본 발명 다량의 monacolin K가 함유된 비지 홍국을 이용한 닭사료의 제조방법의 구성과 작용을 공정별로 나누어 상세히 설명하면,
① 비지선택 및 탈수 공정
비지는 콩을 8시간 수침한 후 원료콩의 8배 량의 물을 가하여 파쇄기로 분쇄하여 두유를 추출하고 남은 생비지를 원료로 사용하였다.
깔대기를 통하여 분리되어 나온 비지는 수분함량이 약 100∼120% 이상으로이를 이용하여 홍국을 제조하면 발효가 일어나지 ??으며, 부패되기 쉽다. 또, 공기의 유통이 어려워 부패된다. 그러므로 얻어진 비지를 원심분리기 등을 사용하여 탈수시키거나 50∼60℃에서 4-8시간동안 건조시켜 수분함량이 60-80%가 되게 조정한다. 수분함량에 따른 부패율을 조사하기 위해 2L의 삼각프라스크 20개씩을 발효시키는 동안 부패되거나 타종의 미생물이 번식되는 율(%)을 부패율로 하였다.
⊙ 비지의 수분함량과 비지홍국 제조중의 부패율과의 관계 (종균 접종량은 20%로 함)
비지의 평균 수분량(%) |
부패율 (%) |
98 (생비지 ) |
45.4±3.4 |
90 (탈수처리) |
35.5±2.8 |
80 (탈수처리) |
0.02±0.0 |
60 (탈수처리) |
0.02±0.0 |
※결과 : 두부제조시에 발생하는 생비지는 수분함량이 98%로 수분함량과다로 발효중에 부패하였으며 비지의 수분함량이 60-80%범위까지 탈수시킴으로서 부패율이 크게 낮아졌다. 그러므로 두부공장에서 발생하는 비지를 이용하여 비지 홍국을 제조할 경우 반드시 탈수하는 공정이 필요함이 증명되었다.
② 살균공정
비지 홍국은 발효기간이 7-10일 정도 걸리므로 일반 제국장치를 사용하여 발효시키는 방법은 오염율이 높아서 적합하지 않다. 본 발명에서는 2L의 삼각프라스크에 1/4∼1/3양이 되게 비지를 넣고 면전을 한 후 autoclave를 사용하여 121℃에서 20분간 살균하였다.
③ 종균접종공정
본 발명에서 사용한 홍국균은Monascus pilosus KCCM60084를 사용하였으며, Mizutani 액체배지(glucose 5.0, peptone 2.0, KH2PO40.8, MgSO4ㆍ7H2O 0.05, CH3COOK 0.2, NaCl 0.1)를 사용하여 30℃에서 5일간 배양한 것을 종균으로 사용하였다. 이 종균을 살균한 비지에 5-15% 되게 접종하여 골고루 혼합하였다. 종균 접종량에 따른 monacolin K의 함량 변화를 알기 위하여 시료 일정량을 정확히 취하여 50% ethanol 20 mL와 0.5 M KOH용액 10 mL을 첨가한 후 30분간 환류, 냉각 후 50% ethanol로 정확히 50 mL로 정용, 이 용액 5 mL를 취하여 다시 50 mL로 정용하여 시료용액으로 하였다. 표준용액의 조제는 monacolin K (lactone 형, 丸善製藥) 5 mg을 정확히 취하여 50% ethanol로 녹인 후 50 mL로 정용, 이 용액 5 mL에 0.5 M KOH용액 2 mL과 50% ethanol을 가하여 50 mL로 정용, 표준용액으로 하였다. 시료용액과 표준용액응 각각 0.45㎛ membranefilter로 여과한 후 10㎕를 취하여 HPLC에 주입하여 분석하였다. 그 분석조건은 아래 표와 같다.
-모나콜린 K분석을 위한 HPLC의 조건-
항 목 |
조 건 |
Column |
YMCJ sphere ODS-H80 (4.6 I.D.×150mm) |
Mobile Phase |
Acetnitrle /0.1% phosphoric acid apueous solution (45 : 55) |
Detector |
UV 237 nm |
Flow Rate |
1.0 mL/min |
Column temperature |
42℃ |
⊙ 비지 홍국의 종균 접종량에 따른 monacolin K의 함량
종균의 접종량 (%) |
부패율 (%) |
Monacolin K 함량(mg/100g dry weight) |
5 |
37.64 |
40.22 ± 3.40 |
10 |
18.50 |
170.50 ± 21.23 |
15 |
5.35 |
230.06 ± 22.65 |
20 |
0.30 |
270.21 ± 23.05 |
※결과 : 탈수와 살균공정을 거친 생 비지에 종균을 각각 5, 10, 15% 접종하여 발효시킨 결과 15, 20%에서 monacolin K의 함량이 최대로 나타났으며 15%와 20%에서는 거의 비슷한 함량을 나타내었다. 종균의 접종량이 5-10%로 낮을 경우는 부패율이 높았다.
④ 발효공정
종균이 접종된 비지를 25∼30℃에서 7∼10일간 발효시켰다. 발효공정 시작시에 monosodium glutamate (MSG)을 0.5% 첨가할 경우 발효후 monacolin K의 함량이 증가하였다.
⊙ 생비지에 monosodium glutamate (MSG) 첨가에 따른 monacolin K의 함량 변화
MSG 첨가량 (%) |
Monacolin K 함량 (mg/100g dry weight) |
무첨가 |
270.21 ± 23.05 |
0.5% 첨가 |
310.45 ± 16.22 |
※결과 : 생비지에 MSG (monosodium glutamate)를 0.5% 첨가함으로서 monacolin K의 생성량을 15%정도 높일 수 있었다.
⑤ 건조공정
발효가 끝난 비지 홍국은 건조기를 사용하여 80℃에서 4~6시간 동안 충분히 건조하였다. 이상과 같이 건조 완성된 비지 홍국 내에 포함되어 있는 monacolin K의 함량을 문헌의 쌀 및 액체 홍국의 monacolin K의 함량과 비교하면 다음과 같다.
⊙ 본 발명 비지홍국과 문헌의 쌀 및 액체홍국의 monacolin K의 함량 비교
홍국의 종류 |
함량단위 |
Monacolin K 함량 |
비지 홍국 |
mg/100g-dry weight |
310.45±16.22 |
쌀 홍국1) |
mg/100g-dry weight |
110.00 |
1)일본 환선제약 시험 성적표 2000년 2월 9일 자료
※결과 : 생비지를 이용하여 제조된 본 발명 비지홍국의 monacolin K의 함량은 문헌에서 보고된 쌀홍국에 비하면 2.8배의 높았다.
⑥ 혼합공정
발효 후 건조된 비지 홍국을 시판 육계용 일반사료에 아래의 표와 같이 5∼20% 범위로 혼합하였다.
⊙ 실험에 사용한 일반 닭 사료의 조성과 닭 사료 혼합용 건조 비지 홍국의 첨가비율
조 성 |
홍국비지 혼합비율 (%) |
0 |
5 |
10 |
15 |
20 |
옥수수 |
35.0 |
30.0 |
25.0 |
20.0 |
15.0 |
밀 |
24.0 |
24.0 |
24.0 |
24.0 |
24.0 |
밀기울 |
14.0 |
14.0 |
14.0 |
14.0 |
14.0 |
쌀겨 |
14.0 |
14.0 |
14.0 |
14.0 |
14.0 |
어분 |
7.0 |
7.0 |
7.0 |
7.0 |
7.0 |
번데기찌끼 |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
1.5 |
소금 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
0.5 |
조개껍질 크로이칼 |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
2.5 |
탄산석회 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
1.0 |
비타민복합체1) |
0.3 |
0.3 |
0.3 |
0.3 |
0.3 |
항생제 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
0.2 |
건조비지홍국 |
0 |
5 |
10 |
15 |
20 |
계 |
100.0 |
100.0 |
100.0 |
100.0 |
100.0 |
1)비타민 A, D, E, K, B2, B12, niacin, folic acid의 혼합물
상기와 같은 방법으로 생산된 본 발명 다량의 monacolin K가 함유된 비지 홍국을 이용한 닭사료의 제조방법으로 생산된 닭 사료를 먹인 닭과 그 닭이 낳은 계란을 통해 HMG-CoA reductase 활성도 및 비지홍국을 섭취한 닭고기와 계란의 총 콜레스테롤 함량 (mg/가식부100g)을 비교하면 다음과 같다. 실험에 사용한 닭은 산란계(Gallus varius)을 사용하였으며 부화 후 60일이 경과된 암병아리를 구입하여 캐이지당 10마리씩 구분하여 비지홍국 무첨가군, 5% 첨가군, 10%첨가군, 15%첨가군, 20% 첨가군으로 나누어 60일간 사육하였다. 사육조건은 온도 15∼22℃의 자연광 조건의 실외 사육실에서 자유섭취시켰다. 또한, 모든 실험은 3회 반복으로 행하여 평균치와 편차를 나타내었다.
HMG-CoA 환원효소의 활성도 측정은 Shapiro 및 Hulcher와 Oleson의 방법을 기본으로 행하였다. 즉, 50 nM14C-HMG- CoA (specific activity: 2.1083 GBq/mM)를함유하는 500 nM NADPH 및 50 nM 용액 30㎕에 김치 추출액 20㎕를 가한 후 30℃의 water bath에서 10분간 예열하고 효소원으로 microsome용액 10 ㎕를 vortex 상에서 혼합하여 37℃에서 15분간 반응시켰다. 반응액은 4℃, 10,000×g로 10분간 원심분리하여 상징액을 얻었으며 이를 흡착제 silica gel (60 F254), 전개용매 benzene : acetone (1 : 1, v/v), 표준품 mevalonate를 사용한 TLC system으로 분리하여 Phospho Image Analyzer (MacBas 1000, Fuji)로 분석한 다음 mevalonate band를 절취하여 scintillation counter (Packard Tricarb 1600 TR, Packard, Austrailia)로 방사선 활성을 계측하였다. 활성 units는 시간당 microsomal protein 1 mg이 생성하는 mevalonate의 p Mole로 하였다. Protein 정량은 Bradfold 방법 (1976)에 준하여 측정하였으며 bovine serum albumin을 표준용액으로 하였다.
효소원 microsome의 조제는 토끼의 간조직 2 g을 0.02 nM EDTA 및 2 nM dithiothreitol을 함유하는 0.1 M triethanolamine완충용액 (pH 7.4) 8 mL로 균질화시킨 후 2회에 걸쳐 10,000×g 로 4℃에서 15분 동안 원심분리하여 상징액을 얻었다. 이 액을 100,000×g에서 1시간 동안 원심분리하여 얻은 pellet을 상기 완충용액 1 mL에 현탁시켜 효소원으로 사용하였다. 김치시료는 동결건조한 후 메탄올로 추출, 감압건조시켜 용매를 제거시킨 후 동일한 완충용액으로 현탁시켜 시료액으로 하였다. 저해 활성도는 대조구 활성에 대한 %로 나타내었다.
⊙ HMG-CoA reductase 활성도
비지홍국 혼합비 |
HMG-CoA reductase 저해활성도(%) |
비지홍국 0% + 일반사료 100% |
0.00 ±0.05 |
비지홍국 5% + 일반사료 95% |
55.40±2.15 |
비지홍국 10% + 일반사료 90% |
64.23±4.18 |
비지홍국 15% + 일반사료 85% |
66,45±3.04 |
비지홍국 20% + 일반사료 80% |
70.06±5.00 |
※결과 : 상기의 "실험재료 및 방법"에서와 같이 제조한 건조한 비지 홍국을시판되고 있는 (주) 대한의 알마니점프 닭사료에 0, 5, 10, 15, 20% 되게 각각 혼합, 조제한 사료로 50일간 사육한 닭의 혈액을 체취하여 콜레스테롤 합성의 율속효소인 HMG-CoA reductase활성을 측정한 결과 5%첨가한 경우는 50.40%가 저해되었으며, 10%첨가한 경우는 64.23%, 15% 첨가한 경우는 66.45%, 20%첨가한 경우는 70.06%를 각각 저해되었다. 이러한 결과는 비지홍국을 첨가한 사료가 체내의 콜레스테롤 합성을 저해시키는 기능성이 있음을 알수 있다.
콜레스테롤함량 측정에 있어서는, Soxhlet법으로 추출한 지질을 검화시키고 불검화물을 분리한 후 일정량을 취하여 내부표준물질과 함께 GC로 측정하였다. 즉, 추출한 지질시료 1g을 클로로포름으로 정용하고, 이 용액 0.5∼1 mL과 내부 표준용액 0.5 mL를 가한 다음 클로로포름을 휘산시켰다. 여기에 1N-KOH 에탄올 용액 5 mL을 가하여 냉각관을 붙여 1시간동안 검화시켰다. 다음에 50 mL의 분액깔때기로 옮겨 에틸에테르 10 mL로 추출하였다. 추출액은 물로 세척하고 무수 황산나트륨으로 탈수, 건고시켜 GC용 시료로 하였다. GC의 분석조건은 아래표와 같다.
-콜레스테롤 분석을 위한 GC의 조건 -
항 목
|
조 건
|
Column |
Glass (3.0 mm×2 m) |
Temperature |
280℃ |
Detector |
FID |
Injector temperature |
300℃ |
Detector temperature |
260℃ |
Carrier gas |
N2(2 mL/min) |
Injection volume |
1 μL |
⊙ 본 발명 비지홍국을 섭취한 닭고기와 계란의 총 콜레스테롤 함량 (mg/가식부100g)
비지홍국 혼합비 |
닭 껍질 |
흉근 |
다리 |
계란 |
비지홍국 0%+일반사료 100% |
112.52±4.25 |
65.71±2.35 |
85.71±3.54 |
517.28±11.25 |
비지홍국 5%+일반사료 95% |
104.64±4.25 |
62.11±1.65 |
80.71±2.84 |
480.83±10.26 |
비지홍국 10%+일반사료 90% |
94.51±3.27 |
58.20±3.57 |
71.00±2.65 |
435.57±12.54 |
비지홍국 15%+일반사료 85% |
83.26±3.68 |
48.62±2.01 |
63.42±2.57 |
387.35±15.26 |
비지홍국 20%+일반사료 80% |
55.01±1.69 |
42.54±1.34 |
48.00±1.53 |
300.26±8.65 |
※결과 : 비지 홍국이 20% 혼합된 사료를 닭에게 50일간 자유 섭취시킨 후 얻은 닭고기의 부위별 콜레스테롤 함량을 측정하였다. 그 결과 닭 껍질에 있어서는 비지홍국을 5% 첨가하였을 때 무첨가에 비해 총콜레스테롤함량이 7.05%가 감소되었으며, 10% 첨가한 경우는 16.01%, 15% 첨가한 경우는 26.00%, 20%첨가한 경우는 51.11%가 감소되었다. 흉근에서는 비지홍국을 5% 첨가한 경우는 무첨가구에 비해 5.4%가 감소되었으며, 10%첨가한 경우는 11.42%, 15% 첨가한 경우는 26.00%, 20%첨가한 경우는 35.26% 감소되었다. 다리부위에서는 5% 첨가한 경우 무첨가구에 비해 5.83% 감소되었으며, 10%첨가한 경우는 17.16%, 15% 첨가한 경우는 26.00%, 20%첨가한 경우는 44.00% 감소되었다. 계란에서는 5% 첨가한 경우는 무첨가구에 비해 7.04% 감소되었으며, 10%첨가한 경우는 15.80%, 15% 첨가한 경우는 25.11%, 20%첨가한 경우는 41.95% 감소되었다. 이상의 결과 비지홍국사료는 닭고기와 계란의 콜레스테롤 함량을 크게 줄여주는 효과가 있음을 나타내며, 이 사료로 저 콜레스테롤 제품을 생산할 수 있음이 확인되었다.