PL193577B1 - Odczynnik do pomiaru hemoglobiny i oznaczania leukocytów w próbce krwi - Google Patents

Abstract

1. Odczynnik do pomiaru hemoglobiny i oznaczania leukocytów w próbce krwi, znamienny tym, ze zawiera: - co najmniej jeden detergent typu kationowego wystepujacy w stezeniu od 0 do 50 g/l, - zwiazek typu glikozydu, korzystnie saponiny, wystepujacy w stezeniu od 0,5 do 20 g/l, - co najmniej jedna sól nieorganiczna, z wylaczeniem zwiazków cyjankowych, wystepujaca w stezeniu od 1 do 15 g/l i/lub czynnik osmotyczny, korzystnie mannit lub D-glukoze, wystepu- jacy w stezeniu od 0 do 30 g/l, oraz - srodek buforowy organiczny i/lub nieorganiczny dostosowujacy selektywnie pH odczynnika, albo do wartosci zasadniczo obojetnej, z pH w zakresie od 5 do 8, dla okreslenia ilosciowego i identyfikacji trzech podpopulacji leukocytów, którymi sa limfocyty, monocyty i krwinki biale obojetnochlonne, albo do wartosci zasadowej, z pH w zakresie od 8 do 12, dla ustalenia wielopierscieniowych granulocytów kwasochlonnych w dodatku do tych trzech pod populacji. PL PL PL

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest odczynnik do pomiaru hemoglobiny i oznaczania leukocytów w próbce krwi, mający zastosowanie do analiz hematologicznych.

Pomiar stężenia hemoglobiny i oznaczania leukocytów, w szczególności niektórych podpopulacji leukocytów, ma zasadnicze znaczenie w diagnostyce niektórych patologii i to zarówno w medycynie jak i w weterynarii.

Hemoglobina jest chromoproteiną zawartą w krwinkach czerwonych krwi (erytrocytach).

Pomiar stężenia hemoglobiny wymaga więc użycia odczynnika do rozpadu komórkowego mogącego doprowadzić do rozpadu erytrocytów lub krwinek czerwonych, aby uwolnić hemoglobinę, w celu jej pomiaru.

Znane jest stosowanie w tym celu odczynników zawierających jony cyjanku, które mogą dokonać rozpadu erytrocytu i przetworzyć hemoglobinę w stabilny związek barwnikotwórczy, dla umożliwienia dokonania oznaczenia hemoglobiny przez pomiar kolorymetryczny. Odczynnik tego rodzaju opisany jest w szczególności w opisie patentowym US 3, 874, 852. Główną wadą tego odczynnika jest zastosowanie w nim cyjanku, a ponadto, nie umożliwia on identyfikacji i policzenia podpopulacji leukocytów zawartych w próbce krwi poddanej analizie.

W rzeczywistości sprawdza się, że oznaczenie podpopulacji leukocytów, w szczególności limfocytów, monocytów, krwinek białych obojętnochłonnych i granulocytów kwasochłonnych, ma zasadnicze znaczenie dla identyfikacji niektórych patologii.

Inne odczynniki, nie zawierające cyjanku, są przedmiotem wcześniejszych rozwiązań znanych ze stanu techniki, do oznaczania leukocytów w próbkach krwi.

Przykłady takich odczynników opisane są, na przykład, w europejskim opisie patentowym EP 0 325 710.

Zaletą tych odczynników jest to, że nie zawierają cyjanku, jednak mają one również tę niedogodność, że nie umożliwiają identyfikacji i dokładnego oznaczenia ilościowego podpopulacji leukocytów krwi.

Zatem, odczynnik według EP 0 325 710 umożliwia, na przykład, oznaczenie granulocytów kwasochłonnych znajdujących się w próbce krwi, ale nie umożliwia identyfikacji w sposób precyzyjny innych podpopulacji leukocytów.

Z kolei, europejski opis patentowy EP 0 424 871 opisuje odczynniki umożliwiające zróżnicowanie podpopulacji leukocytów. Jednak, odczynniki te napotykają niekiedy na trudności, aby pokonać napięcia błonowe, które występują w stanach patologii ludzkiej i w biologii weterynaryjnej.

Celem wynalazku jest uniknięcie wymienionych niedogodności.

W szczególności, celem wynalazku jest opracowanie odczynnika do analizy hematologicznej do pomiaru hemoglobiny i oznaczania leukocytów w próbce krwi, który umożliwiałby zwłaszcza rozpad erytrocytów lub krwinek czerwonych, jak również pomiar hemoglobiny bez stosowania związków cyjankowych.

Celem wynalazku jest również opracowanie odczynnika, który umożliwiałby dokonanie całościowego oznaczenia ilościowego leukocytów, lub krwinek białych, identyfikację co najmniej jednej podpopulacji leukocytów i oznaczenie ilościowe co najmniej jednej takiej podpopulacji.

Celem wynalazku jest ponadto opracowanie odczynnika, który mógłby być stosowany zarówno w medycynie jak i weterynarii.

Dalszym celem wynalazku jest też opracowanie odczynnika, który mógłby wyeliminować trudności analizy związane z występowaniem napięć błonowych, które napotyka się w stanach patologii ludzkiej i w biologii weterynaryjnej.

Zgodnie z wynalazkiem, odczynnik do pomiaru hemoglobiny i oznaczania leukocytów w próbce krwi charakteryzuje się tym, że zawiera:

- co najmniej jeden detergent typu kationowego występujący w stężeniu od 0 do 50 g/l,

- związek typu glikozydu, korzystnie saponiny, występujący w stężeniu od 0,5 do 20 g/l,

- co najmniej jedną sól nieorganiczną, z wyłączeniem związków cyjankowych, występującą w stężeniu od 1 do 15 g/l i/lub czynnik osmotyczny, korzystnie mannit lub D-glukozę, występujący w stężeniu od 0 do 30 g/l, oraz

- środek buforowy organiczny i/lub nieorganiczny dostosowujący selektywnie pH odczynnika, albo do wartości zasadniczo obojętnej, z pH w zakresie od 5 do 8, dla określenia ilościowego i identyfikacji trzech podpopulacji leukocytów, którymi są limfocyty, monocyty i krwinki białe obojętnochłonne,

PL 193 577B1 albo do wartości zasadowej, z pH w zakresie od 8 do 12, dla ustalenia wielopierścieniowych granulocytów kwasochłonnych w dodatku do tych trzech podpopulacji.

Korzystnie, detergent typu kationowego wybrany jest spośród związków obejmujących:

- aminy pierwszorzędowe, octany i chlorowodorki amin tłuszczowych,

- czwartorzędowe sole amoniowe i bromek trimetylocetylu amonu,

- amidy podstawionych diamin, jonizowane dodatnio siarczanem etylowym, dietanoloamino-propyloaminą, dietyloamino-propyloamidem, oraz

- amidy dietylenotriaminowe cyklizowane.

Korzystnie, związek typu glikozydu wybrany jest z grupy obejmującej saponiny triterpenowe albo steroidowe.

Korzystnie, sól nieorganiczna wybrana jest spośród związków obejmujących chlorek, siarczan lub fluorek sodowy lub potasowy.

Korzystnie, środek buforowy organiczny i/lub nieorganiczny wybrany jest spośród związków obejmujących:

- trietanoloaminę,

- uwodornione fosforany sodu i potasu,

-kwas N-[2-acetoamido]-2 iminodioctowy,

-kwas N-[karbamoilmetylu] iminodioctowy,

-2 amino-2-metyl propanediol-1,3,

- glicynę,

- węglan sodowy,

-kwas cytrynowy, oraz

- aminometan tris(hydroksymetylu).

Korzystnie, środek buforowy organiczny i/lub nieorganiczny występuje w stężeniu zawartym między 0% i 2% wagowych.

Korzystnie, środek buforowy dostosowuje pH odczynnika do wartości zawartej pomiędzy 5 i 8, albo do wartości zawartej pomiędzy 8 i 12.

Rozwiązanie według wynalazku przedstawiono na rysunku, w oparciu o ilustrację przeprowadzonej analizy hematologicznej, na którym fig. 1 i fig. 2 pokazują liczbę leukocytów według natężenia względnego, w badaniu wykonanym na automacie hematologicznym typu ABX-Micros, francuskiej firmy ABX, a fig. 3 do fig. 6 przedstawiają wyniki analizy rezystywnej, przy obserwacji od strony prawej do lewej wykresu następujących podpopulacji, ograniczonych strzałkami: limfocyty (LYM), monocyty (MO), granulocyty (GRA) i wielopierścieniowe granulocyty kwasochłonne (EOS).

Odczynnik hematologiczny według wynalazku zawiera zatem co najmniej cztery główne składniki, które umożliwiają osiągnięcie postawionych celów.

Detergent typu kationowego powoduje rozpad krwinek czerwonych lub erytrocytów, co umożliwia uwolnienie hemoglobiny, która może być następnie oznaczona przez pomiar adsorbancji.

Detergenty jonowe (anionowe i kationowe) stosowane są głównie po to, aby zdysocjować związki białkowe, i aby rozpuścić proteiny błonowe. Są one zwane środkami skażającymi.

Ponadto, wywierają one szybkie i wielostronne działanie na populacje komórek krwi (erytrocyty i leukocyty).

Związek typu glikozydu, w szczególności saponiny, powoduje rozpad krwinek czerwonych. Ponadto, spełnia on funkcję stabilizującą w stosunku do hemoglobiny, co umożliwia badanie hemoglobiny przy określonej długości fal. W szczególności, związek ten przyczynia się do niszczenia napięcia błonowego krwinek czerwonych.

Saponiny, zwane inaczej saponozydami, są glikozydami mogącymi doprowadzić do rozpadu erytrocytów, ale rozpad ten jest wolniejszy od rozpadu uzyskanego w obecności detergentów jonowych. Wówczas, gdy saponiny stosowane są wraz z innymi detergentami, umożliwiają one uzyskanie szybszego rozpadu erytrocytów, co ogranicza zniekształcenie leukocytów.

Ponadto, struktura chemiczna tego rodzaju związków, która charakteryzowana jest przez szkielet węglowy z wielokrotnym cyklem, umożliwia stabilizację fizyko-chemiczną pochodnych utleniania hemoglobiny.

Sól nieorganiczna wpływa na aktywność detergentu. Ponadto, konieczne jest stosowanie pomiaru przez rezystywność.

Czynnik osmotyczny spełnia głównie rolę leukoprotektora wówczas, gdy stosowany odczynnik ma obojętne pH, aby ułatwić różnicowanie podpopulacji leukocytów.

PL 193 577 B1

Wreszcie, środek buforowy jest składnikiem kluczowym, ponieważ pH odczynnika jest ważną cechą. W rzeczywistości, zależnie od wartości pH odczynnik umożliwia identyfikację jednej lub wielu podpopulacji leukocytów.

Wówczas, gdy odczynnik dostosowany jest do wartości w przybliżeniu obojętnej (pH zawarte pomiędzy 5 i 8) możliwe jest oznaczenie ilościowe oraz identyfikacja trzech następujących podpopulacji leukocytów: limfocyty, monocyty i neutrofile (krwinki białe obojętnochłonne).

Wówczas, gdy pH odczynnika dostosowane jest do wartości zasadowej (pH zawarte między 8 i 12) można ponadto identyfikować i oznaczać ilościowo wielopierścieniowe granulocyty kwasochłonne.

Stąd też, dla zastosowań wymagających identyfikacji wielopierścieniowych granulocytów kwasochłonnych, trzeba przystosować pH odczynnika do wartości zasadowej.

Natomiast, gdy identyfikacja taka nie jest wymagana, pH odczynnika dostosowane jest do wartości, która jest w zasadzie obojętna.

W odczynniku według wynalazku detergent korzystnie wybrany jest spośród związków, którymi są aminy pierwszorzędowe, octany i chlorowodorki amin tłuszczowych, czwartorzędowe sole amoniowe i bromek trimetylocetylu amonu, amidy podstawionych diamin, jonizowane dodatnio siarczanem etylowym, dietanoloamino-propyloaminą, dietyloamino-propyloamidem, oraz amidy dietylenotriaminowe cyklizowane.

Detergent występuje korzystnie w stężeniu zawartym pomiędzy 0 i 50 g/l, a korzystniej około 18 g/l.

Wśród związków typu glikozydu preferuje się przede wszystkim saponiny, zwane też saponozydami, triterpenowe albo steroidowe.

W odczynniku według wynalazku związek typu glikozydu korzystnie występuje w stężeniu zawartym pomiędzy 0,5 i 20 g/l, a korzystniej około 2 g/l.

Sól nieorganiczna korzystnie wybrana jest spośród następujących związków: chlorek, siarczan lub fluorek sodowy lub potasowy.

Sól nieorganiczna korzystnie występuje w stężeniu zawartym pomiędzy 1i 15 g/l, a korzystniej około 8 g/l.

Czynnik osmotyczny (leukoprotektor) korzystnie wybrany jest spośród mannitu, D-glukozy i podobnych związków.

Ten czynnik osmotyczny korzystnie występuje w stężeniu zawartym pomiędzy 0i 30 g/l, a korzystniej około 2,5 g/l.

Środek buforowy organiczny i/lub nieorganiczny korzystnie wybrany jest spośród związków, którymi są: trietanoloamina, uwodornione fosforany sodu i potasu, kwas N-[2-acetoamido]-2 iminodioctowy, kwas N-[karbamoilmetylu]iminodioctowy, 2 amino-2-metyl propanediol-1,3, glicyna, węglan sodowy, kwas cytrynowy, oraz aminometan tris(hydroksymetylu).

Środek buforowy występuje korzystnie w stężeniu zawartym pomiędzy 0% i 2% wagowych.

W pierwszym przykładzie wykonania wynalazku, środek buforowy dostosowuje pH odczynnika do wartości zawartej pomiędzy 5 i 8.

W innym przykładzie wykonania, środek buforowy dostosowuje pH odczynnika do wartości zawartej pomiędzy 8 i 12.

Wynalazek opisany jest w odniesieniu do następujących, przykładów wykonania.

Przykład 1

Przygotowuje się odczynnik z niżej wymienionych związków i o wskazanym stężeniu:

Związki

Chlorek sodowy

C15H34 NCl (detergent kationowy)

Saponiny triterpenowe

Węglan sodowy (środek buforowy)

Stężenie 9 g/l g/l 2 g/l g/l (0,2% wagowych)

Związki poddaje się mieszaniu, a pH dostosowuje się do wartości zasadowej zawartej pomiędzy 8 i 12, a mianowicie 10,5.

Za pomocą tak przygotowanego odczynnika przystępuje się do dwóch analiz hematologicznych stosując automat hematologiczny ABX-Micros sprzedawany przez francuską firmę ABX.

W tym celu, miesza się wstępnie określoną objętość analizowanej próbki krwi z określoną objętością rozpuszczalnika i wymienionego odczynnika.

W przykładzie tym wykonano pomiary na zwierzęcych próbkach krwi. Wyniki pomiarów przeprowadzonych na tych dwóch różnych próbkach krwi przedstawiono na fig. 1i 2.

PL 193 577B1

Na tych figurach przedstawiono wykres obrazujący liczbę leukocytów w funkcji natężenia względnego. Stwierdzono istnienie czterech podpopulacji leukocytów.

Chodzi tu o analizę rezystywną przy obserwacji od prawej do lewej strony wykresu następujących podpopulacji, ograniczonych strzałkami: limfocyty (LYM), monocyty (MO), granulocyty (GRA) i wielopierścieniowe granulocyty kwasochłonne (EOS).

Automat podaje następujące wyniki zliczania, które dla każdej podpopulacji leukocytów wskazują liczbę zliczonych komórek i odpowiadającą im zawartość procentową, dla każdej podpopulacji leukocytów.

Analiza 1 (fig. 1)

LYM : 3956 komórek 53,23%

MO : 420 komórek 5,65%

GRA : 2576 komórek 34,65%

EOS : 481 komórek 6,47%

Analiza 2 (fig. 2)

LYM : 1071 komórek 9,34%

MO : 805 komórek 7,00%

GRA : 8906 komórek 77,52%

EOS : 706 komórek 6,14%

Zatem, odczynnik z tego przykładu, umożliwia identyfikację i oznaczenie ilościowe każdej z czterech podpopulacji leukocytów wskazanych powyżej.

P r z y k ł a d 2

Stosuje się ten sam odczynnik jak w przykładzie 1 i przystępuje do podobnych analiz na dwóch różnych próbkach krwi ludzkiej. Pomiary dokonywane są za pomocą automatu hematologicznego

ABX-Vega firmy ABX.

Wyniki przedstawione zostały na fig. 3 i 4.

Dla próbki odpowiadającej fig. 3, analiza umożliwia identyfikację i oznaczenie ilościowe czterech następujących podpopulacji: limfocyty (LYM), monocyty (MO), granulocyty (GRA) i wielopierścieniowe granulocyty kwasochłonne (EOS). Te ostatnie reprezentują 5% całej populacji.

W przypadku próbki odpowiadającej fig. 4, analiza umożliwia identyfikację i oznaczenie ilościowe trzech następujących podpopulacji: limfocyty (LYM), monocyty (MO), granulocyty (GRA).

Ponadto, analiza ujawnia, że próbka nie zawiera wielopierścieniowych granulocytów kwasochłonnych (poziom 0%).

P r z y k ł a d 3

Stosuje się odczynnik podobny jak w przykładach 1 i 2, ale dostosowuje się go do pH obojętnego, a mianowicie 7,6%. Przystępuje się do podobnych analiz na próbce krwi ludzkiej. Pomiary wykonywane są za pomocą automatu hematologicznego ABX-Vega firmy ABX.

Wyniki pomiarów przedstawione są na fig. 5. Wykryto jedynie następujące trzy główne podpopulacje leukocytów: limfocyty (LYM), monocyty (MO) i granulocyty (GRA).

P r z y k ł a d 4

Stosuje się odczynnik podobny jak w przykładzie 3, a więc dostosowany do pH obojętnego. Przystępuje się do podobnych analiz na próbce krwi ludzkiej. Pomiary wykonywane są za pomocą automatu hematologicznego ABX-Micros firmy ABX.

Wyniki pomiarów przedstawione są na fig. 6. Podobnie jak w przykładzie 3, uwzględnione są tylko następujące trzy główne podpopulacji leukocytów: limfocyty (LYM), monocyty (MO) i granulocyty (GRA).

Claims (8)

1. Odczynnik do pomiaru hemoglobiny i oznaczania leukocytów w próbce krwi, znamienny tym, że zawiera:

- co najmniej jeden detergent typu kationowego występujący w stężeniu od 0 do 50 g/l,

- związek typu glikozydu, korzystnie saponiny, występujący w stężeniu od 0,5 do 20 g/l,

- co najmniej jedną sól nieorganiczną, z wyłączeniem związków cyjankowych, występującą w stężeniu od 1 do 15 g/l i/lub czynnik osmotyczny, korzystnie mannit lub D-glukozę, występujący w stężeniu od 0 do 30 g/l, oraz

PL 193 577 B1

- środek buforowy organiczny i/lub nieorganiczny dostosowujący selektywnie pH odczynnika, albo do wartości zasadniczo obojętnej, z pH w zakresie od 5 do 8, dla określenia ilościowego i identyfikacji trzech podpopulacji leukocytów, którymi są limfocyty, monocyty i krwinki białe obojętnochłonne, albo do wartości zasadowej, z pH w zakresie od 8 do 12, dla ustalenia wielopierścieniowych granulocytów kwasochłonnych w dodatku do tych trzech pod populacji.

2. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że detergent typu kationowego wybrany jest spośród związków obejmujących:

- aminy pierwszorzędowe, octany i chlorowodorki amin tłuszczowych,

- czwartorzędowe sole amoniowe i bromek trimetylocetylu amonu,

- amidy podstawionych diamin, jonizowane dodatnio siarczanem etylowym, dietanoloamino-propyloaminą, dietyloamino-propyloamidem, oraz amidy dietylenotriaminowe cyklizowane.

3. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że związek typu glikozydu wybrany jest z grupy obejmującej saponiny triterpenowe albo steroidowe.

4. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że sól nieorganiczna wybrana jest spośród związków obejmujących chlorek, siarczan lub fluorek sodowy lub potasowy.

5. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że środek buforowy organiczny i/lub nieorganiczny wybrany jest spośród związków obejmujących:

- trietanoloaminę,

- uwodornione fosforany sodu i potasu,

-kwas N-[2-acetoamido]-2 iminodioctowy,

-kwas N-[karbamoilmetylu] iminodioctowy,

-2 amino-2-metyl propanediol-1,3,

- glicynę,

- węglan sodowy,

-kwas cytrynowy, oraz - aminometan tris(hydroksymetylu).

6. Odczynnik według zastrz. 5, znamienny tym, że środek buforowy organiczny i/lub nieorganiczny występuje w stężeniu zawartym między 0% i 2% wagowych.

7. Odczynnik według zastrz. 6, znamienny tym, że środek buforowy dostosowuje pH odczynnika do wartości zawartej pomiędzy 5 i 8.

8. Odczynnik według zastrz. 6, znamienny tym, że środek buforowy dostosowuje pH odczynnika do wartości zawartej pomiędzy 8 i 12.