KR20000075758A - 세포 집단으로부터 종양 세포를 제거하기위한 시스템 - Google Patents

세포 집단으로부터 종양 세포를 제거하기위한 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 비종양 세포집단으로부터 종양세포를 특이적으로 분리하여 이를 제거하는 방법 및 장치를 제공한다. 보다 구체적으로는 본 발명은 종양세포를 특이적으로 표지한 다음, 고에너지 레이저 빔으로 종양세포에 특이적으로 작용하여 죽이는 방법 및 장치에 관한 것으로 본 발명에 의하면 조혈 간세포 이식의 필요성을 갖는 환자를 암세포의 재도입으로 인한 재발의 위험이 없이 효과적으로 치료할 수 있다.

Description

세포 집단으로부터 종양 세포를 제거하기위한 시스템{Targeted System for Removing Tumor Cells from Cell Populations}
조혈 간 세포 이식술은 그 사용이 전세계적으로 급속히 증가하고 있는 치료법이다. 조혈 간 세포는 골수에 존재하여 신체의 모든 혈액 세포의 생성을 유도하는 세포이다. 1995년에, 미합중국에서는 2만건이상의 조혈 간 세포 이식이 행해졌다. 특히, 자기 조혈 간 세포 이식술에 의해 유방암을 치료하는 것은 세계적으로 사용되고있는 암치료 요법이 되고있다.
종양 전이는 종양 세포가 그 초기 위치를 떠나서 신체의 다른 부분으로 퍼지는 잘 알려져있는 과정이다. 새로운 부위로 옮겨지는 경우, 종양 세포는 성장하기 시작하고 그 새로운 부위에 정착하여, 새로운 종양을 형성한다. 전이 종양이 있는 환자를 치료하기 위한 한 가지 방법은 환자로부터 조혈 간 세포를 수득하고, 고투여량의 방사선 치료요법 또는 화학요법을 이용하여 환자를 치료하는 것을 포함한다. 이러한 치료법은 환자의 모든 종양 세포를 파괴하도록 되어 있지만, 환자의 조혈 세포도 파괴하는 부작용이 있다. 따라서, 환자가 치료되면, 자기 조혈 간세포가 환자의 신체에 되돌려진다.
그러나, 종양 세포가 1차 종양 부위로부터 전이한 경우, 일부의 종양 세포가 상기 수득된 조혈 간 세포 집단을 오염시킬 가능성이 높다. 이러한 경우에 있어서, 상기 수득된 조혈 간 세포는 오염 종양 세포를 함유한다. 환자에게 상기 간세포를 재도입하기 전에 상기 전이된 모든 종양 세포를 죽이기 위한 매커니즘을 찾는 것이 중요하다. 어떤 살아있는 종양형성 세포들이 환자에게 재도입되는 경우, 종양 재발이 초래될 수 있다.
조혈 간 세포로부터 종양 세포를 제거하는데 있어서의 문제가 통상적인 골수 수득 과정동안에 보고되었다. 참조문헌[Campana, D.외, Detection of minimal residual disease in acute leukemia: methodologic advances and clinical significance, Blood, 1995년 3월 15일, 85(6):1416-34)]. 가동화된 주변 세포 혈액의 백혈구를 감소(leukopheresis)하는 더 새로운 방법을 이용하여 암 세포를 제거하고자 하는 경우에도 유사한 문제가 발견되었다. 참조문헌[Brugger, W.외, Mobilization of tumor cells and hematopoietic progenitor cells into peripheral blood of patients with solid tumors, Blood, 83(3): 636-40, 1994)].
각의 이러한 방법에 있어서, 오염 종양 세포의 수는, 가동화에 사용된 화학요법제 처방에 따라, 4백만개의 단핵 수득 세포당 약 10 내지 5000개 였다. 단핵 세포들은 전체 조혈 세포 수득물의 불연속적 밀도 기울기 원심분리에 의해 얻어졌다. 환자로부터 수득한 단핵 세포의 총수는 일반적으로 100억개 정도이다. 따라서, 환자에게 재도입 종양 세포의 총수는 약 2만 5천개 내지 약 1천 2백만개의 사이에서 변화한다.
이러한 오염 종양 세포들은 종양 재발의 원인이 되는 것으로 유전적 표지 결과 확인되었다. 참조문헌[Rill, ER.외, Direct Demonstration That Autologous Bone Marrow Transplantation for Solid Tumors Can Return a Multiplicity of Tumorigenic Cells, Blood, 84(2): 380-383, 1994]. 따라서, 조혈 세포 이식조직으로부터 모든 종양 세포를 효과적으로 제거할 수 있는 방법에 대한 절실한 필요성이 존재한다. 참조문헌[Gulati, SC 외, Rationale for purging in autologous stem cell transplantation, Journal of Hematotherapy, 2(4):467-71, 1993]. 모든 오염 종양 세포를 제거하기 위한 신속하고 신뢰할 수 있는 방법이 증가하는 수의 환자에 있어서 조혈 간 세포 이식술의 효능을 향상시킬 수 있다.
조혈 간 세포 수득물로부터 오염 종양 세포를 제거하기 위한 시도가 있었지만, 그 성공은 제한적이었다. 수득된 간세포로부터 종양 세포 집단을 제거하는 몇 가지의 방법들이 제안 및 테스트되었다. 참조문헌[편집 발행인 A.Gee, Bone Marrow Processing and Purging, Part 5, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1991]. 따라서, 이러한 제거 방법들의 기초가 되는 사상은 이식 환자내에서 조혈 재구성하여야하는 조혈 간 세포는 보존하면서 악성 세포는 분리 또는 파괴하는 것이다.
어떤 회사 및 의사들은 면역친화성 비이드(immunoaffinity bead)에 근거한 선별(selection)을 이용하여 비종양 세포 집단으로부터 악성 세포들을 제거하고자 하였다. 이러한 방법에 있어서, 전체 세포 집단이 면역친화성 비이드와 접촉한다. 예를들어, 조혈 세포로부터 종양 세포를 분리하기 위하여, 제 1(포지티브)CD34 선별에 의하여 종양 세포로부터 조혈 세포를 분리한다. 조혈 세포-특이 항-CD34 항체를 상기 면역친화성 항체에 결합하면, 의사는 비조혈 세포 집단으로부터 상기 종양 세포를 특이적으로 제거할 수 있다. 어떤 경우에는, 상기 비이드에 종양 특이 항체를 접합(conjugation)하여, 종양 또는 상피 세포 표지(marker)상에서 네거티브 면역친화성 비이드에 근거한 선별을 실시하기도 한다.
비종양 세포 집단으로부터 종양 세포를 제거하기 위하여 시도되어온 또다른 방법은 종양 세포에 대하여만 특이성을 갖는 항체에 독성제를 면역접합하는 것을 포함한다. 이러한 방법에 있어서, 항체가 화학독성제, 독소, 또는 방사선 핵종에 결합된 다음, 수득된 세포 집단과 접촉한다. 불운하게도, 이러한 처리 방법에 의해서는 종양 세포들이 전혀 죽지 않았다.
비종양 세포 집단으로부터 종양 세포를 분리하기 위한 또다른 방법은 조혈 세포의 비특이적 결합 특성을 분리의 기초로서 이용했다. 예를들어, Dooley 외 다수는 심층 여과에 의해 조혈 세포를 분리하기 위하여 상기 접착 특성을 이용했다. 참조문헌[Dooley 외, A novel inexpensive technique for the removal of breast cancer cells from mobilized peripheral blood stem cell products, Blood, 88(10)suppl 1: 252a, 1916]. 그러나, 일부의 종양 세포들이 조혈 세포와 함께 분리됨으로써, 환자가 종양 재발 가능성을 가질 수 있다.
또한, 조혈 간 세포를 손상시키지 않고 종양 세포를 선택적으로 죽이기 위하여 4-히드록시-퍼옥시-시클로-포스파미드(4HC)와 같은 세포독성제가 사용되어왔다. 불운하게도, 상기 세포독성제가 일부의 비독성 세포를 약화시키거나 또는 파괴하기 때문에 이러한 방법도 조혈 세포 수득량을 저하시킨다.
다른 방법에 있어서, 메로시아닌과 같은 감착제가 세포 집단과 혼합된 다음, 종양 세포들을 선택적으로 죽이기 위하여 상기 혼합물에 방사선이 조사되었다. 참조문헌[Lydaki외, Merocyanine 540 mediated photoirradiation of leukemic cells, Journal of Photochemistry and Photobiology 32(1-2): 27-32, 1996]. 또한, Gazitt외 다수는 종양 세포로부터 조혈 간 세포를 분리하기 위해 형광 활성화 세포 선별(FACS)을 이용했다. 참조문헌[Gazitt외, Purified CD34+ Lin-Thy+stem cells do not contain clonal myeloma cells, Blood, 86(1):381-389, 1995]. 알려진 바와같이, 흘림 세포계측은 세포들을 한꺼번에 선별하고 표지된 세포들중 한 세트를 또다른 제 2 세트로부터 물리적으로 분리한다. 그러나, 흘림 세포계측에서 사용되는 흡착 염료가 뉴런에 가해지면 상기 뉴런은 죽을 수 있다는 것이 확인되었다. 참조문헌[Miller, JP 및 Selverston Al., Rapid Killing of Single Neurons by irradiation of Intracellularly injected dye, Science, 206:702-704, 1979]. 따라서, 세포 집단을 분리하기위해 FACS를 사용하는 것은 세포 수득율이 매우 낮아질 수 있기 때문에 불리하다.
또다른 방법으로서, Clarke외 다수는 종양 세포를 선택적으로 죽이기 위하여 자살 유전자의 아데노바이러스 중재 전달을 발표했다. 참조문헌[Clarke외, A recombinant bcl-x s adenovirus selectively induces apoptosis in cancer cells but not in normal bone marrow cells, Proc. Nat. Acad. Sci. 92(24):11024-8,1995].
그러나, 상술한 방법들중 대부분은 전체 집단의 종양 세포 분리 또는 살상 방법에 근거한 것이다. 불운하게도, 상기에 열거된 전체 집단 종양 제거 방법은 수득된 간 세포 집단의 모든 오염 종양 세포를 죽이거나 또는 제거하지 못한다. 최상의 경우에 있어서, 신체에 가해진 잔류 종양 세포는 초기 수득물에 존재하는 100,000개의 세포당 1 내지 10개의 수로서 존재한다. 참조문헌[Lazarus 외, Does in vitro bone marrow purging improve the outcome after autologous bone marrow transplantation?, Journal of Hematotherapy, 2(4):457-66, 1993].
따라서, 최상의 방법을 이용하는 겨우에도, 자가 간세포이식동안 환자에게 재도입되는 잔류 종양 세포의 수는 10 내지 2000개 정도이다. 종양 세포의 지수적 성장을 고려하면, 이식물내에 존재하는 상기 잔류 종양 세포는 환자의 재발을 급속하게 초래할 것이다.
또한, 레이저 기술을 이용하는 방법이 Shapiro에게 허여된 미합중국 특허 제 4,395,397호에 설명되어 있다. 상기 Shapiro의 방법에 있어서, 표지된 종양 세포를 확인하기 위하여 형광 탐지기를 갖는 흘림 세포계측기내에 표지된 세포가 위치한다. 상기 세포들이 탐지기를 통과함에 따라 상기 표지된 세포를 죽이기 위하여 레이저 빔이 사용된다. 이러한 방법은 다수의 단점이 있다. 첫째, 원치않는 세포가 상기 탐지기/레이저 빔 영역을 통과한 후, 완전히 성공적인 파괴가 이루어졌는지를 검사할 방법이 전혀없다. 종양 세포가 파괴를 면한 경우, 상기 종양 세포는 환자의 신체내에 필연적으로 재도입될 것이다. 둘째, 상기 레이저 빔의 초점 직경이 상기 액체 스트림 직경보다 커야할 필요가 있다. 따라서, 원치않는 세포 영역에서 대부분의 세포(건강한 세포 포함)가 레이저 빔에 의해 파괴될 수 있다.
또한, 레이저 기술을 이용하는 또다른 방법이 Kratzer에게 허여된 미합중국 특허 제 5,036,693호에 설명되어 있다. 이러한 방법에 있어서, 표지된 세포 집단이 이동 벨트상에 위치한다. 다음에, 상기 표지된 세포들은 탐지기에 의해 확인되고 레이저에 의해 파괴된다. 그러나, 이러한 방법은 상기 Shapiro와 동일하게 많은 단점들을 가지고있다. 예를들어, 상기 세포들은 상기 탐지기를 지나 한 방향으로 벨트상에서 이동하므로, 상기 방법은 전환될 수 없다. 따라서, 단일 종양 세포가 탐지를 벗어난 경우, 그 벗어난 세포는 환자에게 재도입될 수 있다.
따라서, 광대한 노력 및 많은 혁신적인 접근 방법에도 불구하고, 수득된 세포 집단으로부터 모든 종양 세포를 근절하기 위한 방법 및 장치에 대한 중대하고 증가하는 필요성이 존재한다.
본 발명은 비종양 세포 집단(non-tumor cell population)으로부터 종양 세포를 특이적으로 분리하기 위한 방법 및 장치에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 종양 세포를 특이적으로 표지(labeling)한 다음, 레이저 빔과 같은 집속된 고에너지 빔을 이용하여 상기 종양 세포를 개별적으로 죽이는 방법 및 장치에 관한 것이다.
도 1 은 표지된 세포들을 특이적으로 조준 하기위한 자동화 시스템의 한 구현예의 개략도이다. 이 시스템은 컴퓨터, 카메라, 광대역 광원 및 레이저를 포함한다.
도 2 는 표지된 세포를 특이적으로 조준하고 죽이기 위한 자동화 시스템의 또다른 구현예의 개략도이다.
비종양 세포 집단으로부터 오염 종양 세포를 제거하기 위한 방법이 제공된다. 상술한 바와같이, 이 방법은 세포 집단을 제거한 다음 치료 요법의 일부로서 환자에게 재도입하는 의학적 방법에 관한 것이다. 일반적으로, 상기 방법은 오염 종양 세포를 현미경으로 확인하고 및 위치를 찾아내기 위한 표지를 이용한다.
선택된 세포질 표지는 비종양 세포 집단내에 존재하는 오염 종양 세포를 확인 및 구별하는 어떠한 표지일 수 있다. 예를들어, 형광 색소에 접합되는 항종양 항체가 특이 표지로 사용될 수 있다. 참조문헌[편집발행인 A.Gee, Bone Marrow Processing and Purging, Chapter 10, Part 5, CRC Press, Boca Raton, Florida, 1991]. 다수의 종양 특이 표지가 넓은 종류의 종양형성 세포에서 확인되었다. 예를들어, 상피 세포에 대하여 특이적인 많은 표면 표지가 수득된 조혈 세포군의 오염 유방암 세포에서 발견되었다. 이러한 항체들은 조혈 세포 집단에서 유방암 세포를 확인하고, 치사 에너지 펄스가 전달되도록 조준하기위해 사용될 수 있다. 유사하게, 다른 종양-특이 형광 색소-접합 항체들이 다른 유형의 종양 세포를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
또한, 종양 세포 집단에 대한 특이 표지가 이용될 수 없는 경우, 그 방법이 역 형태(inverse fashion)로 수행될 수 있음은 물론이다. 비종양 세포 집단에 대한 특이 표지가 종양을 형성하지 않는 세포를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 예를들어, 조혈 세포 집단에 잇어서, CD34 세포 표지가 조혈 세포뿐 아니라 비조혈 종양 세포를 착색하기 위하여 사용될 수 있다. 이어서, 표지를 가지지않는 어떠한 세포가 집속 에너지 펄스의 전달에 의해 죽게된다. 남아있는 생존가능한 세포 집단은 세포 표지(예, CD34)를 가지는 세포만을 함유하게된다.
종양 세포가 확인된 후, 레이저, 시준 또는 집속 비에너지광, RF 에너지, 가속 입자, 집속 초음파 에너지, 전자 빔, 또는 기타 방사선 빔과 같은 조절된 에너지 원이, 각각의 종양 세포를 개별적으로 죽이는 조준된 치사 에너지 펄스를 전달하기 위해 사용된다. 종양 세포가 비종양 세포 집단안에서 특이적이고 독특하게 확인될 수 있으므로, 상기 방법은 오염 종양 세포를 완전히 근절하기 위해 사용될 수 있다.
상기 방법의 한 구현예에 있어서, 종양 세포들은 동시적인 형광 및 레이저 조명에 의해 죽게된다. 제 1 단계에서, 상기 세포 집단은 종양 세포에 대하여 특이적인 형광 색소로 착색된다. 예를들어, 종양 세포에 대하여 특이적이고 형광 분자에 접합되는 항체가 이 구현예에서 사용될 수 있다. 다음에, 비종양 세포 집단안에서 형광 분자가 확인될 수 있도록 세포 집단에는 적절한 광(예, 자외선광)이 비추어진다.
이어서, 상기 표지된 세포들은 페트리 접시에 위치하여 시스템내에 위치한다. 상기 시스템이 자동 모드에 있는 경우, 형광이 비추어지고 CCD 카메라가 상기 접시에 있는 세포의 비디오 화상을 찍기 시작한다. 부착된 컴퓨터에서 작동하는 컴퓨터 프로그램은 화상을 분석하여 형광 세포를 하나하나 확인하기 시작한다. 각각의 세포가 조준되고 레이저 빔에 의해 파괴된다. 컴퓨터는 레이저가 활성화되기 전후의 형광 변화를 감지하여 각각의 세포가 죽었는 지를 확인한다.
또다른 구현예에 있어서, 생검(biopsy)내의 오염 세포가 암 환자로부터 제거된다. 많은 종양 형태로부터 1차 종양 세포계를 시험관내에서 설정하는 것은 종양 세포보다 더욱 탁월한 시험관내 성장 특성을 갖는 오염 1 차 세포 집단의 존재때문에 복잡해진다. 예를들어, 많은 암세포계를 설정하는데 있어서 오염 섬유모세포가 주된 난제가 된다. 본원에 개시된 시스템은 상기 생검된 종양 세포를 그대로 보전하면서 상기 오염 세포를 표지 및 파괴하기 위해 사용될 수 있다. 따라서 더욱 공격적인 1차 세포계가 상기 암세포계를 압도 및 파괴하지 않을 것이다.
본 발명에 있어서, 본 발명의 시스템은 조직 공학 및 세포 요법용 접종물에서 오염 세포를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 조직 공학용 1차 세포 배지의 설정 및 세포질 생검의 설정시에 세포 오염 문제가 존재한다. 특히, 연골 결함에 대한 연골세포 요법이, 연골 생검으로부터 유도되는 세포군내의 불순물에 의해 방해를 받는다. 따라서, 본 발명의 시스템은 이러한 유형의 세포를 상기 접종물로부터 특이적으로 제거하기 위해 사용될 수 있다. 예를들어, 연골 생검이 취해지고 그 시편이 통상의 조건하에서 성장될 수 있다. 이어서, 성장 배지는 오염 세포에 대한 특이 배지로 착색된다. 다음에, 전체 세포군이 후술하는 시스템내에 위치하여, 표지된 오염 세포가 파괴된다.
또다른 구현예에서, 동종 사람간세포(HSC) 이식편의 설정에 있어서 숙주 질병에 대한 그라프트(GVHD)의 중대한 위험 및 심각성의 제거를 위한 시도가 이루어질 수 있다. 본원에 기술된 시스템을 사용함으로써, 환자의 T 세포를 한정 및 제어하는 것이 가능하다. 이러한 유형의 제어는, T 세포의 과도한 고갈이 동종 이식편에서 발견되는 백혈병에 대한 알려져있는 유익한 그라프트의 효과의 상실을 초래하기 때문에, 오늘날의 기술에서 특히 어려운 것이다. 따라서, 예를들어 백혈병 세포를 공격하기 위하여는 어느정도 수준의 T 세포가 환자에게 유익하다. 그러나, T-세포의 수준이 너무 높으면, 일반 면역 계통이 수용 조직을 공격하게 된다. 본 발명의 시스템 및 방법은 어떤 동종 이식편에서 T 세포의 수를 정밀하게 조절할 수 있다.
자동화 조준 시스템의 한 구현예가 도 1에서 예시되어 있다. 컴퓨터 시스템 12)는 케이블(14)를 통해 카메라(16)에 연결되어 있다. 이러한 컴퓨터 시스템은 비디오 데이터를 접수 및 분석할 수 있는 어떤 상업적으로 입수가능한 컴퓨터일 수 있다. 이러한 컴퓨터 시스템의 일례는 Microsoft Windows 95 소프트웨어를 작동하는 Intel Pentium Pro 컴퓨터이다.
비디오 카메라가 도 1의 구현예에 예시되어 있지만, 카메라(16)는 당업자에게 알려져있는 어떤 유형의 상 수집 장치(image gathering equipment)일 수 있다. 카메라(16)는 지면에 대하여 일반적으로 수직한 방향으로 유지되도록 지지체(20)상에 설치된다.
카메라(16)의 렌즈(22)는 접안렌즈(26)를 통해 현미경(24)과 결합되도록 구성된다. 따라서, 현미경(24)내에 전해지는 어떤 상이 접안렌즈(26)를 통해 카메라 (16)의 렌즈(22)에 보내진다.
카메라(16)는 포착되는 상을 케이블(14)을 통해 컴퓨터(12)에 전달한다. 이러한 방식으로, 컴퓨터(12)는 현미경에 나타나는 어떤 상을 포착하여 분석한다. 예를들어, 현미경(24)은 접시(30)에 있는 세포들에 집속될 수 있다. 상기 세포들의 상이 현미경(24)으로부터 카메라(16)에 전달되고, 끝으로 컴퓨터(12)에 보내진다. 다음에, 컴퓨터(12)는 포착되는 상을 분석하기위해 소프트웨어를 작동할 수 있다.
또한, 컴퓨터(12)는 제 2 케이블(32)을 통해 레이저(34)에 연결되어있다. 이러한 레이저는 지지체(20)에 대한 그 위치가 컴퓨터(12)로부터 신호를 접수함으로써 변경될 수 있도록 전자 제어 스위블(36)에 장착된다. 도시된 바와같이, 레이저(34)는 현미경(24)의 렌즈를 통해 레이저 빔을 조준하도록 조절될 수 있는 한편, 표적 세포는 실제적으로 정지 상태에 있다. 또한, 레이저(34)는 접시(30)상에 직접 레이저 빔을 전달하도록 회전될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "접시"는 광범위한 의미를 가진다. 이러한 용어는 세포 매질과 같은 얇은 유체층을 보유할 수 있는 어떤 표면을 포함하는 것으로 의도된다. 이러한 접시는 본원에 기술된 방법의 실시동안 접시내의 유체를 상온이하로 유지하기위한 냉각 장치를 구비하거나 또는 그 장치와 결합될 수 있다. 또한, 필수적인 것은 아니지만, 유체 표면을 질소 또는 아르곤과 같은 불활성 분위기로 씌우는 것이 바람직할 수 있다.
도 1에 예시된 구현예가 레이저를 조준하기 위하여 전자 제어 스위블(36)을 포함하고 있지만, 다른 방법도 예상될 수 있다. 예를들어, 레이저와 그 표적사이에 전자 제어 미러(mirror)가 위치하여 미러의 회전에 따라 레이저를 조준할 수 있다. 당업계에 알려져있는 빔 스플리터, 미러 또는 프리즘과 같은 레이저를 조준하기위한 다른 기구가 본 발명의 범위내에 포함된다.
또한, 광대역 광원(40)이 어뎁터(42)를 통해 현미경(24)에 연결되어있다. 어뎁터(42)는 광대역 광원으로부터 방출되는 광이 접시(30)에 위치한 세포를 비추는 것을 가능하게 한다.광대역 광원은 당업계에 잘 알려져있는 것이고, 많은 상이한 유형의 광원이 접시(30)에 위치한 표지된 세포를 비추기위해 자동화 조준 시스템 (10)에 배치될 수 있다.
접시(30)를 아래에서 지지하는 것은 컴퓨터 제어되는 이동가능한 트레이(48)이다. 컴퓨터(12)는 레이저(34) 및 현미경(24)에 대한 트레이(48)의 위치가 변화하도록 하는 신호를 통신 케이블(49)를 통해 송신할 수 있다. 따라서, 세포를 특이적으로 조준하기 위해, 컴퓨터(12)는 접시(30)가 특정의 위치까지 로울링되도록 케이블(49)을 통해 트레이(48)에 신호를 송신할 수 있다. 올바른 위치를 계산함으로써, 레이저는 접시(30)의 선택된 위치로 이동함으로써 특정의 세포를 향해 조준될 수 있다. 상기 선택된 위치의 좌표는 컴퓨터(12)가 카메라(16)으로부터 수집되는 세포 상을 분석함으로써 결정될 수 있다.
컴퓨터(12)에서 작동하는 소프트웨어는 카메라(16)로부터 케이블(14)을 통해 전달되는 상을 포착한다. 한 세트의 표지된 세포가 접시(30)에 위치하는 경우, 카메라(16)는 상기 표지된 세포의 화상을 기록할 것이다. 상술한 바와같이, 세포에는 광대역 광원(40)이 비추어질 수 있다. 컴퓨터에 의해 수집된 화상의 상부에 이차원 그리드를 겹쳐놓음으로써, 소프트웨어는 하나의 세포에 해당하는 폭을 갖는 검은점을 찾아서 표지되는 세포의 X/Y좌표를 결정할 수 있다. 이어서, 소프트웨어는 표지된 세포의 데카르트 좌표를 계산하고 이러한 좌표에 레이저(34)를 특이적으로 조준한다. 짧은 고에너지 펄스를 방출함으로써, 레이저는 각각의 표지된 세포를 선택적으로 죽일 수 있지만, 비표지 세포는 전혀 손상시키지 않는다.
또한 컴퓨터 시스템(12)은 착색된 종양 세포로부터의 형광 신호를 탐지한 다음 파괴하기위한 제 1 종양 세포의 좌표 위치를 계산하기 위한 센서를 가진다. 이어서, 상기 컴퓨터 시스템은 레이저 또는 전자 빔과 같은 집속 에너지원을 상기 제 1 종양 세포의 상기 계산된 위치로 조준한다. 따라서, 표적된 종양 세포는 비종양 세포군안에서 특이적으로 파괴된다. 이것은 표적 세포가 상기 과정동안 실제적으로 정지하고 있기 때문에 촉진된다.
또다른 예시적인 시스템에 있어서, 세포들은 CCD 디지탈 카메라에 연결된 현미경아래에 있는 컴퓨터-제어 X-Y 테이블상에 이동하기위해 놓여진다. 레이저는 뷰 필드(view field)내의 특별한 고정 위치로 조준되도록 현미경에 설치된다. 이어서, 컴퓨터는 하나의 착색된 종양 세포가 명시화될 때 까지 X방향으로 제 1 열의 세포를 가로질러 연속적으로 주사한다.
다음에, X-Y 테이블은 몇 개의 세포가 제 1 열과 겹쳐져있는 제 2 열이 명시화될 때 까지 Y 방향으로 이동한다. 다음에, 상기 테이블은 X-방향으로 이동하여 종양 세포들이 상술한 바와같이 파괴되고, 이러한 과정은 세포군 전체가 주사될 때 까지 반복된다. 바람직하게, 컴퓨터 소프트웨어는 세포들을 자동적으로 확인하고 조준한다. 그러나, 표시 스크린상에서 종양 세포를 위치 및 표지하고 및/또는 X-Y테이블의 이동을 조절하기 위해 트랙볼, 조이스틱 또는 마우스와 같은 조작자 제어 지시 장치(pointing device)가 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 물론, 세포를 주사하고 현미경을 기준으로 레이저를 이동(예, Y방향만으로, 또는 뷰 필드내의 임의의장소로)하기위한 대안의 방법을 포함한 많은 종류의 컴퓨터 제어 시스템의 사용이 가능하다. 또한, 접시/테이블은 실제적으로 정지상태로 유지될 수 있고 현미경/레이저 결합물이 표지된 세포를 조준하기위해 이동할 수 있는 것도 구상될 수 있다.
예를들어, 현미경 헤드 및 레이저 조준 시스템이 이동될 수 있는 반면에 세포를 보유하는 플라스크 또는 페트리 접시는 표면상에서 정지한다. 그밖에, 레이저 시스템이 세포군의 하부로부터 상부까지에 레이저를 발사할 수 있다. 상기 레이저 조준 시스템은 현미경을 통해 집속되기 때문에, 레이저 빔은 상이한 초점면들을 향할 수 있다. 따라서, 상이한 수직 높이에 위치하는 세포들은 변화하는 초점면에 레이저 빔을 조준함으로써 특이적으로 죽을 수 있다. 예를들어, 컴퓨터가 탐지기를 통해 특정의 X 및 Y 좌표에서 세포를 확인하면, 상기 좌표의 몇몇의 초점면내에 레이저가 발사될 수 있다. 따라서, 세포가 수직면에 위치하는지에 관계없이 레이저에 의해 확실히 죽을 수 있다.
세포군내의 종양 세포마다 상기의 조준 과정을 반복함으로써 전체 종양 세포집단이 자동적으로 파괴될 수 있다.또한, 각각의 종양 세포를 표지하고, 확인하고 죽이는 과정이 수동으로 수행될 수도 있다. 이 때, 조작자는 각각의 표지된 종양 세포를 현미경으로 확인한 다음, 레이저 빔을 상기 비추어진 종양 세포에 집속하게 된다. 세포의 수동 조준을 가능하게하는 결합된 레이저/현미경 시스템은 미합중국 일리노이즈주 알링턴 하이츠에 소재한 Photonic Instruments로부터 입수가능하다.
예를들어, 연속하는 이웃한 필드(field)의 명시화를 가능하게하는 Nikon 7 Diaphot 300 현미경이 적당한 시간동안 전체의 세포 집단을 조사하기위해 이용될 수 있다. 합류점(confluence)에서 1.5x108개 세포의 예시적인 세포 집단은 300cm2의 면적을 차지할 수 있다. 4X 배율에서 2x1.5mm의 뷰 필드를 가정하면, 현미경은 전체적으로 100x100 매트릭스, 또는 10,000 개의 필드를 주사하여야 한다. 수동 조작자는 시간당 500-1000개의 필드를 주사할 수 있으므로, 전체 수동 조작 과정은 약 10-20시간이 걸릴 것이다. 그러나, 이러한 작업은 자동화 과정을 이용하면 아주 빨라질 것이다.
전체 세포 집단이 형광-표지 항체와 같은 확인제로 처리된 다음 에너지 펄스에 의해 죽으면, 상기 세포 집단은 환자 개개의 임상학적 필요에 따라 세척된다. 다음에, 상기 처리된 세포 집단은 선택된 환자에게 즉시 이식될 수 있는 것이다. 상술한 바와같이, 일반적으로 환자는 세포 집단의 최초 공여자와 동일한 사람이다.
상기 조준 방법에 대한 바람직한 집속 에너지원은 375 내지 900nm 범위의 파장을 전달하는 레이저이다. 하나의 이러한 레이저는 미합중국 일리노이즈주 알링턴 하이츠에 소재한 Photonic Instruments에 의해 제조된다. 알려진 바와같이, 레이저는 단색성 광원에 크게 특이한 방향성을 제공함으로써, 겨우 0.5미크론의 직경을 갖는 현미경 집속 에너지 빔의 조준을 가능하게한다.
광에너지를 전달하는데 있어서 공간 및 시간적인 해상도의 측면에서의 고정밀도가 예정된 파장에서 달성될 수 있다. 특정의 종양 세포를 죽이게되는 가장 유리한 파장은 가장 유리한 결과를 위해 실험적으로 결정및 이용될 수 있다. 또한, 약 10-100 나노초의 펄스 길이가 세포 집단의 단일 세포만을 선택적으로 죽이기위해 사용될 수 있다.
또는 그렇지 않으면, 제어된 에너지 광원을 제공하도록 자동화되는 아이리스를 이용함으로써 광대역 광원(예, 크세논 램프로부터 얻어진 것)이 좁게 집속될 수 있다. 고전력 광대역 광원이 1 입방 미크론정도로 작은 면적에 집속될 수 있으므로, 비종양 세포 집단내의 하나의 종양 세포만을 선택적으로 죽이기 위해 사용될 수 있다.
광원의 전력 및 광펄스 기간은 하나의 특정한 종양 세포를 선택적으로 죽이는 원하는 결과를 달성하도록 조절될 수 있다. 레이저 펄스 길이는 2 내지 6 나노초정도로 짧을 수 있고 광에너지는 50 마이크로쥬울 이하로 방출될 수 있다. 그러나, 지정된 표적 세포에 제공되는 전체량의 광에너지는 조절된 세포 물질 또는 주변 매질의 실제적인 비등을 초래하지 않도록 선택되는 것이 바람직하다.
세포 매질을 비등점까지 국소적으로 가열하면, 뷰 필드(view field)가 혼탁해질 수 있으므로 자동화 조준 시스템이 방해를 받을 수 있다. 또한, 표적 세포의 다음에 위치하는 비종양 세포가 손상될 수 있다는 위험이 있다. 한 구현예에 있어서, 전달되는 전체 광전력은 세포막을 최소로 분열시킴으로써 세포질 성분의 손실로 인한 실제적인 세포 죽음을 유도할 수 있다. 또는 그렇지않으면, 전체 광전력은 세포 성분을 비가역적으로 손상시킴으로써 세포막의 파괴없이 세포 죽음을 유도하도록 선택될 수 있다.
종양 세포를 현미경으로 관찰하기 위하여, 전체 세포 집단은 다수의 세포들이 하나의 초점면에 나타나도록 어느정도 편평한 표면에 위치하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 표면에서 세포의 밀도는 원칙적으로 어떠한 값을 가질 수 있다. 그러나, 세포 밀도는 과정에 필요한 전체 표면적을 최소화하도록 가능하면 높아야한다. 오염 세포가 명백히 확인될 수 있는 경우, 전체 세포 집단은 합류점에서 표면상에 배치될 수 있다(입방 센티미터당 약 500,000개 세포).
수득된 세포 집단이 골수 이식편의 일부로서 제거되어진 조혈 세포인 경우, 상기 세포 집단에서 원하는 간세포를 강화하면 상기 세포 집단은 더욱 작은 면적으로 관찰될 수 있다. 예를들어, 3억 5천만개(70kg 체중의 환자 1kg당 5백만개)조혈 세포의 CD34-강화 집단을 관찰하기 위하여, 필요한 전체 표면적은 약 700입방 센티미터이다. 그러나, 상기 조혈 간 세포 강화 과정이 다중 간세포 특이 표지에 대한 스크리닝을 포함한 경우, 표적 세포의 총수는 감소함으로써 더욱 작은 면적이 조준 과정에 필요할 것이다. 알려진 바와같이, 조혈 세포 집단의 조혈 세포는 간 세포 표지 Thy-1, CD38, CD15, CD11b, Gly-A, CD3, 또는 CD19의 발현에 기초하여 강화될 수 있다. 또한, 상기 간 세포는 심층 여과(deep filtration) 또는 역류 유출(counterflow elutriation)과 같은 잘 알려진 방법에 따라 강화될 수 있다.
종양 세포 탐지가 세포 합류점에서 방해를 받는 경우, 이웃한 세포들에 대한 부수적인 손상이 최소화되도록 표적 세포 집단을 부합류점(subconfluency)에서 유지하는 것이 바람직할 수 있다. 그러나, 세포들의 총수는 종양 세포의 수와 비교하여 많기 때문에, 주변 세포에 대한 일부의 부수적인 손상은 묵인될 수 있다. 초점이 같은 현미경을 이용하여 산차원 공간에서 표지 종양 세포를 탐지 및 위치시키면 평평한 표면에 대한 필요성이 제거될 수 있다. 그리고 치사 광원의 확인 및 집속은 세포들이 위치하는 공간을 통해 일어날 수 있다.
종양 세포가 특이적으로 파괴된 후, 세포 부스러기(cellular debris)는 저온에서 세포를 세척함으로써 제거될 수 있다. 계획된 시간에 따라, 표적 세포 집단은, 비종양 세포 집단의 생리학적 성능의 저하를 최소로 유지하면서 오염물 제거 공정이 진행될 수 있도록 4℃까지 냉각될 수 있다. 이것은 비종양 세포가 조혈 세포인 경우에 특히 중요한데, 이는 상기 조혈 세포가 실온에서 분해되기 때문이다. 상기 세포 집단을 냉각하기 위한 과정동안에 열전기적 냉각 장치가 사용될 수 있다.
알려진 바와같이, 상기 세포 집단을 4℃까지 냉각하면 모든 세포의 이동이 배제된다. 또한, 세포들이 위치하는 표면에는, 세포들이 견고하게 부착되도록 하기 위하여 폴리-I-리신과 같은 다양이온성 화합물이 코팅될 수도 있다.
하기의 실시예는 조혈 세포 집단으로부터 종양 세포를 제거하기 위한 방법의 한 구현예를 예시한다.
본 발명은 세포 집단에 함유된 오염 세포를 개별적으로 확인 및 파괴하기위한 장치 및 방법을 제공한다. 본 발명의 장치를 사용하면, 실제적으로 모든 종양 세포가 확인되고 개별적으로 제거될 수 있다. 따라서, 오염 종양 세포를 전혀 재도입하지 않고 자가 조혈 간 세포 이식 및 유사한 의료 기법을 실시할 수 있다.
몇 가지의 방법을 사용하는 본 발명에 따라 종양 세포들이 확인될 수 있다. 한 구현예는 현미경으로 살아있는 종양 세포들을 비종양 세포들과 구별할 수 있도록 하는 비파괴 표지 방법을 포함한다. 이러한 구현예에 있어서, 종양 특이 형광 색소 접합 항체가 각각의 종양 세포를 특이적으로 표지하면서 조혈 세포는 표지하지 않도록 사용될 수 있다. 이어서, 상기 표지된 종양 세포들은 비종양 세포 집단안에서 현미경에 의해 확인될 수 있다. 다음에, 좁은 고전력 레이저 빔이 각각의 확인된 종양 세포에 집속되고 짧은 치사광 펄스가 전달된다. 이어서 모든 표지된 종양 세포가 파괴될 때 까지 다음의 종양 세포를 확인하여 죽인다.
또다른 구현예에 있어서, 조혈 세포를 선별적으로 결합하지만 종양 세포는 결합하지 않는 항체가 조혈 간 세포를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 모든 종양 세포(예, 표지를 흡수하지 않은 것들)가 확인된 다음 좁은 고전력 레이저 빔에 의해 죽게 된다.
또한, 또다른 구현예는 비종양 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 종양 세포를 제거하는 방법으로서, 상기 방법은 a)종양 세포가 비종양 세포와 구별될 수 있도록 세포 집단을 표지하는 단계와; 상기 표지를 기준으로 하나의 종양 세포의 위치를 찾아내는 단계와; 조절된 에너지원으로부터의 펄스를 상기 찾아낸 종양 세포에 인가하여 상기 종양 세포를 죽이는 단계를 포함한다.
또한, 또다른 구현예는 조혈 간 세포 집단에서 간 세포의 수를 강화하기 위한 방법으로서, a)조혈 세포 집단을 간 세포 특이 표지로 표지하는 단계와; b)상기 집단에서 비표지 세포들중 하나 이상의 세포에 고에너지 레이저광 펄스를 인가하는 단계를 포함한다.
또한, 또다른 구현예는 환자에게 재도입하기 위한 분리된 조혈 세포를 제조하기 위한 방법으로서, 상기 제조 방법은 a)상기 분리된 조혈 세포내의 종양 세포를 종양 세포 특이 표지로 표지하는 단계와; b)상기 표지된 세포들중 하나이상의 세포에 고에너지 레이저광 펄스를 인가하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또다른 구현예는 제 2 세포 집단으로 부터 제 1 세포 집단의 제거를 확실하게 하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 제 1 세포 집단이 제 2 세포 집단과 구별될 수 있도록 제 1 세포 집단을 표지하는 단계와; 상기 제 1 세포 집단 및 제 2 세포 집단을 표면상에 정지 상태로 위치시키는 단계와; 상기 표지를 기준으로 상기 제 1 세포 집단중 하나의 세포의 위치를 찾아내는 단계와; 상기 하나의 세포에 조절된 에너지원으로부터의 제 1 펄스를 인가하는 단계와; 상기 하나의 세포가 상기 제 1 펄스에 의해 죽었는지를 측정하는 단계와; 상기 하나의 세포가 죽지않은 경우, 조절된 에너지원으로부터의 제 2 펄스를 인가하는 단계를 포함한다.
본 발명의 또다른 구현예는 비종양 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 종양 세포를 제거하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 비종양 세포가 종양 세포와 구별될 수 있도록 상기 비종양 세포를 표지하는 단계와; 상기 세포집단의 비표지된 세포를 확인하여 종양 세포들중 하나의 세포의 위치를 찾아내는 단계와; 상기 찾아낸 종양 세포에 조절된 에너지원의 펄스를 인가하여 상기 종양 세포를 죽이면서 상기 종양 세포를 표면상에 실제적으로 정지 상태로 유지하는 단계를 포함한다.
실시예 1
조혈 간세포 이식
전이 종양을 가지며 자가 골수 이식을 필요로하는 환자를 의사가 확인한다. 치료의 제 1 단계로서, 환자는 골수 수득 과정에 처해진다. 이러한 과정에 있어서, 환자는 수술실에서 일반 마취 상태로 유지된다. 다음에, 외과의사가 환자의 후부 장골즐에 몇 번 구멍을 내어 골수를 흡출한다.
상기 수득 과정에 의해 약 1x109의 조혈 세포를 얻는다. 상기 수득된 세포를 우선 면역친화성 칼럼위에서 이동시켜서 CD34 조혈 세포-특이 표면 항원을 갖는 세포를 선별하여 조혈 세포를 강화한다. 상기 수득된 세포 집단에서 간 세포를 더 강화하기 위하여, 상기 수득된 세포를, 항간세포 항체 Thy-1과 결합된 명역친화성 칼럼위에서 이동시켜서 제 2 선별을 수행한다.
상기 칼럼으로부터 통상적으로 용리한 후, 상기 강화된 조혈 세포 집단을 형광 색소에 접합된 CD34 항체와 접촉시켰다. 상기 표지된 항체는 조혈 세포에 특이적으로 결합하지만, 종양 세포는 결합하지 않는다. 다음에, 상기 세포 집단을 명목상 평평한 표면에 합류점으로 배열한다. 상기 세포 밀도는 한층으로 입방 센티미터당 약 500,000개의 세포이다. 상기 형광색소-접합 CD34 항체에 자외선광이 비추어져서 상기 조혈 세포들을 확인한다.
다음에, 조작자는 질소 레이저로부터 레이저광을 조준한다. 375nm파장 및 5나노초의 펄스 길이를 갖는 레이저 빔을 사용하여, 형광을 발하지 않음으로인해 확인되는 각각의 종양 세포를 수동으로 조준하고 죽인다.
비형광 종양 세포가 파괴되면, 나머지 집단은 저온보존한다. 세포를 재도입하기 전에, 환자를 화학요법으로 치료하여 환자의 신체에 전이된 종양 세포를 파괴한다. 그후, 상기 분리된 세포를 37℃에서 신속하게 녹임으로써 재도입하기위해 준비한다. 다음에, 상기 종양 세포가 없는 조혈 간세포를 환자에게 이식한다. 그런다음, 환자는 최초 암의 소실이 없이 회복한다.
상기 골수 수득 및 재동입 과정은 일반적으로 의사가 실시 있지만, 본 발명의 방법을 수행하기 위한 조작자는 의학적 훈련을 필요로하지 않는다.
실시예 2
세포 집단에서 표적 세포가 레이저 처리에 의해 죽었는지를 확인하기 위하여 요오드화프로필리듐(Propidium Iodide(PI))가 사용될 수 있는 지를 결정하기 위한 실험을 수행했다. 당업계에 알려진 바와같이, PI는 이중 가닥 핵산에 대하여 특이적이다. PI가 죽은 세포의 핵내로 확산하지만 살아있는 세포의 막을 침투할 수는 없으므로, 본 발명의 발명자들은 표적 세포의 생존 능력이 그 핵에서 PI 색상 전개에 의해 확인될 수 잇는 지를 테스트했다.
또한, PI는 480nm의 표지 피코에리트린(PE)의 흡수 피이크에 근접한 493nm의 흡수 피이크를 가진다. 따라서, 상기 PI 및 PE는 동일한 파장의 광에 의해 활성화될 수 있다. 또한, PI는 578nm의 PE의 방출 피이크와 아주 충분하게 구별되는 617nm의 방출 피이크를 가진다. 따라서, PE-표지된 항체가 세포에 결합되는 경우에도 포지티브 PE가 구별될 수 있다.
세포계
미합중국 메릴랜드주 로크빌에 소재한 the American Type Culture Collection으로부터 사람의 조혈 세포계 KG1을 얻었다. 상기 세포들을 저온보존한 다음, 신속하게 녹이고, 4mL L-글루타민, 3.024g/l 중탄산나트륨 및 20% 태아소 혈청을 함유하는 IMDM(미합중국 뉴욕주 그랜드 아이슬랜드에 소재한 Life Technologies)에 현탁했다. 상기 세포계를 3-4일 마다 통과시키고 ATCC 가이드라인에 추천된 바와같이 37℃, 95% 습도 및 95%CO2의 인큐베이터에서 유지했다.
세포 착색
제조자의 가이드라인에서 추천한 바와같이, 사람의 CD34 막 항원에 대한 피코에리트린(PE)-접합 단클론 항체((미합중국 캘리포니아주 산 조세에 소재한 Becton Dickinson Immunocytometry Systems)를 이용하여 세포 표면의 직접 면역형광 착색에 의하여 상기 KG1a를 착색했다. 상기 표지된 KG1a 세포(표적)를 비착색된 KG1a 세포(비교 집단)와 1:100의 중량비로 혼합했다.
요오드화프로필리듐(미합중국 미저리주 세인트루이스에 소재한 Sigma Chemical Company)을 부가하여 1x106cells/ml의 세포 현탁액에서 5㎍/ml의 최종 농도를 만들었다. 1.0x106cells/ml의 혼합된 최종 현탁액 20㎕를 384 웰 플레이트(미합중국 일리노이즈주 네이퍼빌에 소재한 Nalge Nunc International)의 웰내에 부가하고, 30분동안 세포를 침전시킨 다음, 상 포착 및 레이저 삭마(laser ablation)를 실시했다.
세포 상 획득
도 2 는 레이저 삭마 시스템(75)의 한 구현예를 개략적으로 보여준다. 상기 시스템은 퍼스널 컴퓨터(80)에 연결된 전자 결합 장치(CCD) 카메라(77)를 포함한다. 상기 퍼스널 컴퓨터(80)는 SGI O2워크스테이션(미합중국 캘리포니아주 마운틴 뷰에 소재한 SILICON Graphics)이었다. 20x 대물렌즈(84)를 갖는 역 Diaphot 300 형광 현미경(미합중국 뉴욕주 멜빌에 소재한 Nikon Inc.)에 설치된 냉각 CCD 카메라(77)(미합중국 애리조나주 츄존에 소재한 Photometric Inc.)에 의해 디지탈화된 화상을 포착했다.
선별 형광 필터(Set B2A; 미합중국 버몬트주 브레틀보로에 소재한 Chroma Technology Corp.,)를 사용하여 밝은 PE 방출 상을 획득했다. 상기 포착된 화상을 표시하고, 퍼스널 컴퓨터(80)에서 작동하는 Isee소프트웨어(미합중국 노쓰 캐로리나주 듀햄에 소재한 Inovision Corp.)를 이용하여 처리했다.
상기 소프트웨어는 단계적 도구 조작, z-방향 집속, 중요한 영역(예,표적)의 좌표화, 및 레이저 제어를 포함한 완전한 시스템 자동화를 제공했다.384 웰 플레이트의 각각의 웰에는 63개의 상 뷰 필드(viewing image field)가 있고, 상기 필드들사이의 단계적 이동은 상기 Isee내의 단계적 도구 통로에 의해 정확하게 제어하였다. 상기 관찰장에서 각각의 표적 세포(90)를 휘도, 사이즈 및 형상과 같은 소정의 매개변수하에서 확인하고, 그 위치를 상기 Isee소프트웨어의 특징 추출 기능에 따라 좌표화 및 표지했다. 이러한 과정동안에, 상기 표지 세포는 그 플라스크(92)의 표면상에서 정지상태로 유지되었다.
레이저 삭마
빔 스플리터(96) 및 Coumarin 440 염료 셀 유니트(미합중국 일리노이즈주 알링턴 헤이츠에 소재한 Photonic Instruments)를 구비한 보증 부류 IIIb 질소 레이저 (94), 모델 VSL-337(미합중국 메사츄세츠주 뉴우톤에 소재한 The Laser Science Inc.)를 이용하여 개개의 세포를 죽였다. 상기 빔 스플리터(96)는 레이저(94)로부터의 광을 통과시키지만, 수은 아크 램프(99)로부터 방출된 청색광은 굴절시킨다. 따라서, 수은 아크 램프(99) 및 레이저(94)로부터의 광은 동일한 경로를 따라 표적 세포(90)을 향해 전달된다.
상기 수은 아크 램프는 450nm 내지 490nm 범위의 파장을 갖는 광을 전도한다. 그러나, 도 2에서 도시하는 바와같이, 상기 수은 아크 램프(99)로부터의 청색 광은 KG1a 세포의 CD34 표면 항원에 부착된 PE 접합물을 활성화하기 위하여 D470/40 여기 필터(100)(미합중국 버몬트주 브레틀보로에 소재한 Chroma Technology Corp.)를 통과한다. 따라서, 상기 여기광 및 레이저 광은 동일한 통로를 통해 운반된다.
다음에, 레이저광 및 여기된 광의 결합광이 제 2 빔 스플리터(102)에 전해진다. 상기 빔 스플리터(102)는 레이저(94) 및 수은 아크 램프(99)로부터의 광을 현미경 대물렌즈(84)를 통해 표적 세포(90)에 굴절시킨다. 또한, 빔 스플리터(102)는 표지된 표적 세포에 비추어지는 광을 필터(104)를 통해 CCD 카메라(77)에 전도한다.
정상 과정동안에, 상기 레이저광은 짧은 기간동안만 전도된다. 대조적으로, 상기 수은 아크 램프광은, 각각의 표지된 세포가 빔 스플리터(102) 및 필터(104)를 통해 CCD 카메라(77)에 광을 반사하도록, 일반적으로 일정하게 전도된다.
펄스 발생기(105)는 표적 세포(90)를 죽이는데 필요한 레이저 광의 최단 파열이 제공되도록 레이저(94)에 연결되어있다. 펄스 길이가 짧을 수록, 주변 세포가 세포 매질의 국소적 가열에 의해 손상될 가능성이 덜하기 때문에, 더욱 바람직하게 된다.
착색된 표적 세포 필드의 디지탈 상을 포착하고, 그 위치를 좌표화하고 상기 Isee 소프트웨어 시스템으로 표지한다. 아크 램프(99)는 상기 접시에서 표지 세포마다 형광을 발하는 광대역 광을 생성하기 때문에, 상기 컴퓨터 시스템은 전체의 뷰 필드를 수집하여 처리한다.
레이저로부터 짧은 펄스의 광이 세포들에 발사됨에 따라, 수직 이동가능한 z-모터(110)는 접시내의 상이한 초점면상에 레이저광을 특이적으로 집속하기위한 매커니즘을 제공했다. 상기 z-모터(110)는 대물렌즈(84)에 부착되는 전자 제어 모터이다. 여러가지의 초점면에 레이저를 정교하게 집속하기 위하여 상기 z-모터는 대물렌즈(84)가 상하 수직방향으로 이동할 수 있도록 연결된다. 또한, 상기 z-모터는 레이저 광 펄스를 표적 세포(90)의 바닥부로부터 상부에 집속하기 위하여 컴퓨터 시스템(80)에 의해 제어된다. z-모터를 이용하여 레이저 펄스를 집속함으로써, 불완전하게 평평한 조직 배양 플레이트 표면때문에 초래되는 세포의 수직 방향 위치 편차를 보상하였다.
세포의 성공적인 파괴의 측정
각각의 세포에 레이저 광 펄스를 인가한 후, 컴퓨터를 이용하여 617nm에서의 PI 방출 피이크를 분석했다. 상기 세포가 레이저에 의해 죽은 경우, 617nm에서의 방출 피이크가 세포의 최초 위치에서 발견되었다. PI 방출 피이크가 확인되지 않는 경우, 레이저는 상기 세포 위치에 또다른 광에너지 펄스를 인가할 것이다. 이러한 방식으로, 세포 집단에서 각각의 종양 세포가 죽었는지를 확인했다.
본 발명에 따라, 의사는 조혈 간세포 이식의 필요성을 갖는 갖는 환자를, 암세포의 재도입으로 인한 재발의 위험이 없이 효과적으로 치료할 수 있다. 본원에 개시된 방법은 조혈 간세포 또는 기타 세포 집단으로부터 오염 세포를 완전하거나 또는 거의 완전하게 제거하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명은 그 정신 또는 본질적 특징을 일탈하지 않고 기타 특정한 형태들로 구현될 수 있다. 상기에 개시된 구현예들은 그 모든점들이 예시만을 위한 것으로서 비제한적인 것으로 고려되어야 한다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기의 상세한 설명이 아니라 동봉한 청구의 범위에 의해 나타내어진다. 청구의 범위의 균등물의 의미 및 범위에 속하는 모든 것들이 청구의 범위에 포함되어야 한다.

Claims (30)

  1. 비종양 세포들을 포함하는 세포 집단으로부터 종양 세포들을 제거하는 시험관내 방법으로서,
    a)상기 종양 세포가 상기 비종양 세포와 구별될 수 있도록 상기 세포 집단을 표지하는 단계와;
    b)상기 표지를 기준으로 상기 종양 세포들중 하나의 종양 세포의 위치를 찾아내는 단계와;
    c)상기 위치된 종양 세포에, 조절된 에너지원으로부터의 펄스를 인가하여 상기 종양 세포를 죽이면서, 상기 종양 세포를 표면상에 실제적으로 정지된 상태로 유지하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 단계 b) 및 c)는 상기 비종양 세포 집단내의 종양 세포마다 반복되는 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 비종양 세포 집단은 조혈 세포 집단인 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 조혈 세포 집단은 조혈 간세포가 강화된 조혈 세포 집단으로 이루어지는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 조혈 간세포 집단은 CD34 표면 항원의 발현에 의하여 강화되는 방법.
  6. 제 4 항에 있어서, 상기 조혈 간세포 집단은 Thy-1, CD38, CD15, CD11b, Gly-A, CD3, 및 CD19로 이루어진 군에서 선택되는 세포 표지의 발현에 따라 강화되는 방법.
  7. 제 4 항에 있어서, 상기 강화된 세포 집단은 심층 여과 또는 역류 유출을 사용하여 만들어지는 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 단계 b) 및 c)는 컴퓨터 제어하에서 실시되는 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 조절된 에너지원은 레이저인 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 레이저로부터 방출되는 광의 파장은 375nm 내지 900nm인 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지는 상기 종양 세포에 대하여 특이적인 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 표지는 상기 비종양 세포에 대하여 특이적인 방법.
  13. 조혈 세포 집단에서 간세포의 수를 강화하기위한 시험관내 방법으로서,
    a)상기 조혈 세포 집단을 간세포 특이 표지로 표지하는 단계와;
    b)상기 세포 집단내의 비표지 세포들중 하나 이상의 세포에 고에너지 레이저광 펄스를 인가하면서, 상기 간세포를 표면상에서 실제적으로 정지된 상태로 유지하는 단계를 포함하는 방법.
  14. 제 13 항에 있어서, 상기 인가 단계는 상기 집단내의 실제적으로 모든 비표지된 세포들에 상기 고에너지 레이저광 펄스를 인가하는 것을 포함하는 방법.
  15. 제 13 항 또는 제 14 항에 있어서, 상기 간세포 특이 표지는 CD34인 방법.
  16. 제 13 항 내지 제 15 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 레이저로부터 방출되는 광의 파장은 375nm 내지 900nm인 방법.
  17. 제 13 항 내지 제 16 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 인가 단계는 컴퓨터의 제어하에서 실시되는 방법.
  18. 환자에게 재도입하기위한 분리된 조혈 세포를 제조하기위한 시험관내 방법으로서,
    a)상기 분리된 조혈 세포내의 종양 세포를 종양 세포 특이 표지로 표지하는 단계와;
    b)상기 표지된 세포들중 하나이상의 세포에 고에너지 레이저광 펄스를 인가하면서, 상기 표지된 세포를 표면상에서 실제적으로 정지된 상태로 유지하는 단계를 포함하는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 인가 단계는 상기 집단내의 모든 표지된 세포들에 상기 고에너지 레이저광 펄스를 인가하는 것을 포함하는 방법.
  20. 제 18 항 또는 제 19 항에 있어서, 상기 레이저로부터 방출되는 광의 파장은 375nm 내지 900nm인 방법.
  21. 제 18 항 내지 제 20 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 인가 단계는 컴퓨터의 도움으로 자동으로 수행되는 방법.
  22. 제 2 세포 집단으로부터 제 1 세포 집단을 제거하기 위한 시험관내 방법으로서,
    a)상기 제 1 세포 집단이 상기 제 2 세포 집단과 구별될 수 있도록 상기 제 1 세포 집단을 표지하는 단계와;
    b)상기 제 1 세포 집단 및 상기 제 2 세포 집단을 표면상에서 정지된 상태로 위치시키는 단계와;
    c)상기 표지를 기준으로 상기 제 1 세포 집단중 하나의 세포의 위치를 찾아내는 단계와;
    d)상기 하나의 세포에, 조절된 에너지원으로부터의 제 1 펄스를 인가하는 단계와;
    e)상기 하나의 세포가 상기 제 1 펄스에 의해 죽었는 지를 판단하는 단계와;
    f)상기 하나의 세포가 죽지 않은 경우, 조절된 에너지원으로부터의 제 2 펄스를 인가하는 단계를 포함하는 방법.
  23. 제 22 항에 있어서, 상기 제 1 세포 집단을 표지하는 단계는 종양 세포를 표지하는 것을 포함하는 방법.
  24. 제 22 항 또는 제 23 항에 있어서, 상기 제 2 세포 집단으로부터 상기 제 1 세포 집단의 제거는 제 2 비종양 세포 집단으로부터 제 1 종양 세포 집단을 제거하는 것을 포함하는 방법.
  25. 제 22 항 내지 제 24 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 펄스의 인가 단계는 레이저 펄스를 인가하는 것을 포함하는 방법.
  26. 제 22 항 내지 제 25 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 펄스를 인가하는 단계는 레이저 펄스를 인가하는 것을 포함하는 방법.
  27. 비종양 세포를 포함하는 세포 집단으로부터 종양 세포를 제거하는 방법으로서,
    a)상기 비종양 세포가 상기 종양 세포와 구별될 수 있도록 상기 종양 세포를 표지하는 단계와;
    b)상기 세포 집단내의 비표지된 세포를 확인하여 상기 종양 세포들중 하나의 세포의 위치를 찾아내는 단계와;
    c)상기 위치된 종양 세포에, 조절된 에너지원으로부터의 펄스를 인가하여 상기 종양 세포를 죽이면서, 상기 종양 세포를 표면상에서 실제적으로 정지된 상태로 유지하는 단계를 포함하는 방법.
  28. 제 27 항에 있어서, 상기 종양 세포를 죽이는 단계는 레이저 펄스를 인가하는 것을 포함하는 방법.
  29. 제 27 항 또는 제 28 항에 있어서, 상기 종양 세포를 죽이는 단계는 상기 찾아낸 종양 세포에 조절된 에너지원을 인가하면서, 상기 종양 세포를 어느정도 편평한 표면상에서 정지 상태로 유지하는 것을 포함하는 방법.
  30. 제 27 항 내지 제 29 항중 어느 한 항에 있어서, 상기 종양 세포를 죽이는 단계는 상기 찾아낸 종양 세포에 조절된 에너지원을 인가하면서, 상기 세포 집단을 합류점에 유지하는 것을 포함하는 방법.
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