KR20000016936A - 혈액 샘플 중의 헤모글로빈 농도 측정 및 백혈구 검출용 시약 - Google Patents

혈액 샘플 중의 헤모글로빈 농도 측정 및 백혈구 검출용 시약 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혈액 샘플 중의 백혈구의 검출과 헤모글로빈의 농도 측정을 위한 시약에 관한 것이다. 상기 시약은 하나 이상의 양이온 형태의 세정제; 배당체 형태의 화합물; 하나 이상의 무기염 및/또는 삼투압제 및/또는 백혈구 보호제; 및 실질적으로 중성값(pH 5 내지 8), 또는 염기성값(pH 8 내지 12)으로 시약의 pH를 조절할 수 있는 유기 및/또는 무기 완충제를 포함한다. 본 발명의 시약은 인간 및 가축에 있어서 혈액 분석에 적용될 수 있다.

Description

혈액 샘플 중의 헤모글로빈 농도 측정 및 백혈구 검출용 시약{Reagent for measurement of the haemoglobin and determination of the leukocytes in a blood sample}
본 발명은 혈액 분석에 관한 것이다.
더욱 상세하게는, 본 발명은 혈액 샘플 중의 백혈구의 검출과 헤모글로빈의 농도 측정을 위한 시약에 관한 것이다.
헤모글로빈의 농도 측정과 백혈구의 검출, 특히 특정 백혈구의 종집단의 검출은 인간과 동물 모두의 특정 질병을 진단함에 있어서 근본적으로 중요한 것이다.
헤모글로빈은 혈액의 적혈구 내에 포함되어 있는 색소-단백질이다.
그러므로, 헤모글로빈의 농도 측정에는 헤모글로빈을 방출시켜서 그 농도를 측정할 수 있도록 적혈구를 용해(lysis)시킬 수 있는 세포 용해 시약을 사용할 필요가 있다.
이 목적을 위하여, 색도 측정에 의해 헤모글로빈의 측정이 가능하도록 적혈구를 용해시킬 수 있고, 헤모글로빈을 안정한 색소원 화합물로 변형시킬 수 있는 시아나이드 이온을 함유하는 시약을 사용하는 방법이 알려져 있다. 이 형태의 시약은 미국 특허 제 3,874,852호에 상세하게 기재되어 있다. 이 시약의 주된 단점은 시아나이드를 사용한다는 것이다. 또한, 분석되어질 혈액 샘플 내의 백혈구 종집단을 확인하거나 정량할 수 없다.
사실상, 백혈구의 종집단, 특히 임파구, 단핵구, 중성구 및 호산구의 검출은 특정 질병의 확인을 위해 기본적으로 중요한 것이다.
혈액 샘플에서 백혈구의 검출을 위한 시약으로서 시아나이드를 함유하지 않는 여러가지 시약이 이미 선행기술에서 개시하고 있다.
이 형태의 시약의 예는, 예를 들어 유럽 특허 제 0,325,710호에 기재되어 있다.
이러한 시약들은 시아나이드를 사용하지 않는다는 장점을 가지고 있기는 하지만, 그것들에 의해 혈액 내의 백혈구 종집단의 정확한 확인 및 정량분석을 할 수는 없다는 단점을 가지고 있다.
그러므로, 예컨데 유럽 특허 제 0,325,710호에 따른 시약은 혈액 샘플 내에 존재하는 호산구는 검출할 수 있으나, 다른 백혈구 종집단 각각을 정확하게 검출할 수는 없다.
또한, 유럽 특허 제 0,424,871호는 백혈구 종집단을 구별할 수 있는 시약들을 기재하고 있다. 그러나, 이러한 시약들은 때때로 인간의 병리상태 및 가축의 정상 생리상태에 존재하는 세포막의 저항을 극복해야 하는 난점에 직면한다.
본 발명의 목적은 상술한 단점들을 제거하는 것이다.
특히, 본 발명의 목적은 혈액 샘플 중의 백혈구의 검출과 헤모글로빈의 농도 측정을 위한 시약으로서, 사아나이드 화합물의 사용없이 헤모글로빈의 농도 측정뿐만 아니라 적혈구의 용해를 가능하게 하는 혈액 분석시약을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 총 백혈구의 정량분석 및 적어도 하나의 백혈구 종집단의 확인과 정량분석을 가능하게 하는 시약을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인간과 가축에 있어서, 약으로서 사용가능한 형태의 시약을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 인간 병리상태 및 가축의 정상 생리상태에서 직면하게 되는 세포막 저항과 관련된 분석상의 문제점을 제거할 수 있는 형태의 시약을 제공하는 것이다.
도 1, 2, 3, 4, 5 및 6은 본 발명의 일실시예에 따른 혈액 분석 결과를 나타내는 그래프이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 다음과 같은 형태의 시약을 제공한다.
본 발명의 시약은 a) 하나 이상의 양이온 형태의 세정제; b) 배당체 형태의 화합물; c) 하나 이상의 무기염 및/또는 삼투압제 및/또는 백혈구 보호제; 및 d) 시약의 pH를 실질적인 중성값(pH 5 내지 8) 또는 염기성값(pH 8 내지 12)으로 선택적으로 조절할 수 있는 유기 및/또는 무기 완충제를 포함한다.
그러므로, 본 발명의 혈액 분석시약은 상술한 목적을 달성할 수 있도록 최소 4개의 주성분을 포함한다.
양이온 형태의 세정제는, 헤모글로빈의 방출이 가능하도록 적혈구를 용해심키는 기능을 수행하며, 방출된 헤모글로빈은 흡착 측정법에 의해 측정될 수 있다.
(양이온 및 음이온성의)이온성 세정제는 주로 단백질 복합체를 용해하고, 세포막의 단백질을 용해시키기 위하여 사용된다. 이것들은 소위 단백질 변성제이다.
또한, 이온성 세정제들은 혈액내의 세포 집단(적혈구 및 백혈구)에 대해 빠르고 비특이적 작용을 나타낸다.
배당체 형태의 화합물, 특히 사포닌은 적혈구의 용해에 기여한다. 또한, 사포닌은 헤모글로빈을 안정화시키는 기능을 수행하여 특정 파장에서 헤모글로빈을 분석할 수 있도록 하고, 특히 이 화합물은 적혈구의 세포막 저항을 파괴하는데 기여한다.
사포노사이드로서도 알려진 사포닌들은 적혈구만을 특이적으로 용해하는 능력을 가진 배당체이나, 이 용해는 이온성 세정제에서 얻을 수 있는 것보다 빠르지 않다. 사포닌들은 다른 세정제와 함께 사용될 때, 백혈구의 파괴는 제한하면서 더욱 빠르게 적혈구만을 특이적으로 용해시킬 수 있다.
또한, 다중-고리 카본 네트워크로 특징지워지는 이러한 형태의 화합물의 화학구조는 헤모글로빈의 산화 유도체를 물리적, 화학적으로 안정화시킨다.
무기염은 세정제의 작용을 조정한다. 또한, 저항성에 의한 측정을 실시할 수 있도록 하기 위해서도 필요하다.
삼투압제는, 시약이 중성 pH로 사용될 때, 실질적으로 백혈구 보호 역할을 하여 백혈구 종집단을 구분하는데 보조 기능을 한다.
마지막으로, 시약의 pH가 중요한 특징이 되기 때문에 완충제는 본 발명의 주요 구성요소이다. 사실상, pH값에 따라 시약은 백혈구 종집단의 하나 또는 다수의 확인이을 가능하게 한다.
시약의 pH가 실질적으로 중성값(pH 5 내지 8)으로 조절되는 경우에는, 임파구, 단핵구 및 중성구의 백혈구 종집단 3개의 확인 및 정량이 가능하다.
시약의 pH가 염기성값(pH 8 내지 12)으로 조절되는 경우에는, 추가적으로 다핵 호산구의 확인이 가능하다.
그러므로, 다핵 호산구의 확인이 요구되는 경우에는 시약의 pH값을 염기성값으로 조절하는 것이 필요하다.
한편, 호산구의 확인이 요구되지 않는다면, 시약의 pH는 실질적으로 중성값으로 조절된다.
본 발명에 따른 시약에 있어서, 세정제는 다음의 성분으로부터 선택되는 것이 바람직하다.
1급 아민, 아세테이트 및 지방 아민의 하이드로클로레이트;
4급 암모늄의 염, 및 브롬화 트리메틸케틸 암모늄;
에틸 설페이트, 디에탄올아미노-프로필아민, 디에틸아미노-프로필아민에 의해 양이온이 부여되는 치환된 디아민의 아마이드; 및
고리 형태의 디에틸렌트리아민의 아마이드.
세정제가 0-50g/l 범위 내의 농도, 특히 약 18g/l의 농도로 존재하는 것이 바람직하다.
배당체 형태의 화합물 중에서 특히 사포노사이드로서도 알려진 사포닌이 바람직하고, 이 사포닌류는 트리테르펜 또는 스테로이드 형태일 수 있다.
본 발명에 따른 시약에 있어서, 배당체 형태의 화합물은 0.5 내지 20g/l의 농도, 특히 약 2g/l의 농도로 존재하는 것이 바람직하다.
무기염은 나트륨과 칼륨의 클로라이드, 설페이트 또는 플루오라이드 중에서 선택되는 것이 바람직하다.
무기염은 1 내지 15g/l의 농도, 특히 약 8g/l의 농도로 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 시약의 삼투압제 및/또는 백혈구 보호제는 만니톨, D-글루코오스 및 그와 유사한 화합물 중에서 선택되는 것이 바람직하다.
이 삼투제 및/또는 백혈구 보호제는 0 내지 30g/l의 농도, 특히 약 2.5g/l의 농도로 존재하는 것이 바람직하다.
유기 및/또는 완충제는 트리에탄올아민, 나트륨과 칼륨의 수소화 포스페이트, N-[2-아세트아미도]-2 이미노디아세트산, N-[2-카바모일메틸]-이미노디아세트산, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올, 글리신, 탄산 나트륨, 시트르산 및 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄 중에서 선택되는 것이 바람직하다.
완충제는 0-2중량% 범위 내의 농도로 존재하는 것이 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시예에서는 완충제로 시약의 pH값을 5 내지 8로 조절하였다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예에서는 완충제로 시약의 pH값을 8 내지 12로 조절하였다.
이하 실시예를 들어 본 발명을 설명하고자 하며, 본 발명이 다음의 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1
아래에 제시된 농도의 화합물로 시약을 제조하였다.
화합물 농도
염화나트륨 9g/l
C15H34NCl(양이온 세정제) 12g/l
트리테르페닉 사포닌 2g/l
탄산 나트륨(완충제) 2g/l(0.2중량%)
상기 화합물들을 혼합하여, pH는 8 내지 12의 염기성값, 약 10.2로 조절하였다.
상술한 바와 같이 제조된 시약을 이용하여, 자동 혈액 분석장치(상표명, ABX-Micros, 프랑스에 소재하는 ABX사)로 혈액 분석을 2회 실시하였다.
이 목적을 위하여, 분석될 혈액 샘플의 소정량을 소정량의 희석제 및 전술한 시약과 혼합하였다.
본 실시예에서는 동물의 혈액에 대해 측정하였다. 두 개의 다른 혈액 샘플을 가지고 실시된 측정의 결과는 도 1과 2에 나타냈다.
이들 도면은 상대적 강도에 따른 백혈구의 수를 보여준다. 4개의 백혈구 종집단이 존재하는 것으로 확인되었다.
도 1과 2는, 저항 분석에 관한 것으로 임파구, 단핵구, 과립구 및 다핵 호산구의 백혈구 종집단이 오른쪽으로부터 왼쪽으로 화살표에 의해 경계가 지어져 나타나 있다.
자동 분석장치를 통해, 각각의 백혈구 종집단에 대한 세포의 수와 그에 상응하는 퍼센트를 나타내는 아래와 같은 측정결과를 얻었다.
분석 1(도 1)
세포수 %
임파구: 3956 53.23%
단핵구: 420 5.65%
과립구: 2576 34.65%
호산구: 481 6.47%
분석 2(도 2)
세포수 %
임파구: 1071 6.34%
단핵구: 805 7.00%
과립구: 8906 77.52%
호산구: 706 6.14%
그러므로, 본 발명에 따른 시약을 이용하면 4개의 상술한 백혈구 종집단 각각을 확인하고 정량하는 것이 가능하다.
실시예 2
실시예 2에서는 실시예 1에서와 동일한 시약을 사용하여 두개의 다른 인간의 혈액 샘플로 실시예 1과 유사한 분석을 실시하였다. 자동 혈액 분석장치(상표명, ABX-Vega, 프랑스에 소재하는 ABX사)를 이용하여 측정하였다.
측정 결과는 도 3과 4에 나타냈다.
도 3에 대응되는 샘플의 경우에는, 임파구, 단핵구, 과립구 및 다핵 호산구의 4 개의 백혈구 종집단에 대한 확인과 정량이 가능했다. 다핵 호산구는 총 백혈구 종집단에 대해 5% 존재한다.
도 4에 대응하는 샘플의 경우에는, 임파구, 단핵구 및 과립구의 3 개의 종집단에 대한 확인과 정량이 가능했다. 또한 이 샘플에서는 다핵 호산구는 포함하고 있지 않는 것(0% 농도))으로 나타났다.
실시예 3
실시예 3에서는 실시예 1 및 2에서와 유사한 시약을 사용했지만, 시약의 pH를 중성, 즉 7.6으로 조절했다. 하나의 인간 혈액 샘플을 가지고 실시예 1 및 2에서와 유사한 분석을 실시하였다. 자동 혈액 분석장치(상표명, ABX-Vega, 프랑스에 소재하는 ABX사)를 이용하여 측정하였다.
측정 결과는 도 5에 나타냈다. 단지 임파구, 단핵구, 과립구의 3 개의 주요한 백혈구 종집단만이 검출되었다.
실시예 4
실시예 4는 실시예 3에서와 유사한 시약을 이용하여 중성의 pH에서 실시되었다. 하나의 인간 혈액 샘플을 이용하여 상기 실시예들과 유사한 분석을 실시했다. 자동 혈액 분석장치(상표명, ABX-Micros, 프랑스에 소재하는 ABX사)로 측정하였다.
측정 결과는 도 6에 나타냈다. 실시예 3에서와 같이 단지 임파구, 단핵구, 과립구의 3 개의 주요한 백혈구 종집단만이 검출되었다.
상술한 바와 같이 본 발명에 따른 시약은 시아나이드를 사용하지 않고도 적혈구 용해가 가능하며, 총 백혈구에 대한 정량분석뿐만 아니라, 각각의 백혈구 종집단에 대한 정성분석 및 정량분석이 가능하다.

Claims (13)

  1. a) 하나 이상의 양이온 형태의 세정제;
    b) 배당체 형태의 화합물;
    c) 무기염, 삼투압제 및 백혈구 보호제 중 하나 이상; 및
    d) 실질적으로 중성값(pH 5 내지 8), 또는 염기성값(pH 8 내지 12)으로 시약의 pH를 선택적으로 조절할 수 있는 유기 및/또는 무기 완충제를 포함하는 것을 특징으로 하는 혈액 샘플 중의 백혈구의 검출과 헤모글로빈의 측정을 위한 시약.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 세정제가
    a) 1급 아민, 아세테이트 및 지방 아민의 하이드로클로레이트;
    b) 4급 암모늄의 염, 및 브롬화 트리메틸케틸 암모늄;
    c) 에틸 설페이트, 디에탄올아미노-프로필아민, 디에틸아미노-프로필아민에 의해 양이온이 부여되는 치환된 디아민의 아마이드; 및
    d) 고리 형태의 디에틸렌트리아민의 아마이드로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 시약.
  3. 제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 세정제가 0-50g/l 범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 시약.
  4. 제 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배당체 형태의 화합물이 사포닌류(또는 사포노사이드류) 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 시약.
  5. 제 1항 내지 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 배당체 형태의 화합물이 0.5 내지 20g/l의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 시약.
  6. 제 1항 내지 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 무기염이 나트륨 또는 칼륨의 클로라이드, 설페이트 또는 플루오라이드 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 시약.
  7. 제 1항 내지 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 무기염이 1 내지 15g/l의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 시약.
  8. 제 1항 내지 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 삼투압제 및/또는 백혈구 보호제가 만니톨 및 D-글루코오스 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 시약.
  9. 제 1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 삼투압제 및/또는 백혈구 보호제가 0 내지 30g/l의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 시약.
  10. 제 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 및/또는 완충제가 트리에탄올아민, 나트륨과 칼륨의 수소화 포스페이트, N-[2-아세트아미도]-2 이미노디아세트산, N-[2-카바모일메틸]-이미노디아세트산, 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올, 글리신, 탄산 나트륨, 시트르산 및 트리스(하이드록시메틸) 아미노메탄 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 시약.
  11. 제 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유기 및/또는 무기 완충제가 0-2중량% 범위의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 시약.
  12. 제 1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제가 상기 시약의 pH를 5 내지 8의 값으로 조절하는 것을 특징으로 하는 시약.
  13. 제 1항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 완충제가 상기 시약의 pH를 8 내지 12의 값으로 조절하는 것을 특징으로 하는 시약.
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