ES2766548T3 - Inhibidores de gelatinasa y uso de los mismos - Google Patents

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Abstract

Compuesto de fórmula (I):**Fórmula** en la que AA1 o bien está ausente o bien es un resto derivado de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N-metil-fenilalanina, N-metil-triptófano, N-metil-tirosina y N-metil-isoleucina, AA2 o bien está ausente o bien es un resto derivado de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N-metil-fenilalanina, N-metil-alanina, N-metil-b-alanina y N-metil-leucina, G es un resto alquileno lineal o ramificado que comprende desde 1 hasta 10 átomos de carbono en el que uno o más restos metileno (-CH2-) no vecinales en dicho resto pueden reemplazarse por átomos de oxígeno (-O-) correspondientes, R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y fenilo, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y flúor, R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y flúor, o una sal del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN
Inhibidores de gelatinasa y uso de los mismos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a inhibidores de gelatinasa, a procedimientos para su preparación, a composiciones farmacéuticas que los comprenden, y a su uso en la terapia y/o profilaxis de afecciones en las que la inhibición de las gelatinasas es útil tal como epilepsia, esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer, autismo (en particular asociado al síndrome del cromosoma X frágil), retraso mental, trastornos del estado de ánimo tales como trastornos bipolares, depresión, vasculopatías tales como apoplejía isquémica y aterosclerosis, enfermedades inflamatorias tales como esclerosis múltiple, artritis reumatoide y enfermedad inflamatoria del intestino, toxicomanía, dolor neuropático, enfermedades pulmonares tales como asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica, cáncer y septicemia.
Antecedentes
Existen pruebas acumuladas de que la matriz extracelular (MEC) no sólo actúa como estructura de soporte sino que también tiene efectos considerables sobre la regeneración y el desarrollo neuronal, la plasticidad sináptica, la excitabilidad neuronal, y regulaciones homeostáticas de actividad de red. De hecho, la MEC tiene un profundo impacto sobre el comportamiento de red, por tanto sobre procesos fisiológicos tales como la cognición. Las gelatinasas pertenecen a la familia de matrixinas (MPM), que está formada por endopeptidasas dependientes de cinc que pueden degradar las proteínas de MEC así como un gran número de proteínas distintas de ECM, tales como factores de crecimiento, citocinas, quimiocinas, receptores de la superficie celular, inhibidores de serina proteinasas y otros MPM. Las MPM son proteasas o bien secretadas o bien unidas a la membrana y desempeñan papeles fisiológicos importantes en la reproducción, el crecimiento, desarrollo, la angiogénesis, respuesta inmunitaria, cicatrización de heridas y fisiología del cerebro. Existe una expresión potenciada de MPM, en particular gelatinasas (MPM-2 o gelatinasa A y MPM-9 o gelatinasa B), durante numerosas afecciones patológicas, incluyendo la progresión tumoral, neurodegeneración, apoplejía, inflamación e infecciones víricas.
Los estudios iniciales sobre la MPM-9 en el cerebro originalmente se centraron en su posible papel en una variedad de afecciones patológicas con una componente degenerativa. Más recientemente, la MPM-9 ha surgido como un actor importante en la fisiología cerebral, en especial como una molécula clave en la plasticidad sináptica. Estos hallazgos dieron lugar a estudios que demuestran una posible implicación de la MPM-9 en afecciones neuropsiquiátricas tales como epilepsia, esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer, autismo (en particular asociados al síndrome del cromosoma X frágil), retraso mental, trastornos bipolares, trastornos del estado de ánimo tales como trastornos bipolares, depresión y toxicomanía.
En la esquizofrenia, se han descrito alteraciones en la señalización de glutamato, que da lugar a plasticidad sináptica aberrante. MPM-9 ha demostrado que regula receptores de glutamato, y que modula la plasticidad sináptica fisiológica y morfológica. Por medio de polimorfismo génico funcional, la capacidad de respuesta génica a antipsicóticos y las concentraciones plasmáticas sanguíneas, MPM-9 recientemente se ha implicado en la esquizofrenia. Esta enfermedad implica alteraciones en la percepción y la cognición, culminando en una tríada de síntomas positivos, negativos y cognitivos que se cree que reflejan modificaciones en los sistemas de circuitos neuronales, la perturbación de la conectividad sináptica, y alteraciones en las espinas dendríticas. De forma notable, la región cromosómica 20q11-13, donde el gen MPM-9 está situado, se ha estudiado extensamente en términos de trastornos psiquiátricos y se ha vinculado a la esquizofrenia. MPM-9 influye en la función cortical del hipocampo y la corteza prefrontal y es una molécula candidata interesante que está implicada potencialmente en la esquizofrenia, una afección en la que la alteración de la corteza prefrontal es uno de los principales hallazgos patológicos. Además, algunas de las proteínas candidatas diana que están implicadas en la esquizofrenia tienen conexiones funcionales o bien con MPM-9 o bien con proteínas que interaccionan con MPM-9, tales como receptores de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y de N-metil-D-aspartato (NMDA), entre otros. Se han encontrado niveles de MPM-9 elevados anómalos en el plasma de pacientes esquizofrénicos como se ha informado por varios autores (Yamamori, H. et al. Neurosci Lett., 2013; (556):37-41).
Existen pruebas acumuladas de la implicación de las MPM en la patogenia de la epilepsia. Esta enfermedad es un trastorno cerebral caracterizado por una predisposición duradera para generar crisis epilépticas y por las consecuencias neurobiológicas, cognitivas, psicológicas y sociales de esta afección. Se ha demostrado que las crisis epilépticas prolongadas se relacionan con altos niveles de MPM-9 en suero. De forma más importante, los estudios recientes en tejido cerebral obtenido durante el tratamiento quirúrgico para la epilepsia informaron del aumento de la inmunorreactividad de MPM-9 en lesiones epileptógenas de displasia cortical focal (Konopka, A. et al., Epilepsy Res., 2013, (1-2):45-58) y esclerosis tuberosa (Li, S. et al., Brain Res, 2012, (1453):46-55) así como en las lesiones epileptógenas corticales o hipocámpicas de pacientes con epilepsia en lóbulo temporal sin anomalías citoarquitectónicas subyacentes. Usando un enfoque imparcial de micromatrices de anticuerpos se ha descubierto una elevación de la expresión de MPM-1, -2, -3, -8, -10 y -13, además de MPM-9, en el tejido de pacientes con displasia cortical focal (Konopka, A. et al., Epilepsy Res., 2013, (1-2):45-58). Sin embargo, la expresión de estas proteinasas no era tan pronunciada y/o no tan sistemática entre los pacientes como la expresión de MPM-9. Entre estas otras MPM, especialmente sorprendente fue la regulación por incremento de MPM-2 en pacientes adultos.
Los trastornos del espectro autista (TEA) se identifican por un conjunto de síntomas en tres ámbitos fundamentales: interacción social, lenguaje y gama de intereses, pero en la mayoría de los casos se desconoce su etiología. El síndrome del cromosoma X frágil (SXF) es la primera causa genética de autismo puesto que a un gran porcentaje de individuos con SXF (46%) se les diagnostica conjuntamente TEA. Se ha informado de una alta actividad plasmática de MPM-9 en individuos con SXF (Leigh, M. J. et al., J Dev Behav Pediatr, 2013, (34):1849-1857), mientras que elevadas cantidades de proteínas de MPM-9 se detectaron en el líquido amniótico de madre con TEA (Abdallah, M. W. et al., Autism Res, 2012, (5):428-433). Por lo tanto, existe una clara conexión entre niveles altos de MPM-9 y TEA.
MPM-9 ha estado implicado también en toxicomanía, trastorno bipolar y depresión en seres humanos. Una vinculación se proporciona debido a los análisis de polimorfismo génico de MPM-9 en C(-1562)T que es funcional, ya que da como resultado una expresión de MPM-9 mayor o menor. Se ha informado de que frecuentemente este polimorfismo se diferencia entre sujetos sanos y pacientes que padecen o bien trastornos bipolares o bien esquizofrenia (Han, H. et al., Psychiatry Res, 2011, (190):163-174). Este polimorfismo se ha vinculado además con el alcoholismo (Samochowiec A et al., Brain Res, 2010, 1327:103-6). Además de esto, se ha descubierto que el polimorfismo génico de MPM-9 modula la cognición prefrontal en hombres con trastornos bipolares. Se ha informado de un aumento de los niveles de MPM-9 en pacientes jóvenes durante depresión bipolar (Rybakowski, J. K. et al., J Affect Disord, 2013, (146):286-289). Se han detectado niveles altos de MPM-9 en plasma en depresión, estos niveles séricos se correlacionan con la gravedad de la depresión (Yoshida T. et al., PLoS One, 2012, (7):e42676).
También se reivindica que MPM-9 está vinculado con enfermedades degenerativas tales la enfermedad de Alzheimer (EA). Se ha demostrado que MPM participa en la formación y la eliminación de los péptidos Ap en la EA. De hecho, el aumento de los niveles de MPM-9 se ha observado en el tejido cerebral y la sangre de pacientes con EA, en particular en astrocitos reactivos que rodean placas amiloides, lo que sugiere una respuesta de tejido local a la acumulación de placas. Varios estudios han documentado que esta metaloproteinasa participa en el catabolismo de Ap in vitro e in vivo y es la única enzima que puede degradar las fibrillas de Ap in vitro y las placas de Ap in situ. Además, se ha informado de que la MPM-9 está implicada en la liberación mediada por receptor de sAPP-a y presenta una actividad similar a a-secretasa en el cerebro in vivo (Fragkouli A., et al., J Neurochem, 2012, (121):239-251). Los inhibidores sintéticos de MPM-2/MPM-9 reducen la muerte neuronal mediada por Ap en cultivos primarios (Mizoguchi, H., et al., J Pharmacol Exp Ther, 2009, (331):14-22). En el mismo estudio, el tratamiento con GM60001 fue neuroprotector después de la administración intracerebroventricular de Ap y mejoró la cognición en ratones. Además, los ratones KO para MPM-9 no experimentaron deficiencias en la memoria inducidas por inyecciones de Ap en ratones silvestres.
También se ha identificado que MPM-9 está implicada afecciones de procesos y enfermedades distintas a las relacionadas con la plasticidad sináptica. Estas afecciones incluyen enfermedades vasculares, pulmonares e inflamatorias, y cáncer. A este respecto, la MPM-9, y en menor medida la MPM-2, se han vinculado con vasculopatías tales como apoplejía isquémica y aterosclerosis, dolor neuropático, enfermedades inflamatorias tales como esclerosis múltiple, artritis reumatoide y enfermedad inflamatoria del intestino, esclerosis múltiple, septicemia, cáncer, enfermedades pulmonares tales como asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica
La apoplejía isquémica es una consecuencia de una deficiencia del riego sanguíneo (resultante de una trombosis local o embolia arterial), que produce una disminución de la oxigenación tisular y, en consecuencia, alteraciones bioenergéticas que pueden dar lugar a la muerte celular de carácter tanto necrótico como apoptótico. El restablecimiento de la circulación sanguínea después de la hipoperfusión temporal da como resultado una fuerte respuesta inflamatoria que puede agravar la destrucción del tejido. La acumulación de células inflamatorias es responsable entonces de los niveles altos de especies reactivas de oxígeno y nitrógeno, así como citocinas proinflamatorias en el tejido isquémico. Un aumento drástico de MPM-9 a todos los niveles de su expresión y actividad es una señal distintiva de las consecuencias de la apoplejía. MPM-9 está implicada en dichos acontecimientos posteriores a la apoplejía como la plasticidad a largo plazo, reorganización vascular y angiogénesis, respuesta inmunitaria e inflamatoria. El bloqueo de las MPM, la MPM-9 en particular, incluyendo ratones KO, se ha demostrado que es protector frente a apoplejía isquémica y sus consecuencias (Chaturvedi, M., et al., Mol. Neurobiol., 2014, (49):563-573)
El tratamiento del dolor neuropático, desencadenado por múltiples lesiones en el sistema nervioso, es un reto clínico debido a que el mecanismo subyacente de desarrollo del dolor neuropático sigue siendo poco conocido. Sin embargo, los estudios recientes informan de que el desarrollo del dolor neuropático en fase temprana y tardía en ratas y ratones después de lesión nerviosa requiere diferentes MPM. Después de lesión nerviosa espinal, la MPM-9 muestra una regulación por incremento rápida y transitoria en neuronas sensitivas primarias de ganglios de la raíz dorsal (GRD) con lesión consistente con una fase temprana de dolor neuropático, mientras que la MPM-2 muestra una respuesta retardada en células satélite de GRD y astrocitos espinales consistente con una fase tardía de dolor neuropático. La administración intratecal de inhibidores de MPM-9 o de TIMP-1, un inhibidor tisular endógeno de MPM-9, retrasan el desarrollo de alodinia mecánica (sensibilización de dolor central después de estimulación dolorosa) los primeros días (<10) después de la lesión. Sin embargo, la inhibición de la MPM-9 no tiene ningún efecto sobre la alodinia cuando se administra 10 días después de una lesión cerebral, lo que muestra el papel crítico de la MPM-9 en el desarrollo temprano de dolor neuropático. En comparación con la MPM-9, la regulación por incremento de MPM-2 después de lesión nerviosa espinal muestra un patrón retardado. La administración intratecal de TIMP-2, un inhibidor endógeno de MPM-2, o inhibidores sintéticos pequeños de MPM-2 atenúa parcialmente la alodinia el día 1 después de una lesión pero casi bloquea completamente la alodinia en los siguientes diez días. Esto muestra la implicación de la MPM-2 en la fase tardía del dolor neuropático. (Kawasaki, Y., et al., Nature Medicine, 2008, (3):331-336).
Durante una respuesta inflamatoria, el tráfico de leucocitos a través de barreras de tejido, incluyendo membranas barreras basales, sólo es posible si estas células están equipadas con enzimas que pueden remodelar la MEC. Por lo tanto, las MPM son moléculas efectoras cruciales de células inflamatorias. Las MPM pueden actuar como interruptores o giradores delicados en inflamación aguda y crónica, durante enfermedades autoinmunitarias, cuando se desencadenan en vasculopatías y en la fase regenerativa después de inflamación. Por tanto, la biología de las MPM es importante en las fases de definición, ejecución y resolución de procesos isquémicos e inflamatorios agudos y crónicos, y en consecuencia, los inhibidores de MPM pueden interferir con estos. Los inhibidores de MPM se han sometido a prueba en muchos modelos animales de inflamación aguda y crónica, tales como choque endotóxico, esclerosis múltiple y artritis reumatoide. La bacteriemia y el choque septicémico y endotóxico son las causas más frecuentes de mortalidad en los hospitales modernos. Los constituyentes de la pared celular bacteriana inducen una respuesta sistemática por la activación de los receptores de tipo Toll, lo que da lugar a una producción excesiva de enzimas y citocinas inflamatorias. Los ratones deficientes en MPM-9 tienen una resistencia modificada de la toxicidad inducida por bacterias, mientras que los ratones deficientes en inhibidores de la proteasa son más sensibles al choque endotóxico.
La esclerosis múltiple es una enfermedad multifactorial que está influenciada por predisposición genética, factores ambientales y mecanismos efectores inmunológicos que dañan el sistema nervioso central. MPM-9 es una molécula efectora inmunitaria en la esclerosis múltiple (Opdenakker, G., et al., Lancet Neurol., 2003, (2):747-756). Funciona en la migración celular a través de tejidos conjuntivos y paredes de los vasos y daña la barrera hematoencefálica. También lisa los sustratos de proteína, tales como proteínas de mielina, moléculas de adhesión celular, citocinas y quimiocinas que son relevantes en la esclerosis múltiple y otras enfermedades neurológicas. Se han obtenido pruebas que respaldan un papel perjudicial de la MPM-9 en daño inflamatorio en el SNC en modelos animales. La encefalomielitis autoinmunitaria experimental murina (EAE), un modelo para esclerosis múltiple, ambas gelatinasas MPM-2 y MPM-9, se regulaban por incremento durante el desarrollo del síndrome de enfermedad (Gijbels, K., et al., J. Neurosci. Res., 1993, (36):432-440). Los ratones deficientes en MPM-9 jóvenes tienen resistencia al desarrollo de EAE. Los ratones doblemente inactivados para Mmp2/Mmp9 son completamente resistentes frente al desarrollo de EAE. La inhibición farmacológica de la actividad de MPM mejora el transcurso de EAE en varios estudios que usan inhibidores de MPM (Hewson, A., et al., Inflamm. Res., 1995, (44):345-349). El uso de inhibidores de M p M podría ser útil en la terapia de artritis reumatoide. MPP-9 está implicada en la degradación de colágeno II durante artritis reumatoide, lo que da lugar a la exposición y la liberación de epítopos inmunodominantes. Además, las MPM son importantes para la migración de leucocitos inflamatorios. Esto sugiere que los inhibidores de MPM podrían ser útiles en la terapia de artritis reumatoide, un concepto que se ha confirmado en diferentes modelos animales (Agrawal, S., et al., J. Exp. Med, 2006, (203):1007-1019).
La aterosclerosis y enfermedades relacionadas, incluyendo infarto de miocardio y apoplejía, a menudo se han comparado con enfermedades inflamatorias crónicas. Esto se basa en hallazgos histopatológicos tales como la activación de macrófagos espumosos, la producción local de citocinas y quimiocinas, y la implicación de las MPM. El uso de modelos animales con ratones alterados genéticamente (tanto transgénicos como inactivados) ha reforzado la opinión de que las MPM son actores clave en patologías vasculares (Janssens, S., et al., Cardiovasc. Res., 2006, (69):585-594 y Tayebjee, M. H., et al., Curr. Med. Chem., 2005, (12):917-925). Se ha informado de que los niveles de MPM-9 se aumentan con la progresión de la fibrilación auricular idiopática (Li, M. et al., J. Int. Med. Res., 2014, (1):224-230) y está asociado con el desarrollo de aneurismas aórticos [Newman, K. M., et al., Arteriosclerosis and thrombosis: a journal of vascular biology, 1994, (8):1315-1320)]. La inhibición de la MPM-9 suprime el crecimiento de aneurismas aórticos (Lindeman, J. H., et al., Circulation, 2009, (119):2209-2216). La muerte súbita después de infarto de miocardio se puede producir por rotura cardíaca, un proceso en el que están implicadas las MPM. En estudios en ratones, se demuestra el papel crítico de las gelatinasas en equilibrio con inhibidores tisulares endógenos de metaloproteasas (TIMP). El infarto de miocardio se podía invertir tratando los ratones con un inhibidor oral de la MPM-2 (Matsumura, S., et al., J. Clin. Invest., 2005, (115):559-609).
La MMP-9 desempeña un papel clave en la patogenia de la enfermedad inflamatoria crónica, incluyendo colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn (Abraham, C., et al., N Eng J Med., 2009, (361):2066-2078) y se ha mostrado que su regulación por incremento en tejidos colónicos coincide con brotes activos de enfermedad inflamatoria del intestino en seres humanos (Gao, Q., et al., Dig Liver Dis., 2005, (37):584-592). De acuerdo con los datos de especímenes humanos, se ha observado una activación y expresión elevadas de las proteínas MPM-2 y MPM-9 en tejido colónico inflamado en modelos de ratón de enfermedad inflamatoria del intestino. Además, se ha mostrado que la colitis se atenúa en ratones inactivados para MPM-9, así como ratones doblemente inactivados para MPM-2 y MPM-9. Por lo tanto, la inhibición concomitante de MPM-2 y MPM-9 es terapéuticamente eficaz en la enfermedad inflamatoria del intestino (Grag, P., et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol., 2009, (284):15353-15357).
La mortalidad en el cáncer se debe principalmente al fallo al prevenir la metástasis. Las pruebas emergentes han enfatizado el papel de las MPM en aspectos tempranos de diseminación de cáncer (Kessenbrock, K., et al., Cell, 2010, (141):52-67). Las enzimas que degradan la MEC se han considerado desde hace tiempo como esenciales para la progresión de los tumores. Se prevé que las células tumorales produzcan enzimas que destruyan las barreras de matriz que rodean el tumor, permitiendo la invasión hacia tejidos conjuntivos circundantes, la entrada y salida de vasos sanguíneos, y la metástasis en órganos alejados. Las MPM tienen la capacidad de degradar todos los componentes estructurales de MEC. Además, las MPM se regulan por incremento en prácticamente todos los tumores humanos y animales así como en la mayoría de las líneas celulares tumorales (Coussens, L. M., et al., Science, 2002, (295):2387-2392). MPM-9 está vinculada con la invasión del cáncer. Se observan niveles elevados de MPM-9 en tejido y sangre en pacientes con cáncer, haciendo por tanto de MPM-9 dianas interesantes para la terapia del cáncer, puesto que la capacidad de la MPM-9 para degradar el colágeno y la laminina se correlaciona con su capacidad para regular la migración celular, aumentar la angiogénesis y el crecimiento tumoral (Bjorklund, M., et al., Biochim Biophys Acta, 2005, (1755):37-69).
En afecciones pulmonares patológicas, las MPM y sus inhibidores fisiológicos (TIMP) se sobreexpresan y producen de manera anómala en las vías respiratorias por un panel de diferentes células estructurales. Las alternancias en estas actividades biológicas tienen varios efectos drásticos en la cicatrización de heridas y el tráfico celular. Se cree que la desregulación de varias MPM por células inflamatorias o estructurales estimuladas participa en la fisiopatología de numerosas enfermedades pulmonares incluyendo asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), fibrosis pulmonar y cáncer de pulmón (Demedts, I. K., et al., Curr Opin Pharmacol, 2005, (5):257-63). El proceso de inflamación se caracteriza por la remodelación de la matriz extracelular y el depósito de colágeno que a su vez solicita un aumento de los niveles de MPM-9 (Kelly, E. A., et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med., 2000 (162): 1157—1161). La inhibición selectiva de la MPM-9 se cree que promueve un beneficio terapéutico en estas enfermedades pulmonares inflamatorias crónicas asociadas como se ha comprobado recientemente en el tratamiento de EPOC (Xie, S. S., et al., J Int Med Res. 2014, (42):1272-84).
Según estas evidencias experimentales, hay una necesidad existente de hallar nuevos compuestos que sean potentes inhibidores de MPM-2 y MPM-9 y que sean selectivos con respecto a otras MPM tales como colagenasas (MPM-1), estromelisinas (MPM-3) y matrilisinas (MPM-7).
Breve descripción de la invención
Los inventores han descubierto ahora con éxito que una familia de compuestos de fórmula (I) pueden inhibir selectivamente la MPM-2 y la MPM-9 con una potencia alta y son selectivos en relación con su capacidad para inhibir otras MPM tales como colagenasas (MPM-1), estromelisinas (MPM-3) y matrilisinas (MPM-7). Estas dos propiedades hacen a los compuestos de la presente invención candidatos ideales para su uso en el tratamiento de la epilepsia, esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer, autismo (en particular asociado al síndrome del cromosoma X frágil), retraso mental, trastornos bipolares, trastornos del estado de ánimo tales como trastornos bipolares, depresión, vasculopatías tales como apoplejía isquémica y aterosclerosis, enfermedades inflamatorias tales como esclerosis múltiple, artritis reumatoide y enfermedad inflamatoria del intestino, toxicomanía, dolor neuropático, enfermedades pulmonares tales como asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica, cáncer y septicemia tal como se explicó anteriormente. Se sabe que MPM-2 y MPM-9 están implicadas en dichas enfermedades y también se sabe que la selectividad es una propiedad deseada para reducir el nivel de efectos secundarios producidos cuando se usan inhibidores de gelatinasa no selectivos.
Por lo tanto, un aspecto de la invención se refiere a compuestos que tienen la fórmula (I):
Figure imgf000005_0001
(i)
en la que
AA1 o bien está ausente o bien es un resto derivado de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N-metil-fenilalanina, N-metil-triptófano, N-metil-tirosina y N-metil-isoleucina,
AA2 o bien está ausente o bien es un resto derivado de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N-metil-fenilalanina, N-metil-alanina, N-metil-p-alanina y N-metil-leucina,
G es un resto alquileno lineal o ramificado que comprende desde 1 hasta 10 átomos de carbono en el que uno o más restos metileno (-CH2-) no vecinales en dicho resto pueden reemplazarse por átomos de oxígeno (-O-) correspondientes,
R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y fenilo,
R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y flúor,
R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y flúor,
o una sal de los mismos.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a procedimientos para la preparación de un compuesto de fórmula (I) como se definió anteriormente o una sal, profármaco o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto de fórmula (I) como se definió anteriormente, o una sal, profármaco o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo y un vehículo, coadyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un compuesto de fórmula (I) como se definió anteriormente, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para su uso como medicamento, en particular para la prevención y/o el tratamiento de epilepsia, esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer, autismo (en particular asociado al síndrome del cromosoma X frágil), retraso mental, trastornos bipolares, trastornos del estado de ánimo tales como trastornos bipolares, depresión, vasculopatías tales como apoplejía isquémica y aterosclerosis, enfermedades inflamatorias tales como esclerosis múltiple, artritis reumatoide y enfermedad inflamatoria del intestino, toxicomanía, dolor neuropático, enfermedades pulmonares tales como asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica, cáncer y septicemia.
Otro aspecto de la presente invención se refiere a un método para el tratamiento o la prevención de epilepsia, esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer, autismo (en particular asociado al síndrome del cromosoma X frágil), retraso mental, trastornos bipolares, trastornos del estado de ánimo tales como trastornos bipolares, depresión, vasculopatías tales como apoplejía isquémica y aterosclerosis, enfermedades inflamatorias tales como esclerosis múltiple, artritis reumatoide y enfermedad inflamatoria del intestino, toxicomanía, dolor neuropático, enfermedades pulmonares tales como asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica, cáncer y septicemia, preferiblemente en un mamífero, en el que una cantidad terapéutica de un compuesto de fórmula (I) como se definió anteriormente, o una sal, profármaco o solvato farmacéuticamente aceptable por lo tanto, se administra a un paciente que necesita dicho tratamiento.
Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de un compuesto de fórmula (I) como se definió anteriormente, o una sal, profármaco o solvato farmacéuticamente aceptable del mismo, para la preparación de un medicamento, en particular para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en epilepsia, esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer, autismo (en particular asociado al síndrome del cromosoma X frágil), retraso mental, trastornos bipolares, trastornos del estado de ánimo tales como trastornos bipolares, depresión, vasculopatías tales como apoplejía isquémica y aterosclerosis, enfermedades inflamatorias tales como esclerosis múltiple, artritis reumatoide y enfermedad inflamatoria del intestino, toxicomanía, dolor neuropático, enfermedades pulmonares tales como asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica, cáncer y septicemia.
Descripción detallada de la invención
En el contexto de la presente invención, el término “resto derivado de un aminoácido” de fórmulas N(Me)H-R-COOH se debe entender como el birradical -N(Me)-R-CO-.
En el contexto de la presente invención, el término “alquileno” se usa para designar un resto de hidrocarburos lineales o ramificados de fórmula -CnH2n-.
En el contexto de la presente invención cuando, en un grupo alquileno, se dice que se reemplazan uno o más metilenos (-CH2-) no vecinales por átomos de oxígeno (-O-) correspondientes, quiere decirse que uno o más de dichos metilenos no está(n) presente(s) y su(s) lugar(es) está(n) ocupado(s) por átomo(s) de oxígeno correspondiente(s) formando un enlace éter (-O-), con la condición de que dos grupos metileno vecinales no pueden reemplazarse simultáneamente por átomos de oxígeno, es decir, la cadena resultante no puede contener un grupo peróxido (-O-O-). Como consecuencia, la fórmula empírica de dicho resto alquileno modificado será CmH2mOx. Ejemplos no limitativos de dichos grupos son n-propoxilo, 1-[2-(2-etoxi-etoxi)-etoxi]-propilo y 2-metoxi-etoximetilo. En el contexto de la presente invención, cuando no se indica estereoisomería para un aminoácido o resto de aminoácido, se debe entender que se hace referencia a cualquiera de los posibles estereoisómeros de dicho aminoácido o resto de aminoácido. Por ejemplo, la referencia a isoleucina (Ile) incluye D-isoleucina y L-isoleucina. En el contexto de la presente invención, se han usado algunas abreviaturas y acrónimos y sus significados se proporcionan a continuación:
Alloc: Aliloxicarbonilo
Dab: ácido 2,4-diaminobutírico
DBU: 1,8-Diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno
DCM: Diclorometano
DIEA: N,N-diisopropiletilamina
DMF: Dimetilformamida
DMSO: Dimetilsulfóxido
DIC: N,N'-diisopropilcarbodiimida
EDC: 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
Fmoc: Fluorenilmetiloxicarbonilo
HFIP: Hexafluoro-2-propanol o hexafluoroisopropanol
HOAt: 1-Hidroxi-7-azabenzotriazol
HPLC: Cromatografía de líquidos de alta resolución
HPLC-EM: Cromatografía de líquidos de alta resolución - espectrometría de masas
MeOH: Metanol
Oxyma pure: ciano(hidroxiimino)acetato de etilo
PyBOP: Hexafluorofosfosfato de benzotriazol-1-il-oxitripirrolidinofosfonio
TBTU: Tetrafluoro-borato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
TFA: Ácido trifluoroacético
TIS: Triisopropilsilano
Tris: Tris(hidroximetil)aminometano o 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol
El término “sal” se debe entender como cualquier forma de un compuesto activo usado según la presente invención en la que dicho compuesto está en forma iónica o está cargado y acoplado (asociado) a un contraión (un catión o anión) o está en disolución. Esta definición también incluye sales de amonio cuaternario y complejos de la molécula activa con otras moléculas e iones, en particular, complejos formados por medio de interacciones iónicas. La definición incluye en particular sales fisiológicamente aceptables; este término se debe entender como equivalente a “sales farmacológicamente aceptables” o “sales farmacéuticamente aceptables”.
El término “sales farmacéuticamente aceptables” en el contexto de la presente invención quiere decir cualquier sal que se tolere fisiológicamente (lo que quiere decir normalmente que no sea tóxica, en particular como resultado del contraión) cuando se usa de una manera apropiada para el tratamiento, aplicado o usado, en particular, en seres humanos y/o mamíferos. Estas sales fisiológicamente aceptables se pueden formar con cationes o bases y, en el contexto de la presente invención, se entiende que son sales formadas por al menos un compuesto usado según la invención (normalmente un ácido (desprotonado)) tal como un anión, en particular cuando se usa en seres humanos y/o mamíferos. Estas sales fisiológicamente aceptables también se pueden formar con aniones o ácidos y, en el contexto de la presente invención, se entiende que son sales formadas por al menos un compuesto usado según la invención (normalmente protonado, por ejemplo un nitrógeno protonado) tal como un catión y al menos un anión fisiológicamente tolerado, en particular cuando se usa en seres humanos y/o mamíferos. Esta definición incluye específicamente en el contexto de la presente invención una sal formada por un ácido fisiológicamente tolerado, es decir, sales de un compuesto activo específico con ácidos orgánicos o inorgánicos fisiológicamente tolerados (en particular cuando se usa en seres humanos y/o mamíferos).
Los ácidos farmacéuticamente aceptables incluyen ácidos inorgánicos, tales como ácidos clorhídrico, sulfúrico, fosfórico, difosfórico, bromhídrico, yodhídrico y nítrico, y ácidos orgánicos, tales como ácidos cítrico, maleico, málico, mandélico, ascórbico, oxálico, succínico, tartárico, acético, metanosulfónico, etanosulfónico, bencenosulfónico y ptoluenosulfónico. Las bases farmacéuticamente aceptables incluyen hidróxidos de metales alcalinos (por ejemplo, sodio o potasio) y metales alcalinotérreros (por ejemplo, calcio o magnesio) y bases orgánicas (por ejemplo, alquilaminas, arilalquilaminas y aminas heterocíclicas).
Otras sales preferidas según la invención son compuestos de amonio cuaternario en los que un equivalente de un anión (X-) está asociado con la carga positiva del átomo de N. X- puede ser un anión de diversos ácidos minerales tales como por ejemplo, cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, nitrato, fosfato, o un anión de un ácido orgánico, tal como acetato, maleato, fumarato, citrato, oxalato, succinato, tartrato, malato, mandelato, trifluoracetato, metanosulfonato y p-toluenosulfonato. X- es preferiblemente un anión seleccionado de cloruro, bromuro, yoduro, sulfato, nitrato, acetato, maleato, oxalato, succinato y trifluoracetato. Más preferiblemente, X- es cloruro, bromuro, trifluoracetato o metanosulfonato.
El término “solvato” según la presente invención se debe entender que quiere decir cualquier forma del compuesto activo según la invención en la que dicho compuesto se une por un enlace no covalente a otra molécula (normalmente un disolvente polar), en especial incluyendo hidratos y alcoholatos, como por ejemplo, metanolato. Un solvato preferido es el hidrato.
Cualquier compuesto que sea un profármaco de un compuesto de fórmula (I) también está dentro del alcance de la invención. El término “profármaco” se usa en su sentido más amplio y engloba los derivados que se convierten in vivo en los compuestos de la invención. Los ejemplos de profármacos incluyen, pero no se limitan a, derivados y metabolitos de los compuestos de fórmula (I) que incluyen restos biohidrolizables tales como amidas biohidrolizables, ésteres biohidrolizables, carbamatos biohidrolizables, carbonatos biohidrolizables, ureidos biohidrolizables y análogos de fosfato biohidrolizables. Preferiblemente, los profármacos de los compuestos con grupos funcionales carboxilo son los ésteres de alquilo inferior del ácido carboxílico. Los ésteres de carboxilato se forman convenientemente por esterificación de cualquiera de los restos de ácido carboxílico presentes en la molécula. Normalmente, los profármacos se pueden preparar usando procedimientos bien conocidos, tales como los descritos por Burger “Medicinal Chemistry and Drug Discovery 6a ed. (Donald J. Abraham ed., 2001, Wiley), “Design and Applications of Prodrugs” (H. Bundgaard ed., 1985, Harwood Academic Publishers) y Krogsgaard-Larsen et al. “Textbook of Drug design and Discovery” Taylor & Francis (abril de 2002).
Los compuestos de la presente invención representados por la fórmula (I) descrita anteriormente pueden incluir enantiómeros y/o diastereoisómeros dependiendo de la presencia de centros quirales. Los isómeros, enantiómeros o diastereoisómeros individuales y mezclas de los mismos se encuentran dentro del alcance de la presente invención. Además, cualquier compuesto al que se hace referencia en el presente documento puede existir como tautómeros. Específicamente, el término tautómero se refiere a uno de dos o más isómeros estructurales de un compuesto que existen en equilibrio y se convierten fácilmente de una forma isomérica a otra. Los pares tautoméricos comunes son amina-imina, amida-ácido imídico, ceto-enol, lactama-lactima, etc.
A menos que se establezca de otro modo, los compuestos de la invención también pretenden incluir formas isotópicamente marcadas, es decir, compuestos que difieren sólo en presencia de uno o más átomos isotópicamente enriquecidos. Por ejemplo, los compuestos que tienen las presentes estructuras excepto por el reemplazo de al menos un átomo de hidrógeno por un deuterio o tritio, o el reemplazo de al menos un carbono por un carbono enriquecido en 13C o 14C, o el reemplazo de al menos un nitrógeno por nitrógeno enriquecido en 15N están dentro del alcance de la presente invención.
Los compuestos de fórmula (I) o sus sales o solvatos están preferiblemente en forma farmacéuticamente aceptable o sustancialmente pura. Por forma farmacéuticamente aceptable se quiere decir, entre otros, que tiene un nivel farmacéuticamente aceptable de pureza excluyendo aditivos farmacéuticos normales tales como diluyentes y vehículos, y sin incluir ningún material considerado tóxico en niveles de dosificación normales. Los niveles de pureza para el principio activo están preferiblemente por encima del 50%, más preferiblemente por encima del 70%, lo más preferiblemente por encima del 90%. En una realización preferida, está por encima del 95% del compuesto de fórmula (I), o de sus sales, solvatos o profármacos.
Como se indicó previamente, el término “sales, solvatos, profármacos farmacéuticamente aceptables” se refiere a cualquier sal, solvato o cualquier otro compuesto que, tras su administración al receptor, puede proporcionar (directa o indirectamente) un compuesto como se describe en el presente documento. Sin embargo, se apreciará que las sales, solvatos y profármacos no farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula (I) también se encuentran dentro del alcance de la invención puesto que pueden ser útiles en la preparación de sales, solvatos y profármacos farmacéuticamente aceptables de dichos compuestos. La preparación de sales, solvatos y profármacos se puede llevar a cabo mediante métodos conocidos en la técnica.
En una realización de la presente invención, el grupo AA1 un resto derivado de un aminoácido seleccionado del seleccionado de grupo que consiste en N-metil-triptófano y N-metil-isoleucina.
En una realización de la presente invención, los grupos AA1 y AA2 están ausentes.
En otra realización de la presente invención, G se selecciona de grupo que consiste en -CH2-, -(CH2)3-, -(CH2)5-, -CH2-CH(CHa)-CH2-, -(CH2)7-, -CH2-CH2-CH2-CH(CH2-CH2-CH3)-, -O-(CH2)3-, -(CH2)13- y -CH2-O-(CH2)2-O-CH2-. En otra realización de la presente invención, R1-G se selecciona de grupo que consiste en CH3-, CH3-(CH2)2-, CH3-CH(CH3)-CH2-, CH3-(CH2)6-, CH3-(CH2)4-, CH3-CH2-CH2-CH(CH2-CH2-CH3)-, fenil-O-(CH2)3-, CH3-(CH2)6-O-(CH2)3- y -CH2-O-(CH2)2-O-CH2-.
En otra realización de la presente invención, R1-G se selecciona de grupo que consiste en CH3-(CH2)2-, CH3-CH(CH3)-CH2-, fenil-O-(CH2)3-, CH3-(CH2)a-, CH3-(CH2)4- y CH3-CH2-CH2-CH(CH3-CH2-CH3)-. Los compuestos definidos en la presente realización son particularmente buenos para atravesar la barrera hematoencefálica.
En otra realización de la presente invención, uno de R2, R3 y R4 es hidrógeno.
En otra realización de la presente invención, uno de R2, R3 y R4 es hidrógeno y los otros dos son átomos de flúor. En otra realización de la presente invención, el grupo fenilo sustituido por R2, R3 y R4 es un 3,5-difluorofenilo.
En otra realización de la presente invención, R5 y R6 son ambos hidrógeno.
En una realización de la presente invención, los compuestos de fórmula (I) como se definieron anteriormente en el presente documento tienen la estereroisomería mostrada en la fórmula a continuación:
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En realizaciones preferidas adicionales, se combinan las preferencias descritas anteriormente para los diferentes sustituyentes. La presente invención también se refiere a dichas combinaciones de sustituciones preferidas en las fórmulas anteriores.
Los compuestos individuales particulares de la invención que se encuentran dentro de la fórmula (I) incluyen los compuestos enumerados a continuación:
• (2S)-1-acetil-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(4-fluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-1-acetil-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metilbutil]-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-1-hexanoil-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-1-butanoil-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metilbutil]-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-1-(3-metilbutanoil)pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-1-octanoil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-N-[(1S,2S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-4,4-difluoro-1-hexanoil-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-1-(2-propilpentanoil)pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-1-(4-fenoxibutanoil)pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-4,4-difluoro-N-metil-1-(4-fenoxibutanoil)pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-1-[(2S)-2-[acetil(metil)amino]-3-fenil-propanoil]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-1-[(2S)-2-[acetil(metil)amino]propanoil]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-1-[3-[acetil(metil)amino]propanoil]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-1-[(2S)-2-[[2-[butanoil(metil)amino]-3-(1H-indol-3-il)propanoil]-metil-amino]-4-metil-pentanoil]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-benzamido-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-1-hexanoilpirrolidin-2-carboxamida
• (2S,4R)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-benzamido-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-4-fluoro-N-metil-1-pentanoil-pirrolidin-2-carboxamida
o una sal, isómero, profármaco o solvato farmacéuticamente aceptable de los mismos.
Los compuestos de fórmula (I) definidos anteriormente se pueden obtener mediante procedimientos de síntesis disponibles como se ilustra mediante el siguiente esquema general:
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE RUTAS DE SÍNTESIS DE COMPUESTOS DE FORMULA (I) ALTERNATIVA I:
Se dispone un soporte polimérico adecuada para acoplarlo a ácido Na-Fmoc-Ny-ANoc-L-2,4-diaminobutírico (Fmoc-L-Dab(Alloc)-OH) por medio de su grupo carbonilo y proporcionar después de la escisión un grupo ácido carboxílico C-terminal, tal como la resina de 2-clorotritilo (III), en una jeringa equipada con un disco poroso de polietileno (recipiente de reacción). Se hincha la resina mediante lavados con disolventes orgánicos apropiados tales como diclorometano (DCM) y dimetilformamida (DMF).
Figure imgf000011_0001
( i i i )
Después del hinchamiento del soporte polimérico, se une Fmoc-L-Dab(Alloc)-OH a la resina usando una base de amina tal como N,N-diisopropiletilamina (DIEA) en un disolvente orgánico apropiado tal como DMF. Se agita la mezcla durante 1 hora. Después de esto, sin filtrar la mezcla, se añade metanol anhidro para ocupar los sitios sin reaccionar restantes de la resina. Después de la filtración y el lavado, se retira Fmoc para proporcionar el producto de fórmula (IV), mediante un tratamiento con una disolución de base de amina tal como disolución de piperidina en DMF y/o una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF. Los filtrados y lavados se recogen en un matraz volumétrico para cuantificar mediante mediciones de UV la carga lograda de la resina una vez se ancla el primer aminoácido. La retirada de Fmoc se evalúa usando también la prueba de Kaiser.
Figure imgf000011_0002
Se une un compuesto de fórmula (V):
Figure imgf000011_0003
al compuesto de fórmula (IV) en la que R7 es como se definió anteriormente en el presente documento para proporcionar el producto de fórmula (VI)
Figure imgf000012_0001
usando un agente de activación tal como hexafluorofosfosfato de benzotriazol-1-M-oxitripirrolidinofosfonio (PyBOP), en presencia o en ausencia de un aditivo tal como 1-hidroxi-7-azabenzotriazol (HOAt), y una base de amina tal como DIEA en un disolvente orgánico apropiado tal como DMF. Se agita la mezcla durante el tiempo de reacción total de 1 a 2 horas. Se puede realizar un seguimiento del grado de acoplamiento usando la prueba de Kaiser y se realiza un nuevo acoplamiento en las mismas condiciones si se requiere.
El grupo protector Fmoc del compuesto de fórmula (VI) se retira con una disolución de base de amina tal como una disolución de piperidina en DMF y/o una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF para proporcionar el compuesto de fórmula (VIIa).
Figure imgf000012_0002
Entonces, el compuesto de fórmula (VIIa) se hace reaccionar en primer lugar con un grupo protector amino tal como cloruro de orto-nitrobencenosulfonilo (oNBS) para lograr un compuesto de fórmula (VIII).
Figure imgf000012_0003
El compuesto mencionado anteriormente se metila entonces usando un agente de metilación tal como una mezcla de 7-metiM,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno y para-nitrobencenosulfonato para proporcionar el producto de fórmula (IX).
Figure imgf000013_0001
Posteriormente, el grupo protector orto-nitrobencenosulfonilo (ONBS) se retira mediante tratamiento de la resina con P-mercaptoetanol y DBU para proporcionar el compuesto de fórmula (VII).
Figure imgf000013_0002
Una vez que el compuesto de fórmula (V) se ha acoplado y metilado, se acopla el derivado de Fmoc-L-prolina-OH de fórmula (X)
Figure imgf000013_0003
en la que R5 y R6 son como se definieron anteriormente en el presente documento para proporcionar el producto de fórmula (XI) usando un agente de activación tal como PyBOP, en presencia o en ausencia de un aditivo tal como HOAt, y una base de amina tal como DIEA en un disolvente orgánico apropiado tal como DMF. Se agita la mezcla durante el tiempo de reacción total de 1 a 2 horas. Se puede realizar un seguimiento del grado de acoplamiento usando la prueba de Kaiser y se realiza un nuevo acoplamiento en las mismas condiciones si se requiere. El grupo protector Fmoc del derivado de prolina de fórmula (X) se retira con una disolución de base de amina tal como una disolución de piperidina en DMF y/o una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF para proporcionar un compuesto de fórmula (XI).
Figure imgf000014_0001
Se ancla Fmoc-L-AA2-OH en el que AA2 es como se definió anteriormente en el presente documento sobre el producto de fórmula (XI), para proporcionar el producto de fórmula (XII)
Figure imgf000014_0002
usando un agente de activación tal como PyBOP, en presencia o en ausencia de un aditivo tal como HOAt, y una base de amina tal como DIEA en un disolvente orgánico apropiado tal como DMF. Se agita la mezcla durante el tiempo de reacción total de 1 a 2 horas. Se puede realizar un seguimiento del grado de acoplamiento usando la prueba de cloranilo y se realiza un nuevo acoplamiento en las mismas condiciones si se requiere. El grupo protector Fmoc de AA2 se retira con una disolución de base de amina tal como una disolución de piperidina en DMF y/o una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF para proporcionar un compuesto de fórmula (XIII).
Figure imgf000014_0003
Se une Fmoc-L-AA1-OH en el que AA1 es como se definió anteriormente en el presente documento sobre el producto de fórmula (XII) para proporcionar el producto de fórmula (XIV)
Figure imgf000015_0001
usando un agente de activación tal como PyBOP, en presencia o en ausencia de un aditivo tal como HOAt, y una base de amina tal como DIEA en un disolvente orgánico apropiado tal como DMF. Se agita la mezcla durante el tiempo de reacción total de 1 a 2 horas. Se puede realizar un seguimiento del grado de acoplamiento usando la prueba de Kaiser y se realiza un nuevo acoplamiento en las mismas condiciones si se requiere. El grupo protector Fmoc de AA1 se retira con una disolución de base de amina tal como una disolución de piperidina en DMF y/o una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF para proporcionar un compuesto de fórmula (XV).
Figure imgf000015_0002
El grupo amino del compuesto de fórmula (XV) se ocupa con R1-G-CO- para proporcionar el compuesto de fórmula (XVI). El procedimiento de ocupación de extremos se realiza con una forma activada de un ácido carboxílico R1-G-COOH tal como un anhídrido de fórmula R1-G-CO-O-CO-G-R1 o haluro de carbonilo de fórmula R1-G-CO-X (en la que R1 y G son como se definieron anteriormente en el presente documento y X es preferiblemente Cl, Br o I) en presencia de una base de amina tal como DIEA en presencia o en ausencia de un agente de activación tal como PyBOP, en presencia o en ausencia de un aditivo tal como HOAt. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción la prueba de kasier.
Figure imgf000015_0003
El grupo protector alloc del compuesto de fórmula (XVI) se retira para proporcionar el compuesto de fórmula (XVII) suspendiendo el compuesto de fórmula (XVI) en un disolvente orgánico tal como DCM y añadiendo fenilsilano al mismo, mientras se burbujea N2 a través de la suspensión. Luego, se añade tetrakis(trifenilfosfina)paladio (0), y el burbujeo de N2 se mantiene durante 5 minutos. Después de eso, se sella el recipiente de reacción y se agita con movimiento orbital durante 15 min. Después de este tiempo, se filtra la reacción y se lava exhaustivamente la resina. El mismo tratamiento se repite dos veces más. Después del último tratamiento, se lava exhaustivamente la resina con DCM, metanol (MeOH) y DMF. Se realiza un seguimiento del grado de retirada del grupo protector alloc usando la prueba de kasiser.
Figure imgf000016_0001
Posteriormente, se acopla el producto de fórmula (XVIII)
Figure imgf000016_0002
en la que R2, R3 y R4 son como se definieron anteriormente en el presente documento al grupo amino de la cadena lateral del resto de ácido diaminobutírico del compuesto de fórmula (XVII) usando 3 eq. del compuesto de fórmula (XI), 3 eq. de N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIPCDI) y 3 eq. de HOAt en DMF. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 1 hora. Luego, se separa por filtración la mezcla de reacción y se lava exhaustivamente la resina con DMF, MeOH y DCM. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción de acoplamiento usando la prueba de Kaiser. Se lleva a cabo una etapa de nuevo acoplamiento del compuesto de fórmula (XVIII) cuando la prueba colorimétrica muestra que la reacción de acoplamiento no se logra completamente. Esta etapa proporciona el compuesto de fórmula (XIX)
Figure imgf000016_0003
El compuesto de fórmula (XIX) se escinde de la resina usando hexafluoro-2-propanol (HFIP). Se lava la resina varias veces con DCM y se seca. El compuesto de fórmula (XX) se obtiene mediante la adición de una mezcla de HFIP/DCM (1:4) al compuesto de fórmula (XIX). Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 15 min. Se filtra la mezcla de reacción y se aclara con HFIP/DCM y luego DCM. La etapa de escisión y lavado se repite en las mismas condiciones dos veces más. Después de eso los filtrados obtenidos se agrupan y se evapora el disolvente a vacío para proporcionar el compuesto de fórmula (XX).
Figure imgf000017_0001
El compuesto de fórmula (I) se puede obtener a partir del compuesto de fórmula (XX) mediante diferentes procedimientos, a continuación se muestran los dos procedimientos usados para la síntesis de los ejemplos:
Procedimiento A:
Se hacen reaccionar 3,5 eq. del producto intermedio O-(2,4-dimetoxibencil)hidroxilamina con 1 eq. del compuesto de fórmula (XX) usando 1,3 eq. de clorhidrato de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDCHCl) y 1,3 eq. del aditivo HOAt en presencia de 5 eq. de una base de amina tal como N-metilmorfolina en DCM o un disolvente orgánico equivalente. Se permite que reaccione la mezcla durante 20 horas a temperatura ambiente para proporcionar el compuesto de fórmula (XXI). Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando HPLC y HPLC-EM. Una vez se completa la reacción, se lava la mezcla de reacción con KHSO4, NaHCO3 y salmuera (3 veces cada uno). Se seca la fase orgánica obtenida usando sulfato de magnesio, se filtra y se evapora a vacío.
Figure imgf000017_0002
Finalmente, se obtiene el compuesto de fórmula (I) tratando el compuesto de fórmula (XXI) con una mezcla de ácido trifluoroacético (TFA)/agua/triisopropilsilano (TIS) (95:2,5:2,5) durante 1 hora. Se realiza un seguimiento de si se completa la reacción usando HPLC y HPLC-EM. Se purifica el producto en bruto del compuesto de fórmula (I) usando HPLC en caso necesario.
Procedimiento B:
Se mezcla 1 eq. del compuesto de fórmula (XX) con 1,1 eq. de cloroformiato de isobutilo y 2,5 eq. de una disolución de hidroxilamina recién preparada (*) en presencia de una base de amina tal N-metilmorfolina en tetrahidrofurano seco frío (-20°C). Se agita la reacción durante 2 horas a -20°C, y se deja que la temperatura alcance 0°C en 2 horas y después se deja durante la noche a 5°C. Se realiza un seguimiento del avance de la reacción mediante cromatografía en capa fina (CCF). Una vez que se completa, se evapora a vacío el disolvente de la reacción para proporcionar el compuesto de fórmula (I). Después de esto, el producto en bruto obtenido se disuelve en acetato de etilo y se lava con KHSO4, NaHCO3 y salmuera. Luego, se seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se evapora.
(*) La disolución de hidroxilamina se prepara disolviendo 3 eq. de clorhidrato de hidroxilamina con 1 eq. de KOH en MeOH a 0°C. La mezcla resultante se agita durante 15 minutos a de 0°C. El KCl precipita y se retira por filtración. El filtrado resultante se usa tal cual.
ALTERNATIVA II:
Se dispone un soporte polimérico adecuado para acoplarlo con Fmoc-NH-OH a través de su grupo alcohol y proporcionar después de la escisión un grupo ácido hidroxámico, tal como la resina de 2-clorotritilo (III), en una jeringa equipada con un disco poroso de polietileno (recipiente de reacción). Se hincha la resina mediante con disolventes orgánicos apropiados tales como diclorometano (DCM) y dimetilformamida (DMF).
Figure imgf000018_0001
Después del hinchamiento del soporte polimérico, se une Fmoc-NH-OH a la resina usando una base de amina tal como N,N-diisopropiletilamina (DIEA) en un disolvente orgánico apropiado tal como DCM. Se agita la mezcla de manera intermitente durante 24 h. Después de esto, sin filtrar la mezcla, se añade metanol anhidro para ocupar los sitios sin reaccionar restantes de la resina. Después de la filtración y el lavado, Fmoc se retira para proporcionar el producto de fórmula (XXII) mediante un tratamiento con una disolución de base de amina tal como piperidina en DMF y/o una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF. Los filtrados y lavados se recogen en un matraz volumétrico para cuantificar mediante mediciones de UV la carga lograda de la resina una vez se ancla el grupo de unión al soporte polimérico. La retirada de Fmoc se evalúa usando también la prueba de Kaiser.
Figure imgf000018_0002
Se une ácido Na-Fmoc-Ny-Alloc-2,4-diaminobutírico (Fmoc-Dab(Alloc)-OH) al soporte polimérico de fórmula (XXII) para proporcionar el producto de fórmula (XXIII) usando un agente de acoplamiento tal como N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), en presencia o en ausencia de un aditivo tal como ciano(hidroxiimino)acetato de etilo (Oxyma pure) en un disolvente orgánico apropiado tal como DMF. Se agita la mezcla durante el tiempo de reacción total de 1 hora. Puede realizarse un seguimiento del grado de acoplamiento usando la prueba de Kaiser y se realiza un nuevo acoplamiento en las mismas condiciones si se requiere.
Figure imgf000019_0001
El grupo protector Fmoc del compuesto de fórmula (XXIII) se retira usando una disolución de base de amina tal como piperidina en DMF y/o una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF para proporcionar el compuesto de fórmula (XXIV).
Figure imgf000019_0002
Se une Na-Fmoc-metil-isoleucina (Fmoc-NMeIle-OH) al compuesto de fórmula (XXIV) para proporcionar el producto de fórmula (XXV) usando un agente de activación tal como N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), en presencia o en ausencia de un aditivo tal como ciano(hidroxiimino)acetato de etilo (Oxyma pure) en un disolvente orgánico apropiado tal como DMF. Se agita la mezcla durante el tiempo de reacción total de 1 hora. Puede realizarse un seguimiento del grado de acoplamiento usando la prueba de Kaiser y se realiza un nuevo acoplamiento en las mismas condiciones si se requiere.
Figure imgf000019_0003
El grupo protector Fmoc del compuesto de fórmula (XXV) se retira una disolución de base de amina tal como piperidina en DMF y/o una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF para proporcionar el compuesto de fórmula (XXVI).
Figure imgf000020_0001
Una vez que se ha obtenido el compuesto de fórmula (XXVI), se acopla el derivado de Na-Fmoc-prolina de fórmula (X)
Figure imgf000020_0002
en la que R5 y R6 son como se definieron anteriormente en el presente documento para proporcionar el producto de fórmula (XXVII) usando un agente de acoplamiento tal como N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), en presencia o en ausencia de un aditivo tal como ciano(hidroxiimino)acetato de etilo (Oxyma pure) en un disolvente orgánico apropiado tal como DMF. Se agita la mezcla durante el tiempo de reacción total de 1 hora. Puede realizarse un seguimiento del grado de acoplamiento usando la prueba de Kaiser y se realiza un nuevo acoplamiento en las mismas condiciones si se requiere. El grupo protector Fmoc del compuesto de fórmula (X) se retira una disolución de base de amina tal como a piperidina en DMF y/o una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF para proporcionar el compuesto de fórmula (XXVII).
Figure imgf000020_0003
(XXVII)
Se ancla Fmoc-AA2-OH en el que AA2 es como se definió anteriormente en el presente documento sobre el producto de fórmula (XXVII) para proporcionar el producto de fórmula (XXVIII)
Figure imgf000021_0001
usando un agente de acoplamiento tal como N,N'-diisopropilcarbodNmida (DIC), en presencia o en ausencia de un aditivo tal como ciano(hidroxiimino)acetato de etilo (Oxyma pure) en un disolvente orgánico apropiado tal como DMF. Se agita la mezcla durante el tiempo de reacción total de 1 hora. Puede realizarse un seguimiento del grado de acoplamiento usando la prueba de cloranilo y se realiza un nuevo acoplamiento en las mismas condiciones si se requiere. El grupo protector Fmoc de AA2 se retira con una disolución de base de amina tal como piperidina en DMF y/o una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF para proporcionar un compuesto de fórmula (XXIX).
Figure imgf000021_0002
Se une Fmoc-AA-i-OH en el que AA1 es como se definió anteriormente en el presente documento sobre el producto de fórmula (XXIX) para proporcionar el producto de fórmula (XXX)
Figure imgf000021_0003
usando un agente de acoplamiento tal como N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), en presencia o en ausencia de un aditivo tal como ciano(hidroxiimino)acetato de etilo (Oxyma pure) en un disolvente orgánico apropiado tal como DMF. Se agita la mezcla durante el tiempo de reacción total de 1 hora. Puede realizarse un seguimiento del grado de acoplamiento usando la prueba de Kaiser y se realiza un nuevo acoplamiento en las mismas condiciones si se requiere. El grupo protector Fmoc del compuesto de fórmula (XXX) se retira una disolución de base de amina tal como piperidina en DMF y/o una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF para proporcionar el compuesto de fórmula (XXXI).
Figure imgf000022_0001
Se une el resto R1-G- en el que R1 y G son como se definieron anteriormente en el presente documento al compuesto de fórmula (XXXI) usando un agente de acoplamiento tal como N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), en presencia o en ausencia de un aditivo tal como ciano(hidroxiimino)acetato de etilo (Oxyma pure) en un disolvente orgánico apropiado tal como DMF. Se agita la mezcla durante el tiempo de reacción total de 1 hora. Puede realizarse un seguimiento del grado de acoplamiento usando la prueba de Kaiser y se realiza un nuevo acoplamiento en las mismas condiciones si se requiere para proporcionar el compuesto (XXXII).
Figure imgf000022_0002
(XXXII)
El grupo protector alloc del compuesto de fórmula (XXXII) se retira para proporcionar el compuesto de fórmula (XXXIII) suspendiendo el compuesto de fórmula (XXXII) en un disolvente orgánico tal como DCM y añadiendo fenilsilano al mismo, mientras se burbujea N2 a través de la suspensión. Luego, se añade tetrakis(trifenilfosfina)paladio (0), y se mantiene el burbujeo de N2 durante 5 minutos. Después de eso, se sella el recipiente de reacción y se agita mediante movimiento orbital durante 15 min. Después de este tiempo, se filtra la reacción y se lava exhaustivamente la resina. El mismo tratamiento se repite dos veces más. Después del último tratamiento, se lava exhaustivamente la resina con DCM, MeOH y DMF. Se realiza un seguimiento del grado de retirada del grupo protector alloc usando la prueba de Kaiser.
Figure imgf000022_0003
Posteriormente, se acopla el producto de fórmula (XVIII)
Figure imgf000023_0001
en la que R2, R3 y R4 son como se definieron anteriormente en el presente documento al grupo amino de la cadena lateral del resto de ácido diaminobutírico del compuesto (XXXIII), usando un agente de acoplamiento tal como N,N'-diisopropilcarbodiimida (DIC), en presencia o en ausencia de un aditivo tal como ciano(hidroxiimino)acetato de etilo (Oxyma pure) en un disolvente orgánico apropiado tal como DMF. Se agita la mezcla durante el tiempo de reacción total de 1 hora. Luego, se separa por filtración la mezcla de reacción y se lava exhaustivamente la resina con DMF, MeOH y DCM. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción de acoplamiento usando la prueba de Kaiser. Se lleva a cabo una etapa de nuevo acoplamiento del compuesto de fórmula (XVIII) cuando la prueba colorimétrica muestra que la reacción de acoplamiento no se logra completamente. Esta etapa proporciona el compuesto de fórmula (XXXIV).
Figure imgf000023_0002
(XXXIV)
El compuesto de fórmula (XXXIV) se escinde de la resina mediante la adición de un ácido tal como ácido trifluoroacético (TFA) en DCM (TFA/DCM 5:95). Se agita la mezcla a temperatura ambiente durante 15 min. Después de este tiempo, se separa por filtración la resina y se lava varias veces con TFA/DCM (5:95) y luego con DCM. Después de eso, los filtrados obtenidos se agrupan y se evapora el disolvente a vacío para proporcionar el compuesto de fórmula (I).
Figure imgf000023_0003
Ejemplos
Ejemplo 1:
(2S)-1-acetil-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(4-fluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N- metil-pirrolidin-2-carboxamida
Figure imgf000024_0001
Se añaden 0,8 eq. de Fmoc-L-Dab(Alloc)-OH comercialmente disponible y DIEA (4 eq.) a la resina en 2 ml de DMF. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 1 hora. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de la resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento de Na-Fmoc-L-isoleucina (Fmoc-L-Ile-OH), se disolvieron 3 eq. del aminoácido, 3 eq. de agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclaron durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. El grupo Fmoc se retira luego mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para la N-metilación del grupo amino del resto Ile, el grupo amino libre se protege con cloruro de orto-nitrobencenosulfonilo (4 eq.) usando colidina (10 eq.) como base en DMF, que se permite que reaccione con la resina durante 30 minutos. Luego, se aclara la resina con DMF y DCM, y la etapa de protección se repite de nuevo en las mismas condiciones. Se realiza un seguimiento del grado de protección usando la prueba de Kaiser. La N-metilación del grupo amino se logra tratando la resina con 3 eq. de 7-metil-1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno y 4 eq. de para-nitrobencenosulfonato en DMF durante 30 minutos (3 tratamientos). Entre los tratamientos, se lava exhaustivamente la resina con DMF y DCM. Después de la N-metilación del grupo amino de Ile, el grupo protector orto-nitrobencenosulfonilo se retira tratando la resina con 10 eq. de p-mercaptoetanol y 5 eq. de DBU (1 x 10' y 1 x 40'). La retirada del grupo orto-nitrobencenosulfonilo se evalúa usando la prueba de cloranilo. Luego, se une Fmoc-L-Pro-OH, para ese propósito se disolvieron 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclaron durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. El grupo Fmoc se retira luego mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Para la acetilación de la parte N-terminal del péptido, se añaden 20 eq. de anhídrido acético y 20 eq. de DIEA a la resina. Se permite que reaccione la mezcla durante 30 minutos y se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la retirada del grupo Alloc, se añaden 10 eq. de fenilsilano en DCM a la resina mientras se burbujea N2 a través de la mezcla. Luego, se añaden 0,1 eq. de Pd(PPh3)4 manteniendo el burbujeo de N2 mientras se mezcla todo bien. Luego, se sella el recipiente de reacción y se agita durante 15 minutos. Después de este tiempo, se filtra la reacción y se lava exhaustivamente la resina. El mismo tratamiento se repite dos veces más. Después del último tratamiento, se lava exhaustivamente la resina con DCM, MeOH y DMF. Para el acoplamiento del ácido 4-fluorobenzoico en la cadena lateral del resto Dab, se añaden 3 eq. de dicho ácido, 3 eq. de TBTU y 6 eq. de DIEA en DMF a la resina. Se permite que reaccione la reacción durante 60 minutos. Después de este tiempo, se lava la resina con DMF y DCM y se realiza un seguimiento del grado de la reacción mediante la prueba de Kaiser.
Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido con cadena lateral protegida lineal se escinde de la resina añadiendo una disolución de HFIP/DCM (1:4), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego, se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con HFIP/DCM. Este procedimiento de escisión se repite una segunda vez. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío. El péptido en bruto se usa para la formación de la hidroxamida en disolución sin purificación previa. Se disuelve el péptido en DCM. Después de esto, se añaden 3,5 eq. de O-(2,4-dimetoxibencil)hidroxilamina, 5 eq. de 4-metilmorfolina, 1,3 eq. del agente de acoplamiento EDCHCl y 1,3 eq. del aditivo HOAt y se permite que reaccione la mezcla bajo una atmósfera de N2 durante la noche. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando HPLC. Una vez que se obtiene el producto deseado, se lava la mezcla con HCl 1 N, agua y salmuera. Se seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se evapora. Después de esto, se añade una mezcla de TFA/agua/TIS (95:2,5:2,5) al péptido en bruto y se agita la mezcla suavemente durante 2 horas. Después de esto, se evapora el TFA bajo un flujo de N2, proporcionando el ejemplo 1. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo 2:
(2S)-1-acetil-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(4-fluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
Figure imgf000025_0001
Se añaden 0,8 eq. de Fmoc-L-Dab(Alloc)-OH comercialmente disponible y DIEA (4 eq.) a la resina en 2 ml de DMF. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 1 hora. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de la resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento de Fmoc-L-Ile-OH, 3 eq. del aminoácido, se disolvieron 3 eq. de agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclaron durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. El grupo Fmoc se retira luego mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para la N-metilación del grupo amino del resto Ile, el grupo amino libre se protege con cloruro de ortonitrobencenosulfonilo (4 eq.) usando colidina (10 eq.) como base en DMF, que se permite que reaccione con la resina durante 30 minutos. Luego, se aclara la resina con DMF y DCM, y la etapa de protección se repite de nuevo en las mismas condiciones. Se realiza un seguimiento del grado de protección usando la prueba de Kaiser. La N-metilación del grupo amino se logra tratando la resina con 3 eq. de 7-metil-1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno y 4 eq. de para-nitrobencenosulfonato en DMF durante 30 minutos (3 tratamientos). Entre los tratamientos se lava exhaustivamente la resina con DMF y DCM. Después de la N-metilación del grupo amino de Ile, el grupo protector orto-nitrobencenosulfonilo se retira tratando la resina con 10 eq. de p-mercaptoetanol y 5 eq. de DBU (1 x 10' y 1 x 40'). La retirada del grupo orto-nitrobencenosulfonilo se evalúa usando la prueba de cloranilo. Luego, se une Fmoc-L-Pro-OH, para ese propósito se disolvieron 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclaron durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. El grupo Fmoc se retira luego mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Para la acetilación de la parte N-terminal del péptido, se añaden 20 eq. de anhídrido acético y 20 eq. de DIEA a la resina. Se permite que reaccione la mezcla durante 30 minutos y se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la retirada del grupo Alloc, se añaden 10 eq. de fenilsilano en DCM a la resina mientras se burbujea N2 a través de la mezcla. Luego, se añaden 0,1 eq. de Pd(PPh3)4 manteniendo el burbujeo de N2 mientras se mezcla bien. Luego, se sella el recipiente de reacción y se agita durante 15 minutos. Después de este tiempo, se filtra la reacción y se lava exhaustivamente la resina. El mismo tratamiento se repite dos veces más. Después del último tratamiento, se lava exhaustivamente la resina con DCM, MeOH y DMF. Para el acoplamiento del ácido 3,5-difluorobenzoico en la cadena lateral del resto Dab, se añaden 3 eq. de dicho ácido, 3 eq. de TBTU y 6 eq. de DIEA en DMF a la resina. Se permite que la reacción reaccione durante 60 minutos. Después de este tiempo, se lava la resina con DMF y DCM y se realiza un seguimiento del grado de la reacción mediante la prueba de Kaiser.
Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido con cadena lateral protegida lineal se escinde de la resina añadiendo una disolución de HFIP/DCM (1:4), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego, se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con HFIP/DCM. Este procedimiento de escisión se repite una segunda vez. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío. El péptido en bruto se usa para la formación de la hidroxamida en disolución sin purificación previa. Se disuelve el péptido en DCM. Después de esto, se añaden 3,5 eq. de O-(2,4-dimetoxibencil)hidroxilamina, 5 eq. de 4-metilmorfolina, 1,3 eq. del agente de acoplamiento EDCHCl y 1,3 eq. del aditivo HOAt y se permite que reaccione la mezcla bajo una atmósfera de N2 durante la noche. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando HPLC. Una vez que se obtiene el producto deseado, se lava la mezcla con HCl 1 N, agua y salmuera. Se seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se evapora. Después de esto, se añade una mezcla de TFA/agua/TIS (95:2,5:2,5) al péptido en bruto y se agita la mezcla suavemente durante 2 horas. Después de esto, se evapora el TFA bajo un flujo de N2, proporcionando el ejemplo 2. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo 3:
(2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-1- hexanoil-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
Figure imgf000026_0001
Se añaden 0,8 eq. de Fmoc-L-Dab(Alloc)-OH comercialmente disponible y DIEA (4 eq.) a la resina en 2 ml de DMF. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 1 hora. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento de Fmoc-L-Ile-OH, se disolvieron 3 eq. del aminoácido, 3 eq. de agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclaron durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. El grupo Fmoc se retira luego mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para la N-metilación del grupo amino del resto Ile, el grupo amino libre se protege con cloruro de ortonitrobencenosulfonilo (4 eq.) usando colidina (10 eq.) como base en DMF, que se permite que reaccione con la resina durante 30 minutos. Luego, se aclara la resina con DMF y DCM, y la etapa de protección se repite de nuevo en las mismas condiciones. Se realiza un seguimiento del grado de protección usando la prueba de Kaiser. La N-metilación del grupo amino se logra tratando la resina con 3 eq. de 7-metil-1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno y 4 eq. de para-nitrobencenosulfonato en DMF durante 30 minutos (3 tratamientos). Entre los tratamientos, se lava exhaustivamente la resina con DMF y DCM. Después de la N-metilación del grupo amino de Ile, el grupo protector orto-nitrobencenosulfonilo se retira tratando la resina con 10 eq. de p-mercaptoetanol y 5 eq. de DBU (1 x 10' y 1 x 40'). La retirada del grupo orto-nitrobencenosulfonilo se evalúa usando la prueba de cloranilo. Después de esto, se une el resto Fmoc-L-Pro-OH, para ese propósito se disolvieron 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclaron durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. El grupo Fmoc se retira luego mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Se acopla ácido hexanoico al resto Pro añadiendo a la resina 20 eq. del ácido, 10 eq. del reactivo de acoplamiento DPCDI y 10 eq. del aditivo HOAt. Se agita la reacción de manera intermitente manualmente durante 60 minutos. Luego, se separa por filtración la reacción y se aclara la resina exhaustivamente con DMF, MeOH y DCM. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la retirada del grupo Alloc, se añaden 10 eq. de fenilsilano en DCM a la resina mientras se burbujea N2 a través de la mezcla. Luego, se añaden 0,1 eq. de Pd(PPh3)4 manteniendo el burbujeo de N2 mientras se mezcla bien. Luego, se sella el recipiente de reacción y se agita durante 15 minutos. Después de este tiempo, se filtra la reacción y se lava exhaustivamente la resina. El mismo tratamiento se repite dos veces más. Después del último tratamiento, se lava exhaustivamente la resina con DCM, MeOH y DMF. Para el acoplamiento del ácido 3,5-difluorobenzoico en la cadena lateral del resto Dab, se añaden 3 eq. de dicho ácido, 3 eq. de TBTU y 6 eq. de DIEA en DMF a la resina. Se permite que la reacción reaccione durante 60 minutos. Después de este tiempo, se lava la resina con DMF y DCM y se realiza un seguimiento del grado de la reacción mediante la prueba de Kaiser.
Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido con cadena lateral protegida lineal se escinde de la resina añadiendo una disolución de HFIP/DCM (1:4), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego, se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con HFIP/DCM. Este procedimiento de escisión se repite una segunda vez. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío. El péptido en bruto se usa para la formación de la hidroxamida en disolución sin purificación previa. Se disuelve el péptido en DCM. Después de esto, se añaden 3,5 eq. de O-(2,4-dimetoxibencil)hidroxilamina, 5 eq. de 4-metilmorfolina, 1,3 eq. del agente de acoplamiento EDCHCl y 1,3 eq. del aditivo HOAt y se permite que reaccione la mezcla bajo una atmósfera de N2 durante la noche. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando HPLC. Una vez que se obtiene el producto deseado, se lava la mezcla con HCl 1 N, agua y salmuera. Se seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se evapora. Se añade una mezcla de TFA/agua/TIS (95:2,5:2,5) al péptido en bruto y se agita la mezcla suavemente durante 2 horas. Después de esto, se evapora el TFA bajo un flujo de N2, proporcionando el ejemplo 3. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo 4:
(2S)-1-butanoil-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil- butil]-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
Figure imgf000027_0001
Se añaden 0,8 eq. de Fmoc-L-Dab(Alloc)-OH comercialmente disponible y DIEA (4 eq.) a la resina en 2 ml de DMF. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 1 hora. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento de Fmoc-L-Ile-OH, 3 eq. del aminoácido, se disolvieron 3 eq. de agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclaron durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. El grupo Fmoc se retira luego mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para la N-metilación del grupo amino del resto Ile, el grupo amino libre se protege con cloruro de ortonitrobencenosulfonilo (4 eq.) usando colidina (10 eq.) como base en DMF, que se permite que reaccione con la resina durante 30 minutos. Luego, se aclara la resina con DMF y DCM, y la etapa de protección se repite de nuevo en las mismas condiciones. Se realiza un seguimiento del grado de protección usando la prueba de Kaiser. La N-metilación del grupo amino se logra tratando la resina con 3 eq. de 7-metil-1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno y 4 eq. de para-nitrobencenosulfonato en DMF durante 30 minutos (3 tratamientos). Entre los tratamientos, se lava exhaustivamente la resina con DMF y DCM. Después de la N-metilación del grupo amino de Ile, el grupo protector orto-nitrobencenosulfonilo se retira tratando la resina con 10 eq. de p-mercaptoetanol y 5 eq. de DBU (1 x 10' y 1 x 40'). La retirada del grupo orto-nitrobencenosulfonilo se evalúa usando la prueba de cloranilo. Después de esto, se une el resto Fmoc-L-Pro-OH, para ese propósito se disolvieron 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclaron durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. El grupo Fmoc se retira luego mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Se acopla ácido hexanoico al resto Pro añadiendo a la resina 20 eq. del ácido, 10 eq. del reactivo de acoplamiento DPCDI y 10 eq. del aditivo HOAt. Se agita la reacción de manera intermitente manualmente durante 60 minutos. Luego, se separa por filtración la reacción y se aclara la resina exhaustivamente con DMF, MeOH y DCM. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la retirada del grupo Alloc, se añaden 10 eq. de fenilsilano en DCM a la resina mientras se burbujea N2 a través de la mezcla. Luego, se añaden 0,1 eq. de Pd(PPh3)4 manteniendo el burbujeo de N2 mientras se mezcla bien. Luego, se sella el recipiente de reacción y se agita durante 15 minutos. Después de este tiempo, se filtra la reacción y se lava exhaustivamente la resina. El mismo tratamiento se repite dos veces más. Después del último tratamiento, se lava exhaustivamente la resina con DCM, MeOH y DMF. Para el acoplamiento del ácido 3,5-difluorobenzoico en la cadena lateral del resto Dab, se añaden 3 eq. de dicho ácido, 3 eq. de TBTU y 6 eq. de DIEA en DMF a la resina. Se permite que la reacción reaccione durante 60 minutos. Después de este tiempo, se lava la resina con DMF y DCM y se realiza un seguimiento del grado de la reacción la prueba de Kaiser.
Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido con cadena lateral protegida lineal se escinde de la resina añadiendo una disolución de HFIP/DCM (1:4), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego, se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con HFIP/DCM. Este procedimiento de escisión se repite una segunda vez. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío. El péptido en bruto se usa para la formación de la hidroxamida en disolución sin purificación previa. Se disuelve el péptido en DCM. Después de esto, se añaden 3,5 eq. de O-(2,4-dimetoxibencil)hidroxilamina, 5 eq. de 4-metilmorfolina, 1,3 eq. del agente de acoplamiento EDCHCl y 1,3 eq. del aditivo HOAt y se permite que reaccione la mezcla bajo una atmósfera de N2 durante la noche. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando HPLC. Una vez que se obtiene el producto deseado, se lava la mezcla con HCl 1 N, agua y salmuera. Se seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se evapora. Se añade una mezcla de TFA/agua/TIS (95:2,5:2,5) al péptido en bruto y se agita la mezcla suavemente durante 2 horas. Después de esto, se evapora el TFA bajo un flujo de N2, proporcionando el ejemplo 4. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo 5:
(2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-1-(3-metilbutanoil)pirrolidin-2-carboxamida
Figure imgf000028_0001
Se añaden 0,8 eq. de Fmoc-L-Dab(Alloc)-OH comercialmente disponible y DIEA (4 eq.) a la resina en 2 ml de DMF. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 1 hora. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento de Fmoc-L-Ile-OH, se disolvieron 3 eq. del aminoácido, 3 eq. de agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclaron durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. El grupo Fmoc se retira luego mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para la N-metilación del grupo amino del resto Ile, el grupo amino libre se protege con cloruro de ortonitrobencenosulfonilo (4 eq.) usando colidina (10 eq.) como base en DMF, que se permite que reaccione con la resina durante 30 minutos. Luego, se aclara la resina con DMF y DCM, y la etapa de protección se repite de nuevo en las mismas condiciones. Se realiza un seguimiento del grado de protección usando la prueba de Kaiser. La N-metilación del grupo amino se logra tratando la resina con 3 eq. de 7-metil-1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno y 4 eq. de para-nitrobencenosulfonato en DMF durante 30 minutos (3 tratamientos). Entre los tratamientos se lava exhaustivamente la resina con DMF y DCM. Después de la N-metilación del grupo amino de Ile, el grupo protector orto-nitrobencenosulfonilo se retira tratando la resina con 10 eq. de p-mercaptoetanol y 5 eq. de DBU (1 x 10' y 1 x 40'). La retirada del grupo orto-nitrobencenosulfonilo se evalúa usando la prueba de cloranilo. Después de esto, se une el resto Fmoc-L-Pro-OH, para ese propósito se disolvieron 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclaron durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. El grupo Fmoc se retira luego mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Se acopla ácido 3-metilbutanoico al resto Pro añadiendo a la resina 20 eq. del ácido, 10 eq. del reactivo de acoplamiento DPCDI y 10 eq. del aditivo HOAt. Se agita la reacción de manera intermitente manualmente durante 60 minutos. Luego, se separa por filtración la reacción y se aclara la resina exhaustivamente con DMF, MeOH y DCM. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la retirada del grupo Alloc, se añaden 10 eq. de fenilsilano en DCM a la resina mientras se burbujea N2 a través de la mezcla. Luego, se añaden 0,1 eq. de Pd(PPh3)4 manteniendo el burbujeo de N2 mientras se mezcla bien. Luego, se sella el recipiente de reacción y se agita durante 15 minutos. Después de este tiempo, se filtra la reacción y se lava exhaustivamente la resina. El mismo tratamiento se repite dos veces más. Después del último tratamiento, se lava exhaustivamente la resina con DCM, MeOH y DMF. Para el acoplamiento del ácido 3,5-difluorobenzoico en la cadena lateral del resto Dab, se añaden 3 eq. de dicho ácido, 3 eq. de TBTU y 6 eq. de DIEA en DMF a la resina. Se permite que la reacción reaccione durante 60 minutos. Después de este tiempo, se lava la resina con DMF y DCM y se realiza un seguimiento del grado de la reacción la prueba de Kaiser.
Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido con cadena lateral protegida lineal se escinde de la resina añadiendo una disolución de HFIP/DCM (1:4), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego, se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con HFIP/DCM. Este procedimiento de escisión se repite una segunda vez. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío. El péptido en bruto se usa para la formación de la hidroxamida en disolución sin purificación previa. Se disuelve el péptido en DCM. Después de esto, se añaden 3,5 eq. de O-(2,4-dimetoxibencil)hidroxilamina, 5 eq. de 4-metilmorfolina, 1,3 eq. del agente de acoplamiento EDCHCl y 1,3 eq. del aditivo HOAt y se permite que reaccione la mezcla bajo una atmósfera de N2 durante la noche. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando HPLC. Una vez que se obtiene el producto deseado, se lava la mezcla con HCl 1 N, agua y salmuera. Se seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se evapora. Se añade una mezcla de TFA/agua/TIS (95:2,5:2,5) al péptido en bruto y se agita la mezcla suavemente durante 2 horas. Después de esto, se evapora el TFA bajo un flujo de N2, proporcionando el ejemplo 5. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo 6:
(2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metiM-octanoil-pirroMdm-2-carboxamida
Figure imgf000029_0001
Se añaden 0,8 eq. de Fmoc-L-Dab(Alloc)-OH comercialmente disponible y DIEA (4 eq.) a la resina en 2 ml de DMF. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 1 hora. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento de Fmoc-L-Ile-OH, se disolvieron 3 eq. del aminoácido, 3 eq. de agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclaron durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. El grupo Fmoc se retira luego mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para la N-metilación del grupo amino del resto Ile, el grupo amino libre se protege con cloruro de ortonitrobencenosulfonilo (4 eq.) usando colidina (10 eq.) como base en DMF, que se permite que reaccione con la resina durante 30 minutos. Luego, se aclara la resina con DMF y DCM, y la etapa de protección se repite de nuevo en las mismas condiciones. Se realiza un seguimiento del grado de protección usando la prueba de Kaiser. La N-metilación del grupo amino se logra tratando la resina con 3 eq. de 7-metil-1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno y 4 eq. de para-nitrobencenosulfonato en DMF durante 30 minutos (3 tratamientos). Entre los tratamientos, se lava exhaustivamente la resina con DMF y DCM. Después de la N-metilación del grupo amino de Ile, el grupo protector orto-nitrobencenosulfonilo se retira tratando la resina con 10 eq. de p-mercaptoetanol y 5 eq. de DBU (1 x 10' y 1 x 40'). La retirada del grupo orto-nitrobencenosulfonilo se evalúa usando la prueba de cloranilo. Después de esto, se une el resto Fmoc-L-Pro-OH, para ese propósito se disolvieron 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclaron durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. El grupo Fmoc se retira luego mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Se acopla ácido octanoico al resto Pro añadiendo a la resina 20 eq. del ácido, 10 eq. del reactivo de acoplamiento DPCDI y 10 eq. del aditivo HOAt. Se agita la reacción de manera intermitente manualmente durante 60 minutos. Luego, se separa por filtración la reacción y se aclara la resina exhaustivamente con DMF, MeOH y DCM. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la retirada del grupo Alloc, se añaden 10 eq. de fenilsilano en DCM a la resina mientras se burbujea N2 a través de la mezcla. Luego, se añaden 0,1 eq. de Pd(PPh3)4 manteniendo el burbujeo de N2 mientras se mezcla bien. Luego, se sella el recipiente de reacción y se agita durante 15 minutos. Después de este tiempo, se filtra la reacción y se lava exhaustivamente la resina. El mismo tratamiento se repite dos veces más. Después del último tratamiento, se lava exhaustivamente la resina con DCM, MeOH y DMF. Para el acoplamiento del ácido 3,5-difluorobenzoico en la cadena lateral del resto Dab, se añaden 3 eq. de dicho ácido, 3 eq. de TBTU y 6 eq. de DIEA en DMF a la resina. Se permite que la reacción reaccione durante 60 minutos. Después de este tiempo, se lava la resina con DMF y DCM y se realiza un seguimiento del grado de la reacción la prueba de Kaiser.
Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido con cadena lateral protegida lineal se escinde de la resina añadiendo una disolución de HFIP/DCM (1:4), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego, se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con HFIP/DCM. Este procedimiento de escisión se repite una segunda vez. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío. El péptido en bruto se usa para la formación de la hidroxamida en disolución sin purificación previa. Se disuelve el péptido en DCM. Después de esto, se añaden 3,5 eq. de O-(2,4-dimetoxibencil)hidroxilamina, 5 eq. de 4-metilmorfolina, 1,3 eq. del agente de acoplamiento EDCHCl y 1,3 eq. del aditivo HOAt y se permite que reaccione la mezcla bajo una atmósfera de N2 durante la noche. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando HPLC. Una vez que se obtiene el producto deseado, se lava la mezcla con HCl 1 N, agua y salmuera. Se seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se evapora. Se añade una mezcla de TFA/agua/TIS (95:2,5:2,5) al péptido en bruto y se agita la mezcla suavemente durante 2 horas. Después de esto, se evapora el TFA bajo un flujo de N2, proporcionando el ejemplo 11. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo 7:
(2S)-N-[(1S,2S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-4,4- difluoro-1-hexanoil-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
Figure imgf000030_0001
Se añaden 0,8 eq. de Fmoc-L-Dab(Alloc)-OH comercialmente disponible y DIEA (4 eq.) a la resina en 2 ml de DMF. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 1 hora. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento de Fmoc-L-Ile-OH, se disolvieron 3 eq. del aminoácido, 3 eq. de agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclaron durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. El grupo Fmoc se retira luego mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para la N-metilación del grupo amino del resto Ile, el grupo amino libre se protege con cloruro de ortonitrobencenosulfonilo (4 eq.) usando colidina (10 eq.) como base en DMF, que se permite que reaccione con la resina durante 30 minutos. Luego, se aclara la resina con DMF y DCM, y la etapa de protección se repite de nuevo en las mismas condiciones. Se realiza un seguimiento del grado de protección usando la prueba de Kaiser. La N-metilación del grupo amino se logra tratando la resina con 3 eq. de 7-metil-1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno y 4 eq. de para-nitrobencenosulfonato en DMF durante 30 minutos (3 tratamientos). Entre los tratamientos, se lava exhaustivamente la resina con DMF y DCM. Después de la N-metilación del grupo amino de Ile, el grupo protector orto-nitrobencenosulfonilo se retira tratando la resina con 10 eq. de p-mercaptoetanol y 5 eq. de DBU (1 x 10' y 1 x 40'). La retirada del grupo orto-nitrobencenosulfonilo se evalúa usando la prueba de cloranilo. Después de eso, se une el resto Fmoc-L-(4,4-difluoro)Pro-OH, para ese propósito se disolvieron 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclaron durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. El grupo Fmoc se retira luego mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Se acopla ácido hexanoico al resto Pro añadiendo a la resina 20 eq. del ácido, 10 eq. del reactivo de acoplamiento DPCDI y 10 eq. del aditivo HOAt. Se agita la reacción de manera intermitente manualmente durante 60 minutos. Luego, se separa por filtración la reacción y se aclara la resina exhaustivamente con DMF, MeOH y DCM. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la retirada del grupo Alloc, se añaden 10 eq. de fenilsilano en DCM a la resina mientras se burbujea N2 a través de la mezcla. Luego, se añaden 0,1 eq. de Pd(PPh3)4 manteniendo el burbujeo de N2 mientras se mezcla bien. Luego, se sella el recipiente de reacción y se agita durante 15 minutos. Después de este tiempo, se filtra la reacción y se lava exhaustivamente la resina. El mismo tratamiento se repite dos veces más. Después del último tratamiento, se lava exhaustivamente la resina con DCM, MeOH y DMF. Para el acoplamiento del ácido 3,5-difluorobenzoico en la cadena lateral del resto Dab, se añaden 3 eq. de dicho ácido, 3 eq. de TBTU y 6 eq. de DIEA en DMF a la resina. Se permite que la reacción reaccione durante 60 minutos. Después de este tiempo, se lava la resina con DMF y DCM y se realiza un seguimiento del grado de la reacción la prueba de Kaiser.
Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido con cadena lateral protegida lineal se escinde de la resina añadiendo una disolución de HFIP/DCM (1:4), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego, se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con HFIP/DCM. Este procedimiento de escisión se repite una segunda vez. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío. El péptido en bruto se usa para la formación de la hidroxamida en disolución sin purificación previa. Se disuelve el péptido en DCM. Después de esto, se añaden 3,5 eq. de O-(2,4-dimetoxibencil)hidroxilamina, 5 eq. de 4-metilmorfolina, 1,3 eq. del agente de acoplamiento EDCHCl y 1,3 eq. del aditivo HOAt y se permite que reaccione la mezcla bajo una atmósfera de N2 durante la noche. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando HPLC. Una vez que se obtiene el producto deseado, se lava la mezcla con HCl 1 N, agua y salmuera. Se seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se evapora. Se añade una mezcla de TFA/agua/TIS (95:2,5:2,5) al péptido en bruto y se agita la mezcla suavemente durante 2 horas. Después de esto, se evapora el TFA bajo un flujo de N2, proporcionando el ejemplo 7. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo 8:
(2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N- metil-1-(2-propilpentanoil)pirrolidin-2-carboxamida
Figure imgf000031_0001
Se añaden 1,5 eq. de Fmoc-NH-OH comercialmente disponible y DIEA (10 eq.) a la resina de 2-clorotritilo en 2 ml de DCM. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 24 h. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de la resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento del ácido Na-Fmoc-Ny-alloc-L-2,4-diaminobutírico (Fmoc-L-Dab(alloc)-OH), se disolvieron 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. del aditivo Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclaron durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Después de eso, se une el resto Fmoc-N-metil-L-isoleucina (Fmoc-NMe-L-Ile-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclaron durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Después de eso, se une el resto Fmoc-L-prolina (Fmoc-L-Pro-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Se acopla ácido 2-propil-pentanoico al resto de prolina añadiendo a la resina 3 eq. del ácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure disueltos en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Luego se separa por filtración la reacción y se aclara exhaustivamente la resina con DMF y DCM. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la retirada del grupo Alloc, se añaden 10 eq. de fenilsilano en DCM a la resina mientras se burbujea N2 a través de la mezcla. Luego, se añaden 0,1 eq. de Pd(PPh3)4 manteniendo el burbujeo de N2 mientras se mezcla todo bien. Luego se sella el recipiente de reacción y se agita durante 15 minutos. Después de este tiempo, se filtra la reacción y se lava exhaustivamente la resina. El mismo tratamiento se repite dos veces más. Después del último tratamiento, se lava exhaustivamente la resina con DCM, MeOH y DMF. Para el acoplamiento del ácido 3,5-difluorobenzoico en la cadena lateral del resto diaminoetilo, se disuelven 3 eq. de dicho ácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Después de este tiempo, se lava la resina con DMF y DCM y se realiza un seguimiento del grado de la reacción la prueba de Kaiser.
Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido se escinde de la resina añadiendo una disolución de DCM/TFA (95:5), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con DCM. Este procedimiento de escisión se repite dos veces. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío, proporcionando el ejemplo 8. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo 9:
(2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-1-(4-fenoxibutanoil)pirrolidin-2-carboxamida
Figure imgf000032_0001
Se añaden 1,5 eq. de Fmoc-NH-OH comercialmente disponible y DIEA (10 eq.) a la resina de 2-clorotritilo en 2 ml de DCM. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 24 h. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de la resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento del ácido Na-Fmoc-Ny-alloc-L-2,4-diaminobutírico (Fmoc-L-Dab(alloc)-OH), se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Después de eso, se une el resto Fmoc-N-metil-L-isoleucina (Fmoc-L-NMeIle-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Después de eso, se une el resto Fmoc-L-prolina (Fmoc-L-Pro-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Se acopla ácido 4-fenoxibutírico al resto de prolina añadiendo a la resina 3 eq. del ácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure disueltos en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Luego se separa por filtración la reacción y se aclara exhaustivamente la resina con DMF y DCM. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la retirada del grupo Alloc, se añaden 10 eq. de fenilsilano en DCM a la resina mientras se burbujea N2 a través de la mezcla. Luego, se añaden 0,1 eq. de Pd(PPh3)4 manteniendo el burbujeo de N2 mientras se mezcla todo bien. Luego se sella el recipiente de reacción y se agita durante 15 minutos. Después de este tiempo, se filtra la reacción y se lava exhaustivamente la resina. El mismo tratamiento se repite dos veces más. Después del último tratamiento, se lava exhaustivamente la resina con DCM, MeOH y DMF. Para el acoplamiento del ácido 3,5-difluorobenzoico en la cadena lateral del resto diaminoetilo, se disuelven 3 eq. de dicho ácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Después de este tiempo, se lava la resina con DMF y DCM y se realiza un seguimiento del grado de la reacción la prueba de Kaiser.
Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido se escinde de la resina añadiendo una disolución de DCM/TFA (95:5), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con DCM. Este procedimiento de escisión se repite dos veces. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío, proporcionando el ejemplo 9. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo 10:
(2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-4,4-difluoro-N-metil-1-(4-fenoxibutanoil)pirrolidin-2-carboxamida
Figure imgf000033_0001
Se añaden 1,5 eq. de Fmoc-NH-OH comercialmente disponible y DIEA (10 eq.) a la resina de 2-clorotritilo en 2 ml de DCM. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 24 h. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de la resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento del ácido Na-Fmoc-Ny-alloc-L-2,4-diaminobutírico (Fmoc-L-Dab(alloc)-OH), se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Después de eso, se une el resto Fmoc-N-metil-L-isoleucina (Fmoc-NMe-L-Ile-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Después de eso, se une el resto Fmoc-4,4-difluoro-L-prolina, para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Se acopla ácido 4-fenoxibutírico al resto de prolina añadiendo a la resina 3 eq. del ácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure disueltos en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Luego se separa por filtración la reacción y se aclara exhaustivamente la resina con DMF y DCM. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la retirada del grupo Alloc, se añaden 10 eq. de fenilsilano en DCM a la resina mientras se burbujea N2 a través de la mezcla. Luego, se añaden 0,1 eq. de Pd(PPh3)4 manteniendo el burbujeo de N2 mientras se mezcla todo bien. Luego se sella el recipiente de reacción y se agita durante 15 minutos. Después de este tiempo, se filtra la reacción y se lava exhaustivamente la resina. El mismo tratamiento se repite dos veces más. Después del último tratamiento, se lava exhaustivamente la resina con DCM, MeOH y DMF. Para el acoplamiento del ácido 3,5-difluorobenzoico en la cadena lateral del resto diaminoetilo, se disuelven 3 eq. de dicho ácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Después de este tiempo, se lava la resina con DMF y DCM y se realiza un seguimiento del grado de la reacción la prueba de Kaiser.
Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido se escinde de la resina añadiendo una disolución de DCM/TFA (95:5), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con DCM. Este procedimiento de escisión se repite dos veces. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío, proporcionando el ejemplo 10. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo 11:
(2S)-1-[(2S)-2-[acetil(metil)amino]-3-fenil-propanoil]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
Figure imgf000034_0001
Se añaden 1,5 eq. de Fmoc-NH-OH comercialmente disponible y DIEA (10 eq.) a la resina de 2-clorotritilo en 2 ml de DCM. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 24 h. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de la resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento del ácido Na-Fmoc-Ny-alloc-L-2,4-diaminobutírico (Fmoc-L-Dab(alloc)-OH), se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Después de eso, se une el resto Fmoc-N-metil-L-isoleucina (Fmoc-NMe-L-Ile-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Después de eso, se une el resto Fmoc-L-prolina (Fmoc-L-Pro-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Después de eso, se une el resto Fmoc-N-metil-L-fenilalanina (Fmoc-NMe-L-Phe-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para la acetilación de la parte N-terminal del péptido, se añaden 20 eq. de anhídrido acético y 20 eq. de DIEA a la resina. Se permite que reaccione la mezcla durante 30 minutos y se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la retirada del grupo Alloc, se añaden 10 eq. de fenilsilano en DCM a la resina mientras se burbujea N2 a través de la mezcla. Luego, se añaden 0,1 eq. de Pd(PPh3)4 manteniendo el burbujeo de N2 mientras se mezcla todo bien. Luego se sella el recipiente de reacción y se agita durante 15 minutos. Después de este tiempo, se filtra la reacción y se lava exhaustivamente la resina. El mismo tratamiento se repite dos veces más. Después del último tratamiento, se lava exhaustivamente la resina con DCM, MeOH y DMF. Para el acoplamiento del ácido 3,5-difluorobenzoico en la cadena lateral del resto diaminoetilo, se disuelven 3 eq. de dicho ácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Después de este tiempo, se lava la resina con DMF y DCM y se realiza un seguimiento del grado de la reacción la prueba de Kaiser.
Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido se escinde de la resina añadiendo una disolución de DCM/TFA (95:5), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con DCM. Este procedimiento de escisión se repite dos veces. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío, proporcionando el ejemplo 11. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo 12:
(2S)-1-[(2S)-2-[acetN(metN)ammo]propanoM]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoN)ammo]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
Figure imgf000035_0001
Se añaden 1,5 eq. de Fmoc-NH-OH comercialmente disponible y DIEA (10 eq.) a la resina de 2-clorotritilo en 2 ml de DCM. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 24 h. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de la resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento del ácido Na-Fmoc-Ny-alloc-L-2,4-diaminobutírico (Fmoc-L-Dab(alloc)-OH), se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Después de eso, se une el resto Fmoc-N-metil-L-isoleucina (Fmoc-NMe-L-Ile-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Después de eso, se une el resto Fmoc-L-prolina (Fmoc-L-Pro-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Después de eso, se une el resto Fmoc-N-L-alanina (Fmoc-L-Ala-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). La N-metilación del grupo amino se logra tratando la resina con 3 eq. de 7-metil-1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno y 4 eq. de para-nitrobencensulfonato en DMF durante 30 minutos (3 tratamientos). Entre tratamientos, se lava exhaustivamente la resina con DMF y DCM. Después de la N-metilación del grupo amino de Ala, el grupo protector orto-nitrobencenosulfonilo se retira tratando la resina con 10 eq. de p-mercaptoetanol y 5 eq. de DBU (1 x 10' y 1 x 40'). La retirada del grupo orto-nitrobencenosulfonilo se evalúa usando la prueba de cloranilo. Para la acetilación de la parte N-terminal del péptido, se añaden 20 eq. de anhídrido acético y 20 eq. de DIEA a la resina. Se permite que reaccione la mezcla durante 30 minutos y se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la retirada del grupo Alloc, se añaden 10 eq. de fenilsilano en DCM a la resina mientras se burbujea N2 a través de la mezcla. Luego, se añaden 0,1 eq. de Pd(PPh3)4 manteniendo el burbujeo de N2 mientras se mezcla todo bien. Luego se sella el recipiente de reacción y se agita durante 15 minutos. Después de este tiempo, se filtra la reacción y se lava exhaustivamente la resina. El mismo tratamiento se repite dos veces más. Después del último tratamiento, se lava exhaustivamente la resina con DCM, MeOH y DMF. Para el acoplamiento del ácido 3,5-difluorobenzoico en la cadena lateral del resto diaminoetilo, se disolvieron 3 eq. de dicho ácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclaron durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Después de este tiempo, se lava la resina con DMF y DCM y se realiza un seguimiento del grado de la reacción la prueba de Kaiser.
Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido se escinde de la resina añadiendo una disolución de DCM/TFA (95:5), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con DCM. Este procedimiento de escisión se repite dos veces. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío, proporcionando el ejemplo 12. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo 13:
(2S)-1-[3-[acetN(metN)ammo]propanoM]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoM)ammo]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
Figure imgf000036_0001
Se añaden 1,5 eq. de Fmoc-NH-OH comercialmente disponible y DIEA (10 eq.) a la resina de 2-clorotritilo en 2 ml de DCM. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 24 h. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de la resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento del ácido Na-Fmoc-Ny-alloc-L-2,4-diaminobutírico (Fmoc-L-Dab(alloc)-OH), se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Después de eso, se une el resto Fmoc-N-metil-L-isoleucina (Fmoc-NMe-L-Ile-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Después de eso, se une el resto Fmoc-L-prolina (Fmoc-L-Pro-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Después de eso, se une el resto Fmoc-p-alanina (Fmoc-p-Ala-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). La N-metilación del grupo amino se logra tratando la resina con 3 eq. de 7-metil-1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno y 4 eq. de para-nitrobencensulfonato en DMF durante 30 minutos (3 tratamientos). Entre tratamientos se lava exhaustivamente la resina con DMF y DCM. Después de la N-metilación del grupo amino de p-Ala, el grupo protector orto-nitrobencenosulfonilo se retira tratando la resina con 10 eq. de p-mercaptoetanol y 5 eq. de DBU (1 x 10' y 1 x 40'). La retirada del grupo orto-nitrobencenosulfonilo se evalúa usando la prueba de cloranilo. Para la acetilación de la parte N-terminal del péptido, se añaden 20 eq. de anhídrido acético y 20 eq. de DIEA a la resina. Se permite que reaccione la mezcla durante 30 minutos y se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la retirada del grupo Alloc, se añaden 10 eq. de fenilsilano en DCM a la resina mientras se burbujea N2 a través de la mezcla. Luego, se añaden 0,1 eq. de Pd(PPh3)4 manteniendo el burbujeo de N2 mientras se mezcla todo bien. Luego se sella el recipiente de reacción y se agita durante 15 minutos. Después de este tiempo, se filtra la reacción y se lava exhaustivamente la resina. El mismo tratamiento se repite dos veces más. Después del último tratamiento, se lava exhaustivamente la resina con DCM, MeOH y DMF. Para el acoplamiento del ácido 3,5-difluorobenzoico en la cadena lateral del resto diaminoetilo, se disuelven 3 eq. de dicho ácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Después de este tiempo, se lava la resina con DMF y DCM y se realiza un seguimiento del grado de la reacción la prueba de Kaiser.
Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido se escinde de la resina añadiendo una disolución de DCM/TFA (95:5), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con DCM. Este procedimiento de escisión se repite dos veces. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío, proporcionando el ejemplo 13. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo 14:
(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[butanoil(metil)amino]-3-(1H-indol-3-il)propanoil]-metil-amino]-4-metil-pentanoil]-N-[(lS)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoN)ammo]-1-(hidroxicarbamoN)propN]carbamoN]-2-metN-butM]-N-metM-pirrolidin-2-carboxamida
Figure imgf000037_0001
Se añaden 1,5 eq. de Fmoc-NH-OH comercialmente disponible y DIEA (10 eq.) a la resina de 2-clorotritilo en 2 ml de DCM. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 24 h. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de la resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento del ácido Na-Fmoc-Ny-alloc-L-2,4-diaminobutírico (Fmoc-L-Dab(alloc)-OH), se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Después de eso, se une el resto Fmoc-N-metil-L-isoleucina (Fmoc-NMe-L-Ile-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Después de eso, se une el resto Fmoc-L-prolina (Fmoc-L-Pro-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Después de eso, se une el resto Fmoc-N-metil-L-leucina (Fmoc-NMeLeu-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Después de eso, se une el resto Na-Fmoc-N(en)-Boc-N-metil-L-triptófano (Fmoc-NMe-L-Trp(Boc)-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Se acopla ácido butírico al resto triptófano añadiendo a la resina 3 eq. del ácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure disueltos en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Luego se separa por filtración la reacción y se aclara exhaustivamente la resina con DMF y DCM. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la retirada del grupo Alloc, se añaden 10 eq. de fenilsilano en DCM a la resina mientras se burbujea N2 a través de la mezcla. Luego, se añaden 0,1 eq. de Pd(PPh3)4 manteniendo el burbujeo de N2 mientras se mezcla todo bien. Luego se sella el recipiente de reacción y se agita durante 15 minutos. Después de este tiempo, se filtra la reacción y se lava exhaustivamente la resina. El mismo tratamiento se repite dos veces más. Después del último tratamiento, se lava exhaustivamente la resina con DCM, MeOH y DMF. Para el acoplamiento del ácido 3,5-difluorobenzoico en la cadena lateral del resto diaminoetilo, se disolvieron 3 eq. de dicho ácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclaron durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Después de este tiempo, se lava la resina con DMF y DCM y se realiza un seguimiento del grado de la reacción la prueba de Kaiser.
Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido se escinde de la resina añadiendo una disolución de DCM/TFA (95:5), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con DCM. Este procedimiento de escisión se repite dos veces. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío, proporcionando el ejemplo 14. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo 15:
(2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-benzamido-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-1-hexanoilpirrolidin-2-carboxamida
Figure imgf000038_0001
Se añaden 1,5 eq. de Fmoc-NH-OH comercialmente disponible y DIEA (10 eq.) a la resina de 2-clorotritilo en 2 ml de DCM. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 24 h. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de la resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento del ácido Na-Fmoc-Ny-alloc-L-2,4-diaminobutírico (Fmoc-L-Dab(alloc)-OH), se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Después de eso, se une el resto Fmoc-N-metil-L-isoleucina (Fmoc-NMe-L-Ile-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Después de eso, se une el resto Fmoc-L-prolina (Fmoc-L-Pro-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Se acopla ácido hexanoico al resto de prolina añadiendo a la resina 3 eq. del ácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure disueltos en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Luego se separa por filtración la reacción y se aclara exhaustivamente la resina con DMF y DCM. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la retirada del grupo Alloc, se añaden 10 eq. de fenilsilano en DCM a la resina mientras se burbujea N2 a través de la mezcla. Luego, se añaden 0,1 eq. de Pd(PPh3)4 manteniendo el burbujeo de N2 mientras se mezcla todo bien. Luego se sella el recipiente de reacción y se agita durante 15 minutos. Después de este tiempo, se filtra la reacción y se lava exhaustivamente la resina. El mismo tratamiento se repite dos veces más. Después del último tratamiento, se lava exhaustivamente la resina con DCM, MeOH y DMF. Para el acoplamiento del ácido benzoico en la cadena lateral del resto diaminoetilo, se disuelven 3 eq. de dicho ácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Después de este tiempo, se lava la resina con DMF y DCM y se realiza un seguimiento del grado de la reacción la prueba de Kaiser.
Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido se escinde de la resina añadiendo una disolución de DCM/TFA (95:5), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con DCM. Este procedimiento de escisión se repite dos veces.
Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío, proporcionando el ejemplo 15. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo 16:
(2S,4R)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-benzamido-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-4-fluoro-N-metil-1-hexanoil-pirrolidin-2-carboxamida
Figure imgf000039_0001
Se añaden 1,5 eq. de Fmoc-NH-OH comercialmente disponible y DIEA (10 eq.) a la resina de 2-clorotritilo en 2 ml de DCM. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 24 h. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de la resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de
Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento del ácido Na-Fmoc-Ny-alloc-L-2,4-diaminobutírico (Fmoc-L-Dab(alloc)-OH), se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Después de eso, se une el resto Fmoc-N-metil-L-isoleucina (Fmoc-NMe-L-Ile-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza u seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Después de eso, se une el resto Fmoc-trans-4-fluoro-L-prolina (Fmoc-L-(F)Pro-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Se realiza u seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Se acopla ácido hexanoico al resto de prolina añadiendo a la resina
3 eq. del ácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure disueltos en una pequeña cantidad de
DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Luego se separa por filtración la reacción y se aclara exhaustivamente la resina con
DMF y DCM. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la retirada del grupo Alloc, se añaden 10 eq. de fenilsilano en DCM a la resina mientras se burbujea N2 a través de la mezcla.
Luego, se añaden 0,1 eq. de Pd(PPh3)4 manteniendo el burbujeo de N2 mientras se mezcla todo bien. Luego se sella el recipiente de reacción y se agita durante 15 minutos. Después de este tiempo, se filtra la reacción y se lava exhaustivamente la resina. El mismo tratamiento se repite dos veces más. Después del último tratamiento, se lava exhaustivamente la resina con DCM, MeOH y DMF. Para el acoplamiento del ácido benzoico en la cadena lateral del resto diaminoetilo, se disuelven 3 eq. de dicho ácido, 3 eq. del agente de acoplamiento DIC y 3 eq. de Oxyma pure en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Se añade la mezcla resultante a la resina y se permite que avance la reacción durante 60 minutos. Después de este tiempo, se lava la resina con DMF y DCM y se realiza un seguimiento del grado de la reacción la prueba de Kaiser.
Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido se escinde de la resina añadiendo una disolución de DCM/TFA (95:5), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con DCM. Este procedimiento de escisión se repite dos veces.
Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío, proporcionando el ejemplo 16. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
EJEMPLOS COMPARATIVOS
Ejemplo comparativo 17:
(2S)-2-[[(2S)-1-acetilpirrolidin-2-carbonil)amino]-N-[(1S)-2-(hidroxiamino)-1-(1H-indol-3-ilmetil)-2-oxoetil]pentanodiamida
Figure imgf000040_0001
Se añaden 0,8 eq. de Na-Fmoc-N(en)-Boc-L-triptófano (Fmoc-L-Trp(Boc)-OH) comercialmente disponible y DIEA (4 eq.) a la resina en 2 ml de DMF. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 1 hora. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de la resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento de Na-Fmoc-N8-tritil-L-glutamina (Fmoc-L-Gln(Trt)-OH), se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10'). Se une Fmoc-L-prolina (Fmoc-L-Pro-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Para la acetilación de la parte N-terminal del péptido, se añaden 20 eq. de anhídrido acético y 20 eq. de DIEA a la resina. Se permite que reaccione la mezcla durante 30 minutos y se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido con cadena lateral protegida lineal se escinde de la resina añadiendo una disolución de h FiP/DCM (1:4), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con 30 HFIP/DCM. Este procedimiento de escisión se repite una segunda vez. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío. El péptido en bruto se usa para la formación de la hidroxamida en disolución sin purificación previa. Se disuelve el péptido en DCM. Después de esto, se añaden 3,5 eq. de O-(2,4-dimetoxibencil)hidroxilamina, 5 eq. de 4-metilmorfolina, 1,3 eq. del agente de acoplamiento EDCHCl y 1,3 eq. del aditivo HOAt y se permite que reaccione la mezcla bajo una atmósfera de N2 durante la noche. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando HPLC. Una vez que se obtiene el producto deseado, se lava la mezcla con HCl 1 N, agua y salmuera. Se seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se evapora. Después de eso, se añade una mezcla de TFA/agua/TIS (95:2,5:2,5) al péptido en bruto y se agita suavemente la mezcla durante 2 horas. Después de esto, se evapora el TFA bajo un flujo de N2, proporcionando el ejemplo 17. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo comparativo 18:
(2S)-2-acetamido-N-[(1S)-2-[[(1S)-1-(hidroxicarbamoil)-2-metil-butil]amino]-1-(1H-indol-3-ilmetil)-2-oxoetil]pentanodiamida
Figure imgf000041_0001
Se añaden 0,8 eq. de Fmoc-L-isoleucina (Fmoc-L-Ile-OH) comercialmente disponible y DIEA (4 eq.) a la resina en 2 ml de DMF. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 1 hora. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de la resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento de Na-Fmoc-N(en)-Boc-L-triptófano (Fmoc-L-Trp(Boc)-OH), se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10'). Luego, se une el resto Fmoc-L-éster 5-terc-butílico del ácido glutámico (Fmoc-L-Glu(tBu)-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Para la acetilación de la parte N-terminal del péptido, se añaden 20 eq. de anhídrido acético y 20 eq. de DIEA a la resina. Se permite que reaccione la mezcla durante 30 minutos y se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo
Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido con cadena lateral protegida lineal se escinde de la resina añadiendo una disolución de HFIP/DCM (1:4), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con 30 HFIP/DCM. Este procedimiento de escisión se repite una segunda vez. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío. El péptido en bruto se usa para la formación de la hidroxamida en disolución sin purificación previa. Se disuelve el péptido en DCM. Después de esto, se añaden 3,5 eq. de O-(2,4-dimetoxibencil)hidroxilamina, 5 eq. de 4-metilmorfolina, 1,3 eq. del agente de acoplamiento EDCHCl y 1,3 eq. del aditivo HOAt y se permite que reaccione la mezcla bajo una atmósfera de N2 durante la noche. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando HPLC. Una vez que se obtiene el producto deseado, se lava la mezcla con HCl 1 N, agua y salmuera. Se seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se evapora. Después de eso, se añade una mezcla de TFA/agua/TIS (95:2,5:2,5) al péptido en bruto y se agita suavemente la mezcla durante 2 horas. Después de esto, se evapora el TFA bajo un flujo de N2, proporcionando el ejemplo 18. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo comparativo 19:
(2S)-1-[(2S)-2-acetamido-5-amino-5-oxo-pentanoil]-N-[(1S)-1-(hidroxicarbamoil)-2-metil-butil]pirrolidin-2-carboxamida
Figure imgf000041_0002
Se añaden 0,8 eq. de Fmoc- L-isoleucina (Fmoc- L-Ile-OH) comercialmente disponible y DIEA (4 eq.) a la resina en 2 ml de DMF. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 1 hora. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de la resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento de Fmoc-L-prolina (Fmoc-L-Pro-OH), se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10'). Luego, se une Na-Fmoc-N8-tritil-L-glutamina (Fmoc-L-Gln(Trt)-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1x15 ' ) y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Para la acetilación de la parte N-terminal del péptido, se añaden 20 eq. de anhídrido acético y 20 eq. de DIEA a la resina. Se permite que reaccione la mezcla durante 30 minutos y se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo.
Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido con cadena lateral protegida lineal se escinde de la resina añadiendo una disolución de HFIP/DCM (1:4), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con 30 HFIP/DCM. Este procedimiento de escisión se repite una segunda vez. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío. El péptido en bruto se usa para la formación de la hidroxamida en disolución sin purificación previa. Se disuelve el péptido en DCM. Después de esto, se añaden 3,5 eq. de O-(2,4-dimetoxibencil)hidroxilamina, 5 eq. de 4-metilmorfolina, 1,3 eq. del agente de acoplamiento EDCHCl y 1,3 eq. del aditivo HOAt y se permite que reaccione la mezcla bajo una atmósfera de N2 durante la noche. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando HPLC. Una vez que se obtiene el producto deseado, se lava la mezcla con HCl 1 N, agua y salmuera. Se seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se evapora. Después de eso, se añade una mezcla de TFA/agua/TIS (95:2,5:2,5) al péptido en bruto y se agita suavemente la mezcla durante 2 horas. Después de esto, se evapora el TFA bajo un flujo de N2, proporcionando el ejemplo 19. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo comparativo 20:
(2S)-2-[[(2S)-1-acetilpirrolidin-2-carbonil]-metil-amino]-N-[(1S)-2-(hidroxiamino)-1-(1H-indol-3-ilmetil)-2-oxoetil]pentanodiamida
Se añaden 0,8 eq. de Na-Fmoc-N(en)-Boc-L-triptófano (Fmoc-L-Trp(Boc)-OH) comercialmente disponible y DIEA (4 eq.) a la resina en 2 ml de DMF. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 1 hora. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de la resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento de Na-Fmoc-N8-tritil-L-glutamina (Fmoc-L-Gln(Trt)-OH), se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc por tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10'). Para la N-metilación del grupo amino en el resto Gln, el grupo amino libre se protege con cloruro de orto-nitrobencenosulfonilo (4 eq.) usando colidina (10 eq.) como base en DMF, que se permite que reaccione con la resina durante 30 minutos. Luego, se aclara la resina con DMF y DCM, y la etapa de protección se repite de nuevo en las mismas condiciones. Se realiza un seguimiento del grado de protección usando la prueba de Kaiser. La N-metilación del grupo amino se logra tratando la resina con 3 eq. de 7-metil-1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno y 4 eq. de para-nitrobencenosulfonato en DMF durante 30 minutos (3 tratamientos). Entre tratamientos se lava exhaustivamente la resina con DMF y DCM. Después de la N-metilación del grupo amino de Gln, el grupo protector orto-nitrobencenosulfonilo se retira tratando la resina con 10 eq. de p-mercaptoetanol y 5 eq. de DBU (1 x 10' y 1 x 40'). La retirada del grupo ortonitrobencenosulfonilo se evalúa usando la prueba de cloranilo. Luego, se une Fmoc-L-prolina (Fmoc-L-Pro-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Para la acetilación de la parte N-terminal del péptido, se añaden 20 eq. de anhídrido acético y 20 eq. de DIEA a la resina. Se permite que reaccione la mezcla durante 30 minutos y se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido con cadena lateral protegida lineal se escinde de la resina añadiendo una disolución de HFIP/DCM (1:4), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con 30 HFIP/DCM. Este procedimiento de escisión se repite una segunda vez. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío. El péptido en bruto se usa para la formación de la hidroxamida en disolución sin purificación previa. Se disuelve el péptido en DCM. Después de esto, se añaden 3,5 eq. de O-(2,4-dimetoxibencil)hidroxilamina, 5 eq. de 4-metilmorfolina, 1,3 eq. del agente de acoplamiento EDCHCl y 1,3 eq. del aditivo HOAt y se permite que reaccione la mezcla bajo una atmósfera de N2 durante la noche. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando HPLC. Una vez que se obtiene el producto deseado, se lava la mezcla con HCl 1 N, agua y salmuera. Se seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se evapora. Después de eso, se añade una mezcla de TFA/agua/TIS (95:2,5:2,5) al péptido en bruto y se agita suavemente la mezcla durante 2 horas. Después de esto, se evapora el TFA bajo un flujo de N2, proporcionando el ejemplo 20. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo comparativo 21:
(2S)-1-acetil-N-[(1S)-1-[[(1S)-2-(hidroxiamino)-1-(1H-indol-3-ilmetil)-2-oxo-etil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metilpirrolidin-2-carboxamida
Figure imgf000044_0001
Se añaden 0,8 eq. de Na-Fmoc-N(en)-Boc-L-triptófano (Fmoc-L-Trp(Boc)-OH) comercialmente disponible y DIEA (4 eq.) a la resina en 2 ml de DMF. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 1 hora. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de la resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento de Na-Fmoc-L-Isoleucina (Fmoc-L-Ile-OH), se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10'). Para la N-metilación del grupo amino del resto Ile, el grupo amino libre se protege con cloruro de orto-nitrobencenosulfonilo (4 eq.) usando colidina (10 eq.) como base en DMF, que se permite que reaccione con la resina durante 30 minutos. Luego, se aclara la resina con DMF y DCM, y la etapa de protección se repite de nuevo en las mismas condiciones. Se realiza un seguimiento del grado de protección usando la prueba de Kaiser. La N-metilación del grupo amino se logra tratando la resina con 3 eq. de 7-metil-1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno y 4 eq. de para-nitrobencenosulfonato en DMF durante 30 minutos (3 tratamientos). Entre tratamientos se lava exhaustivamente la resina con DMF y 5 DCM. Después de la N-metilación del grupo amino de Ile, el grupo protector orto-nitrobencenosulfonilo se retira tratando la resina con 10 eq. de p-mercaptoetanol y 5 eq. de DBU (1 x 10' y 1 x 40'). La retirada del grupo orto-nitrobencenosulfonilo se evalúa usando la prueba de cloranilo. Luego, se une Fmoc-L-prolina (Fmoc-L-Pro-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Para la acetilación de la parte N-terminal del péptido, se añaden 20 eq. de anhídrido acético y 20 eq. de DIEA a la resina. Se permite que reaccione la mezcla durante 30 minutos y se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido con cadena lateral protegida lineal se escinde de la resina añadiendo una disolución de HFIP/DCM (1:4), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con 30 HFIP/DCM. Este procedimiento de escisión se repite una segunda vez. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío. El péptido en bruto se usa para la formación de la hidroxamida en disolución sin purificación previa. Se disuelve el péptido en DCM. Después de esto, se añaden 3,5 eq. de O-(2,4-dimetoxibencil)hidroxilamina, 5 eq. de 4-metilmorfolina, 1,3 eq. del agente de acoplamiento EDC HCl y 1,3 eq. del aditivo HOAt y se permite que reaccione la mezcla bajo una atmósfera de N2 durante la noche. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando HPLC. Una vez que se obtiene el producto deseado, se lava la mezcla con HCl 1 N, agua y salmuera. Se seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se evapora. Después de eso, se añade una mezcla de TFA/agua/TIS (95:2,5:2,5) al péptido en bruto y se agita suavemente la mezcla durante 2 horas. Después de esto, se evapora el TFA bajo un flujo de N2, proporcionando el ejemplo 21. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo comparativo 22:
(2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-2-(hidroxiamino)-1-(1H-indol-3-ilmetil)-2-oxo-etil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-1-tetradecanoil-pirrolidin-2-carboxamida
Figure imgf000045_0001
Se añaden 0,8 eq. de Na-Fmoc-N(en)-Boc-L-triptófano (Fmoc-L-Trp(Boc)-OH) comercialmente disponible y DIEA (4 eq.) a la resina en 2 ml de DMF. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 1 hora. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de la resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento de Fmoc-L-Leucina (Fmoc-L-Leu-OH), se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10'). Luego, se une Fmoc-L-prolina (Fmoc-L-Pro-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Para la ocupación de la parte N-terminal del péptido, se añaden 3 eq. de ácido mirístico, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTu y 6 eq. de DIEA a la resina. Se permite que reaccione la mezcla durante 60 minutos y se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido con cadena lateral protegida lineal se escinde de la resina añadiendo una disolución de HFIP/DCM (1:4), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con 30 HFIP/DCM. Este procedimiento de escisión se repite una segunda vez. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío. El péptido en bruto se usa para la formación de la hidroxamida en disolución sin purificación previa. Se disuelve el péptido en DCM. Después de esto, se añaden 3,5 eq. de O-(2,4-dimetoxibencil)hidroxilamina, 5 eq. de 4-metilmorfolina, 1,3 eq. del agente de acoplamiento EDC HCl y 1,3 eq. del aditivo HOAt y se permite que reaccione la mezcla bajo una atmósfera de N2 durante la noche. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando HPLC. Una vez que se obtiene el producto deseado, se lava la mezcla con HCl 1 N, agua y salmuera. Se seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se evapora. Después de eso, se añade una mezcla de TFA/agua/TIS (95:2,5:2,5) al péptido en bruto y se agita suavemente la mezcla durante 2 horas. Después de esto, se evapora el TFA bajo un flujo de N2, proporcionando el ejemplo 22. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Ejemplo comparativo 23:
(2S)-2-[[(SS)-1-hexanoilpirrolidin-2-carbonil)-metil-amino]-N-[(1S)-2-(hidroxiamino)-1-(1H-indol-3-ilmetil)-2-oxo-etil]pentanodiamida
Figure imgf000046_0001
Se añaden 0,8 eq. de Na-Fmoc-N(en)-Boc-L-triptófano (Fmoc-L-Trp(Boc)-OH) comercialmente disponible y DIEA (4 eq.) a la resina en 2 ml de DMF. Se agita la mezcla de manera intermitente manualmente durante 1 hora. Después de eso, se añaden 0,5 ml/g de MeOH a la mezcla de reacción para ocupar los puntos reactivos restantes de la resina. Después de 15 minutos, se separa por filtración la disolución y se lava exhaustivamente la resina con DCM, DMF y MeOH. La retirada de Fmoc se logra tratando la resina con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15'). Para el acoplamiento de Na-Fmoc-N8-tritil-L-glutamina (Fmoc-L-Gln(Trt)-OH), se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10'). Para la N-metilación del grupo amino del resto Gln, el grupo amino libre se protege con cloruro de orto-nitrobencenosulfonilo (4 eq.) usando colidina (10 eq.) como base en DMF, que se permite que reaccione con la resina durante 30 minutos. Luego, se aclara la resina con DMF y DCM, y la etapa de protección se repite de nuevo en las mismas condiciones. Se realiza un seguimiento del grado de protección usando la prueba de Kaiser. La N-metilación del grupo amino se logra tratando la resina con 3 eq. de 7-metil-1,5,7-triazabiciclo[4.4.0]dec-5-eno y 4 eq. de para-nitrobencenosulfonato en DMF durante 30 minutos (3 tratamientos). Entre tratamientos se lava exhaustivamente la resina con DMF y 5 DCM. Después de la N-metilación del grupo amino de Gln, el grupo protector orto-nitrobencenosulfonilo se retira tratando la resina con 10 eq. de p-mercaptoetanol y 5 eq. de DBU (1 x 10' y 1 x 40'). La retirada del grupo ortonitrobencenosulfonilo se evalúa usando la prueba de cloranilo. Luego, se une Fmoc-L-prolina (Fmoc-L-Pro-OH), para ese propósito se disuelven 3 eq. del aminoácido, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA en una pequeña cantidad de DMF y se premezclan durante 2 minutos. Después de esto, se añade la mezcla a la resina y se permite que reaccione la reacción durante 90 minutos. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de Kaiser. Luego se retira el grupo Fmoc mediante tratamientos con piperidina al 20% en DMF (1 x 5', 1 x 10' y 1 x 15') y tratamiento adicional con una mezcla de piperidina/DBU/tolueno/DMF (5:5:20:70) (1 x 5'). Para la ocupación de la parte N-terminal del péptido, se añaden 3 eq. de ácido hexanoico, 3 eq. del agente de acoplamiento TBTU y 6 eq. de DIEA a la resina. Se permite que reaccione la mezcla durante 60 minutos y se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando la prueba de cloranilo. Para la escisión del péptido, se lava la resina varias veces con DCM y se seca por succión. El péptido con cadena lateral protegida lineal se escinde de la resina añadiendo una disolución de HFIP/DCM (1:4), se permite que reaccione la mezcla durante 15 min. Luego se filtra la mezcla de reacción y se aclara la resina con 30 HFIP/DCM. Este procedimiento de escisión se repite una segunda vez. Todos los filtrados se agrupan y se evapora el disolvente a vacío. El péptido en bruto se usa para la formación de la hidroxamida en disolución sin purificación previa. Se disuelve el péptido en DCM. Después de esto, se añaden 3,5 eq. de O-(2,4-dimetoxibencil)hidroxilamina, 5 eq. de 4-metilmorfolina, 1,3 eq. del agente de acoplamiento EDC HCl y 1,3 eq. del aditivo HOAt y se permite que reaccione la mezcla bajo una atmósfera de N2 durante la noche. Se realiza un seguimiento del grado de la reacción usando HPLC. Una vez que se obtiene el producto deseado, se lava la mezcla con HCl 1 N, agua y salmuera. Se seca la fase orgánica sobre sulfato de magnesio, se filtra y se evapora. Después de eso, se añade una mezcla de TFA/agua/TIS (95:2,5:2,5) al péptido en bruto y se agita suavemente la mezcla durante 2 horas. Después de esto, se evapora el TFA bajo un flujo de N2, proporcionando el ejemplo 23. Se purifica el compuesto usando cromatografía de fase inversa.
Experimentos:
DETERMINACIÓN DEL EFECTO INHIBIDOR DE COMPUESTOS NOVEDOSOS SOBRE MPM-2 Y MPM-9 DE LA MATRIZ
Consideraciones generales: se realizaron todos los experimentos en tampón de reacción 1X, que se obtuvo a partir de una disolución de tampón de reacción 10X. El contenido del tampón de reacción 1X fue: 50 ml de Tris-HCl 0,5 M, NaCl 1,5 M, CaCl250 mM y azida de sodio 2 mM a pH 7,6. Para obtener el tampón de reacción 1X, se diluyeron 4 ml del tampón de reacción 10X en 36 ml de H2O.
Ensayo de inhibición de MPM-2:
La MPM-2 recombinante expresada en células de ovario de hámster chino (CHO) se obtuvo de Merck-Millipore (número de catálogo PF023-5UG). La gelatina DQ de piel porcina conjugada con fluoresceína (sustrato de MPM-2) se obtuvo de Life Technologies (número de catálogo E12055).
Preparación de la MPM-2 para el ensayo de actividad: La MPM-2 se proporcionó como una disolución madre (0,1 mg/ml). La enzima se diluyó en tampón de reacción 1X hasta una concentración final de 5 |ig/ml.
Preparación de la disolución de gelatina DQ (sustrato) para el ensayo de actividad: la forma sólida del sustrato se disolvió en agua para obtener una disolución madre de 1 mg/ml.
Procedimiento: Se realizaron los ensayos enzimáticos en una placa de microtitulación de 96 pocillos, que permitió el seguimiento simultáneo de múltiples reacciones. Para cada reacción, se añadieron 86,3 |il de tampón de reacción 1X (pH 7,6), 1,7 |il de MPM-2 (concentración final 85 ng/ml) y 2 |il del correspondiente nuevo compuesto a cada pocillo. Se preparó una disolución madre del nuevo compuesto en DMSO (100 mM), y se prepararon diluciones a partir de esta disolución madre con DMSO. Finalmente, a la mezcla contenida en cada pocillo se le añadieron 10 |il del sustrato (concentración final 50 |ig/ml). Se incubó la reacción durante 2 horas a temperatura ambiente en un agitador orbital (100 rpm).
La actividad inhibidora del nuevo compuesto se midió fluorimétricamente. Las longitudes de onda de excitación y emisión fueron de 483 y 525 nm, respectivamente.
Ensayo de inhibición de MPM-9:
La MPM-9 recombinante expresada se obtuvo de Merck-Millipore (número de catálogo PF140-5UG, usada en los ejemplos 1 a 9 y los ejemplos comparativos) y Enzo (número de catálogo SE360-0010, usada en los ejemplos 10 a 16). La gelatina DQ de piel porcina conjugada con fluoresceína (sustrato de MPM-9) se obtuvo de Life Technologies (número de catálogo E12055).
Preparación de la MPM-9 para el ensayo de actividad: La MPM-9 se proporcionó como una disolución madre (0,1 mg/ml). La enzima se diluyó en tampón de reacción 1X hasta una concentración final de 5 |ig/ml.
Preparación de la disolución de gelatina DQ (sustrato) para el ensayo de actividad: la forma sólida del sustrato se disolvió en agua para obtener una disolución madre de 1 mg/ml.
Procedimiento: Se realizaron los ensayos enzimáticos en una placa de microtitulación de 96 pocillos, que permitió el seguimiento simultáneo de múltiples reacciones. Para cada reacción, se añadieron 84,6 |il de tampón de reacción 1X (pH 7,6), 3,4 |il de MPM-9 (concentración final 85 ng/ml) y 2 |il del correspondiente nuevo compuesto a cada pocillo. Se preparó una disolución madre del nuevo compuesto en DMSO (100 mM), y se prepararon diluciones a partir de esta disolución madre con DMSO. Finalmente, a la mezcla contenida en cada pocillo se le añadieron 10 |il del sustrato (concentración final 50 |ig/ml). Se incubó la reacción durante 4 horas a temperatura ambiente en un agitador orbital (100 rpm).
La actividad inhibidora del nuevo compuesto se midió fluorimétricamente. Las longitudes de onda de excitación y emisión fueron de 483 y 525 nm, respectivamente.
Para cada compuesto, se midió la actividad inhibidora en varios puntos de concentración (que variaron entre 100 pM y 200 |iM de MPM). La actividad inhibidora en MPM-2 y MPM-9 se calculó según la ec. 1. Para cada nuevo compuesto, se midió la fluorescencia en presencia (a) y en ausencia (b) de la correspondiente MPM. La fluorescencia máxima (0% de actividad inhibidora) se obtuvo de una muestra de la MPM correspondiente en ausencia de compuestos inhibidores. Para estimar la potencia inhibidora de los compuestos novedosos, se representaron gráficamente las actividades frente a la concentración logarítmica del compuesto, ajustando a una curva sigmoidea usando el software GraphPad Prism, y se determinó el valor de CI50, definido como la concentración de compuesto necesaria para inhibir el 50% de la actividad de MPM correspondiente, a partir de la curva resultante.
a-b
Actividad inhibidora (%) 1- x 100 (Ecuación 1)
c-d
en la que:
a corresponde a la intensidad de fluorescencia en presencia de sustrato compuesto de prueba MPM b corresponde a la intensidad de fluorescencia en presencia de sustrato compuesto de prueba
c corresponde a la intensidad de fluorescencia en presencia de sustrato MPM
d corresponde a la intensidad de fluorescencia de la presencia de sustrato
Los nuevos compuestos mostraron una alta potencia de inhibición frente a MPM-2 y MPM-9. Los resultados se resumen en la tabla 1.
Tabla 1: Inhibición de MPM-2 y MPM-9
Figure imgf000048_0001
Actividad inhibidora frente a proteasas MPM-2 y MPM-9 relacionadas: Ensayos de inhibición de MPM-1, MPM-3 y MPM-7
Consideraciones generales: se realizaron todos los experimentos en tampón de reacción 1X, que se obtuvo a partir de una disolución de tampón de reacción 10X. El contenido del tampón de reacción 1X fue: 50 ml de Tris-HCl 0,5 M, NaCl 1,5 M, CaCl250 mM y azida de sodio 2 mM a pH 7,6. Para obtener el tampón de reacción 1X, se diluyeron 4 ml del tampón de reacción 10X en 36 ml de H2O.
Ensayo de inhibición de MPM-1:
La MPM-1 recombinante expresada en E. Coli se obtuvo de Enzo Life Sciences (número de catálogo BML-SE180). Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2 (sustrato peptídico fluorogénico) se obtuvo de R&D Systems (número de catálogo ES001). Preparación de la MPM-1 para el ensayo de actividad: La MPM-1 se proporcionó como una disolución madre (0,55 mg/ml). La enzima se diluyó en tampón de reacción 1X hasta una concentración final de 276 nM.
El sustrato peptídico DE MPM-1 se proporcionó como una disolución madre en DMSO (6 mM). Para el ensayo, el sustrato se diluyó tampón de reacción 1X hasta una concentración de 100 |iM.
Procedimiento: Se realizaron los ensayos enzimáticos en una placa de microtitulación de 96 pocillos, que permitió el seguimiento simultáneo de múltiples reacciones. Para cada reacción, se añadieron 86 |il de tampón de reacción 1X (pH 7,6), 2 |il de MPM-1 (concentración final 5,52 nM) y 2 |il del correspondiente nuevo compuesto a cada pocillo. Se preparó una disolución madre del nuevo compuesto en DMSO (100 mM), y se prepararon diluciones a partir de esta disolución madre con DMSO. Finalmente, a la mezcla contenida en cada pocillo se le añadieron 10 |il del sustrato (concentración final 10 |iM). Se incubó la reacción durante 4 horas a temperatura ambiente en un agitador orbital (100 rpm).
La actividad inhibidora del nuevo compuesto se midió fluorimétricamente. Las longitudes de onda de excitación y emisión fueron de 320 y 405 nm, respectivamente.
Ensayo de inhibición de MPM-3:
La MPM-3 recombinante expresada en E. Coli se obtuvo de Merck-Millipore (número de catálogo 44217). Mca-RPKPVE-Nval-WRK (Dnp)-NH2 (sustrato peptídico fluorogénico) se obtuvo de R&D Systems (número de catálogo ES002).
Preparación de la MPM-3 para el ensayo de actividad: La MPM-3 se proporcionó como una disolución madre (0,1 mg/ml). La enzima se diluyó en agua hasta una concentración final de 0,005 mg/ml.
El sustrato peptídico MPM-3 se proporcionó como una disolución madre en DMSO (4,5 mM). Para el ensayo, se diluyó el sustrato en tampón de reacción 1X hasta una concentración de 100 |iM.
Procedimiento: Se realizaron los ensayos enzimáticos en una placa de microtitulación de 96 pocillos, que permitió el seguimiento simultáneo de múltiples reacciones. Para cada reacción, se añadieron 84,6 |il de tampón de reacción 1X (pH 7,6), 3,4 |il de MPM-3 (concentración final 7,7 nM) y 2 |il del correspondiente nuevo compuesto a cada pocillo. Se preparó una disolución madre de nuevo compuesto en DMSO (100 mM), y se prepararon diluciones a partir de esta disolución madre con DMSO. Finalmente, a la mezcla contenida en cada pocillo se le añadieron 10 |il del sustrato (concentración final 10 |iM). Se incubó la reacción durante 4 horas a temperatura ambiente en un agitador orbital (90 rpm).
La actividad inhibidora del nuevo compuesto se midió fluorimétricamente. Las longitudes de onda de excitación y emisión fueron de 320 y 405 nm, respectivamente.
Ensayo de inhibición de MPM-7:
La MPM-7 recombinante expresada en E. Coli se obtuvo de Merck-Millipore (número de catálogo 44270). Mca-PLGL-Dpa-AR-NH2 (sustrato peptídico fluorogénico) se obtuvo de R&D Systems (número de catálogo ES001). Preparación de la MPM-7 para el ensayo de actividad: MPM-7 se proporcionó como una disolución madre (2,1 mg/ml). La enzima se diluyó en agua hasta una concentración final de 0,005 mg/ml.
El sustrato peptídico MPM-7 se proporcionó como un sólido (1 mg). Se obtuvo una disolución madre 4 mM del sustrato en DMSO añadiendo 214,7 |il de DMSO. Después de esto, se preparó una disolución 100 |iM de sustrato en tampón de reacción 1X.
Procedimiento: Se realizaron los ensayos enzimáticos en una placa de microtitulación de 96 pocillos, que permitió el seguimiento simultáneo de múltiples reacciones. Para cada reacción, se añadieron 84,6 |il de tampón de reacción 1X (pH 7,6), 3,4 |il de MPM-7 (concentración final 8,3 nM) y 2 |il del correspondiente nuevo compuesto a cada pocillo. Se preparó una disolución madre de nuevo compuesto en DMSO (100 mM), y se prepararon diluciones a partir de esta disolución madre con DMSO. Finalmente, a la mezcla contenida en cada pocilio se le añadieron 10 |il del sustrato (concentración final 10 |iM). Se incubó la reacción durante 4 horas a temperatura ambiente en un agitador orbital (90 rpm).
La actividad inhibidora del nuevo compuesto se midió fluorimétricamente. Las longitudes de onda de excitación y emisión fueron de 320 y 405 nm, respectivamente.
Para cada compuesto, se midió la actividad inhibidora en varios puntos de concentración (1, 10, 100 y 200 |iM). La actividad inhibidora en MPM-1, MPM-3 y MPM-7 se calculó según la ec. 1 y se calculó el valor de CI50 como se explicó anteriormente para MPM-2 y MPM-9.
Los valores de CI50 se muestran en la tabla 2.
Tabla 2. CI50 con respecto a MPM-1, MPM-3 y MPM-7.
Figure imgf000050_0001
Como puede observarse fácilmente al comparar los valores de la tabla 2 (que muestran las CI50 para MMP-1, MMP-3 y MMP-7) con los de la tabla 1 (que muestran las CI50 para MMP-2 y MMP-9), los compuestos de la invención son altamente selectivos para MMP-2 y MMP-9.
DETERMINACIÓN DE PROPIEDADES DE PERMEABILIDAD DE LOS COMPUESTOS
Ensayo de permeabilidad de membranas artificiales en paralelo (PAMPA)
El ensayo de permeabilidad de membranas artificiales en paralelo (PAMPA) descrito en Kansy et al., J. M. Chem.
1998; 41(7):1007-10 se usó en este caso para determinar la capacidad de los compuestos para atravesar la barrera hematoencefálica (BHE) por difusión pasiva (Di L et al., Eur. J. Med. Chem. 2003;38(3):223-32). Se midió la permeabilidad eficaz (Pe) de los compuestos a una concentración inicial de 200 |iM. Se preparó la disolución tampón a partir de un concentrado comercial siguiendo las instrucciones del fabricante. Se ajustó el pH a 7,4 usando una disolución de NaOH 0,5 M. Se preparó una disolución madre de nuevo compuesto en d Ms O y se diluyó con disolución tampón hasta una concentración final de 200 |iM (contenido en DMSO del 0,5%). Se separó la intercalación de PAMPA y se llenó cada pocillo dador con 200 |iM de la disolución del compuesto. La placa aceptora se colocó en la placa dadora, garantizando que la parte inferior de la membrana estaba en contacto con tampón. Se añadieron 4 |il de la mezcla de fosfolípidos (20 mg/ml) en dodecano al filtro de cada pocillo, y se añadieron 200 |il de disolución tampón a cada pocillo aceptor. Se cubrió la placa y se incubó a temperatura ambiente en una atmósfera de humedad saturada durante 4 horas con agitación orbital a 100 rpm. Después de 4 horas, se analizó mediante HPLC el contenido de los compartimentos aceptor y dador: se transfirieron 150 |il de cada pocillo de la placa dadora y 150 |il de cada pocillo de la placa aceptora a viales de HPLC, inyectando cada muestra en una columna C18 de fase inversa (150 mm x 4,6 mm x 5 |im, 100 A) (100 |il/inyección de pocillos aceptores, 10 |il/inyección de pocillos dadores y para referencias t0). El transporte también se confirmó usando espectrometría de masas (MALDI-TOF). La mezcla de fosfolípidos usada fue de un extracto lipídico cerebral polar porcino, proporcionado por Avanti polar lipids, con la siguiente composición: el 12,6% de fosfatidilcolina (PC), el 33,1% de fosfatidiletanolamina (PE), el 18,5% de fosfatidilserina (PS), el 4,1% de fosfatidilinositol (PI), el 0,8% de ácido fosfatídico y el 30,9% de otros compuestos.
Se calculó la permeabilidad eficaz (Pe) después de 4 horas usando la ecuación 2 y se calculó el porcentaje de transporte (% de T) usando la ecuación 3:
d -218,3 l_2Ca(t)
Pe = --------- x log x 10-6 cm/s (Ecuación 2)
^ Cd(t0)
% deT = Ca(t) x 100 (Ecuación 3)
Cd(t0)
en las que:
t es tiempo (h)
Ca(t) es la concentración de compuesto en el pocillo aceptor a tiempo t
Y Cd(t0) es la concentración de compuesto en el pocillo dador a t0.
Basándose en los valores indicativos de Pe mostrados en la tabla 4, los compuestos novedosos presentan buena permeabilidad a través de la BHE (tabla 5).
Tabla 4: Valores indicativos de Pe
Figure imgf000051_0002
Tabla 5: Permeabilidad eficaz (Pe) y porcentaje de transporte de los nuevos compuestos
Figure imgf000051_0001
Figure imgf000052_0001

Claims (13)

REIVINDICACIONES
1. Compuesto de fórmula (I):
Figure imgf000053_0001
en la que
AA1 o bien está ausente o bien es un resto derivado de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N-metil-fenilalanina, N-metil-triptófano, N-metil-tirosina y N-metil-isoleucina,
AA2 o bien está ausente o bien es un resto derivado de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N-metil-fenilalanina, N-metil-alanina, N-metil-p-alanina y N-metil-leucina,
G es un resto alquileno lineal o ramificado que comprende desde 1 hasta 10 átomos de carbono en el que uno o más restos metileno (-CH2-) no vecinales en dicho resto pueden reemplazarse por átomos de oxígeno (-O-) correspondientes,
R1 se selecciona del grupo que consiste en hidrógeno y fenilo,
R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y flúor,
R5 y R6 se seleccionan independientemente del grupo que consiste en hidrógeno y flúor,
o una sal del mismo.
2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que AA1 y AA2 están ausentes.
3. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1a 2, en el que G se selecciona del grupo que consiste en -CH2-, -(CH2)3-, -(CH2)5-, -CH2-CH(CH3)-CH2-, -(CH2)7-, -CH2-CH2-CH2-CH(CH2-CH2-CH3)-, -O-(CH2)3-, -(CH2)13- y-CH2-O-(CH2)2-O-CH2-..
4. Compuesto según la reivindicación 3, en el que R1-G se selecciona del grupo que consiste en CH3-(CH2)2-, CH3-CH(CH3)-CH2-, fenil-O-(CH2)3-, CH3-(CH2)6-, CH3-(CH2)4- y CH3-CH2-CH2-CH(CH3-CH2-CH3)-.
5. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que uno de R2, R3 y R4 es hidrógeno.
6. Compuesto según la reivindicación 5, en el que uno de R2, R3 y R4 es hidrógeno y los otros dos son átomos de flúor.
7. Compuesto según la reivindicación 6, en el que el grupo fenilo sustituido con R2, R3 y R4 es un 3,5-difluorofenilo.
8. Compuesto según cualquier reivindicación anterior, en el que R5 y R6 son ambos hidrógeno.
9. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 de fórmula:
Figure imgf000054_0001
10. Compuesto según la reivindicación 1, seleccionado del grupo que consiste en:
• (2S)-1-acetil-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(4-fluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-1-acetil-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metilbutil]-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-1-hexanoil-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-1-butanoil-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metilbutil]-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-1-(3-metilbutanoil)pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-1-octanoil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-N-[(1S,2S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-4,4-difluoro-1-hexanoil-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-1-(2-propilpentanoil)pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-1-(4-fenoxibutanoil)pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-4,4-difluoro-N-metil-1-(4-fenoxibutanoil)pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-1-[(2S)-2-[acetil(metil)amino]-3-fenil-butanoil]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-1-[(2S)-2-[acetil(metil)amino]propanoil]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-1-[3-[acetil(metil)amino]propanoil]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1
(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-1-[(2S)-2-[[2-[butanoil(metil)amino]-3-(1H-indol-3-il)propanoil]-metil-amino]-4-metil-pentanoil]-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-[(3,5-difluorobenzoil)amino]-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-pirrolidin-2-carboxamida
• (2S)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-benzamido-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-N-metil-1-hexanoilpirrolidin-2-carboxamida
• (2S,4R)-N-[(1S)-1-[[(1S)-3-benzamido-1-(hidroxicarbamoil)propil]carbamoil]-2-metil-butil]-4-fluoro-N-metil-1-pentanoil-pirrolidin-2-carboxamida
o una sal de los mismos.
11. Composiciones farmacéuticas que comprenden un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 y un vehículo, coadyuvante o excipiente farmacéuticamente aceptable.
12. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para su uso como medicamento.
13. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, para su uso en la prevención y/o el tratamiento de epilepsia, esquizofrenia, enfermedad de Alzheimer, autismo (en particular asociado al síndrome del cromosoma X frágil), retraso mental, trastornos bipolares, trastornos del estado de ánimo tales como trastornos bipolares, depresión, vasculopatías tales como apoplejía isquémica y aterosclerosis, enfermedades inflamatorias tales como esclerosis múltiple y artritis reumatoide, y enfermedad inflamatoria del intestino, toxicomanía, dolor neuropático, enfermedades pulmonares tales como asma y enfermedad pulmonar obstructiva crónica, cáncer y septicemia.
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