CN102119212B - 分选细胞的方法及装置 - Google Patents

Abstract

用于分选流式细胞仪的方法、装置和系统，包括物镜，所述物镜具有在焦点处与流径同轴对准的光轴。可控能量源根据对分析物是否在所需亚群的确定选择性地改变分析物。在各实施例中，由可控能量源发出的光和/或由照射能量源发出的光中之一或二者穿过物镜。在由可控能量源发出的光穿过物镜的一些实施例中，物镜可以在与分析物的检测信号的焦点不同的点、特别是在靠近物镜的点处聚焦由可控能量源发出的光。

Description

分选细胞的方法及装置

相关申请

本申请要求2008年6月30日提交的美国临时专利申请61/077,083号的优先权，该申请的内容全文以引用的方式并入本文。

技术领域

本发明一般涉及分选细胞的方法及装置，特别是涉及使用受控的能量源修饰所关注的细胞群的方法及装置，方式是选择性地去除、富集或改变该群中的细胞、病毒或微粒。

背景技术

流式细胞分选可实现对所关注的细胞、病毒、小体或微粒（下文称为细胞）的群进行选择、富集、分配或划分。选择标准包括个体细胞的可测量特性或复合体或小体的可测量特性，前者可以在不借助化学试剂的情况下从细胞外部进行检测，后者与细胞相关，或者可以使之与细胞相关。例如，可以通过对细胞与一种或多种标记的结合进行检测和/或定量来测量或大致估计细胞的特性，所述标记例如为发荧光或经修饰呈荧光性的分子、复合体或小体。这种荧光分子、复合体和/或小体可以根据细胞的定性或定量特性而有差别地与细胞相关联，这些特性包括它们就蛋白质、脂质、磷蛋白、糖蛋白、磷脂、糖脂、核酸（包括核酸的数量、序列或组织）、碳水化合物、盐/离子以及在细胞内、细胞上或与细胞关联的任何其它分子而言的组成。另外，这种荧光分子、复合体和/或小体可以根据细胞的物理或生理特性而有差别地与细胞相关联，这些特性的例子包括但不限于细胞膜渗透性、细胞膜组成、细胞膜流动性、化学或膜电位、存活能力、化学梯度、运动性、还原或氧化电位或还原或氧化态以及其它参数或特性。

对于细胞来说，无论是标记的或未标记的、修饰的或未修饰的，可以作为细胞选择的基础的其它细胞可测量特性可以包括但不限于：

与细胞相互作用的光的特性，如荧光性、吸光度、反射率、散射性、极化性或其它特性；

细胞的电学特性或细胞对其环境的影响的电学特性，包括电导率、电感、电阻、膜电位或膜电压或其它特性；

细胞的磁特性或电磁特性，包括磁性、顺磁性、磁共振和/或细胞与电磁能的相互作用；

细胞的外形、图像或形态学特性；以及

就任何物质或参数而言的细胞组成，可通过任何方式直接或间接地进行测量。

此外，直接或间接、单独或组合地测量这类参数可以反映对细胞所关注的简单或复杂特性。

这种特性的一个例子是包含在二倍体、单倍体或配子基因组中的性染色体，根据细胞类型和生物体的情况，该性染色体可以是X染色体或Y染色体或二者的组合。对性染色体内含物的确定可以通过采用直接或间接测量或利用一种或多种方法进行测定来推断。这种方法包括测量相对或绝对确定的细胞的DNA含量；某些DNA序列的存在与否，或表示某些DNA序列存在与否的标记物的存在与否；细胞的大小，或细胞组成部分或细胞器的大小；蛋白质或细胞性染色体内含物的其它特性标记物的存在与否及位置，或这种标记表达的组合或模式；或反映细胞性染色体组成的任何其它的测量。可以进行多种其它的此类测量或特性的测定，用以识别在特定实例、情况、系统、疾病、病症、过程或环境中所关注的细胞。

这种细胞测量可实现对细胞、细胞群、器官、组织或生物体的定量和/或定性测定。这种测定可应用于许多领域，包括但不限于诊断、生物医学研究、工程学、流行病学、医药、农业、畜牧业、牲畜管理、动物学、生物制药业以及其它领域。除了能进行这种测量外，根据上述细胞术法测定的特征或参数，现有的方法及装置可实现细胞的分离。对所关注的细胞进行富集、采集或分隔，或者在制剂中除去非所需或非所关注的细胞，由此可以对细胞进行正选或负选。根据可如上所述进行测定的任何参数、特征或参数或特征的组合可以对这种选择进行控制。

通过包括或涉及上述方法识别的细胞可以被分离、分隔、富集、耗尽或收集到任意数量的任何组中。一种常见的分离方法（如图1A所示）利用静电力使含具有所需或非所需特性的（多个）细胞的带电或带静电的液流、（多个）液滴转向。根据具体的应用情况，收集或丢弃转向的细胞，如图1A所示。其它分离方法包括使用具有阀的流控装置使液流中的细胞转向至另外的途径、通道、管路或元件中供后续的采集或处理用，如图1B所示。

对细胞进行流式细胞分选有许多方法和系统。在这些方法和系统中，有些是专门设计用来对哺乳动物精细胞进行流式细胞分选的，特别是把精细胞分为携带X染色体的精细胞群和/或携带Y染色体的精细胞群，目的是提高由经分选的精子得到的受精卵产生所需性别的后代的几率。例如，奶农可能期望分选公牛的精子，以便通过用具有X染色体的精子进行人工授精、体外受精或其它方法得到牛胚胎，从而产生更多的雌性牛犊。

流式细胞分选方法面临一系列挑战，特别是在分选哺乳动物精细胞供以后产生后代之用的方面。重要的是，用于标记和/或区分细胞的方法和/或用于分选细胞的方法不能对细胞的存活能力产生不利的影响。通常，所述方法和/或系统的一个或多个目标（例如，更快的分选、提高准确度等）与所述方法和/或系统的其它目标冲突。必须平衡考虑各种因素，包括细胞经受的温度、温度变化、压力和/或压力变化、细胞暴露的流体环境、施加于细胞的力以及细胞的寿命。例如，随着温度的升高，荧光分子（例如，荧光色素）进入细胞中与细胞核内的DNA结合的速率（即，细胞被染色的速率）可增大。因此，系统的处理能力（至少染色过程的处理能力）可随着细胞环境温度的升高而提高。然而，经证实温度的升高对细胞的存活能力和/或细胞保持存活的持续时间是不利的。相反，将细胞保持在适合存活能力的最佳温度下可能会增加对细胞进行染色（以及测量和分选）所需的时间，从而使过程所花费的时间比可行的要长，或者在完成所述过程所需的时间过后细胞无法存活。

有关分选细胞的另一个挑战涉及细胞的物理及光学特性。特别是，扁平或以其它方式非对称的细胞（如哺乳动物血红细胞或精细胞）表现出各向异性的能量（例如光）发射。细胞内部的复杂几何形状和/或细胞边界的复杂几何形状的作用是以一定方式折射和/或反射光，这些方式高度依赖于细胞相对于用来区分细胞的任何照射源和/或检测器的取向。例如，将哺乳动物精细胞通过流式细胞分选分为具有X或Y染色体的群通常涉及使用与细胞内的DNA结合的荧光分子将细胞染色。大多数哺乳动物物种的X染色体与Y染色体之间的DNA含量差异（Y染色体含有的DNA通常少于X染色体）导致含X染色体的细胞有相对较高的荧光性。然而，X染色体和Y染色体的DNA含量差异通常仅为百分之几，并且，通常细胞的几何形状和/或取向对所检测的荧光性的影响百分数远远超过了X染色体与Y染色体之间的DNA含量差异百分数。另外，这种分析要求细胞单个通过检测区，这样检测器不会将来自二个细胞的荧光性解析成来自单细胞的荧光性。

流式细胞分选系统通常采用鞘包芯式（core-in-sheath)流控装置携带细胞通过检测区。如图1C所示，将细胞52的水性悬浮液的相对慢速移动流50注入至鞘液的相对较快的移动流54。这样的设置将细胞52聚集成被称为芯流的液流56。通过适当地选择芯悬浮液和鞘液的压力和随之而来的速度，由鞘流施加的流体动力使芯流变窄，芯流中的细胞纵向分布，从而使它们在液流中被依次携带。使芯流拉长和变窄的力具有定向细胞52的附加效果，这样使细胞52的纵轴58与单行流56的流动方向平行。然而，细胞对纵轴58的取向仍有些许的随机性。因此，当每个细胞52经过检测区时，入射到细胞上的光、从细胞发出的光（例如荧光）和由细胞反射出的光仍依赖于细胞52的取向。特别是对于许多类型的哺乳动物精细胞来说确实如此。

关于精细胞在流式细胞系统内相对于细胞的照射和检测的取向问题，存在着许多解决方案。例如，图1D示出一种解决方案，该方案采用在管62上切出的斜面尖头60向鞘流66中注入样本流64。该扁平的斜面尖头60有助于在鞘流66内将细胞相对于它们的纵轴58定向，这样使细胞的扁平面趋于排列在一致的方向上。另一种解决方案（可与斜面尖头方案结合）采用二个相互垂直的检测器68和70（0度检测器68和90度检测器70），该二个检测器结合使用以估计每个经过检测区72的细胞52的取向并测量那些被发现适当定向的细胞的荧光性，从而可实现荧光信号的精确量化。采用细胞相对于纵轴的流体动力定向的方案通常产生这样的群，其中样本流中约70%或更少的细胞达到了荧光测量所需的排列，这降低了仪器的处理能力，并导致不适当定向的细胞的丢弃。

再一种针对与细胞几何形状和取向有关的问题的解决方案利用沿与携带细胞的鞘包芯式液流同轴的光学检测。在一个这样的方案中，使用顶置式照射光学器件（epi-illumination optics）照射细胞和检测由细胞发出的光。如图1E所示，鞘流76携带的样本流74直接向显微镜物镜78移动，消除了对细胞（例如，精细胞80）相对于细胞80的纵轴82的取向的依赖性。然而，细胞80朝向物镜78的轨迹要求细胞80在经过检测区82A（即，物镜78的焦点84）后立即改变轨迹。系统通过使用液体的横向流86完成此轨迹变化。分析之后，横向液流86、鞘流76和液流74的汇流88可能会引起个体细胞位置的不确定性。因为细胞经过检测区82A后，汇集流内的细胞80的位置立即变得不可预测，所以这种位置的不确定性可以使系统无法进行细胞分选操作。

图1F示出的再一种解决方案利用一个或多个抛物面反射镜102均匀地照射细胞和/或从细胞径向集光。系统使用喷嘴104发射含个体细胞92的液流/射流106。液流106移动经过检测区94并通过抛物面反射镜102上的孔96。在经过检测区后的某点上，液流106被分割为可带电的液滴90。此后可以对每一液滴90进行分选，方式例如是，使带电液滴90和带电偏转器板98偏转，从而将液滴偏转到一个或多个容器100中。问题是，这种“空气中的射流（jet-in-air)”构造使得当液流106离开喷嘴104时，液流106（以及包含在液流106内的细胞92）的压力下降。压力的突然变化（以及喷嘴本身内的压力升高）和随后细胞92进入容器100时的碰撞一样，会对细胞92的存活能力产生不利影响。因此液流106离开喷嘴104时的压力和速度必须保持低于任何可能损坏细胞92的阈值，而细胞的损坏会降低系统的处理能力。另外，液滴90通过大气的移动可能要求一些环境约束条件，包括室内空气的清洁（例如，“无尘室”）和温度控制。

所以，尽管流式细胞术已经相对先进，本领域中仍然不断地要求提供更有效、更灵敏和更精确的方法及装置来进行细胞分离和/或识别。

发明内容

本发明描述了采用流式细胞术的方法及装置，用于检测、通过功能和/或物理性修饰而选择性地改变、和收集细胞群中所需或非所需的细胞。和现有常见的细胞分选方法及装置不同，本方法不依赖抛物面反射镜或正交检测来对细胞进行检测和分类。而本方法使用物镜，该物镜具有与通过检测区的样本流同轴的光轴。本方法可依赖或不依赖于细胞液流的转向或分离或将细胞分类到不同的接收容器或通路，这些也都是现有常见的细胞分选方法及装置中的情况。

本方法设想使用可控能量源，例如但不限于电磁辐射源（如激光器），对已经利用细胞检测技术识别的细胞群中的所需或非所需的细胞进行照射。对于所关注的细胞来说，在细胞仪中对它们进行分析之后，在某些方面在对它们进行分析后的一秒钟内，同时细胞还保持于装置的液流中，根据其所测量的特性或特征，将可控能量源选择性地导向所关注的细胞。所施加的能量可以在功能上和物理上改变这种细胞。根据本方法或装置的具体用途和具体实施例，可以在功能上和物理上消耗所得细胞群中的非所需细胞，或以能随后实现所需细胞的富集或非所需细胞的去除的方式修饰所得细胞群。所述方法及装置广泛适用于需要富集或消耗细胞的应用当中。在一些实施例中，所述方法和/或装置改变含有细胞群中所需和非所需细胞的液体，可能不会直接改变细胞，其中已经利用细胞检测技术对所述细胞群进行了识别。在这种实施例中，所述方法和/或装置可依靠细胞液流的转向或分离或将细胞分类到不同的接收容器或通路。

所述方法及装置的一方面包括基于包含在细胞中的性染色体X或Y对细胞群中的精细胞进行富集、选择、功能性改变或消耗的用途。所述方法及装置包括对细胞仪的流体及光学系统使用替代性的设计，在一方面包括垂直于液流定向光学测量部件和/或细胞改变能量源的装置，在另一方面所包括的装置中，也可以或作为另外的选择将一些此类部件按与液流同轴和/或成斜角的方式定向。

通过在细胞分析过程中观察细胞，不依赖于细胞相对于其最长轴的取向而精确地对每个细胞进行分类，随后利用该分类确定是否对细胞进行修饰、衍化、破坏、杀死或破碎，所述流式细胞方法及装置能提供新的方法及装置以实现细胞的正选或负选。在细胞测量的同时或细胞测量之后的一秒钟内，本发明所述的方法及装置对所需或非所需细胞结合应用力、能量或辐射，在那些细胞中产生变化，从而在物理上或功能上改变它们。根据具体用途或应用的要求，这种被改变的细胞或它们的碎片或衍生物在一方面可保留在所得制剂中，或者在另一方面被富集或除去。

描述的一个实施例可实现从携带Y染色体的精子中功能性和/或物理性地分离携带X染色体的精子，和/或从携带X染色体的精子中功能性和/或物理性地分离携带Y染色体的精子。在这个实施例中，利用具有公知特性的DNA结合化学物质间接地测量精子群中个体精子的相对DNA含量，这些化学物质例如但不限于双苯酰亚胺、SYBR染料（如SYBR-14）、Hoechst33342、Hoechst33258、溴化乙锭、吖啶橙、DAPI、色霉素、光神霉素、橄榄霉素以及本领域中已知当与DNA结合时表现出荧光性增强的其它化学物质。通过当细胞在向观察点流动的液流中运动时优选使用物镜观察该细胞来完成所述测量，其中所述物镜具有与液流的流动同轴的光轴。据推测，含相对较多DNA（即较高DNA含量）的细胞含较大的X染色体，而含相对较少DNA（即较低DNA含量）的细胞含较小的Y染色体。在一些期望最终制剂中的细胞只具有一种性染色体的方法实施例中，所述方法一方面在进行细胞分析的同时，或者在另一方面，在进行细胞分析后的一秒或更短的时间内，利用导向细胞的激光能量源，其中可快速调节激光能量源以照射含非所需性染色体的细胞和/或性染色体含量不确定的细胞。在本实施例的一个方面，本方法使用的激光能量源储存的能量在质量和/或数量上足以对非所需细胞进行修饰、衍化、破坏、失活和/或杀死。选定细胞中的这种变化在一方面涉及细胞的破碎，或者在另外的方面中是破坏性较小的，这取决于应用的情况。例如，在将识别和/或分离的精子用于受精和/或生殖的方法实施例中，一方面，例如通过破坏细胞中的DNA分子的序列或结构，或者通过降低其活动性，使其在用于人工授精时大部分不育，使非所需细胞不能生育可存活的后代，在这方面足以生产所需的制剂。在其它方面，以一些其它方式使非所需细胞不能活动，杀死、修饰它们或使它们失活，从而影响非所需细胞的生殖能力。在另一方面，以允许随后从所需细胞的制剂中除去或部分除去非所需细胞来对它们进行修饰或衍化。

在另一实施例中，细胞仪的配置采用一个或多个光学元件，在一方面，所述光学元件用于测量细胞的特性，和/或在另一方面，所述光学元件用于向细胞传递能量，其中至少一个光学元件，优选物镜的光轴，与经受分析的细胞流同轴定向。因此，在一些实施例中，所提供的方法及装置使用光学元件，特别是使用与液流同轴设置的物镜，来对细胞进行照射、测量或传递能量。在另一实施例中，所提供的方法及装置使用单独或组合的一个或多个附加光学元件，它们与液流成90度设置，用以对细胞进行测量或传递能量。在又一实施例中，所提供的方法及装置使用单独或组合的一个或多个附加光学元件，它们的设置与液流非同轴，用以对细胞进行测量或传递能量。再一实施例中，所提供的方法及装置使用单独或组合的一个或多个附加光学元件，它们与液流成斜角设置，用以对细胞进行测量或传递能量。用在本文中的“斜角”是诸如锐角或钝角的角，其不是直角或直角的倍数。

一些实施例提供修饰细胞群中所关注的细胞的方法，包括使所关注的细胞与可控能量源接触的步骤，所述可控能量源在将细胞群中的细胞识别为所关注的细胞后对所关注的细胞进行修饰，在经由能量源修饰后不用从细胞群中分离所关注的细胞。

一些实施例提供识别细胞群中所关注的细胞亚群的方法，包括使细胞群与可控能量源接触的步骤，所述可控能量源修饰所关注的细胞亚群中的细胞，其中的接触发生于在对流式细胞仪的样本液流中的细胞进行首次分析之后，且在首次分析后不超过约一秒钟进行接触，细胞保留在流式细胞仪的样本液流内，其中在那些所关注的细胞流向询问区时，首次分析将细胞亚群中的细胞识别为所关注的细胞，且其中可控能量源通过流式细胞仪修饰样本流中所关注的细胞。

在一些实施例中，首次分析包括检测具有所需特性的所关注的细胞，该所需特性选自所需的：蛋白质组成、DNA组成、细胞表面标记物、分子大小、吸光度、光反射、荧光性、光散射、极化、电特性、磁性、形态特性、细胞膜渗透性、细胞膜流动性和氧化还原态。

在一些实施例中，在细胞群经过流式细胞仪中的液流时使细胞群与能量源接触。在相关的实施例中，在将液流中的细胞识别为所关注的细胞之后且在之后的一秒钟之内使所关注的细胞与能量源接触。

在一些实施例中设想将能量源与液流同轴设置。进一步设想将能量源与液流成90度角设置，或者与液流成斜角设置。在另一实施例中，通过科勒（Kohler）和/或顶置式照射光学器件将能量源传递至所关注的细胞。在另一实施例中，将能量源导向细胞流上的一点，该点在细胞特性的测量位置的下游。在另一实施例中，将能量源导向细胞流上的一点，该点在细胞特性的测量位置的下游，并且在液流从其初始流动方向上转向或转弯后。

在一些实施例中，当细胞在流向观察点的液流中移动时，优选通过使用物镜观察该细胞，由此完成一种或多种分析，其中所述物镜具有与液流的流动同轴的光轴。在一些实施例中，液流在经过观察点后改变方向，同时仍可确定液流内的细胞顺序和/或位置。在一些实施例中，根据一种或多种分析，可控能量源可选择性地改变一个或多个细胞。在一些实施例中，可控能量源与新导向的液流同轴设置，而在其它实施例中，可控能量源与新导向的液流垂直或成斜角设置。在可包括或不包括可控能量源的一些实施例中，喷嘴可喷射液流，形成可用已知方法（例如使用可控能量源施加静电荷、控制各液流通路中的压力等）分选的液滴。

在一些相关的实施例中，以选自以下的方式将可控能量源导向液流中的细胞位置：连续液流、脉冲液流、间歇通/断循环、能量源的定期聚焦或散焦以及能量源向液流的间歇快速转向。

在一些实施例中，受控能量源是电磁源。在一些实施例中，能量源是激光器。

在一些实施例中，对细胞的修饰选自对所关注的细胞进行衍化、杀死、破坏、分裂和破碎。

在另外的方面，使用可通过电、磁、光谱、光化学、生物化学、免疫化学、荧光或其它化学手段检测的标记将细胞识别为所关注的细胞。在一些实施例中，所述标记是添加光活化型化学化合物或标记物。

在相关的实施例中，所关注的细胞被识别为具有所需的特性，该所需特性选自所需的：蛋白质组成、蛋白质含量、DNA组成、DNA含量、细胞表面标记物、分子大小、吸光度、光反射、荧光性、光散射、极化、电特性、磁性、形态特性、细胞膜渗透性、细胞膜流动性和氧化还原态。

在所述方法及装置中可设想将用于检测液流中的细胞特性的任何能量源、检测器或聚焦元件与液流同轴设置。例如，在包括检测器和可控能量源的流式细胞仪中，检测器或可控能量源其中之一或二者与液流同轴设置。在相关的实施例中，用于检测液流中的细胞特性的任何检测装置和或光学元件与液流同轴设置。

在另一实施例中，使用科勒和/或顶置式照射光学器件传递用于检测所需特性的光或能量。在相关的实施例中，当所述方法使用流式细胞仪时，该流式细胞仪是顶置式照射细胞仪。进一步设想将适用于所述方法中的顶置式照射细胞仪与修饰所关注的细胞的装置相结合，这将在本文中进一步描述。

当流式细胞仪用于所述方法时，流式细胞仪具有一个或多个样本流并结合具有物镜的光学器件，所述物镜与一个或多个样本流的流动同轴，用于传递检测所需特性所用的光或能量、用于检测细胞的所需特性和/或用于传递修饰所需或非所需细胞所用的光或能量。

在另一实施例中，能量源修饰具有所需特性的所关注的细胞。在相关的实施例中，能量源修饰缺乏所需特性的所关注的细胞。

在又一实施例中，所关注的细胞是选自携带X染色体的精子和携带Y染色体的精子的精细胞。在一些实施例中设想的是，携带X染色体的精子与携带Y染色体的精子之间存在着DNA含量的差异，基于这一所需特性将精细胞识别为所关注的细胞。

所述方法及装置进一步提供的是，在收集室中收集细胞群供进一步使用。在一些实施例中，收集室中包含已被可控能量源修饰的所关注的细胞和没有被可控能量源修饰的细胞。在相关的实施例中，收集之后，所关注的细胞可用于后续处理或程序。还在另外的实施例中，设想在收集之后丢弃所关注的细胞，细胞群的剩余部分用于后续处理或程序。

所述方法及装置还提供修饰细胞群中所关注的细胞的装置，所述装置包括可控能量源，经将细胞识别为细胞群中所关注的细胞，所述可控能量源对所关注的细胞进行修饰，不用在经能量源修饰后从细胞群中分离所关注的细胞。

在相关的实施例中，设想所述方法及装置使用流式细胞仪从细胞群中识别所关注的细胞亚群，所述流式细胞仪包括修饰所关注的细胞亚群的可控能量源，其中在样本流经流式细胞仪的样本管期间，在首次细胞分析后进行接触，且通常是在细胞分析后的一秒钟内进行，这时细胞仍保持在装置的样本液流内，其中首次分析将细胞识别为所关注的细胞，且其中在样本流经流式细胞仪期间，可控能量源修饰所关注的细胞。

在一些实施例中，所述方法的一步或多步以机器可读指令的形式存储在控制器内的有形存储介质上。控制器的处理器执行指令以全方位地监视和/或控制分选流式细胞仪。所述指令可实施为与细胞仪内的各项任务相适应的一个或多个程序。

在一些另外的实施例中，分选流式细胞仪的光学池、比色皿、视窗、液流管、壁、边界或其它部件由折射率为1.30-1.40（含）的材料形成。在这些及其它实施例中，可以调节携带分析物的溶液，使溶液的折射率接近分选流式细胞仪的光学池、比色皿、视窗、液流管或其它部件的折射率，特别是折射率相差为0.02或更小。

附图说明

图1A示出分选流式细胞仪中采用的液滴分选法；

图1B示出分选流式细胞仪中采用的流动压差法；

图1C描述流式细胞系统中采用的鞘-流装置；

图1D描述采用斜面尖头在液流内定向的鞘-流装置；

图1E描述使用与液流同轴定向的物镜检测细胞的流式细胞仪；

图1F示出使用抛物面反射镜均匀照射细胞并从细胞径向集光的系统；

图2描述分选流式细胞仪的流径的设想实施例；

图3描述分选流式细胞仪的设想实施例；

图4描述分选流式细胞仪的设想的替代实施例；

图5描述分选流式细胞仪的另一设想的替代实施例；

图6A描述分选流式细胞仪的一部分的设想替代实施例。

图6B描述分选流式细胞仪的一部分的另一设想替代实施例；

图7示出可使用设想的分选流式细胞仪的一个或多个实施例为系统内的能量产生两个不同焦点的方法；

图8A描述在本发明所述的方法及装置的设想实施例的流径内的物镜及相关的焦点；

图8B示出在标称焦点与物镜之间形成的通常是锥形的体积的实施例；

图9描述在本发明所述的方法及装置的实施例的流径内的水浸物镜及相关焦点；

图10描述根据本发明所述的方法及装置的实施例在其中可形成分选流式细胞仪的一部分流径的主体；

图11描述图9中所示主体的替代实施例；

图12描述图9中所示主体的另一替代实施例；

图13描述图9中所示主体的又一替代实施例；

图14描述图9中所示主体的再一替代实施例；及

图15描述显示根据本发明所述方法及装置的方法步骤的流程图。

具体实施方式

本说明书描述基于流式细胞术的细胞分离方法、系统和装置。除另有定义外，本文中所使用的所有科技术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同。

这里需要注意的是，用在本说明书和所附权利要求书中的单数形式“一”、“一个（种）”和“所述（该）”包括复数个指代物，除非上下文中明确指出另外的情况。

本领域普通技术人员容易理解的是，除因对理解所述方法及装置有重要性而另指出外，所包括的附图没有按比例绘制。

除另有规定外，用在本文中的以下术语具有它们本来的含义。

术语“细胞”指所述方法及装置中的分析物，这种物质包括但不限于细胞、病毒、小体或微粒。术语“所关注的细胞”指具有所需特性的细胞，在细胞流过流式细胞装置的过程中可以检测该所需特性。“所需特性”指使具有所需特性的细胞与不具有所述特征的细胞区别开来的某种特征。具有所需特性的细胞在细胞的“所需亚群”内。在所关注的细胞中的示例性可测量或可检测的细胞特征包括但不限于蛋白质组成、蛋白质含量、DNA组成、DNA含量、细胞表面标记物、分子大小、吸光度、光反射、荧光性、光散射、极化、细胞的电特性、磁性、形态学特性、细胞膜渗透性、细胞膜流动性和氧化还原态。本领域普通技术人员容易理解的是，细胞仪可以测量或检测所关注的细胞的多种选择性特征中的任一种，并且这些选择性特征可以很容易地在所述方法及装置中利用。在一方面，所述方法或装置利用所关注的细胞的“所需特性”识别具有此特性的细胞。

术语“首次分析”指当细胞通过流式细胞装置行进时对细胞进行的初始分析，用以确定所述细胞是否是所关注的细胞，所述流式细胞装置可以是管、比色皿、区域、槽、室等。在一些实施例的一方面，流式细胞仪中的检测器执行首次分析。

用在本文中的术语“二次分析”指在通过液流管进行首次分析后，对所关注的细胞进行表征以确定是否使用能量源改变所关注的细胞。在一些实施例的一方面，通常在首次分析之后不到一秒钟之内进行二次分析。

用在本文中的术语“修饰（modify,modification）”和“改变（alter,alteration）”指使用能量源引起细胞发生变化。修饰包括但不限于对细胞的直接作用，包括但不限于修饰细胞组分或化学物质，包括蛋白质、DNA和涉及细胞代谢的物质；在细胞内或细胞附近进行的分裂、加热、空化或爆破；细胞的透化或穿孔；以及对细胞的破坏、破碎或形态改变。在其它方面，修饰也包括或作为另外的选择而包括能量源的间接作用，这种间接作用受能量源或其它因素的介导，包括细胞或一种或多种细胞组分的化学活化和/或去活化、化学交联或化学衍化；细胞内或细胞附近的一种或多种化学试剂的活化和/或去活化，这使这种试剂或其衍化物与细胞或其组分结合或关联；或诱导细胞功能的改变。在某些方面，在细胞被照射的情况下，通常存在于细胞内或另外施加于细胞的化学试剂与细胞相互作用。

所述方法及装置可通过检测任何数量的特征（例如所需特性）或参数的存在与否来实现对所关注的细胞的识别，所述特征或参数可以在与流式细胞技术相容的测量中得到确定、估计或反映。在各方面，用于确定所关注的细胞或细胞群的细胞测量包括本文中讨论的和另外在本领域中已知的细胞测量以及可引进到或可使之应用于流式细胞分析的新测量方法、手段和/或装置。通过本发明所述方法及装置的实践进行细胞分析的细胞可以是标记的或未标记的，或者另外是利用本领域中已知的技术和试剂修饰或未修饰的。

用在本文中的术语“标记物”是指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测的成分。例如，有用的标记物包括抗血清或单克隆抗体可用的荧光染料、高电子密度试剂、酶、生物素-链霉亲和素、地高辛（dioxigenin）、半抗原、蛋白质，或核酸特异性染料。因此，在本发明所述的方法及装置中，就任何物质或参数而言的细胞组成、特性和/或特征（以任何方式直接或间接测量的）是为选择或排除而进行的细胞和细胞群的识别的基础。

可检测的细胞组成、特性和/或特征的例子包括但不限于：与细胞相互作用或自细胞发出的光的特性的测量，如吸光度、光散射、发光性、荧光性、磷光性、光的极化或去极化或其它特性；电特性，包括但不限于细胞或周围介质的电感、电容、电位、电流或电阻；电磁特性，包括磁性、顺磁性、磁共振和/或细胞与电磁力和/或波的相互作用或电磁力和/或波的发射；成像、图像特性、形态学特性或由细胞的图像或图像样特性的收集和/或分析得到的相关特性。在某些方面，测量的是细胞的固有数量或质量特性，或者在另外的方面，测量的是间接反映、表现或大致估计细胞的数量或质量特性的值。还在另外的方面，测量的既是细胞的固有数量或质量特性，也是细胞的数量或质量特性的间接反映、表现或大致估计。作为例子而非限制，测量细胞的荧光性可反映细胞的固有荧光性，或者测量细胞的荧光性可反映与细胞结合或关联的荧光色素或荧光微粒的存在和/或数量，或者间接地反映细胞的一些特性，或兼而有之。

在所述方法及装置的一些方面，分选细胞仪采用可实现细胞和细胞群的物理和空间分离的技术。在所述方法及装置的其它方面，分选细胞仪利用在物理上和/或功能上修饰细胞群中选定细胞的技术来实现它们的功能性和/或物理性分离和/或区分，任选供后续使用。在所述方法及装置的一些方面，分选细胞仪不依靠按位置、定位、容器或时间对细胞进行即时分离，而是提供就一些所需特性而言是失活、钝化、分裂、分离、破碎或以其它方式改变（即，“修饰”）的细胞，这可任选能在制剂中实现亚群的分离和区分。修饰的类型完全或部分地取决于识别的细胞的预期应用或用途，并因此取决于识别的细胞在应用中的相关特征。例如，仅旨在说明或解释而言，在制备正常体细胞的情况下，如果细胞的繁殖能力受到负面影响或细胞被杀死，则恶性或以其它方式毫无节制或快速生长的细胞可视为在机能上失活。在另一实例中，也仅旨在说明或解释而言，在要求从细胞群中去除产生不良蛋白质或其它物质的细胞亚群的应用中，分选细胞仪可以通过以下的方式实现这一效果：停止在这些细胞中产生所述物质、杀死细胞和/或修饰细胞以允许将其从细胞群中物理地去除。

在一些实施例中，本发明所述的方法及装置利用能量源修饰细胞或者诱导或引发诸如化学活化的过程，所述化学活化可修饰细胞。能量源诱导的修饰包括在各方面对细胞的直接影响，包括但不限于修饰细胞的组分或化学物质，包括蛋白质、DNA和涉及细胞代谢的物质；在细胞内或细胞附近进行的分裂、加热、空化或爆破；细胞的透化或穿孔；以及对细胞的破坏、破碎或形态改变，包括细胞、病毒、小体或微粒。在其它实施例中，修饰也包括或作为另外的选择而包括能量源的间接作用，这种间接作用受能量源或其它因素的介导，包括细胞或一种或多种细胞组分的化学活化和/或去活化、化学交联或化学衍化，细胞内或细胞附近的一种或多种化学试剂的活化和/或去活化，这使这种试剂或其衍化物与细胞或其组分结合或关联，或诱导细胞功能的改变。在某些实施例中，经照射与细胞发生反应的化学试剂通常存在于细胞内或应用中，或作为所述方法的一部分进行添加。

在一些实施例中，所述方法及装置结合使用光活化型化合物，所述光活化型化合物经用适当强度或能量的光照射而受诱导与细胞或细胞组分结合或关联。这种化合物在某些方面诱导能影响所关注的细胞的细胞进程或代谢的一种或多种细胞组分发生充分的交联或变性。或者，这种化合物在某些方面诱导能杀死所关注的细胞的一种或多种细胞组分发生充分的交联或变性。在另一种可供选择的方案中，在所述方法及装置中使用的光活化型化合物与选定的细胞结合，并以这样的方式改变所关注的细胞的一种或多种特性，即，使所关注的细胞在后续过程中适于识别和/或富集和/或消耗。对于通过化学衍化（例如添加化学物质）改变的所关注的细胞来说，在某些方面，在后续的步骤中通过利用这种物质的特性或相互作用的方法对其进行去除、富集或纯化。例如，仅旨在说明或解释而言，在一方面，通过添加随后由抗体结合的物质对所关注的细胞进行衍化，所述抗体可通过各种方式实现对所关注的衍化细胞的捕集或截留。设想了许多这类物质，并且在一方面，这种物质包括含2,4-二硝基苯基（DNP）或与之相关的一类化合物，这类化合物在一方面由识别DNP的抗体识别并专门地结合。因此，在一方面，DNP或相关化合物的光活化型衍化物用于在这种类型的应用中衍化所关注的细胞。或者，利用使所关注的衍化细胞优先与某些底物结合的策略捕集或去除所关注的衍化细胞。例如，仅旨在说明或解释而言，在一方面，使用含生物素或与之相关的化合物衍化的所关注的细胞被捕集或截留在与生物素结合或经修饰（例如通过存在亲和素、链霉亲和素、生物素结合抗体或其它生物素结合分子）与生物素结合的底物、表面、物质、介质、化合物或微粒上。在涉及本方面的另一可供选择的方案中，生物素或相关化合物的光活化型衍化物用于在这种应用中衍化所关注的细胞。或者在其它方面中，所关注的细胞在经受选择和修饰之前通过化学物质或化合物的添加或结合被改变。因此在这种情况下，本文中所述方法及装置的实施例利用添加物质对选定细胞的改变来实现这种细胞与细胞群中其它细胞的区分。例如，仅旨在说明或解释而言，在一方面，在分析前通过添加光不稳定的化学化合物对群中的所有细胞进行衍化，在一方面，针对特定的细胞进行修饰，方式是使用装置的能量源修饰这些细胞上的光不稳定的化学化合物。

在细胞仪的一些实施例中（见图1），细胞以本领域中熟悉的常见方式进入询问或分析室、比色皿、液流或其它分析位置或区域供流式细胞分析和/或分选。细胞仪通过如上所述测量细胞的特性将其识别为在最终制剂中具有所需特性或不具有所需特性，所述细胞的特性包括但不限于诸如荧光和/或光散射之类的特性。液体的流动携带细胞经过细胞仪的区域，并且在一方面，通过一个或多个激光束、检测器和/或检测细胞数量和质量特性的其它装置。在一个这样的方面中，液体的流动使细胞向着具有通常与液流同轴对准的轴的光学元件移动。作为例子而非限制，光学元件可以包括诸如物镜的透镜，和/或可以包括一个或多个检测器、激光束和/或其它能量源。通过细胞与检测器、激光束和或其它能量源之间的光和/或能量可以穿过光学元件（例如，物镜），所述光学元件通常与细胞通过细胞仪的相关部分的流动同轴对准。在一方面，由细胞或流体经过仪器的相关部分的速度直接或间接地确定和/或估计在任意时间点时每个细胞在细胞仪中的位置。在一方面，将已经通过区域中的一些或所有分析位置的细胞识别为在最终制剂中具有所需特性或不具有所需特性。在一方面，由计算机和/或模拟和/或数字电气和/或电子和/或软件和/或计算计硬件数据分析设备完成这种测定。这种设备将每个细胞的单个或多个特性、测量结果和/或特征与由装置的操作员确定的一个或一套或一组特性、测量结果和/或特征进行比较。或者，在一方面，使用细胞仪所包括或带有的算法或程序自动地确定要与测量的特性进行比较的特性。

在一方面，在细胞仪中测定的细胞与之进行比较的特性集合确定在细胞制剂中具有所需特性或不具有所需特性的一个或多个所关注的细胞亚群。在一方面，迅速完成对经过仪器的分析区的细胞是否属于所关注的特定细胞亚群的确定，使得当细胞在仪器的流动系统中的位置得到确定之时将细胞的状态确定为在细胞制剂中具有所需特性或不具有所需特性，在某些方面，通常在进入仪器的分析区后不到一秒内确定。一旦完成所述确定，在一方面使细胞受选择性地施与满足或不满足选择标准的细胞的能量或力的作用。就与任选的后续应用相关的所需特性而言，所述力或能量在各方面使所关注的细胞失活、钝化、分裂、分离、破碎或以其它方式改变所关注的细胞，或者所述力或能量在另外的方面修饰和/或衍化所关注的细胞，或使所关注的细胞以这样的一种方式衍化，即，可实现在制剂中随后分离或区分一个或多个所关注的细胞亚群。

在各方面，这种力或能量是由导向流动液流中的细胞位置的一个或多个激光器或其它光和/或电磁源以这样的方式施与的，即，使能量源能够进行快速转向、散焦或关闭以允许未选择进行修饰的细胞通过。例如，仅旨在说明或解释而言，能够快速脉冲或开闭的高能量和/或高强度激光将选定的细胞暴露于使它们在任何所需用途中丧失功能的破坏性辐射。在一些方面，所述力或能量穿过光学元件，所述光学元件通常与在细胞经过细胞仪的相关区域时的细胞流动同轴对准。无论如何，所有细胞，不论是选定并受修饰力或能量作用的细胞还是未选择且不受所述力或能量作用的细胞，均继续随细胞流迁移，并离开装置中进行细胞特性测量和选定细胞修饰的区域。收集流出液，其含有修饰和未修饰的细胞，以及在某些方面含有细胞的碎片或残留物以及所述过程中使用的流体、溶液和/或缓冲液。在各方面，以这种形式进一步使用流出液，或者在其它方面中对其进行浓缩、分级或以另外的方式进一步处理以获得所需特性和/或组成。

图2至5描述根据所述方法及装置的分选流式细胞仪的各种实施例。图2特别地描述这种细胞仪的基本流径110的实施例。鞘液输入管112容许加压鞘液在鞘液输入端114进入流径110，产生经过流径110的鞘液流116。在鞘液输入端114的下游、优选在鞘液的平稳层流区，分析物流体输入管118容许分析物液流120（即，悬浮、携带分析物的流体等）经分析物输入端122进入流径110。在一些实施例中，分析物输入端122设置在鞘液流116内的中心处和/或流径110内的中心处，并定向成在分析物流体进入流径110时，分析物液流120平行于鞘液流116。当然，分析物输入端122不必在鞘液流116或流径110的中心，并且本领域的普通技术人员可以设想出在分析物液流120进入流径110时分析物液流120不与鞘液流116平行的实施例。鞘液流116相对于分析物液流120的流速和压力压缩分析物液流120并使之收缩而相对于鞘液流116变窄。鞘液流116与分析物液流120合并形成样本流123。

流径110可以在区域124改变方向，但优选此后包括没有障碍和流动方向陡变的区域，用来在样本流123到达询问区128（即，观察区、分析区、标称焦点等）之前稳定样本流123。样本流123经过流径110的路径限定了流动轴130。在一些实施例中，分析物液流120，特别是分析物液流120内的分析物（即，细胞），通常沿着流动轴130经过流径110移动。

在到达和/或经过询问区128后，样本流123转向。在一些实施例中，流径110在转角132（图2中以虚线标示）改变方向。在其它实施例中，样本流123在其到达区域126的端部136时遇到横流134。横流134使样本流123改变方向。在一些实施例中，转角132或横流134使样本流123的方向改变90度。然而在可供选择的实施例中，样本流123的改变可以超过或不到90度。在任何情况下，样本流123在改变方向后可以流向收集容器138，并且在到达收集容器138之前可以经过一个或多个流径元件140（例如，流量调节器、过滤器等）。

通常设置在转角132或其附近或者设置在样本流123与横流134的交点或其附近的物镜142起到在询问区128内产生焦点（未示出）的作用。在流径110经过询问区128时，物镜142的光轴144通常与流径110的流动轴130同轴对准。当然，光轴144与流动轴130不必完全同轴，可有所不同，如光轴144平行且偏离流动轴130，如光轴144相对于流动轴130呈斜角，等等。

图3示出包括所述方法及装置的各种特征的示例性分选流式细胞仪151。类似于图2中所示的流径110的实施例，图3描述鞘流输入管112和样本流输入管118，它们分别通过鞘液输入端114和分析物流体输入端122引入鞘液流116和分析物液流120。特别地，图3中所示的分析物流体包含哺乳动物精细胞150和携带哺乳动物精细胞150的缓冲液152。由于鞘液流116与分析物液流120并成样本流123，各自的流速使细胞150形成单行流并使它们的纵轴（即，沿着细胞尾的长度方向）对准样本流123的方向。

仍参照图3，分选流式细胞仪的一个实施例包括首次分析和二次分析。当细胞150随着样本流123经过流径110行进时，首次分析可以确定细胞是否是所关注的细胞，可以确定细胞经过流径110的移动速度，可以确定在样本流123中的给定点处，对于一种或多种稍后的分析来说，细胞150是否过于密集，细胞150是尾部朝前还是头部朝前定向等。在图3所示的实施例中，在细胞150到达流径110中的点154时进行首次分析。首次分析照射源156将能量158导向点154。能量158可以与每个细胞150相互作用以分散能量158，或者以其它的方式与细胞150、细胞150的相关抗体、细胞150的相关荧光色素（例如，荧光素）等相互作用。检测器160可以检测所产生的能量162（例如，分散的能量、所产生的荧光信号等）并通过接线164向控制器166发送相应的信号。检测器160可以设置在适于检测能量162的任何位置，包括与点154（相对于照射能量源156）成斜角，或者与点154成一直线。首次分析照射源156优选为488nm激光器，但也可以包括设想适合在首次分析中进行测量的任何能量源。首次分析照射源156可以定向成使能量158垂直于样本流123移动，或者作为另外的选择，可以定向成使能量158以相对于样本流123的方向成斜角的方式入射到细胞150上。此外，能量158和/或能量162可以穿过诸如滤光器、透镜等的一个或多个光学元件（未示出），这样可允许如本领域中通常已知的那样，通过建立不同的光路以不同于所描述的方式设置照射能量源156和检测器160中的任一者或两者。

一些实施例可以省略首次分析。例如，从二次分析（下文进行详述）收集的信息经证实可足以确定哪些细胞是所关注的细胞并区别在所需和非所需亚群中的细胞。因此在一些实施例中可以省略元件154-164。或者，一些实施例可以包括两个或多个首次分析，并相应地包括两组或多组元件154-164。作为例子而非限制，样本流123可以包括一个或多个标记物（例如，包括于鞘流116中、附着于或以其它的方式与样本流120中的一些细胞150结合等）。主要的首次分析可以在第一点检测标记物之一，次要的首次分析可以在第二点检测该标记物以确定样本流123中的细胞流速。

在任何情况下，首次分析后样本流123继续行进，沿着流径110携带细胞150。在细胞150经过点170时，如下文所述，二次分析对细胞150进行表征，用以确定是否对每个细胞150进行修饰。在每个细胞150到达点170时，二次分析照射源172将能量174导向点170。能量174可以与细胞150、细胞150的相关抗体、细胞150或细胞150内的DNA的相关荧光色素（例如，Hoechst染色剂）等相互作用。如本领域中通常已知的那样，在一些实施例中，二次分析照射源172是以紫外辐射的形式发射能量174的紫外激光器，所述紫外辐射与附着于细胞150内部的DNA上的Hoechst染色剂微粒相互作用，从而产生正比于细胞150的DNA含量的荧光。如图3所示，二次分析照射源172可定向成使射束174垂直于样本流123。然而，二次分析照射源172的位置也可以相对于样本流123成斜角。此外，能量174可以穿过诸如滤光器、透镜等的一个或多个光学元件（未示出），这样可允许通过建立不直的光路以不同于所描述的方式设置二次分析照射源172。

能量174与细胞150或与细胞150的内部成分的相互作用使所产生的能量176自细胞150发散出来。将物镜142设置成使物镜142的光轴144通常与样本流123同轴，这样的作用是聚焦能量176。物镜142的焦点178通常位于点170，但可以设置成便于在能量174照射细胞150的稍后检测自细胞150的所产生的能量176（即，焦点178可以稍微比点170更靠近物镜142）。设置成便于接收由物镜142聚焦的能量182的检测器180检测自细胞150的聚焦能量182，并通过接线184向控制器166发送相应的信号。当然，诸如滤光器186的一个或多个光学元件可起到改动或改变物镜142与检测器180之间的能量182的方向的作用。在一些实施例中，物镜142在转角132之前或者在横流134与样本流123汇合之前产生焦点178。在其它实施例中，物镜142在转角132或横流134与样本流123的汇合点或其附近产生焦点（未示出）。

控制器166可以包括一个或多个微处理器188、一个或多个晶体振荡器190、存储一个或多个程序194的一个或多个存储器192等，它对接收自检测器160和/或检测器180的信号进行解析，用以针对每个细胞150确定细胞150是否属于所需的细胞亚群。例如在一些实施例中，细胞150是哺乳动物精细胞，控制器166解析接收自检测器180的信号，用以确定每个细胞150携带X染色体还是Y染色体。本领域的普通技术人员通常已知的是，在哺乳动物的精细胞中，Y染色体所含的DNA通常比X染色体所含的要少。因此，通过分析由细胞150中的染色剂经二次分析照射源172的照射而发射的荧光（即，产生的能量176），控制器166通常可以确定细胞150携带X染色体还是携带Y染色体。在一些实施例中，程序194之一连续地监测检测荧光信号的统计分布，以便随着时间的推移提高测定的精确度。

仍参照图3，在一些实施例中，控制器166根据对细胞150是否属于所需亚群的确定，通过接线198向可控能量源196输出信号。可控能量源196可以发出导向样本流123中的点199的能量197。在一些实施例中，操作控制器166使信号与可控能量源196协调，和/或根据细胞150经过流径110的移动速度选择点199（例如，通过瞄准、通过一个或多个透镜、镜子等）。在一些实施例中，点199可以位于转角132或横流134与样本流123的汇合点之前，从而简化对沿流径110移动的细胞150的位置确定。在其它实施例中，点199可以位于转角132之后，或者可以位于横流134与样本流123的汇合点或其后。在上述实例中，控制器166可以输出信号，使可控能量源196响应对细胞150具有X染色体的确定或响应对细胞150具有Y染色体的确定而发出能量197。或者，控制器166可以输出信号，使可控能量源196响应对细胞150具有X染色体的确定或响应对细胞150具有Y染色体的确定而停止发出能量197。由能量源196发出的能量197的作用可以是使细胞150丧失机能或使细胞150不能存活（例如，通过修饰细胞的组分或化学物质，包括蛋白质、DNA和涉及细胞代谢的物质；通过在细胞150中或其附近造成分裂、加热、空化或爆破；通过造成细胞150的透化或穿孔；和/或通过造成对细胞的破坏、破碎或形态改变），可以是改变（例如，通过与细胞组分中或附着于细胞组分的化学物质的相互作用）细胞，使之随后可以被识别和/或从所需细胞亚群150中被去除，或者可以是有利地影响细胞。在一些实施例中，可控能量源196是激光器，并且特别地，可以是输出光谱的可见光或红外部分能量的激光器。在一些实施例中，激光器输出具有690nm波长的能量。在其它实施例中，可控能量源196可以输出其它类型或波长的辐射，如X射线、微波、可见光、红外光、紫外光或对细胞150具有所需效果的任何其它类型的能量。当然，响应于对细胞是否属于所需亚群的确定，控制器166可以：（1）发出能量197以不利地影响确定不属于所需亚群的细胞150（而留下确定属于所需亚群的细胞150）；（2）可以发出能量197以有利地影响确定属于所需亚群的细胞150（而留下确定不属于所需亚群的细胞150）；（3）可以停止发出能量197以避免有利地影响确定不属于所需亚群的细胞150（而继续发出能量197以有利地影响确定属于所需亚群的细胞150）；或（4）可以停止发出能量197以避免不利地影响确定属于所需亚群的细胞150（而继续发出能量197以不利地影响确定不属于所需亚群的细胞150）。此外，在一些实施例中，控制器166可以按与控制器166处理确定不在所需亚群中的细胞相同的方式处理不确定的细胞150（例如，控制器166不能进行确定的细胞150、过于密集的细胞150等）。

图4示出包括所述方法及装置的各种特征的示例性分选流式细胞仪200，特别地，图4中所示的分选流式细胞仪200省略了首次分析，因此没有元件154-164。然而，虽然未示出，但本领域的普通技术人员可以理解的是，如有必要，图4示出的实施例可以包括首次分析。如在图3中所示的实施例中的那样，样本流123沿流径110携带细胞150。在细胞150经过点170时，如上所述，二次分析（在图4的描述中并不是在任何首次分析之后）对细胞150进行表征，用以确定是否修饰每个细胞150。也就是说，在每个细胞150到达点170时，如上所述，二次分析照射源172将能量174导向点170，能量174与细胞150相互作用。当然，二次分析照射源172可以是紫外激光器，并且能量174可以与附着于细胞150内部的DNA上的Hoechst33342染色剂的分子相互作用。如图4所示，二次分析照射源172可以定向成使射束174与样本流123垂直。然而，二次分析照射源172也可以相对于样本流123成斜角。此外，能量174可以穿过诸如滤光器、透镜等的一个或多个光学元件（未示出），这样可允许通过建立不直的光路以不同于所描述的方式设置二次分析照射源172。

从细胞150发出的所产生的能量176向着物镜142传播，所述物镜142设置成使物镜142的光轴144（见图3）通常与样本流123同轴，并且作用是聚焦能量176。物镜142的焦点178通常位于点170，但作为另外的选择，可设置成便于在能量174照射细胞150的稍后检测自细胞150的所产生的能量176。一个或多个光学元件可以将由物镜142聚焦的能量182导向检测器180。例如，在图4所示的实施例中，聚焦的能量182在到达检测器180之前经过分束器202和滤光器186。其它光学元件（例如，透镜、镜子、滤光器等）也可影响聚焦的能量在物镜142与检测器180之间的路径。如在图3所示的实施例中的那样，在一些实施例中，物镜142在转角132或横流134与样本流123的汇合点之前建立焦点178。在其它实施例中，物镜142在转角132或横流134与样本流123的汇合点处或其附近建立焦点（未示出）。

如上文参照图3所述，控制器166的作用是解析（通过接线184）接收自检测器180（以及检测器160，如果细胞仪200包括首次分析的话）的信号以对每个细胞150确定细胞150是否属于所需细胞亚群（例如，带有X染色体的精细胞）。控制器166通过接线206向可控能量源204输出信号。可控能量源204以与可控能量源196（图3）相同的方式进行操作。然而，在图4所示的实施例中，由可控能量源204发出的能量208在一些实施例中穿过诸如滤光器216的一个或多个光学元件之后穿过物镜142。物镜142的作用是在焦点210聚焦能量208。在一些实施例中，物镜142可以聚焦来自可控能量源204的能量208，使聚焦的能量212通常与样本流123同轴，并且使点210位于比点170更靠近物镜142的位置。

本领域的普通技术人员可以理解的是，使用相同的透镜建立焦点210和焦点178有多种方法。图7描述细胞仪200可用来为能量176建立焦点178和为能量212建立焦点210的一种方法。图7描述在能量176（图7中以实线标示）从焦点178（即，从点170处的细胞150）经过物镜142（图7中未示出）的透镜214时，透镜214作用于能量176，使能量176的射线在其离开透镜214时是平行的。相比之下，能量208的射线在其落射在透镜214上的时候略微收敛，并因此在经过透镜214后汇合于焦点210。当然建立焦点178和焦点210有其它方法，包括利用不同波长的能量通过相同材料时的折射不同的事实，或者采用多焦点透镜，作为例子而非限制，如美国专利No.6,010,647中所述的方法。

为说明的目的，图5描述分选流式细胞仪220的另一示例性实施例。分选流式细胞仪220包括通常参照图3和4所描述的流径110。类似于图4中所示的分选流式细胞仪200，分选流式细胞仪220省略了首次分析（以及首次分析的相关设备）。样本流123，特别是细胞150，向着物镜142流动。如在前述实施例中的那样，物镜142在流径110中的点170处建立焦点178。在细胞150到达点170时，来自细胞150的能量176穿过物镜142，物镜142设置成使物镜142的光轴144通常与样本流123同轴，且作用是聚焦能量176。物镜142的焦点178通常位于点170，但作为另外的选择，可设置成便于在能量174照射细胞150的稍后检测自细胞150的所产生的能量176。一个或多个光学元件（如分束器202、滤光器186等）可以将自物镜142聚焦的能量182导向检测器180。

仍参照图5，所示的分选流式细胞仪220包括二次分析照射源222。二次分析照射源222发出能量224，能量224可以是紫外能量174。由二次分析照射源222发出的能量224经光路移动至物镜142。物镜142可以将能量224聚焦到焦点178，按照这种方式，能量176和能量224的光路可以在一定程度上重叠。诸如分束器202和滤光器226的其它光学元件的各种配置的作用可以是将能量224从二次分析照射源222导向物镜，并将（来自细胞150）的能量176从物镜142导向检测器180。

如上文参照图3和4所述，控制器166的作用是解析（通过接线184）接收自检测器180（和检测器160，如果细胞仪200包括首次分析的话）的信号，用以对每个细胞150确定细胞150是否属于所需细胞亚群。控制器166通过接线230向可控能量源228输出信号。可控能量源228以与可控能量源196（图3）相同的方式进行操作，输出导向点234的能量232。

图6A和6B分别描述根据设想方法及装置的流式细胞仪的其它实施例的部分235A和235B。如参照图2所述的那样，在各图6A和6B中，细胞236经流径238在液流237中移动，流径238在点239或其附近改变轨迹。流径238和/或经过流径238的细胞236的液流237的流体建模和/或精确形成和/或为监测细胞236的位置而并入附加元件（未示出）可以改善不然由在点239或其附近改变轨迹所导致的不确定性。按照这种方式可以在改变轨迹后仍能确定个体细胞的位置和本体。图6A描述一个实施例，其中将按与上文参照图3、4和5所述（分别是196、204和228）相同的方式操作的可控能量源240设置成使细胞236移过流径238中的点239后，所发出的能量241落射到细胞236上。图6A描述垂直于细胞236经流径238的流动方向移动的能量241。当然，可以理解的是，作为另外的选择，可以将可控能量源240设置成使发出的能量241通常与细胞236经流径238的流动方向同轴地移动（例如，通过再次改变流动方向，并将可控能量源240设置成使流径238中的细胞236向着可控能量源240移动）。

应当理解的是，作为另外的选择，根据设想方法及装置的分选流式细胞仪可以采取如图6B所示的“空气中的射流（jet-in-air)”配置。图6B描述了发射由液滴244组成的液流243的喷嘴242。可控能量源（未示出）通过对一个或多个液滴244施予电荷而选择性地改变液滴。此后，作为例子而非限制，如上所述，一对带电板245可以根据检测器（未示出）的确定将由液滴244组成的液流243分选到容器246当中。

图8A描述物镜142和包括询问区128在内的部分流径110。本领域中通常已知的是，一个或多个透镜元件250（例如，半球前透镜、弯月透镜等）的作用是建立标称焦点252。在上文参照图3-5所述的实施例中，标称焦点252在样本流123内，特别是在细胞150经过流径110的路径内。标称焦点252限定通常为锥形体254的顶点，所述锥形体254在标称焦点252与物镜142的外部元件256（形成锥形体254的基部253）之间。锥形体254可以是正圆锥体，但也可以是斜锥形体。在锥形体254是正圆锥体的实施例中，锥轴258通常与物镜142的轴260同轴。在这种实施例中，轴258和260进一步与流径110内的流动轴262同轴，流动轴262通常限定细胞150在流径110内移动的路径。

在一些实施例中，物镜142的焦点252使锥形体254的侧面264穿过的界面数最小化。例如，参照图8A，流径壁268A形成通常为圆柱形的横流径270A，流径壁268B形成通常为圆柱形的流径270B，所述流径270B通常与锥形体254的轴同轴。图8A中的锥形体254在进入和离开包括壁268A的材料时仅穿过两个界面。锥形体254穿过在空气276与包括壁268A的材料之间的界面272，并穿过在包括壁268A的材料与流径110中的流体278之间的界面274。此外，在一些实施例中，侧面264经过的流径110的壁268A通常可平行于锥形体254的基部253。这样简化了由物镜142聚焦的能量必须穿过的界面（即，能量不穿过任何曲面），每个所述界面可通过折射作用影响物镜142的焦点252。此外，如图8B所示，锥形体254可以由多个锥体257、259和261的255A、255B和255C部分连在一起形成，例如由具有不同折射率的材料形成一个或多个界面（如界面272和274）的情况。

一般来说，锥形体254必须穿过至少两个界面272和274。在所述方法及装置的一些实施例中，物镜142例如可根据形成界面（例如，壁268A）的材料的厚度和折射率情况而考虑一个或多个界面。此外，在一些实施例中，物镜142可以是使用折射率类似于形成界面（例如，壁268A）的材料的浸泡介质（例如，水或油）的水蘸透镜、水浸透镜或油浸透镜。因此，如图9所示，一些实施例通过使锥形体254穿过的材料的各折射率之差最小化而进一步减少焦点252的变形。例如在图9中，锥形体254可以穿过水280A、壁268A和流径110中的流体278。物镜142可以是水浸物镜，其中例如壁268A由玻璃制成。或者，在不必要校正由壁268A造成的折射的情况下，例如当壁268A由折射率与流体278的折射率类似或相同的材料形成时，物镜142可以是水蘸透镜。

还在另外的实施例中，流径110的壁268A和268B可以由折射率接近于流体278的折射率的材料形成（即，使锥形体254穿过的材料的折射率之差最小化的材料）。例如，折射率接近于水的材料包括折射率范围在1.30-1.40（含）的材料。无定形全氟聚合物、无定形氟聚合物和全氟烷氧基聚合物系列的若干固体材料的折射率在该范围内。作为例子而非限制，Asahi Glass Co.,Ltd.制造的Cytop^TM以及DuPont^TM制造的AF和PFA是三种此类材料。

在一些实施例中，所述方法或装置也可以调节流体278的折射率，使流体278的折射率更接近于形成流径110的壁268A和/或268B的材料的折射率。特别地，所述方法或装置可以将流体278的折射率调节成与形成流径110的壁268A和/或268B的材料的折射率相差在0.02以内。

在一些细胞仪中，在主体280中形成包括询问区128在内的部分流径110，例如图10所示的主体280。图10描述的主体280为矩形立方体，其内有钻成或以其它方式形成的流径110的部分281。所述部分281包括第一流径部分282（通常垂直于表面284，物镜142可以通过表面284进行观察）和第二流径部分286（通常平行于表面284，并与最靠近表面284的第一流径部分282的端部288交叉）。主体280例如可以是比色皿，可以由抛光的石英、玻璃、塑料或本领域中通常已知的其它材料形成。在一些实施例中，主体280可以完全或部分地由折射率范围在1.30-1.40（含）的材料形成，如Cytop^TM或AF。

在如图11示出的另一实施例中，主体280包括流径的部分281。所述部分281包括通常垂直于表面284（物镜142可以通过表面284进行观察）的第一流径部分282。然而，在图11所示的实施例中，第二流径部分286形成具有上边缘290的槽，通常与表面284共面。在一些实施例中，设置在表面284顶部上的盖玻片292可允许使用为与这种盖玻片292使用而校正的物镜，用以消除不同折射率材料之间的界面的折射影响或使这种影响最小化。

还在其它实施例中，如图12所示，主体280包括在第一流径部分282与第二流径部分286的交叉处形成的储池294。例如，第一流径部分282可以与储池294交叉在通常平的底表面296处，底表面296通常与表面284平行。流径部分286的两部分286A和286B可在通常可以为扁平圆筒形状的储池294的相对表面上与储池294连接。当调节焦点252（图8和9）时，这种布置可例如通过防止锥形体254穿过通常是圆柱形横流径270A（图8和9）的壁268A而提供进一步的灵活性。

图13描述了一个类似的实施例，其中储池294的上边缘298与主体280的表面284共面。水蘸物镜（未显示）可延伸到储池294当中，并且如此一来可以与流经流径110的流体接触，这样可以消除不同折射率材料之间的任何界面。

图14描述又一实施例，其中盖玻片299放置在图13的实施例中所示的暴露储池之上。

图15示出从细胞样本中选择所需细胞亚群的方法300。在一些实施例中，方法300或其部分方法以构成一个或多个相关装置的控制程序的一组机器可读指令的形式存储在存储器中。处理器可以从存储器中读取指令和执行指令以实施方法300。在另一实施例中，方法300包括若干程序，所述程序可以单独控制一个或多个装置，可以对由一个或多个装置收集的数据进行分析，可以根据分析的数据做出一种或多种确定，等等。通常已知的是，技术员或装置可以标记（例如，通过应用Hoechst染色剂）用于分析的样本（例如，精细胞集）（方块305）。标记细胞可以在分选流式细胞仪内完成，或者在分选流式细胞仪以外的单独过程或程序中完成。此外，应用于细胞的具体标记物可取决于细胞仪的应用。

在任何情况下，标记细胞后，分选流式细胞仪可以在流径中产生鞘液流（方块310）。分选流式细胞仪可以通过单独的输入端将样本（即，标记的细胞）注入流径（方块315），优选在鞘液流的中心或其附近。还优选的是，样本相对于鞘液流以缓慢的方式进入鞘液流，使样本内的单细胞（例如精细胞）与平行于鞘液流的长轴对准，并且使细胞以通常单行的模式流动。

在细胞经流径移动时，诸如UV激光器的激发能量源照射样本（方块320）。激发能量源可以不断地照射流径，或者在处理器上执行的程序可以控制激发能量源选择性地照射流径（例如，只有当样本存在于流径中的时候）。

物镜或其它聚焦装置的作用是在与液流同轴的方向上聚焦由每个细胞发出、传输或反射的能量（例如由标记物发出的荧光）（方块325）。也就是说，在流径内合并的鞘流和样本通常向着具有光轴的物镜移动，所述光轴通常与液流同轴，并且名义上而言，样本内的每个细胞经过物镜的焦点。检测器接收由物镜聚焦的能量（方块330），并对控制器发送代表检测能量的信号。在一些实施例中，检测器每秒可以单独检测从超过40,000个细胞聚焦的能量、每秒可以单独检测从超过75,000个细胞聚焦的能量或者每秒可以单独检测从超过100,000个细胞聚焦的能量。

控制器接收代表检测能量的信号并分析数据（方块335）以确定（方块340）数据所代表的是所需亚群内的细胞、不是所需亚群内的细胞，还是既不能确定在所需亚群也不能确定不在所需亚群的不确定的细胞。在后一种情况下，控制器可以如同检测器已确定细胞不在所需亚群的那样对细胞进行处理。如果控制器确定细胞不在所需亚群或者是不确定的，控制器可以对诸如红外激光器的可控能量源发送信号以照射细胞（例如，改变细胞、破坏细胞、使细胞无法存活等）（方块345）。或者，如果控制器确定细胞在所需的亚群，控制器可以对可控能量源发送信号（或不再发送信号），使可控能量源不照射细胞（方块350）。

所述装置可用于收集细胞供过程末期使用和/或进一步处理（例如，分离细胞）。在可以包括图15所示实施例的一些实施例中，控制器对可控能量源发送信号，对确定在所需亚群的细胞不进行改变（即，不照射），所得到的经处理的细胞集具有的所需细胞亚群中的细胞与未被改变的细胞总数之比大于或等于60%。此外，在可以包括图15所示实施例的一些实施例中，控制器对可控能量源发送信号，对确定在所需亚群的细胞不进行改变（即，不照射），所得到的经处理的细胞集具有的所需亚群中被改变的细胞与所需亚群中的细胞总数之比小于或等于50%。

当然，上述方法反映的是本发明所述方法的一个或多个实施例，但也可以包括一个或多个附加的步骤或程序，如在整个本说明书中参照各实施例描述的那样。此外，一些实施例可以省略参照方法300描述的一个或多个步骤或程序。作为例子而非限制，在一些实施例中，标记物可自动发出荧光，从而不再需要用照射能量源照射样本。此外，在一些实施例中（如上所述），所述方法可以颠倒方块345和350，不用可控能量源进行照射而允许确定不在所需亚群的细胞通过，而使可控能量源照射确定在所需亚群的细胞。

所述方法及装置提供的许多重要的优点都优于目前已实施的分选流式细胞仪。作为一项优点，本发明所述的方法及装置不使分析物细胞（在一些实施例中为哺乳动物精细胞）受限于分选流式细胞仪中通常采用的空气中射流的配置。其结果是，根据本发明所述实施例的细胞仪不将分析物细胞暴露于细胞仪外部的环境或分选液滴与容器所产生的碰撞，并且不会经历与空气中的射流配置的喷嘴相关的压力和压力变化。这允许在实施严格的空气质量条件和温度控制的环境以外使用细胞仪（例如，在“无尘室”环境以外）。实际上，细胞仪本身可以实施温度控制，从而扩充分析物细胞的存活能力。此外，本发明所述方法及装置可以更快和/或更精确地检测和改变分析物细胞，这部分是因为通常物镜与分析物通过询问区的流动同轴对准缓解和/或消除了与由分析物各向异性地发出能量相关的问题，特别是在用来分选许多类型哺乳动物精细胞的实施例中。在阅读本文中公开的方法及装置的说明书之后，本发明所述的方法及装置的其它优点对本领域的普通技术人员而言将是显而易见的。

虽然前文给出了对许多不同实施例的详细描述，但应该理解的是，保护范围由随后的权利要求的文字所限定。详细描述仅可视为是示例性的，并不描述全部可能的实施例，因为描述全部可能的实施例即使并非不可能，也是不切实际的。可以采用现有技术或本专利提交日之后开发的技术实施许多替代性实施例，这也在所述权利要求的范围以内。

因此，在不偏离本权利要求书的实质和范围的情况下可以对本文中所描述和说明的技术和结构做出许多修改和变化。因此，应当理解的是，本文中所述的方法及装置仅是示例性的，并不限制权利要求的范围。上述说明书描述至少以下各方面：

1.一种从包括第一组细胞和第二组细胞的细胞群中选择第一组细胞的方法，该方法包括：

对细胞群进行标记，以便可以区分第一组细胞与第二组细胞；

提供具有远端、近端、设置在近端与远端之间的询问区、和流动轴的第一流径；

产生通过第一流径的鞘液的鞘流，鞘流以第一流速朝近端移动；

在近端上游点处将包括细胞群的样本流注入鞘流，该样本流具有低于第一流速的初始第二流速；

提供激发能量源，当个体细胞经过询问区时，由激发能量源发出的能量作用于个体细胞，并引起自细胞发出或传输二次辐射；

当细胞经过询问区时，使用具有通常与流动轴同轴对准的光轴的物镜聚焦自个体细胞的二次辐射；

检测自个体细胞的聚焦二次辐射；

由检测的二次辐射确定个体细胞是在第一组还是在第二组；以及

选择确定在第一组的细胞。

2.根据第1方面所述的方法，其中选择确定在第一组的细胞包括对不是确定在第一组的细胞进行衍化、杀死、破坏、修饰、分裂或破碎中的一种处理。

3.根据第1方面所述的方法，其中选择确定在第一组的细胞包括由喷嘴喷射细胞流，由该流产生许多液滴，对液滴选择性地施加电荷，以及根据每个液滴的电荷对液滴进行分选。

4.根据第1至3中任一方面所述的方法，其中标记细胞群包括对细胞染色。

5.根据第1至4中任一方面所述的方法，其中引起发出二次辐射包括引起发出荧光。

6.根据第1至5中任一方面所述的方法，其中由激发能量源发出的能量穿过物镜。

7.根据第1至6中任一方面所述的方法，其中的细胞是精细胞，并且进一步地，其中第一组细胞包括带有X染色体的细胞或带有Y染色体的细胞任一者。

8.根据第1至7中任一方面所述的方法，其中选择确定在第一组的细胞包括使用区别能量源照射不是确定在第一组的细胞。

9.根据第8方面所述的方法，其中的区别能量源是近红外激光器。

10.根据第8方面或第9方面所述的方法，其中由区别能量源发出的能量穿过物镜。

11.根据第1至10中任一方面所述的方法，其中提供激发能量源包括提供紫外激光器。

12.根据第10方面所述的方法，进一步包括∶

选择区别能量源的波长、第一流速、第二流速和物镜的组合，使得物镜的标称焦点与区别能量源的标称焦点隔开一定的距离，该距离是在检测聚焦二次辐射与使用区别能量源照射不是确定不在第一组的细胞的过程之间个体细胞所经过的流径的距离。

13.根据第8方面或第10方面所述的方法，其中提供激发能量源包括提供从区别能量源中衰减的输出。

14.根据第1至13中任一方面所述的方法，进一步包括提供垂直于流动轴并设置在第一流径的近端的第二流径，使得细胞在经过询问区并到达第一流径的近端后进入第二流径并远离询问区。

15.根据第1至14中任一方面所述的方法，其中提供流径进一步包括提供由折射率范围在1.30-1.40（含）的材料形成的流径。

16.根据第1至15中任一方面所述的方法，进一步包括调整含细胞群的溶液的折射率，使得溶液的折射率与形成流径的材料的折射率相差在0.02以内。

17.一种用于检测和选择性地改变样本细胞群中的所需细胞亚群的装置，该装置包括：

流体流径，具有：

具有流动轴的第一流动部分，和

第二流动部分，

第一与第二流动部分在第一流动部分的测量端相交；

设置在第一流动部分的测量端或其附近的询问区；

以流体流动的方式与流体流径连通的鞘液输入端；

以流体流动的方式与流体流径连通的样本输入端；

具有标称焦点和光轴并设置在第一流动部分的测量端的物镜，该物镜对准第一流动部分，使标称焦点沿着流动轴且在询问区，并且使光轴通常与流动轴同轴对准；

设置检测由物镜聚焦的光的检测器；

与检测器通信连接的逻辑程序，可操作该逻辑程序以确定样本细胞群中的细胞是否属于所需细胞亚群，并且可进一步操作该逻辑程序以根据对细胞是否属于所需细胞亚群的确定来输出信号；

和可控能量源，该可控能量源与逻辑程序通信连接，并且可操作该可控能量源以根据至少由逻辑程序输出的信号选择性地改变所需细胞亚群中的细胞或不在所需细胞亚群中的细胞。

18.根据第17方面所述的装置，其中可控能量源通过对不是确定在所需亚群中的一个或多个细胞进行衍化、杀死、破坏、修饰、分裂或破碎来选择性地改变细胞。

19.根据第17方面或第18方面所述的装置，还包括激发能量源。

20.根据第19方面所述的装置，其中由激发能量源发出的能量穿过物镜。

21.根据第19方面或第20方面所述的装置，其中激发能量源包括具有作为输入端的可控能量源的衰减器。

22.根据第17至21中任一方面所述的装置，其中由可控能量源发出的能量穿过物镜。

23.根据第17至22中任一方面所述的装置，其中可控能量源包括激光器。

24.根据第17至23中任一方面所述的装置，其中可控能量源包括近红外激光器。

25.根据第17至24中任一方面所述的装置，还包括在其中形成流径的主体。

26.根据第25方面所述的装置，还包括在主体的第一表面形成第二流动部分的槽，其中第一流动部分的测量端与该槽相交于该第一表面。

27.根据第25方面所述的装置，还包括：

通过主体的第一内部通道，其从主体的第一表面延伸至主体内的一点并形成第一流动部分；和

通过主体的第二内部通道，其从主体内的所述点延伸至主体的第二表面。

28.根据第25至27中任一方面所述的装置，其中主体由折射率为1.30-1.40（含）的材料形成。

29.根据第28方面所述的装置，其中该材料包括无定形全氟聚合物、无定形氟聚合物或全氟烷氧基聚合物。

30.根据第17至29中任一方面所述的装置，其中物镜是水浸透镜或者是水蘸透镜。

31.根据第17至30中任一方面所述的装置，其中样本细胞群包括精细胞。

32.根据第31方面所述的装置，其中所需细胞群包括带有X染色体的细胞或带有Y染色体的细胞。

33.一种用于检测和选择性地改变样本细胞群中的所需细胞亚群的系统，该系统包括：

具有流动轴的流体流径；

设置在流体流径内的询问区；

以流体流动的方式与流体流径连通的鞘液输入端；

以流体流动的方式与鞘液输入端连通的第一泵；

以流体流动的方式与流体流径连通的样本流体输入端；

以流体流动的方式与样本流体输入端连通的第二泵；

物镜，具有标称焦点和光轴，并设置成使标称焦点沿着流动轴并在询问区，且使光轴通常在询问区与流动轴同轴对准；

设置检测由物镜聚焦的光的检测器；

可控能量源；

与计算机可读存储介质、检测器和可控能量源通信连接的处理器；以及

其中处理器和可控能量源配合，根据处理器的输出选择性地改变所需细胞亚群中的细胞或不在所需细胞亚群中的细胞。

34.根据第33方面所述的系统，进一步地，其中处理器和可控能量源合作，通过对不是确定在所需细胞亚群中的一个或多个细胞进行衍化、杀死、破坏、修饰、分裂或破碎来选择性地改变所需细胞亚群中的细胞。

35.根据第33方面或第34方面所述的系统，其中由可控能量源发出的能量穿过物镜。

36.根据第33至35中任一方面所述的系统，其中可控能量源包括近红外激光器。

37.根据第33至35中任一方面所述的系统，还包括由折射率为1.30-1.40（含）的材料形成的主体。

38.根据第33至37中任一方面所述的系统，其中样本细胞群包括精细胞。

39.根据第38方面所述的系统，其中所需的亚群是带有X染色体的细胞或带有Y染色体的细胞。

40.一种检测和选择性地改变样本细胞群中的所需细胞亚群的方法，该方法具体实施为在处理器上执行并储存在有形介质上的一套机器可读的指令，该方法包括：

控制样本细胞群通过具有流动轴的流径的流动；

控制照射源以对样本细胞群中的细胞经过的询问区进行照射；

接收来自具有物镜的光路上的检测器的数据，该物镜具有光轴和标称焦点，光轴通常与流动轴同轴对准，标称焦点在询问区内；

由接收到的数据确定样本细胞群中的一个细胞在询问区中的存在；

由接收到的数据确定该一个样本细胞是否属于所需细胞亚群；以及

根据至少对该一个样本细胞是否属于所需细胞亚群的确定来控制细胞选择能量源。

41.根据第40方面所述的方法，其中控制细胞选择能量源包括：

确定该一个样本细胞通过询问区的流速；以及

根据确定的该一个样本细胞通过流径的流速来控制细胞选择能量源，由此选择性地照射该一个细胞。

42.根据第40方面所述的方法，其中控制细胞选择能量源包括对包含一个细胞的液滴选择性地施加电荷。

43.一种用于检测和选择性地改变样本细胞群中的所需细胞亚群的系统，该系统包括：

具有询问区和询问区中的流动轴的流径；

控制样本细胞群通过流径的流动的控制装置；

当样本细胞经过询问区时对它们进行照射的照射装置；

具有光轴和标称焦点的物镜，该光轴通常与流动轴同轴对准，该标称焦点在询问区内；

检测由物镜聚焦的能量并提供有关检测能量数据的检测装置；

接收有关检测能量数据并确定经过询问区的个体样本细胞是否属于所需亚群的处理装置；

选择性地照射样本细胞的细胞选择装置；和

根据至少对个体样本细胞是否属于所需亚群的确定来控制细胞选择装置的细胞选择控制装置。

44.根据第43方面所述的系统，其中样本细胞群包括精细胞群，且其中所需的细胞亚群包括带有X染色体的精细胞。

45.根据第43方面所述的系统，其中样本细胞群包括精细胞群，且其中所需的细胞亚群包括带有Y染色体的精细胞。

46.根据第43至45中任一方面所述的系统，其中由细胞选择装置发出的能量在到达样本细胞前穿过物镜。

47.根据第43至46中任一方面所述的系统，其中至少部分流径由折射率为1.30-1.40（含）的材料形成。

48.一种用于检测和选择性地改变样本细胞群中的所需细胞亚群的方法，该方法包括：

产生携带通常为单行前进的样本细胞通过流径的流动；

当样本细胞在流径中经过询问区时照射样本细胞；

定位物镜，使得：

物镜的光轴通常与流径同轴，

流束通过流径向物镜移动，且

物镜具有在询问区中的标称焦点；

当样本细胞经过询问区时检测个体样本细胞的参数；

解释检测到的个体样本细胞的参数以确定个体样本细胞是否属于所需亚群；

根据对个体样本细胞是否属于所需细胞亚群的确定对一个或多个样本细胞群进行选择性的衍化、杀死、破坏、修饰、分裂或破碎；以及

收集所得到的经处理的细胞群。

49.根据第48方面所述的方法：

其中样本细胞群包括精细胞；

其中所需细胞亚群包括具有X染色体的细胞或具有Y染色体的细胞；且

其中当样本细胞经过询问区时检测个体样本细胞的参数包括当细胞经过询问区时每秒钟检测超过40,000个样本细胞的参数。

50.根据第48方面所述的方法，其中当样本细胞经过询问区时检测个体样本细胞的参数包括当细胞经过询问区时每秒钟检测超过75,000个样本细胞的参数。

51.根据第48方面所述的方法，其中当样本细胞经过询问区时检测个体样本细胞的参数包括当细胞经过询问区时每秒钟检测超过100,000个样本细胞的参数。

52.根据第48至51中任一方面所述的方法，其中选择性地衍化、杀死、破坏、修饰、分裂或破碎细胞并不改变确定在所需亚群中的细胞，且其中所得到的经处理的细胞群具有的所需细胞亚群中的细胞与未被改变的细胞总数之比大于或等于60%。

53.根据第48至51中任一方面所述的方法，其中选择性地衍化、杀死、破坏、修饰、分裂或破碎细胞改变了确定在所需亚群中的细胞，且其中所得到的经处理的细胞群具有的所需细胞亚群中的细胞与被改变的细胞总数之比大于或等于60%。

54.根据第48至53中任一方面所述的方法，其中选择性地衍化、杀死、破坏、修饰、分裂或破碎细胞并不改变确定在所需亚群中的细胞，且其中所得到的经处理的细胞群具有的所需亚群中被改变的细胞与所需亚群中的细胞总数之比小于或等于50%。

55.根据第48至53中任一方面所述的方法，其中选择性地衍化、杀死、破坏、修饰、分裂或破碎细胞改变了确定在所需亚群中的细胞，且其中所得到的经处理的细胞群具有的所需亚群中未被改变的细胞与所需亚群中的细胞总数之比小于或等于50%。

Claims (36)

1.一种从包括第一组细胞和第二组细胞的细胞群中选择第一组细胞的方法，所述方法包括：

对所述细胞群进行标记，以便可以区分所述第一组细胞与所述第二组细胞；

提供具有远端、近端、设置在所述近端与所述远端之间的询问区、和流动轴的第一流径；

产生通过所述第一流径的鞘液的鞘流，所述鞘流以第一流速朝所述近端移动；

在所述近端上游点处将包括细胞群的样本流注入所述鞘流，所述样本流具有低于所述第一流速的初始第二流速；

提供激发能量源，当个体细胞经过询问区时，由所述激发能量源发出的能量作用于个体细胞，并引起自所述细胞发出或传输二次辐射；

当所述细胞经过所述询问区时，使用具有与所述流动轴同轴对准的光轴的物镜聚焦自所述个体细胞的二次辐射；

检测自所述个体细胞的聚焦二次辐射；

由检测的二次辐射确定所述个体细胞是在所述第一组还是在所述第二组；以及

选择确定在所述第一组的细胞，

其中所述细胞来自非人的哺乳动物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中选择确定在所述第一组的细胞包括对不是确定在所述第一组的细胞进行杀死、破坏、修饰、分裂或破碎。

3.根据权利要求1所述的方法，其中选择确定在所述第一组的细胞包括：

由喷嘴喷射细胞流；

由所述流产生许多液滴；

对所述液滴选择性地施加电荷；

以及根据每个液滴的电荷对所述液滴进行分选。

4.根据权利要求1所述的方法，其中由所述激发能量源发出的能量穿过所述物镜。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞是精细胞，且进一步地，其中所述第一组细胞包括带有X染色体的细胞或带有Y染色体的细胞。

6.根据权利要求1所述的方法，其中选择确定在所述第一组的细胞包括使用区别能量源照射不是确定在所述第一组的细胞，所述区别能量源是激光器。

7.根据权利要求6所述的方法，其中由所述区别能量源发出的能量穿过所述物镜。

8.根据权利要求7所述的方法，进一步包括：

选择所述区别能量源的波长、所述第一流速、所述第二流速和所述物镜的组合，使得所述物镜的标称焦点与所述区别能量源的标称焦点隔开一定的距离，所述距离是在检测所述聚焦二次辐射与使用所述区别能量源照射不是确定不在所述第一组的细胞的过程之间所述个体细胞所经过的所述流径的距离。

9.根据权利要求1所述的方法，进一步包括提供垂直于所述流动轴并设置在所述第一流径的近端的第二流径，使得所述细胞在经过所述询问区并到达所述第一流径的近端后进入所述第二流径并远离所述询问区。

10.根据权利要求1所述的方法，其中提供流径进一步包括提供由折射率范围在1.30-1.40的材料形成的流径。

11.根据权利要求1所述的方法，进一步包括调整含所述细胞群的溶液的折射率，使得所述溶液的折射率与形成所述第一流径的材料的折射率相差在0.02以内。

12.一种用于检测和选择性地改变样本细胞群中的所需细胞亚群的装置，所述装置包括：

流体流径，具有：

具有流动轴的第一流动部分，和

第二流动部分，

所述第一与所述第二流动部分在所述第一流动部分的测量端相交；

设置在所述第一流动部分的测量端或其附近的询问区；

以流体流动的方式与所述流体流径连通的鞘液输入端；

以流体流动的方式与所述流体流径连通的样本输入端；

具有标称焦点和光轴并设置在所述第一流动部分的测量端的物镜，所述物镜对准所述第一流动部分，使所述标称焦点沿着所述流动轴且在所述询问区，并且使所述光轴与所述流动轴同轴对准；

设置检测由所述物镜聚焦的光的检测器；

与所述检测器通信连接的逻辑程序，可操作所述逻辑程序以确定所述样本细胞群中的细胞是否属于所需细胞亚群，并且可进一步操作所述逻辑程序以根据对所述细胞是否属于所需细胞亚群的确定来输出信号；和

可控能量源，所述可控能量源与所述逻辑程序通信连接，并且可操作所述可控能量源以根据至少由所述逻辑程序输出的信号选择性地改变所需细胞亚群中的细胞或不在所需细胞亚群中的细胞。

13.根据权利要求12所述的装置，其中所述可控能量源通过对不是确定在所需亚群中的一个或多个细胞进行杀死、破坏、修饰、分裂或破碎来选择性地改变细胞。

14.根据权利要求12所述的装置，还包括激发能量源，且其中由所述激发源发出的能量穿过所述物镜。

15.根据权利要求14所述的装置，其中所述激发能量源包括具有作为输入端的可控能量源的衰减器。

16.根据权利要求12所述的装置，其中由所述可控能量源发出的能量穿过所述物镜。

17.根据权利要求12所述的装置，还包括在其中形成所述流径的主体。

18.根据权利要求17所述的装置，还包括在所述主体的第一表面形成所述第二流动部分的槽，其中所述第一流动部分的测量端与所述槽相交于所述第一表面。

19.根据权利要求17所述的装置，还包括：

通过所述主体的第一内部通道，其从所述主体的第一表面延伸至所述主体内的一点并形成所述第一流动部分；和

通过所述主体的第二内部通道，其从所述主体内的所述点延伸至所述主体的第二表面。

20.根据权利要求17所述的装置，其中所述主体由折射率为1.30-1.40的材料形成。

21.根据权利要求20所述的装置，其中所述材料包括无定形全氟聚合物、无定形氟聚合物或全氟烷氧基聚合物。

22.根据权利要求12所述的装置，其中所述物镜是水浸透镜或者是水蘸透镜。

23.根据权利要求12所述的装置，其中所述样本细胞群包括精细胞，且其中所需细胞群包括带有X染色体的细胞或带有Y染色体的细胞。

24.一种用于检测和选择性地改变样本细胞群中的所需细胞亚群的装置，所述装置包括：

具有流动轴的流体流径；

设置在所述流体流径内的询问区；

以流体流动的方式与所述流体流径连通的鞘液输入端；

以流体流动的方式与所述鞘液输入端连通的第一泵；

以流体流动的方式与所述流体流径连通的样本流体输入端；

以流体流动的方式与所述样本流体输入端连通的第二泵；

物镜，具有标称焦点和光轴，并设置成使所述标称焦点沿着所述流动轴并在所述询问区，且使所述光轴在所述询问区与所述流动轴同轴对准；

设置检测由所述物镜聚焦的光的检测器；

可控能量源；

与计算机可读存储介质、所述检测器和所述可控能量源通信连接的处理器；且

其中所述处理器和所述可控能量源配合，根据所述处理器的输出选择性地改变所需细胞亚群中的细胞或不在所需细胞亚群中的细胞。

25.根据权利要求24所述的装置，进一步地，其中所述处理器和所述可控能量源合作，通过对不是确定在所需细胞亚群中的一个或多个细胞进行杀死、破坏、修饰、分裂或破碎来选择性地改变所需细胞亚群中的细胞。

26.根据权利要求24所述的装置，其中由所述可控能量源发出的能量穿过所述物镜。

27.根据权利要求24所述的装置，还包括由折射率为1.30-1.40的材料形成的主体。

28.根据权利要求24所述的装置，其中所述样本细胞群包括精细胞，且其中所需亚群是带有X染色体的细胞或带有Y染色体的细胞。

29.一种用于检测和选择性地改变样本细胞群中的所需细胞亚群的方法，所述方法包括：

产生携带通常为单行前进的样本细胞通过流径的流动；

当所述样本细胞在所述流径中经过询问区时照射所述样本细胞；

定位物镜，使得：

所述物镜的光轴与所述流径同轴，流束通过所述流径向所述物镜移动，且所述物镜具有在所述询问区中的标称焦点；

当所述样本细胞经过所述询问区时检测个体样本细胞的参数；

解释检测到的所述个体样本细胞的参数以确定所述个体样本细胞是否属于所需亚群；

根据对所述个体样本细胞是否属于所需细胞亚群的确定对一个或多个所述样本细胞群进行选择性的杀死、破坏、修饰、分裂或破碎；以及

收集所得到的经处理的细胞群，

其中所述细胞来自非人的哺乳动物。

30.根据权利要求29所述的方法：

其中所述样本细胞群包括精细胞；

其中所需细胞亚群包括具有X染色体的细胞或具有Y染色体的细胞；且

其中当所述样本细胞经过所述询问区时检测所述个体样本细胞的参数包括当所述细胞经过所述询问区时每秒钟检测超过40,000个样本细胞的参数。

31.根据权利要求29所述的方法，其中当所述样本细胞经过所述询问区时检测所述个体样本细胞的参数包括当所述细胞经过所述询问区时每秒钟检测超过75,000个样本细胞的参数。

32.根据权利要求29所述的方法，其中当所述样本细胞经过所述询问区时检测所述个体样本细胞的参数包括当所述细胞经过所述询问区时每秒钟检测超过100,000个样本细胞的参数。

33.根据权利要求29所述的方法，其中选择性地杀死、破坏、修饰、分裂或破碎所述细胞并不改变确定在所需亚群中的细胞，且其中所得到的经处理的细胞群具有的所需细胞亚群中的细胞与未被改变的细胞总数之比大于或等于60%。

34.根据权利要求29所述的方法，其中选择性地杀死、破坏、修饰、分裂或破碎所述细胞改变了确定在所需亚群中的细胞，且其中所得到的经处理的细胞群具有的所需细胞亚群中的细胞与被改变的细胞总数之比大于或等于60%。

35.根据权利要求29所述的方法，其中选择性地杀死、破坏、修饰、分裂或破碎所述细胞并不改变确定在所需亚群中的细胞，且其中所得到的经处理的细胞群具有的所需亚群中被改变的细胞与所需亚群中的细胞总数之比小于或等于50%。

36.根据权利要求29所述的方法，其中选择性地杀死、破坏、修饰、分裂或破碎所述细胞改变了确定在所需亚群中的细胞，且其中所得到的经处理的细胞群具有的所需亚群中未被改变的细胞与所需亚群中的细胞总数之比小于或等于50%。