KR20020088053A

KR20020088053A - 영지버섯 포자로부터의 유성 물질 추출 방법

Info

Publication number: KR20020088053A
Application number: KR1020020012387A
Authority: KR
Inventors: 신 류; 시아오-니 후앙; 피터 치-킁 정
Original assignee: 신 류; 시아오-니 후앙; 피터 치-킁 정
Priority date: 2001-03-19
Filing date: 2002-03-08
Publication date: 2002-11-25
Also published as: EP1245235B1; DE60105967T2; JP2002275190A; EP1245235A3; ES2227048T3; DE60105967D1; EP1245235A2; ATE277627T1

Abstract

본 발명은 SCF-CO₂를 사용하여 포자외피가 파괴된 영지 포자로부터 유성 물질을 추출하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 기계적 수단에 의하여 영지 포자를 파괴하여 포자외피가 파괴된 포자를 수득하는 단계; 및 초임계 유체-이산화 탄소(SCF-CO₂) 추출법을 사용하여 포자외피가 파괴된 포자로부터 유성 물질을 추출하는 단계를 포함한다. 기계적 수단에 의하여 상기 포자를 파괴하기 이전에, 자양 용액에서 상기 포자를 배양시킴에 의하여 영지 포자의 발아를 유도하는 단계와, 발아가 유도된 포자를 벽이 통풍되는 능한 배양 상자에 위치시키고 일정 온도와 습도를 유지시켜, 포자외피가 파괴된 포자를 얻는 단계를 포함시킬 수도 있다. SCF-CO₂를 위하여, 바람직한 초임계 조건은 5M Pa 내지 60M Pa 의 압력; 32℃ 내지 85℃의 온도; 및 5kg/h 내지 80kg/h 의 유량율을 포함한다. SCF-CO₂에서의 총 추출 시간은 0.5시간 내지 6시간이다. 이러한 방법은 포자외피가 파괴된 영지 포자로부터 약 37 중량%의 유성 물질을 생산한다. 이들 유성 물질은 투명하고, 영지 포자의 특별한 향기를 함유한다. 이 유성 물질에는 침전물, 용매 잔류물 또는 산화의 흔적이 없다.

Description

영지버섯 포자로부터의 유성 물질 추출 방법{METHOD FOR EXTRACTING OLEAGINOUS SUBSTANCES FROM GANODERMA LUCIDUM SPORES}

본 발명은 초임계 유체 이산화탄소(SCF-CO₂)를 이용한 영지버섯 포자로부터 유성 물질을 추출하는 방법에 관한 것이다. 상기 포자는 SCF-CO₂추출 이전에 발아가 활성화되고(germination-activated) 포자외피가 파괴(epispore-broken)되어 있을 수 있다.

영지 버섯(Ganoderma lucidum Leyssex Fr.Karst)은 다공성의 버섯이다. 이는 담자균아문(Basidiomycotal), 폴리폴라세아(Polypolaceae)과, 영지(Ganoderma)속에 속한다. 중국 민속에서는 영지가 만병통치약으로 간주되고 있으며, 이는 많은 병을 치료하는 영지의 어떠한 효험에 기인된 것일 것이다. 영지의 알려진 의약적 또는 치료적 효과 중 일부는 만성 기관지염, 만성 바이러스성 간염, 관동맥심질환, 과립백혈구감소증, 만성 케산병(Keshan disease), 신경쇠약증, 진행성 근육 디스트로피(dystrophy), 위축성 근긴장증 및 특정의 신경계 질환의 환자를 치료하는것을 포함한다(예를 들면, Liu 외., Chinese Medical Journal, 92: 496-500 (1979) 참조). 또한 항-HIV로서(예를 들면, El-Mekkawy 외., Phytochemistry, 49: 1651-1657(1998); Min 외., Chem. Phar. Bull, 46: 1607-1612(1998) 참조)의 또는 항-종양성, 심장혈관, 항바이러스, 항균, 항구충 및 면역조절활성(예를 들면, Wasser 외., Critical Review in Immunology, 19:65-96(1999))용으로서의 영지가 보고되어 있다.

영지의 의약적 또는 치료적 효과와 연관되어 나타나는 영지에서의 두 개의 주요 화합물 형태가 있으며, 이는 다당류와 테르펜류이다. 다당류 화합물은 주로 수용성이다. 테르펜류는 유성 물질이며, 일반적으로 물에 녹지 않는다.

영지로부터 분리된 다당류 화합물은 헤테로 β-글루칸 및 그 단백질 복합체(자일로글루칸 및 산성 β-글루칸-함유 우론산, 식이 섬유, 렉틴)를 포함한다. 영지에서 발견된 다당류는 항 종양 및 면역 조절 효과를 포함하는 것으로 보고되어 있다(상기 Wasser 외. 저서 참조).

상기 영지 테르페노이드는 라노스탄(lanostane) 골격을 포함한다. 이들은 그들의 탄소 수와 산화수에 기초하여 여러 가지 그룹으로 분류된다(Komodo 외.,Chem. Pharm. Bull., 33:4829-4835(1985)). 상기 영지 테르페노이드는 라노스타닌-타입 트리테르페노이드(예를들면, 가노데린 산(ganoderic acids)A, B, C₁, C₂, D₁, D₂, E₁, E₂, F, G, H, I, J, K₁, K₂, L, Ma, Mb, Mc, Md, Me, Mf, Mg, Mi, Mj, Mk, Mn, N, O, P, Q, S, T, U, V, W, X, Y, 및 Z), 7-O-메틸-가노데린 산O, 트리데아세틸 가노데린 산 T, 가노데린 산 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, K, M, 가노데리올 타입 1(A, B, F) 및 타입 2(C, D, E, F, G, H, 및 I), 가노데랄(ganoderal) A 및 B, 에폭시가노데리올 A, B, C, 루시돈 A, B, C, 푸라노가노데린 산, 및 다른 테르페노이드 성분을 포함한다. 영지 테르페노이드(예., 가노데린 산 R, T, U-Z)는 시험관내 헤파토마 셀의 성장을 방해하는 것으로 보고되어 있다(Toth 외., Tetrahedron Lett., 24:1081-1084(1983)참조).

영지 포자는 (6~7)㎛ x (10~12)㎛ 크기의 작은 안개와 같은 갈색 타원형 포자로, 숙성한 영지의 페리우스(pelius)에서 배출된다. 이들 포자는 영지의 순수한 유전적 물질 및 생물학적 물질을 함유한다. 그러나, 야생의 영지 포자는 특히 그 짧은 방출 기간, 낮은 발아율, 및 불리한 환경 조건하에서의 낮은 생산률 때문에 수집하기가 어렵다. 따라서, 영지 포자가 영지의 자실체(fruiting bodies)보다 더 우수한 약제학적 가치를 가지고 있다는 것이 알려져 있음에도 불구하고, 영지 포자의 수집과 관련된 어려움으로 인하여, 영지에 대한 연구의 대부분이 영지의 자실체를 사용하여 수행되어 왔다. 영지의 치료학적 효과를 야기하는 영지 포자 내의 생물학적 물질은 영지 버섯의 이중막 포자외피 내에 저장되어 있다. 그러나, 이들 포자외피는 치밀한 구조를 가지며, 대단히 단단하고 탄성이 있다. 따라서, 영지 포자의 포자외피 층을 파괴하여 여는 것과 종래의 추출방법을 사용하여 그 내부의 생물학적 물질을 방출시키는 것은 매우 어렵다.

영지 포자의 포자외피를 분쇄하는 방법에 관한 보고가 되어 있다. 예를 들면, 일본 특허 JP52041208 에서는 기계적 힘을 사용하여 영지 포자를 파괴하는 방법을 개시하고 있다. 중국 특허 CN1134306 에서는 물에서 포자를 침지시킨 후, 마이크로파-가열에 의하여 영지 포자의 포자외피(sporoderm)를 파괴하는 방법을 개시하고 있다. 중국 특허 CN 1165032 에는 리소자임, 달팽이 효소, 셀룰라아제, 또는 헤미셀룰라아제와 같이 껍질을 용해시키는 효소로 상기 포자를 처리한 후, 20-50℃에서 세포벽의 초음파 파손을 행하여 영지 버섯 포자의 세포벽을 파괴하는 방법을 개시하고 있다.

그러나, 이러한 방법은 영지의 생활 주기의 각각 상이한 단계에서 수집된 포자의 혼합 배치를 사용한다. 생활 주기의 상이한 단계에 있는 포자는 각각 상이한 종류 및/또는 특성의 생물학적 물질을 만들어 낸다고 알려져 있으며, 기대되는 높은 수준의 치료학적 효과를 가질 수도 있고 그렇지 않을 수도 있다. 따라서, 이러한 방법에 의하여 포자외피가 파괴된 포자는 일관성이 없는 결과를 나타내며, 각각의 약용 효과가 다양하다.

또한 대부분 유기 용매를 사용하는 것을 포함하는, 영지로부터의 유성 물질(예를 들면, 테르페노이드)의 단리 및 분리에 관한 것도 보고되어 있다. 예를 들면, Min et al.,Chem. Pharm. Bull.,supra에는 메탄올 추출 CHCl₃-용해 분별 컬럼 크로마토그래피를 사용한 영지 포자에서의 라노스탄-타입 트리테르페노이드의 단리가 개시되어 있다. Lin et al.,J. Chromatography, 410: 195-200 (1987) 에서는 영지 버섯의 메탄올 추출의 고성능 액체 크로마토그래피를 사용하여 산소화 트리테르페노이드의 분리를 개시하고 있다. 이들 방법은 복합 추출방법으로 인하여 불충분하고 유성 물질의 수율이 낮다.

본 발명에서는, 영지 포자로부터 유성 물질을 추출하는 방법이 제공된다.

본 발명에서 사용된 영지 포자는 발아가 활성화되어 생물학적 물질이 최대한 생산되는 것이 확실하다. 발아가 활성화된 영지 포자의 포자외피는 기계적 수단에 의하여 파괴되어 생물학적 물질을 방출한다. 상기 생물학적 물질의 유성 물질은 초임계 유체 이산화탄소(SCF-CO₂) 추출방법에 의하여 물질의 잔여물로부터 분리된다.

본 발명은 SCF-CO₂를 사용하여 영지 포자로부터 유성 물질을 분리 및 단리하기 위한 추출 방법을 제공한다.

발명의 요약

본 발명은 초임계 유체 이산화탄소(SCF-CO₂) 추출법을 이용하여 포자외피가 파괴된 영지 포자로부터 유성 물질을 추출하는 방법을 제공한다. 영지 포자는 추출되기 전에 포자외피가 파괴되고 발아가 활성화될 수 있다.

발아가 활성화된 영지 포자를 얻기 위하여, 영지 포자를 우선 발아를 유도하기에 알맞은 자양 용액에 침지시킨다. 발아 목적을 위한 자양 용액은 영지 자실체의 침수 용액, 바이오틴 용액, 물, 및 영지 균사체의 침수 용액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 영지 자실체의 침수 용액은 0.5 내지 25 중량%인 것이 바람직하며; 바이오틴 용액은 0.1 내지 0.5 중량%인 것이 바람직하다. 자양 용액의 부피와 영지 포자의 중량의 비는 약 0.01 내지 5 배이다. 바람직한 침지 시간은 10분 내지 10시간이다. 바람직한 침지 온도는 16℃ 내지 43℃ 이다.

발아가 유도된 영지 포자는 통풍이 되는 배양 상자내에 침지된 영지 포자를 위치시킴으로써 활성화된다. 바람직한 상대 습도는 60% 내지 98%이다. 바람직한 온도는 16℃ 내지 43℃이다. 바람직한 활성화 주기는 10분 내지 24시간이다.

영지 포자의 포자외피의 파괴는 포자에 기계적 수단을 가함으로써 이루어질 수 있다. 바람직한 기계적 수단은 미분화(micronization), 초고속 기류(ultra-high-speed airstream), 가위-절단/분쇄(scissor-cut/grinding), 및 초고압 미세기류(ultra-high pressure microstream) 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 선택적으로 포자에 기계적 수단을 적용하기 전에, 발아가 활성화된 영지 포자를 키티나아제 및/또는 셀룰라아제와 같은 효소로 배양하여 포자의 세포벽을 부드럽게 할 수도 있다.

발아가 활성화되고 포자외피가 파괴된 영지 포자로부터의 유성 물질 추출은 초임계 유체 이산화탄소 추출법(SCF-CO₂)에 의하여 수행된다. 상기 방법은 (1) 압력 용기 내에 상기 포자를 위치시키는 단계; (2) 상기 압력 용기 내의 포자를 SCF-CO₂와 접촉시키는 단계; (3) 압력 용기를 감압시켜 영지 포자로부터 유성 물질을 수집하는 단계를 포함한다. 상기 압력 용기 내의 압력은 5M Psia(Pa) 내지 60M Pa 인 것이 바람직하다. 상기 압력 용기 내의 온도는 32℃ 내지 85℃로 유지되는 것이 바람직하다. 압력 용기의 바람직한 유량 속도(flow capacity rate)는 5 kg/h 내지 80 kg/h 이다. 바람직한 추출 시간은 30분 내지 6시간이다.

선택적으로, 포자외피가 파괴된 영지 포자를 압력 용기 내에 위치시키기 이전에, 85% 내지 100% 에탄올과 같은 담체와 혼합할 수 있다. 포자외피에 대한 담체의 바람직한 비율은 2중량% 내지 200중량%이다. 유성 물질은 원심분리에 의하여 상기 담체로부터 분리되는 것이 바람직하다.

SCF-CO₂추출법은 영지 포자로부터, 영지 포자의 총 중량의 약 37%의 유성 물질을 생산한다. 유성 물질은 투명하며 영지 포자의 특별한 향기를 갖는다. 유성 물질 내의 산화, 용매 잔여물 또는 침전물의 흔적이 없다.

포자외피가 파괴된 영지 포자로부터 추출된 유성 물질은, 항 종양성, 항 HIV 또는 HBV, 및 항 면역질환을 포함하는(이에 한정되는 것은 아님) 의학적 효과를 갖는다. 이들은 종량, HIV 또는 HBV 감염 및 면역 질환을 갖는 환자를 치료하는 데에 사용될 수 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 SCF-CO₂를 사용하여 영지 포자로부터 유성 물질을 분리 및 단리하기 위한 추출 방법을 제공한다. 이 방법에 의하여 생산된 유성 물질의 양은 포자 총 중량의 약 37%를 구성한다. 더구나, 이 방법에 의하여 생산된 유성 물질은 그 자연적인 상태(즉, 용매 잔여물 및 이상한 냄새가 없음)로 잘 보존되어 있다. 이상한 냄새는 유성 물질이 산화되었다는 것을 나타낸다.

종래에, 혼합물에서 물질을 분리 또는 추출하는 방법은 증류 및 용매 추출을 포함한다. 증류는 각 물질의 끓는점에 따라 혼합물에서 물질을 분리한다. 용매 추출은 각 물질의 친수성 및 친지방성에 따라 혼합물에서 물질을 분리한다. 증류는 물질이 분리되어야 할 물질이 열적으로 안정하지 않을 경우 사용할 수 없다. 용매 추출은 분리되어야 할 물질이 용해도가 유사하여 효과적인 분리를 할 수 없을 때 사용이 제한된다.

초임계 유체(SCFs) 기술은 종래의 추출 방법에 대한 실행가능한 대안이다. SCFs는 종종 치밀한 기체로서 언급된다. 기술적으로, SCF는 임계압력 및 임계 온도 이상에서 존재하는 기체이다. 기체가 임계 온도 이상에서 압축되는 경우 밀도는 극도로 증가된다. 따라서, 주어진 일단의 조건 하에서, SCF는 기체의 확산율을 유지하면서 액체의 밀도를 가지게 될 것이다.

각 기체는 임계 압력 (Pc) 및 임계 온도(Tc)를 가지며, 각각 상기 임계값 이상일 때 초임계 유체 상태에 도달한다. 그러한 SCFs의 용매적 성질은 차례로 온도 및 압력의 복소 함수(complex function)인 유체 밀도의 복소 함수가 된다. 그러한 SCFs의 용매 특성은 유체 밀도의 복소함수에서 발견할 수 있고, 이는 차례로 온도 및 압력의 복소 함수이다. 따라서, 초임계 유체의 온도 및 압력을 변화시킴으로써, 추출 및 침전이 수행될 수 있다.

이산화탄소는 용매 특성이 좋고 낮은 화학적 반응성 및 독성을 가지기 때문에 SCF 추출에 사용하기에 특히 이로운 기체로 판명되었다. 더구나, 이산화탄소는 비 가연성이며, 값이 저렴하고, 또한 쉽게 재활용될 수 있고, 또한 침전물에 원하지 않는 잔여물이 남지 않는다. 이산화탄소는 임계 압력(Pc)이 73.8 bar 이며, 임계 온도(Tc)는 31.1℃이고, 또한 Pc 및 Tc에서의 밀도는 0.468 g/cc 이다.

SCF-CO₂의 사용에 의하여, 초임계 조건하에서 이산화 탄소가 침투가능한 물리적 상태로 전환될 수 있거나 또는 그 내부에 존재하는 혼합물 내의 어떠한 물질이, 이산화탄소내에 용해될 것이며 또한 상기 혼합물로부터 분리될 것이다. SCF-CO₂추출법 이면의 원리는 초임계 유체에서의 기체를 사용한 추출에 요구되는 고압하에서, 많은 유기 화합물의 용해도는 증대된다는 것이다. 이것은, 종래의 용매보다 초임계 유체의 더 큰 확산도와 결합되어 추출될 물질을 통한 질량이동을 더 빠르게 하고, 따라서 추출 속도를 더 빠르게 하는 결과를 낳는다. 초임계 유동 기체들은 유기 혼합물, 유기/수성 혼합물, 유기/무기 매트릭스 및 지방성/수성 매트릭스로부터 유기 종을 선택적으로 용해시키고 추출하는 능력을 가지고 있다. 이론적으로, 더 높은 압력은 추출효율을 더 크게 한다. 본질적으로, 영지 포자에서의 유성 물질(물에의 용해도는 낮음)의 대부분 또는 전부는 이산화탄소에서 용해되어야 한다. 영지 버섯의 작은 포자는 매우 단단하며 탄력이 있고 이중막의 포자외피를 가지고 있다. 야생에서, 영지 버섯의 포자의 발아는 상대적으로 느리고 그들의 발아율은 매우 낮다. 포자의 발아관이 알맞은 조건에서 싹을 트기 시작하는 데에는 24시간 내지 48시간이 소요되며, 모세관(capillitia)은 72시간 후에 가지를 형성하며, 발아율은 3 내지 15% 밖에 되지 않는다.

영지 버섯의 작은 포자가 SCF-CO₂하에서 추출될 때는, 약 3.5%의 유성 물질만이 회수된다.

영지 버섯으로부터의 유성 물질의 생산을 최대화하기 위하여, 영지 포자외피의 세포 벽을 포자외피를 파괴하여 여는 과정 및 발아를 활성화하는 방법이 설계되었다. 상기 방법은 영지 포자외피의 세포 벽을 파괴하여 열기 위한 포자외피 파괴 과정에 이어 수행된다. 마지막으로, 발아가 활성화되고, 포자외피가 파괴된 영지 포자는 상기 포자로부터 유성 물질을 분리하기 위하여 SCF-CO₂하에서 추출된다.

휴면의 영지 포자의 발아가 활성화될 때, 포자의 생물학적 물질의 생산율은 최대에 이른다는 것이 주목된다. 이들 생물학적 물질은, 특히 활성 유전자 및 프로모터, 활성 효소, 스테롤(sterols), 시토킨(cytokines), 인터페론, 락토 A, 가노데린 산 A, 트리테르페노이드, 다당류, 비타민, 수퍼옥사이드 디스뮤타아제(superoxide dismutases; SOD), 당단백질(glycoproteins) 등을 포함한다. 이들 생물학적 물질은 특히, 신경계 및 면역계를 자극 및 조절하는데에 뛰어난 의학적 효과를 보여준다. 이들 생물학적 물질은 또한 간암 및 HBV 감염에 치료학적 효과를 나타낸다. 또한, 발아 활성화되는 기간동안, 포자외피의 탄성은 현저히 감소하고, 교대로 포자외피의 세포 벽의 침투율이 증가된다는 것이 주목된다.

발아 활성화에 관한 동물 및 임상적 연구의 결과는, 발아가 활성화된 영지 포자로부터 생산된 생물학적 물질이 간암 조직에서의 텔로머라아제(telomerase)의 활동을 억제함으로써 간암에 대한 억제 효과를 나타낸다는 것을 보여주었다. 이러한 생물학적 물질은 또한 HBV 감염에 치료적 효과를 나타낸다. 부가적으로, 발아가 활성화된 영지 포자를 동물에게 공급한 경우, 포자외피가 파괴되지 않은 항종양율은 23.2%이었으며, 항종양율이 86.1%인 포자외피가 파괴된 포자보다 실절적으로 낮았다.

본 발명의 추출방법을 하기에 기술하였다.

1. 영지 포자의 수집.성숙하고 속이 찬 영지 포자를 통나무에서 배양된 영지버섯으로부터 적절한 방출 시간에 수집하였다. 통나무에서 영지를 배양하는 것은 포자가 더 신선하고 영양이 많으며, 포자외피의 파괴율/ 침투율이 더 높기 때문에 유리하다.

2. 영지 포자의 발아 유도.영지 포자를 수집한 후, 상기 포자를 하기 4 단계에서와 같이 직접 기계적 수단에 의하여 파괴한 후, 더 추출할 수도 있다. 또는 선택적으로, 상기 포자를 기계적 힘에 의하여 파괴하기 이전에 2단계 및 3단계에서와 같이 발아 및 활성을 유도할 수 있다. 선택된 포자는 자양 용액에 침지시키며, 상기 자양 용액은 증류수, 식염수, 영지의 자실체 또는 영지 균사가 담겨진 용액일 수 있다. 자양용액에 상기 포자를 침지시키는 목적은 상기 포자의 발아를 가능하게 하고 가속하는 것이다. 자양 용액의 예에는 0.5~25중량%의 영지 자실체 또는 균사의 침수 용액, 0.1~0.5중량%의 바이오틴 용액 등이 포함된다. 자양 용액은 영지 포자 중량의 약 0.01~5배 정도 였다. 침지 시간은 약 10분 내지 8시간이었다. 온도는 약 16~43℃ 이었다.

3. 발아된 영지 포자의 활성.발아된 영지 포자를 활성화시키기 위하여, 침지된 포자를 자양 용액으로부터 제거하고 여분의 용액은 떨어지도록 하였다.

침지된 포자를 이후 벽이 통풍가능한 배양 상자에 위치시켜 일정한 온도 및 습도가 유지되도록 하였다. 배영 상자 내의 상대 습도는 약 60~98%로 유지되었다. 배양 상자의 온도는 약 16~48℃로 유지되었다. 포자를 활성화시키는 시칸은 약 10분 내지 24 시간이었다.

4. 포자외피의 침투/파괴.영지 포자의 발아가 활성화 된 후, 상기 포자는 기계적 수단에 의하여 파괴된다. 포자를 파괴하는 데에 사용되는 기계적 수단의 예에는 미분화(micronization), 롤-프레스(roll-pressing), 또는 가위-절단/분쇄(scissor-cut/grinding), 미세흐름-충격 분쇄(microstream-impact crushing), 초고속 기류 충격 분쇄(ultra-high-speed airstream impact crushing), 초고압 미세흐름 분쇄(ultra-high pressure microstream crushing), 초저온 분쇄(ultra-low temperature crushing) 등이 포함된다.

포자외피를 파괴하기 전에, 선택적으로 포자외피의 벽을 부드럽게 하기 위하여 셀룰라아제 및 키티나아제와 같은 효소로 포자를 처리할 수도 있다. 효소로 처리된 포자는 약 3,000~30,000 rpm에서의 원심분리 또는 약 10,000 분자량 차단 필터를 사용한 한외 여과기를 사용하여 반응 혼합물로부터 분리될 수 있다.

5. SCF-CO ₂ 를 사용한 유성 물질의 추출.포자외피가 파괴된 포자로부터의 유성 물질의 추출은, CO₂소스, 압축기, 열 교환기, 압력 조절기, 및 압력 용기가 포함된 SCF-CO₂추출 장치에서 수행되었다. 선택적으로, 종래의 추출기(즉, 압력 용기) 및 분리기를 포함하는 초임계 유체 추출 장치 중 어떤 것이라도 또한 추출에 적합할 것이다. 작동을 위하여, 포자외피가 파괴된 포자를 압력 용기에 위치시켰다. 초임계 온도 및 압력 보다 더 커지도록 하기 위하여 이산화탄소를 압축기 및 열 교환지를 통하여 흐르도록 하고, 이후 압력 용기 내의 포자를 통하여 흘려주었다. 이후 SCF를 압력 용기로부터 제거하고 이산화탄소를 증발시키기 시켜 감압하였다. 본 방법에서 사용된 초임계 압력은 약 5~60 M Pa 이었다. 본 방법에서의의 초임계 온도는 32~85℃이었다. CO₂의 유량(flow volume rate)은 약 5~80 kg/h 이었다. 추출시간은 약 0.5~6 시간이었다.

선택적으로 SCF-CO₂추출을 시작하는 사이에 포자에 담체를 부가할 수도 있다. 상기 담체의 예는 물 또는 85~100% 에탄올을 포함한다. 상기 포자에 대한 상기 담체의 비는 약 2~200%(v/w)이었다. 상기 담체가 포자에 부가된 경우, 약 3,000~30,000rpm 에서의 원심분리에 의하여 상기 포자의 잔여물로부터 유성 물질이 분리될 수 있다.

하기 실시예는 단지 본 발명을 부가적으로 예시하기 위한 것으로, 본 발명의범위가 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다. 합리적인 숙련된 기술자에게 일어날 수 있는 것과 같은 적당한 변형은 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않고 이루어질 수 있다.

실시예 1

하기 나타낸 방법에 따라, 영지 포자로부터 유성 물질을 추출하였다.

1. 100kg의 숙성되고 속이 찬 영지 포자를 신중하게 선택하였다.

2. 5%의 영지 자실체 침수 용액 2kg과 식염수(0.15M NaCl) 150kg을 포함한 자양 용액을 상기 포자에 부가하였다. 상기 포자를 자양 용액에 6시간 동안 32℃에서 침지시켰다.

3. 침지된 영지 포자를 자양 용액에서 제거하여 벽이 통풍 가능한 배양 상자에 위치시킨 후 일정온도 34℃와 상대 습도 90%를 유지시켰다. 상기 포자를 3시간동안 배양 상자에 보관하였다. 상기 조건하에서, 포자의 발아율은 95%이었고, 발아가 활성화된 포자의 세포 벽은 부드러워졌다는 명백한 표시를 나타내었다.

4. 발아가 활성화된 영지 포자를 미분화하였다. 포자를 현미경으로 검사하였다. 이러한 처리 이후 포자외피의 침투/ 파괴율은 99.6%에 달하였다.

5. 포자외피가 파괴된 영지 포자를 SCF-CO₂의 추출 장치의 압력 용기에 위치시켰다. 초임계 압력은 45 M Pa 로, 초임계 온도는 53℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 60kg/h 를 유지시켰다. 총 추출 시간은 1.5 시간이었다.

결과:

이 방법으로 유성 물질을 약 37kg (포자 중량의 약 37%를 구성함) 생산하였다. 유성 물질은 투명하였고, 유성 물질이 산화되지 않았다는 표시인 영지 포자의 특별한 향기를 함유하였다. 유성 물질 내에 침전물 또는 용매의 잔여물의 흔적은 없었다.

실시예 2

하기 나타낸 방법에 따라, 영지 포자로부터 유성 물질을 추출하였다:

2. 1%의 바이오틴 용액 20kg과 증류수 250kg을 포함한 자양 용액을 상기 포자에 부가하였다. 상기 포자를 자양 용액에 3시간 동안 43℃에서 침지시켰다.

3. 침지된 영지 포자를 자양 용액에서 제거하여 벽이 통풍 가능한 배양 상자에 위치시킨 후 온도 18℃와 상대 습도 60%를 유지시켰다. 상기 포자를 24시간동안 배양 상자에 보관하였다. 상기 조건하에서, 포자의 발아율은 95%이었고, 발아가 활성화된 포자의 세포 벽은 부드러워졌다는 명백한 표시를 나타내었다.

4. 키티나아제 5g, 셀룰로오즈 10g, 및 증류수 150kg (pH 6.8)을 포함하는 효소 혼합물을 포자에 부가하여 반응시켰다. 반응은 43℃의 온도에서 1.5시간동안 수행되었다. 반응의 결과, 포자외피가 탄성을 잃었다.

5. 상기 포자를 분쇄하여 미분화하였다. 포자를 현미경으로 검사하였다. 이러한 처리 이후 포자외피의 침투/ 파괴율은 99.6%에 달하였다. 3,000rpm에서 원심분리하여 효소 혼합물로부터 포자외피가 파괴된 포자를 분리하였다.

6. 상기 포자를 SCF-CO₂용 추출 장치의 압력 용기 내에 위치시켰다. 90% 에탄올 10kg을 상기 포자에 담체로서 부가하였다. 초임계 압력은 40M Pa 로, 초임계 온도는 32℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 15kg/h 를 유지시켰다. 총 추출 시간은 5 시간이었다.

7. SCF-CO₂추출 이후, 6,000 rpm에서의 원심분리에 의하여 담체로부터 유성 물질을 분리하였다.

결과:

이 방법으로 유성 물질을 약 36.9kg (포자 중량의 약 36.9%를 구성함) 생산하였다. 유성 물질은 투명하였고, 유성 물질이 산화되지 않았다는 표시인 영지 포자의 특별한 향기를 함유하였다. 유성 물질 내에 침전물 또는 용매의 잔여물의 흔적은 없었다.

실시예 3

2. 증류수 200kg을 포함한 자양 용액을 상기 포자에 부가하였다. 상기 포자를 자양 용액에 8시간 동안 16℃에서 침지시켰다.

3. 침지된 포자를 자양 용액에서 제거하여 벽이 통풍 가능한 배양 상자에 위치시킨 후 온도 48℃와 상대 습도 98%를 10분간 유지시켰다. 상기 조건하에서, 포자의 발아율은 95%이었고, 발아가 활성화된 포자의 세포 벽은 부드러워졌다는 명백한 표시를 나타내었다.

4. 키티나아제 10g, 셀룰로오즈 20g, 및 증류수 200kg (pH 6.8)을 포함하는 효소 혼합물을 포자에 부가하여 반응시켰다. 반응은 38℃의 온도에서 3.0 시간동안 수행되었다. 반응의 결과, 포자외피가 탄성을 잃었다.

5. 상기 포자의 포자외피를 분쇄와 함께 롤링/프레싱에 의하여 파괴하였다. 상기 포자를 현미경으로 검사하였다. 한회 여과에 의하여 효소 혼합물로부터 포자외피가 파괴된 포자를 분리하였다.

6. 상기 포자를 SCF-CO₂용 추출 장치의 압력 용기 내에 위치시켰다. 초임계 압력은 60M Pa 로, 초임계 온도는 48℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 5kg/h 를 유지시켰다. 총 추출 시간은 4.5 시간이었다.

결과:

실시예 4

2. 0.5%의 영지 자실체의 침수 용액 10kg과 0.1%의 바이오틴 용액 10kg, 및 증류수 200kg을 포함한 자양 용액을 상기 포자에 부가하였다. 상기 포자를 이 용액에 30분 동안 25℃에서 침지시켰다.

3. 침지된 포자를 자양 용액에서 제거하여 벽이 통풍 가능한 배양 상자에 위치시킨 후 24시간 동안 온도 16℃와 상대 습도 80%를 유지시켰다. 상기 조건하에서, 포자의 발아율은 95%이었고, 발아가 활성화된 포자의 세포벽은 부드러워졌다는 명백한 표시를 나타내었다.

4. 상기 포자의 포자외피를 파괴하기 위하여 초고속 기류를 사용하였다. 파괴된 포자를 현미경으로 검사하였다. 약 99.6%의 포자가 이러한 조건 하에서 파괴되었다.

5. 상기 포자를 SCF-CO₂용 추출 장치의 압력 용기 내에 위치시켰다. 100% 에탄올 50kg을 담체로서 부가하였다. 초임계 압력은 10M Pa 로, 초임계 온도는 85℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 80kg/h를 유지시켰다. 총 추출 시간은 6 시간이었다.

6. SCF-CO₂추출 이후, 20,000rpm에서의 원심분리에 의하여 담체로부터 유성 물질을 분리하였다.

결과:

실시예 5

2. 5%의 영지 균사 침수 용액 50kg 및 0.1% 바이오틴 용액 5kg을 포함한 자양 용액을 상기 포자에 부가하였다. 상기 포자를 이 용액에 5시간 동안 38℃에서 침지시켰다.

3. 침지된 포자를 자양 용액에서 제거하여 벽이 통풍 가능한 배양 상자에 위치시킨 후 1.5시간 동안 온도 30℃와 상대 습도 70%를 유지시켰다. 상기 조건하에서, 포자의 발아율은 95%이었고, 발아가 활성화된 포자의 세포 벽은 부드러워졌다는 명백한 표시를 나타내었다.

4. 키티나아제 20g, 및 증류수 180kg (pH 6.4)을 포함하는 효소 혼합물을 포자에 부가하여 반응시켰다. 반응은 38℃의 온도에서 4.0시간동안 수행되었다. 반응의 결과, 포자외피가 탄성을 잃었다.

5. 상기 포자를 가위-절단/분쇄에 의하여 파괴하였다. 파괴된 포자를 현미경으로 검사하였다. 약 99.6%의 포자가 이러한 조건 하에서 파괴되었다. 15,000rpm에서 원심분리하여 효소 혼합물로부터 포자외피가 파괴된 포자를 분리하였다.

6. 상기 포자를 SCF-CO₂용 추출 장치의 압력 용기 내에 위치시켰다. 증류수 50kg을 담체로서 부가하였다. 초임계 압력은 55M Pa로 초임계 온도는 55℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 42kg/h를 유지시켰다. 총 추출 시간은 2 시간이었다.

7. SCF-CO₂추출 이후, 20,000rpm에서의 원심분리에 의하여 담체로부터 유성 물질을 분리하였다.

결과:

실시예 6

2. 20%의 영지 자실체 침수 용액 5kg 및 증류수 150kg을 포함한 자양 용액을 상기 포자에 부가하였다. 상기 포자를 이 용액에 2시간 동안 28℃에서 침지시켰다.

3. 침지된 포자를 자양 용액에서 제거하여 벽이 통풍 가능한 배양 상자에 위치시킨 후 3시간 동안 온도 40℃와 상대 습도 65%를 유지시켰다. 상기 조건하에서, 포자의 발아율은 95%이었고, 발아가 활성화된 포자의 세포 벽은 부드러워졌다는 명백한 표시를 나타내었다.

4. 상기 포자의 포자외피를 미분화에 의하여 파괴하였다. 파괴된 포자를 현미경으로 검사하였다. 약 99.7%의 포자가 이러한 조건 하에서 파괴되었다.

5. 상기 포자를 SCF-CO₂용 추출 장치의 압력 용기 내에 위치시켰다. 95% 에탄올 200kg을 담체로서 부가하였다. 초임계 압력은 55M Pa로 초임계 온도는 68℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 70kg/h를 유지시켰다. 총 추출 시간은 2 시간이었다.

결과:

이 방법으로 유성 물질을 약 37kg (포자 중량의 약 37%를 구성함) 생산하였다. 유성 물질은 투명하였고, 유성 물질이 산화되지 않았다는 표시인 영지 포자의 특별한 향기를 함유하였다. 유성 물질 내에 침전물 또는 용매의 잔여물의 흔적은없었다.

실시예 7

2. 25%의 영지 균사 침수 용액 20kg 및 증류수 150kg을 포함한 자양 용액을 상기 포자에 부가하였다. 상기 포자를 이 용액에 6시간 동안 22℃에서 침지시켰다.

3. 침지된 포자를 자양 용액에서 제거하여 벽이 통풍 가능한 배양 상자에 위치시킨 후 4시간 동안 온도 26℃와 상대 습도 75%를 유지시켰다. 상기 조건하에서, 포자의 발아율은 95%이었고, 발아가 활성화된 포자의 세포 벽은 부드러워졌다는 명백한 표시를 나타내었다.

4. 셀룰로오즈 20g, 및 증류수 250kg (pH 5.6)을 포함하는 효소 혼합물을 포자에 부가하여 반응시켰다. 반응은 45℃의 온도에서 2시간동안 수행되었다. 반응의 결과, 포자외피가 탄성을 잃었다.

5. 상기 포자를 롤링/프레스에 의하여 파괴하였다. 파괴된 포자를 현미경으로 검사하였다. 약 99.7%의 포자가 이러한 조건 하에서 파괴되었다. 15,000rpm에서 원심분리하여 효소 혼합물로부터 포자외피가 파괴된 포자를 분리하였다.

6. 상기 포자를 SCF-CO₂용 추출 장치의 압력 용기 내에 위치시켰다. 초임계압력은 55M Pa 로, 초임계 온도는 70℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 60kg/h를 유지시켰다. 총 추출 시간은 0.5 시간이었다.

결과:

실시예 8

2. 1%의 바이오틴 용액 20kg과 증류수 150kg을 포함한 자양 용액을 상기 포자에 부가하였다. 상기 포자를 자양 용액에 2시간 동안 40℃에서 침지시켰다.

3. 침지된 포자를 자양 용액에서 제거하여 벽이 통풍 가능한 배양 상자에 위치시킨 후 온도 18℃와 상대 습도 88%를 12시간동안 유지시켰다. 상기 조건하에서, 포자의 발아율은 95%이었고, 발아가 활성화된 포자의 세포 벽은 부드러워졌다는 명백한 표시를 나타내었다.

4. 상기 포자를 가위 절단/분쇄에 의하여 파괴하였다. 포자를 현미경으로검사하였다. 이러한 조건하에서 약 99.9%의 포자가 파괴되었다. 에 달하였다.

5. 상기 포자를 SCF-CO₂용 추출 장치의 압력 용기 내에 위치시켰다. 95% 에탄올 70kg을 담체로서 부가하였다. 초임계 압력은 10M Pa 로, 초임계 온도는 38℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 18kg/h 를 유지시켰다. 총 추출 시간은 4 시간이었다.

6. SCF-CO₂추출 이후, 15,000rpm에서의 원심분리에 의하여 담체로부터 유성 물질을 분리하였다.

결과:

실시예 9

2. 증류수 250kg을 포함한 자양 용액을 상기 포자에 부가하였다. 상기 포자를 자양 용액에 10시간 동안 34℃에서 침지시켰다.

3. 침지된 포자를 자양 용액에서 제거하여 벽이 통풍 가능한 배양 상자에 위치시킨 후 2시간동안 온도 31℃와 상대 습도 80%를 유지시켰다. 상기 조건하에서, 포자의 발아율은 95%이었고, 발아가 활성화된 포자의 세포 벽은 부드러워졌다는 명백한 표시를 나타내었다.

4. 키티나아제 10g, 증류수 250kg (pH 6.8)을 포함하는 효소 혼합물을 부가하여 포자와 반응시켰다. 반응은 44℃의 온도에서 2시간동안 수행되었다. 반응의 결과, 포자외피가 탄성을 잃었다.

5. 상기 포자를 미분화/프레스에 의하여 파괴하였다. 포자를 현미경으로 검사하였다. 이러한 조건하에서 약 99.9%의 포자가 파괴되었다. 30,000rpm에서 원심분리하여 효소 혼합물로부터 포자외피가 파괴된 포자를 분리하였다.

6. 이후 상기 포자를 SCF-CO₂용 추출 장치의 압력 용기 내에 위치시켰다. 증류수 2kg을 담체로서 부가하였다. 초임계 압력은 14M Pa 로, 초임계 온도는 45℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 12kg/h를 유지시켰다. 총 추출 시간은 2시간이었다.

7. SCF-CO₂추출 이후, 30,000rpm에서의 원심분리에 의하여 담체로부터 유성 물질을 분리하였다.

결과:

이 방법으로 약 36.8kg (포자 중량의 약 36.9%를 구성함)의 유성 물질을 생산하였다. 유성 물질은 투명하였고, 유성 물질이 산화되지 않았다는 표시인 영지 포자의 특별한 향기를 함유하였다. 유성 물질 내에 침전물 또는 용매의 잔여물의 흔적은 없었다.

실시예 10

2. 식염수 200kg을 포함한 자양 용액을 상기 포자에 부가하였다. 상기 포자를 이 용액에 6시간 동안 22℃에서 침지시켰다.

3. 침지된 포자를 자양 용액에서 제거하여 벽이 통풍 가능한 배양 상자에 위치시킨 후 5시간동안 온도 34℃와 상대 습도 75%를 유지시켰다. 상기 조건하에서, 포자의 발아율은 95%이었고, 발아가 활성화된 포자의 세포 벽은 부드러워졌다는 명백한 표시를 나타내었다.

4. 상기 포자의 포자외피를 초고압 미세기류에 의하여 파괴하였다. 파괴된 포자를 현미경으로 검사하였다. 약 99.9%의 포자가 이러한 조건하에서 파괴되었다.

5. 이후 상기 포자를 SCF-CO₂용 추출 장치의 압력 용기 내에 위치시켰다. 85% 에탄올 65kg을 담체로서 부가하였다. 초임계 압력은 14M Pa 로, 초임계 온도는 40℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 25kg/h를 유지시켰다. 총 추출 시간은 1시간이었다.

6. SCF-CO₂추출 이후, 8,000rpm에서의 원심분리에 의하여 담체로부터 유성 물질을 분리하였다.

결과:

이 방법으로 약 37kg (포자 중량의 약 37%를 구성함)의 유성 물질을 생산하였다. 유성 물질은 투명하였고, 유성 물질이 산화되지 않았다는 표시인 영지 포자의 특별한 향기를 함유하였다. 유성 물질 내에 침전물 또는 용매의 잔여물의 흔적은 없었다.

실시예 11

2. 상기 영지 포자를 미분화하였다. 상기 포자를 현미경으로 검사하였다. 이러한 처리 후 포자외피의 침튜/파괴율은 약 99.6%에 달하였다.

3. 포자외피가 파괴된 영지 포자를 SCF-CO₂용 추출 장치의 압력 용기 내에 위치시켰다. 초임계 압력은 35M Pa 로, 초임계 온도는 50℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 25kg/h를 유지시켰다. 총 추출 시간은 3.0시간이었다.

결과:

실시예 12

2. 키티나아제 10g, 셀룰로오즈 20g 및 증류수(pH 6.2) 200kg을 포함한 효소 혼합물을 부가하여 포자와 반응시켰다. 반응은 45℃에서 1시간동안 수행되었다. 반응의 결과, 포자외피는 탄성을 잃었다.

3. 상기 포자를 분쇄에 의하여 미분화시켰다. 포자를 현미경으로 검사하였다. 이러한 처리 후 포자외피의 침투/파괴율은 99.9%에 달하였다. 포자외피가 파괴된 포자를 3,000rpm에서의 원심분리에 의하여 효소 혼합물로부터 분리하였다.

4. 이후 상기 포자를 SCF-CO₂용 추출 장치의 압력 용기 내에 위치시켰다. 90% 에탄올 10kg을 담체로서 포자에 부가하였다. 초임계 압력은 30M Pa 로, 초임계 온도는 41℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 5kg/h를 유지시켰다. 총 추출 시간은 5시간이었다.

5. SCF-CO₂추출 이후, 3,000rpm에서의 원심분리에 의하여 담체로부터 유성 물질을 분리하였다.

결과:

이 방법으로 약 37.1kg (포자 중량의 약 37.1%를 구성함)의 유성 물질을 생산하였다. 유성 물질은 투명하였고, 유성 물질이 산화되지 않았다는 표시인 영지 포자의 특별한 향기를 함유하였다. 유성 물질 내에 침전물 또는 용매의 잔여물의 흔적은 없었다.

실시예 13

2. 키티나아제 20g, 셀룰로오즈 10g 및 증류수(pH 6.5) 250kg을 포함한 효소 혼합물을 가하여 포자와 반응시켰다. 반응은 48℃에서 2시간동안 수행되었다. 반응의 결과, 포자외피는 탄성을 잃었다.

3. 상기 포자의 포자외피를 분쇄와 함께 롤링/프레스에 의하여 파괴하였다. 포자를 현미경으로 검사하였다. 포자외피가 파괴된 포자를 한외여과에 의하여 효소 혼합물로부터 분리하였다.

4. 이후 상기 포자를 SCF-CO₂용 추출 장치의 압력 용기 내에 위치시켰다.초임계 압력은 40M Pa 로, 초임계 온도는 32℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 10kg/h를 유지시켰다. 총 추출 시간은 4시간이었다.

결과:

이 방법으로 약 37.3kg (포자 중량의 약 37.3%를 구성함)의 유성 물질을 생산하였다. 유성 물질은 투명하였고, 유성 물질이 산화되지 않았다는 표시인 영지 포자의 특별한 향기를 함유하였다. 유성 물질 내에 침전물 또는 용매의 잔여물의 흔적은 없었다.

실시예 14

2. 상기 포자의 포자외피를 파괴하기 위하여 초고속 기류를 사용하였다. 파괴된 포자를 현미경으로 검사하였다. 이러한 조건 하에서 약 99.6%의 포자가 파괴되었다.

3. 이후 상기 포자를 SCF-CO₂용 추출 장치의 압력 용기 내에 위치시켰다. 100% 에탄올 20kg을 담체로 부가하였다. 초임계 압력은 10M Pa 로, 초임계 온도는 35℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 12kg/h를 유지시켰다. 총 추출 시간은 6시간이었다.

4. SCF-CO₂추출 이후, 5,000rpm에서의 원심분리에 의하여 담체로부터 유성 물질을 분리하였다.

결과:

이 방법으로 약 37.2kg (포자 중량의 약 37.2%를 구성함)의 유성 물질을 생산하였다. 유성 물질은 투명하였고, 유성 물질이 산화되지 않았다는 표시인 영지 포자의 특별한 향기를 함유하였다. 유성 물질 내에 침전물 또는 용매의 잔여물의 흔적은 없었다.

실시예 15

2. 키티나아제 30g 및 증류수 (pH 6.2) 250kg를 포함하는 효소 혼합물을 부가하여 포자와 반응시켰다. 상기 반응은 45℃에서 2.5시간동안 수행되었다. 반응 결과, 상기 포자외피는 그 탄성을 잃었다.

3. 상기 포자는 가위 절단/ 분쇄에 의하여 파괴되었다. 파괴된 포자를 현미경으로 검사하였다. 이러한 조건 하에서 약 99.9%의 포자가 파괴되었다. 상기 포자외피가 파괴된 포자를 15,000rpm에서의 원심분리에 의하여 효소 혼합물로부터 분리하였다.

4. 이후 상기 포자를 SCF-CO₂용 추출 장치의 압력 용기 내에 위치시켰다. 증류수 50kg을 담체로 부가하였다. 초임계 압력은 50M Pa 로, 초임계 온도는 60℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 40kg/h를 유지시켰다. 총 추출 시간은 2.5시간이었다.

5. SCF-CO₂추출 이후, 10,000rpm에서의 원심분리에 의하여 담체로부터 유성 물질을 분리하였다.

결과:

이 방법으로 약 37.6kg (포자 중량의 약 37.6%를 구성함)의 유성 물질을 생산하였다. 유성 물질은 투명하였고, 유성 물질이 산화되지 않았다는 표시인 영지 포자의 특별한 향기를 함유하였다. 유성 물질 내에 침전물 또는 용매의 잔여물의 흔적은 없었다.

실시예 16

2. 상기 포자의 포자외피를 미분화에 의하여 파괴하였다. 파괴된 포자를 현미경으로 검사하였다. 이러한 조건 하에서 약 99.7%의 포자가 파괴되었다.

3. 이후 상기 포자를 SCF-CO₂용 추출 장치의 압력 용기 내에 위치시켰다.95% 에탄올 100kg을 담체로 부가하였다. 초임계 압력은 55M Pa 로, 초임계 온도는 68℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 70kg/h를 유지시켰다. 총 추출 시간은 2시간이었다.

4. SCF-CO₂추출 이후, 20,000rpm에서의 원심분리에 의하여 담체로부터 유성 물질을 분리하였다.

결과:

이 방법으로 약 37.5kg (포자 중량의 약 37.5%를 구성함)의 유성 물질을 생산하였다. 유성 물질은 투명하였고, 유성 물질이 산화되지 않았다는 표시인 영지 포자의 특별한 향기를 함유하였다. 유성 물질 내에 침전물 또는 용매의 잔여물의 흔적은 없었다.

실시예 17

2. 셀룰로오즈 30g 및 증류수 (pH 5.8) 200kg를 포함하는 효소 혼합물을 부가하여 포자와 반응시켰다. 상기 반응은 40℃에서 1.5시간동안 수행되었다. 반응 결과, 포자외피는 그 탄성을 잃었다.

3. 상기 포자는 롤링/프레스에 의하여 파괴되었다. 파괴된 포자를 현미경으로 검사하였다. 이러한 조건 하에서 약 99.8%의 포자가 파괴되었다. 상기 포자외피가 파괴된 포자를 20,000rpm에서의 원심분리에 의하여 효소 혼합물로부터 분리하였다.

6. 이후 상기 포자를 SCF-CO₂용 추출 장치의 압력 용기 내에 위치시켰다. 초임계 압력은 60M Pa 로, 초임계 온도는 75℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 80kg/h를 유지시켰다. 총 추출 시간은 0.5시간이었다.

결과:

이 방법으로 약 37.4kg (포자 중량의 약 37.4%를 구성함)의 유성 물질을 생산하였다. 유성 물질은 투명하였고, 유성 물질이 산화되지 않았다는 표시인 영지 포자의 특별한 향기를 함유하였다. 유성 물질 내에 침전물 또는 용매의 잔여물의 흔적은 없었다.

실시예 18

2. 상기 포자의 포자외피를 가위-절단/분쇄에 의하여 파괴되었다. 파괴된 포자를 현미경으로 검사하였다. 이러한 조건 하에서 약 99.9%의 포자가 파괴되었다.

3. 이후 상기 포자를 SCF-CO₂용 추출 장치의 압력 용기 내에 위치시켰다. 90% 에탄올 100kg을 담체로서 부가하였다. 초임계 압력은 15M Pa 로, 초임계 온도는 48℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 25kg/h를 유지시켰다. 총 추출 시간은 2시간이었다.

4. SCF-CO₂추출 이후, 25,000rpm에서의 원심분리에 의하여 담체로부터 유성 물질을 분리하였다.

결과:

실시예 19

2. 키티나아제 10g, 셀룰라아제 10kg 및 증류수 (pH 7.3) 220kg를 포함하는 효소 혼합물을 부가하여 포자와 반응시켰다. 상기 반응은 45℃에서 1.5시간동안 수행되었다. 반응 결과, 상기 포자외피는 그 탄성을 잃었다.

3. 상기 포자는 미분화/프레스에 의하여 파괴되었다. 파괴된 포자를 현미경으로 검사하였다. 이러한 조건 하에서 약 99.9%의 포자가 파괴되었다. 상기 포자외피가 파괴된 포자를 한외여과에 의하여 효소 혼합물로부터 분리하였다.

4. 이후 상기 포자를 SCF-CO₂용 추출 장치의 압력 용기 내에 위치시켰다. 증류수 10kg을 담체로 부가하였다. 초임계 압력은 5M Pa 로, 초임계 온도는 85℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 35kg/h를 유지시켰다. 총 추출 시간은 1.5시간이었다.

5. SCF-CO₂추출 이후, 30,000rpm에서의 원심분리에 의하여 담체로부터 유성 물질을 분리하였다.

결과:

실시예 20

2. 상기 포자의 포자외피는 초고압 미세기류에 의하여 파괴되었다. 파괴된 포자를 현미경으로 검사하였다. 이러한 조건 하에서 약 99.9%의 포자가 파괴되었다.

5. 이후 상기 포자를 SCF-CO₂용 추출 장치의 압력 용기 내에 위치시켰다. 80% 에탄올 200kg을 담체로 부가하였다. 초임계 압력은 14M Pa 로, 초임계 온도는 40℃로 유지시켰다. CO₂의 유속은 12kg/h를 유지시켰다. 총 추출 시간은 0.5시간이었다.

6. SCF-CO₂추출 이후, 6,000rpm에서의 원심분리에 의하여 담체로부터 유성 물질을 분리하였다.

결과:

본 발명이 실시예 및 바람직한 태양의 형태로 기술되었으나, 본 발명이 기술된 실시 태양으로 제한되는 것으로 이해되는 것은 아니다. 오히려, 당업계의 숙련된 기술자에게 명확한 바와 같이 다양한 변형을 포함하는 것을 의도한 것이다. 따라서, 본 발명의 청구범위는 그러한 변형을 모두 포함할 수 있도록 넓은 해석이 허용되어야 할 것이다.

본 발명은 영지로부터 유성 물질을 고 수율(즉, 유성 물질의 수율은 영지로부터 방출된 총 생물학적 물질의 약 37중량%임)로 생산할 수 있는 이점을 가지고 있다.

본 발명의 방법에 기초하여 분리된 유성 물질은 산화되지 않았음을 나타내는 영지의 특이한 향기를 나타내며, 용매 잔여물의 흔적, 이상한 냄새 및 침전물이 없다.

Claims

포자외피가 파괴된 포자를 수득하기 위하여 기계적 수단에 의하여 영지 포자를 파괴하는 단계;

초임계 유체-이산화탄소(SCF-CO₂)추출법을 사용하여 상기 포자외피가 파괴된 포자로부터 유성 물질을 추출하는 단계

를 포함하는 영지버섯 포자로부터 유성 물질을 추출하는 방법.
제1 항에 있어서,

상기 영지 포자를 상기 기계적 수단에 의하여 파괴하는 단계 이전에,

상기 영지 포자를 발아의 유도에 알맞은 자양 용액에 침지시킴으로써 발아를 활성화시키는 단계; 및

상기 발아가 유도된 영지 포자를 상기 영지 포자의 세포벽이 부드러워질 때까지 통풍가능한 배양 상자에 위치시키는 단계를 포함하는

방법.
제2 항에 있어서,

상기 자양 용액은 영지 자실체의 침지 용액, 바이오틴 용액, 물, 및 영지 균사의 침지 용액으로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나인

방법.
제2 항에 있어서,

상기 영지 포자를 상기 자양 용액에 침지시키는 시간은 10분 내지 10시간인

방법
제2 항에 있어서,

상기 영지 포자를 상기 자양 용액에 침지시키는 온도는 16℃ 내지 43℃인

방법.
제2 항에 있어서,

상기 통풍 가능한 배양 상자의 상대 습도는 60% 내지 98%인

방법.
제2 항에 있어서,

상기 통풍가능한 배양 상자의 온도는 16℃ 내지 48℃인

방법.
제2 항에 있어서,

상기 침지된 영지 포자를 상기 통풍가능한 배양 상자에 위치시키는 시간은 10분 내지 24시간인

방법.
제1 항에 있어서,

상기 기계적 수단은 미분화, 초고속 기류, 가위 절단/분쇄, 및 초고압 미세기류로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나인

방법.
제1 항에 있어서,

상기 기계적 수단을 적용하는 단계 이전에

적어도 하나의 효소로 상기 영지 포자를 처리하는 단계를 부가적으로 포함하는

방법.
제10 항에 있어서,

상기 효소는 키티나아제 및 셀룰라아제로 이루어진 그룹에서 선택된 적어도 하나인

방법.
제1 항에 있어서,

상기 SCF-CO₂추출법은,

상기 포자외피가 파괴된 영지 포자를 압력 용기에 위치시키는 단계;

SCF-CO₂와 상기 압력 용기내의 영지 포자를 접촉시키는 단계; 및

상기 압력 용기를 감압시켜 상기 포자외피가 파괴된 영지 포자로부터 유성 물질을 수집하는 단계를 포함하는

방법.
제12 항에 있어서,

상기 압력 용기는 5M Psia(Pa) 내지 60M Pa의 압력이 유지되는

방법.
제12 항에 있어서,

상기 압력 용기는 32℃ 내지 85℃의 온도가 유지되는

방법.
제12 항에 있어서,

상기 압력 용기는 5kg/h 내지 80kg/h의 유량이 유지되는

방법.
제12 항에 있어서,

상기 추출시간은 30분 내지 6시간인

방법.
제12 항에 있어서,

상기 포자외피가 파괴된 영지 포자를 상기 압력 용기 내에 위치시키기 전에 담체와 혼합하는

방법.
제17 항에 있어서,

상기 담체는 85% 내지 100% 에탄올(vol/vol) 또는 물인

방법.
제17 항에 있어서,

상기 담체와 상기 영지 포자의 중량비는 2% 내지 200%인

방법.
제17 항에 있어서,

원심분리에 의하여 상기 담체로부터 상기 유성 물질을 분리하는 단계를 더 포함하는

방법.
제1 항의 방법에 의하여 정제 및 분리된 영지 포자로부터의 유성 물질.
제1 항에 따른 영지 포자로부터의 유성 물질을 포함하는 항종양제.
제1 항에 따른 영지 포자로부터의 유성 물질을 포함하는 항-HIV 제.
제1 항에 따른 영지 포자로부터의 유성 물질을 포함하는 항-HBV 제.
제1 항에 따른 영지 포자로부터의 유성 물질을 포함하는 면역 조절제.
제1 항에 따른 영지 포자로부터의 유성 물질의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 종양 환자를 치료하는 방법.
제1 항에 따른 영지 포자로부터의 유성 물질의 유효량을 투여하는 것을 HIV 감염 환자를 치료하는 방법.
제1 항에 따른 영지 포자로부터의 유성 물질의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 HBV 감염 환자를 치료하는 방법.
제1 항에 따른 영지 포자로부터의 유성 물질의 유효량을 투여하는 것을 포함하는 면역학적 질환이 있는 환자를 치료하는 방법.