KR102649684B1 - 젤라티나제 억제제 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

신규한 젤라티나제 억제제, 그의 제조 방법, 상기 억제제를 포함하는 제약 조성물, 및 젤라티나제의 억제가 유용한 병태 예컨대 간질, 정신분열증, 알츠하이머병, 자폐증 (특히 취약 X 증후군과 연관됨), 정신 지체, 기분 장애 예컨대 양극성 장애, 우울증, 혈관 질환 예컨대 허혈성 뇌졸증 및 죽상동맥경화증, 염증성 질환 예컨대 다발성 경화증, 류마티스 관절염 및 염증성 장 질환, 약물 중독, 신경성 동통, 폐 질환 예컨대 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환, 암 및 패혈증의 요법 및/또는 예방에서의 상기 억제제의 용도.

Description

젤라티나제 억제제 및 그의 용도
본 발명은 젤라티나제 억제제, 그의 제조 방법, 상기 억제제를 포함하는 제약 조성물, 및 젤라티나제의 억제가 유용한 병태 예컨대 간질, 정신분열증, 알츠하이머병, 자폐증 (특히 취약 X 증후군과 연관됨), 정신 지체, 기분 장애 예컨대 양극성 장애, 우울증, 혈관 질환 예컨대 허혈성 뇌졸증 및 죽상동맥경화증, 염증성 질환 예컨대 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 및 염증성 장 질환, 약물 중독, 신경성 동통, 폐 질환 예컨대 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환, 암 및 패혈증의 요법 및/또는 예방에서의 상기 억제제의 용도에 관한 것이다.
세포 외 기질 (ECM)이 지지 구조로서 작용할 뿐만 아니라 신경세포의 발달과 재생, 시냅스 가소성, 신경세포 흥분성, 및 네트워크 활성의 항상성 조절에 상당한 영향을 미친다는 증거는 축적되어 있다. 실제로, ECM은 네트워크 거동, 그런 이유로 생리학적 과정 예컨대 인지에 심대한 영향을 미친다. 젤라티나제는 ECM 단백질뿐만 아니라 대다수의 비-ECM 단백질, 예컨대 성장 인자, 시토카인, 케모카인, 세포 표면 수용체, 세린 프로테이나제 억제제 및 기타 MMP를 분해할 수 있는 아연 의존성 엔도펩티다제에 의해 형성되는, 매트릭신 패밀리 (MMP)에 속한다. MMP는 분비되거나 막 결합된 프로테아제이며 생식, 성장, 발달, 혈관 신생, 면역 반응, 상처 치유 및 뇌 생리학에서 중요한 생리학적 역할을 한다. 종양 진행, 신경 변성, 뇌졸증, 염증 및 바이러스 감염을 포함한 수많은 병리학적 병태 동안에, MMP, 특히 젤라티나제 (MMP-2 또는 젤라티나제 A 및 MMP-9 또는 젤라티나제 B)의 발현이 증진된다.
원래 뇌 내의 젤라티나제 MMP-9에 대한 초기 연구는 퇴행성 구성 요소를 가진 여러 가지의 병리학적 상태에서 그의 가능한 역할에 중점을 두었다. 더 최근에는, MMP-9가 뇌 생리학에서 중요한 역할자로서, 특히 시냅스 가소성에서 핵심 분자로서 부각되었다. 이들 연구 결과는 MMP-9가 신경정신 병태 예컨대 간질, 정신분열증, 알츠하이머병, 자폐증 (특히 취약 X 증후군과 연관됨), 정신 지체, 양극성 장애, 기분 장애 예컨대 양극성 장애, 우울증 및 약물 중독에 관여할 수 있음을 입증하는 연구로 이어졌다.
정신분열증에서, 이상 시냅스 가소성을 야기하는, 글루타메이트 신호 전달의 변경이 기재되어 있다. MMP-9는 글루타메이트 수용체를 조절하고, 생리학적 및 형태론적 시냅스 가소성을 조정하는 것으로 밝혀져 있다. 기능 유전자 다형성, 항정신병제에 대한 유전자 반응성 및 혈장 수준에 의해, MMP-9는 최근 정신분열증과 관련이 있었다. 이 질환은 지각과 인지의 손상을 수반하여, 결국 신경세포 회로의 변형, 시냅스 연결성의 섭동, 및 수지상극(dendritic spine)에서의 변경을 반영하는 것으로 믿어지는 긍정적, 부정적 및 인지적 증상의 삼징후가 된다. 특히, MMP-9 유전자가 위치하는 염색체 영역 20q11-13은 정신 장애의 면에서 및 정신분열증과 관련하여 광범위하게 연구되어 왔다. MMP-9는 해마 및 전두엽 피질 기능에 영향을 미치며, 전두엽 피질 손상이 가장 흔한 병리학적 소견 중 하나인 병태인 정신분열증에 잠재적으로 관여하는 흥미로운 후보 분자이다. 더욱이, 정신분열증에 관련된 표적 후보 단백질의 일부는 MMP-9 또는 MMP-9 상호 작용 단백질, 그 중에서도, 예컨대 뇌에서 유도된 신경 영양 인자 (BDNF) 및 N-메틸-D-아스파르테이트 (NMDA) 수용체와 기능적으로 연결되어 있다. 몇몇 저자들에 의해 보고된 바와 같이 정신분열증 환자의 혈장에서 MMP-9 수준이 비정상적으로 상승된 것으로 밝혀졌다 (Yamamori, H. et al., Neurosci Lett., 2013,(556):37-41).
간질의 병인에서 MMP가 관여한다는 증거가 축적되고 있다. 이 질환은 간질 발작을 일으키는 지속되는 경향 및 이 병태의 신경생물학적, 인지적, 심리적, 및 사회적 영향을 특징으로 하는 뇌 장애이다. 오래 계속되는 발작은 높은-혈청 MMP-9 수준과 관련이 있음이 입증되어 있다. 더 중요한 것은, 간질 수술 동안에 얻은 뇌 조직에 대한 최근의 연구에 따르면 국소 피질 형성 이상(focal cortical dysplasia) (Konopka, A. et al., Epilepsy Res., 2013, (1-2):45-58) 및 결절성 경화증 (Li, S. et al., Brain Res, 2012, (1453):46-55)의 간질유발 병변에서 뿐만 아니라 근본적인 세포구축 이상이 없는 측두엽 간질을 가진 환자의 간질유발 피질 또는 해마 병변에서도 MMP-9 면역 반응이 증가하는 것으로 보고되었다. 항체 마이크로어레이의 비편견 접근법을 사용하여, 국소 피질 형성 이상 (Konopka, A. et al., Epilepsy Res., 2013, (1-2):45-58)을 가진 환자로부터의 조직에서, MMP-9에 더하여, MMP-1, -2, -3, -8, -10 및 -13의 상승된 발현이 밝혀졌다. 그러나, 이들 프로테이나제의 발현은 MMP-9의 발현과 같이 확연하지도 않고/거나 환자간에 일관성이 없었다. 이들 기타 MMP 중에서, 성인 환자에서 MMP-2의 상향 조절이 특히 두드러졌다.
자폐 스펙트럼 장애 (ASD)는 사회적 상호 작용, 언어 및 관심 범위의 세 가지 핵심 영역에서의 증상 군에 의해 확인되나, 대부분의 경우에 그의 원인은 알려져 있지 않다. 취약 X 증후군 (FXS)은 자폐증의 선두적인 유전적 원인이며 그 이유는 FXS를 가진 환자의 상당 부분 (46%)이 ASD와 공동 진단되기 때문이다. FXS를 가진 개인에서 MMP-9의 높은 혈장 활성이 보고되어 있으며 (Leigh, M. J. et al., J Dev Behav Pediatr, 2013, (34):1849-1857), 한편 ASD 모체로부터의 양수에서 MMP-9의 상승된 단백질 양이 검출되었다 (Abdallah, M. W. et al., Autisim Res, 2012, (5):428-433). 따라서, 높은 수준의 MMP-9와 ADS 사이에는 명확한 관련성이 존재한다.
MMP-9는 인간 약물 중독, 양극성 장애 및 우울증에 또한 관련되어 있다. 기능적인 C(-1562)T에서의 MMP-9 유전자 다형성의 분석으로 인해 하나의 관련성이 제공되는데, 그 이유는 이것이 MMP-9 발현의 증가 또는 감소를 결과하기 때문이다. 이러한 다형성의 빈번함이 건강한 대상체와 양극성 장애나 정신분열증을 앓고 있는 환자를 구별하는 것으로 보고되어 있다 (Han, H. et al., Psychiatry Res, 2011, (190):163-164). 이 다형성은 또한 알코올 중독과 관련되어 있다 (Samochowiec A et al, Brain Res, 2010, 1327:103-6). 이외에도, MMP-9 유전자 다형성은 양극성 남성에서 전두엽 인지를 조정하는 것으로 밝혀졌다. 양극성 우울증 동안에 젊은 환자에서 증가된 MMP-9 수준이 보고되어 있다 (Rybakowski, J. K., et al., J Affect Disord, 2013, (146):286-289). 우울증에서 혈장 중 높은 수준의 MMP-9가 검출되었으며, 이 혈청 수준이 우울증의 중증도와 관련이 있다 (Yoshida, T. et al., PLoS One, 2012, (7):e42676).
MMP-9는 알츠하이머병 (AD)과 같은 퇴행성 질환과 관련되어 있는 것으로 또한 주장된다. MMP가 AD에서 Aβ 펩티드의 형성 및 제거에 관여하는 것으로 나타났다. 실제로, MMP-9의 증가된 수준은, 특히 아밀로이드 플라크를 둘러싸고 있는 반응성 성상 세포에서, 환자의 뇌 조직 및 혈액에서 관찰되었으며, 이는 플라크 축적에 대한 국소 조직 반응을 시사하는 것이다. 몇몇 연구는 이 메탈로프로테이나제가 시험관내 및 생체내에서 Aβ 이화작용에 관여하며, 이것이 시험관내에서 Aβ 피브릴을 그리고 계내에서 Aβ 플라크를 분해할 수 있는 유일한 효소임을 입증하였다. 게다가, MMP-9가 수용체-매개 sAPP-α 방출에 관여하고 생체내에서 뇌에서 α-세크레타제-유사 활성을 나타내는 것으로 보고되어 있다 (Fragkouli, A., et al., J Neurochem, 2012, (121):239-251). MMP-2/MMP-9의 합성 억제제는 1차 배양에서 Aβ-매개 신경세포 사멸을 감소시킨다 (Mizoguchi, H., et al., J Pharmacol Exp Ther, 2009, (331):14-22). 동일한 연구에서, GM60001 치료는 Aβ의 뇌실내 투여시 신경 보호적이었고 마우스에서의 인지 능력을 개선시켰다. 더욱이, MMP-9 KO 마우스는 야생형 마우스에서 Aβ 주입에 의해 유도된 기억 결함을 겪지 않았다.
MMP-9는 시냅스 가소성과 관련된 것들 이외의 과정 및 질환 병태에 관여하는 것으로 또한 확인되었다. 이들 병태는 혈관, 폐 및 염증성 질환 및 암을 포함한다. 이와 관련하여, MMP-9, 그리고 보다 적게는 MMP-2는, 혈관 질환 예컨대 허혈성 뇌졸증 및 죽상동맥경화증, 신경성 동통, 염증성 질환 예컨대 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 및 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 패혈증, 암, 폐 질환 예컨대 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환과 관련되어 있다.
허혈성 뇌졸증은 (국소 혈전증 또는 동맥 색전증으로 인해 발생한) 혈액 공급 부족의 결과이어서, 조직의 산소공급 감소를 초래하며, 결과적으로 괴사성 및 아폽토시스성 형질 둘 다의 세포사를 야기할 수 있는 생물에너지학 장애(bioenergetics disturbance)를 초래한다. 일시적인 저관류 후 혈액 순환을 회복시키면 조직 손상을 악화시킬 수 있는 강력한 염증 반응을 결과한다. 그 다음에 염증 세포의 축적은 허혈성 조직에서 높은 수준의 활성 산소 및 질소 종뿐만 아니라 염증유발성 시토카인의 원인이 된다. 모든 수준의 MMP-9의 발현 및 활성에서 MMP-9의 극적인 증가는 뇌졸증 결과의 특징이다. MMP-9는 장기간의 가소성, 혈관 재구성 및 혈관 신생, 면역 반응 및 염증과 같은 뇌졸증 후 현상에 관여한다. KO 마우스를 포함하여 MMP, 특히 MMP-9를 차단하는 것은, 허혈성 뇌졸증 및 그의 결과에 대하여 보호적임이 입증되어 있다 (Chaturvedi, M., et al., Mol. Neurobiol., 2014, (49):563-573)
신경계에 대한 다수의 손상에 의해 촉발되는 신경성 동통의 치료는, 신경성 동통 발달의 근본적인 메커니즘이 여전히 잘 이해되지 않은 채로 있기 때문에 임상적 도전 과제이다. 그러나, 최근의 연구는 신경 손상 후 래트 및 마우스의 초기 단계 및 후기 단계의 신경성 동통 발달이 상이한 MMP를 필요로 하는 것으로 보고하고 있다. 척수 신경 손상 후, MMP-9는 신경성 동통의 초기 단계와 일치하는 손상된 후근 신경절 (DRG) 1차 감각 뉴런에서 신속하고 일시적인 상향 조절을 나타내며, 한편 MMP-2는 신경성 동통의 후기 단계와 일치하는 DRG 위성 세포 및 척수 성상 세포에서 지연 반응을 나타낸다. MMP-9 억제제 또는 TIMP-1 (MMP-9의 내인성 조직 억제제)의 척추강내 투여는 손상 후 최초 날들 (<10)에서 기계적 이질통 (통증 자극 후 중추 통증 민감화)의 발생을 지연시킨다. 그러나 MMP-9의 억제는 뇌 손상 후 소정의 10일의 경우 이질통에 어떠한 영향도 미치지 않는데, 이는 신경성 동통의 초기 발생에서 MMP-9의 중대한 역할을 나타내는 것이다. MMP-9에 비해, 척수 신경 손상 후 MMP-2의 상향 조절은 지연된 패턴을 나타낸다. MMP-2의 내인성 억제제, 또는 MMP-2의 작은 합성 억제제인 TIMP-2의 척추강내 투여는 손상 후 1일째 이질통을 부분적으로 약화시키나, 그 다음 10일내에 이질통을 거의 완전히 차단한다. 이는 후기 단계의 신경성 동통에서 MMP-2가 관여함을 나타내는 것이다. (Kawasaki, Y., et al., Nature Medicine, 2008, (3):331-336).
염증 반응 동안에, 기저 장벽 막을 포함한 조직 장벽을 통하는 백혈구 수송(traffic)은 이들 세포에 ECM을 개조할 수 있는 효소가 구비된 경우만 가능하다. 따라서 MMP는 염증 세포의 중대한 이펙터(effector) 분자이다. MMP는 염증 후 재생 단계에서 및 혈관 질환에서 촉발될 때, 자가 면역 질환 동안에, 급성 및 만성 염증에서 섬세한 터너(turner)로서 또는 스위치로서 역할을 할 수 있다. 따라서, MMP 생물학은 급성 및 만성 염증성 및 허혈성 과정의 정의, 실행 및 해결 단계에서 중요하며 결과적으로, MMP 억제제가 이들에 지장을 줄 수 있다. MMP 억제제는 급성 및 만성 염증, 예컨대 내독소 쇼크, 다발성 경화증 및 류마티스 관절염의 많은 동물 모델에서 시험되었다. 균혈증, 패혈성 및 내독소 쇼크는 현대 병원의 사망률 중 가장 빈번한 원인이다. 박테리아 세포벽 구성 성분은 톨(toll)-유사 수용체의 활성화에 의해 전신 반응을 유도하여, 염증성 시토카인과 효소의 과도한 생산을 야기한다. MMP-9가 결핍된 마우스는 박테리아 유도된 독성에 변경된 내성을 가지며, 한편 프로테아제 억제제가 결핍된 마우스는 내독소 쇼크에 더 민감하다.
다발성 경화증은 중추 신경계를 손상시키는 면역학적 이펙터 메커니즘, 환경 요인 및 유전적 소인에 의해 영향을 받는 다인자 질환이다. MMP-9는 다발성 경화증에서 면역 이펙터 분자이다 (Opdenakker, G., et al., Lancet Neurol., 2003, (2):747-756). 이는 결합 조직과 혈관벽을 통한 세포 이동에서 기능하며 혈액-뇌 장벽을 손상시킨다. 이는 또한 다발성 경화증 및 기타 신경계 질환과 관련이 있는 단백질 기질, 예컨대 미엘린 단백질, 세포-부착 분자, 시토카인 및 케모카인을 용해시킨다. 염증성 CNS 손상에서 MMP-9의 해로운 역할을 뒷받침하는 증거가 동물 모델에서 수득되어 있다. 다발성 경화증, 젤라티나제 MMP-2 및 MMP-9 둘 다에 대한 모델인 뮤린의 실험적 자가 면역 뇌척수염 (EAE)은 질환 증후군의 발달 동안에 상향 조절된다 (Gijbels, k., et al., J. Neurosci. Res., 1993, (36):432-440). 어린 MMP-9 결핍 마우스는 EAE의 발달에 저항성이 있다. 더블(Double) Mmp2/Mmp9-녹아웃(knockout) 마우스는 EAE의 발달에 대해 완전히 저항성이다. MMP 활성의 약리학적 억제는 MMP 억제제를 사용한 몇몇 연구에서 EAE의 과정을 개선시킨다 (Hewson, A., et al., Inflamm. Res., 1995, (44):345-349). MMP 억제제의 사용은 류마티스 관절염의 요법에서 또한 유용할 수 있다. MPP-9는 류마티스 관절염 동안에 콜라겐 II의 분해에 관여하여, 면역 우성 에피토프의 노출 및 방출을 야기한다. 게다가, MMP는 염증성 백혈구의 이동에 중요하다. 이것은 MMP 억제제가, 상이한 동물 모델에서 확인된 개념인, 류마티스 관절염의 요법에서 유용할 수 있음을 시사한다 (Agrawal, S., et al., J. Exp. Med., 2006, (203):1007-1019).
죽상동맥경화증, 및 심근 경색증 및 뇌졸증을 포함한 관련 질환은, 만성 염증성 질환과 종종 비교되어 왔다. 이는 조직병리학적 연구 결과 예컨대 거품성 대식세포의 활성화, 시토카인 및 케모카인의 국소 생성, 및 MMP의 관여에 기반을 두고 있다. 유전적으로 변경된 마우스 (트랜스제닉 및 녹아웃 둘 다)를 이용한 동물 모델의 사용은 MMP가 혈관 병리에서 핵심 역할자라는 견해를 강화시켰다 (Janssens, S., et al., Cardiovsac. Res., 2006, (69):585-594 및 Tayebjee, M. H., et al., Curr. Med. Chem., 2005, (12):917-925). MMP-9 수준은 특발성 심방 세동의 진행에 따라 증가하고 (Li, M. et al., J. Int. Med. Res., 2014, (1):224-230), 대동맥류의 발달과 연관이 있는 것으로 보고되어 있다 (Newman, K. M., et al., Arteriosclerosis and thrombosis: a journal of vascular biology, 1994, (8):1315-1320). MMP-9의 억제는 대동맥류의 성장을 억제한다 (Lindeman, J. H., et al., Circulation, 2009, (119):2209-2216). 심근 경색증 후 돌연사는 MMP가 관여하는 과정인 심장 파열에 의해 발생할 수 있다. 마우스 연구에서, 내인성, 메탈로프로테이나제의 조직 억제제 (TIMP)와 균형을 이루는 젤라티나제의 중대한 역할이 입증되었다. 심근 경색증은 마우스를 MMP-2의 경구 억제제로 처리함으로써 역전될 수 있다 (Matsumura, S., et al., J. Clin. Invest., 2005, (115):559-609).
MMP-9는 궤양성 대장염 및 크론병을 포함한 만성 염증성 질환의 병인에 핵심적인 역할을 하고 (Abraham, C., et al., N Eng J Med., 2009, (361):2066-2078), 결장 조직에서의 그의 상향 조절은 인간에서 염증성 장 질환의 활성 발적과 일치하는 것으로 밝혀져 있다 (Gao, Q., et al., Dig Liver Dis., 2005, (37):584-592). 인간 표본의 데이터와 일치하여, 염증성 장 질환의 마우스 모델에서 염증된 결장 조직에서 상승된 MMP-2 및 MMP-9 단백질 발현 및 활성화가 관찰되었다. 더욱이, 대장염은 MP-9 녹아웃 마우스뿐만 아니라 MMP-2 및 MMP-9 더블-녹아웃 마우스에서 약화되는 것으로 밝혀져 있다 (Grag, P., et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol., 2009, (284):15353-15357).
암의 사망률은 주로 전이를 예방하지 못하기 때문이다. 부각되는 증거는 암 전파의 초기 측면에서 MMP의 역할을 강조하였다 (Kessenbrock, K., et al., Cell, 2010, (141):52-67). ECM을 분해하는 효소는 종양 진행에 필수적인 것으로 오랫동안 검토되어 왔다. 종양 세포는 종양을 둘러싸고 있는 매트릭스 장벽을 파괴하는 효소를 생산하여, 주변 결합 조직으로의 침습, 혈관으로부터의 출입, 및 원거리 장기로의 전이를 허용하는 것으로 구상된다. MMP는 ECM의 모든 구조 구성 요소를 분해하는 능력을 갖는다. 더욱이, MMP는 거의 모든 인간 및 동물 종양에서 뿐만 아니라 대부분의 종양 세포주에서 상향 조절된다 (Coussens, L. M., et al., Science, 2002, (295):2387-2392). MMP-9는 암 침습과 관련이 있다. 조직 및 혈액에서의 MMP-9의 상승된 수준은 암 환자에서 관찰되어, MMP-9를 암 요법을 위한 눈에 띄는 표적이 되도록 하는데, 그 이유는 콜라겐 및 라미닌을 분해하는 MMP-9의 능력이 세포 이동을 조절하고 혈관 신생 및 종양 성장을 증가시키는 능력과 관련되기 때문이다 (Bjorklund, M., et al., Biochim Biophys Acta, 2005, (1755):37-69).
병리학적 폐 병태에서, MMP 및 그의 생리학적 억제제 (TIMP)는 비정상적으로 과도하게 발현되고 상이한 구조 세포의 패널에 의해 호흡기에서 생산된다. 이들 생물학적 활성의 변경은 상처 치유 및 세포 수송(cell trafficking)에서 몇 가지 극적인 효과를 갖는다. 자극된 구조 세포 또는 염증 세포에 의한 다양한 MMP의 탈조절이 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 폐 섬유증 및 폐암을 포함한 수많은 폐 질환의 병리 생리학에 참여하는 것으로 여겨진다 (Demedts, I. K., et al., Curr Opin Pharmacol, 2005, (5):257-63). 염증 과정은 세포외 기질 개조 및 콜라겐 침착을 특징으로 하며 결국 증가된 수준의 MMP-9를 요구한다 (Kelly, E. A., et al., Am J Respir Crit Care Med, 2000, (162):1157-1161). MMP-9의 선택적 억제는 COPD의 치료에서 최근 입증된 바와 같이 이들 연관된 만성 염증성 폐 질환에서 치료 이익을 촉진시키는 것으로 여겨진다 (Xie, S. S., et al., J Int Med Res, 2014, (42):1272-1284).
이들 실험적 증거에 따르면, MMP-2 및 MMP-9의 강력한 억제제일 것이고 기타 MMP 예컨대 콜라게나제 (MMP-1), 스트로멜리신 (MMP-3) 및 매트릴리신(MMP-7)에 대하여 선택적일 신규한 화합물을 발견할 필요가 존재한다.
발명의 간단한 설명
본 발명자들은 화학식 (I)의 화합물의 패밀리가 높은 효능으로 젤라티나제 MMP-2 및 MMP-9를 억제할 수 있고 기타 MMP 예컨대 콜라게나제 (MMP-1), 스트로멜리신 (MMP-3) 및 매트릴리신 (MMP-7)을 억제하는 그들의 능력과 관련하여 선택적이라는 것을 성공적으로 밝혀냈다. 이들 두 가지 특성은 본 발명의 화합물을 간질, 정신분열증, 알츠하이머병, 자폐증 (특히 취약 X 증후군과 연관됨), 정신 지체, 양극성 장애, 기분 장애 예컨대 양극성 장애, 우울증, 혈관 질환 예컨대 허혈성 뇌졸증 및 죽상동맥경화증, 염증성 질환 예컨대 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 및 염증성 장 질환, 약물 중독, 신경성 동통, 폐 질환 예컨대 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환, 암 및 패혈증의 요법에서 사용하기에 이상적인 후보 물질로 만드는데, 그 이유는 상기에서 설명된 바와 같이 MMP-2 및 MMP-9는 상기 질환에 관여하는 것으로 공지되어 있으며, 선택성은 비선택적 젤라티나제 억제제가 사용될 때 생성되는 2차 효과의 수준을 감소시키기 위해 바람직한 특성인 것으로 또한 공지되어 있기 때문이다.
따라서, 본 발명의 한 측면은 화학식 (I)을 갖는 화합물 또는 그의 염에 관한 것이다:
(I)
상기 식에서,
AA1은 부재하거나 N-메틸-페닐알라닌, N-메틸-트립토판, N-메틸-티로신 및 N-메틸-이소류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로부터 유래된 잔기(rest)이고,
AA2는 부재하거나 N-메틸-페닐알라닌, N-메틸-알라닌, N-메틸-β-알라닌 및 N-메틸-류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로부터 유래된 잔기이고,
G는 1 내지 10개의 탄소 원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬렌 잔기이며, 여기서 상기 잔기에서 하나 이상의 비-인접(non-vicinal) 메틸렌 모이어티 (-CH2-)는 상응하는 산소 원자 (-O-)에 의해 대체될 수 있고,
R1은 수소 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고,
R2, R3 및 R4는 수소 및 불소로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고,
R5 및 R6은 수소 및 불소로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 전구 약물 또는 용매화물의 제조 방법을 지칭한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 전구 약물 또는 용매화물 및 제약상 허용되는 담체, 아주반트(adjuvant) 또는 비히클(vehicle)을 포함하는 제약 조성물을 지칭한다.
본 발명의 또 다른 측면은 간질, 정신분열증, 알츠하이머병, 자폐증 (특히 취약 X 증후군과 연관됨), 정신 지체, 양극성 장애, 기분 장애 예컨대 양극성 장애, 우울증, 혈관 질환 예컨대 허혈성 뇌졸증 및 죽상동맥경화증, 염증성 질환 예컨대 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 및 염증성 장 질환, 약물 중독, 신경성 동통, 폐 질환 예컨대 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환, 암 및 패혈증의 특히 예방 및/또는 치료를 위한, 의약으로서 사용하기 위한 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염을 지칭한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 바람직하게는 포유동물에서, 간질, 정신분열증, 알츠하이머병, 자폐증 (특히 취약 X 증후군과 연관됨), 정신 지체, 양극성 장애, 기분 장애 예컨대 양극성 장애, 우울증, 혈관 질환 예컨대 허혈성 뇌졸증 및 죽상동맥경화증, 염증성 질환 예컨대 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 및 염증성 장 질환, 약물 중독, 신경성 동통, 폐 질환 예컨대 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환, 암 및 패혈증의 치료 또는 예방 방법으로서, 치료량의 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 전구 약물 또는 용매화물을 상기 치료를 필요로 하는 환자에게 투여하는, 상기 치료 또는 예방 방법을 지칭한다.
본 발명의 또 다른 측면은 간질, 정신분열증, 알츠하이머병, 자폐증 (특히 취약 X 증후군과 연관됨), 정신 지체, 양극성 장애, 기분 장애 예컨대 양극성 장애, 우울증, 혈관 질환 예컨대 허혈성 뇌졸증 및 죽상동맥경화증, 염증성 질환 예컨대 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 및 염증성 장 질환, 약물 중독, 신경성 동통, 폐 질환 예컨대 천식 및 만성 폐쇄성 폐 질환, 암 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택된 질환의 특히 예방 및/또는 치료를 위한, 의약의 제조를 위한 상기 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 전구 약물 또는 용매화물의 용도를 지칭한다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 맥락에서 화학식 N(Me)H-R-COOH의 용어 "아미노산으로부터 유래된 잔기"는 비라디칼(biradical) -N(Me)-R-CO-로서 이해되어야 한다.
본 발명의 맥락에서 용어 "알킬렌"은 화학식 -CnH2n-의 선형 또는 분지형 탄화수소 잔기를 나타내기 위해 사용된다.
본 발명의 맥락에서, 알킬렌 기에서, 하나 이상의 비-인접 메틸렌 (-CH2-)이 상응하는 산소 원자 (-O-)에 의해 대체되는 것으로 언급되는 경우, 이는 상기 메틸렌 중 하나 이상이 존재하지 않으며, 그/그들의 자리는 상응하는 산소 원자(들)의 형성 및 에테르 (-O-) 결합에 의해 점유되되, 단, 2개의 인접한 메틸렌 기가 산소 원자에 의해 동시에 대체되지 않을 수 있으며, 즉, 생성된 쇄는 퍼옥시드 기 (-O-O-)를 함유하지 않을 수 있음을 의미한다. 결과적으로 상기 수정된 알킬렌 잔기의 실험식은 CmH2mOx가 될 것이다. 상기 기의 비제한적인 예는 n-프로폭시, 1-[2-(2-에톡시-에톡시)-에톡시]-프로필 및 2-메톡시-에톡시메틸이다.
본 발명의 맥락에서 아미노산 또는 아미노산 잔기에 대해 어떠한 입체이성에 대해 명시되지 않는 경우, 상기 아미노산 또는 아미노산 잔기의 가능한 입체이성질체 중 어느 하나에 대해 언급되는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어 이소류신 (Ile)에 대한 언급은 D-이소류신 및 L-이소류신을 포함한다.
본 발명의 맥락에서 일부 약어 및 두문자어가 사용되었으며 그 의미는 이하에 제공되어 있다:
Alloc: 알릴옥시카르보닐
Dab: 2,4-디아미노부티르산
DBU: 1,8-디아자비시클로[5.4.0]운데크-7-엔
DCM: 디클로로메탄
DIEA: N,N-디이소프로필에틸아민
DMF: 디메틸포름아미드
DMSO: 디메틸 술폭시드
DIC: N,N'-디이소프로필카르보디이미드
EDC: 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드
Fmoc: 플루오레닐메틸옥시카르보닐
HFIP: 헥사플루오로-2-프로판올 또는 헥사플루오로이소프로판올
HOAt: 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸
HPLC: 고성능 액체 크로마토그래피
HPLC-MS: 고성능 액체 크로마토그래피 - 질량 분석법
MeOH: 메탄올
옥시마 퓨어(oxyma pure): 에틸 시아노(히드록시이미노)아세테이트
PyBOP: 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트
TBTU: O-(벤조트리아졸-1-일)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로-보레이트
TFA: 트리플루오로아세트산
TIS: 트리이소프로필실란
Tris: 트리스(히드록시메틸)아미노메탄 또는 2-아미노-2-히드록시메틸-프로판-1,3-디올
용어 "염"은 상기 화합물이 이온 형태이거나, 하전되고 반대 이온 (양이온 또는 음이온)과 커플링 (회합)되거나 용액 상태인 본 발명에 따라 사용되는 임의의 형태의 활성 화합물로서 이해되어야 한다. 이 정의는 또한 4급 암모늄 염 및 활성 분자와 다른 분자 및 이온과의 착물, 특히 이온 상호 작용을 통해 형성된 착물을 포함한다. 상기 정의는 특히 생리학상 허용되는 염을 포함하며; 이 용어는 "약리학상 허용되는 염" 또는 "제약상 허용되는 염"과 동등한 것으로서 이해되어야 한다.
용어 "제약상 허용되는 염"은 본 발명의 맥락에서 치료를 위해 적절한 방식으로 사용되거나, 특히, 인간 및/또는 포유동물에서 적용되거나 사용될 때 생리학상 용인되는 (통상적으로는 그것이, 특히, 반대 이온의 결과로서 독성이 아닌 것을 의미함) 임의의 염을 의미한다. 이들 생리학상 허용되는 염은, 양이온 또는 염기로 형성될 수 있으며, 본 발명의 맥락에서, 특히 인간 및/또는 포유 동물에서 사용될 때, 본 발명에 따라 사용된 적어도 1종의 화합물 -통상적으로 산 (탈양성자화된)- 예컨대 음이온에 의해 형성된 염으로서 이해된다. 이들 생리학상 허용되는 염은 또한 음이온 또는 산으로 형성될 수 있으며, 본 발명의 맥락에서, 특히 인간 및/또는 포유 동물에서 사용될 때, 본 발명에 따라 사용된 적어도 1종의 화합물 - 통상적으로 양성자화된, 예를 들어 양성자화된 질소 - 예컨대 양이온 및 적어도 1종의 생리학상 용인된 음이온에 의해 형성된 염으로서 이해된다. 이 정의는 구체적으로 본 발명의 맥락에서- 특히 인간 및/또는 포유동물에 사용될 때, 생리학상 용인된 산에 의해 형성된 염, 즉 생리학상 용인된 유기 또는 무기 산을 사용한 특정한 활성 화합물의 염에 의해 형성된 염을 포함한다.
제약상 허용되는 산은 무기 산, 예컨대 염산, 황산, 인산, 이인산, 브로민화수소산, 아이오딘화수소산, 니트레이트산, 및 유기 산, 예컨대 시트르산, 말레산, 말산, 만델산, 아스코르브산, 옥살산, 숙신산, 타르타르산, 아세트산, 메탄술폰산, 에탄술폰산, 벤젠술폰산 및 p-톨루에노술폰산을 포함한다. 제약상 허용되는 염기는 알칼리 금속 (예를 들어, 나트륨 또는 칼륨), 알칼리 토금속 (예를 들어, 칼슘 또는 마그네슘) 및 유기 염기 (예를 들어, 알킬 아민, 아릴알킬아민 및 헤테로시클릭 아민)의 수산화물을 포함한다.
본 발명에 따른 기타 바람직한 염은 음이온 (X-)의 등가물이 N 원자의 양전하와 회합되어 있는 4급 암모늄 화합물이다. X-는 다양한 광산의 음이온 예컨대 예를 들어, 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 술페이트, 니트레이트, 포스페이트, 또는 유기산의 음이온, 예컨대 아세테이트, 말레에이트, 푸마레이트, 시트레이트, 옥살레이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 말레이트, 만델레이트, 트리플루오르아세테이트, 메탄술포네이트 및 p-톨루엔술포네이트일 수 있다. X-는 바람직하게는 클로라이드, 브로마이드, 아이오다이드, 술페이트, 니트레이트, 아세테이트, 말레에이트, 옥살레이트, 숙시네이트 및 트리플루오르아세테이트로부터 선택된 음이온이다. 보다 바람직하게는, X-는 클로라이드, 브로마이드, 트리플루오르아세테이트 또는 메탄술포네이트이다.
본 발명에 따른 용어 "용매화물"은, 특히 수화물 및 알콜레이트, 예컨대 예를 들어, 메탄올레이트를 포함하여, 상기 화합물이 또 다른 분자 (통상적으로 극성 용매)에 비공유 결합에 의해 결합되어 있는 본 발명에 따른 활성 화합물의 임의의 형태를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 바람직한 용매화물은 수화물이다.
화학식 (I)의 화합물의 전구 약물인 임의의 화합물이 또한 본 발명의 범위 내에 있다. 용어 "전구 약물"은 그의 가장 넓은 의미로 사용되며 생체내에서 본 발명의 화합물로 전환되는 유도체를 포함한다. 전구 약물의 예는, 생가수분해성 모이어티 예컨대 생가수분해성 아미드, 생가수분해성 에스테르, 생가수분해성 카르바메이트, 생가수분해성 카르보네이트, 생가수분해성 우레이드, 및 생가수분해성 포스페이트 유사체를 포함하는, 화학식 (I)의 화합물의 유도체 및 대사 산물을 포함하나, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는, 카르복실 작용기를 가진 화합물의 전구 약물은 카르복실산의 저급 알킬 에스테르이다. 카르복실레이트 에스테르는 분자 상에 존재하는 카르복실산 모이어티 중 어느 하나를 에스테르화하여 편리하게 형성시킨다. 전구 약물은 널리 공지된 방법, 예컨대 문헌 [Burger "Medicinal Chemistry and Drug Discovery 6th ed. (Donald, J., Abraham ed., 2001, Wiley)], ["Design and Applications of Prodrugs" (H. Bundgaard ed., 1985, Harwood Academic Publishers)] 및 [Krogsgaard-Larsen et al. "Textbook of Drug design and Discovery" Taylor & Francis (April 2002)]에 기재된 것들을 사용하여 전형적으로 제조될 수 있다.
상기 기재된 화학식 (I)로 표시되는 본 발명의 화합물은 키랄 중심의 존재에 따라 거울상 이성질체 및/또는 부분입체 이성질체를 포함할 수 있다. 단일 이성질체, 거울상 이성질체 또는 부분입체 이성질체 및 그의 혼합물은 본 발명의 범위 내에 속한다.
더욱이, 본원에서 언급된 임의의 화합물은 호변이성질체로서 존재할 수 있다. 구체적으로, 용어 호변이성질체는 평형 상태로 존재하고 한 이성질체 형태가 또 다른 형태로 쉽게 전환되는 화합물의 두 개 이상의 구조 이성질체 중 하나를 지칭한다. 일반적인 호변이성질체 쌍은 아민-이민, 아미드-이미드산, 케토-에놀, 락탐-락팀 등이다.
달리 명시되지 않는 한, 본 발명의 화합물은, 동위 원소-표지된 형태, 즉 하나 이상의 동위 원소-풍부한 원자의 존재에서만 상이한 화합물을 포함하는 것을 또한 의미한다. 예를 들어, 중수소 또는 삼중 수소에 의한 적어도 하나의 수소 원자의 대체, 또는 13C- 또는 14C-풍부한 탄소에 의한 적어도 하나의 탄소의 대체, 또는 15N-풍부한 질소에 의한 적어도 하나의 질소의 대체를 제외하고는 본 구조를 갖는 화합물은 본 발명의 범위 내에 있다.
화학식 (I)의 화합물, 또는 그의 염 또는 용매화물은 바람직하게는 제약상 허용되거나 실질적으로 순수한 형태이다. 제약상 허용되는 형태란, 특히, 통상적인 제약 첨가물 예컨대 희석제 및 담체를 제외한 제약상 허용되는 수준의 순도를 갖고, 정상적인 투여 수준에서 독성으로 간주되는 어떠한 물질도 포함하지 않는 것을 의미한다. 약물 물질에 대한 순도는 바람직하게는 50% 초과, 보다 바람직하게는 70% 초과, 가장 바람직하게는 90% 초과이다. 바람직한 실시양태에서 이는 화학식 (I)의 화합물, 또는 그의 염, 용매화물 또는 전구 약물의 95% 초과이다.
이전에 언급된 바와 같이, 용어 "제약상 허용되는 염, 용매화물, 전구 약물"은 수령자에게 투여시 본원에 기재된 바와 같은 화합물을 (직접적으로 또는 간접적으로) 제공할 수 있는, 임의의 염, 용매화물 또는 임의의 다른 화합물을 지칭한다. 그러나, 화학식 (I)의 화합물의 비-제약상 허용되는 염, 용매화물, 전구 약물이 이들의 화합물이 상기 화합물의 제약상 허용되는 염, 용매화물 및 전구 약물의 제조에서 유용할 수 있기 때문에 본 발명의 범위 내에 또한 속한다는 것이 인식될 것이다. 염, 용매화물 및 전구 약물의 제조는 관련 기술분야에 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다.
본 발명의 한 실시양태에서 기 AA1은 N-메틸-트립토판 및 N-메틸-이소류신.으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로부터 유래된 잔기이다.
본 발명의 한 실시양태에서 기 AA1 및 AA2는 부재한다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서 G는 -CH2-, -(CH2)3-, -(CH2)5-, -CH2-CH(CH3)-CH2-, -(CH2)7-, -CH2-CH2-CH2-CH(CH2-CH2-CH3)-, -O-(CH2)3-, -(CH2)13- 및 -CH2-O-(CH2)2-O-CH2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서 R1-G는 CH3-, CH3-(CH2)2-, CH3-CH(CH3)-CH2-, CH3-(CH2)6-, CH3-(CH2)4-, CH3-CH2-CH2-CH(CH2-CH2-CH3)-, 페닐-O-(CH2)3-, CH3-(CH2)6-O-(CH2)3- 및 -CH2-O-(CH2)2-O-CH2-로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서 R1-G는 CH3-(CH2)2-, CH3-CH(CH3)-CH2-, 페닐-O-(CH2)3-, CH3-(CH2)6-, CH3-(CH2)4- 및 CH3-CH2-CH2-CH(CH3-CH2-CH3)-로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이 실시양태에서 정의된 화합물은 혈액-뇌 장벽을 관통하는 데 특히 양호하다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서 R2, R3 및 R4 중 하나는 수소이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서 R2, R3 및 R4 중 하나는 수소이고 나머지 둘은 불소 원자이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서 R2, R3 및 R4에 의해 치환된 페닐 기는 3,5-디플루오로페닐이다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서 R5 및 R6 둘 다가 수소이다.
본 발명의 한 실시양태에서 앞에 정의된 바와 같은 화학식 (I)의 화합물은 하기 화학식에 나타낸 입체 이성질을 갖는다:
추가의 바람직한 실시양태에서, 상이한 치환체에 대해 상기 기재된 선호도가 조합된다. 본 발명은 또한 상기 화학식에서의 바람직한 치환의 이러한 조합에 관한 것이다.
화학식 (I)에 속하는 본 발명의 특정한 개개의 화합물은 이하에 열거된 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염, 이성질체, 전구 약물 또는 용매화물을 포함한다:
· (2S)-1-아세틸-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(4-플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
· (2S)-1-아세틸-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
· (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-1-헥사노일-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
· (2S)-1-부타노일-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
· (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-1-(3-메틸부타노일)피롤리딘-2-카르복스아미드
· (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-1-옥타노일-피롤리딘-2-카르복스아미드
· (2S)-N-[(1S,2S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-4,4-디플루오로-1-헥사노일-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
· (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-1-(2-프로필펜타노일)피롤리딘-2-카르복스아미드
· (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-1-(4-페녹시부타노일)피롤리딘-2-카르복스아미드
· (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-4,4-디플루오로-N-메틸-1-(4-페녹시부타노일)피롤리딘-2-카르복스아미드
· (2S)-1-[(2S)-2-[아세틸(메틸)아미노]-3-페닐-프로파노일]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
· (2S)-1-[(2S)-2-[아세틸(메틸)아미노]프로파노일]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
· (2S)-1-[3-[아세틸(메틸)아미노]프로파노일]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
· (2S)-1-[(2S)-2-[[2-[부타노일(메틸)아미노]-3-(1H-인돌-3-일)프로파노일]-메틸-아미노]-4-메틸-펜타노일]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
· (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-벤즈아미도-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-1-헥사노일-피롤리딘-2-카르복스아미드
· (2S,4R)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-벤즈아미도-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-4-플루오로-N-메틸-1-펜타노일-피롤리딘-2-카르복스아미드.
상기 정의된 화학식 (I)의 화합물은 하기 일반 반응식에 의해 예시된 바와 같은 이용 가능한 합성 절차에 의해 수득될 수 있다:
화학식 (I)의 화합물의 합성 경로의 상세한 설명
대안 I:
Nα-Fmoc-Nγ-Alloc-2,4-디아미노부티르산 (Fmoc-Dab(Alloc)-OH)에 그의 카르보닐 기를 통해 커플링되어 절단시 C-말단 카르복실산 기, 예컨대 2-클로로트리틸 수지 (III)를 수득하기에 적합한 중합체 지지체를 폴리에틸렌 다공성 디스크 (반응 용기)가 장착된 시린지에 배치한다. 수지는 적절한 유기 용매 예컨대 디클로로메탄 (DCM) 및 디메틸포름아미드 (DMF)를 사용한 세척에 의해 팽윤시킨다.
(III)
상기 중합체 지지체의 팽윤 후, Fmoc-Dab(Alloc)-OH를, 적절한 유기 용매 예컨대 DMF 중 아민 염기 예컨대 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA)을 사용하여 수지에 부착시킨다. 혼합물을 1시간 동안 교반한다. 그 후, 혼합물을 여과하지 않고, 무수 메탄올을 첨가하여 수지의 잔류하는 미반응 부위를 캡핑한다. 여과 및 세척 후, 아민 염기 용액 예컨대 DMF 중 피페리딘 용액 및/또는 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF의 혼합물로 처리함으로써 Fmoc을 제거하여 화학식 (IV)의 생성물을 수득한다. 여액 및 세척액을 부피 측정 플라스크(volumetric flask)에 수집하여 일단 최초의 아미노산이 고정되면 수지의 달성된 로딩(loading)을 UV 측정에 의해 정량화한다. Fmoc 제거를 또한 카이저 테스트(Kaiser test)를 사용하여 평가한다.
(IV)
적절한 유기 용매 예컨대 DMF 중 아민 염기 예컨대 DIEA, 및 첨가제 예컨대 1-히드록시-7-아자벤조트리아졸 (HOAt)의 존재하에 또는 부재하에, 활성화제 예컨대 벤조트리아졸-1-일-옥시트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트 (PyBOP)를 사용하여,
화학식 (V)의 화합물:
(V)
을 화학식 (IV)의 화합물에 부착시켜 화학식 (VI)의 생성물
(VI)
을 수득한다. 혼합물을 1 내지 2시간의 총 반응 시간 동안에 교반한다. 커플링의 정도는 카이저 테스트를 사용하여 모니터링할 수 있고 재커플링(re-coupling)을 필요한 경우 동일한 조건하에 행한다.
화학식 (VI)의 화합물로부터의 Fmoc 보호기는 아민 염기 용액 예컨대 DMF 중 피페리딘 용액 및/또는 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF의 혼합물로 제거하여 화학식 (VIIa)의 화합물을 수득한다.
(VIIa)
그 다음에 화학식 (VIIa)의 화합물을 먼저 아미노 보호기 예컨대 오르토-니트로 벤젠 술포닐 (oNBS) 클로라이드와 반응시켜 화학식 (VIII)의 화합물을 수득한다.
(VIII)
그 다음에 상기 언급된 화합물을 메틸화제 예컨대 7-메틸-1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔과 파라-니트로벤젠술포네이트의 혼합물을 사용하여 메틸화하여 화학식 (IX)의 생성물을 수득한다.
(IX)
후속적으로 수지를 β-메르캅토에탄올 및 DBU로 처리함으로써 오르토-니트로 벤젠 술포닐 (oNBS) 보호기를 제거하여 화학식 (VII)의 화합물을 수득한다.
(VII)
일단 화학식 (V)의 화합물이 커플링되고 메틸화되면, 화학식 (X)의 Fmoc-프롤린-OH 유도체
(X)
[상기 식에서 R5 및 R6은 앞에 정의된 바와 같다]를, 적절한 유기 용매 예컨대 DMF 중 아민 염기 예컨대 DIEA, 및 첨가제 예컨대 HOAt의 존재하에 또는 부재하에, 활성화제 예컨대 PyBOP를 사용하여 커플링시켜, 화학식 (XI)의 생성물을 수득한다. 혼합물을 1 내지 2시간의 총 반응 시간 동안에 교반한다. 커플링의 정도는 카이저 테스트를 사용하여 모니터링할 수 있고 재커플링을 필요한 경우 동일한 조건하에 행한다. 화학식 (X)의 프롤린 유도체로부터의 Fmoc 보호기는 아민 염기 용액 예컨대 DMF 중 피페리딘 용액 및/또는 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF의 혼합물로 제거하여 화학식 (XI)의 화합물을 수득한다.
(XI)
적절한 유기 용매 예컨대 DMF 중 아민 염기 예컨대 DIEA, 및 첨가제 예컨대 HOAt의 존재하에 또는 부재하에, 활성화제 예컨대 PyBOP를 사용하여,
Fmoc-AA2-OH [상기 식에서 AA2는 본원에서 상기 정의된 바와 같다]를 화학식 (XI)의 생성물 상에 고정시켜 화학식 (XII)의 생성물을 수득한다.
(XII)
혼합물을 1 내지 2시간의 총 반응 시간 동안에 교반한다. 커플링의 정도는 클로라닐 테스트(chloranil test)를 사용하여 모니터링할 수 있고 재커플링을 필요한 경우 동일한 조건하에 행한다. AA2로부터의 Fmoc 보호기는 아민 염기 용액 예컨대 DMF 중 피페리딘 용액 및/또는 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF의 혼합물로 제거하여 화학식 (III)의 화합물을 수득한다.
(XIII)
적절한 유기 용매 예컨대 DMF 중 아민 염기 예컨대 DIEA, 및 첨가제 예컨대 HOAt의 존재하에 또는 부재하에, 활성화제 예컨대 PyBOP를 사용하여,
Fmoc-AA1-OH [상기 식에서 AA1은 본원에서 상기 정의된 바와 같다]를 화학식 (XII)의 생성물 상에 부착시켜 화학식 (XIV)의 생성물을 수득한다.
(XIV)
혼합물을 1 내지 2시간의 총 반응 시간 동안에 교반한다. 커플링의 정도는 카이저 테스트를 사용하여 모니터링할 수 있고 재커플링을 필요한 경우 동일한 조건하에 행한다. AA1로부터의 Fmoc 보호기는 아민 염기 용액 예컨대 DMF 중 피페리딘 용액 및/또는 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF의 혼합물로 제거하여 화학식 (XV)의 화합물을 수득한다.
(XV)
화학식 (XV)의 화합물의 아미노 기는 기 R1-G-CO-로 캡핑하여 화학식 (XVI)의 화합물을 수득한다. 캡핑 절차는 첨가제 예컨대 HOAt의 존재하에 또는 부재하에, 활성화제 예컨대 PyBOP의 존재하에 또는 부재하에 아민 염기 예컨대 DIEA의 존재하에 카르복실산 R1-G-COOH의 활성화된 형태 예컨대 화학식 R1-G-CO-O-CO-G-R1의 무수물 또는 화학식 R1-G-CO-X의 카르보닐 할라이드 (상기 식에서, R1 및 G는 본원에서 상기 정의된 바와 같고 X는 바람직하게는 Cl, Br 또는 I이다)를 사용하여 수행한다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링한다.
(XVI)
화학식 (XVI)의 화합물로부터의 alloc 보호기는, 화학식 (XVI)의 화합물을 유기 용매 예컨대 DCM에 현탁시키고 거기에 페닐실란을 첨가하며, 한편 현탁액을 통해 N2를 버블링시킴으로써 제거하여, 화학식 (XVII)의 화합물을 수득한다. 그 다음에, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)을 첨가하고, N2-버블링을 5분 동안 유지한다. 그 후, 반응 용기를 밀봉하고 15분 동안 환상으로(orbitally) 진탕시킨다. 이 시간 후, 반응물을 여과하고 수지를 완전히 세척한다. 동일한 처리를 2회 더 반복한다. 마지막 처리 후, 수지를 DCM, 메탄올 (MeOH) 및 DMF로 완전히 세척한다. alloc 보호기의 제거의 정도는 카이저 테스트를 사용하여 모니터링한다.
(XVII)
후속적으로, 화학식 (XVIII)의 생성물
(XVIII)
[상기 식에서 R2, R3 및 R4는 앞에 정의된 바와 같다]을, DMF 중 3 당량의 화학식 (XVIII)의 화합물, 3 당량의 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIPCDI) 및 3 당량의 HOAt를 사용하여, 화학식 (XVII)의 화합물의 디아미노부티르산 모이어티의 측쇄의 아미노 기에 커플링시킨다. 혼합물을 1시간 동안 수동으로 간헐적으로 교반한다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과해 내고 수지를 DMF, MeOH 및 DCM으로 완전히 세척한다. 커플링 반응의 정도는 카이저 테스트를 사용하여 모니터링한다. 비색 검사가 커플링 반응이 완전히 달성되지는 않았음을 나타낼 때 화학식 (XVIII)의 화합물의 재커플링 단계를 수행한다. 이 단계로 화학식 (XIX)의 화합물이 수득된다.
(XIX)
화학식 (XIX)의 화합물은 헥사플루오로-2-이소프로판올 (HFIP)을 사용하여 수지로부터 절단한다. 수지를 DCM으로 수회 세척하고 건조시킨다. HFIP/DCM (1:4) 혼합물을 화학식 (XIX)의 화합물에 첨가함으로써 화학식 (XX)의 화합물을 수득한다. 혼합물은 15분 동안 실온에서 교반한다. 반응 혼합물을 여과하고 HFIP/DCM 그리고 그 다음에 DCM로 세정한다. 절단 및 세척 단계는 동일한 조건하에 2회 추가로 반복한다. 그 후, 수득된 여액을 풀링(pool)하고 용매를 진공 하에 증발시켜 화학식 (XX)의 화합물을 수득한다.
(XX)
화학식 (I)의 화합물은 화학식 (XX)의 화합물로부터 상이한 절차에 의해 수득될 수 있으며, 실시예의 합성에 사용된 두 가지 절차는 다음과 같다:
절차 A:
3.5 당량의 중간체 O-(2,4-디메톡시벤질)히드록실아민을 1 당량의 화학식 (XX)의 화합물과, DCM 또는 상당하는 유기 용매 중 5 당량의 아민 염기 예컨대 N-메틸모르폴린의 존재하에 1.3 당량의 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드 히드로클로라이드 (EDC·HCl) 및 1.3 당량의 첨가제 HOAt를 사용하여 반응시킨다. 혼합물을 실온에서 20시간 동안 반응시켜 화학식 (XXI)의 화합물을 수득한다. 반응의 정도를 HPLC 및 HPLC-MS를 사용하여 모니터링한다. 일단 반응이 완료되면 반응 혼합물을 KHSO4, NaHCO3 및 염수 (각각 3회)로 세척한다. 수득된 유기 층을 황산마그네슘을 사용하여 건조시키고, 여과하고 진공 하에 증발시킨다.
(XXI)
마지막으로, 화학식 (XXI)의 화합물을 트리플루오로아세트산 (TFA)/물/트리이소프로필실란 (TIS) (95:2.5:2.5)의 혼합물로 1시간 동안 처리함으로써 화학식 (I)의 화합물을 수득한다. 반응의 완료를 HPLC 및 HPLC-MS를 사용하여 모니터링한다. 화학식 (I)의 화합물의 조생성물(crude)을 필요한 경우 HPLC를 사용하여 정제한다.
절차 B:
1 당량의 화학식 (XX)의 화합물을 냉 (-20℃) 건조 테트라히드로푸란 중 아민 염기 예컨대 N-메틸모르폴린의 존재하에 1.1 당량의 이소부틸 클로로포르메이트 및 2.5 당량의 새로 제조된 히드록실아민 용액 (*)과 혼합한다. 반응물을 -20℃에서 2시간 동안 교반하고, 온도를 2시간 이내에 0℃에 도달시킨 다음에 5℃에서 이를 밤새 방치한다. 반응의 진행은 박층 크로마토그래피 (TLC)에 의해 모니터링한다. 일단 완료되면, 반응의 용매를 진공 하에 증발시켜 화학식 (I)의 화합물을 수득한다. 그 후, 수득된 조생성물을 에틸 아세테이트에 용해시키고 KHSO4, NaHCO3 및 염수로 세척한다. 그 다음에 유기 층을 황산마그네슘으로 건조시키고, 여과하고 증발시킨다.
(*) 히드록실아민 용액은 3 당량의 히드록실아민 히드로클로라이드와 1 당량의 KOH를 MeOH에 0℃에서 용해시킴으로써 제조한다. 생성된 혼합물을 0℃에서 15분 동안 교반한다. KCl이 석출되며 여과에 의해 제거한다. 생성된 여액은 그대로 사용한다.
대안 II:
Fmoc-NH-OH에 그의 알콜 기를 통해 커플링되고 절단시 히드록삼산 기, 예컨대 2-클로로트리틸 수지 (III)를 수득하기에 적합한 중합체 지지체를 폴리에틸렌 다공성 디스크 (반응 용기)가 장착된 시린지에 배치한다. 수지는 적절한 유기 용매 예컨대 디클로로메탄 (DCM) 및 디메틸포름아미드 (DMF)를 사용한 세척에 의해 팽윤시킨다.
(III)
상기 중합체 지지체의 팽윤 후, Fmoc-NH-OH를, 적절한 유기 용매 예컨대 DCM 중 아미드 염기 예컨대 N,N-디이소프로필에틸아민 (DIEA)을 사용하여 수지에 부착시킨다. 혼합물을 24시간 동안 간헐적으로 교반한다. 그 후, 혼합물을 여과하지 않고, 무수 메탄올을 첨가하여 수지의 잔류하는 미반응 부위를 캡핑한다. 여과 및 세척 후, 아민 염기 용액 예컨대 DMF 중 피페리딘 용액 및/또는 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF의 혼합물로 처리함으로써 Fmoc을 제거하여 화학식 (XXII)의 생성물을 수득한다. 여액 및 세척액을 부피 측정 플라스크에 수집하여 일단 링커가 중합체 지지체에 고정되면 수지의 달성된 로딩을 UV 측정에 의해 정량화한다. Fmoc 제거를 또한 카이저 테스트를 사용하여 평가한다.
(XXII)
적절한 유기 용매 예컨대 DMF 중 첨가제 예컨대 에틸 시아노(히드록시이미노)아세테이트 (옥시마 퓨어)의 존재하에 또는 부재하에, 커플링제 예컨대 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC)를 사용하여 Nα-Fmoc-Nγ-Alloc-2,4-디아미노부티르산 (Fmoc-Dab(Alloc)-OH)을 화학식 (XXII)의 중합체 지지체에 부착시켜 화학식 (XXIII)의 생성물을 수득한다. 혼합물을 1시간의 총 반응 시간 동안에 교반한다. 커플링의 정도는 카이저 테스트를 사용하여 모니터링할 수 있고 재커플링을 필요한 경우 동일한 조건하에 행한다.
(XXIII)
화학식 (XXIII)의 화합물로부터의 Fmoc 보호기는 아민 염기 용액 예컨대 DMF 중 피페리딘 및/또는 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF의 혼합물을 사용하여 제거하여 화학식 (XXIV)의 화합물을 수득한다.
(XXIV)
적절한 유기 용매 예컨대 DMF 중 첨가제 예컨대 에틸 시아노(히드록시이미노)아세테이트 (옥시마 퓨어)의 존재하에 또는 부재하에, 활성화제 예컨대 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC)를 사용하여 Nα-Fmoc-메틸 이소류신 (Fmoc-NMeIle-OH)을 화학식 (XXIV)의 화합물에 부착시켜 화학식 (XXV)의 생성물을 수득한다. 혼합물을 1시간의 총 반응 시간 동안에 교반한다. 커플링의 정도는 카이저 테스트를 사용하여 모니터링할 수 있고 재커플링을 필요한 경우 동일한 조건하에 행한다.
(XXV)
화학식 (XXV)의 화합물로부터의 Fmoc 보호기는 아민 염기 용액 예컨대 DMF 중 피페리딘 용액 및/또는 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF의 혼합물로 제거하여 화학식 (XXVI)의 화합물을 수득한다.
(XXVI)
일단 화학식 (XXVI)의 화합물이 수득되면, 화학식 (X)의 Nα-Fmoc-프롤린 유도체
(X)
[상기 식에서 R5 및 R6은 앞에 정의된 바와 같다]를, 적절한 유기 용매 예컨대 DMF 중 첨가제 예컨대 에틸 시아노(히드록시이미노)아세테이트 (옥시마 퓨어)의 존재하에 또는 부재하에 커플링제 예컨대 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC)를 사용하여 커플링시켜, 화학식 (XXVII)의 생성물을 수득한다. 혼합물을 1시간의 총 반응 시간 동안에 교반한다. 커플링의 정도는 카이저 테스트를 사용하여 모니터링할 수 있고 재커플링을 필요한 경우 동일한 조건하에 행한다. 화학식 (X)의 화합물로부터의 Fmoc 보호기는 아민 염기 용액 예컨대 DMF 중 피페리딘 용액 및/또는 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF의 혼합물로 제거하여 화학식 (XXVII)의 화합물을 수득한다.
(XXVII)
적절한 유기 용매 예컨대 DMF 중 첨가제 예컨대 에틸 시아노(히드록시이미노)아세테이트 (옥시마 퓨어)의 존재하에 또는 부재하에, 커플링제 예컨대 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC)를 사용하여,
Fmoc-AA2-OH [상기 식에서 AA2는 본원에서 상기 정의된 바와 같다]를 화학식 (XXVII)의 생성물 상에 고정시켜 화학식 (XXVIII)의 생성물을 수득한다.
(XXVIII)
혼합물을 1시간의 총 반응 시간 동안에 교반한다. 커플링의 정도는 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링할 수 있고 재커플링을 필요한 경우 동일한 조건하에 행한다. AA2로부터의 Fmoc 보호기는 아민 염기 용액 예컨대 DMF 중 피페리딘 용액 및/또는 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF의 혼합물로 제거하여 화학식 (XXIX)의 화합물을 수득한다.
(XXIX)
적절한 유기 용매 예컨대 DMF 중 첨가제 예컨대 에틸 시아노(히드록시이미노)아세테이트 (옥시마 퓨어)의 존재하에 또는 부재하에, 커플링제 예컨대 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC)를 사용하여,
Fmoc-AA1-OH [상기 식에서 AA1은 본원에서 상기 정의된 바와 같다]를 화학식 (XXIX)의 생성물 상에 부착시켜 화학식 (XXX)의 생성물을 수득한다.
(XXX)
혼합물을 1시간의 총 반응 시간 동안에 교반한다. 커플링의 정도는 카이저 테스트를 사용하여 모니터링할 수 있고 재커플링을 필요한 경우 동일한 조건하에 행한다. 화학식 (XXX)의 화합물로부터의 Fmoc 보호기는 아민 염기 용액 예컨대 DMF 중 피페리딘 용액 및/또는 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF의 혼합물로 제거하여 화학식 (XXXI)의 화합물을 수득한다.
(XXXI)
R1-G- 모이어티 [여기서 R1 및 G는 본원에서 상기 정의된 바와 같다]를 화학식 (XXXI)의 화합물에, 적절한 유기 용매 예컨대 DMF 중 첨가제 예컨대 에틸 시아노(히드록시이미노)아세테이트 (옥시마 퓨어)의 존재하에 또는 부재하에, 커플링제 예컨대 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC)를 사용하여 부착시킨다. 혼합물을 1시간의 총 반응 시간 동안에 교반한다. 커플링의 정도는 카이저 테스트를 사용하여 모니터링할 수 있고 재커플링을 필요한 경우 동일한 조건하에 행하여 화합물 (XXXII)을 수득한다.
(XXXII)
화학식 (XXXII)의 화합물로부터의 alloc 보호기는, 화학식 (XXXII)의 화합물을 유기 용매 예컨대 DCM에 현탁시키고 거기에 페닐실란을 첨가하며, 한편 현탁액을 통해 N2를 버블링시킴으로써 제거하여, 화학식 (XXXIII)의 화합물을 수득한다. 그 다음에, 테트라키스(트리페닐포스핀)팔라듐(0)을 첨가하고, N2-버블링을 5분 동안 유지한다. 그 후, 반응 용기를 밀봉하고 15분 동안 환상으로 진탕시킨다. 이 시간 후, 반응물을 여과하고 수지를 완전히 세척한다. 동일한 처리를 2회 더 반복한다. 마지막 처리 후, 수지를 DCM, MeOH 및 DMF로 완전히 세척한다. alloc 보호기의 제거의 정도는 카이저 테스트를 사용하여 모니터링한다.
(XXXIII)
후속적으로, 화학식 (XVIII)의 생성물
(XVIII)
[상기 식에서 R2, R3 및 R4는 앞에 정의된 바와 같다]을, 적절한 유기 용매 예컨대 DMF 중 첨가제 예컨대 에틸 시아노(히드록시이미노)아세테이트 (옥시마 퓨어)의 존재하에 또는 부재하에, 커플링제 예컨대 N,N'-디이소프로필카르보디이미드 (DIC)를 사용하여, 화학식 (XXXIII)의 화합물의 디아미노부티르산 모이어티의 측쇄의 아미노 기에 커플링시킨다. 혼합물을 1시간의 총 반응 시간 동안에 교반한다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과해 내고 수지를 DMF, MeOH 및 DCM으로 완전히 세척한다. 커플링 반응의 정도는 카이저 테스트를 사용하여 모니터링한다. 비색 검사가 커플링 반응이 완전히 달성되지는 않았음을 나타낼 때 화학식 (XVIII)의 화합물의 재커플링 단계를 수행한다. 이 단계로 화학식 (XXXIV)의 화합물이 수득된다.
(XXXIV)
DCM 중 산 예컨대 트리플루오로아세트산 (TFA) (TFA/DCM 5:95)을 첨가함으로써 수지로부터 화학식 (XXXIV)의 화합물을 절단한다. 혼합물은 15분 동안 실온에서 교반한다. 이 시간 후, 수지를 여과해 내고 TFA/DCM (5:95) 그리고 그 다음에 DCM으로 수회 세척한다. 그 후, 수득된 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켜 화학식 (I)의 화합물을 수득한다.
(I)
실시예
실시예 1:
(2S)-1-아세틸-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(4-플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
0.8 당량의 시판되는 Fmoc-L-Dab(Alloc)-OH 및 DIEA (4 당량)를 2 mL의 DMF 중의 수지에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Nα-Fmoc-L-이소류신 (Fmoc-L-Ile-OH)의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. Ile 모이어티의 아미노 기의 N-메틸화를 위해, 유리 아미노 기를 DMF 중 염기로서 콜리딘 (10 당량)을 사용하여 오르토-니트로 벤젠 술포닐 클로라이드 (4 당량)로 보호하고, 이를 30분 동안 수지와 반응시켰다. 그 다음에, 수지를 DMF 및 DCM으로 세정하고, 상기 보호 단계를 동일한 조건하에 다시 반복하였다. 보호의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 수지를 DMF 중 3 당량의 7-메틸-1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔 및 4 당량의 파라-니트로벤젠술포네이트로 30분 동안 처리 (3회 처리)함으로써 아미노 기의 N-메틸화를 달성하였다. 처리 사이에 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세척하였다. Ile 아미노 기의 N-메틸화 후, 수지를 10 당량의 β-메르캅토에탄올 및 5 당량의 DBU (1 x 10' 및 1 x 40')로 처리함으로써 오르토-니트로 벤젠 술포닐 보호기를 제거하였다. 오르토-니트로 벤젠 술포닐 기의 제거는 클로라닐 테스트를 사용하여 평가하였다. 그 다음에, Fmoc-L-Pro-OH를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 펩티드의 N-부분 말단 부분의 아세틸화를 위해, 20 당량의 아세트산 무수물 및 20 당량의 DIEA를 수지에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 반응시키고 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. Alloc 기의 제거를 위해, DCM 중 10 당량의 페닐실란을 수지에 첨가하였으며 한편 혼합물을 통해 N2를 버블링시켰다. 그 다음에, 0.1 당량의 Pd(PPh3)4를 모든 것을 잘 혼합하면서 N2 버블링을 유지하여 첨가하였다. 그 다음에 반응 용기를 밀봉하고 15분 동안 진탕시켰다. 이 시간 후, 반응물을 여과하고 수지를 완전히 세척하였다. 동일한 처리를 2회 더 반복하였다. 마지막 처리 후, 수지를 DCM, MeOH 및 DMF로 완전히 세척하였다. Dab 모이어티의 측쇄 상에의 4-플루오로벤조산의 커플링을 위해, DMF 중 3 당량의 상기 산, 3 당량의 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 수지에 첨가하였다. 반응물을 60분 동안 반응시켰다. 이 시간 후, 수지를 DMF 및 DCM으로 세척하고 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다.
펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 선형 측쇄 보호된 펩티드는 HFIP/DCM (1:4)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 HFIP/DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 재차 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켰다. 조 펩티드를 사전 정제 없이 용액 중 히드록스아미드의 형성에 사용하였다. 펩티드를 DCM에 용해시켰다. 그 후, 3.5 당량의 O-(2,4-디메톡시벤질)히드록실아민, 5 당량의 4-메틸모르폴린, 1.3 당량의 커플링제 EDC·HCl 및 1.3 당량의 첨가제 HOAt를 첨가하고 혼합물을 N2 분위기 하에 밤새 반응시켰다. 반응의 정도를 HPLC를 사용하여 모니터링하였다. 일단 목적 생성물이 수득되면, 혼합물을 1N HCl, 물 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 그 후, TFA/물/TIS (95:2.5:2.5)의 혼합물을 펩티드 조생성물에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 가볍게 교반하였다. 그 후, TFA를 N2 흐름 하에 증발시켜, 실시예 1을 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
실시예 2:
(2S)-1-아세틸-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
0.8 당량의 시판되는 Fmoc-L-Dab(Alloc)-OH 및 DIEA (4 당량)를 2 mL의 DMF 중의 수지에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Fmoc-L-Ile-OH의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. Ile 모이어티의 아미노 기의 N-메틸화를 위해, 유리 아미노 기를 DMF 중 염기로서 콜리딘 (10 당량)을 사용하여 오르토-니트로 벤젠 술포닐 클로라이드 (4 당량)로 보호하고, 이를 30분 동안 수지와 반응시켰다. 그 다음에, 수지를 DMF 및 DCM으로 세정하고, 상기 보호 단계를 동일한 조건하에 다시 반복하였다. 보호의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 수지를 DMF 중 3 당량의 7-메틸-1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔 및 4 당량의 파라-니트로벤젠술포네이트로 30분 동안 처리 (3회 처리)함으로써 아미노 기의 N-메틸화를 달성하였다. 처리 사이에 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세척하였다. Ile 아미노 기의 N-메틸화 후, 수지를 10 당량의 β-메르캅토에탄올 및 5 당량의 DBU (1 x 10' 및 1 x 40')로 처리함으로써 오르토-니트로 벤젠 술포닐 보호기를 제거하였다. 오르토-니트로 벤젠 술포닐 기의 제거는 클로라닐 테스트를 사용하여 평가하였다. 그 다음에, Fmoc-L-Pro-OH를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 펩티드의 N-부분 말단 부분의 아세틸화를 위해, 20 당량의 아세트산 무수물 및 20 당량의 DIEA를 수지에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 반응시키고 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. Alloc 기의 제거를 위해, DCM 중 10 당량의 페닐실란을 수지에 첨가하였으며 한편 혼합물을 통해 N2를 버블링시켰다. 그 다음에, 0.1 당량의 Pd(PPh3)4를 모든 것을 잘 혼합하면서 N2 버블링을 유지하여 첨가하였다. 그 다음에 반응 용기를 밀봉하고 15분 동안 진탕시켰다. 이 시간 후, 반응물을 여과하고 수지를 완전히 세척하였다. 동일한 처리를 2회 더 반복하였다. 마지막 처리 후, 수지를 DCM, MeOH 및 DMF로 완전히 세척하였다. Dab 모이어티의 측쇄 상에의 3,5-디플루오로벤조산의 커플링을 위해, DMF 중 3 당량의 상기 산, 3 당량의 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 수지에 첨가하였다. 반응물을 60분 동안 반응시켰다. 이 시간 후, 수지를 DMF 및 DCM으로 세척하고 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다.
펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 선형 측쇄 보호된 펩티드는 HFIP/DCM (1:4)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 HFIP/DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 재차 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켰다. 조 펩티드를 사전 정제 없이 용액 중 히드록스아미드의 형성에 사용하였다. 펩티드를 DCM에 용해시켰다. 그 후, 3.5 당량의 O-(2,4-디메톡시벤질)히드록실아민, 5 당량의 4-메틸모르폴린, 1.3 당량의 커플링제 EDC·HCl 및 1.3 당량의 첨가제 HOAt를 첨가하고 혼합물을 N2 분위기 하에 밤새 반응시켰다. 반응의 정도를 HPLC를 사용하여 모니터링하였다. 일단 목적 생성물이 수득되면, 혼합물을 1N HCl, 물 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 그 후, TFA/물/TIS (95:2.5:2.5)의 혼합물을 펩티드 조생성물에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 가볍게 교반하였다. 그 후, TFA를 N2 흐름 하에 증발시켜, 실시예 2를 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
실시예 3:
(2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-1-헥사노일-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
0.8 당량의 시판되는 Fmoc-L-Dab(Alloc)-OH 및 DIEA (4 당량)를 2 mL의 DMF 중의 수지에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Fmoc-L-Ile-OH의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. Ile 모이어티의 아미노 기의 N-메틸화를 위해, 유리 아미노 기를 DMF 중 염기로서 콜리딘 (10 당량)을 사용하여 오르토-니트로 벤젠 술포닐 클로라이드 (4 당량)로 보호하고, 이를 30분 동안 수지와 반응시켰다. 그 다음에, 수지를 DMF 및 DCM으로 세정하고, 상기 보호 단계를 동일한 조건하에 다시 반복하였다. 보호의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 수지를 DMF 중 3 당량의 7-메틸-1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔 및 4 당량의 파라-니트로벤젠술포네이트로 30분 동안 처리 (3회 처리)함으로써 아미노 기의 N-메틸화를 달성하였다. 처리 사이에 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세척하였다. Ile 아미노 기의 N-메틸화 후, 수지를 10 당량의 β-메르캅토에탄올 및 5 당량의 DBU (1 x 10' 및 1 x 40')로 처리함으로써 오르토-니트로 벤젠 술포닐 보호기를 제거하였다. 오르토-니트로 벤젠 술포닐 기의 제거는 클로라닐 테스트를 사용하여 평가하였다. 그 후, Fmoc-L-Pro-OH 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 헥산산을, 20 당량의 상기 산, 10 당량의 커플링제 DPCDI 및 10 당량의 첨가제 HOAt를 수지에 첨가함으로써 Pro 모이어티에 커플링시켰다. 반응물을 60분 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 다음에 반응물을 여과해 내고 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세정하였다. 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. Alloc 기의 제거를 위해, DCM 중 10 당량의 페닐실란을 수지에 첨가하였으며 한편 혼합물을 통해 N2를 버블링시켰다. 그 다음에, 0.1 당량의 Pd(PPh3)4를 모든 것을 잘 혼합하면서 N2 버블링을 유지하여 첨가하였다. 그 다음에 반응 용기를 밀봉하고 15분 동안 진탕시켰다. 이 시간 후, 반응물을 여과하고 수지를 완전히 세척하였다. 동일한 처리를 2회 더 반복하였다. 마지막 처리 후, 수지를 DCM, MeOH 및 DMF로 완전히 세척하였다. Dab 모이어티의 측쇄 상에의 3,5-디플루오로벤조산의 커플링을 위해, DMF 중 3 당량의 상기 산, 3 당량의 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 수지에 첨가하였다. 반응물을 60분 동안 반응시켰다. 이 시간 후, 수지를 DMF 및 DCM으로 세척하고 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다.
펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 선형 측쇄 보호된 펩티드는 HFIP/DCM (1:4)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 HFIP/DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 재차 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켰다. 조 펩티드를 사전 정제 없이 용액 중 히드록스아미드의 형성에 사용하였다.　 펩티드를 DCM에 용해시켰다. 그 후, 3.5 당량의 O-(2,4-디메톡시벤질)히드록실아민, 5 당량의 4-메틸모르폴린, 1.3 당량의 커플링제 EDC·HCl 및 1.3 당량의 첨가제 HOAt를 첨가하고 혼합물을 N2 분위기 하에 밤새 반응시켰다. 반응의 정도를 HPLC를 사용하여 모니터링하였다. 일단 목적 생성물이 수득되면, 혼합물을 1N HCl, 물 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. TFA/물/TIS (95:2.5:2.5)의 혼합물을 펩티드 조생성물에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 가볍게 교반하였다. 그 후, TFA를 N2 흐름 하에 증발시켜, 실시예 3을 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
실시예 4:
(2S)-1-부타노일-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
0.8 당량의 시판되는 Fmoc-L-Dab(Alloc)-OH 및 DIEA (4 당량)를 2 mL의 DMF 중의 수지에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Fmoc-L-Ile-OH의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. Ile 모이어티의 아미노 기의 N-메틸화를 위해, 유리 아미노 기를 DMF 중 염기로서 콜리딘 (10 당량)을 사용하여 오르토-니트로 벤젠 술포닐 클로라이드 (4 당량)로 보호하고, 이를 30분 동안 수지와 반응시켰다. 그 다음에, 수지를 DMF 및 DCM으로 세정하고, 상기 보호 단계를 동일한 조건하에 다시 반복하였다. 보호의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 수지를 DMF 중 3 당량의 7-메틸-1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔 및 4 당량의 파라-니트로벤젠술포네이트로 30분 동안 처리 (3회 처리)함으로써 아미노 기의 N-메틸화를 달성하였다. 처리 사이에 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세척하였다. Ile 아미노 기의 N-메틸화 후, 수지를 10 당량의 β-메르캅토에탄올 및 5 당량의 DBU (1 x 10' 및 1 x 40')로 처리함으로써 오르토-니트로 벤젠 술포닐 보호기를 제거하였다. 오르토-니트로 벤젠 술포닐 기의 제거는 클로라닐 테스트를 사용하여 평가하였다. 그 후, Fmoc-L-Pro-OH 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 헥산산을, 20 당량의 상기 산, 10 당량의 커플링제 DPCDI 및 10 당량의 첨가제 HOAt를 수지에 첨가함으로써 Pro 모이어티에 커플링시켰다. 반응물을 60분 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 다음에 반응물을 여과해 내고 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세정하였다. 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. Alloc 기의 제거를 위해, DCM 중 10 당량의 페닐실란을 수지에 첨가하였으며 한편 혼합물을 통해 N2를 버블링시켰다. 그 다음에, 0.1 당량의 Pd(PPh3)4를 모든 것을 잘 혼합하면서 N2 버블링을 유지하여 첨가하였다. 그 다음에 반응 용기를 밀봉하고 15분 동안 진탕시켰다. 이 시간 후, 반응물을 여과하고 수지를 완전히 세척하였다. 동일한 처리를 2회 더 반복하였다. 마지막 처리 후, 수지를 DCM, MeOH 및 DMF로 완전히 세척하였다. Dab 모이어티의 측쇄 상에의 3,5-디플루오로벤조산의 커플링을 위해, DMF 중 3 당량의 상기 산, 3 당량의 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 수지에 첨가하였다. 반응물을 60분 동안 반응시켰다. 이 시간 후, 수지를 DMF 및 DCM으로 세척하고 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다.
펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 선형 측쇄 보호된 펩티드는 HFIP/DCM (1:4)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 HFIP/DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 재차 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켰다. 조 펩티드를 사전 정제 없이 용액 중 히드록스아미드의 형성에 사용하였다.　 펩티드를 DCM에 용해시켰다. 그 후, 3.5 당량의 O-(2,4-디메톡시벤질)히드록실아민, 5 당량의 4-메틸모르폴린, 1.3 당량의 커플링제 EDC·HCl 및 1.3 당량의 첨가제 HOAt를 첨가하고 혼합물을 N2 분위기 하에 밤새 반응시켰다. 반응의 정도를 HPLC를 사용하여 모니터링하였다. 일단 목적 생성물이 수득되면, 혼합물을 1N HCl, 물 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. TFA/물/TIS (95:2.5:2.5)의 혼합물을 펩티드 조생성물에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 가볍게 교반하였다. 그 후, TFA를 N2 흐름 하에 증발시켜, 실시예 4를 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
실시예 5:
(2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-1-(3-메틸부타노일)피롤리딘-2-카르복스아미드
0.8 당량의 시판되는 Fmoc-L-Dab(Alloc)-OH 및 DIEA (4 당량)를 2 mL의 DMF 중의 수지에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Fmoc-L-Ile-OH의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. Ile 모이어티의 아미노 기의 N-메틸화를 위해, 유리 아미노 기를 DMF 중 염기로서 콜리딘 (10 당량)을 사용하여 오르토-니트로 벤젠 술포닐 클로라이드 (4 당량)로 보호하고, 이를 30분 동안 수지와 반응시켰다. 그 다음에, 수지를 DMF 및 DCM으로 세정하고, 상기 보호 단계를 동일한 조건하에 다시 반복하였다. 보호의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 수지를 DMF 중 3 당량의 7-메틸-1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔 및 4 당량의 파라-니트로벤젠술포네이트로 30분 동안 처리 (3회 처리)함으로써 아미노 기의 N-메틸화를 달성하였다. 처리 사이에 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세척하였다. Ile 아미노 기의 N-메틸화 후, 수지를 10 당량의 β-메르캅토에탄올 및 5 당량의 DBU (1 x 10' 및 1 x 40')로 처리함으로써 오르토-니트로 벤젠 술포닐 보호기를 제거하였다. 오르토-니트로 벤젠 술포닐 기의 제거는 클로라닐 테스트를 사용하여 평가하였다. 그 후, Fmoc-L-Pro-OH 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 3-메틸부탄산을, 20 당량의 상기 산, 10 당량의 커플링제 DPCDI 및 10 당량의 첨가제 HOAt를 수지에 첨가함으로써 Pro 모이어티에 커플링시켰다. 반응물을 60분 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 다음에 반응물을 여과해 내고 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세정하였다. 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. Alloc 기의 제거를 위해, DCM 중 10 당량의 페닐실란을 수지에 첨가하였으며 한편 혼합물을 통해 N2를 버블링시켰다. 그 다음에, 0.1 당량의 Pd(PPh3)4를 모든 것을 잘 혼합하면서 N2 버블링을 유지하여 첨가하였다. 그 다음에 반응 용기를 밀봉하고 15분 동안 진탕시켰다. 이 시간 후, 반응물을 여과하고 수지를 완전히 세척하였다. 동일한 처리를 2회 더 반복하였다. 마지막 처리 후, 수지를 DCM, MeOH 및 DMF로 완전히 세척하였다. Dab 모이어티의 측쇄 상에의 3,5-디플루오로벤조산의 커플링을 위해, DMF 중 3 당량의 상기 산, 3 당량의 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 수지에 첨가하였다. 반응물을 60분 동안 반응시켰다. 이 시간 후, 수지를 DMF 및 DCM으로 세척하고 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다.
펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 선형 측쇄 보호된 펩티드는 HFIP/DCM (1:4)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 HFIP/DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 재차 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켰다. 조 펩티드를 사전 정제 없이 용액 중 히드록스아미드의 형성에 사용하였다.　 펩티드를 DCM에 용해시켰다. 그 후, 3.5 당량의 O-(2,4-디메톡시벤질)히드록실아민, 5 당량의 4-메틸모르폴린, 1.3 당량의 커플링제 EDC·HCl 및 1.3 당량의 첨가제 HOAt를 첨가하고 혼합물을 N2 분위기 하에 밤새 반응시켰다. 반응의 정도를 HPLC를 사용하여 모니터링하였다. 일단 목적 생성물이 수득되면, 혼합물을 1N HCl, 물 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. TFA/물/TIS (95:2.5:2.5)의 혼합물을 펩티드 조생성물에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 가볍게 교반하였다. 그 후, TFA를 N2 흐름 하에 증발시켜, 실시예 5를 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
실시예 6:
(2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-1-옥타노일-피롤리딘-2-카르복스아미드
0.8 당량의 시판되는 Fmoc-L-Dab(Alloc)-OH 및 DIEA (4 당량)를 2 mL의 DMF 중의 수지에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Fmoc-L-Ile-OH의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. Ile 모이어티의 아미노 기의 N-메틸화를 위해, 유리 아미노 기를 DMF 중 염기로서 콜리딘 (10 당량)을 사용하여 오르토-니트로 벤젠 술포닐 클로라이드 (4 당량)로 보호하고, 이를 30분 동안 수지와 반응시켰다. 그 다음에, 수지를 DMF 및 DCM으로 세정하고, 상기 보호 단계를 동일한 조건하에 다시 반복하였다. 보호의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 수지를 DMF 중 3 당량의 7-메틸-1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔 및 4 당량의 파라-니트로벤젠술포네이트로 30분 동안 처리 (3회 처리)함으로써 아미노 기의 N-메틸화를 달성하였다. 처리 사이에 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세척하였다. Ile 아미노 기의 N-메틸화 후, 수지를 10 당량의 β-메르캅토에탄올 및 5 당량의 DBU (1 x 10' 및 1 x 40')로 처리함으로써 오르토-니트로 벤젠 술포닐 보호기를 제거하였다. 오르토-니트로 벤젠 술포닐 기의 제거는 클로라닐 테스트를 사용하여 평가하였다. 그 후, Fmoc-L-Pro-OH 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 옥탄산을, 20 당량의 상기 산, 10 당량의 커플링제 DPCDI 및 10 당량의 첨가제 HOAt를 수지에 첨가함으로써 Pro 모이어티에 커플링시켰다. 반응물을 60분 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 다음에 반응물을 여과해 내고 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세정하였다. 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. Alloc 기의 제거를 위해, DCM 중 10 당량의 페닐실란을 수지에 첨가하였으며 한편 혼합물을 통해 N2를 버블링시켰다. 그 다음에, 0.1 당량의 Pd(PPh3)4를 모든 것을 잘 혼합하면서 N2 버블링을 유지하여 첨가하였다. 그 다음에 반응 용기를 밀봉하고 15분 동안 진탕시켰다. 이 시간 후, 반응물을 여과하고 수지를 완전히 세척하였다. 동일한 처리를 2회 더 반복하였다. 마지막 처리 후, 수지를 DCM, MeOH 및 DMF로 완전히 세척하였다. Dab 모이어티의 측쇄 상에의 3,5-디플루오로벤조산의 커플링을 위해, DMF 중 3 당량의 상기 산, 3 당량의 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 수지에 첨가하였다. 반응물을 60분 동안 반응시켰다. 이 시간 후, 수지를 DMF 및 DCM으로 세척하고 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다.
펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 선형 측쇄 보호된 펩티드는 HFIP/DCM (1:4)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 HFIP/DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 재차 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켰다. 조 펩티드를 사전 정제 없이 용액 중 히드록스아미드의 형성에 사용하였다.　 펩티드를 DCM에 용해시켰다. 그 후, 3.5 당량의 O-(2,4-디메톡시벤질)히드록실아민, 5 당량의 4-메틸모르폴린, 1.3 당량의 커플링제 EDC·HCl 및 1.3 당량의 첨가제 HOAt를 첨가하고 혼합물을 N2 분위기 하에 밤새 반응시켰다. 반응의 정도를 HPLC를 사용하여 모니터링하였다. 일단 목적 생성물이 수득되면, 혼합물을 1N HCl, 물 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. TFA/물/TIS (95:2.5:2.5)의 혼합물을 펩티드 조생성물에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 가볍게 교반하였다. 그 후, TFA를 N2 흐름 하에 증발시켜, 실시예 6을 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
실시예 7:
(2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-4,4-디플루오로-1-헥사노일-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
0.8 당량의 시판되는 Fmoc-L-Dab(Alloc)-OH 및 DIEA (4 당량)를 2 mL의 DMF 중의 수지에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Fmoc-L-Ile-OH의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. Ile 모이어티의 아미노 기의 N-메틸화를 위해, 유리 아미노 기를 DMF 중 염기로서 콜리딘 (10 당량)을 사용하여 오르토-니트로 벤젠 술포닐 클로라이드 (4 당량)로 보호하고, 이를 30분 동안 수지와 반응시켰다. 그 다음에, 수지를 DMF 및 DCM으로 세정하고, 상기 보호 단계를 동일한 조건하에 다시 반복하였다. 보호의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 수지를 DMF 중 3 당량의 7-메틸-1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔 및 4 당량의 파라-니트로벤젠술포네이트로 30분 동안 처리 (3회 처리)함으로써 아미노 기의 N-메틸화를 달성하였다. 처리 사이에 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세척하였다. Ile 아미노 기의 N-메틸화 후, 수지를 10 당량의 β-메르캅토에탄올 및 5 당량의 DBU (1 x 10' 및 1 x 40')로 처리함으로써 오르토-니트로 벤젠 술포닐 보호기를 제거하였다. 오르토-니트로 벤젠 술포닐 기의 제거는 클로라닐 테스트를 사용하여 평가하였다. 그 후, Fmoc-L-(4,4-디플루오로)Pro-OH 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 헥산산을, 20 당량의 상기 산, 10 당량의 커플링제 DPCDI 및 10 당량의 첨가제 HOAt를 수지에 첨가함으로써 Pro 모이어티에 커플링시켰다. 반응물을 60분 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 다음에 반응물을 여과해 내고 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세정하였다. 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. Alloc 기의 제거를 위해, DCM 중 10 당량의 페닐실란을 수지에 첨가하였으며 한편 혼합물을 통해 N2를 버블링시켰다. 그 다음에, 0.1 당량의 Pd(PPh3)4를 모든 것을 잘 혼합하면서 N2 버블링을 유지하여 첨가하였다. 그 다음에 반응 용기를 밀봉하고 15분 동안 진탕시켰다. 이 시간 후, 반응물을 여과하고 수지를 완전히 세척하였다. 동일한 처리를 2회 더 반복하였다. 마지막 처리 후, 수지를 DCM, MeOH 및 DMF로 완전히 세척하였다. Dab 모이어티의 측쇄 상에의 3,5-디플루오로벤조산의 커플링을 위해, DMF 중 3 당량의 상기 산, 3 당량의 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 수지에 첨가하였다. 반응물을 60분 동안 반응시켰다. 이 시간 후, 수지를 DMF 및 DCM으로 세척하고 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다.
펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 선형 측쇄 보호된 펩티드는 HFIP/DCM (1:4)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 HFIP/DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 재차 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켰다. 조 펩티드를 사전 정제 없이 용액 중 히드록스아미드의 형성에 사용하였다.　 펩티드를 DCM에 용해시켰다. 그 후, 3.5 당량의 O-(2,4-디메톡시벤질)히드록실아민, 5 당량의 4-메틸모르폴린, 1.3 당량의 커플링제 EDC·HCl 및 1.3 당량의 첨가제 HOAt를 첨가하고 혼합물을 N2 분위기 하에 밤새 반응시켰다. 반응의 정도를 HPLC를 사용하여 모니터링하였다. 일단 목적 생성물이 수득되면, 혼합물을 1N HCl, 물 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. TFA/물/TIS (95:2.5:2.5)의 혼합물을 펩티드 조생성물에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 가볍게 교반하였다. 그 후, TFA를 N2 흐름 하에 증발시켜, 실시예 7을 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
실시예 8:
(2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-1-(2-프로필펜타노일)피롤리딘-2-카르복스아미드
1.5 당량의 시판되는 Fmoc-NH-OH 및 DIEA (10 당량)를 2 mL의 DCM 중의 2-클로로트리틸 수지에 첨가하였다. 혼합물을 24시간 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Nα-Fmoc-Nγ-alloc-L-2,4-디아미노부티르산 (Fmoc-L-Dab(alloc)-OH)의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 첨가제 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 그 후, Fmoc-N-메틸-L-이소류신 (Fmoc-NMe-L-Ile-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 그 후, Fmoc-L-프롤린 (Fmoc-L-Pro-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 2-프로필 펜탄산을, 소량의 DMF에 용해되고 2분 동안 예비 혼합된 3 당량의 상기 산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 수지에 첨가함으로써, 프롤린 모이어티에 커플링시켰다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 그 다음에 반응물을 여과해 내고 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세정하였다. 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. Alloc 기의 제거를 위해, DCM 중 10 당량의 페닐실란을 수지에 첨가하였으며 한편 혼합물을 통해 N2를 버블링시켰다. 그 다음에, 0.1 당량의 Pd(PPh3)4를 모든 것을 잘 혼합하면서 N2 버블링을 유지하여 첨가하였다. 그 다음에 반응 용기를 밀봉하고 15분 동안 진탕시켰다. 이 시간 후, 반응물을 여과하고 수지를 완전히 세척하였다. 동일한 처리를 2회 더 반복하였다. 마지막 처리 후, 수지를 DCM, MeOH 및 DMF로 완전히 세척하였다. 디아미노에틸 모이어티의 측쇄 상에의 3,5-디플루오로벤조산의 커플링을 위해, 3 당량의 상기 산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 이 시간 후, 수지를 DMF 및 DCM으로 세척하고 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다.
펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 펩티드는 DCM/TFA (95:5)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 2회 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켜, 실시예 8을 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다
실시예 9:
(2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-1-(4-페녹시부타노일)피롤리딘-2-카르복스아미드
1.5 당량의 시판되는 Fmoc-NH-OH 및 DIEA (10 당량)를 2 mL의 DCM 중의 2-클로로트리틸 수지에 첨가하였다. 혼합물을 24시간 동안에 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Nα-Fmoc-Nγ-alloc-L-2,4-디아미노부티르산 (Fmoc-L-Dab(alloc)-OH)의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 그 후, Fmoc-N-메틸-L-이소류신 (Fmoc-L-NMeIle-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 그 후, Fmoc-L-프롤린 (Fmoc-L-Pro-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 4-페녹시부티르산을, 소량의 DMF에 용해되고 2분 동안 예비 혼합된 3 당량의 상기 산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 수지에 첨가함으로써, 프롤린 모이어티에 커플링시켰다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 그 다음에 반응물을 여과해 내고 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세정하였다. 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. Alloc 기의 제거를 위해, DCM 중 10 당량의 페닐실란을 수지에 첨가하였으며 한편 혼합물을 통해 N2를 버블링시켰다. 그 다음에, 0.1 당량의 Pd(PPh3)4를 모든 것을 잘 혼합하면서 N2 버블링을 유지하여 첨가하였다. 그 다음에, 0.1 당량의 Pd(PPh3)4를 모든 것을 잘 혼합하면서 N2 버블링을 유지하여 첨가하였다. 그 다음에 반응 용기를 밀봉하고 15분 동안 진탕시켰다. 이 시간 후, 반응물을 여과하고 수지를 완전히 세척하였다. 동일한 처리를 2회 더 반복하였다. 마지막 처리 후, 수지를 DCM, MeOH 및 DMF로 완전히 세척하였다. 디아미노에틸 모이어티의 측쇄 상에의 3,5-디플루오로벤조산의 커플링을 위해, 3 당량의 상기 산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 이 시간 후, 수지를 DMF 및 DCM으로 세척하고 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다.
펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 펩티드는 DCM/TFA (95:5)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 2회 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켜, 실시예 9를 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
실시예 10:
(2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-4,4-디플루오로-N-메틸-1-(4-페녹시부타노일)피롤리딘-2-카르복스아미드
1.5 당량의 시판되는 Fmoc-NH-OH 및 DIEA (10 당량)를 2 mL의 DCM 중의 2-클로로트리틸 수지에 첨가하였다. 혼합물을 24시간 동안에 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Nα-Fmoc-Nγ-alloc-L-2,4-디아미노부티르산 (Fmoc-L-Dab(alloc)-OH)의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 그 후, Fmoc-N-메틸-L-이소류신 (Fmoc-NMe-L-Ile-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 그 후, Fmoc-4,4-디플루오로-L-프롤린 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 4-페녹시부티르산을, 소량의 DMF에 용해되고 2분 동안 예비 혼합된 3 당량의 상기 산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 수지에 첨가함으로써, 프롤린 모이어티에 커플링시켰다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 그 다음에 반응물을 여과해 내고 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세정하였다. 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. Alloc 기의 제거를 위해, DCM 중 10 당량의 페닐실란을 수지에 첨가하였으며 한편 혼합물을 통해 N2를 버블링시켰다. 그 다음에, 0.1 당량의 Pd(PPh3)4를 모든 것을 잘 혼합하면서 N2 버블링을 유지하여 첨가하였다. 그 다음에 반응 용기를 밀봉하고 15분 동안 진탕시켰다. 이 시간 후, 반응물을 여과하고 수지를 완전히 세척하였다. 동일한 처리를 2회 더 반복하였다. 마지막 처리 후, 수지를 DCM, MeOH 및 DMF로 완전히 세척하였다. 디아미노에틸 모이어티의 측쇄 상에의 3,5-디플루오로벤조산의 커플링을 위해, 3 당량의 상기 산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 이 시간 후, 수지를 DMF 및 DCM으로 세척하고 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다.
펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 펩티드는 DCM/TFA (95:5)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 2회 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켜, 실시예 10을 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
실시예 11:
(2S)-1-[(2S)-2-[아세틸(메틸)아미노]-3-페닐-프로파노일]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
1.5 당량의 시판되는 Fmoc-NH-OH 및 DIEA (10 당량)를 2 mL의 DCM 중의 2-클로로트리틸 수지에 첨가하였다. 혼합물을 24시간 동안에 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Nα-Fmoc-Nγ-alloc-L-2,4-디아미노부티르산 (Fmoc-L-Dab(alloc)-OH)의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 그 후, Fmoc-N-메틸-L-이소류신 (Fmoc-NMe-L-Ile-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 그 후, Fmoc-L-프롤린 (Fmoc-L-Pro-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 그 후, Fmoc-N-메틸-L-페닐알라닌 (Fmoc-NMe-L-Phe-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 펩티드의 N-부분 말단 부분의 아세틸화를 위해, 20 당량의 아세트산 무수물 및 20 당량의 DIEA를 수지에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 반응시키고 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. Alloc 기의 제거를 위해, DCM 중 10 당량의 페닐실란을 수지에 첨가하였으며 한편 혼합물을 통해 N2를 버블링시켰다. 그 다음에, 0.1 당량의 Pd(PPh3)4를 모든 것을 잘 혼합하면서 N2 버블링을 유지하여 첨가하였다. 그 다음에 반응 용기를 밀봉하고 15분 동안 진탕시켰다. 이 시간 후, 반응물을 여과하고 수지를 완전히 세척하였다. 동일한 처리를 2회 더 반복하였다. 마지막 처리 후, 수지를 DCM, MeOH 및 DMF로 완전히 세척하였다. 디아미노에틸 모이어티의 측쇄 상에의 3,5-디플루오로벤조산의 커플링을 위해, 3 당량의 상기 산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 이 시간 후, 수지를 DMF 및 DCM으로 세척하고 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다.
펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 펩티드는 DCM/TFA (95:5)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 2회 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켜, 실시예 11을 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
실시예 12:
(2S)-1-[(2S)-2-[아세틸(메틸)아미노]프로파노일]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
1.5 당량의 시판되는 Fmoc-NH-OH 및 DIEA (10 당량)를 2 mL의 DCM 중의 2-클로로트리틸 수지에 첨가하였다. 혼합물을 24시간 동안에 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Nα-Fmoc-Nγ-alloc-L-2,4-디아미노부티르산 (Fmoc-L-Dab(alloc)-OH)의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 그 후, Fmoc-N-메틸-L-이소류신 (Fmoc-NMe-L-Ile-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 그 후, Fmoc-L-프롤린 (Fmoc-L-Pro-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 그 후, Fmoc-N-L-알라닌 (Fmoc-L-Ala-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 수지를 DMF 중 3 당량의 7-메틸-1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔 및 4 당량의 파라-니트로벤젠술포네이트로 30분 동안 처리 (3회 처리)함으로써 아미노 기의 N-메틸화를 달성하였다. 처리 사이에 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세척하였다. Ala 아미노 기의 N-메틸화 후, 수지를 10 당량의 β-메르캅토에탄올 및 5 당량의 DBU (1 x 10' 및 1 x 40')로 처리함으로써 오르토-니트로 벤젠 술포닐 보호기를 제거하였다. 오르토-니트로 벤젠 술포닐 기의 제거는 클로라닐 테스트를 사용하여 평가하였다. 펩티드의 N-부분 말단 부분의 아세틸화를 위해, 20 당량의 아세트산 무수물 및 20 당량의 DIEA를 수지에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 반응시키고 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. Alloc 기의 제거를 위해, DCM 중 10 당량의 페닐실란을 수지에 첨가하였으며 한편 혼합물을 통해 N2를 버블링시켰다. 그 다음에, 0.1 당량의 Pd(PPh3)4를 모든 것을 잘 혼합하면서 N2 버블링을 유지하여 첨가하였다. 그 다음에 반응 용기를 밀봉하고 15분 동안 진탕시켰다. 이 시간 후, 반응물을 여과하고 수지를 완전히 세척하였다. 동일한 처리를 2회 더 반복하였다. 마지막 처리 후, 수지를 DCM, MeOH 및 DMF로 완전히 세척하였다. 디아미노에틸 모이어티의 측쇄 상에의 3,5-디플루오로벤조산의 커플링을 위해, 3 당량의 상기 산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 이 시간 후, 수지를 DMF 및 DCM으로 세척하고 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다.
펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 펩티드는 DCM/TFA (95:5)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 2회 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켜, 실시예 12를 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
실시예 13:
(2S)-1-[3-[아세틸(메틸)아미노]프로파노일]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
1.5 당량의 시판되는 Fmoc-NH-OH 및 DIEA (10 당량)를 2 mL의 DCM 중의 2-클로로트리틸 수지에 첨가하였다. 혼합물을 24시간 동안에 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Nα-Fmoc-Nγ-alloc-L-2,4-디아미노부티르산 (Fmoc-L-Dab(alloc)-OH)의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 그 후, Fmoc-N-메틸-L-이소류신 (Fmoc-NMe-L-Ile-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 그 후, Fmoc-L-프롤린 (Fmoc-L-Pro-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 그 후, Fmoc-β-알라닌 (Fmoc-β-Ala-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 수지를 DMF 중 3 당량의 7-메틸-1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔 및 4 당량의 파라-니트로벤젠술포네이트로 30분 동안 처리 (3회 처리)함으로써 아미노 기의 N-메틸화를 달성하였다. 처리 사이에 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세척하였다. β-Ala 아미노 기의 N-메틸화 후, 수지를 10 당량의 β-메르캅토에탄올 및 5 당량의 DBU (1 x 10' 및 1 x 40')로 처리함으로써 오르토-니트로 벤젠 술포닐 보호기를 제거하였다. 클로라닐 테스트를 사용하여 오르토-니트로 벤젠 술포닐 기의 제거를 평가하였다. 펩티드의 N-부분 말단 부분의 아세틸화를 위해, 20 당량의 아세트산 무수물 및 20 당량의 DIEA를 수지에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 반응시키고 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. Alloc 기의 제거를 위해, DCM 중 10 당량의 페닐실란을 수지에 첨가하였으며 한편 혼합물을 통해 N2를 버블링시켰다. 그 다음에, 0.1 당량의 Pd(PPh3)4를 모든 것을 잘 혼합하면서 N2 버블링을 유지하여 첨가하였다. 그 다음에 반응 용기를 밀봉하고 15분 동안 진탕시켰다. 이 시간 후, 반응물을 여과하고 수지를 완전히 세척하였다. 동일한 처리를 2회 더 반복하였다. 마지막 처리 후, 수지를 DCM, MeOH 및 DMF로 완전히 세척하였다. 디아미노에틸 모이어티의 측쇄 상에의 3,5-디플루오로벤조산의 커플링을 위해, 3 당량의 상기 산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 이 시간 후, 수지를 DMF 및 DCM으로 세척하고 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다.
펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 펩티드는 DCM/TFA (95:5)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 2회 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켜, 실시예 13을 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
실시예 14:
(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[부타노일(메틸)아미노]-3-(1H-인돌-3-일)프로파노일]-메틸-아미노]-4-메틸-펜타노일]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
1.5 당량의 시판되는 Fmoc-NH-OH 및 DIEA (10 당량)를 2 mL의 DCM 중의 2-클로로트리틸 수지에 첨가하였다. 혼합물을 24시간 동안에 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Nα-Fmoc-Nγ-alloc-L-2,4-디아미노부티르산 (Fmoc-L-Dab(alloc)-OH)의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 그 후, Fmoc-N-메틸-L-이소류신 (Fmoc-NMe-L-Ile-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 그 후, Fmoc-L-프롤린 (Fmoc-L-Pro-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 그 후, Fmoc-N-메틸-L-류신 (Fmoc-NMeLeu-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 그 후, Nα-Fmoc-N(in)-Boc-N-메틸-L-트립토판 (Fmoc-NMe-L-Trp(Boc)-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 부티르산을, , 소량의 DMF에 용해되고 2분 동안 예비 혼합된 3 당량의 상기 산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 수지에 첨가함으로써, 트립토판 모이어티에 커플링시켰다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 그 다음에 반응물을 여과해 내고 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세정하였다. 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. Alloc 기의 제거를 위해, DCM 중 10 당량의 페닐실란을 수지에 첨가하였으며 한편 혼합물을 통해 N2를 버블링시켰다. 그 다음에, 0.1 당량의 Pd(PPh3)4를 모든 것을 잘 혼합하면서 N2 버블링을 유지하여 첨가하였다. 그 다음에 반응 용기를 밀봉하고 15분 동안 진탕시켰다. 이 시간 후, 반응물을 여과하고 수지를 완전히 세척하였다. 동일한 처리를 2회 더 반복하였다. 마지막 처리 후, 수지를 DCM, MeOH 및 DMF로 완전히 세척하였다. 디아미노에틸 모이어티의 측쇄 상에의 3,5-디플루오로벤조산의 커플링을 위해, 3 당량의 상기 산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 이 시간 후, 수지를 DMF 및 DCM으로 세척하고 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다.
펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 펩티드는 DCM/TFA (95:5)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 2회 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켜, 실시예 14를 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
실시예 15:
(2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-벤즈아미도-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-1-헥사노일-피롤리딘-2-카르복스아미드
1.5 당량의 시판되는 Fmoc-NH-OH 및 DIEA (10 당량)를 2 mL의 DCM 중의 2-클로로트리틸 수지에 첨가하였다. 혼합물을 24시간 동안에 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Nα-Fmoc-Nγ-alloc-L-2,4-디아미노부티르산 (Fmoc-L-Dab(alloc)-OH)의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 그 후, Fmoc-N-메틸-L-이소류신 (Fmoc-NMe-L-Ile-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 그 후, Fmoc-L-프롤린 (Fmoc-L-Pro-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 헥산산을, 소량의 DMF에 용해되고 2분 동안 예비 혼합된 3 당량의 상기 산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 수지에 첨가함으로써, 프롤린 모이어티에 커플링시켰다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 그 다음에 반응물을 여과해 내고 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세정하였다. 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. Alloc 기의 제거를 위해, DCM 중 10 당량의 페닐실란을 수지에 첨가하였으며 한편 혼합물을 통해 N2를 버블링시켰다. 그 다음에, 0.1 당량의 Pd(PPh3)4를 모든 것을 잘 혼합하면서 N2 버블링을 유지하여 첨가하였다. 그 다음에 반응 용기를 밀봉하고 15분 동안 진탕시켰다. 이 시간 후, 반응물을 여과하고 수지를 완전히 세척하였다. 동일한 처리를 2회 더 반복하였다. 마지막 처리 후, 수지를 DCM, MeOH 및 DMF로 완전히 세척하였다. 디아미노에틸 모이어티의 측쇄 상에의 벤조산의 커플링을 위해, 3 당량의 상기 산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 이 시간 후, 수지를 DMF 및 DCM으로 세척하고 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다.
펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 펩티드는 DCM/TFA (95:5)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 2회 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켜, 실시예 15를 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
실시예 16:
(2S,4R)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-벤즈아미도-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-4-플루오로-N-메틸-1-헥사노일-피롤리딘-2-카르복스아미드
1.5 당량의 시판되는 Fmoc-NH-OH 및 DIEA (10 당량)를 2 mL의 DCM 중의 2-클로로트리틸 수지에 첨가하였다. 혼합물을 24시간 동안에 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Nα-Fmoc-Nγ-alloc-L-2,4-디아미노부티르산 (Fmoc-L-Dab(alloc)-OH)의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 그 후, Fmoc-N-메틸-L-이소류신 (Fmoc-NMe-L-Ile-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하여 제거하였다. 그 후, Fmoc-트랜스-4-플루오로-L-프롤린 (Fmoc-L-(F)Pro-OH) 모이어티를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 헥산산을, 소량의 DMF에 용해되고 2분 동안 예비 혼합된 3 당량의 상기 산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 수지에 첨가함으로써, 프롤린 모이어티에 커플링시켰다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 그 다음에 반응물을 여과해 내고 수지를 DMF 및 DCM으로 완전히 세정하였다. 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. Alloc 기의 제거를 위해, DCM 중 10 당량의 페닐실란을 수지에 첨가하였으며 한편 혼합물을 통해 N2를 버블링시켰다. 그 다음에, 0.1 당량의 Pd(PPh3)4를 모든 것을 잘 혼합하면서 N2 버블링을 유지하여 첨가하였다. 그 다음에 반응 용기를 밀봉하고 15분 동안 진탕시켰다. 이 시간 후, 반응물을 여과하고 수지를 완전히 세척하였다. 동일한 처리를 2회 더 반복하였다. 마지막 처리 후, 수지를 DCM, MeOH 및 DMF로 완전히 세척하였다. 디아미노에틸 모이어티의 측쇄 상에의 벤조산의 커플링을 위해, 3 당량의 상기 산, 3 당량의 커플링제 DIC 및 3 당량의 옥시마 퓨어를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 생성된 혼합물을 수지에 첨가하고 반응을 60분 동안 진행시켰다. 이 시간 후, 수지를 DMF 및 DCM으로 세척하고 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다.
펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 펩티드는 DCM/TFA (95:5)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 2회 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켜, 실시예 16을 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
비교 실시예
비교 실시예 17:
(2S)-2-[[(2S)-1-아세틸피롤리딘-2-카르보닐)아미노]-N-[(1S)-2-(히드록시아미노)-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소-에틸]펜탄디아미드
0.8 당량의 시판되는 Nα-Fmoc-N(in)-Boc-L-트립토판 (Fmoc-L-Trp(Boc)-OH), 및 DIEA (4 당량)를 2 mL의 DMF 중의 수지에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Nα-Fmoc-Nδ-트리틸-L-글루타민 (Fmoc-L-Gln(Trt)-OH)의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10')으로 처리하여 제거하였다. 그 다음에, Fmoc-L-프롤린 (Fmoc-L-Pro-OH)을 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 펩티드의 N-부분 말단 부분의 아세틸화를 위해, 20 당량의 아세트산 무수물 및 20 당량의 DIEA를 수지에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 반응시키고 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 선형 측쇄 보호된 펩티드는 HFIP/DCM (1:4)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 30 HFIP/DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 재차 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켰다. 조 펩티드를 사전 정제 없이 용액 중 히드록스아미드의 형성에 사용하였다. 펩티드를 DCM에 용해시켰다. 그 후, 3.5 당량의 O-(2,4-디메톡시벤질)히드록실아민, 5 당량의 4-메틸모르폴린, 1.3 당량의 5 커플링제 EDC·HCl 및 1.3 당량의 첨가제 HOAt를 첨가하고 혼합물을 N2 분위기 하에 밤새 반응시켰다. 반응의 정도를 HPLC를 사용하여 모니터링하였다. 일단 목적 생성물이 수득되면, 혼합물을 1N HCl, 물 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 그 후, TFA/물/TIS (95:2.5:2.5)의 혼합물을 펩티드 조생성물에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 가볍게 교반하였다. 그 후, TFA를 N2 흐름 하에 증발시켜, 실시예 17을 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
비교 실시예 18:
(2S)-2-아세트아미도-N-[(1S)-2-[[(1S)-1-(히드록시카르바모일)-2-메틸-부틸]아미노]-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소-에틸]펜탄디아미드
0.8 당량의 시판되는 Fmoc-L-이소류신 (Fmoc-L-Ile-OH) 및 DIEA (4 당량)를 2 mL의 DMF 중의 수지에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 10 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Nα-Fmoc-N(in)-Boc-L-트립토판 (Fmoc-L-Trp(Boc)-OH)의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10')으로 처리하여 제거하였다. 그 다음에, Fmoc-L-글루탐산 5-tert-부틸 에스테르 (Fmoc-L-Glu(tBu)-OH)를 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 펩티드의 N-부분 말단 부분의 아세틸화를 위해, 20 당량의 아세트산 무수물 및 20 당량의 DIEA를 수지에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 반응시키고 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다
펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 선형 측쇄 보호된 펩티드를 HFIP/DCM (1:4)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 30 HFIP/DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 재차 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켰다. 조 펩티드를 사전 정제 없이 용액 중 히드록스아미드의 형성에 사용하였다. 펩티드를 DCM에 용해시켰다. 그 후, 3.5 당량의 O-(2,4-디메톡시벤질)히드록실아민, 5 당량의 4-메틸모르폴린, 1.3 당량의 5 커플링제 EDC·HCl 및 1.3 당량의 첨가제 HOAt를 첨가하고 혼합물을 N2 분위기 하에 밤새 반응시켰다. 반응의 정도를 HPLC를 사용하여 모니터링하였다. 일단 목적 생성물이 수득되면, 혼합물을 1N HCl, 물 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 그 후, TFA/물/TIS (95:2.5:2.5)의 혼합물을 펩티드 조생성물에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 가볍게 교반하였다. 그 후, TFA를 N2 흐름 하에 증발시켜, 실시예 18을 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
비교 실시예 19:
(2S)-1-[(2S)-2-아세트아미도-5-아미노-5-옥소-펜타노일]-N-[(1S)-1-(히드록시카르바모일)-2-메틸-부틸]피롤리딘-2-카르복스아미드
0.8 당량의 시판되는 Fmoc-L-이소류신 (Fmoc-L-Ile-OH) 및 DIEA (4 당량)를 2 mL의 DMF 중의 수지에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Fmoc-L-프롤린 (Fmoc-L-Pro-OH)의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10')으로 처리하여 제거하였다. 그 다음에, Nα-Fmoc-Nδ-트리틸-L-글루타민 (Fmoc-L-Gln(Trt)-OH)을 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 10 제거하였다. 펩티드의 N-부분 말단 부분의 아세틸화를 위해, 20 당량의 아세트산 무수물 및 20 당량의 DIEA를 수지에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 반응시키고 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다.
펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 선형 측쇄 보호된 펩티드는 HFIP/DCM (1:4)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 30 HFIP/DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 재차 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켰다. 조 펩티드를 사전 정제 없이 용액 중 히드록스아미드의 형성에 사용하였다. 펩티드를 DCM에 용해시켰다. 그 후, 3.5 당량의 O-(2,4-디메톡시벤질)히드록실아민, 5 당량의 4-메틸모르폴린, 1.3 당량의 5 커플링제 EDC·HCl 및 1.3 당량의 첨가제 HOAt를 첨가하고 혼합물을 N2 분위기 하에 밤새 반응시켰다. 반응의 정도를 HPLC를 사용하여 모니터링하였다. 일단 목적 생성물이 수득되면, 혼합물을 1N HCl, 물 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 그 후, TFA/물/TIS (95:2.5:2.5)의 혼합물을 펩티드 조생성물에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 가볍게 교반하였다. 그 후, TFA를 N2 흐름 하에 증발시켜, 실시예 19를 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
비교 실시예 20:
(2S)-2-[[(2S)-1-아세틸피롤리딘-2-카르보닐]-메틸-아미노]-N-[(1S)-2-(히드록시아미노)-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소-에틸]펜탄디아미드
0.8 당량의 시판되는 Nα-Fmoc-N(in)-Boc-L-트립토판 (Fmoc-L-Trp(Boc)-OH), 및 DIEA (4 당량)를 2 mL의 DMF 중의 수지에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 10 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Nα-Fmoc-Nδ-트리틸-L-글루타민 (Fmoc-L-Gln(Trt)-OH)의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10')으로 처리하여 제거하였다. Gln 모이어티의 아미노 기의 N-메틸화를 위해, 유리 아미노 기를 DMF 중 염기로서 콜리딘 (10 당량)을 사용하여 오르토-니트로 벤젠 술포닐 클로라이드 (4 당량)로 보호하고, 이를 30분 동안 수지와 반응시켰다. 그 다음에, 수지를 DMF 및 DCM으로 세정하고, 상기 보호 단계를 동일한 조건하에 다시 반복하였다. 보호의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 수지를 DMF 중 3 당량의 7-메틸-1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔 및 4 당량의 파라-니트로벤젠술포네이트로 30분 동안 처리 (3회 처리)함으로써 아미노 기의 N-메틸화를 달성하였다. 처리 사이에 수지를 DMF 및 5 DCM으로 완전히 세척하였다. Gln 아미노 기의 N-메틸화 후, 수지를 10 당량의 β-메르캅토에탄올 및 5 당량의 DBU (1 x 10' 및 1 x 40')로 처리함으로써 오르토-니트로 벤젠 술포닐 보호기를 제거하였다. 오르토-니트로 벤젠 술포닐 기의 제거는 클로라닐 테스트를 사용하여 평가하였다. 그 다음에, Fmoc-L-프롤린 (Fmoc-L-Pro-OH)을 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 펩티드의 N-부분 말단 부분의 아세틸화를 위해, 20 당량의 아세트산 무수물 및 20 당량의 DIEA를 수지에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 반응시키고 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 선형 측쇄 보호된 펩티드는 HFIP/DCM (1:4)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 HFIP/DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 재차 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켰다. 조 펩티드를 사전 정제 없이 용액 중 히드록스아미드의 형성에 사용하였다. 펩티드를 DCM에 용해시켰다. 그 후, 3.5 당량의 O-(2,4-디메톡시벤질)히드록실아민, 5 당량의 4-메틸모르폴린, 1.3 당량의 5 커플링제 EDC·HCl 및 1.3 당량의 첨가제 HOAt를 첨가하고 혼합물을 N2 분위기 하에 밤새 반응시켰다. 반응의 정도를 HPLC를 사용하여 모니터링하였다. 일단 목적 생성물이 수득되면, 혼합물을 1N HCl, 물 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 그 후, TFA/물/TIS (95:2.5:2.5)의 혼합물을 펩티드 조생성물에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 가볍게 교반하였다. 그 후, TFA를 N2 흐름 하에 증발시켜, 실시예 20을 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
비교 실시예 21:
(2S)-1-아세틸-N-[(1S)-1-[[(1S)-2-(히드록시아미노)-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소-에틸]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
0.8 당량의 시판되는 Nα-Fmoc-N(in)-Boc-L-트립토판 (Fmoc-L-Trp(Boc)-OH), 및 DIEA (4 당량)를 2 mL의 DMF 중의 수지에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Nα-Fmoc-L-이소류신 (Fmoc-L-Ile-OH)의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10')으로 처리하여 제거하였다. Ile 모이어티의 아미노 기의 N-메틸화를 위해, 유리 아미노 기를 DMF 중 염기로서 콜리딘 (10 당량)을 사용하여 오르토-니트로 벤젠 술포닐 클로라이드 (4 당량)로 보호하고, 이를 30분 동안 수지와 반응시켰다. 그 다음에, 수지를 DMF 및 DCM으로 세정하고, 상기 보호 단계를 동일한 조건하에 다시 반복하였다. 보호의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 수지를 DMF 중 3 당량의 7-메틸-1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔 및 4 당량의 파라-니트로벤젠술포네이트로 30분 동안 처리 (3회 처리)함으로써 아미노 기의 N-메틸화를 달성하였다. 처리 사이에 수지를 DMF 및 5 DCM으로 완전히 세척하였다. Ile 아미노 기의 N-메틸화 후, 수지를 10 당량의 β-메르캅토에탄올 및 5 당량의 DBU (1 x 10' 및 1 x 40')로 처리함으로써 오르토-니트로 벤젠 술포닐 보호기를 제거하였다. 오르토-니트로 벤젠 술포닐 기의 제거는 클로라닐 테스트를 사용하여 평가하였다. 그 다음에, Fmoc-L-프롤린 (Fmoc-L-Pro-OH)을 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 펩티드의 N-부분 말단 부분의 아세틸화를 위해, 20 당량의 아세트산 무수물 및 20 당량의 DIEA를 수지에 첨가하였다. 혼합물을 30분 동안 반응시키고 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 선형 측쇄 보호된 펩티드는 HFIP/DCM (1:4)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 30 HFIP/DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 재차 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켰다. 조 펩티드를 사전 정제 없이 용액 중 히드록스아미드의 형성에 사용하였다. 펩티드를 DCM에 용해시켰다. 그 후, 3.5 당량의 O-(2,4-디메톡시벤질)히드록실아민, 5 당량의 4-메틸모르폴린, 1.3 당량의 5 커플링제 EDC·HCl 및 1.3 당량의 첨가제 HOAt를 첨가하고 혼합물을 N2 분위기 하에 밤새 반응시켰다. 반응의 정도를 HPLC를 사용하여 모니터링하였다. 일단 목적 생성물이 수득되면, 혼합물을 1N HCl, 물 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 그 후, TFA/물/TIS (95:2.5:2.5)의 혼합물을 펩티드 조생성물에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 가볍게 교반하였다. 그 후, TFA를 N2 흐름 하에 증발시켜, 실시예 21을 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
비교 실시예 22:
(2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-2-(히드록시아미노)-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소-에틸]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-1-테트라데카노일-피롤리딘-2-카르복스아미드
0.8 당량의 시판되는 Nα-Fmoc-N(in)-Boc-L-트립토판 (Fmoc-L-Trp(Boc)-OH), 및 DIEA (4 당량)를 2 mL의 DMF 중의 수지에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Fmoc-L-류신 (Fmoc-L-Leu-OH)의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10')으로 처리하여 제거하였다. 그 다음에, Fmoc-L-프롤린 (Fmoc-L-Pro-OH)을 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 펩티드의 N-부분 말단 부분의 캡핑을 위해, 3 당량의 미리스틸산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 수지에 첨가하였다. 혼합물을 60분 동안 반응시키고 반응의 정도를 15 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 선형 측쇄 보호된 펩티드는 HFIP/DCM (1:4)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 30 HFIP/DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 재차 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켰다. 조 펩티드를 사전 정제 없이 용액 중 히드록스아미드의 형성에 사용하였다. 펩티드를 DCM에 용해시켰다. 그 후, 3.5 당량의 O-(2,4-디메톡시벤질)히드록실아민, 5 당량의 4-메틸모르폴린, 1.3 당량의 5 커플링제 EDC·HCl 및 1.3 당량의 첨가제 HOAt를 첨가하고 혼합물을 N2 분위기 하에 밤새 반응시켰다. 반응의 정도를 HPLC를 사용하여 모니터링하였다. 일단 목적 생성물이 수득되면, 혼합물을 1N HCl, 물 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 그 후, TFA/물/TIS (95:2.5:2.5)의 혼합물을 펩티드 조생성물에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 가볍게 교반하였다. 그 후, TFA를 N2 흐름 하에 증발시켜, 실시예 22를 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
비교 실시예 23:
(2S)-2-[[(SS)-1-헥사노일피롤리딘-2-카르보닐)-메틸-아미노]-N-[(1S)-2-(히드록시아미노)-1-(1H-인돌-3-일메틸)-2-옥소-에틸]펜탄디아미드
0.8 당량의 시판되는 Nα-Fmoc-N(in)-Boc-L-트립토판 (Fmoc-L-Trp(Boc)-OH), 및 DIEA (4 당량)를 2 mL의 DMF 중의 수지에 첨가하였다. 혼합물을 1시간 동안 수동으로 간헐적으로 교반하였다. 그 후, 0.5 mL/g의 MeOH를 반응 10 혼합물에 첨가하여 수지의 잔류하는 반응 지점을 캡핑하였다. 15분 후에, 용액을 여과해 내고, 수지를 DCM, DMF 및 MeOH로 완전히 세척하였다. 수지를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리함으로써 Fmoc 제거를 달성하였다. Nα-Fmoc-Nδ-트리틸-L-글루타민 (Fmoc-L-Gln(Trt)-OH)의 커플링을 위해, 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10')으로 처리하여 제거하였다. Gln 모이어티의 아미노 기의 N-메틸화를 위해, 유리 아미노 기를 DMF 중 염기로서 콜리딘 (10 당량)을 사용하여 오르토-니트로 벤젠 술포닐 클로라이드 (4 당량)로 보호하고, 이를 30분 동안 수지와 반응시켰다. 그 다음에, 수지를 DMF 및 DCM으로 세정하고, 상기 보호 단계를 동일한 조건하에 다시 반복하였다. 보호의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 수지를 DMF 중 3 당량의 7-메틸-1,5,7-트리아자비시클로[4.4.0]데크-5-엔 및 4 당량의 파라-니트로벤젠술포네이트로 30분 동안 처리 (3회 처리)함으로써 아미노 기의 N-메틸화를 달성하였다. 처리 사이에 수지를 DMF 및 5 DCM으로 완전히 세척하였다. Gln 아미노 기의 N-메틸화 후, 수지를 10 당량의 β-메르캅토에탄올 및 5 당량의 DBU (1 x 10' 및 1 x 40')로 처리함으로써 오르토-니트로 벤젠 술포닐 보호기를 제거하였다. 오르토-니트로 벤젠 술포닐 기의 제거는 클로라닐 테스트를 사용하여 평가하였다. 그 다음에, Fmoc-L-프롤린 (Fmoc-L-Pro-OH)을 부착시키고, 그 목적을 위해 3 당량의 아미노산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 소량의 DMF에 용해시키고 2분 동안 예비 혼합하였다. 그 후, 혼합물을 수지에 첨가하고 반응물을 90분 동안 반응시켰다. 반응의 정도를 카이저 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 그 다음에 Fmoc 기를 DMF 중 20% 피페리딘 (1 x 5', 1 x 10' 및 1 x 15')으로 처리하고 피페리딘/DBU/톨루엔/DMF (5:5:20:70)의 혼합물 (1 x 5')로 추가 처리함으로써 제거하였다. 펩티드의 N-부분 말단 부분의 캡핑을 위해, 3 당량의 헥산산, 3 당량의 커플링제 TBTU 및 6 당량의 DIEA를 수지에 첨가하였다. 혼합물을 60분 동안 반응시키고 반응의 정도를 클로라닐 테스트를 사용하여 모니터링하였다. 펩티드의 절단을 위해, 수지를 DCM으로 수회 세척하고 흡입에 의해 건조시켰다. 선형 측쇄 보호된 펩티드는 HFIP/DCM (1:4)의 용액을 첨가함으로써 수지로부터 절단하고, 혼합물을 15분 동안 반응시켰다. 그 다음에 반응 혼합물을 여과하고 수지를 30 HFIP/DCM으로 세정하였다. 이 절단 절차를 재차 반복하였다. 모든 여액을 풀링하고 용매를 진공 하에 증발시켰다. 조 펩티드를 사전 정제 없이 용액 중 히드록스아미드의 형성에 사용하였다. 펩티드를 DCM에 용해시켰다. 그 후, 3.5 당량의 O-(2,4-디메톡시벤질)히드록실아민, 5 당량의 4-메틸모르폴린, 1.3 당량의 5 커플링제 EDC·HCl 및 1.3 당량의 첨가제 HOAt를 첨가하고 혼합물을 N2 분위기 하에 밤새 반응시켰다. 반응의 정도를 HPLC를 사용하여 모니터링하였다. 일단 목적 생성물이 수득되면, 혼합물을 1N HCl, 물 및 염수로 세척하였다. 유기 층을 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고 증발시켰다. 그 후, TFA/물/TIS (95:2.5:2.5)의 혼합물을 펩티드 조생성물에 첨가하고 혼합물을 2시간 동안 가볍게 교반하였다. 그 후, TFA를 N2 흐름 하에 증발시켜, 실시예 23을 수득하였다. 화합물을 역상 크로마토그래피를 사용하여 정제하였다.
실험:
신규 화합물이 매트릭스 MMP-2 및 MMP-9에 미치는 억제 효과의 결정
일반적인 고려 사항: 모든 실험을 10X 반응 완충제 용액으로부터 수득된 1X 반응 완충제 중에서 행하였다. 10X 반응 완충제의 함량은 pH 7.6에서 50 mL의 0.5 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 50 mM CaCl2 및 2 mM 소듐 아지드였다. 1X 반응 완충제를 수득하기 위해 4 mL의 10X 반응 완충제를 36 mL의 H2O에 희석하였다.
MMP-2 억제 검정:
중국 햄스터 난소 (CHO) 세포에서 발현된 재조합 MMP-2를 머크-밀리포어(Merck-Millipore) (카탈로그 번호 PF023-5UG)로부터 입수하였다. 접합된 돼지 피부 플루오레세인으로부터의 DQ 젤라틴 (MMP-2 기질)을 라이프 테크놀로지즈(Life Technologies) (카탈로그 번호 E12055)로부터 입수하였다.
활성 검정을 위한 MMP-2의 제조: MMP-2를 스톡 용액 (0.1 mg/mL)으로서 제공하였다. 효소를 1X 반응 완충제로 5 μg/mL의 최종 농도로 희석하였다.
활성 검정을 위한 DQ 젤라틴 (기질) 용액의 제조: 기질의 고체 형태를 물에 용해시켜 1 mg/mL의 스톡 용액을 수득하도록 하였다.
절차: 효소 검정은 96-웰 미량 정량판에서 수행하였으며, 이는 다중 반응의 동시 모니터링을 가능하게 하였다. 각각의 반응을 위해, 86.3 μL의 1X 반응 완충제 (pH 7.6), 1.7 μL의 MMP-2 (최종 농도 85 ng/mL) 및 2 μL의 상응하는 신규한 화합물을 각각의 웰에 첨가하였다. 신규한 화합물의 스톡 용액을 DMSO (100 mM) 중에서 제조하고, DMSO로 이 스톡 용액으로부터 희석액을 제조하였다. 마지막으로, 각각의 웰에 함유된 혼합물에 10 μL의 기질을 첨가하였다 (최종 농도 50 μg/mL). 반응물을 오비탈 진탕기(orbital shaker) (100 rpm)에서 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다.
신규한 화합물의 억제 활성을 형광 측정으로 측정하였다. 여기 및 방출 파장은 각각 483 및 525 nm였다.
MMP-9 억제 검정:
발현된 재조합 MMP-9를 머크-밀리포어 (카탈로그 번호 PF140-5UG, 실시예 1 내지 9 및 비교 실시예에서 사용됨) 및 엔조(Enzo) (카탈로그 번호-SE360-0010, 실시예 10 내지 16에서 사용됨)로부터 입수하였다. 접합된 돼지 피부 플루오레세인으로부터의 DQ 젤라틴 (MMP-9 기질)을 라이프 테크놀로지즈 (카탈로그 번호 E12055)로부터 입수하였다.
활성 검정을 위한 MMP-9의 제조: MMP-9를 스톡 용액 (0.1 mg/mL)으로서 제공하였다. 효소를 1X 반응 완충제로 5 μg/mL의 최종 농도로 희석하였다.
활성 검정을 위한 DQ 젤라틴 (기질) 용액의 제조: 기질의 고체 형태를 물에 용해시켜 1 mg/mL의 스톡 용액을 수득하도록 하였다.
절차: 효소 검정은 96-웰 미량 정량판에서 수행하였으며, 이는 다중 반응의 동시 모니터링을 가능하게 하였다. 각각의 반응을 위해, 84.6 μL의 1X 반응 완충제 (pH 7.6), 3.4 μL의 MMP-9 (최종 농도 85 ng/mL) 및 2 μL의 상응하는 신규한 화합물을 각각의 웰에 첨가하였다. 신규한 화합물의 스톡 용액을 DMSO (100 mM) 중에서 제조하고, DMSO로 이 스톡 용액으로부터 희석액을 제조하였다. 마지막으로, 각각의 웰에 함유된 혼합물에 10 μL의 기질을 첨가하였다 (최종 농도 50 μg/mL). 반응물을 오비탈 진탕기 (100 rpm)에서 실온에서 4시간 동안 인큐베이션하였다.
신규한 화합물의 억제 활성을 형광 측정으로 측정하였다. 여기 및 방출 파장은 각각 483 및 525 nm였다.
몇몇 농도 지점 (100 pM 내지 200 μM MMP의 범위)에서의 억제 활성을 각각의 화합물에 대해 측정하였다. MMP-2 및 MMP-9에 대한 억제 활성을 수학식 1에 따라 계산하였다. 각각의 신규한 화합물에 대해, 상응하는 MMP의 존재하에 (a) 및 부재하에 (b)의 형광을 측정하였다. 최대 형광 (0% 억제 활성)은 억제성 화합물의 부재하에 상응하는 MMP의 샘플로부터 수득하였다. 신규한 화합물의 억제 효능을 평가하기 위해, 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어를 사용하여 S자 곡선으로 조정하면서, 화합물의 로그 농도에 대해 활성을 플롯팅하고, 상응하는 MMP 활성의 50%를 억제하는 데 필요한 화합물의 농도로서 정의되는 IC50 값은 생성된 곡선으로부터 결정하였다.
상기 식에서:
a는 기질 + 시험 화합물 + MMP의 존재하의 형광 강도에 상응하며
b는 기질 + 시험된 화합물의 존재하의 형광 강도에 상응하며
c는 기질 + MMP의 존재하에 형광 강도의 상응하며
d는 기질의 존재하에 형광 강도의 상응한다.
신규한 화합물은 MMP-2 및 MMP-9에 대해 높은 억제 효능을 나타냈다. 결과는 표 1에 요약하였다.
MMP-2 및 MMP-9의 억제
화합물
(실시예 번호) 		MMP-2 IC 50 (nM) MMP-9 IC 50 (nM)
1 202 1260
2 242 301
3 81 395
4 62 235
5 116 601
6 400 733
7 159 713
8 974 263
9 362 506
10 37 223
11 174 71
12 21 136
13 1149 339
14 116 46
15 285 702
16 <1 10
C17 1.1·105 3.5·106
C18 7.1·105 2.4·105
C19 >2·106 >2·106
C20 5.3·104 2.2·104
C21 1.1·105 1.6·104
C22 4.8·103 1.2·103
C23 >2·106 >1·106
관련 MMP-2 및 MMP-9 프로테아제에 대한 억제 활성: MMP-1, MMP-3 및 MMP-7 억제 검정
일반적인 고려 사항: 모든 실험을 10X 반응 완충제 용액으로부터 수득된 1X 반응 완충제 중에서 행하였다. 10X 반응 완충제의 함량은 pH 7.6에서 50 mL의 0.5 M Tris-HCl, 1.5 M NaCl, 50 mM CaCl2 및 2 mM 소듐 아지드였다. 1X 반응 완충제를 수득하기 위해 4 mL의 10X 반응 완충제를 36 mL의 H2O로 희석하였다.
MMP-1 억제 검정:
대장균(E. Coli)에서 발현된 재조합 MMP-1을 엔조 라이프 사이언시즈(Enzo Life Sciences) (카탈로그 번호 BML-SE180)로부터 입수하였다. Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2 (형광원성(fluorogenic) 펩티드 기질)를 알앤디 시스템즈(R&D Systems) (카탈로그 번호 ES001)로부터 입수하였다.
활성 검정을 위한 MMP-1의 제조: MMP-1을 스톡 용액 (0.55 mg/mL)으로서 제공하였다. 효소를 1X 반응 완충제로 276 nM의 최종 농도로 희석하였다.
MMP-1 펩티드 기질을 DMSO (6 mM) 중 스톡 용액으로서 제공하였다. 검정을 위해, 기질을 1X 반응 완충제로 100 μM의 농도로 희석하였다.
절차: 효소 검정은 96-웰 미량 정량판에서 수행하였으며, 이는 다중 반응의 동시 모니터링을 가능하게 하였다. 각각의 반응을 위해, 86 μL의 1X 반응 완충제 (pH 7.6), 2 μL의 MMP-1 (최종 농도 5.52 nM) 및 2 μL의 상응하는 신규한 화합물을 각각의 웰에 첨가하였다. 신규한 화합물의 스톡 용액을 DMSO (100 mM) 중에서 제조하고, DMSO로 이 스톡 용액으로부터 희석액을 제조하였다. 마지막으로, 각각의 웰에 함유된 혼합물에 10 μL의 기질을 첨가하였다 (최종 농도 10 μM). 반응물을 오비탈 진탕기 (100 rpm)에서 실온에서 4시간 동안 인큐베이션하였다.
신규한 화합물의 억제 활성을 형광 측정으로 측정하였다. 여기 및 방출 파장은 각각 320 및 405 nm였다.
MMP-3 억제 검정:
대장균에서 발현된 재조합 MMP-3을 머크-밀리포어 (카탈로그 번호 44217)로부터 입수하였다. Mca-RPKPVE-Nval-WRK(Dnp)-NH2 (형광원성 펩티드 기질)를 알앤디 시스템즈 (카탈로그 번호 ES002)로부터 입수하였다.
활성 검정을 위한 MMP-3의 제조: MMP-3을 스톡 용액 (0.1 mg/mL)으로서 제공하였다. 효소를 물로 0.005 mg/mL의 최종 농도로 희석하였다.
MMP-3 펩티드 기질을 DMSO (4.5 mM) 중 스톡 용액으로서 제공하였다. 검정을 위해, 기질을 1X 반응 완충제로 100 μM의 농도로 희석하였다.
절차: 효소 검정은 96-웰 미량 정량판에서 수행하였으며, 이는 다중 반응의 동시 모니터링을 가능하게 하였다. 각각의 반응을 위해, 84.6 μL의 1X 반응 완충제 (pH 7.6), 3.4 μL의 MMP-3 (최종 농도 7.7 nM) 및 2 μL의 상응하는 신규한 화합물을 각각의 웰에 첨가하였다. 신규한 화합물의 스톡 용액을 DMSO (100 mM) 중에서 제조하고, DMSO로 이 스톡 용액으로부터 희석액을 제조하였다. 마지막으로, 각각의 웰에 함유된 혼합물에 10 μL의 기질을 첨가하였다 (최종 농도 10 μM). 반응물을 오비탈 진탕기 (90 rpm)에서 실온에서 4시간 동안 인큐베이션하였다.
신규한 화합물의 억제 활성을 형광 측정으로 측정하였다. 여기 및 방출 파장은 각각 320 및 405 nm였다.
MMP-7 억제 검정:
대장균에서 발현된 재조합 MMP-7을 머크-밀리포어 (카탈로그 번호 44270)로부터 입수하였다. Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2 (형광원성 펩티드 기질)를 알앤디 시스템즈 (카탈로그 번호 ES001)로부터 입수하였다.
활성 검정을 위한 MMP-7의 제조: MMP-7을 스톡 용액 (2.1 mg/mL)으로서 제공하였다. 효소를 물로 0.005 mg/mL의 최종 농도로 희석하였다.
MMP-7 펩티드 기질을 고체 (1 mg)로서 제공하였다. 214.7 μL의 DMSO를 첨가함으로써 DMSO 중 기질의 4 mM 스톡 용액을 수득하였다. 그 후, 기질의 100 μM 용액을 1X 반응 완충제 중에서 제조하였다.
절차: 효소 검정은 96-웰 미량 정량판에서 수행하였으며, 이는 다중 반응의 동시 모니터링을 가능하게 하였다. 각각의 반응을 위해, 84.6 μL의 1X 반응 완충제 (pH 7.6), 3.4 μL의 MMP-7 (최종 농도 8.3 nM) 및 2 μL의 상응하는 신규한 화합물을 각각의 웰에 첨가하였다. 신규한 화합물의 스톡 용액을 DMSO (100 mM) 중에서 제조하고, DMSO로 이 스톡 용액으로부터 희석액을 제조하였다. 마지막으로, 각각의 웰에 함유된 혼합물에 10 μL의 기질을 첨가하였다 (최종 농도 10 μM). 반응물을 오비탈 진탕기 (90 rpm)에서 실온에서 4시간 동안 인큐베이션하였다.
신규한 화합물의 억제 활성을 형광 측정으로 측정하였다. 여기 및 방출 파장은 각각 320 및 405 nm였다.
몇몇 농도 지점 (1, 10, 100 및 200 μM)에서의 억제 활성을 각각의 화합물에 대해 측정하였다. MMP-1, MMP-3 및 MMP-7에 대한 억제 활성을 수학식 1에 따라 계산하고 IC50값은 MMP-2 및 MMP-9에 대해 상기에 설명한 바와 같이 계산하였다.
IC50 값을 표 2에 나타냈다.
MMP-1, MMP-3 및 MMP-7에 대한 IC50.
화합물
(실시예 번호) 		MMP-1 IC 50 (nM) MMP-3 IC 50 (nM) MMP-7 IC 50 (nM)
1 <1·103 3.01·107 2.3·107
2 4.94·106 1.92·107 3.14·107
3 6.82·106 2.54·107 6.61·106
4 4.73·106 1.33·107 4.42·106
5 6.68·106 2.57·107 3.48·106
6 2.56·107 5.34·107 5.26·107
7 2.47·107 2.25·107 7.71·106
8 3.65·106 3.81·106 4.10·106
9 1.14·107 3.20·106 4.03·107
10 6.61·106 1.60·108 8.08·106
11 9.13·106 2.00·108 2.01·107
12 1.49·107 1.57·108 1.41·107
13 2.00·108 2.00·108 5.04·107
14 6.07·106 <1.00·103 6.10·107
15 1.08·107 9.89·106 4.12·107
16 <1.00·103 <1.00·103 1.00·106
C17 6.10·103 3.1·103 >2·106
C18 - - -
C19 - - -
C20 >2·106 >2·106 >2·106
C21 - - -
C22 - - -
C23 - - -
C24 - - -
표 2의 값 (MMP-1, MMP-3 및 MMP-7에 대한 IC50을 나타냄)와 표 1의 것들 (MMP-2 및 MMP-9에 대한 IC50을 나타냄)을 비교했을 때 쉽게 알 수 있듯이, 본 발명의 화합물은 MMP-2 및 MMP-9에 대해 매우 선택적이다.
화합물의 투과성 특성의 결정
평행 인공 막 투과성 검정 (PAMPA)
문헌 [Kansy et al., J. M. Chem. 1998; 41(7):1007-10]에 기재된 평행 인공 막 투과성 검정 (PAMPA)을 여기서 사용하여 수동 확산에 의해 혈액-뇌 장벽 (BBB)을 관통하는 화합물의 능력을 측정하였다 (Di L et al., Eur. J. Med. Chem. 2003;38(3):223-32). 화합물의 유효 투과성 (Pe)은 200 μM의 초기 농도에서 측정하였다. 완충제 용액은 제조업체의 지침에 따라 시판되는 농축 용액으로부터 제조 하였다. pH를 0.5 M NaOH 용액을 사용하여 7.4로 조정하였다. 신규한 화합물의 스톡 용액을 DMSO 중에서 제조하고 완충제 용액으로 최종 200 μM 농도 (0.5% DMSO 함량)로 희석하였다. PAMPA 샌드위치를 분리하고 각각의 공여자 웰을 200 μM의 화합물 용액으로 채웠다. 수용자 판을 공여자 판에 넣어, 반드시 막의 아래쪽이 완충제와 접촉하도록 하였다. 도데칸 중 인지질 (20 mg/ml)의 혼합물 4 μL를 각각의 웰의 필터에 첨가하고, 200 μL의 완충제 용액을 각각의 수용자 웰에 첨가하였다. 판을 덮고 100 rpm에서 오비탈 교반하에 4시간 동안 포화 습도 분위기에서 실온에서 인큐베이션하였다. 4시간 후, 수용자 및 공여자 구획의 내용물을 HPLC에 의해 분석하였다: 공여자 판으로부터의 150 μL의 각각의 웰 및 수용자 판으로부터의 150 μL의 각각의 웰을 HPLC 바이알에 옮겨, 각각의 샘플을 역상 C18 칼럼 (150 mm x 4.6 mm x 5 μm, 100 Å) (100 μL/수용자 웰로부터의 주입, 10 μL/공여자웰로부터의 주입 및 t0 참조용)에 주입하였다. 질량 분석법 (MALDI-TOF)을 사용하여 수송을 또한 확인하였다.
사용된 인지질 혼합물은 하기 조성을 갖는, 아반티(Avanti) 극성 지질에 의해 제공된, 돼지 극성 뇌 지질 추출물이었다: 12.6% 포스파티딜콜린 (PC), 33.1% 포스파티딜에탄올아민 (PE), 18.5% 포스파티딜세린 (PS), 4.1% 포스파티딜이노시톨 (PI), 0.8% 포스파티드산 및 30.9%의 기타 화합물.
4시간 후 유효 투과성 (Pe)은 수학식 2를 사용하여 계산하였고 수송율 (T%)은 수학식 3을 사용하여 계산하였다:
상기 식에서:
t는 시간 (h)이고
Ca(t)는 시간 t에서 수용자 웰의 화합물 농도이고
Cd(t0)는 t0에서 공여자 웰의 화합물 농도이다.
표 4에 나타낸 지표(indicative) Pe 값을 기준으로 하여, 신규한 화합물은 BBB를 통과하는 양호한 투과성을 나타낸다 (표 5).
지표 Pe 값
지표 Pe 값 (cm/s) CNS 내부로 수송
Pe = 4·10-6 양호
2·10-6 = Pe < 4·10-6 보통
Pe < 2·10-6 저조
신규한 화합물의 유효 투과성 (Pe) 및 수송율
화합물
(실시예 번호) 		Pe (cm/s) SD %T SD
1 9.4·10-8 2.4·10-8 0.4 0.1
2 2.0·10-7 3.5·10-8 0.8 0.1
3 2.3·10-6 2·10-7 9.3 0.6
4 7.4 ·10-7 1.4·10-7 3.1 0.6
5 1.9·10-6 4·10-7 7.6 1.4
6 3.5·10-6 8·10-7 14.3 2.8
7 11.3·10-6 6·10-8 19.0 0.1
8 4.7·10-6 0.4·10-6 9.0 0.7
9 5.2·10-6 3.1·10-6 9.9 0.5
10 7.6·10-6 0.2·10-6 13.6 0.3
15 1.1·10-6 0.1·10-6 2.3 0.5
16 3.7·10-6 0.07·10-6 7.3 0.1

Claims (15)

  1. 화학식 (I)의 화합물 또는 그의 염:

    (I)
    상기 식에서,
    AA1은 부재하거나 N-메틸-페닐알라닌, N-메틸-트립토판, N-메틸-티로신 및 N-메틸-이소류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로부터 유래된 잔기(rest)이고,
    AA2는 부재하거나 N-메틸-페닐알라닌, N-메틸-알라닌, N-메틸-β-알라닌 및 N-메틸-류신으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산으로부터 유래된 잔기이고,
    G는 1 내지 10개의 탄소 원자를 포함하는 선형 또는 분지형 알킬렌 잔기이며, 여기서 상기 잔기에서 하나 이상의 비-인접(non-vicinal) 메틸렌 모이어티 (-CH2-)는 상응하는 산소 원자 (-O-)에 의해 대체될 수 있고,
    R1은 수소 및 페닐로 이루어진 군으로부터 선택되고,
    R2, R3 및 R4는 수소 및 불소로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되고,
    R5 및 R6은 수소 및 불소로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, AA1 및 AA2가 부재하는 화합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, G가 -CH2-, -(CH2)3-, -(CH2)5-, -CH2-CH(CH3)-CH2-, -(CH2)7-, -CH2-CH2-CH2-CH(CH2-CH2-CH3)-, -O-(CH2)3-, -(CH2)13- 및 -CH2-O-(CH2)2-O-CH2-로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  4. 제3항에 있어서, R1-G가 CH3-(CH2)2-, CH3-CH(CH3)-CH2-, 페닐-O-(CH2)3-, CH3-(CH2)6-, CH3-(CH2)4- 및 CH3-CH2-CH2-CH(CH3-CH2-CH3)-로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 화합물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, R2, R3 및 R4 중 하나가 수소인 화합물.
  6. 제5항에 있어서, R2, R3 및 R4 중 하나가 수소이고 나머지 둘이 불소 원자인 화합물.
  7. 제6항에 있어서, R2, R3 및 R4에 의해 치환된 페닐 기가 3,5-디플루오로페닐인 화합물.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, R5 및 R6 둘 다가 수소인 화합물.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 하기 화학식의 화합물:
  10. 제1항에 있어서,
    · (2S)-1-아세틸-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(4-플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
    · (2S)-1-아세틸-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
    · (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-1-헥사노일-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
    · (2S)-1-부타노일-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
    · (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-1-(3-메틸부타노일)피롤리딘-2-카르복스아미드
    · (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-1-옥타노일-피롤리딘-2-카르복스아미드
    · (2S)-N-[(1S,2S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-4,4-디플루오로-1-헥사노일-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
    · (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-1-(2-프로필펜타노일)피롤리딘-2-카르복스아미드
    · (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-1-(4-페녹시부타노일)피롤리딘-2-카르복스아미드
    · (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-4,4-디플루오로-N-메틸-1-(4-페녹시부타노일)피롤리딘-2-카르복스아미드
    · (2S)-1-[(2S)-2-[아세틸(메틸)아미노]-3-페닐-부타노일]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
    · (2S)-1-[(2S)-2-[아세틸(메틸)아미노]프로파노일]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
    · (2S)-1-[3-[아세틸(메틸)아미노]프로파노일]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
    · (2S)-1-[(2S)-2-[[2-[부타노일(메틸)아미노]-3-(1H-인돌-3-일)프로파노일]-메틸-아미노]-4-메틸-펜타노일]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-디플루오로벤조일)아미노]-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-피롤리딘-2-카르복스아미드
    · (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-벤즈아미도-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-N-메틸-1-헥사노일-피롤리딘-2-카르복스아미드
    · (2S,4R)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-벤즈아미도-1-(히드록시카르바모일)프로필]카르바모일]-2-메틸-부틸]-4-플루오로-N-메틸-1-펜타노일-피롤리딘-2-카르복스아미드로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물, 또는 그의 제약상 허용되는 염 또는 용매화물.
  11. 제1항, 제2항 및 제10항 중 어느 한 항에 따른 화합물 및 제약상 허용되는 담체, 아주반트(adjuvnat) 또는 비히클을 포함하는 제약 조성물로서, 간질, 정신분열증, 알츠하이머병, 자폐증, 정신 지체, 양극성 장애, 기분 장애, 혈관 질환, 염증성 질환, 약물 중독, 신경성 동통, 폐 질환, 암 및 패혈증의 예방 및/또는 치료를 위한 제약 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 양극성 장애, 우울증, 허혈성 뇌졸증, 죽상동맥경화증, 다발성 경화증, 류마티스 관절염, 염증성 장 질환, 천식, 만성 폐쇄성 폐 질환, 취약 X 증후군과 연관된 자폐증의 예방 및/또는 치료를 위한 제약 조성물.
  13. 삭제
  14. 삭제
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