (16)

  1. 탁센(Taxane) 항암제 약물;
    히드록시프로필메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 및 이들의 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 친수성 고분자와, 부탄디올디글리시딜에테르, 헥산디올디글리시딜에테르, 에틸렌글리콜디글리시딜에테르, 프로필렌글리콜디글리시딜에테르, 폴리에틸렌글리콜디글리시딜에테르, 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르, 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르, 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 가교제를 가교결합하여 형성된 가교고분자를 하이드로겔화하여 제조된 것으로, 상기 약물을 코어 내부에 내포하는 하이드로겔 고분자; 및
    폴리(에틸렌옥사이드), 폴리(에틸렌옥사이드-프로필렌옥사이드) 랜덤 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드 트라이블록 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상으로 체내에서 겔로 전환되는 온도감응 고분자;
    가 포함된 약물전달체.
  2. 제 1 항에 있어서,
    항암제 약물 0.6 ∼ 2.2 중량%;
    상기 약물을 코어 내부에 내포하는 하이드로겔 고분자 6.2 ∼ 21.7 중량%; 및
    체내에서 겔로 전환되는 온도감응 고분자 76.1 ∼ 93.2 중량%;
    가 포함된 약물전달체.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 항암제 약물은 파클리탁셀(Paclitaxel), 도세탁셀(Docetaxel), 이의 약학적 허용 가능한 염 및 수화물로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 하이드로겔 고분자는 친수성 고분자의 하이드록시 관능기와 가교제의 에폭시 관능기의 몰비 ([OH]/[에폭시])가 1/1 ∼ 1/20 범위인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 친수성 고분자는 중량평균분자량이 10,000 ∼ 1,000,000 g/mol인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 온도감응 고분자는 중량평균분자량이 500 ∼ 500,000 g/mol인 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  7. 제 1 항에 있어서,
    종양 제거부위에 도포되는 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  8. 제 7 항에 있어서,
    종양 제거부위에 도포되어 항암치료제로서 기능과 인공장벽을 형성하여 미세혈관을 통한 암의 전이를 방지하는 기능을 동시에 가지는 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  9. 제 1 항에 있어서,
    액제, 분말제 또는 필름제로 제형화된 것을 특징으로 하는 약물전달체.
  10. 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스 및 이들의 알칼리금속 또는 알칼리토금속의 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 친수성 고분자와, 부탄디올디글리시딜에테르, 헥산디올디글리시딜에테르, 에틸렌글리콜디글리시딜에테르, 프로필렌글리콜디글리시딜에테르, 폴리에틸렌글리콜디글리시딜에테르, 폴리프로필렌글리콜디글리시딜에테르, 폴리테트라메틸렌글리콜디글리시딜에테르, 네오펜틸글리콜디글리시딜에테르로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 가교제를 가교반응시켜, 에테르 가교결합을 가지는 가교고분자를 제조하는 제 1단계;
    탁센(Taxane) 항암제 약물과, 폴리(에틸렌옥사이드), 폴리(에틸렌옥사이드-프로필렌옥사이드) 랜덤 공중합체, 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드-폴리에틸렌옥사이드 트라이블록 공중합체로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 온도감응 고분자를 혼합하고 40 ∼ 60℃ 온도에서 교반하여, 항암제 약물을 전처리하는 제 2단계; 및
    상기 제 1단계에서 제조된 가교고분자와 제 2단계에서 전처리된 항암제 약물을 혼합하고 60 ∼ 110℃ 온도에서 하이드로겔화 반응시켜, 청구항 1의 약물전달체를 제조하는 제 3단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 약물전달체의 제조방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 제 1단계의 가교반응에서는 친수성 고분자의 하이드록시 관능기와 가교제의 에폭시 관능기의 몰비 ([OH]/[에폭시])가 1/1 ∼ 1/20 범위가 되도록 투입하는 것을 특징으로 하는 약물전달체의 제조방법.
  12. 제 10 항에 있어서,
    상기 제 1단계의 친수성 고분자는 중량평균분자량이 10,000 ∼ 1,000,000 g/mol인 것을 특징으로 하는 약물전달체의 제조방법.
  13. 제 10 항에 있어서,
    상기 제 1단계의 가교반응은 물과 아세톤 및 탄소수 1 내지 6의 알콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 분산보조제의 혼합용액 하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 약물전달체의 제조방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 제 1단계의 가교반응은 물 1 중량부와 분산보조제 10 ∼ 20 중량부의 혼합용액 하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 약물전달체의 제조방법.
  15. 제 10 항에 있어서,
    상기 제 1단계의 가교반응은 pH 9 ∼ 13 및 25 ∼ 60℃ 온도 조건에서 진행되는 것을 특징으로 하는 약물전달체의 제조방법.
  16. 제 10 항에 있어서,
    상기 제 2단계에서의 온도감응 고분자는 중량평균분자량이 500 ∼ 500,000 g/mol인 것을 특징으로 하는 약물전달체의 제조방법.
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