KR102437992B1 - 노로 바이러스 불활화제 및 그 제조 방법, 노로 바이러스 불활화 방법, 노로 바이러스 불활화용 라이소자임류의 제조 방법, 노로 바이러스 감염의 예방약 또는 치료약, 그리고 노로 바이러스 불활화용 피부 외용제 - Google Patents

노로 바이러스 불활화제 및 그 제조 방법, 노로 바이러스 불활화 방법, 노로 바이러스 불활화용 라이소자임류의 제조 방법, 노로 바이러스 감염의 예방약 또는 치료약, 그리고 노로 바이러스 불활화용 피부 외용제 Download PDF

Info

Publication number
KR102437992B1
KR102437992B1 KR1020167024237A KR20167024237A KR102437992B1 KR 102437992 B1 KR102437992 B1 KR 102437992B1 KR 1020167024237 A KR1020167024237 A KR 1020167024237A KR 20167024237 A KR20167024237 A KR 20167024237A KR 102437992 B1 KR102437992 B1 KR 102437992B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
norovirus
lysozyme
fluorescence intensity
fluorescence
wavelength
Prior art date
Application number
KR1020167024237A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20160117560A (ko
Inventor
하지메 다카하시
미키 사토
다카시 미야시타
료 사사하라
Original Assignee
고쿠리츠 다이가쿠 호우징 도쿄 가이요우 다이가쿠
큐피가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 고쿠리츠 다이가쿠 호우징 도쿄 가이요우 다이가쿠, 큐피가부시키가이샤 filed Critical 고쿠리츠 다이가쿠 호우징 도쿄 가이요우 다이가쿠
Publication of KR20160117560A publication Critical patent/KR20160117560A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102437992B1 publication Critical patent/KR102437992B1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/47—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2), e.g. cellulases, lactases
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0014—Skin, i.e. galenical aspects of topical compositions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/16—Agglomerates; Granulates; Microbeadlets ; Microspheres; Pellets; Solid products obtained by spray drying, spray freeze drying, spray congealing,(multiple) emulsion solvent evaporation or extraction
    • A61K9/1605—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/1617—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A61K9/1623—Sugars or sugar alcohols, e.g. lactose; Derivatives thereof; Homeopathic globules
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/20—Pills, tablets, discs, rods
    • A61K9/2004—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/2013—Organic compounds, e.g. phospholipids, fats
    • A61K9/2018—Sugars, or sugar alcohols, e.g. lactose, mannitol; Derivatives thereof, e.g. polysorbates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2462—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01017—Lysozyme (3.2.1.17)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/16011—Caliciviridae
    • C12N2770/16061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/16063—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

노로 바이러스 불활화제가, 라이소자임 및/또는 그 염, 그리고 이것들의 변성물에서 선택되는 적어도 1 종인 라이소자임류를 함유한다.

Description

노로 바이러스 불활화제 및 그 제조 방법, 노로 바이러스 불활화 방법, 노로 바이러스 불활화용 라이소자임류의 제조 방법, 노로 바이러스 감염의 예방약 또는 치료약, 그리고 노로 바이러스 불활화용 피부 외용제 {NOROVIRUS INACTIVATOR AND METHOD FOR PRODUCING SAME, METHOD FOR INACTIVATING NOROVIRUS, METHOD FOR PRODUCING LYSOZYME COMPONENT FOR NOROVIRUS INACTIVATION USE, PROPHYLACTIC OR THERAPEUTIC AGENT FOR NOROVIRUS INFECTION, AND EXTERNAL PREPARATION FOR SKIN FOR NOROVIRUS INACTIVATION PURPOSES}
본 발명은, 라이소자임 및/또는 그 염, 그리고 이것들의 변성물 중 적어도 1 종을 함유하는 노로 바이러스 불활화제 및 그 제조 방법, 노로 바이러스 불활화 방법, 노로 바이러스 불활화용 라이소자임류의 제조 방법, 노로 바이러스 감염의 예방약 또는 치료약, 그리고 노로 바이러스 불활화용 피부 외용제에 관한 것이다.
노로 바이러스는 사람에 대한 감염이 높아, 식중독이나 바이러스성 급성 위장염 (감염증) 을 일으킨다. 현재, 노로 바이러스에는 백신이 없고, 유효한 항바이러스제도 없기 때문에, 일단 발증하면 치료는 수액 등의 대증 요법에 한정되어 버려 고령자들에게서는 중증화되는 경우도 있다.
노로 바이러스의 감염 경로는 주로 경구 감염이다. 그 때문에, 식중독이나 감염증의 발생 예방 및 발생 후의 확대 방지를 위해서는, 환경에 존재하는 노로 바이러스를 불활화하는 것이 매우 중요하다.
종래, 알코올 제제를 비롯한 많은 소독약은, 노로 바이러스의 불활화에는 소용이 없어, 불활화를 위해서는 85 ℃ 1 분 이상의 가열이나 하이포아염소산나트륨에 의한 처리가 권장되었다. 그러나, 하이포아염소산나트륨은, 금속에 대한 부식 작용, 피부에 대한 자극 작용, 의류 등에 대한 표백 작용이 있기 때문에 실제상의 사용은 제한된다. 그 때문에, 하이포아염소산나트륨을 대신할 불활화제의 개발이 요망되고 있다.
이에 비해서, 노로 바이러스 불활화제의 유효 성분으로서 감 탄닌 추출물 (감 탄닌) (특허문헌 1), 포도의 종자 등에 함유되는 프로안토시아니딘 (특허문헌 2) 등이 제안되어 있다.
즉, 특허문헌 1 에는, 감 탄닌 추출물의 2 분간의 적용에 의한 바이러스 게놈 RNA 수의 억제율이 86 ∼ 99 ％ 가 되고, 또, 특허문헌 2 에는, 프로안토시아니딘의 50 ％ 배양 세포 감염 농도법에 의한 대조에 대한 감염가 (logTCID50/㎖) 가, 작용 시간 1 분인 경우에 3 이었던 것이 기재되어 있다. 그러나, 모두, 노로 바이러스를 충분히 불활화하기에는 이르지 못하고, 노로 바이러스의 강한 감염력을 감안하면, 보다 강한 불활화 효과를 갖는 새로운 불활화제의 개발이 요망되고 있다.
일본 특허 5092145호 일본 공개특허공보 2013-47196호
본 발명의 과제는, 노로 바이러스를 효과적으로 불활화하는 기술을 제공하는 것에 있다.
본 발명자는, 의외로 라이소자임 및/또는 그 염, 그리고 이것들의 변성물 중 적어도 1 종이 노로 바이러스에 대해서 우수한 불활화 작용을 갖는 것을 알아내고, 본 발명을 생각하기에 이르렀다.
1. 본 발명의 1 종류에 관련된 노로 바이러스 불활화제는, 라이소자임 및/또는 그 염, 그리고 이것들의 변성물에서 선택되는 적어도 1 종인 라이소자임류를 함유한다.
2. 상기 1 에 기재된 노로 바이러스 불활화제는, 상기 라이소자임류의 함유량이 0.05 질량％ 이상일 수 있다.
3. 상기 1 또는 2 에 기재된 노로 바이러스 불활화제는, 상기 라이소자임류는, 하기 정의에 의해서 규정되는 형광 강도가 4,000 이상일 수 있다.
형광 강도 : 상기 라이소자임류의 농도가 고형분 환산으로 0.05 질량％ 가 되며, 또한 인산염의 농도가 0.2 M 이 되도록 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 희석하여 얻어지는 희석액 5 ㎖ 에 8 mM 의 1,8-아닐리노나프탈렌술폰산의 메탄올 용액 25 ㎕ 를 첨가하여 얻어지는 액을 30 분간 실온에서 반응시킨 후의 그 액에 대해서, 여기 파장 390 ㎚ (여기 밴드 폭 10 ㎚) 및 형광 파장 470 ㎚ (형광 밴드 폭 10 ㎚) 의 조건에서 측정된 형광 강도
4. 상기 1 ∼ 3 중 어느 하나에 기재된 노로 바이러스 불활화제는, 상기 라이소자임류는, 하기에 규정되는 항노로 바이러스 활성이 2.0 이상일 수 있다.
항노로 바이러스 활성 : 노로 바이러스액과 상기 라이소자임류의 2 질량％ 수용액을 등량 혼합하여 얻어진 노로 바이러스 혼합액을 실온에서 1 분간 방치했을 때의, 방치 전의 감염가의 대수에서 방치 후의 감염가의 대수를 뺀 값
5. 상기 1 ∼ 4 중 어느 하나에 기재된 노로 바이러스 불활화제로서 액제일 수 있다.
6. 본 발명의 1 종류에 관련된 노로 바이러스의 불활화 방법은, 라이소자임 및/또는 그 염, 그리고 이것들의 변성물에서 선택되는 적어도 1 종인 라이소자임류를 사용하여 노로 바이러스를 불활화하는 공정을 포함할 수 있다.
7. 본 발명의 1 종류에 관련된 노로 바이러스 불활화용 라이소자임류의 제조 방법은, 상기 1 ∼ 5 중 어느 하나에 기재된 노로 바이러스 불활화제에 함유되는 노로 바이러스 불활화용 라이소자임류의 제조 방법으로서, 라이소자임 및/또는 그 염을 가열 변성하는 공정을 포함한다.
8. 본 발명의 1 종류에 관련된 노로 바이러스 불활화제의 제조 방법은, 라이소자임 및/또는 그 염, 그리고 이것들의 변성물에서 선택되는 적어도 1 종인 라이소자임류를 함유시키는 공정을 포함한다.
9. 본 발명의 1 종류에 관련된 노로 바이러스 불활화제의 제조 방법은, 상기 8 에 기재된 노로 바이러스 불활화제의 제조 방법으로서, 라이소자임 및/또는 그 염을 가열 변성시켜서 가열 변성물을 얻는 공정, 그리고, 그 가열 변성물을 함유하는 노로 바이러스 불활화제를 얻는 공정을 포함한다.
10. 상기 9 에 기재된 노로 바이러스 불활화제의 제조 방법으로서, 상기 가열 변성물을 얻는 공정은, 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 초과이고, pH 가 5.0 이상 7.0 이하이며, 또한, 라이소자임 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.5 질량％ 이상 7 질량％ 이하인 라이소자임 및/또는 그 염의 수용액을, 그 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 가 될 때까지 가열하는 제 1 가열 공정과, 상기 제 1 가열 공정 후에, 상기 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 미만인 극소치까지 가열한 후, 70 ％ 가 될 때까지 그 수용액을 가열하는 제 2 가열 공정과, 상기 제 2 가열 공정 후에, 상기 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 를 초과하는 상태에서 그 수용액을 추가로 가열하는 제 3 가열 공정을 포함할 수 있다.
11. 상기 10 에 기재된 노로 바이러스 불활화제의 제조 방법으로서, 상기 제 3 가열 공정의 가열 조건이, 그 제 3 가열 공정에서 얻어진 수용액을 0.45 ㎛ 의 멤브레인 필터로 여과한 것과 에탄올을 질량비로 1 : 1 의 비율로 혼합했을 때에 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 85 ％ 이상이 될 때까지 가열하는 조건일 수 있다.
12. 상기 10 또는 11 에 기재된 노로 바이러스 불활화제의 제조 방법으로서, 상기 제 3 가열 공정 후에, 상기 수용액을 분무 건조 또는 동결 건조시켜, 분말상의 상기 가열 변성물을 얻는 공정을 추가로 포함할 수 있다.
13. 본 발명의 1 종류에 관련된 노로 바이러스 감염의 예방약 또는 치료약은, 라이소자임 및/또는 그 염, 그리고 이것들의 변성물에서 선택되는 적어도 1 종인 라이소자임류를 함유한다.
14. 본 발명의 1 종류에 관련된 노로 바이러스 불활화용 피부 외용제는, 라이소자임 및/또는 그 염, 그리고 이것들의 변성물에서 선택되는 적어도 1 종인 라이소자임류를 함유한다.
15. 본 발명의 1 종류에 관련된 라이소자임류는, 노로 바이러스의 불활화에 사용되는, 라이소자임 및/또는 그 염, 그리고 이것들의 변성물에서 선택되는 적어도 1 종이다.
본 발명의 노로 바이러스 불활화제에 함유되는 라이소자임 및/또는 그 염, 그리고 이것들의 변성물에서 선택되는 적어도 1 종인 라이소자임류는, 노로 바이러스에 대해서 우수한 불활화 작용을 갖고, 특히, 가열 변성물은 1 분 이내라는 매우 짧은 작용 시간에 노로 바이러스를 불활화시킬 수 있다. 또, 라이소자임은, 종전부터, 식품의 보존을 향상시키는 식품 첨가물로서 사용되고, 염화라이소자임은 소염제로서 사용되고 있는 점에서, 본 발명의 노로 바이러스 불활화제는 안전하게 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 노로 바이러스 불활화제, 본 발명의 노로 바이러스의 불활화 방법, 본 발명의 노로 바이러스 감염의 예방약 또는 치료약, 본 발명의 노로 바이러스 불활화용 피부 외용제는, 노로 바이러스의 증식 저해, 사멸화, 노로 바이러스 감염의 예방, 감염의 확대 방지, 및 감염의 치료에 유용해진다.
특히, 라이소자임 혹은 그 염, 또는 이것들의 변성물을 저급 알코올이나 다가 알코올 등의 알코올 함유 액체와 혼합하여 얻어지는 노로 바이러스 불활화제에 의하면, 알코올에 의한 제균 효과와, 상기 라이소자임류에 의한 노로 바이러스 불활화 효과의 쌍방을 발휘하기 때문에, 일상적으로 주거 환경의 살균과 노로 바이러스의 불활화를 행할 수 있다.
또, 본 발명의 노로 바이러스 불활화제의 제조 방법에 의하면, 노로 바이러스 불활화제를 간편하게 제조할 수 있고, 노로 바이러스 불활화용 라이소자임류의 제조 방법에 의하면, 노로 바이러스 불활화 효과가 매우 높은 라이소자임류를 제조할 수 있다.
도 1 은, 본 발명의 노로 바이러스 불활화제의 제조 방법에 있어서, 라이소자임의 가열 변성물을 얻는 공정에서, 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정에서의 가열 시간과 투과율의 관계를 모식적으로 나타내는 도면이다.
도 2 는, 본 발명의 일 실시예에서 얻어진 라이소자임류 (라이소자임 및/또는 그 염의 변성물) 의 전기 영동 (SDS-PAGE) 결과를 나타내는 사진이다.
도 3(a) 는, 노로 바이러스의 전자 현미경 사진이고, 도 3(b) 는, 라이소자임류 (80 ℃ 에서 180 분간의 가열에 의해서 얻어진 라이소자임 변성물) 의 전자 현미경 사진이고, 도 3(c) 는, 접촉 개시부터 1 분 시점에 있어서의, 노로 바이러스 및 라이소자임류 (라이소자임 변성물) 의 전자 현미경 사진이다.
도 4(a) 는, 접촉 개시부터 1 시간 시점에 있어서의, 노로 바이러스 및 라이소자임류 (80 ℃ × 180 분간의 가열에 의해서 얻어진 라이소자임 변성물) 의 전자 현미경 사진이고, 도 4(b) 는, 접촉 개시부터 1 분 시점에 있어서의, 노로 바이러스 및 라이소자임류 (비가열 라이소자임) 의 전자 현미경 사진이다.
도 5 는, 인간 노로 바이러스와 본 발명의 라이소자임류 (100 ℃ × 40 분간) 를 1 시간 접촉 후, 인간 노로 바이러스 유전자량을 리얼타임 PCR 법으로 분석한 결과이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다. 또한, 본 발명에 있어서, 특별하게 언급하지 않는 이상,「부」는「질량부」를 의미하고,「％」는「질량％」를 의미한다.
<발명의 개요>
본 발명의 노로 바이러스 불활화제는, 라이소자임 및/또는 그 염, 그리고 이것들의 변성물에서 선택되는 적어도 1 종 (이하,「라이소자임류」로 약기하는 경우도 있다) 을 함유한다. 라이소자임류는 노로 바이러스의 불활화에 사용된다. 즉, 본 발명의 노로 바이러스 불활화제는, 라이소자임 및/또는 그 염, 그리고 이것들의 변성물 (이하, 라이소자임 및/또는 그 염의 변성물을「라이소자임 변성물」로 약기하는 경우도 있다) 중 1 종 또는 2 종 이상을 함유할 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 노로 바이러스 불활화제는, 라이소자임류 (예를 들어, 라이소자임 혹은 그 염, 또는 이것들의 변성물) 를 유효 성분으로 할 수 있다. 이 노로 바이러스 불활화제는, 노로 바이러스의 소독제, 노로 바이러스 감염의 예방약 또는 치료약 등으로서 사용할 수 있다. 또, 사용 형태에 따라서 외용제로도 경구제로도 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서,「노로 바이러스의 불활화 (deactivate)」란, 소장의 상피 세포에 감염되어, 증식하는 점에서, 구토나 설사 등의 증상을 일으키는 노로 바이러스의 활성을 저하시키는 것을 말하고, 노로 바이러스를 사멸시켜 활성을 저하시킬 뿐만 아니라, 노로 바이러스가 생존한 상태에서 활성만 저하시키는 것을 포함한다.
<라이소자임 및/또는 그 염>
본 발명에 있어서,「라이소자임」이란, N－아세틸글루코사민과 N－아세틸뮤람산의 β-1,4 결합을 가수분해하는 성질을 갖는 단백질을 말한다.
본 발명의 노로 바이러스 불활화제에 함유시킬 수 있는 라이소자임은, 알, 동물의 조직, 체액, 식물 등 생물계에 널리 존재하고, 기질 특이성과 구조로부터 크게 이하의 5 종의 패밀리로 분류된다. 또, 라이소자임 및/또는 그 염을 라이소자임 변성물의 원료로서 사용할 수 있다.
1. 라이소자임 (세균형)
2. 라이소자임 (닭형)
3. 라이소자임 (거위형)
4. 라이소자임 (살균 바이러스형 ; V 타입)
5. 라이소자임 (CH 형)
본 발명에서는 5 종의 패밀리 모두 사용할 수 있다. 이들 라이소자임중에서도, 본 발명에서 사용하는 라이소자임류로서, 그리고, 라이소자임 변성물의 원료로는, 식품 첨가물 등으로서 널리 사용되고 있는 관점에서, 난백 라이소자임, 인간 라이소자임 등의 라이소자임 (닭형) 이 바람직하고, 추가로 저비용이며 또한 입수 용이한 점에서, 난백 라이소자임 및/또는 그 변성물인 것이 특히 바람직하다.
또, 라이소자임의 염으로는, 식품 첨가물로서 허용 가능하거나 또는 약학적으로 허용 가능한 염을 들 수 있고, 예를 들어, 염산, 탄산, 인산, 붕산, 헥사메타인산, 질산, 황산 등의 무기산의 염, 시트르산, 타르타르산, 숙신산, 말산, 아세트산, 글루타민산, 글리세로인산, 글루콘산 등의 유기산의 염을 들 수 있다. 라이소자임의 염 중에서도, 무기산의 염이 바람직하고, 소염제로서 널리 사용되어, 안전성이 확립되어 있는 점에서, 염화라이소자임 등의 염산염이 보다 바람직하다.
라이소자임 및/또는 그 염의 변성 방법으로는, 가열 처리, 산 처리, 알칼리 처리, 효소 처리, 유기 용제 처리, 계면 활성제 처리, 산화 처리, 환원 처리, 고압력 처리 등을 들 수 있다. 이들 변성 처리는 단독 혹은 병용하여 행할 수 있다. 또한, 라이소자임 변성물에는, 라이소자임 및/또는 그 염을 분해 처리한 라이소자임 유래 펩티드도 포함된다.
라이소자임류 중에서도, 노로 바이러스의 불활화 효과의 관점에서, 라이소자임 및/또는 그 염을 가열 변성한 것 (이하, 간단히「가열 변성물」이라고도 한다) 이 바람직하다. 가열 변성물은, 비가열의 라이소자임 및/또는 그 염에 비교하여 단시간에 노로 바이러스를 불활화시킬 수 있다. 그래서, 본 발명은, 노로 바이러스 불활화용 라이소자임의 제조 방법으로서, 라이소자임 및/또는 그 염을 가열 변성하는 방법도 포함한다.
가열 변성은, 라이소자임 및/또는 그 염의 변성이 적절히 행해지고 있으면 가열 조건을 특별히 한정하는 것은 아니지만, 라이소자임 및/또는 그 염을 50 ℃ 이상 130 ℃ 이하, 바람직하게는 60 ℃ 이상, 보다 바람직하게는 70 ℃ 이상에서 가열하는 것이 바람직하다.
가열 변성의 방법으로는, 라이소자임 및/또는 그 염을 용매에 용해시켜 가열해도 되고, 분말인 채로 가열해도 되며, 라이소자임 및/또는 그 염을 용해시켜 가열했을 경우, 가열 시간은 라이소자임 가열 온도에 따라서 결정할 수 있고, 1 분 이상 720 분 이하여도 된다. 분말인 채 가열할 경우, 가열 시간은 1 일 이상 30 일 미만인 것이 바람직하다. 또한, 상기 용매는, 라이소자임 및/또는 그 염을 용해시킬 수 있는 용매이면 한정되지 않는데, 예를 들어, 물이나, 물을 함유하는 유기 용매이어도 된다.
<가열 변성물을 얻는 공정>
상기 가열 변성물을 얻는 공정은, 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 초과 (바람직하게는 80 ％ 이상, 보다 바람직하게는 90 ％ 이상, 통상적으로 100 ％ 이하) 이고, pH 가 5.0 이상 7.0 이하이며, 또한, 라이소자임 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.5 질량％ 이상 7 질량％ 이하인 라이소자임의 수용액을, 그 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 가 될 때까지 가열하는 제 1 가열 공정 (이하, 간단히「제 1 가열 공정」이라고도 한다) 과, 상기 제 1 가열 공정 후에, 그 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 미만인 극소치까지 가열한 후, 70 ％ 가 될 때까지 그 수용액을 가열하는 제 2 가열 공정 (이하, 간단히「제 2 가열 공정」이라고도 한다) 과, 상기 제 2 가열 공정 후에, 상기 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 를 초과하는 상태에서 그 수용액을 추가로 가열하는 제 3 가열 공정 (이하, 간단히「제 3 가열 공정」이라고도 한다) 을 포함한다. 상기 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정에 의해서 라이소자임 변성물을 얻을 수 있다.
상기 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정에 의해서, 상기 정의로 규정되는 형광 강도가 4,000 이상인 라이소자임 변성물을 얻을 수 있다.
[가열의 메커니즘]
도 1 은, 본 실시 형태에 관련된 라이소자임 변성물의 제조 방법에 있어서, 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정에서의 가열 시간과 투과율의 관계를 모식적으로 나타내는 도면이다. 본 발명자들은, 라이소자임을 함유하는 수용액을 가열할 때, 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 가열 시간에 따라서, 도 1 에 나타내는 바와 같이 변화하는 것을 알아내었다. 당해 투과율의 변화는, 얻어지는 라이소자임 변성물의 표면 소수성의 변화 (주로, 표면 소수성의 증가) 및 수용성의 변화 (수용성의 저하 및 이것에 계속되는 수용성의 증가) 에서 기인된다고 추측된다.
[제 1 가열 공정]
도 1 에 나타내는 바와 같이, 제 1 가열 공정에 의해서, 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 초과인 수용액에 있어서의 그 광의 투과율이 저하되어 70 ％ 가 되는 것은, 그 수용액의 투과율이 저하되는 것을 의미하고, 예를 들어, 육안으로 그 수용액의 백탁을 확인할 수 있다.
즉, 제 1 가열 공정에서는, 상기 수용액 중의 라이소자임의 입체 구조 및/또는 라이소자임 표면의 표면 소수성이 상승하고, 소수성 부분이 수축 응집되어, 상기 수용액 중의 라이소자임의 용해성이 저하되는 결과, 그 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 초과에서 70 ％ 로 저하된다고 추측된다.
(원료)
제 1 가열 공정에 있어서 수용액 중에서 사용하는, 원료인 라이소자임 및/또는 그 염은, 상기 서술한 <라이소자임 및/또는 그 염> 의 란에서 예시한 라이소자임 및/또는 그 염을 사용할 수 있다. 저비용이고 입수 용이한 점에서, 원료인 라이소자임 및/또는 그 염은 난백 라이소자임인 것이 바람직하다.
(원료의 농도)
라이소자임의 입체 구조를 확실하게 변화시킬 수 있으며, 또한, 라이소자임의 응집을 방지하여, 노로 바이러스의 불활화 작용을 높일 수 있는 점에서, 제 1 가열 공정에 있어서, 수용액 중의 라이소자임의 농도는 1 질량％ 이상인 것이 바람직하고, 한편, 5 질량％ 이하인 것이 바람직하다.
(라이소자임 및/또는 그 염의 수용액)
라이소자임 및/또는 그 염의 수용액을 구성하는 용매는 물이지만, 라이소자임 및/또는 그 염의 물에 대한 용해성에 영향을 주지 않는 범위에서 물과 혼화하는 유기 용매를 사용해도 된다. 라이소자임 및/또는 그 염의 수용액을 구성하는 용매에 있어서의 물의 비율은, 통상적으로 80 질량％ 이상 100 질량％ 이하이다. 또, 라이소자임 및/또는 그 염의 수용액을 구성하는 용매가, 물과 혼화하는 유기 용매를 함유하는 경우, 라이소자임 및/또는 그 염의 수용액을 구성하는 용매에 있어서의 그 유기 용매의 비율은 통상적으로 1 질량％ 이상 20 질량％ 이하이다.
상기 유기 용매로는, 물과 혼화하는 유기 용매이면 되고, 예를 들어, 메탄올, 에탄올, 1-프로판올, 2-프로판올, 에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린 등의 알코올계 용매, 아세톤, 메틸에틸케톤 등의 케톤계 용매, 아세토니트릴, 테트라하이드로푸란, 1,4-디옥산 등을 들 수 있고, 이것들을 단독으로 또는 2 종 이상을 조합하여 사용할 수 있다.
(pH)
라이소자임의 응집을 방지할 수 있으며, 또한, 얻어지는 라이소자임 변성물의 표면 소수성을 높일 수 있는 점에서, 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정에 있어서, 상기 수용액의 pH 는 5.5 이상인 것이 보다 바람직하고, 한편, 6.5 이하인 것이 보다 바람직하다.
또, 필요에 따라서, 산 (예를 들어, 염산, 황산, 질산 등의 무기산, 시트르산, 아세트산, 인산 등의 유기산), 알칼리 (예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨 등의 무기 염기) 또는 완충액 (예를 들어, 아세트산 완충액) 을 사용하여, 상기 수용액을 상기 범위의 pH 로 조정해도 된다.
예를 들어, 라이소자임이 라이소자임의 염 (예를 들어, 염화라이소자임) 인 경우, 산, 알칼리 또는 완충액을 사용하여, 수용액의 pH 를 상기 범위의 pH 로 조정한 후, 제 1 가열 공정을 행하는 것이 바람직하다.
[제 2 가열 공정]
제 2 가열 공정에 있어서, 제 1 가열 공정에서 얻어진 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 내지 70 ％ 미만 (바람직하게는 60 ％ 미만, 보다 바람직하게는 50 ％ 미만, 통상적으로 0 ％ 이상) 의 극소치까지 가열한 후, 70 ％ 가 될 때까지 가열함으로써, 제 1 가열 공정에서 얻어진 수용액의 광의 투과율이 더욱 저하되고 (그 결과, 육안으로 수용액의 백탁 및/또는 침전을 확인할 수 있다), 그 후, 그 투과율이 증가로 바뀌어, 그 백탁 및/또는 침전이 점차 소실되는 것 (그 결과, 육안으로 점차 투명하게 되어 가는 것을 확인할 수 있다) 을 확인할 수 있다.
즉, 제 2 가열 공정에서는, 상기 수용액 중의 라이소자임의 입체 구조가 더욱 변화되어, 라이소자임의 표면 소수성이 더욱 높아짐에 따라서, 라이소자임의 수용성이 일단 저하된 후에 높아지는 결과, 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 로 된다고 추측된다.
제 2 가열 공정에 있어서 라이소자임의 표면 소수성이 더욱 높아짐에 따라서, 라이소자임의 수용성이 일단 저하된 후에 높아지는 메커니즘은 명확하지 않지만, 제 2 가열 공정에 의해서, 제 1 가열 공정에 있어서 응집된 라이소자임끼리가 결합되어 선상의 응집체로 변화되고, 이 응집체가 상기 수용액에 용해되기 때문에, 상기 수용액 중의 라이소자임의 용해성이 상승하기 때문으로 추측된다.
제 2 가열 공정은 제 1 가열 공정 후에 계속적으로 행할 수 있다. 즉, 제 2 가열 공정은 제 1 가열 공정과 연속적으로 행할 수 있다.
[제 3 가열 공정]
제 3 가열 공정에서는, 상기 수용액 중의 라이소자임의 입체 구조가 더욱 변화되어, 라이소자임의 수용성을 유지한 상태에서, 라이소자임의 표면 소수성이 더욱 높아지는 결과, 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 를 초과하는 값을 유지할 수 있다고 추측된다.
보다 구체적으로는, 제 3 가열 공정에 있어서는, 그 수용액 중에 백탁 및/또는 침전이 발생되지 않는 (그 수용액의 투과율 (투명성) 이 유지되고 있는) 것이 바람직하다.
상기 수용액 중의 라이소자임의 입체 구조를 보다 확실하게 변화시킬 수 있는 점에서, 제 3 가열 공정은, 그 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 75 ％ 이상이 될 때까지 가열하는 것이 보다 바람직하고, 80 ％ 이상이 될 때까지 가열하는 것이 보다 바람직하다 (통상적으로 100 ％ 이하이다).
또한, 제 3 가열 공정은, 제 3 가열 공정에서 얻어진 수용액을 0.45 ㎛ 의 멤브레인 필터로 여과한 것과 에탄올을 질량비로 1 : 1 의 비율로 혼합했을 때, 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 85 ％ 이상이 될 때까지 가열하는 것이 바람직하고, 90 ％ 이상이 될 때까지 가열하는 것이 보다 바람직하다 (통상적으로 100 ％ 이하이다).
제 3 가열 공정에서 얻어진 수용액을 0.45 ㎛ 의 멤브레인 필터로 여과한 것과 에탄올을 질량비로 1 : 1 의 비율로 혼합했을 때, 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 85 ％ 이상이 되는 것은, 상기 정의로 규정되는 형광 강도가 4,000 이상인 라이소자임 변성물이 얻어진 지표로 할 수 있다.
제 3 가열 공정은 제 2 가열 공정 후에 계속하여 행할 수 있다. 즉, 제 3 가열 공정은 제 1 가열 공정 및 제 2 가열 공정과 연속적으로 행할 수 있다.
제 3 가열 공정에 있어서, 상기 투과율이 70 ％ 를 초과하는 상태에서 가열된 (투명화한) 수용액은, 실온 (예를 들어 25 ℃) 으로 되돌려도 그 투과율을 유지할 수 있다 (투명성을 유지할 수 있다). 그 원인으로는, 그 수용액 중에 함유되는 라이소자임 등의 형태 (입체 구조) 가 실온에서도 유지되고 있기 때문으로 추측된다.
(가열 온도 및 가열 시간)
본 실시 형태에 관련된 노로 바이러스 불활화제의 제조 방법 (라이소자임 변성물의 제조) 에 있어서, 높은 수율을 달성할 수 있으며, 또한, 그 수용액을 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정에서 각각 규정되는 투과율로 조정할 수 있는 점에서, 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정에 있어서의 그 수용액의 중심 품온 (品溫) 을 70 ℃ 이상이 되도록 가열하는 것이 바람직하고, 가열 시간이 짧기 때문에 제조 시간을 단축할 수 있는 점에서 80 ℃ 이상이 보다 바람직하고, 90 ℃ 이상이 더욱 바람직하다 (130 ℃ 이하여도 되고, 약 100 ℃ 이하여도 된다). 또한, 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정에 있어서의 가열 시간은, 가열 온도 및 처리량에 따라서 각 공정에서 규정하는 투과율을 만족하도록 적절히 결정할 수 있다.
제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정을 동일한 가열 온도에서 연속하여 행할 경우, 제 1 가열 공정에 있어서의 가열 시간 및 제 2 가열 공정에 있어서의 및 제 3 가열 공정에 있어서의 가열 시간은, 합계로 중심 품온이 70 ℃ 이상 75 ℃ 이하인 경우에는 125 분간 이상 720 분간 이하, 중심 품온이 75 ℃ 초과 80 ℃ 이하인 경우에는 80 분간 이상 435 분간 이하, 중심 품온이 80 ℃ 초과 85 ℃ 이하인 경우에는 70 분간 이상 305 분간 이하, 중심 품온이 85 ℃ 초과 90 ℃ 이하인 경우에는 50 분간 이상 240 분간 이하, 중심 품온이 90 ℃ 초과 95 ℃ 이하인 경우에는 40 분간 이상 185 분간 이하, 중심 품온이 95 ℃ 초과 100 ℃ 이하인 경우에는 25 분간 이상 120 분간 이하, 중심 품온이 100 ℃ 초과인 경우에는 10 분간 이상 120 분간 이하인 것이 바람직하다.
(분무 건조/동결 건조)
또한, 본 발명의 라이소자임 변성물의 제조 방법에 있어서, 상기 제 3 가열 공정 후에, 상기 수용액을 분무 건조 또는 동결 건조시켜, 분말상의 라이소자임 변성물을 얻는 공정을 추가로 포함할 수 있다.
분무 건조 및 동결 건조는, 통상적인 방법에 준거하여 행하면 된다.
<노로 바이러스 불활화 작용>
본 발명에 있어서, 노로 바이러스 불활화 작용은, 후술하는 실시예에 기재된 방법 (즉, 노로 바이러스를 감염시킨 마우스 세포) 을 사용한 계에 의해서 평가할 수 있다.
(형광 강도)
본 발명의 라이소자임류는, 표면 소수성이 보다 높고, 노로 바이러스의 불활화 작용이 보다 우수한 점에서, 하기 정의에 의해서 규정되는 라이소자임류 (라이소자임 및/또는 그 염의 변성물 (이하,「라이소자임 변성물」이라고 표기하는 경우도 있다), 보다 구체적으로는, 라이소자임 변성물의 형광 강도가 4,000 이상인 것이 바람직하고, 5,000 이상인 것이 보다 바람직하며, 통상적으로 10,000 이하이다. 또한, 본 발명에 있어서「실온」이란 20 ℃ 이상 25 ℃ 이하를 말한다.
형광 강도 : 상기 라이소자임류의 농도가 고형분 환산으로 0.05 질량％ 가 되며, 또한 인산염의 농도가 0.2 M 이 되도록 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 희석하여 얻어지는 희석액 5 ㎖ 에 8 mM 의 1,8-아닐리노나프탈렌술폰산의 메탄올 용액 25 ㎕ 를 첨가하여 얻어지는 액을 30 분간 실온에서 반응시킨 후의 그 액에 대해서, 여기 파장 390 ㎚ (여기 밴드 폭 10 ㎚) 및 형광 파장 470 ㎚ (형광 밴드 폭 10 ㎚) 의 조건에서 측정된 형광 강도
본 발명에서 규정되는 라이소자임류의 형광 강도는, 라이소자임류의 표면 소수성의 지표이다. 즉, 본 발명에서 규정되는 라이소자임류의 형광 강도가 높을수록, 라이소자임류의 표면 소수성이 높다고 할 수 있다. 또, 라이소자임류의 표면 소수성이 높을수록, 노로 바이러스의 불활화 효과 (항노로 바이러스 활성) 가 우수한 경향이 있다.
본 발명자들은, 라이소자임류의 표면 소수성이 높을수록, 노로 바이러스의 불활화 작용이 높은 경향이 있는 것을 알아내었다. 그 중에서도, 라이소자임 가공품 및/또는 그 염인 본 발명의 라이소자임 변성물은, 노로 바이러스의 불활화 작용이 보다 우수하다는 특징을 갖는다. 또한, 본 발명에 있어서,「라이소자임 가공품」이란, 라이소자임 변성물로서, 라이소자임 및/또는 그 염과는 상이한 입체 구조를 갖는 것을 말한다.
본 발명의 라이소자임 가공품 및/또는 그 염이, 우수한 노로 바이러스의 불활화 작용을 갖는 원인은 명확하지 않지만, 첫 번째로, 표면 소수성을 갖는 라이소자임 가공품 및/또는 그 염이, 노로 바이러스의 소수성 부위에 결합하기 쉬운 것, 두 번째로, 라이소자임 가공품 및/또는 그 염은, 라이소자임 변성물로서, 변성에 의해서, 라이소자임이 갖는 S-S 결합의 적어도 일부가 개열하여 얻어지는 티올기 (-SH) 를 라이소자임 가공품이 함유하고 있고, 이 티올기가 노로 바이러스의 표면에 존재하는 S-S 결합과 결합하고 있는 것, 세 번째로, 라이소자임 가공품 및/또는 그 염이, 노로 바이러스에 결합하기 쉬운 입체 구조를 갖는 것이 추측된다.
또한, 라이소자임류의 농도가 고형분 환산으로 0.05 질량％ 이고, 인산염의 농도가 0.2 M 이 되도록 인산 완충액으로 희석한다는 것은, 구체적으로는, 예를 들어, 라이소자임류를 고형분 환산으로 1 질량％ 함유하는 수용액의 형광 강도를 측정할 경우, 상기 수용액 5 g 과 0.25 M 의 인산 완충액 80 ㎖ 를 100 ㎖ 의 메스 플라스크에 넣은 후, 정제수로 100 ㎖ 로 메스 업함으로써 조정되는 것을 말한다.
본 발명에 있어서, 라이소자임류의 형광 강도는, Canadian Institute of Food Science and Technology 1985 Vol.18 No.4, p.290 - 295 에 기재된 방법으로 측정된 값이다. 또한, 본 발명에 있어서의 라이소자임류의 형광 강도의 측정에 사용하는 인산 완충액은, 인산이수소나트륨 및 인산수소이나트륨으로 조제된 것이다. 또, 본 발명에 있어서의 라이소자임류의 형광 강도는, 0.2 M 인산 완충액 (pH 7.0, 인산염으로서 인산이수소나트륨 및 인산수소이나트륨을 함유한다) 의 형광 강도를 블랭크 값으로 해서 별도 측정하고, 그 블랭크 값을 공제한 값이다.
보다 구체적으로는, 라이소자임류의 형광 강도는, 니혼 분광 주식회사 제조, 형명 FP-8500 형광 분광 광도계를 사용하여, 여기 파장 390 ㎚, 여기 밴드 폭 10 ㎚, 형광 파장 470 ㎚, 형광 밴드 폭 10 ㎚, 리스폰스 0.5 sec, 감도 Low (약 270 ± 10 V) (전원 주파수 (50/60 ㎐)), 페리스타시퍼 SHP-820 형 사용의 조건으로 측정했을 때의 값이다. 또한, 다른 형광 분광 광도계 (예를 들어, 주식회사 히타치 제작소 제조, 형명 F-2000 형광 분광 광도계) 를 사용하여 측정할 수도 있지만, 그 때는 감도 등의 측정 조건을 본원에서 규정하는 조건으로 맞출 필요가 있다.
(항노로 바이러스 활성)
상기 라이소자임류는, 하기에 규정되는 항노로 바이러스 활성이 2.0 이상인 것이 바람직하다.
항노로 바이러스 활성 : 노로 바이러스액과 상기 라이소자임류의 2 질량％ 수용액을 등량 혼합하여 얻어진 노로 바이러스 혼합액을 실온에서 1 분간 방치했을 때의, 방치 전의 감염가의 대수에서 방치 후의 감염가의 대수를 뺀 값
(이량체 및 삼량체)
상기 라이소자임류 (라이소자임 변성물, 보다 구체적으로는, 라이소자임 가공품 및/또는 그 염) 는, 약 29 KDa (KDa ＝ 103 Da) 의 단백질 및/또는 약 36.5 KDa 의 단백질을 함유할 수 있다. 즉, 본 발명의 노로 바이러스 불활화제는, 약 29 KDa 의 단백질 및/또는 약 36.5 KDa 의 단백질을 함유할 수 있다. 본 발명의 노로 바이러스 불활화제 그리고 상기 라이소자임류 중에 약 29 KDa 의 단백질 및/또는 약 36.5 KDa 의 단백질이 함유되어 있는 것은, 후술하는 실시예에 나타내는 전기 영동에 의해서 확인할 수 있다. 또한, 전기 영동은 시판되는 전기 영동 키트를 사용하여 행할 수 있다.
약 29 KDa 의 단백질은 라이소자임 변성물의 이량체로 추측되고, 약 36.5 KDa 의 단백질은 라이소자임 변성물의 삼량체로 추측된다.
본 발명의 노로 바이러스 불활화제에 있어서, 약 29 KDa 의 단백질 및/또는 약 36.5 KDa 의 단백질이 함유되어 있음으로써, 항노로 바이러스 활성이 높아져 있다.
<라이소자임 및/또는 그 염의 함유량>
본 발명의 노로 바이러스 불활화제에 있어서 라이소자임류의 바람직한 함유량 (고형분 환산) 은, 당해 노로 바이러스 불활화제에 있어서 사용하는 라이소자임의 종류, 노로 바이러스 불활화제의 제형, 사용 양태 등에 따라서 상이하지만, 노로 바이러스 불활화제의 0.05 질량％ 이상이 바람직하고, 0.1 질량％ 이상이 더욱 바람직하며, 0.25 질량％ 이상이 (예를 들어, 0.05 질량％ 이상 100 질량％ 이하) 특히 바람직하다고 할 수 있다. 여기서, 본 발명의 노로 바이러스 불활화제가, 라이소자임류 중 2 종 이상 함유하는 경우, 라이소자임류의 함유량 (고형분 환산) 은 라이소자임류의 합계의 함유량을 말한다.
<배합 소재>
본 발명의 노로 바이러스 불활화제에 있어서, 라이소자임류와 함께 배합하는 배합 소재는, 노로 바이러스 불활화제의 제형 등에 따라서 적절히 선택할 수 있고, 예를 들어, 물 ; 에탄올, 이소프로판올 등의 탄소수 5 이하의 저급 알코올 ; 글리세린, 폴리에틸렌글리콜, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디프로필렌글리콜, 소르비톨 등의 다가 알코올 ; 글리신, 유기산, 글리세린 지방산 에스테르, 자당 지방산 에스테르, 벤조산나트륨, 소르브산나트륨, 프로피온산나트륨, 디하이드로산나트륨, 파라옥시벤조산에스테르, 아황산나트륨, EDTA, 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄, 글루콘클로르헥시딘, 알킬디아미노에틸글리신 염산염, 요오드팅크, 포피돈요오드, 세틸인산화벤잘코늄, 트리클로산, 클로르자일레놀, 이소프로필메틸페놀, ε-폴리리신, 락토페린, 나이신, 박테리오신, 땅두릅 추출물, 때죽나무 추출물, 사철쑥 추출물, 효소 분해 율무 추출물, 이리 단백 추출물, 투야플리신, 펙틴 분해물 등의 정균제 (靜菌劑) 를 적절히 조합하여 사용할 수 있다.
그 중에서도, 물, 저급 알코올 및 다가 알코올의 적어도 1 종을 사용하는 것, 특히 저급 알코올 및 다가 알코올의 적어도 1 종을 함유하는 알코올 제제를 사용함으로써, 알코올에 의한 살균 효과와 라이소자임류에 의한 노로 바이러스 불활화 효과를 겸비할 수 있기 때문에 소독제로서 편리성이 높아진다.
이 외에, 본 발명의 노로 바이러스 불활화제에는, 필요에 따라서 시트르산, 시트르산나트륨, 수산화나트륨, 트리에탄올아민 등의 pH 조정제, 토코페롤아세트산에스테르 등의 산화 방지제, 카르복시비닐 폴리머, 하이드록시에틸셀룰로오스 등의 증점제 등의 첨가제를 배합해도 된다.
<제형>
본 발명의 노로 바이러스 불활화제는, 필요에 따라서 여러 가지 제형을 취할 수 있고, 예를 들어, 액제로 해도 되고, 분말, 정제, 캡슐 등의 고형제로 해도 된다.
액제로 할 경우, 그 점도는 사용 방법에 따라서 적절히 정할 수 있다. 예를 들어, 분무 가능한 점도의 액제로 하고, 트리거 스프레이어, 스퀴즈 용기, 에어 졸 용기 등의 스프레이 용기에 충전함으로써, 손가락, 식품, 조리 기구, 주거 환경, 구토물, 배설물 등에 그 노로 바이러스 불활화제를 함유하는 액적을 분무함으로써, 노로 바이러스의 불활화를 간편하게 행할 수 있고, 노로 바이러스 불활화제를 함유하는 액제에, 불활화의 대상물 (예를 들어, 손가락, 식품, 의료 기기, 의료 기구, 조리 기구, 주거 환경) 을 담금으로써, 노로 바이러스의 불활화를 간편하게 행할 수도 있다. 또, 노로 바이러스 불활화제를 함유하는 액제를 습윤시킨 시트로서 사용할 수 있다. 또한, 로션, 크림 등으로 함으로써 피부 외용제로서 사용할 수 있고, 이로써, 노로 바이러스가 손가락에 부착되어도, 그 자리에서 불활화하여 노로 바이러스가 경구 감염되는 것을 방지하는 감염 예방약으로서 사용할 수 있다.
한편, 고형제로 하는 경우, 예를 들어, 미리 경구 섭취해 둠으로써, 노로 바이러스가 입에 들어갔다고 해도, 그것을 불활화하여 감염을 예방하는 감염 예방약으로서 사용할 수 있고, 또, 노로 바이러스에 의한 감염증이 발증한 경우에도 체내의 노로 바이러스를 불활화하는 치료약으로서 사용할 수 있다. 본 발명의 노로 바이러스 불활화제의 섭취 방법으로는, 예를 들어, 경구 섭취, 좌약, 점적 (點滴), 정맥 주사 등을 들 수 있다.
<노로 바이러스의 불활화 방법>
본 발명은, 라이소자임류를 사용하여, 주거, 식품 공장, 공공 시설, 병원 등의 여러 환경이나 상황에 있어서 노로 바이러스를 불활화하는 방법을 포함한다. 단, 의료 행위로서 노로 바이러스를 불활화하는 경우에는 제외해도 된다.
라이소자임은, 종래부터 식품 첨가물로서 사용되고 있고, 그 라이소자임의 염도 항균제로서 사용되고 있다. 특히, 염화라이소자임은 소염제로서 널리 사용되어 안전성이 확립되어 있다. 따라서, 라이소자임 혹은 그 염, 또는 이것들의 변성물은, 노로 바이러스를 불활화한다고 하는 본 발명의 유효 성분의 특이성이 저해되지 않는 한, 사용 방법에 특별히 제한은 없다.
즉, 상기 서술한 노로 바이러스 불활화제의 제형에 따라서, 노로 바이러스 불활화제를, 노로 바이러스를 불활화하는 대상 영역에 분무 또는 도포하거나, 노로 바이러스를 불활화하는 대상물과 혼합하거나 섭취시키는 등의 방법을 취할 수 있다.
<노로 바이러스 불활화제의 제조 방법>
본 발명은, 노로 바이러스를 불활화하는 유효 성분으로서 라이소자임류를 여러 가지의 고체 또는 액체의 담체에 함유시켜 노로 바이러스 불활화제를 제조하는 방법을 포함한다. 특히, 라이소자임류를, 저급 알코올 및 다가 알코올의 적어도 1 종을 함유하는 액체와 혼합하여 노로 바이러스 불활화제를 제조하는 방법, 그 중에서도, 알코올 제제와 혼합하여 노로 바이러스 불활화제를 제조하는 방법을 포함한다. 이 경우, 라이소자임류를 함유시키는 대상은, 노로 바이러스를 불활화한다고 하는 본 발명의 유효 성분의 특이성이 저해되지 않는 한, 특별히 제한은 없고, 예를 들어, 라이소자임류와 상기 서술한 배합 소재를 혼합하여, 원하는 제형으로 조제하면 된다.
<작용 효과에 대해>
본 발명의 노로 바이러스 불활화제가 유효 성분으로 하는 라이소자임류는, 종래 노로 바이러스 불활화제의 유효 성분으로서 알려져 있는 감 탄닌 추출물 (감 탄닌), 및 포도의 종자 등에 함유되는 프로안토시아니딘과 비교하여, 노로 바이러스에 대해서 우수한 불활화 작용을 갖고, 특히, 가열 변성물은 1 분 이내라는 매우 짧은 작용 시간에 노로 바이러스를 불활화시킬 수 있다. 또, 라이소자임은, 종전부터, 식품의 보존을 향상시키는 식품 첨가물로서 사용되고, 염화라이소자임은 소염제로서 사용되고 있는 점에서, 본 발명의 노로 바이러스 불활화제는 안전하게 사용할 수 있다. 또한, 감 탄닌 추출물 (감 탄닌), 및 포도의 종자 등에 함유되는 프로안토시아니딘은 모두 폴리페놀계·색소계의 물질로서, 분무했을 때에 식기나 기구가 착색되는 등의 문제가 있었지만, 본 발명의 노로 바이러스 불활화제는 백색으로서, 식기나 기구를 착색하지 않기 때문에 폭 넓게 사용할 수 있다.
실시예
이하, 시험예에 의해서 본 발명을 구체적으로 설명한다.
[시험예 1]
[1] 라이소자임 용액의 조제
노로 바이러스 불활화제로서, 난백 (계란 난백) 라이소자임 (큐피 주식회사 제조) 을 증류수에 용해시켜 소정 농도로 한 후, 표 1 에 나타내는 조건으로 가열 처리하고, 공랭시킨 것을 조제하였다 (시험 번호 2 ∼ 14). 또, 동일한 난백 라이소자임 (비가열 라이소자임) 을 물에 용해시키고, 여과 감균을 행함으로써, 농도 10 질량％ 의 라이소자임 용액을 조제하였다 (시험 번호 1). 각 용액의 노로 바이러스 활성을 측정한 결과를 표 1 에 나타낸다.
또한, 각 시험 번호에 있어서의 반응액 (수용액) 의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율은, 흡광 광도계 (형명「UV-2450」, 주식회사 시마즈 제작소 제조) 에 의해서 측정되었다.
시험 번호 8, 9, 11, 13 및 14 에서는, 상기 서술한 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정으로서 기재된, 반응액의 투과율 변화가 확인되었다. 또한, 본 시험예에서는, 제 1 가열 공정, 제 2 가열 공정 및 제 3 가열 공정을 연속하여 행하고 있고, 표 1 의 가열 시간은 제 1, 제 2 및 제 3 가열 공정에 있어서의 가열 시간의 합계이다.
보다 구체적으로는, 시험 번호 8, 9, 11, 13 및 14 의 라이소자임 변성물을 조제할 때의 가열 공정에 있어서, 제 1 가열 공정 전의 반응액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 초과 (99 ％ ∼ 100 ％) 인 것이, 제 1 가열 공정에 의해서, 그 투과율이 저하되어 70 ％ 가 되고, 이어서, 제 2 가열 공정에 의해서, 그 투과율이 더욱 저하되어, 그 제 2 가열 공정에 있어서의 반응액의 투과율의 극소치가 70 ％ 미만 (20 ％ ∼ 30 ％) 이 된 후, 그 투과율이 다시 상승하여, 70 ％ 가 된 후, 계속되는, 제 3 가열 공정에 의해서, 그 투과율이 더욱 상승하여, 최종적으로, 그 제 3 가열 공정 종료 후의 반응액의 투과율이 70 ％ 를 초과하고 있었던 것이 확인되었다.
Figure 112016085533892-pct00001
[2] 감염가의 평가
플라크 어세이법에 의해서, 각 시험 번호의 감염가를 다음과 같이 평가하였다.
(1) 6 웰 플레이트에, 마우스 매크로파지 주화 세포 (RAW264.7 세포) 를 컨플루엔트의 60 ∼ 80 ％ 까지 배양하였다.
(2) 한편, 노로 바이러스의 감염가 (PFU/㎖) 가 106 ∼ 107 PFU/㎖ 정도인 바이러스액을 다음과 같이 하여 조제하였다.
먼저, 마우스 매크로파지 주화 세포 (RAW264.7 세포) 를 컨플루엔트까지 배양하고, 컨플루엔트가 된 세포에 노로 바이러스액 1 ㎖ 를 접종하고, 2 일간, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건 하에서 배양하였다. 이 경우, 노로 바이러스액으로서 Murine norovirus strain1 (MNV-1) (Effect of Food Residues on Norovirus Survival on Stainless Steel Surfaces) 를 사용하였다.
배양 후, 세포가 박리되어 있는 것을 육안으로 확인하고, 동결 융해를 4 회 반복하여 세포를 파괴하고, 세포 중의 바이러스를 방출시켰다. 그 후, 50 ㎖ 원심관에 분주 (分注) 하고, 원심 분리 (8,000 g, 20 분) 를 행하여, 감염가 (PFU/㎖) 가 106 ∼ 107 PFU/㎖ 정도인 노로 바이러스액을 얻었다. 이 노로 바이러스액은 -80 ℃ 에서 보존하고, 해동하여 사용하였다.
(3) 시험 번호 1 ∼ 14 의 라이소자임 용액에 (2) 에서 얻은 노로 바이러스액을 등량 첨가하고, 이것을 시험 번호 1 ∼ 14 의 평가용 샘플로 하였다.
각 평가용 샘플을, 실온에서 소정 반응 시간 (0 분, 1 분 또는 60 분) 으로 방치함으로써 각 평가용 샘플 중의 라이소자임과 노로 바이러스를 반응시켰다.
반응 후, 각 평가용 샘플을 10x 배 희석하여, 희석 샘플로 하였다. 여기서, x 는 정수이고, 후술하는 (8) 에 있어서 육안으로 플라크수를 카운트할 수 있는 수로 한다. 즉, (8) 에서, 플라크수가 10 ∼ 100 정도가 되도록 희석 배율을 조정하였다.
(4) (1) 의 플레이트에 있어서 배양액을 전량 철거하고, 소정 시간 방치 후 희석된 희석 샘플을 500 ㎕/well 로 2 웰씩 접종하였다.
(5) 마우스 매크로파지 주화 세포 (RAW264.7 세포) 가 마르지 않도록 진탕하면서, 실온에서 1 시간 인큐베이트하고, 노로 바이러스를 마우스 매크로파지 주화 세포에 감염시켰다.
(6) 플레이트 상의 500 ㎕/well 의 접종액을 전량 제거하고, 1.5 ％ Sea Plaque Agarose-DMEM (37 ℃) 을 2 ㎖/well 로 중층하고, 그것이 굳어진 후, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건 하에서 2 일간 배양하였다.
(7) 2 일간 배양 후의 플레이트에 염색액인 0.03 ％ 뉴트럴 레드 용액을 2 ㎖/well 로 중층하고, 37 ℃, 5 ％ CO2 조건 하에서 1 시간 인큐베이트하였다.
(8) (7) 의 인큐베이트 후에 0.03 ％ 뉴트럴 레드 용액의 전량을 철거하고, 육안으로 플라크수를 카운트하였다. 얻어진 플라크수와 희석 배율로부터 감염가 (PFU/㎖) 를 산출하였다.
(9) 또, 표 1 에 나타나는 결과를 바탕으로, 이하의 식으로부터, 시험 번호 3 ∼ 14 의 항노로 바이러스 활성을 산출하였다. 그 결과, 형광 강도가 4,000 이상인 시험 번호 8, 9, 11, 13 및 14 의 어느 경우에 있어서도, 이하의 식에서 규정되는 항노로 바이러스 활성은 2 이상인 것이 확인되었다.
항노로 바이러스 활성 ＝ Log10 (1 분간 방치 전의 노로 바이러스 혼합액의 감염가) － Log10 (1 분간 방치 후의 노로 바이러스 혼합액의 감염가)
그 결과, 시험 번호 8, 9, 11, 13 및 14 의 라이소자임 변성물은 모두 노로 바이러스와의 접촉에 의해서, 노로 바이러스의 감염가를 102 분의 1 이하로 저하시킬 수 있어, 노로 바이러스 불활화 효과를 갖는 것이 확인되었다.
또, 라이소자임 변성물 (시험 번호 6) 및 비가열의 라이소자임 (시험 번호 1) 은, 시험 번호 2 의 라이소자임 변성물과 동등한 노로 바이러스의 불활화 효과를 나타내고, 라이소자임 변성물 (시험 번호 5) 은, 시험 번호 2 의 라이소자임 변성물보다 약간 강한 노로 바이러스의 불활화 효과를 나타내었다.
[시험예 2]
시험예 1 에 있어서, 라이소자임의 가열 시간 및 가열온도 그리고 라이소자임 수용액의 농도를 변경하여, 표 2 에 나타내는 형광 강도를 갖는 라이소자임 변성물을 얻었다.
Figure 112016085533892-pct00002
[시험예 3]
본 시험예에서는, 라이소자임 변성물에 대해서 전기 영동을 행하였다. 본 시험예에서는, 시험예 1 에 있어서의 가열 조건 (가열 온도, 가열 시간 및 난백 라이소자임의 농도) 을 변경하여, 라이소자임 변성물을 조제하였다.
보다 구체적으로는, 난백 라이소자임의 2 질량％ 수용액을 가열 온도 80 ℃ 에서 가열 시간 0 분, 15 분, 30 분, 60 분, 90 분, 및 120 분 시점에서 채취한 그 수용액 50 ㎕ 에 샘플 버퍼 950 ㎕ 를 첨가하고, 100 ℃ 에서 10 분간 가열한 후, 빙랭하고, 10 ㎕ (라이소자임 변성물로서 10 ㎍) 를 전기 영동 겔에 차지하였다. 또한, 샘플 버퍼로서 2-메르캅토에탄올을 첨가하지 않은 것 (비환원) 을 사용하였다. 전기 영동의 겔은 SDS-PAGEmini (테프코 주식회사 제조, 겔 농도 4 - 10 ％, 겔 두께 1 ㎜) 를 사용하고, 20 ㎃ 의 정전류로 영동하였다. 염색액에는 쿠마시 블루 R250 을 사용하였다.
도 2 는, 전기 영동의 결과를 나타내는 사진이다. 도 2 에 나타내는 바와 같이, 가열 시간 60 분, 90 분, 및 120 분 시점에서, 약 29 KDa 의 단백질 (이량체로 추측) 및/또는 약 36.5 KDa 의 단백질 (삼량체로 추측) 을 나타내는 밴드가 명확하게 검출되었다. 또, 가열 시간이 길수록, 이들 단백질을 나타내는 밴드가 진해지는 (생성되는 상기 단백질의 양이 증가하는) 것이 확인되었다. 또, 동일한 가열 온도에 있어서는, 가열 시간이 길수록, 그 단백질의 표면 소수성이 증가되어, 노로 바이러스 불활화 작용이 높은 단백질이 얻어지는 것으로 추측된다.
[시험예 4]
본 시험예에서는, 노로 바이러스와 라이소자임류의 접촉을 전자 현미경을 사용하여 촬영하였다.
노로 바이러스 : 노로 바이러스로서, MNV-1 (워싱턴 대학 (Washington University) 의 하바트. W. 버진 박사 (Dr. Herbert W. Virgin) 로부터 공여) 을 사용하였다. 또, 배지 성분을 제거한 노로 바이러스액을 제조하였다. 노로 바이러스액의 제조 방법은 하기와 같다.
시험 샘플 : 난백 라이소자임 2 질량％ 수용액을 각각, 80 ℃ 에서 180 분간 (시험 번호 9) 가열하여 얻어진 라이소자임 변성물을 사용하였다. 가열에는 항온 수조를 사용하였다.
노로 바이러스와 라이소자임 변성물의 접촉 시간은 각각, 1 분간 및 1 시간으로 하였다.
시험 방법 (네이티브 염색법) :
1) 시험 샘플을 파라필름 상에 적하하고, 카본 지지막 상에 2 분간 접촉시켰다.
2) 1) 에서 얻어진 시험 샘플을, 2 질량％ 아세트산우라늄 상에 2 분간 접촉시켰다.
3) 2) 에서 얻어진 시험 샘플로부터 여분의 액체를 여과지로 흡수시켜, 그 시험 샘플을 건조시켰다.
전자 현미경 (JEOL JEM1200EX) 으로 80 ㎸ 에서 전자 현미경 사진을 촬영하였다.
고찰 :
문헌에서는, 노로 바이러스의 크기 (직경) 는 30 ∼ 40 ㎚ 로 되어 있다. 도 3(a) 및 도 4(a) 및 도 4(b) 에 있어서,「NV」는 노로 바이러스를 의미하고, 동그라미로 둘러싼 곳이 노로 바이러스이다.
도 3(a) 에 나타내는 바와 같이, 본 시험예에서는, 직경이 30 ∼ 40 ㎚ 와, 문헌에 기재된 노로 바이러스의 크기와 거의 동일한 크기의 구형의 물체를 관찰할 수 있었다. 크기로부터 판단하여, 이 구형의 물체는 노로 바이러스로 추정된다.
또, 도 3(b) 에 나타내는 바와 같이, 비구형의 일그러진 물체를 관찰할 수 있었다. 라이소자임 (비가열) 은, 크기 (직경) 가 3 ∼ 4 ㎚ 의 입자인 것이 알려져 있다. 이것으로부터, 이들 물체는, 라이소자임이 가열에 의해서 변성되고, 형상이 변화된 것으로 추정된다.
도 3(c) 에 나타내는 바와 같이, 노로 바이러스와의 접촉 개시로부터 1 분 시점에서는, 노로 바이러스가 팽화된 것으로 추정되는 구체가 관찰되었다.
또, 도 4(a) 에 나타내는 바와 같이, 노로 바이러스와의 접촉 개시로부터 1 시간 시점에 있어서도, 노로 바이러스와의 접촉 개시로부터 1 분 시점 (도 3(c)) 에서 관찰된, 노로 바이러스가 팽화된 것으로 추측되는 구체가 관찰되었다. 또, 이 시점에서는, 노로 바이러스와의 접촉 개시로부터 1 분 시점과 비교하여, 노로 바이러스의 수가 전체적으로 감소된 것이 관찰되었다. 이것은, 상기 서술한 바와 같이, 80 ℃ 에서 180 분간의 가열에 의해서 얻어지는 라이소자임 변성물에 의해서, 노로 바이러스의 생존수가 1,000 분의 1 이하로 감소된 것과 합치된다.
한편, 도 4(b) 에 나타내는 바와 같이, 노로 바이러스와 라이소자임 (비가열) 의 접촉 개시로부터 1 분 시점에서는, 노로 바이러스의 변화는 관찰되지 않았다.
또, 라이소자임 (또는 라이소자임 변성물) 의 용액과 접촉한 경우의 노로 바이러스의 직경은 이하와 같았다.
노로 바이러스 : 35.5 ± 1.70 ㎚
비가열 라이소자임 : 37.3 ± 1.77 ㎚
라이소자임 변성물 (80 ℃ × 180 분 가열 : 49.1 ± 2.12 ㎚)
본 시험예에 의하면, 라이소자임 변성물과의 접촉에 의해서, 노로 바이러스가 팽화되는 것이 확인되었다. 이것으로부터, 라이소자임 변성물과의 접촉에 의해서, 노로 바이러스가 팽화되는 결과, 노로 바이러스가 불활화되는 것이 추측된다.
[시험예 5]
본 시험예에서는, 인간 노로 바이러스에 대한 라이소자임 변성물의 효과를 리얼타임 PCR 법을 이용하여 검토하였다. 또한, 본 시험에서 사용한 인간 노로 바이러스액은 환자의 변에서 채취되고, -80 ℃ 에서 동결 보존되어 있던 인간 노로 바이러스 원액을 빙상에서 해동하고, 그것을 인산 완충 생리 식염수로 10 배로 희석한 후, 10,000 rpm 으로 20 분간 원심 분리하고, 침전물을 제거하여 조제하였다.
시험 방법 (리얼타임 PCR 법) :
인간 노로 바이러스액을 시험 번호 13 의 라이소자임 용액 또는 증류수와 등량 혼합하고, 1 시간 방치하였다. 이어서, Takara qPCR Norovirus (GⅠ/GⅡ) Typing kit 를 사용한 리얼타임 PCR 법에 의해서, 인간 노로 바이러스 유전자량을 측정하였다.
그 결과, 시험 번호 13 의 라이소자임 용액과의 혼합액에 잔존하는 인간 노로 바이러스 유전자량 (도 5 우측) 은, 증류수와의 혼합액에 잔존하는 인간 노로 바이러스 유전자량 (도 5 좌측) 보다 1.5 log10 particles/㎖ 적은 것이 확인되었다. 이것으로부터, 라이소자임 변성물은 인간 노로 바이러스를 사멸시키는 것이 시사되었다 (도 5).
[배합예 1]
시험예 1 의 라이소자임 변성물 (시험 번호 9) 을 사용하여, 내용물이 하기의 배합인 소프트 캡슐을 제조하였다.
<배합 비율>
라이소자임 변성물 (시험 번호 9) 20 ％
올리브유 50 ％
밀랍 10 ％
중사슬 지방산 트리글리세리드 10 ％
유화제 10 ％
―――――――――――――――――――――
계 100 ％
[배합예 2]
시험예 1 의 라이소자임 변성물 (시험 번호 11) 을 사용하여, 내용물이 하기의 배합인, 하기의 배합의 산제 (과립제) 를 제조하였다.
<배합 비율>
라이소자임 변성물 (시험 번호 11) 10 ％
젖당 60 ％
옥수수 전분 25 ％
하이프로멜로스 5 ％
―――――――――――――――――――――
계 100 ％
[배합예 3]
시험예 1 의 라이소자임 변성물 (시험 번호 13) 을 사용하여, 내용물이 하기의 배합인, 하기 배합의 정제를 제조하였다.
<배합 비율>
라이소자임 변성물 (시험 번호 13) 25 ％
젖당 24 ％
결정 셀룰로오스 20 ％
옥수수 전분 15 ％
덱스트린 10 ％
유화제 5 ％
이산화규소 1 ％
―――――――――――――――――――――
계 100 ％
본 발명은, 노로 바이러스를 불활화하는 여러 상황에서 유효하고, 예를 들어, 손가락, 체구, 의료 기구, 학교, 병원, 복지 시설 등의 시설, 공장, 주거등의 소독을 행하는 소독제, 식품 첨가물, 노로 바이러스의 제거제, 감염 예방 또는 치료약으로서 유용하다.
본 발명에 관련된 실시형태의 설명은 이상이다. 본 발명은, 실시형태에서 설명한 구성과 실질적으로 동일한 구성 (예를 들어, 기능, 방법 및 결과가 동일한 구성, 혹은 목적 및 결과가 동일한 구성) 을 포함한다. 또, 본 발명은, 실시형태에서 설명한 구성의 본질적이 아닌 부분을 바꾸어 놓은 구성을 포함한다. 또, 본 발명은, 실시형태에서 설명한 구성과 동일한 작용 효과를 발휘하는 구성 또는 동일한 목적을 달성할 수 있는 구성을 포함한다. 또, 본 발명은, 실시형태에서 설명한 구성에 공지 기술을 부가한 구성을 포함한다.

Claims (16)

  1. 라이소자임 및/또는 그 염, 그리고 이것들의 변성물에서 선택되는 적어도 1 종인 라이소자임류를 함유하고, 상기 라이소자임류는, 하기 정의에 의해서 규정되는 형광 강도가 4,000 이상인, 노로 바이러스 불활화제.
    형광 강도 : 상기 라이소자임류의 농도가 고형분 환산으로 0.05 질량％ 가 되며, 또한 인산염의 농도가 0.2 M 이 되도록 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 희석하여 얻어지는 희석액 5 ㎖ 에 8 mM 의 1,8-아닐리노나프탈렌술폰산의 메탄올 용액 25 ㎕ 를 첨가하여 얻어지는 액을 30 분간 실온에서 반응시킨 후의 그 액에 대해서, 여기 파장 390 ㎚ (여기 밴드 폭 10 ㎚) 및 형광 파장 470 ㎚ (형광 밴드 폭 10 ㎚) 의 조건에서 측정된 형광 강도
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 라이소자임류의 함유량이 0.05 질량％ 이상인 노로 바이러스 불활화제.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 라이소자임류는, 하기에 규정되는 항노로 바이러스 활성이 2.0 이상인 노로 바이러스 불활화제.
    항노로 바이러스 활성 : 노로 바이러스액과 상기 라이소자임류의 2 질량％ 수용액을 등량 혼합하여 얻어진 노로 바이러스 혼합액을 실온에서 1 분간 방치했을 때의, 방치 전의 감염가의 대수에서 방치 후의 감염가의 대수를 뺀 값
  5. 제 1 항에 기재된 노로 바이러스 불활화제로서 액제인 노로 바이러스 불활화제.
  6. 라이소자임 및/또는 그 염, 그리고 이것들의 변성물에서 선택되는 적어도 1 종인 라이소자임류를 사용하여 노로 바이러스를 불활화하는 공정을 포함하고, 상기 라이소자임류는, 하기 정의에 의해서 규정되는 형광 강도가 4,000 이상인, 인간을 제외한 대상에 있어서, 노로 바이러스를 불활화하는 방법.
    형광 강도 : 상기 라이소자임류의 농도가 고형분 환산으로 0.05 질량％ 가 되며, 또한 인산염의 농도가 0.2 M 이 되도록 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 희석하여 얻어지는 희석액 5 ㎖ 에 8 mM 의 1,8-아닐리노나프탈렌술폰산의 메탄올 용액 25 ㎕ 를 첨가하여 얻어지는 액을 30 분간 실온에서 반응시킨 후의 그 액에 대해서, 여기 파장 390 ㎚ (여기 밴드 폭 10 ㎚) 및 형광 파장 470 ㎚ (형광 밴드 폭 10 ㎚) 의 조건에서 측정된 형광 강도
  7. 제 1 항 내지 제 2 항, 및 제 4 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 기재된 노로 바이러스 불활화제에 함유되는 라이소자임류의 제조 방법으로서, 라이소자임 및/또는 그 염을 가열 변성하는 공정을 포함하고, 상기 라이소자임류는, 하기 정의에 의해 규정되는 형광 강도가 4,000 이상인, 노로 바이러스 불활화용 라이소자임류의 제조 방법.
    형광 강도 : 상기 라이소자임류의 농도가 고형분 환산으로 0.05 질량％ 가 되며, 또한 인산염의 농도가 0.2 M 이 되도록 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 희석하여 얻어지는 희석액 5 ㎖ 에 8 mM 의 1,8-아닐리노나프탈렌술폰산의 메탄올 용액 25 ㎕ 를 첨가하여 얻어지는 액을 30 분간 실온에서 반응시킨 후의 그 액에 대해서, 여기 파장 390 ㎚ (여기 밴드 폭 10 ㎚) 및 형광 파장 470 ㎚ (형광 밴드 폭 10 ㎚) 의 조건에서 측정된 형광 강도
  8. 라이소자임 및/또는 그 염, 그리고 이것들의 변성물에서 선택되는 적어도 1 종인 라이소자임류를 함유시키는 공정을 포함하고, 상기 라이소자임류는, 하기 정의에 의해 규정되는 형광 강도가 4,000 이상인, 노로 바이러스 불활화제의 제조 방법.
    형광 강도 : 상기 라이소자임류의 농도가 고형분 환산으로 0.05 질량％ 가 되며, 또한 인산염의 농도가 0.2 M 이 되도록 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 희석하여 얻어지는 희석액 5 ㎖ 에 8 mM 의 1,8-아닐리노나프탈렌술폰산의 메탄올 용액 25 ㎕ 를 첨가하여 얻어지는 액을 30 분간 실온에서 반응시킨 후의 그 액에 대해서, 여기 파장 390 ㎚ (여기 밴드 폭 10 ㎚) 및 형광 파장 470 ㎚ (형광 밴드 폭 10 ㎚) 의 조건에서 측정된 형광 강도
  9. 제 8 항에 있어서, 라이소자임 및/또는 그 염을 가열 변성시켜서 가열 변성물을 얻는 공정, 그리고, 그 가열 변성물을 함유하는 노로 바이러스 불활화제를 얻는 공정을 포함하는, 노로 바이러스 불활화제의 제조 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    상기 가열 변성물을 얻는 공정은,
    파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 초과이고, pH 가 5.0 이상 7.0 이하이며, 또한, 라이소자임 및/또는 그 염의 농도가 고형분 환산으로 0.5 질량％ 이상 7 질량％ 이하인 라이소자임 및/또는 그 염의 수용액을, 그 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 가 될 때까지 가열하는 제 1 가열 공정과,
    상기 제 1 가열 공정 후에, 상기 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 미만인 극소치까지 가열한 후, 70 ％ 가 될 때까지 그 수용액을 가열하는 제 2 가열 공정과,
    상기 제 2 가열 공정 후에, 상기 수용액의 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 70 ％ 를 초과하는 상태에서 그 수용액을 추가로 가열하는 제 3 가열 공정을 포함하는, 노로 바이러스 불활화제의 제조 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    상기 제 3 가열 공정의 가열 조건이, 그 제 3 가열 공정에서 얻어진 수용액을 0.45 ㎛ 의 멤브레인 필터로 여과한 것과 에탄올을 질량비로 1 : 1 의 비율로 혼합했을 때에 파장 660 ㎚ 의 광의 투과율이 85 ％ 이상이 될 때까지 가열하는 조건인, 노로 바이러스 불활화제의 제조 방법.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서,
    상기 제 3 가열 공정 후에, 상기 수용액을 분무 건조 또는 동결 건조시켜, 분말상의 상기 변성물을 얻는 공정을 추가로 포함하는, 노로 바이러스 불활화제의 제조 방법.
  13. 라이소자임 및/또는 그 염, 그리고 이것들의 변성물에서 선택되는 적어도 1 종인 라이소자임류를 함유하고, 상기 라이소자임류는, 하기 정의에 의해서 규정되는 형광 강도가 4,000 이상인, 노로 바이러스 감염의 예방약 또는 치료약.
    형광 강도 : 상기 라이소자임류의 농도가 고형분 환산으로 0.05 질량％ 가 되며, 또한 인산염의 농도가 0.2 M 이 되도록 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 희석하여 얻어지는 희석액 5 ㎖ 에 8 mM 의 1,8-아닐리노나프탈렌술폰산의 메탄올 용액 25 ㎕ 를 첨가하여 얻어지는 액을 30 분간 실온에서 반응시킨 후의 그 액에 대해서, 여기 파장 390 ㎚ (여기 밴드 폭 10 ㎚) 및 형광 파장 470 ㎚ (형광 밴드 폭 10 ㎚) 의 조건에서 측정된 형광 강도
  14. 라이소자임 및/또는 그 염, 그리고 이것들의 변성물에서 선택되는 적어도 1 종인 라이소자임류를 함유하고, 상기 라이소자임류는, 하기 정의에 의해서 규정되는 형광 강도가 4,000 이상인, 노로 바이러스 불활화용 피부 외용제.
    형광 강도 : 상기 라이소자임류의 농도가 고형분 환산으로 0.05 질량％ 가 되며, 또한 인산염의 농도가 0.2 M 이 되도록 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 희석하여 얻어지는 희석액 5 ㎖ 에 8 mM 의 1,8-아닐리노나프탈렌술폰산의 메탄올 용액 25 ㎕ 를 첨가하여 얻어지는 액을 30 분간 실온에서 반응시킨 후의 그 액에 대해서, 여기 파장 390 ㎚ (여기 밴드 폭 10 ㎚) 및 형광 파장 470 ㎚ (형광 밴드 폭 10 ㎚) 의 조건에서 측정된 형광 강도
  15. 라이소자임 및/또는 그 염, 그리고 이것들의 변성물에서 선택되는 적어도 1 종인 라이소자임류를 함유하고, 상기 라이소자임류는, 하기 정의에 의해서 규정되는 형광 강도가 4,000 이상인, 바이러스성 급성 위장염의 예방약 또는 치료약.
    형광 강도 : 상기 라이소자임류의 농도가 고형분 환산으로 0.05 질량％ 가 되며, 또한 인산염의 농도가 0.2 M 이 되도록 인산 완충액 (pH 7.0) 으로 희석하여 얻어지는 희석액 5 ㎖ 에 8 mM 의 1,8-아닐리노나프탈렌술폰산의 메탄올 용액 25 ㎕ 를 첨가하여 얻어지는 액을 30 분간 실온에서 반응시킨 후의 그 액에 대해서, 여기 파장 390 ㎚ (여기 밴드 폭 10 ㎚) 및 형광 파장 470 ㎚ (형광 밴드 폭 10 ㎚) 의 조건에서 측정된 형광 강도
  16. 삭제
KR1020167024237A 2014-02-21 2015-02-23 노로 바이러스 불활화제 및 그 제조 방법, 노로 바이러스 불활화 방법, 노로 바이러스 불활화용 라이소자임류의 제조 방법, 노로 바이러스 감염의 예방약 또는 치료약, 그리고 노로 바이러스 불활화용 피부 외용제 KR102437992B1 (ko)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2014-032313 2014-02-21
JP2014032313 2014-02-21
JP2014157145 2014-07-31
JPJP-P-2014-157145 2014-07-31
JPJP-P-2014-189487 2014-09-17
JP2014189487 2014-09-17
PCT/JP2015/055070 WO2015125961A1 (ja) 2014-02-21 2015-02-23 ノロウィルス不活化剤及びその製造方法、ノロウィルス不活化方法、ノロウィルス不活化用リゾチーム類の製造方法、ノロウィルス感染の予防薬又は治療薬、並びにノロウィルス不活化用皮膚外用剤

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20160117560A KR20160117560A (ko) 2016-10-10
KR102437992B1 true KR102437992B1 (ko) 2022-08-29

Family

ID=53878457

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020167024237A KR102437992B1 (ko) 2014-02-21 2015-02-23 노로 바이러스 불활화제 및 그 제조 방법, 노로 바이러스 불활화 방법, 노로 바이러스 불활화용 라이소자임류의 제조 방법, 노로 바이러스 감염의 예방약 또는 치료약, 그리고 노로 바이러스 불활화용 피부 외용제

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20170049863A1 (ko)
EP (1) EP3108894B1 (ko)
JP (1) JP5806434B1 (ko)
KR (1) KR102437992B1 (ko)
CN (1) CN106029089B (ko)
WO (1) WO2015125961A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102437992B1 (ko) 2014-02-21 2022-08-29 고쿠리츠 다이가쿠 호우징 도쿄 가이요우 다이가쿠 노로 바이러스 불활화제 및 그 제조 방법, 노로 바이러스 불활화 방법, 노로 바이러스 불활화용 라이소자임류의 제조 방법, 노로 바이러스 감염의 예방약 또는 치료약, 그리고 노로 바이러스 불활화용 피부 외용제
EP3175713A4 (en) * 2014-07-31 2018-04-18 Kewpie Corporation Water-containing fluid composition, method for producing same, processed lysozyme and/or salt thereof, and method for producing same
JP6590332B2 (ja) * 2015-02-04 2019-10-16 国立大学法人東京海洋大学 ノロウイルス不活化剤及びその製法
CN110499306A (zh) * 2019-05-22 2019-11-26 华中农业大学 一种抗菌增效型鸡蛋源溶菌酶制备方法
EP4144363A4 (en) * 2020-04-27 2024-05-29 Guangzhou Century Clinical Res Co Ltd MEDICINES, FOOD AND USE OF ANTI-CORONAVIRUS INFECTION
CN113355306B (zh) * 2021-05-18 2022-11-08 金橄榄科技(上海)有限公司 具备抗甲型流感病毒活性的热变性溶菌酶的制备方法及应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070191255A1 (en) * 2006-02-16 2007-08-16 Buckman Laboratories International, Inc. Method and composition to control the growth of microorganisms in aqueous systems
JP2007312740A (ja) * 2006-05-29 2007-12-06 Asama Chemical Co Ltd 食品用抗菌組成物
US20100240600A1 (en) * 2007-06-12 2010-09-23 Hiroshima University Anti-Norovirus Agent and Composition Containing the Same

Family Cites Families (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4670178A (en) 1985-09-09 1987-06-02 Allergan Pharmaceuticals, Inc. Method for the simultaneous cleaning and disinfecting of contact lenses
USRE32672E (en) 1985-09-09 1988-05-24 Allergan, Inc. Method for simultaneously cleaning and disinfecting contact lenses using a mixture of peroxide and proteolytic enzyme
JPH066049B2 (ja) 1986-08-25 1994-01-26 キユーピー株式会社 食品保存剤
JPH022329A (ja) 1988-03-14 1990-01-08 Q P Corp アルコール組成物並びにこれを用いた食品保存料及び消毒料
US5200182A (en) * 1988-05-26 1993-04-06 Nika Health Products, Ltd. Antiviral or antibacterial composition and method of use
JP2646048B2 (ja) 1991-10-24 1997-08-25 キユーピー 株式会社 リゾチーム含有医薬組成物
JPH06246157A (ja) 1993-02-24 1994-09-06 Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd 変性タンパク質固定化担体およびそれを用いる細胞の分離・除去法
IL109705A (en) * 1993-06-17 1998-07-15 Allergan Inc Enzyme compositions and methods for contact lens cleaning
JP3730269B2 (ja) * 1994-07-11 2005-12-21 太陽化学株式会社 変性リゾチーム含有抗菌剤
IT1291366B1 (it) * 1997-05-14 1999-01-07 Angelini Ricerche Spa Composizione farmaceutica antivirale comprendente acido glicirrizico ed almeno una proteina dotata di attivita' antivirale
DE60130994T2 (de) * 2000-07-07 2008-07-24 New York University Anti-hiv und anti-tumor lysozympeptide sowie fragmente
JP4975365B2 (ja) * 2006-05-09 2012-07-11 大阪瓦斯株式会社 耐熱性リゾチーム
JP4996934B2 (ja) * 2007-02-05 2012-08-08 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 組換え型リゾチームの製造法
CN101461379A (zh) * 2007-12-18 2009-06-24 李萍 复合溶菌酶消毒液
US9296719B2 (en) * 2011-07-08 2016-03-29 Indiana University Research And Technology Corporation Compositions and methods for the treatment of norovirus infection
JP5832201B2 (ja) 2011-08-29 2015-12-16 攝津製油株式会社 殺ノロウイルス組成物
KR102437992B1 (ko) 2014-02-21 2022-08-29 고쿠리츠 다이가쿠 호우징 도쿄 가이요우 다이가쿠 노로 바이러스 불활화제 및 그 제조 방법, 노로 바이러스 불활화 방법, 노로 바이러스 불활화용 라이소자임류의 제조 방법, 노로 바이러스 감염의 예방약 또는 치료약, 그리고 노로 바이러스 불활화용 피부 외용제
EP3175713A4 (en) 2014-07-31 2018-04-18 Kewpie Corporation Water-containing fluid composition, method for producing same, processed lysozyme and/or salt thereof, and method for producing same

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070191255A1 (en) * 2006-02-16 2007-08-16 Buckman Laboratories International, Inc. Method and composition to control the growth of microorganisms in aqueous systems
JP2007312740A (ja) * 2006-05-29 2007-12-06 Asama Chemical Co Ltd 食品用抗菌組成物
US20100240600A1 (en) * 2007-06-12 2010-09-23 Hiroshima University Anti-Norovirus Agent and Composition Containing the Same

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CURRENT MICROBIOLOGY, Vol. 10 (1984), pp. 35-40*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20160117560A (ko) 2016-10-10
JPWO2015125961A1 (ja) 2017-03-30
EP3108894A1 (en) 2016-12-28
EP3108894B1 (en) 2022-01-26
CN106029089B (zh) 2020-12-29
US20190314462A1 (en) 2019-10-17
WO2015125961A1 (ja) 2015-08-27
US20170049863A1 (en) 2017-02-23
EP3108894A4 (en) 2017-11-22
US11160849B2 (en) 2021-11-02
JP5806434B1 (ja) 2015-11-10
CN106029089A (zh) 2016-10-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR102437992B1 (ko) 노로 바이러스 불활화제 및 그 제조 방법, 노로 바이러스 불활화 방법, 노로 바이러스 불활화용 라이소자임류의 제조 방법, 노로 바이러스 감염의 예방약 또는 치료약, 그리고 노로 바이러스 불활화용 피부 외용제
JP5421901B2 (ja) エンテロウイルス属の非エンベロープウイルスに対する抗ウイルス剤および抗ウイルス用組成物
JP5092145B2 (ja) 抗ノロウイルス剤およびこれを含有する組成物
RU2234945C2 (ru) Стабилизатор водного раствора и водосодержащего сырья с самопроизвольно изменяющимися окислительно-восстановительными свойствами
JP5670201B2 (ja) Ａ型インフルエンザウイルス属のエンベロープウイルスに対する抗ウイルス剤および抗ウイルス用組成物
KR102124592B1 (ko) 천연 추출물을 함유하는 항균 및 항바이러스 활성을 가지는 손소독제 조성물
KR20160079473A (ko) 녹차 추출물을 유효성분으로 포함하여 항바이러스 활성을 가지는 세정 또는 소독용 조성물 제조방법
KR102442117B1 (ko) 와송 추출물 또는 와송 추출물과 참도박 추출물을 포함하는 피부 개선용 화장료 조성물
JPH11139986A (ja) 絹蛋白質加水分解物由来の生理活性作用組成物
JP2006523684A (ja) 活性化かんきつ類果皮エキス含有組成物
CN106659165B (zh) 含水流动状组合物及其制造方法、以及溶菌酶加工品和/或其盐、及其制造方法
KR20160079459A (ko) 녹차 추출물을 유효성분으로 포함하여 항바이러스 활성을 가지는 세정 또는 소독용 조성물
JP6799904B2 (ja) 含水エタノール製剤及びその製造方法、並びに、リゾチーム加工品及び／又はその塩並びにその製造方法
KR102225151B1 (ko) A형 인플루엔자 바이러스 감염의 예방 또는 치료를 위한 안토시아닌-음전하성 다당류 복합체의 용도
JP7029749B2 (ja) 真菌を原因とする皮膚疾患に対する予防・改善剤
JP6736512B2 (ja) リゾチーム変性物含有粉末及びその製造方法
JPH11139985A (ja) ケラチン蛋白質加水分解物由来の生理活性作用組成物
JP7175467B2 (ja) ノロウイルスおよびその代替ウイルスに対する抗ウイルス剤および抗ウイルス組成物
JP6590332B2 (ja) ノロウイルス不活化剤及びその製法
KR102598905B1 (ko) 퀼라야 추출물을 함유하는 소취용 조성물
JP2008088185A (ja) 絹蛋白質加水分解物由来の免疫賦活剤
JP2022181794A (ja) コロナウイルス不活化剤
JP2018177712A (ja) 粉末製剤及びその製造方法
JP2018177708A (ja) リゾチーム変性物含有粉末及びその製造方法
KR20210020781A (ko) 나노입자 및 환경 유래 미세입자의 독성 저해 조성물

Legal Events

Date Code Title Description
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
X601 Decision of rejection after re-examination
J201 Request for trial against refusal decision
J301 Trial decision

Free format text: TRIAL NUMBER: 2021101002421; TRIAL DECISION FOR APPEAL AGAINST DECISION TO DECLINE REFUSAL REQUESTED 20210917

Effective date: 20220707

GRNO Decision to grant (after opposition)
GRNT Written decision to grant