MXPA99008715A - Sistema dirigido para remover celulas tumorales de poblaciones celulares - Google Patents

Abstract

Se presenta un método para remover células tumorales que contaminan desde una población celular. Este método incluye etiquetar células tumorales individuales en la población y luego destruirlas con un haz de láser, de alta energía. El láser se enfoca de modo que destruya específicamente las células tumorales identificadas, pero no las células remanentes en la población.

Description

SISTEMA DIRIGIDO PARA REMOVER CÉLULAS TUMORALES DE POBLACIONES CELULARES ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Campo de la Invención Esta invención se refiere a métodos y aparatos para aislar específicamente células tumorales desde poblaciones de células no tumorales. En particular, esta invención se refiere a métodos y aparatos para etiquetar específicamente y en seguida matar individualmente células tumorales con un haz enfocado de alta energía, tal como un haz láser.

Descripción de la Técnica Relacionada El transplante de células de estirpe hematopoiética es una terapia que crece rápidamente en todo el mundo. Las células de estirpe hematopoiética son células que residen en la médula del hueso y llevan a la producción de todas las células de la sangre del cuerpo. En 1995, se realizaron más de veinte mil trasplantes de células de estirpe hematopoiética en los Estados Unidos de América. En particular, el tratamiento del cáncer del pecho con el transplante de células autólogas de estirpe hematopoiética ha llegado a ser una terapia del cáncer ampliamente usada. La metástasis de tumores es un proceso bien conocido, por el cual las células tumorales dejan su ubicación inicial y se extienden a otras partes del cuerpo. Una vez transportadas a un nuevo sitio, las células tumorales comienzan a crecer y poblar este nuevo sitio, creando así un nuevo tumor. Un tratamiento de pacientes con tumores metastáticos implica recoger sus células de estirpe hematopoiética y luego tratar al paciente con altas dosis de radioterapia o quimioterapia. Este tratamiento se diseña para destruir toas las células tumorales de los pacientes, pero tiene el efecto secundario de también destruir sus células hematopoiéticas . Así, una vez que el paciente ha sido tratado, las células de estirpe autóloga se regresan a su cuerpo . Sin embargo, si las células tumorales se han metastasiado alejadas del sitio primario del tumor, existe una alta probabilidad que algunas células tumorales contaminen la población celular hematopoiética recogida. En tal caso, las células de estirpe hematopoiética recogidas incluyen células tumorales que contaminan. Es importante encontrar un mecanismo para matar todas las células tumorales metastasiadas antes de reintroducir las células de estirpe al paciente. Si cualquier célula tumorigénica viva es introducida en el paciente, ella puede conducir a una recaída de este paciente. El problema de remover las células tumorales de las células hematopoiéticas, se ha informado durante los procedimientos tradicionales de recoger la médula del hueso (Campana, D. et al . , Detección de enfermedad residual mínima en leucemia aguda: avances metodológicos y significado clínico, Blood, 15 de marzo de 1995, 85(6): 1416-34). Problemas similares son también encontrados cuando se intentan remover células tumorales con el método más reciente de, leucoféresis de las células de la sangre periférica movilizada (Brugger, W. et al., Movilización de células tumorales y células progenitoras hematopoiéticas en la sangre periférica de pacientes con tumores sólidos. Blood, 83(3): 636-40, 1994) . En cada uno de estos procedimientos, el número de células tumorales que contaminan varían de aproximadamente 10 a 5000 células tumorales por cuatro millones de células recogidas mononucleares, dependiendo del régimen de drogas quimio-terapéuticas usado para la movilización. Las células mononucleares se obtienen por la centrifugación de gradiente de densidad continua de todas las células hematopoiéticas recogidas. El número total de células mononucleares recogidas de un paciente es normalmente del orden de 10,000 millones de células. Así, la carga total del tumor en las células recogidas varía de un límite inferior de aproximadamente 25 mil células a un límite superior de aproximadamente 12 millones de células. Esta contaminación de células tumorales se ha mostrado por el marcado genético para contribuir a la reincidencia del tumor (Rill, ER et al., Demostración Directa que el Transplante Autológo de la Médula Ósea en Tumores Sólidos. Puede Regresar a una Multiplicidad de Células Tumorigénicas . Blood, 84(2): 380-383, 1994). Así, existe una gran necesidad para métodos eficientes para remover todas las células tumorales desde un transplante de células hematopoiéticas (Gulati, SC et al., Razón para la depuración en el transplante de células de estirpe autólogas, Journal of Hematotherapy , 2(4):467-71, 1993). Un método rápido y confiable para remover todas las células de tumores que contaminan mejoraría la eficacia del transplante de células de estirpe hematopoiética para un creciente número de pacientes. Otros han intentado remover las células tumorales que contaminan de las células de estirpe hematopoiética recogidas, pero han tenido un éxito limitado. Varios métodos para depurar las poblaciones de células tumorales alejadas de las células de estirpe recogidas se han propuesto y probado (A. Gee, Editor, Proceso y Depuración de la Médula del Hueso, Parte 5, CRC Press, Boca Ratón, Florida, 1991) . Así, la idea fundamental de todos estos métodos de depuración es separar o destruir las células malignas, mientras se preservan las células de estirpe hematopoiética, que son necesarias para la reconstitución hematopoiética en el paciente del transplante. Algunas compañías y médicos han intentado depurar las células malignas en alejamiento de las poblaciones de células no tumorales, usando una selección basada en los glóbulos de inmunoafinidad. En este procedimiento, la población total de células se pone en contacto con los glóbulos de inmunoafinidad. Por ejemplo, para aislar células tumorales de células hematopoiéticas, una primera selección CD34 (positiva) aisla las células hematopoiéticas de células tumorales. La unión de los anticuerpos anti-CD34 específicos de las células hematopoiéticas a los glóbulos de inmunoafinidad, permite que el médico remueva específicamente estas células de poblaciones de células no hematopoiéticas. En algunos casos, también se realiza una selección basada en glóbulos de inmunoafinidad negativa en marcadores de células tumorales o epiteliales, por conjugar los anticuerpos específicos de tumor a los glóbulos. Otro método ha sido tratado para remover células tumorales de células no tumorales que implica la inmunoconjugación de un agente tóxico a un anticuerpo que tiene especificidad para sólo células tumorales. En este sistema, los anticuerpos se unen a los agentes quimiotóxicos, toxinas o radionucléidos y luego se ponen en contacto con la población celular recogida. Desafortunadamente, no todas las células de tumores se matan por este tratamiento.

Otros sistemas para aislar células tumorales de poblaciones de células no tumorales, han usado las características de unión no específicas de las células hematopoiéticas como una base de la separación. , Por ejemplo, Dooley et al, usaron estas características adhesivas para aislar células hematopoiéticas con filtración de lecho profundo (Dooley DC et al., Una novedosa técnica barata para la remoción de células del cáncer del pecho de los productos celulares de estirpe sanguínea periféricas movilizadas, Blood. 88(10) Supl. 1: 252a, 1916). Sin embargo, algunas de las células tumorales se encontró se aislan con las células hematopoiéticas, abriendo así la puerta para una recaída potencial del paciente. Además, los agentes citotóxicos, tal como la 4-hidroxi-peroxi-ciclo-fosfamida (4HC) , se han usado para matar selectivamente células tumorales sin dañar las células de estirpe hematopoiética. Desafortunadamente, este sistema también lleva a cosechas menores de células hematopoiéticas, debido a que los agentes citotóxicos debilitan o destruyen algunas de las células no tumorales.

En otros métodos, los agentes sensibilizadores, tal como la merocianina, se mezclaron con las poblaciones celulares, que fueron después foto-irradiadas para matar específicamente las células tumorales (Lydaki et al., Fotoirradiación mediada por Merocianina 540 de células leucémicas, Journal of Photochemistry and Photobiology 32(1-2):27-32, 1966). También Gazitt et al., usaron la clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) para separar las células de estirpe hematopoiética de las células tumorales. (Gazitt et al., Las células de estirpe CD34 + Lin- Thy+ no contienen células de mieloma clónales Blood 88(1) : 381-389, 1995) . Como se conoce, la citometría del flujo clasifica células, una a la vez, y separa físicamente un conjunto de células etiquetadas de otro segundo conjunto de células. Sin embargo, se ha mostrado que neuronas individuales pueden ser destruidos después de cargarlos con tintes adsorbentes, usados en la citometría de flujo (Miller, JP y Selverston AI., Destrucción rápida de neuronas sencillas por irradiación de tintes inyectados intracelularmente , Science 206: 702-704, 1979) . Así, el uso de la FACS para separar poblaciones celulares no es ventajoso debido a que los rendimientos celulares pueden ser muy bajos En otro protocolo, Clarke et al., revelaron el uso de la transferencia, mediada por adenovirus, de genes suicidas, para matar selectivamente células de tumores (Clarke et al., Un adenovirus bcl-x s recombinante induce selectivamente apoptosis en células del cáncer, pero no en células normales de la médula del hueso Proc . Nat . Acad. 92 (24 ) : 11024-B, 1995). Sin embargo, la mayoría de los métodos listados anteriormente se basan en la administración la estrategia de separación o destrucción de las células tumorales, con base en la población completa. Desafortunadamente, los métodos de depuración de células tumorales de la población completa, listados anteriormente, no matan o remueven todas las células tumorales que contaminan de la población celular de estirpe recogida. En el mejor caso, la carga residual de células tumorales permanece en 1 a 10 células por cada 100,000 células presentes en la cosecha inicial (Lazarus et al . , ¿La depuración de la médula del hueso in vi tro mej ora el efecto después del transplante de médula ósea análogo? Journal of Hematotherapy , 2(4):457-55, 1993). Por lo tanto, aún usando las mejores técnicas disponibles, el número de células tumorales residuales que son reintroducidas en el paciente durante el transplante de células de estirpe autólogas es del orden de 10 a 2000 células . Dado el crecimiento exponencial de las células de tumores, tales células tumorales residuales en el transplante puede llevar fácilmente a una recaída del paciente. Aún otro método que utiliza la tecnología del láser se describe en la patente de EUA número 4,395,397, de Shapiro. En el método de Shapiro, las células etiquetadas son colocadas en un citómetro de flujo, que tiene un detector de fluorescencia, para identificar las células tumorales etiquetadas. Un haz de láser se usa para matar las células etiquetadas, conforme ellas pasan por el detector. Este método tiene un número de desventajas. Primeramente, una vez que una célula no deseada ha pasado a través del detector/región láser, no hay manera de comprobar si esa destrucción ha tenido un éxito completo. Si la célula de tumor evade la destrucción, inevitablemente será reintroducida en el paciente. Segundo, el diámetro de la zona focal _jdel haz de láser es de necesidad mayor que la sección transversal de la corriente de líquido. Por lo tanto, muchas de las células en la región de una célula no deseada serán destruidas por el haz de láser, incluyendo células saludables . Otro método que utiliza la tecnología de láser se describe en la patente de EUA número 5,035,693 de Kratzer. En este método, las poblaciones de células etiquetadas se colocan sobre una banda móvil. En seguida las células etiquetadas son identificadas por un detector y destruidas por un láser. Sin embargo, este sistema tiene muchas de las mismas desventajas como el método de Shapiro. Por ejemplo, debido a que las células se mueven sobre una banda pasando el detector en una dirección, el método no es reversible. Así, si una sola célula tumoral escapa la detección, ella será reintroducida en el paciente. Por lo tanto, a pesar de los esfuerzos extensos y muchos acercamientos novedosos, existe una gran necesidad creciente para métodos y sistemas para erradicar virtualmente cada célula tumoral desde una población celular recogida. El sistema y método aquí descritos, cumplen con esta necesidad.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Esta invención suministra un sistema y método dirigidos para identificar y destruir individualmente células tumorales que contaminan una población celular. El uso del sistema de la presente invención virtualmente, cada célula de _ tumor se puede identificar y destruir individualmente. Así, el transplante de células hematopoiéticas autólogas y técnicas médicas similares, se puede llevar a cabo sin reintroducir cualquier célula tumoral que contamine . Las células tumorales se pueden identificar con la invención descrita con el uso de varios acercamientos. Una modalidad incluye un método de etiquetación no destructivo, así que todas las células tumorales viables se pueden distinguir bajo el microscopio de las células no tumorales. En esta modalidad, el anticuerpo conjugado de fluorocromo, específico del tumor, puede ser usado para marcar específicamente cada célula de tumor, sin marcar cualquier célula hematopoiética. Las células tumorales etiquetadas son luego identificadas microscópicamente dentro de la población de células no tumorales. Un haz láser estrecho, de alta potencia, es luego enfocado en cada una de las células tumorales identificadas y se entrega un pulso breve de luz letal . La siguiente célula de tumor es luego identificada y destruida, etc., hasta que cada célula marcada es destruida. En otra modalidad, un anticuerpo, el cual se une selectivamente a las células hematopoiéticas, pero no a las células de tumor, se usa para identificar las células de estirpe hematopoiética. Todas las células tumorales (por ejemplo, aquéllas que no llevan la etiqueta) se identifican y después de destruyen con un haz láser estrecho, de alta potencia. Aún otra modalidad se refiere a un método para eliminar células tumorales desde una población de células, que incluye células no tumorales, este método comprende las etapas de: a) etiquetar la población de células, de modo que las células tumorales puedan ser distinguidas de las células no tumorales; b) ubicar una de las células tumorales con referencia a la etiqueta; y c) matar las células tumorales, aplicando un pulso desde una fuente de energía controlada a la célula de tumor localizada. Una modalidad adicional e refiere a un método para enriquecer el número de células de estirpe en una población de células hematopoiéticas, que incluye: a) etiquetar la población de células hematopoiéticas con una etiqueta específica de células de estirpe; y b) aplicar un pulso de luz láser, de alta energía, a cuando menos una de las células no etiquetadas en la población. Aún otra modalidad se refiere a un método para preparar células hematopoiéticas aisladas para la reintroducción en un paciente, que incluye: a) etiquetar células tumorales dentro de las células hematopoiéticas aisladas con una etiqueta específica de célula tumoral; y b) aplicar un pulso de luz láser, de alta energía, a cuando menos una de las células etiquetadas en la población. Otra modalidad de la invención es un método ip vi tro para asegurar que una primera población de células haya sido eliminada desde una segunda población de células, este método comprende: etiquetar la primera población de células, así que esta primera población de células se pueda distinguir de la segunda población de células; la colocación de la primera población y la segunda población de células es en una posición estacionaria sobre una superficie; ubicar una célula en la primera población de células, con referencia a la etiqueta; aplicar un primer pulso de una fuente de energía controlada a una célula; determinar si esta primera célula fue destruida por el primer pulso; y aplicar un segundo pulso desde una fuente de energía controlada, si la primera célula no fue destruida. Una modalidad más de la invención se refiere a un método para eliminar células tumorales desde dentro de una población celular, que incluye células no tumorales. Este método incluye las etapas de: etiquetar las células no tumorales, de manera que estas células no tumorales se puedan distinguir de las células tumorales; ubicar una de las células tumorales identificando una célula no etiquetada en la población celular; y destruir la célula tumoral, aplicando un pulso desde una fuente de energía controlada a la célula tumoral localizada, mientras esta célula tumoral está en una posición substancialmente estacionaria sobre una superficie.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 es un diagrama de una modalidad de un sistema automático para dirigirse específicamente a células etiquetadas. El sistema incluye una computadora, una cámara, una fuente de luz de banda ancha y un láser. La Figura 2 es un diagrama de otra modalidad de un sistema automático, para dirigirse específicamente y destruir células etiquetadas .

DESCRIPCIÓN DETALLADA Se suministra un método de dirección para remover células tumorales que contaminan de una población de células no tumorales. Como se discutió antes, este método se refiere a procedimientos médicos, por los cuales las poblaciones de células se remueven y luego se reintroducen en los pacientes como parte de un régimen terapéutico. En general, el método dirigido emplea primero una etiqueta que actúa como un marcador para identificar microscópicamente y ubicar las células tumorales que contaminan. El marcador celular escogido puede ser cualquier etiqueta que identifique y discrimine una célula tumoral contaminada, que resida dentro de una población de células no tumorales. Por ejemplo, los anticuerpos anti-tumorales, que se conjugan a un fluorocromo, se pueden usar como etiquetas específicas (véase el Capítulo 10 en A. Gee, Editor, Procedimiento y Depuración de la Médula del Hueso, Parte 5, CRC Press, Boca Ratón, Florida, 1991) . Numerosos marcadores específicos de tumores se han encontrado en una amplia variedad de células tumorigénicas . Por ejemplo, muchos marcadores de superficie que son específicos a las células epiteliales se han encontrado en las células del cáncer del pecho que contaminan en las poblaciones celulares hematopoiéticas recogidas . Tales anticuerpos se pueden usar para identificar las células del cáncer del pecho dentro de poblaciones de células hematopoiéticas y, por lo tanto, se dirigen para la entrega a de un pulso de energía letal . Similarmente, otros anticuerpos conjugados de fluorocromo, específicos de tumores, pueden ser usados para identificar otros tipos de células tumorales que contaminan. Se debe notar que si no están disponibles marcadores específicos para la población celular de tumores, el método puede ser llevado a cabo en una manera 'inversa'. Los marcadores específicos para la población celular no tumoral se pueden usar para identificar esas células que no son tumorigénicas. Por ejemplo, en poblaciones celulares hematopoiéticas, el marcador celular CD34 puede ser usado para teñir solamente las células hematopoiéticas, pero no las células tumorales no hematopoiéticas. Cualquier célula que no tenga el marcador es luego destruida por la entrega del pulso de energía enfocado. La población celular viable remanente contendrá solamente las células que poseían el marcador celular (por ejemplo el CD34) . Después de identificar las células tumorales, una fuente de energía controlada, tal como un láser, luz no láser colimada o enfocada, energía de RF, partículas aceleradas, energía ultrasónica enfocada, haces de electrones u otros haces de radiación, se usan para entregar un pulso objetivo de energía letal, que destruye individualmente cada célula tumoral. Debido a que las células tumorales pueden ser específica y únicamente identificadas dentro de una población de células no tumorales, el método puede ser útil para erradicar por completo justamente las células tumorales que contaminan. En una modalidad del método dirigido, las células tumorales son destruidas por la iluminación simultánea de fluorescencia y láser. En una primera etapa, la población celular es teñida con un tinte fluorescente, que es específico a las células tumorales. Por ejemplo, los anticuerpos que son específicos para células tumorales y conjugados a moléculas fluorescentes pueden ser usados en esta modalidad. La población celular es luego iluminada por una luz apropiada (por ejemplo, luz ultravioleta) de manera que las células tumorales fluorescentes puedan ser identificadas dentro de la población de células no tumorales . Las células etiquetadas son luego colocadas en un platillo de Petri y dentro del sistema. Si el sistema está en un modo automático, una luz fluorescente es iluminada y una cámara CCD comienza a tomar fotografías de video de las células en el platillo. Un programa de computadora que opera en la computadora adjunta comienza a analizar las fotografías e identificar cada una de las células fluorescentes . Cada célula es dirigida y destruida con un haz láser. La computadora confirma que cada célula es destruida, notando el cambio en la fluorescencia antes y después que el láser se haya activado. En otra modalidad, las células que contaminan en las biopsias se remueven de los pacientes del cáncer. El establecimiento ip ví tro de las líneas celulares primarias de tumores humanos de muchos tipos de tumores, se complican por la presencia de las poblaciones celulares primarias que contaminan, que tienen características superiores del crecimiento in vi tro sobre las células tumorales. Por ejemplo, los fibroblastos que contaminan representan un mayor reto en establecer muchas líneas celulares del cáncer. El sistema revelado puede ser usado para etiquetar particularmente y destruir las células que contaminan, mientras dejan las células tumorales de la biopsia intactas. Por lo tanto, las células primarias más agresivas no alcanzarán y destruirán la línea celular del cáncer.

En una solicitud relacionada, el presente sistema se puede usar para remover las células que contaminan en inóculos para tejidos diseñados y aplicaciones de terapia de células. Los problemas de contaminación celular existen en el establecimiento de cultivos celulares primarios para aplicaciones de diseño de tejidos y en la realización de terapias celulares. En particular, las terapias de condrocitos para defectos del cartílago son dañadas por impurezas en las poblaciones celulares derivadas de biopsias de cartílagos. Por lo tanto, el presente sistema puede ser usado para remover específicamente estos tipos de células de los inóculos. Por ejemplo, una biopsia de cartílago puede ser tomada y la muestra crecida bajo condiciones convencionales. El cultivo que crece es luego teñido con una etiqueta específica para las células que contaminan. Toda la población celular es luego colocada dentro del sistema descrito abajo y las células etiquetadas que contaminan son destruidas . En otra modalidad, el riesgo significante y la severidad de la Enfermedad del Huésped Versus Injerto (GVHD) en el establecimiento del transplante Celular de Linaje Humano alogénico (HSC) puede ser combatido. Usando el sistema aquí descrito, es posible definir y controla el contenido de células T del paciente. Este tipo de control es particularmente difícil con la tecnología existente, debido al sobre-agotamiento de las células T resulta en la pérdida del efecto de leucemia versus el injerto, benéfico, conocido, que es observado en transplantes alogénicos. Así, algún nivel de las células T es benéfico al paciente con el fin de atacar, por ejemplo, las células de leucemia. Sin embargo, un nivel de células T demasiado alto, lleva a ataques del sistema inmunológico general en los tejidos del receptor. El presente sistema y métodos son capaces de controlar con precisión el número de células T en cualquier transplante alogénico. Una modalidad del sistema objetivo automático 10 se ilustra en la Figura 1. Un sistema 12 de computadora comunica a través de un cable 14 a una cámara 16. El sistema de computadora puede ser cualquier computadora disponible comercialmente, que pueda recibir y analizar datos de video. Un ejemplo de tal sistema de computadora es una computadora Intel Pentium Pro, que opera el software (programa) de Microsoft Windows 95. Aunque una cámara de video se ilustra en la modalidad de la Figura 1, la cámara 16 puede ser cualquier tipo de agrupamiento de imágenes, conocido por los expertos en la materia. La cámara 10 se monta sobre un soporte 20, así que se mantiene en una orientación generalmente vertical con respecto al suelo. El lente 22 de la cámara 16 se diseña para corresponder con un microscopio 24, a través de un ocular 26 al lente 22 de la cámara 16. Esta cámara 16 transmite las imágenes que captura a la computadora 12 a través del cable 14. De esta manera, la computadora 12 captura y analiza cualquier imagen que se presenta al microscopio. Por ejemplo, el microscopio 24 puede ser enfocado sobre las células en un platillo 30. Las imágenes de las células serán transmitidas desde el microscopio 24 a la cámara 16, y finalmente serán enviadas a la computadora 12. Esta computadora 12 puede luego operar el software para analizar las imágenes que se capturan.

La computadora 12 está también en comunicación a través de un segundo cable 32 a un láser 34. Este láser se monta a un dispositivo giratorio 36, controlado electrónicamente, de modo que su posición en relación con el soporte 20 pueda ser alterada por recibir señales desde la computadora 12. Como se muestra, el láser 34 puede ser ajustado para ayudar a un haz de luz a través de la óptica del microscopio 24, mientas la célula objetivo está substancialmente estacionaria. Además, el láser 34 puede girar para enviar un haz de luz directamente al platillo 30. En el contexto de la presente invención, el término de "platillo" tiene un amplio significado. Intenta abarcar cualquier superficie capaz de retener una capa delgada de fluido, tal como un medio celular. El platillo puede incorporar o estar asociado con el aparato de enfriamiento para mantener el fluido del platillo debajo de la temperatura ambiente, durante la operación de los métodos aquí descritos. Puede también ser conveniente, pero no esencial, cubrir la superficie del fluido con una atmósfera inerte, tal como el nitrógeno o argón.

Aunque la modalidad ilustrada en la Figura 1 incluye un dispositivo de giro 36, controlado electrónicamente, para dirigir el láser, otros métodos se anticipan. Por ejemplo, un espejo controlado electrónicamente puede ser colocado entre el láser y su objetivo, así que la rotación del espejo se usa para dirigir el láser. Otros mecanismos para dirigir un rayo láser, tal como divisores de haces, espejos o prismas, que se conocen en la técnica, se incluyen dentro del ámbito de la invención. Una fuente 40 de luz, de banda ancha, está también en comunicación con el microscopio 24 a través de un adaptador 42. Este adaptador 42 permite que las emisiones de luz desde la fuente de luz de banda ancha iluminen las células que se colocan en el platillo 30. Las fuentes de luz de banda ancha son bien conocidas en la técnica, y muchos diferentes tipos pueden ser colocados dentro del sistema objetivo automático 10 para iluminar células etiquetadas que se colocan sobre el platillo o disco 30. Debajo y soportando el platillo 30, está una charola móvil 48, controlada por computadora. Esta computadora 12 puede enviar señales a lo largo de un cable 49 de comunicación, que causa que la charola 48 cambie su posición con relación al láser 34 y el microscopio 24. Así, para células objetivo específicamente, la computadora 12 puede enviar señales a lo largo del cable 49 a la charola 48, que causan que el platillo 30 sea rodado en una posición particular. Calculando la posición correcta, el láser puede ser dirigido hacia una célula particular, moviendo el platillo 30 en una posición escogida. Las coordenadas de la posición escogida se pueden determinar por la computadora 12 del análisis de las imágenes celulares, que son agrupadas desde la cámara 16. El software que es operado en la computadora 12 captura las imágenes que se transmiten a través del cable 14 desde la cámara 16. Si un conjunto de células etiquetadas se coloca en el platillo 30, entonces la cámara 16 registrará una fotografía de las células etiquetadas. Como se discutió antes, las células pueden ser iluminadas con la fuente de luz 40 de banda ancha. Sobreponiendo una rejilla de dos dimensiones en la parte superior de la fotografía capturada por la computadora, el software puede determinar las coordenadas X/Y de las células, que se etiquetan mirando las zonas obscuras que tienen un ancho de célula de diámetro. El software luego calcula las coordenadas Cartesianas de las células etiquetadas y dirige específicamente el láser 34 a esas coordenadas. Emitiendo un pulso corto, de alta energía, el láser puede destruir selectivamente cada una de las células etiquetadas y no dañar las células no etiquetadas. El sistema de computadora 12 puede también tener sensores que detectan señales fluorescentes desde las células tumorales teñidas y luego calcula la posición de coordenadas de la primera célula tumoral por destruir. El sistema de computadora luego se dirige a una fuente de energía enfocada, tal como un haz de láser o electrónico, en la posición calculada de la primera célula tumoral. La célula tumofal objetivo es así destruida específicamente dentro de la población celular no tumoral . Esto se facilita por el hecho que la célula objetivo es substancialmente estacionaria durante el procedimiento. En otro sistema ejemplar, las células se montan para el movimiento sobre una tabla de X-Y controlada por computadora, bajo un microscopio acoplado con una cámara digital CCD. El láser es montado al microscopio de modo que se dirija en una ubicación fija específica dentro del campo de visión. La computadora luego rastrea continuamente a través de la primera hilera de células en la dirección X hasta que se visualiza la célula tumoral teñida. La computadora luego se mueve en la tabla X-Y hasta que la célula del tumor está en el área objetivo del láser; este láser es pulsado para destruir la célula; luego la tabla X-Y se regresa a la posición previa y se mueve a lo largo de la dirección X hasta que es rastreada una primer hilera y todas las células dentro de esa hilera son destruidas. La tabla X-Y luego se mueve en la dirección Y hasta que una segunda hilera es visualizada, que traslapa la primera hilera por unas cuantas células . La tabla es luego movida en la dirección X, las células tumorales son destruidas como antes, y el procedimiento se repite hasta que toda la población celular se ha explorado. Preferiblemente, el software de la computadora identifica automáticamente los objetivos celulares. Sin embargo también se considera que un dispositivo indicador, controlado por el operador (por ejemplo, una bola de seguimiento, palanca de mando o ratón, pueden ser usados para localizar y marcar células tumorales en la pantalla de exhibición y/o controlar el movimiento de la tabla X-Y. Por supuesto, muchas variaciones del sistema de control de la computadora son posible, que incluyen métodos alternativos de explorar las células y el movimiento del láser con relación al microscopio (por ejemplo en la dirección Y únicamente, o cualquiera dentro del campo) . También se considera que el platillo/mesa pueden permanecer estacionarios substancialmente y la combinación de microscopio/láser se pueden mover a las células etiquetadas objetivo. Por ejemplo, la cabeza del microscopio y el sistema objetivo de láser se pueden mover, mientras el matraz o platillo de Petri que mantiene las células es estacionario sobre una superficie. Adicionalmente, el sistema láser puede ser activado desde cualquiera de o arriba de la población celular. Debido a que el sistema objetivo se enfoca a través de un microscopio, el haz de láser puede ser dirigido a diferentes planos focales. Así, las células que se ubican en diferentes alturas verticales pueden ser destruidas específicamente dirigiendo el haz de láser a varios planos focales. Por ejemplo, una vez que la computadora, a través de un detector, ha identificado una célula en coordenadas particulares X e Y, el láser puede ser activado en varios planos focales en estas coordenadas. Esto asegura que la célula, no importa dónde se ubique en el plano vertical, sea destruida por el láser. Toda la población de células tumorales puede ser destruida automáticamente repitiendo este procedimiento dirigido para cualquier célula tumoral en la población. El procedimiento de etiquetar, identificar y destruir cada célula tumoral puede también ser llevado a cabo manualmente, por lo cual cada célula tumoral etiquetada es identificada microscópicamente por un operador y el haz láser es luego enfocado por el operador sobre las células tumorales iluminadas. Un sistema combinador de láser/microscopio que permite la dirección manual de las células, está disponible de Photonic Instruments (Arlington Heights, IL) . Por ejemplo, un microscopio Nikon7 Diaphot, que permite la visualización de campos adyacentes sucesivos, puede ser utilizado para ver toda la población celular en un tiempo razonable. Una población celular ejemplar de 1.5 x 108 células, en confluencia, ocupará un área de 300 cm . Suponiendo un campo de visión de 2 x 1.5 mm, a una amplificación de 4 veces, el microscopio necesitará rastrear una matriz de 100 x 100, o 10,000 campos en total. Un operador manual puede explorar tal vez 500 a 1000 campos por hora, así que el procedimiento manual total tomará aproximadamente de 10 a 20 horas. El procedimiento automático será mucho más rápido. Una vez que la población total de células se ha tratado con un agente de identificación, tal como un anticuerpo etiquetado fluorescente, y luego destruida por un pulso de energía, la población celular se lava de acuerdo con las necesidades clínicas individuales del paciente. La población de células tratadas está después lista para ser transplantada en un paciente seleccionado. Como se discutió antes . , el paciente es normalmente la misma persona como el donador original de la población celular. Una fuente de energía enfocada preferida para el método dirigido es un láser que transmite longitudes de onda de luz en el intervalo de 375 a 900 nanómetros. Uno de tales láser se fabrica por Photonic Instruments (Arlington Heíghts, IL) . Como es conocido, los láser suministran una fuente de luz monocromática con direccionalidad altamente específica, haciendo posible dirigir un haz enfocado microscópicamente de energía, que tenga un diámetro de sólo 0.5 mieras . La alta precisión, tanto en términos de resolución espacial como temporal, en la entrega de la energía de luz, puede ser lograra en longitudes de onda definidas previamente. La longitud de onda más ventajosa que matará una célula tumoral particular, puede ser determinada experimentalmente y empleada para los resultados más ventajoso. Además, las longitudes de pulsos de aproximadamente 10 a 100 nanosegundos se pueden usar para destruir específicamente sólo una sola célula en la población. Como una alternativa, fuentes de luz de banda ancha (por ejemplo, los obtenidos de una lámpara de Xenón) pueden ser enfocadas estrechamente empleando un iris automático para suministrar una fuente de energía controlada. Una fuente de luz de banda ancha, de alta energía, puede ser enfocada en áreas tan pequeñas como de una miera cuadrada y así usadas selectivamente para destruir una célula tumoral sencilla dentro de una población de células sin tumores. La potencia de la fuente de luz, y la duración del pulso de luz, pueden ser ajustados para lograr el resultado deseado de destruir específicamente una célula tumoral particular. Las longitudes del pulso de láser pueden ser tan cortas como de 2 a 6 nanosegundos, y la energía de luz puede ser emitida hasta 50 microjoules o más. Sin embargo, la cantidad total de la energía de luz provista a la célula objetivo designada se selecciona preferiblemente para no causar la ebullición substancial del material celular objetivo o del medio que lo rodea. El calentamiento local del medio celular al punto de ebullición puede causar que el campo de visión sea enturbiado, alterando así un sistema objetivo automático. Además, hay el riesgo que células no tumorales que se coloquen cerca de la célula objetivo lleguen a ser dañadas. En una modalidad, la potencia de luz total entregada alterará mínimamente la membrana celular, conduciendo así a una muerte final de la célula a través de la pérdida de 1os componentes citoplásmicos . Alternativamente, la potencia de luz total puede ser escogida para dañar irreversiblemente los componentes celulares, llevando así a la muerte de la células sin destrucción de la membrana celular. Para observar microscópicamente las células tumorales, la población celular total puede ser colocada ventajosamente en una superficie nominalmente plana, así que un número grande de células aparezcan en un solo plano focal. La densidad de las células en esta superficie puede, en principio, ser de cualquier valor. Sin embargo, la densidad celular debe ser tan alta como sea posible para minimizar el área superficial total requerida por el procedimiento. Si las células que contaminan son claramente identificables, la población celular total puede ser colocada en la superficie en confluencia (alrededor de 500,000 células por centímetro cuadrado) . Si la población de las células recogidas es de células hematopoiéticas, que se remueven como parte de un transplante de médula del hueso, entonces el enriquecimiento de la población para sólo las células de estirpe deseadas permitirá que la población sea observada en un área total más pequeña. Por ejemplo, para observar la población enriquecida de CD34, de 350 millones (5 millones por kilogramo en un paciente de 70 kilogramos) , de células hematopoiéticas, el área superficial total requerida es de aproximadamente 700 centímetros cuadrados. Sin embargo, si los procedimientos de enriquecimiento de células de estirpe hematopoiética incluyen la clasificación de múltiples marcadores específicos de células de estirpe, el número total de células objetivo disminuirá, requiriendo así un área total más pequeña para el procedimiento objetivo. Como es sabido, las poblaciones hematopoiéticas se pueden enriquecer para las células estirpe basadas en la expresión de los marcadores celulares de estirpe Thy-1, CD38, CD15, CDllb, Gly-A, CD3 o CD19. Además, las células pueden ser enriquecidas por las técnicas bien conocidas de filtración de lecho profundo o elutriación en contraflujo. Si la detección de células tumorales no es dificultada en la confluencia celular, luego puede ser deseable mantener la población celular objetivo en subconfluencia, así que el daño colateral a las células vecinas se reduce al mínimo. Sin embargo, debido a que el número total de células es grande en comparación con • el número de células tumorales, algún daño colateral a las células que rodean se puede tolerar. La detección y ubicación de células tumorales etiquetadas en un espacio tridimensional que usa la microscopía cofocal, removerá la necesidad para una superficie plana y la identificación y enfoque de la fuente de luz letal puede tomar lugar a través de un volumen, en el cual se colocan las células. Después que las células de tumor se han destruido específicamente, los desechos celulares se pueden remover lavando las células a una temperatura baja. Dependiendo de la longitud proyectada del procedimiento. la población celular objetivo puede ser enfriada a 4°C, de modo que el proceso de remoción de contaminantes procederá con sólo una degradación mínima en el desempeño fisiológico de la población celular sin tumores. Esto puede ser importante especialmente cuando las células sin tumores son células hematopoiéticas, puesto que ellas se someten a la degradación a la temperatura ambiente. Un dispositivo de enfriamiento termoeléctrico puede ser usado durante este procedimiento para enfriar la población celular.

Como es sabido, el enfriamiento de la población celular a 4°C elimina todo movimiento celular. La superficie sobre la cual las células se colocan, puede también ser recubierta con compuestos policatiónicos, tal como la poli-I-lisina., de modo que las células se pegan fuertemente. El siguiente ejemplo ilustra una modalidad del método dirigido para remover células tumorales de una población de células hematopoiéticas.

Ejemplo 1 Transplante de Células de Estirpe Hematopoiética Un paciente con un tumor metastático y con necesidad de un transplante de médula ósea autólogo, se identificó por un médico. Como una primera etapa en el tratamiento, el paciente se sometió a un procedimiento para recoger la médula ósea. En este procedimiento, el paciente se colocó bajo anestesia general en una sala de operaciones. La cresta ilíaca posterior del paciente luego se punzó múltiples veces por el cirujano y se aspiró la médula del hueso.

El procedimiento de recolección resultó en la recuperación de aproximadamente 1 x 109 células hematopoiéticas . Las células recogidas se enriquecieron en las células hematopoiéticas llevándolas primero sobre una columna de inmunoafinidad, que selecciona las células que tienen el antígeno superficial específico de células hematopoiéticas CD34. Para enriquecer la población de células recogidas, aún después para las células de estirpe, se realizó una segunda selección llevando las células recogidas sobre una columna de inmunoafinidad que se une con el anticuerpo de células anti-estirpe, Thy-1. Después de la elución convencional de la columna, la población celular hematopoiética enriquecida después se puso en contacto con anticuerpos CD34 que se han conjugado a un fluorocromo. Los anticuerpos etiquetados se unieron específicamente a las células hematopoiéticas, pero no a las células tumorales. La población de células luego se colocó sobre una superficie nominalmente plana en confluencia. La densidad celular es una monocapa de aproximadamente 500,000 células por centímetro cuadrado. Una luz ultravioleta que ilumina el anticuerpo CD34 conjugado de fluocromo se accionó para identificar las células hematopoiéticas. Un operador dirigió una luz láser desde un láser de Nitrógeno. Un haz láser con una longitud de onda de 375 nanómetros y longitud de pulso de cinco nanosegundos se usó para dirigir y destruir manualmente cada célula tumoral, que se identificó debido a que no hay fluorescencia. Una vez que las células tumorales no fluorescentes se han destruido, la población remanente es criopreservada. Antes de reintroducir las células, el paciente se sometió a un tratamiento quimioterapéutico para destruir las células tumorales que se han metastasiado a través del cuerpo del paciente. En seguida de este tratamiento, las células aisladas se prepararon para la reintroducción por el derretido rápido a 37 °C. Las células de estirpe hematopoiéticas, exentas de células tumorales, luego fueron transplantadas en el paciente. El paciente se recuperó subsecuentemente sin remisión del cáncer original. Aunque los procedimientos de recolección de médula ósea y la reintroducción se llevaron a cabo usualmente por un médico, el operador del método de la presente invención no necesita un adiestramiento médico.

EJEMPLO 2 Se realizó un experimento para determinar si el Yoduro de Propidio (Pl) puede ser usado para confirmar que una célula objetivo, en una población de células, fue destruida por el tratamiento de láser. Como es sabido en la técnica, el yoduro de propidio es específico a los ácidos nucleicos de doble cordón. Puesto que el Pl puede difundir en el núcleo de una célula muerta, pero no puede penetrar la membrana de una célula viable, probamos si la viabilidad de las células objetivo puede ser confirmada por el desarrollo de color del Pl en sus núcleos. Adicionalmente, el Pl tiene una cresta de absorbencia en 493 nm, que está cerca de la cresta de absorbencia de la etiqueta de ficoeritrina (PE) a 480 nm. Así, el Pl y PE pueden ser activados por la misma longitud de onda de luz. Además, el Pl tiene una cresta de emisión de 617 nm, lo cual fue suficiente para distinguirlo de aquélla de la PE a 578 nm. Así, la lectura de PE positiva puede ser distinguida aún cuando los anticuerpos etiquetados de PE se unan a la célula.

Línea Celular Se obtuvo la línea celular hematopoiética humana KGla de American Type Culture Collection (Rockville, MD) . Las células se recibieron criopreservadas y luego se derritieron rápidamente y se suspendieron en IMDM (Life Technologies, Grand Island, NY) que contiene 4 mM de L.-glutamina, 3.024 g/1 de bicarbonato de sodio y 20% de suero de bovino fetal. La línea celular e pasó cada 3 a 4 días y se mantuvo en una incubadora a 37°C, 95% de humedad y 5% de C02 (como recomiendas las líneas de guía de ATCC) .

Teñido de Células Las células KGla se tiñeron por inmunofluorecencia directa de los antígenos superficiales de la célula, usando anticuerpos monoclonales conjugados (PE) ficoeritrina, contra el antígeno de membrana CD34 humano, como recomiendan las líneas de guía del fabricante (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San José, CA) . Las células KGla etiquetadas (objetivos) se mezclaron con células KGla sin teñir (población de control) en una relación de 1:100.

El yoduro de propidio (Sigma Chemical Company, St . Louis, MO) se agregó para obtener una concentración final de 5 µg/ml, en una suspensión celular de lxlO6 células/ml . Cada parte alícuota de 20 µl de una suspensión celular mixta de l.O x 10s células/ml se agregó a cavidades de una placa de 384 cavidades (Nalge Nunc International, Naperville, IL) y después de 30 minutos para el ajuste celular, se llevaron a cabo la captura de imágenes y la ablación por láser. Adquisición de la Imagen Celular La Figura 2 ilustra un diagrama esquemático de una modalidad de un sistema 75 de ablación por láser. El sistema incluye una cámara Charged Couple Device (CCD) 77 unida a una computadora personal 80. Esta computadora personal 80 fue una estación de trabajo SGI 02, Mountain View, CA) . Las imágenes de células digitalizadas se capturaron por la cámara 77 CCD (Photometrics Inc., Tucson, AZ) que se ha instalado en un microscopio fluorescente invertido Diaphot 300 (Nikon Inc. Melville, NY) con un objetivo 84 20x. Un filtro fluorescente selectivo 86 (Set B2A, Chroma Technology Corp., Brattleboro, VT) se usó para adquirir una imagen de emisión PE brillante., Las imágenes capturadas se exhibieron y procesaron por el software Isee™ (Inovision Corp.,' Durham, NC) que opera en la computadora personal 80. El software suministró la forma automática completa del sistema, que incluye la etapa de operación de herramientas, foco en dirección z, coordinación de regiones de interés (por ejemplo, objetivos) y control de láser. Hubo 63 campos de imagen de visión en cada cavidad de la placa de 384 cavidades y el movimiento escalonado entre los campos se controló correctamente por la rutina del software de herramienta de etapas dentro del Isee. Cada célula objetivo 90 en el campo de visión se identificó bajo parámetros dados, tal como la brillantez, tamaño y configuración, y sus ubicaciones se coordinaron y marcaron por una función de extracción característica en el software Isee ™. Durante el procedimiento, las células objetivo permanecieron estacionarias en la superficie 92 de sus matraces.

Ablación por Láser Un láser de nitrógeno Illb, 94, de clase certificada, modelo VSL-337 (The Láser Science Inc., Newton, MA) equipado con un divisor 96 de haces y una unidad 98 de células teñida con Coumarin 440 (Photonic Instruments, Arlington, Heights, IL) se usó para destruir células individuales. El divisor 96 de haces pasó luz desde el láser 94, pero refractó la luz azul emitida de una lámpara 99 de arco de Mercurio. Así, la luz desde la lámpara 99 de arco de mercurio y el láser 94 fue enviada a lo largo de la misma trayectoria hacia la célula objetivo 90. La lámpara de arco de mercurio transmitió luz que tiene un intervalo de longitud de onda entre 450 y 490 nm. Sin embargo, como se indica en la Figura 2, la luz azul desde la lámpara 99 de arco de mercurio se pasó a través de un filtro de excitación 100, D4700/40 (Chroma Technology Corp. Brattleboro, VI), con el fin de activar los conjugados de PE unidos al antígeno superficial CD34 de las células KGla. Por lo tanto, la misma trayectoria llevó la luz de excitación y la luz láser. La combinación de la luz láser y la luz de la lámpara de arco de mercurio excitada luego se pasó en un segundo divisor 102 de haces. Este divisor 102 de haces refractó la luz desde el láser 94 y la lámpara 99 de arco de mercurio a través del objetivo 84 del microscopio a la célula objetivo 90. El divisor 102 de haces también transmite la luz que se ilumina por la célula objetivo etiquetada a través de un filtro 104 y dentro de la cámara 77 CCD. Se debe notar que durante un procedimiento normal, la luz láser es sólo transmitida por breves instantes. En contraste, la luz de lámpara de arco de mercurio es normalmente transmitida en forma constante, así que cada célula etiquetada reflejará luz a través del divisor 102 de haces, el filtro 104 y dentro de la cámara 77 CCD. Un generador 105 de pulsos se une al láser 94 para suministrar la ráfaga más corta de luz láser, necesaria para destruir la célula objetivo 90. Las longitudes de pulsos más cortos son más convenientes, debido a que hay menos oportunidad que las células que rodean se dañen a través del calentamiento local de los medios celulares . Las imágenes digitales de un campo de las células objetivo teñidas se capturaron y sus ubicaciones se coordinaron y marcaron por el sistema de software Isee. Debido a que la lámpara 99 de arco produce una luz de banda ancha que fluoresce cada célula etiquetada en el platillo, el sistema de computadora es capaz de agrupar y procesar un campo de visión completo a la vez. Conforme se activan las células por pulsos cortos de luz desde el láser, un motor z, que se puede mover verticalmente, 110, suministra un mecanismo para enfocar específicamente la luz láser son diferentes planos focales en el platillo. Este motor z 110 es un motor controlado electrónicamente, unido al objetivo 84. El motor z se conecta de modo que el objetivo 84 pueda ser movido arriba y abajo en la dirección vertical, con el fin del enfoque fino del láser en varios planos focales. Además, el motor z puede ser controlado por el sistema 80 de computadora con el fin de enfocar el pulso de luz láser desde el fondo de la célula objetivo 90 a la parte superior de esta célula objetivo. El enfoque del pulso láser con el motor z compensado para las variaciones de posición de la célula en la dirección vertical, causadas por la imperfección de las superficies de la placa de cultivo del tejido.

Determinación de la Destrucción Exitosa de Células Después que cada célula se ha pulsado con el láser, la computadora analiza el espectro en la cresta de emisión de Pl de 617 nm. Si la célula se destruye por el láser, una emisión cresta de 617 nm será encontrada en la ubicación original de la célula. Si la cresta de emisión Pl no se encuentra, el láser enviará otro pulso de energía de luz a la ubicación de la célula. De esta manera, cada célula de tumor en la población se confirmará se ha destruido.

Conclusión Esta invención hace posible que los médicos traten efectivamente a pacientes que necesitan transplantes de células hematopoiéticas, sin el riesgo de recaídas debido a la reintroducción de células cancerosas. El método dirigido, aquí descrito, suministra un método para la remoción completa o casi completa de células de tumor que contaminan, desde una población de células de estirpe hematopoiética u otras poblaciones celulares. La invención puede también s ser incorporada en otras formas específicas sin apartarse de su espíritu o características esenciales. Las modalidades descritas se deben considerar en todos los aspectos únicamente como ilustrativas y no restrictivas. El alcance de la invención, por lo tanto, se indica por las reivindicaciones anexas, más bien que por las descripciones anteriores. Todos los cambios que se hagan dentro del significado e intervalo de equivalencia de las reivindicaciones, se considerarán dentro de su ámbito de las mismas .

Claims (29)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método in vi tro para eliminar células tumorales desde dentro de una población de células, que incluye células no tumorales, este método comprende las etapas de : a.) etiquetar la población de células de manera que las células tumorales se puedan distinguir de las células no tumorales; b.) iluminar toda la población de células; c.) capturar una imagen de la población de células iluminada; d.) determinar al menos las coordenadas bidi ensionales de una célula tumoral en la población de células, con referencia a la imagen capturada y la etiqueta; y e.) destruir la célula tumoral, aplicando un pulso desde una fuente de energía controlada a las coordenadas de las células tumorales, mientras está célula tumoral está en una posición substancialmente estacionaria sobre una superficie.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en que las etapas d) y e) se repiten para cada célula tumoral en la oblación de células no tumorales.
3. 3. El método de las reivindicaciones 1 ó 2, en que las células no tumorales son una población de células hematopoiéticas .
4. 4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 , en que la población de células hematopoiéticas está comprendida de una población de células hematopoiéticas que se ha enriquecido para las células de estirpe hematopoiética .
5. 5. El método de la reivindicación 4, en que la población de células de estirpe hematopoiética se enriquece con base en la expresión de la proteína superficial CD34.
6. 6. El método de la reivindicación 4, en que la población de células de estirpe hematopoiética se enriquece con base en la expresión de un marcador celular, seleccionado del grupo que consta de: Thy-1, CD38, CD15, CDllb, Gly-A, CD3 y CD19.
7. 7. El método de la reivindicación 4, en que la población celular enriquecida se crea usando la filtración de lecho profundo o la elutriación en contraflujo.
8. 8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en que las etapas d) y e) se realizan bajo el control de una computadora.
9. 9. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en que la fuente de energía controlada es un láser.
10. 10. El método de la reivindicación 9, en que la longitud de onda de la luz emitida desde el láser se encuentra entre 375 y 900 nanómetros.
11. 11 El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en que la etiqueta es específica para las células tumorales.
12. 12 El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en que la etiqueta es específica para las células no tumorales .
13. 13. Un método in vi tro para enriquecer el número de células de estirpe en una población de células hematopoiéticas, este método comprende: a.) etiquetar la población de células hematopoiéticas con una etiqueta específica de células de estirpe; b.) iluminar toda la población de células hematopoiéticas; c.) capturar una imagen de la población de células hematopoiéticas iluminada; d.) calcular al menos las coordenadas bidimensionales de cualquier célula no etiquetada en la población de células hematopoiéticas, determinando su posición en la imagen; y e.) aplicar un pulso de luz láser, de alta energía, a las coordinadas de al menos una de las células no etiquetadas en la población, mientras la célula de estirpe está en una posición estacionaria sobre una superficie .
14. 14. El método de la reivindicación 13, en que la etapa de aplicación comprende aplicar el pulso de luz láser de alta energía a substancialmente todas las células no etiquetadas en la población.
15. 15. El método de la reivindicación 13 ó 14, en que la etiqueta específica de células de estirpe es la CD34.
16. 16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en que la longitud de onda de la luz emitida desde el láser está entre 375 y 900 nanómetros.
17. 17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13 a 16, en que la etapa de aplicación se realiza bajo el control de una computadora.
18. 18. Un método in vi tro para preparar células hematopoiéticas aisladas, para la reintroducción en un paciente, este método comprende: a.) etiquetar las células tumorales dentro de las células hematopoiéticas aisladas con una etiqueta específica de células tumorales; b.) iluminar las células hematopoiéticas aisladas; c.) capturar una imagen de las células hematopoiéticas aisladas ,-d.) determinar al menos las coordenadas bidimensionales de las células tumorales dentro de las células hematopoiéticas aisladas, con referencia a la imagen y a la etiqueta; y e.) aplicar un pulso de luz láser, de alta energía, a cuando menos una de las células tumorales etiquetadas, en las coordenadas determinadas, mientras las células tumorales están en una posición substancialmente estacionaria sobre una superficie.
19. 19. EL método de la reivindicación 18, en que la etapa de aplicación comprende aplicar el pulso de luz láser, de alta energía, a todas las células etiquetadas en la población.
20. 20. El método de la reivindicación 18 ó 19, en que la longitud de onda de la luz emitida desde el láser, está entre 357 y 900 nanómetros.
21. 21. El método de cualquiera de las reivindicaciones 18 a 20, en que la etapa de aplicación se lleva a cabo automáticamente con la asistencia de una computadora.
22. 22. Un método in vi tro para eliminar una primera población de células desde una segunda población de células, este método comprende: a.) etiquetar la primera población de células de manera que esta primera población de células se pueda distinguir de la segunda población de células; b.) b) colocar la primera población de células y la segunda población de células en una posición estacionaria sobre una superficie; c.) c) ubicar una célula en la primera población de células con referencia a la etiqueta; d.) d) aplicar un primer pulso, desde una fuente de energía controlada, a esta primera célula; e.) determinar si la primera célula fue destruida por el primer pulso; y f.) aplicar un segundo pulso, desde la fuente de energía controlada, si la primera célula no fue destruida.
23. 23. El método de la reivindicación 22, donde el método de —etiquetar la primera población de células comprende células tumorales etiquetadas.
24. 24. El método de la reivindicación 22 ó 23, en que el método de eliminar la primera población de células de una segunda población de células comprende eliminar una primera población de células tumoraíes de una segunda población de células no tumorales.
25. 25. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, en que el método de aplicar un primer pulso comprende aplicar un pulso de láser.
26. 26. El método de cualquiera de las reivindicaciones 22 a 25, en que el método de aplicar un segundo pulso comprende aplicar un pulso de láser.
27. 27. Un método para eliminar células tumorales desde dentro de una población celular, que incluye células no tumorales, este método comprende las etapas de: a.) etiquetar las células no tumorales, de modo que estas células no tumorales puedan ser distinguidas de las células tumorales; b.) ubicar una de las células tumorales, identificando una célula no etiquetada en la población de células; y c.) destruir la célula tumoral, aplicando un pulso desde una fuente de energía controlada a la célula tumoral ubicada, mientras esta célula tumoral está en una posición substancialmente estacionaria sobre una superficie.
28. 28. El método de la reivindicación 27, en que la etapa de destruir la célula tumoral comprende aplicar un pulso de láser.
29. 29. El método de la reivindicación 27 ó 28, en que la etapa de destruir la célula tumoral comprende aplicar una fuente de energía controlada a la célula de tumor ubicada, mientras esta célula de tumor está en una posición estacionaria. sobre una superficie nominalmente plana. 30 El método de cualquiera de las reivindicaciones 28 ó 29, en que la etapa de destruir la célula tumoral comprende aplicar una fuente de energía controlada a una célula de tumor ubicada, mientras la población celular está en confluencia.