KR19980074333A

KR19980074333A - 센텔라아시아티카에서 분리한 아시아티코사이드와 마테카소 사이드의 수용성 추출물 및 그 분리방법

Info

Publication number: KR19980074333A
Application number: KR1019970010114A
Authority: KR
Inventors: 김권; 이승용; 서성기; 황병룡; 박진규
Original assignee: 강재헌; 동국제약 주식회사
Priority date: 1997-03-24
Filing date: 1997-03-24
Publication date: 1998-11-05
Also published as: KR100228873B1; EP0867447A1; DE69711843D1; DE69711843T2; US6417349B1; JPH10279590A; EP0867447B1

Abstract

본 발명은 Centella asiatica(L)Urb로부터 간세포 보호효과와 항섬유화 효과가 탁월한 아시아티코사이드와 마테카소사이드의 수용성 추출물 및 그 분리방법에 관한 발명이다.

시료에 에탄올 수용액을 첨가하여 얻은 추출액에 염화메틸렌을 가하여 층분리하여 상등액에 노말부탄으로 추출한 후 노말부탄층을 가성소다로 세척하고 물로 세척한다. 부탄올 층을 가압농축하고 에틸아세테이트를 첨가하여 결정화한 후 분리하여 세척, 건조하여 아시아티코사이드와 마테카소 사이드가 혼합된 추출물을 분리하였다.

시 수용성 추출물로 간세포 보호효과를 확인하기 위하여 흰쥐의 간세포에 독성을 유발시켜 독성차단 및 회복효과를 실험한 바 40 -60%의 효과를 나타냈고, 항간섬유화 효과를 확인하기 위하여 담도결찰법 및 간섬유화 실험을 통하여 섬유화를 완화시키는 효과가 있다는 것을 확인하였다.

Description

센텔라아시아티카에서 분리한 아시아티코사이드와 마테카소 사이드의 수용성 추출물 및 그 분리방법

본 발명은 센텔라아시아티카(Centella asiatica, 일명 적설초)로부터 분리한 간세포 보호효과와 항섬유화 효과가 있는 아시아티코사이드와 마테카소사이드의 수용성 추출물 및 분리방법에 관한 것이다.

아프리카의 마다가스카르섬과 인도등에서 자생하는 Centella asiatica (L.) Urb.은 미나리과(Umbelliferea)에 속하는 식물로 과거 오래전부터 국소상처치료에 사용되어져 왔으며(Poizot. A., Dumez. D., C.R. Acad. Sci. [D] 286, 1978), 이것의 정량추출물인 Titrated Extract of Centella asiatica(이하 TECA라 함)는 효과가 인정되어 그 추출물은 Madecassol(아시아티코사이드, 아시아틱산, 마데카식산=4:3:3)로 상품화 되어, 피부와 위점막을 위시한 국소적 조직손상에 대한 치료효과가 이미 여러 연구자들의 보고에 의해 널리 알려져 있다. 이는 주로 섬유화 과정을 변형시키고 조직내 세포를 보호함으로써 손상된 조직이 원상에 가깝게 치유되는데 그 역할을 하는 것으로 생각되고 있다.

그러나, 이들 성분은 외과적 상처치료에 국한되고 있으며, 그 추출방법은 한국특허공고 제 87-1458호, 제 87-1573호, 제 91-2518호 등에 게재된 바와 같이 복잡한 공정을 거치게 되므로서 수율과 순도가 좋지않다고 지적하고 있다. 또한, 목적하는 주성분이 게닌(아시아틱산, 메테카식산, 마다시아틱산)과 아시아티코사이드로서 수불용성이므로 용도확대의 한계가 있었다.

기존의 TECA는 항섬유화에 대한 탁월한 효과가 있음에도 불구하고 수불용성의 물리적 성질로 인하여 분말형태로 외과적 상처치료로 그 응용범위가 제한되었다. 본 발명자들은 이러한 TECA의 제제학적인 응용범위를 확대하기 위하여 많은 연구를 거듭한 끝에 TECA의 수용성을 극대화 하는데 착안하여 센텔라아시아티카로부터 기존의 TECA 추출법과는 다른 새로운 추출방법으로 아시아티코사이드와 마테카소사이드를 주성분으로 하는 간세포 보호효과와 항섬유화 효과에 탁월한 효과가 있는 수용성 추출물을 분리하는 방법을 발명하였다.

1) 아시아티코사이드와 마테카소사이드 추출물의 분리

센텔라아시아티카를 알콜성 수용액으로 추출한 다음 이액을 할로겐화용매로 처리한 뒤 얻어지는 수층을 다시 알콜(Cn≥4)로 추출한다. 이어 알콜(Cn≥4) 층을 알카리수용액으로 수용액으로 수회 처리하고 얻어지는 알콜(Cn≥4) 층을 감압농축하거나 알콜층으로부터 침전을 유도하여 고체를 얻는다.

이 고체는 Asiaticoside와 Madecassoside를 주성분으로 하며, 물에 대한 용해도를 가진다.

그 구조는 식 (1)에서 나타내는 바와 같다.

식 (1)

본원 발명의 추출에 사용되는 알콜성 수용액은 메탄올, 에탄올의 알콜성수용액이며 알콜함량은 50-80%의 것이다. 알콜성수용액을 처리하는 할로겐화용매는 염화메칠렌, 클로로폼, 디클로로에탄, 디클로로에텐을 사용할 수 있다. 할로겐화용매로 추출하고 얻어지는 수층을 추출하는 용매는 Cn≥4의 알콜이며 이는 노말부탄올, 세크부탄올, 아밀알콜을 이용한다. 알콜(Cn≥4)층을 처리하는 알카리수용액은 가성소다, 가성카리수용액을 사용한다.

이상의 방법으로 추출된 센텔라아시아티카의 신규추출물은 Asiaticoside (40-60%), Madecassoside (40-60%)의 조성이며 두 성분이 신규추출물의 97%이상을 차지한다. 이 신규추출물은 물, 알콜, 식물유에 녹으며 특히 물에 대한 용해도는 이 신규 추출물의 중요한 물리적 성질이므로 이 신규추출물을 Water Soluble TECA 이하 WS-TECA로 약칭한다.

2) 간세포 보호효과 실험

일차 배양한 흰쥐의 간세포에 대표적 독성물질로 알려져 있는 사염화탄소(Cl₄) 및 Galactosamine로 간세포에 독성을 유발시켜 WS-TECA의 독성차단 및 회복효과를 확인하였다.

(가). 실험동물

흰쥐(Wistar, male, 150-200g)를 온도 22±1℃, 습도 60±5%로 유지하면서 12시간 간격으로 명암을 바꿔주면서 사료와 물을 마음껏 섭취하도록 한다. 실험시에는 하루 전부터 굶겨 공복 상태가 되도록 하였다.

(나). 흰쥐의 간세포 배양

간세포를 Berry와 Friend의 방법을 약간 수정한 2단게 collagenase 관류법으로 분리하였다. 흰쥐를 urethane(1g/kg body weight)으로 마취시킨 다음 70% ethanol로 복부를 소독한 후 개복하였다. 간문맥에 20 guage catheter를 삽관하고 15ml/min의 속도로 HBBS 150ml를 관류시키면서 하대정맥을 잘라 혈액을 제거하였다. 흉강을 열어 하대정맥에 18 guage catheter를 삽관한 다음 하대정맥을 묶은 후 소화용액을 재손환시켰다. 재순환은 37℃에서 CO₂(5%)와 O₂(95%)의 혼합기체를 공급해주면서 HBBS 95ml과 collagenase (최종농도 0.05%)로 구성된 소화용액으로 10분간 수행하였다. 간세포가 분리되면 간을 몸체에서 적출하여 비이커에 옮긴 다음 HBBS 60ml를 가한 후 간막을 가위로 찢어서 간세포를 유리시킨 후 lens paper를 사용하여 여과하였다. 여과액은 50g에서 2분간 원심분리한 다음 상등액을 버리고 다시 배양액으로 같은 조건에서 원심분리한 후 간세포 현탁액을 얻었다. 간세포 현탁액은 5x 10⁵cells/ml의 농도로 collagen이 도포된 배양용기에 이식하였다. 배양액은 Waymouth's MB 752/1 medium, 10% fetal calf serum, 2.0mg/ml bovine serum albumin(fraction V), 10^-6M dexamethason, 10^-7M insulin, 5.32 x 10^-2M L-serine, 4.07 x 10^-2M NaHCO3, 100IU/ml penicillin, 100ug/ml streptomycin과 5ug/ml amphotericin B로 구성된 배양액을 사용하였다. 일정한 습도를 유지하는 37℃ 배양기에서 공기(95%)와 CO₂(5%)의 혼합기체를 계속 공급하면서 세포를 배양하였다.

다. 실험방법

간세포를 24시간 동안 배양한 후 배양액을 제거하고 10mM 사염화탄소를 함유한 배양액으로 갈아준 다음 1.5시간 동안 더 배양하여 사염화탄소에 의한 간세포 독성을 유도하였다. Galactosamine에 의한 간세포 독성은 간세포를 배양한지 1.5시간 경과한 후에 배양액을 1.5mM galactosamine을 첨가한 배양액으로 갈아준 후 14시간 동안 더 세포를 배양함으로써 유도되어졌다.

배양액중의 Glutamic pyruvic transaminase(GPT)와 Sorbitol dehydrogenase(SDH)는 Reitman-Frankel의 방법과 약간 수정된 Gerlach의 방법으로 각각 측정하였다.

Glutathione-S-transferase의 활성은 gluatathione, 1-chloro-2,4-dinitrobenzene, potassium phosphate buffer가 담긴 시험관에 post mitochondrial supernatant를 가하여 잘 혼합한 후 즉시 340nm에서 흡광도가 직상으로 증가하는 부분을 5분간 측정하여 mg 단백질이 매분당 생성하는 생성물의 양으로 나타내었다.

Post mitochondrial supernatant는 간세포를 배양한 후 배양용기의 배양액을 제거하고 3ml의 66mM Tris-HCl buffer(pH 7.4)를 가하여 세포현탁액으로 만들어 이것을 15초간 균질화시킨 후 원심분리(12500g, 15min)한 상등액을 이용하였다.

간세포내의 superoxide dimutase(SOD)의 활성은 McCord와 Frivich등의 방법을 수정하여 측정하였다. Post mitochondrial supernatant에 100ul에 0.2ml의 reagent A, 500ul의 DDW, 200ul의 reagent B를 가한 후 37℃에서 30분간 정치하여 반응시키고 200ul의 reagent C를 가하여 상온에서 20분간 방치한 후 550nm에서 흡광도를 측정하여 SOD unit로 환산하였다.

GSSG reductase의 활성은 phosphate buffer 600ul, 10mM GSSG 100ul, 1mM NADPH 100ul를 포함하는 시험관에 post mitochondrial supernatant 200ul를 가한 후 340nm에서 2분간의 흡광도의 변화를 측정하였다.

총 glutathione(GSH 및 GSSG)의 함량은 시험관에 0.3mM NADPH 700ul와 6mM DTNB 100ul를 넣고 post mitochondrial supernatant 200ul를 가한 후 30C로 유지되는 항온조에 방치한 후 여기에 50 units GSH reductase/ml 용액을 10ul 가하여 반응을 시작한 후 412nm에서 2분간 15초 간격으로 흡광도에 변화를 측정하였다.

Glutathione(oxidized form, GSSG)의 함량은 post mitochondrial supernatant 100ul당 2ul의 2-vinylpridine을 가하고 1분간 격렬히 반응시키고 25℃에서 60분 방치하여 GSH의 유도체가 형성되면 GSH의 함량을 측정하는 방법으로 남아있는 GSSG의 양을 측정하였다.

RNA 생합성 측정은 [3H]-uridine을 배양액에 첨가하여 (최종농도 1uCi/ml)방사성 동위원소로 표지된 uridine이 배양세포의 RNA에 incoporation되는 정도를 측정하였다. 배양액을 제거한 후 HBSS로 3회 세척하고 10% trichloroacetic acid를 1ml가하여 단백질을 침전시키고 1ml의 ethanol-ether(3:1)의 혼합용매를 가하여 잔존하는 trichloroacetic acid를 제거한 후 1N NaOH 200ul로 단백질을 용해시킨 후 그 중 100ul를 취하여 scintillation cockail인 aquasol을 3ml 가한 후 방사능을 측정하였다.

(라). 실험결과

WS-TECA는 사염화탄소로 유발시킨 일차배양한 흰쥐의 간세포에 1ug/ml에서부터 300ug/ml까지 증가시켜 투여하였을 때 WS-TWCA는 1ug/ml에서부터 100ug/ml까지 농도의존적으로 배양액중으로 유리되는 GPT 및 SDH의 활성을 감소시켰으며 100ug/ml의 농도에서 가장 높은 간세포 보호활성을 나타내었다. 또한 간세포내에 존재하는 여러효소들 해독작용에 관여하는 GST 자유기 생성의 억제 및 생성된 자유기의 제거에 관여하는 GSSG reductase, SOD의 활성을 증가시켰으며 자유기로 인하여 감소된 GSH의 양을 증가시켰다. 그 활성은 100ug/ml의 농도에서 가장 뛰어나 50-60%의 활성을 나타내었다. (표1)

Galactosamine으로 유발시킨 일차배양한 흰쥐의 간세포에 WS-TECA를 1ug/ml에서부터 300ug/ml까지 농도를 증가시켜 투여하였을 때 배양액중으로 유리되는 GTP 및 SDH의 활성을 300ug/ml의 농도에서 가장 많이 차단하여 가장 높은 간세포 보호활성은 나타내었다. 또한 galactosamine으로 인하여 감소된 간세포 내의 RNA의 생합성에 미치는 영향을 측정한 결과 WS-TECA는 300ug/ml의 농도에서 galactosamine으로 독성을 유발시킨 대조군에 비하여 RNA 생합성을 약 2배 증가시켜 galactosamine에 간세포 독성을 정상상태때의 40% 정도까지 회복시킴을 알 수 있었다. (표2)

표 1 사염화탄소에 의하여 유도된 간세포 독성에 미치는 WS-TECA의 효과

^*Protection (%) = (Reference값 - Sample값) / (Reference값 - Control값)

^**Control : CCl₄로 처리되지 않은 간세포

^***Reference : CCl₄로 처리되어진 간세포

표 2 Galactosamine에 의하여 유도된 간세포 독성에 미치는 WS-TECA의 효과

^*Protection (%) = (Reference값 - Sample값) / (Reference값 - Control값)

^**Control : Galactosamine으로 처리되지 않은 간세포

^***Reference : Galactosamine으로 처리되어진 간세포

(다) 항간섬유화 효과

본 발명에서 얻어진 WS-TECA의 항섬유화 효과는 담도 결찰법 또는 사염화탄소를 처리하여 간 섬유화를 유도한 실험동물에 WS-TECA를 투여하여 섬유화 과정의 주요원인인 콜라겐 생합성 및 조직내의 축적정도를 Serum procollagen N-terminal peptide (PIIIP)와 간의 hydroxyproline을 정량하여 측정할 수 있다. 각 시험방법 및 측정된 화합물의 항섬유화는 다음과 같다.

담도결찰법은 200-220g의 수컷의 SD계 랫트를 개복하여 담관을 double ligation한 후 4주동안 섬유화를 유도하였다. 약물은 매일 1회 복강으로 투여하였으며 혈청내의 PIIIP는 rabbit anti PIIIP antibody를 이용하여 ELISA방법으로 정량하였다. 조직내 collagen량은 간 조직을 산가수분해하여 유리되는 hydroxyproline을 chloramine T와 ER용액(P-dimethylaminobenzaldehyde, perchloric acid, isopropanol)을 이용하여 발색법으로 정량하였다.

담도결찰모델시험에서 항섬유화 효과는 다음과 같다. 간섬유화 지표인 hydroxyproline량을 WS-TECA는 용량의존성으로 감소함을 알 수 있었다. (표3) 또한 collagen 생합성지표인 혈청중 PIIIP농도도 저해함을 알 수 있었다. (표4) 이러한 사실로부터 WS-TECA는 간의 섬유화를 완화하는 효능약임을 알 수 있다.

Carbon tetrachloride로 유도한 섬유화동물 모델 시험은 다음과 같이 수행하였다. 200-220g의 수컷의 SD계 랫드에 CCl₄를 480mg/kg 용량으로 1주 2회 4주동안 복강 투여하여 간 섬유화를 유도하였다. 시험약은 매일 1회 생리 식염수에 녹여 복강으로 4주동안 투여하였다. 담도결찰 모델에서와 동일하게 혈청 PIIIP 농도와 간 조직내의 collagen 양을 측정하였다.

CCl₄처리시는 섬유화 유동정도가 담도결찰보다 완화된 모델로서 이때는 collagen 침착정도가 대조군에 비하여 두배정도 증가되었다. WS-TECA 처리시 간 조직내의 collagen 침착이 용량 의존적으로 저해되었으며(표5), 또한 혈청 PIIIP 농도도 저해함을 보여주었다. (표6)

이러한 사실로부터 WS-TECA 95는 간 섬유화 원인에 관계없이 collagen의 합성 증가와 이들의 조직내의 침착으로 기인되는 간 섬유화 정도를 collagen 합성 억제를 유도하여 섬유화를 완화시키는데 효과적인 약물임을 알 수 있다.

(표 3) 담도결찰 모델에서 WS-TECA의 hydroxyproline 침착 저해 효과

(표 4) 담도결찰 모델에서 WS-TECA의 혈중 PIIIP 농도저하 효과

(표 5) CCl₄처리 랫드에서의 WS-TECA의 collagen 침착 저해 효과

(표 6) CCl₄처리 랫드에서의 WS-TECA의 혈청 PIIIP 농도 저하 효과

실시예 1

센텔라아시아티카 건조물 4.7kg에 70% 에탄올수용액 32L를 가하고 48시간 동안 냉침한다. 에탄올성추출액을 여과하여 하구병에 옮기고 여기에 염화메칠렌 17L를 가하고 1시간 동안 교반한 뒤 완전히 층분리가 된후 상층만을 취한다. 상층에 에탄올 5L, 염화메칠렌 7L를 넣고 1시간동안 교반한 다음 완전히 층분리가 되면 상층을 취하고 얻어진 상층액을 노말부탄올 17L를 사용하여 추출하고 얻어진 노말부탄올층은 0.1N NaOH용액으로 수회세척하고 다시 물로 세척한다. 부탄올층을 총부피의 10분의 1 정도로 감압농축하여 5L의 에칠아세테트에 넣어 결정화한다. 생성된 결정을 흡인여과하고 얻어진 고체를 소량의 에틸아세테이트로 세척하고 50℃에서 24시간 진공건조하여 미황색 고체 120g을 얻는다.

실시예 2

센텔라아시아티마 5Kg에 70% 메탄올 수용액 35ℓ를 가하고 48시간동안 10℃로 냉각하여 추출시킨다.

메탄올성 추출액을 여과하여 하구병에 옮기고 실시예 1과 같은 방법으로하여 아시아티코사이드와 마테카소사이드가 혼합된 추출물 (4:6) 125g을 얻었다.

실시예 3

실시예 1과 같은 방법으로하여 아시아티코사이드와 마테카소사이드가 혼합된 추출물 (6:4) 118g을 얻었다.

실시예 4

실리카겔(70-230mesh)를 이동상(노말부탄올:에탈올:암모니아수:물=60:40:5:10)을 이용하여 직경 6cm, 길이 26cm가 되도록 충진한 다음 상층부에 1g의 WS-TECA를 최소량의 이동상에 녹여 loading하였다. 이동상을 일정한 속도로 흘려주며 25ml용기로 분취하여 순수한 Asiaticoside 400mg과 Madecassoside 400mg을 얻었다.

시험예

WS-TECA 5g을 메탄올 100ml에 녹이고 여기에 5N-NaOH 3ml를 가하고 12시간동안 가열환류한 다음 반응액과 TECA 표준품을 이동상(노말부탄올:에탄올:암모니아수=60:40:5:10)와 고정상(실리카겔 판)에서 전개하고 무수초산과 황산혼합액(9:1)로 발색시켜 WS-TECA의 가수분해 물은 Madecassic acid와 Asiatic acid임을 확인하였다.

또한 이들 성분의 혼합비를 측정하기 위하여 HLPC로 분석한 결과 아시아티코사이드와 마테카소사이드가 5:5의 비율로 혼합되었음을 확인하였다.

우리나라는 바이러스성 간염과 알콜성 간염등 만성간질환이 빈발하는 지역으로 매년 이로 인한 사망율이 매우 높은 실정이다. 만성 간질환은 지속적인 간세포 손상과 이에 따르는 간섬유화를 유발하여 종국에는 간세포 부전증과 문맥압항진의 합병증으로 사망케 하는 질환으로 지금까지 Colchichine, UDCA 등이 간질환 치료의 목적으로 시도되었으나 그 효과에 대해서는 아직까지 이견이 많은 실정이다. 따라서 간세포 손상과 섬유화 과정을 감소시킬 수 있는 새로운 치료제의 개발이 시급한 실정이다. 센텔라아시아티카에서 아시아티코사이드와 마테카소사이드 혼합물의 추출에 관한 본 항간섬유화 효과실험에서 나타난 바와 같이 만성간질환의 중증도를 경감은 물론 이로 인한 사망율 감소에 크게 기여할 것으로 판단된다.

Claims

센텔라아시아티카를 알콜수용액에 냉침하여 알콜성 추출액을 얻어 여과하고, 할로겐화용매로 추출하여 층분리한 후 고급알콜로 추출하고 가성소다와 물로 세척하여 농축하고, 에틸아세테이트로 결정화하여 생성된 결정을 세척하는 것을 특징으로 하는 센텔라아시아티카에서 아시아티코사이드와 마테카소사이드의 수용성 추출물을 분리하는 방법.
제 1항에 있어서 알콜수용액은 에탄올, 메탄올이고 할로겐화용매는 염화메칠렌, 클로로포름, 디클로로에탄이고 다가알콜은 노말부탄올, 세크부탄올, 아밀알콜인 것을 특징으로 하는 아시아티코사이드와 마테카소사이드의 수용성 추출물을 분리하는 방법.
센텔라아시아티카에서 분리한 수용성 추출물은 간세포 보호효과 및 항섬유화 효과에 특징이 있는 아시아티코사이드와 마테카소사이드의 수용성 추출물.
제 3항에 있어서 수용성 추출물의 혼합비는 4:6 내지 6:4인 것을 특징으로 하는 아시아티코사이드와 마테카소사이드의 수용성 추출물.