JP4278788B2 - 血液サンプル中のヘモグロビンの測定および白血球の検出用試薬 - Google Patents

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、血液学的な分析に関する。
【０００２】
さらに詳細には、本発明は血液サンプル中のヘモグロビンの測定および白血球の検出用試薬に関するものである。
【０００３】
【従来の技術】
へモグロビンの濃度および白血球の検出、特に特定の白血球亜細胞（leukocytic sub-populations）の検出の測定は、ヒト医学および獣医学双方の特定の病理診断にとって根本的に重要なものである。
【０００４】
ヘモグロビンは、血液の赤血球（red globule 又はerythrocyte ）に含まれている色素タンパク質である。
【０００５】
したがって、ヘモグロビン濃度の測定では、ヘモグロビンを遊離するために赤血球（red globule 又はerythrocyte ）を細胞溶解することができる細胞溶解試薬を使用することが要求され、それによってヘモグロビンを測定することができる。
【０００６】
この用途において、比色法測定によるヘモグロビンの検出を可能にするため、赤血球を溶解し、ヘモグロビンを安定した色原体化合物（chromogen compound）に変換することができるシアン化物イオンを含む試薬の使用が知られている。特に、米国特許第３８７４８５２号にこの種類の試薬についての記述がある。この試薬の主要な欠点は、シアン化物を使用することである。さらに、かかる試薬では、分析される血液サンプルに含まれている白血球亜細胞を同定し定量することができない。
【０００７】
実際、白血球亜細胞、特にリンパ球、単球、好中球および好酸球の検出は、特定の病理の同定において根本的に重要なものである。
【０００８】
血液サンプル中の白血球の検出用に、シアン化物を含んでいない様々な試薬がすでに先行技術において提案されている。
【０００９】
例えば、文献ＥＰ０３２５７１０号には、この種類の試薬の実施例が記述されている。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
しかし、これらの試薬はシアン化物を使用しないという長所を持つが、血液の白血球亜細胞の正確な同定および定量化が出来ないという欠点がある。
【００１１】
例えば、ＥＰ０３２５７１０号による試薬は、血液サンプルの中に存在する好酸球を検出することは可能であるが、他の白血球亜細胞の各々を正確に同定することはできない。
【００１２】
さらに、文献ＥＰ０４２４８７１号には、白血球亜細胞の識別を可能にする試薬についての記述がなされている。しかしながら、これらの試薬は、ヒト病理学および獣医生物学において生じる膜の耐性の克服という問題に時として遭遇することになる。
【００１３】
本発明の目的は、特に前述の欠点を除くことにある。
【００１４】
特に、血液サンプル中のヘモグロビンの測定および白血球の検出用の血液学的分析試薬を供給することを目指すものであり、そによれば、シアン化物化合物を使用せずに、ヘモグロビンの測定とともに、赤血球（red globule 又はerythrocte）の細胞溶解を特別に可能にすることができる。
【００１５】
また、本発明の目的は、白血球（leukocytes又はwhite globules）の総計を定量し、少なくとも１つの白血球亜細胞を同定し、かつ少なくとも１つの白血球亜細胞を定量することを可能にするこの種の試薬を提供することにある。
【００１６】
さらに、本発明の目的は、ヒト医学および獣医学の双方で使用することができるこの種の試薬を提供することにある。
【００１７】
加えて、本発明の目的は、ヒト病理学および獣医生物学で遭遇する膜の耐性に関連づけられる分析上の問題を解決することができるこの種の試薬を提供することにある。
【００１８】
【課題を解決するための手段】
これらの目的に対し、本発明により、カチオン型の少なくとも１つのデタージェント（detergents）と、配糖体型の化合物、特にサポニンと、少なくとも１つの無機塩、および／または浸透作用および／または白血球保護作用を有する物質と、実質的に中性値（５〜８の間のｐＨ値）、または塩基性値（８〜１２の間のｐＨ値）のいずれかに試薬のｐＨ値を選択的に調整することが可能である有機および／または無機の緩衝剤とからなる上記種類の試薬が提案されている。
【００１９】
したがって、本発明による血液学的試薬は、上記の目的を達成することを可能にする少なくとも４つの主成分から成っている。
【００２０】
カチオン型のデタージェントは、赤血球（red globule 又はerythrocyte ）の細胞溶解の作用をなし、ヘモグロビンを遊離させ、吸光度測定による検出を可能にする。
【００２１】
（アニオン型とカチオン型の）イオン性デタージェントは、タンパク質複合体（protein complexes ）を解離して、膜のタンパク質類を可溶性にするのに主に使用され、それらはいわゆる変性である。
【００２２】
さらに、それらは、血液の細胞群（赤血球と白血球）に対し、速やかでかつ非特異的な作用を持っている。
【００２３】
配糖体型の化合物、特にサポニンは、赤血球の細胞溶解に寄与する。その上、ヘモグロビンに関して安定化作用を担い、それによって特定の波長でヘモグロビンを分析することが可能となる。特に、この化合物は、赤血球の抵抗性膜の破壊に寄与する。
【００２４】
サポノシドとしてすでに公知のサポニンは、赤血球を特異的に細胞溶解する機能を持っている配糖体であるが、この細胞溶解はイオン性のデタージェントが存在する状態で行なわれるほど速くはない。サポニンを他のデタージェントとともに使用する場合、赤血球をより速く特異的に細胞溶解することができ、それによって白血球の劣化が制限される。
【００２５】
さらに、多重環炭素網状構造によって特徴付けられるこの種類の化合物の化学構造は、ヘモグロビンの酸化誘導体の物理的かつ化学的安定化を可能にする。
【００２６】
無機塩はデタージェントの活性に干渉する。また無機塩は、抵抗率により測定を行なうことができるようにするのに必要である。
【００２７】
中性ｐＨ値でその試薬を使用する場合、白血球亜細胞の識別を促進するために、浸透作用を有する物質は、実質的に白血球の保護的役割を果たす。
【００２８】
最終的に、試薬のｐＨ値が重要な特性であるので、緩衝剤は重要な成分である。実際、ｐＨ値に応じて、試薬は一つあるいは複数の白血球亜細胞を同定することができる。
【００２９】
実質的な中性値（５〜８の間のｐＨ）に試薬のｐＨを調整する場合、次の３つの白血球亜細胞、すなわち、リンパ球、単球および好中球を定量し同定することが可能である。
【００３０】
塩基性値（８〜１２の間のｐＨ）に試薬のｐＨを調整する場合、さらに、多核性の好酸球を同定することが可能である。
【００３１】
従って、多核性の好酸球の同定を要求する適用については、塩基性値に試薬のｐＨを調整することが必要である。
【００３２】
一方、好酸球の同定が必要ない場合は、実質的な中性値に試薬のｐＨを調整する。
【００３３】
本発明による試薬においては、デタージェントは、次の成分、すなわち、
第一級アミン、脂肪アミンの酢酸塩および塩酸塩、
第四級アンモニウム塩、およびトリメチルケチルアンモニウムの臭化物、
エチル硫酸塩によってカチオン型にされた置換したジアミンのアミド、ジエタノールアミノ−プロピルアミン、ジエチルアミノ−プロピルアミド、
環状形成されたジエチレントリアミンのアミドから選択するのが好ましい。
【００３４】
デタージェントは、０〜５０ｇ／ｌの範囲の濃度で、さらに詳細には、約１８ｇ／ｌの濃度で存在するのが好ましい。
【００３５】
配糖体型の化合物から、特にサポノシドとして公知であるサポニンを選択するのが好ましく、それはトリテルペンのあるいはステロイド性のいずれのサポニンでもよい。
【００３６】
本発明による試薬では、配糖体型の化合物は、０．５〜２０ｇ／ｌの範囲の濃度で、さらに詳細には、約２ｇ／ｌの濃度で存在するのが好ましい。
【００３７】
無機塩は、次の化合物、ナトリウムまたはカリウムの塩化物、硫酸塩あるいはフッ化物から選択するのが好ましい。
【００３８】
この無機塩は、１〜１５ｇ／ｌの範囲の濃度で、さらに詳しくはは、約８ｇ／ｌの濃度で存在するのが好ましい。
【００３９】
本発明による試薬の浸透作用および／または白血球保護作用を有する物質は、マンニトール、Ｄ−グルコースおよびその類似化合物から選択するのが好ましい。
【００４０】
この浸透作用および／または白血球保護作用を有する物質は、０〜３０ｇ／ｌの範囲の濃度で、さらに詳しくは、約２．５ｇ／ｌの濃度で存在するのが好ましい。
【００４１】
有機および／または無機の緩衝剤は、以下の化合物、すなわち、
トリエタノールアミン、
ナトリウムおよびカリウムの水素化したリン酸塩、
Ｎ−［２−アセトアミド］−２−イミノ二酢酸、
Ｎ−［カルバモイルメチル］イミノ二酢酸、
２−アミノ−２−メチル−１、３−プロパンジオール、
グリシン、
炭酸ナトリウム、
クエン酸、
トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンとから選択するのが好ましい。
この緩衝剤は、０〜２重量％の範囲の濃度で存在するのが好ましい。
【００４２】
本発明の第１の態様によれば、緩衝剤は、試薬のｐＨ値を５〜８の間に調整する。
【００４３】
別の態様によれば、この緩衝剤は、試薬のｐＨ値を８〜１２の間に調整する。
【００４４】
【発明の実施の形態】
制限されない以下の実施例に関連して、この発明をこれより説明する。
【００４５】
（実施例１）
試薬を、以下の化合物から、示された濃度で調製する。
【００４６】
化合物 濃度
塩化ナトリウム ９ｇ／ｌ
C15 H34 NCl （陽イオンデタージェント） １２ｇ／ｌ
トリテルペンのサポニン ２ｇ／ｌ
炭酸ナトリウム（緩衝剤） ２ｇ／ｌ（０．２重量％）
化合物を混合し、そのｐＨを８〜１２の間、すなわち１０．５の塩基性値に調整する。
【００４７】
このように調製された試薬によって、フランスのＡＢＸ社によって製造されたＡＢＸマイクロ（ＡＢＸ−Ｍｉｃｒｏｓ）の名称で販売されている自動血液装置を使用して、２つの血液学的分析を実施する。
【００４８】
この目的のために、予め、特定の容量の分析する血液サンプルを特定の容量の希釈剤および前述の試薬と混合する。
【００４９】
この実施例では、動物血液で測定を行なう。図１および図２に、２つの異なる血液サンプルで行なった測定の結果を示す。
【００５０】
これらの図は、相対的強度にもとづいて白血球の数を示している。４つの白血球亜細胞の存在が認められる。
【００５１】
図は、抵抗性分析に関し、次の亜細胞、すなわち、リンパ球（ＬＹＭ）、単球（ＭＯ）、顆粒球（ＧＲＡ）および多核性の好酸球（ＥＯＳ）を右から左へ参照することができ、それらは矢印によって定められている。
【００５２】
その自動装置は、各白血球亜細胞に対する計測された細胞数とそれに対応する百分率を示す以下の測定結果を提供する。
【００５３】
分析結果１（図１参照）
リンパ球（ＬＹＭ）： ３９５６細胞 ５３．２３％
単球（ＭＯ）： ４２０細胞 ５．６５％
顆粒球（ＧＲＡ）： ２５７６細胞 ３４．６５％
多核性の好酸球（ＥＯＳ）： ４８１細胞 ６．４７％
分析結果２（図２参照）
リンパ球（ＬＹＭ）： １０７１細胞 ９．３４％
単球（ＭＯ）： ８０５細胞 ７．００％
顆粒球（ＧＲＡ）： ８９０６細胞 ７７．５２％
多核性の好酸球（ＥＯＳ）： ７０６細胞 ６．１４％
従って、本実施例による試薬は、上記の４つの亜細胞の各々を同定し定量することができる。
【００５４】
（実施例２）
ヒト血液の異なる２つのサンプルについて、実施例１と同じ試薬を使用し、同様の分析を行なう。ＡＢＸ社製の自動ＡＢＸ−ベガ（ＡＢＸ−Ｖｅｇａ）血液装置によって測定を実施した。
【００５５】
図３および４にその結果を示す。
【００５６】
図３に相当するサンプルでは、この分析は、次の４つの亜細胞、すなわち、リンパ球（ＬＹＭ）、単球（ＭＯ）、顆粒球（ＧＲＡ）および多核性の好酸球（ＥＯＳ）を同定および定量することを可能にした。ＥＯＳの定量は、総細胞数の５％を示している。
【００５７】
図４に相当するサンプルの場合には、この分析は、次の３つの亜細胞、すなわち、リンパ球（ＬＹＭ）、単球（ＭＯ）および顆粒球（ＧＲＡ）を同定し定量することを可能にした。さらに、この分析は、サンプルがいかなる多核性の好酸球も含まないこと（０％レベル）を示している。
【００５８】
（実施例３）
実施例１および２において使用した試薬と同様の試薬を用いるが、ｐＨは中性ｐＨ、すなわち７．６％に調整する。ヒト血液のサンプルで同様の分析を実施する。ＡＢＸ社製の自動ＡＢＸ−ベガ（ＡＢＸ−Ｖｅｇａ）血液装置を用いて測定を実施する。
【００５９】
図５に測定の結果を示す。次の３つの主要白血球亜細胞、リンパ球（ＬＹＭ）、単球（ＭＯ）および顆粒球（ＧＲＡ）のみが検知された。
【００６０】
（実施例４）
実施例３と同様の試薬を使用するため、中性のｐＨに調整する。ヒト血液のサンプルで同様の分析を実施する。ＡＢＸ社製の自動ＡＢＸ−マイクロ（ＡＢＸ−Ｍｉｃｒｏｓ）血液装置によって測定を実施する。
【００６１】
図６に測定の結果を示す。実施例３のように、次の３つの主要な白血球亜細胞、すなわち、リンパ球（ＬＹＭ）、単球（ＭＯ）、および顆粒球（ＧＲＡ）のみが検知された。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明における実施例１による測定結果を示す図である。
【図２】本発明における実施例１による測定結果を示す図である。
【図３】本発明における実施例２による測定結果を示す図である。
【図４】本発明における実施例２による測定結果を示す図である。
【図５】本発明における実施例３による測定結果を示す図である。
【図６】本発明における実施例４による測定結果を示す図である。

Claims (13)

1. 血液サンプル中のヘモグロビンの測定および白血球の検出用試薬であって、
   少なくとも１つのカチオン型のデタージェントと、
   配糖体型の化合物、特にサポニンと、
   少なくとも１つの無機塩、および／または浸透作用および／または白血球保護作用を有する物質と、
   次の３つの白血球亜細胞、すなわち、リンパ球、単球および好中球を同定する実質的な中性値（５〜８の間のｐＨ）、または前記３つの白血球亜細胞に加えてさらに、多核性の好酸球を同定する塩基性値（８〜１２の間のｐＨ）のいずれかにその試薬のｐＨを選択的に調整することができる有機および／または無機の緩衝剤とからなることを特徴とする試薬。
2. 前記デタージェントが次の成分、すなわち、
   第一級アミン、脂肪アミンの酢酸塩および塩酸塩と、
   第四級アンモニウム塩、およびトリメチルケチルアンモニウムの臭化物と、
   エチル硫酸塩によってカチオン型にされた置換したジアミンのアミド、ジエタノールアミノプロピルアミン、ジエチルアミノプロピルアミドと、
   環状形成されたジエチレントリアミンのアミドとから選択されることを特徴とする請求項１に記載の試薬。
3. 前記デタージェントが、０〜５０ｇ／ｌの範囲の濃度で存在することを特徴とする請求項１または２に記載の試薬。
4. 前記配糖体型の化合物が、サポニン（またはサポノシド）から選択されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の試薬。
5. 前記配糖体型の化合物が、０．５〜２０ｇ／ｌの範囲の濃度で存在することを特徴とする請求項１〜４のいずれか１項に記載の試薬。
6. 前記無機塩が次の化合物、すなわち、ナトリウムまたはカリウムの塩化物、硫酸塩またはフッ化物から選択されることを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の試薬。
7. 前記無機塩が、１〜１５ｇ／ｌの範囲の濃度で存在することを特徴とする請求項１〜６のいずれか１項に記載の試薬。
8. 前記浸透作用および／または白血球保護作用を有する物質をマンニトール、Ｄ−グルコース等から選択することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の試薬。
9. 前記浸透作用および／または白血球保護作用を有する物質が、０〜３０ｇ／ｌの範囲の濃度で存在することを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の試薬。
10. 前記有機および／または無機の緩衝剤が、次の化合物、すなわち、
    トリエタノールアミン、
    ナトリウムとカリウムの水素化したリン酸塩、
    Ｎ−［２−アセトアミド］−２−イミノ二酢酸、
    Ｎ−［カルバモイルメチル］イミノ二酢酸、
    ２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、
    グリシン、
    炭酸ナトリウム、
    クエン酸、
    トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンから選択されることを特徴とする請求項１〜９のいずれか１項に記載の試薬。
11. 前記有機および／または無機の緩衝剤が、０〜２重量％の範囲の濃度で存在することを特徴とする請求項１〜１０のいずれか１項に記載の試薬。
12. 前記緩衝剤が、試薬のｐＨを５〜８の間の値に調整することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の試薬。
13. 前記緩衝剤が、試薬のｐＨを８〜１２の間の値に調整することを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の試薬。

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