KR20210020781A - 나노입자 및 환경 유래 미세입자의 독성 저해 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 나노입자 및 환경에서 발생되는 미세입자에 대한 독성을 저해하는 조성물에 관한 것으로, 나노입자 또는 환경 유래 미세 입자로 유발된 세포 내 ATP 감소, 세포 생존율 감소, 세포의 염증 유발성 형태 변화 및 세포의 활성화가 본 발명에 따른 조성물에 의해 저해되는 것이 확인됨에 따라, 상기 조성물은 나노입자 및 미세입자의 독성에 대한 저감 물질로 유용하게 사용될 수 있는 가능성이 있다.
Description
본 발명은 나노입자 및 환경에서 발생 되는 미세입자에 대한 독성을 저해하는 조성물에 관한 것이다.
최근 나노입자에 대한 기술은 급격한 성장을 거두어 공업, 의료, 식품, 화장품 등 여러 산업분야에 응용되고 있다. 또한, 환경에서 연소, 물리적 분해를 통하여 블랙카본, 미세먼지, 미세플라스틱과 같은 미세입자들이 생성되어 공기, 물에 존재할 수 있다. 하지만, 나노입자의 응용 범위가 넓어지고, 환경 유래 미세입자의 생성이 증가할수록 인체에 대한 나노입자 및 미세입자의 노출 경로는 다양해지고, 빈도 또한 잦아질 수 있다(Angew. Chem. Int Ed Engi, 2011, Arch Toxicol, 2017).
이에 따라, 세계적으로 나노입자 및 미세입자에 대한 독성 저감 물질이 필요한 실정이다.
일반적으로 나노입자는 일반적으로 평균 지름이 1-100 nm의 범위에 속하는 입자를 뜻하며, 이는 큰 입자의 소재보다 부피당 비표면적이 매우 넓다. 이에 따라 표면에서 일어나는 반응성이 상당히 높으며, 고유한 물리, 화학적 특성을 지닌다. 이러한 고유 특성들은 산업적으로 유용하지만, 안전성 측면에서는 잠재적으로 독성을 나타낼 수 있다.
또한, 나노입자의 크기가 작을수록 더욱 유해하고 활성산소 생성으로 인한 세포의 사멸 및 염증과 같은 반응을 유발한다고 보고되었다(J. Control Release, 2013). 게다가, 나노입자를 구성하는 물질에 따라서도 독성의 정도가 다르게 나타나고, 심지어 동일 물질, 동일 크기라 하더라도 구조와 형태 및 존재 환경에 따라 독성이 달라질 수 있다(Environ Health Perspect, 2006).
나노입자의 유입 경로는 흡입, 섭취, 피부가 주된 경로로 알려져 있으며, 인체에 유입된 나노입자는 모든 장기에 분포하게 되고 각각의 장기에 대한 질환의 원인이 될 수 있다(Biointerphases, 2007).
그러나 상기 나노입자 및 미세입자의 독성을 탁월하게 저감하는 조성물은 개발되어 있지 않다.
따라서 나노입자 및 환경에서 발생 되는 미세입자에 대해 독성을 저해시킬 수 있는 조성물에 대한 연구가 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 나노입자 및 환경 유래 미세입자로 유도된 세포 내 ATP 감소 및 세포 생존율 감소, 세포의 염증 유발성의 형태학적 변화 및 세포 활성을 완화 시킬 수 있는 나노 독성 저해 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 펩타이드(peptide)계 화합물 및 유기산으로 이루어진 군에서 선택되는 일종 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 나노 독성 저해 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 나노 독성 저해 조성물을 유효성분으로 포함하는 나노 또는 미세 물질에 의해 유도되는 세포 독성 예방 또는 치료용 화장료 조성물, 약학 조성물 또는 건강식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 나노 독성 저해 조성물은 나노입자 또는 환경 유래 미세 입자로 유발된 세포 내 ATP 감소, 세포 생존율 감소, 세포의 염증 유발성 형태 변화 및 세포 활성을 완화 시킬 수 있다.
또한, 상기 조성물을 유효 성분으로 포함하여 나노입자 또는 환경 유래 미세 입자로 유발된 세포 독성 예방 또는 치료용 화장료 조성물, 약학 조성물 또는 건강식품 조성물을 제공할 수 있다.
도 1은 0.01 μg/μl 혹은 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm)가 24시간동안 처리된 미세아교세포 내 ATP의 양을 분석한 결과이며, 막대 그래프 위의 검은 이미지는 실제로 관찰된 발광을 포집하여 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).
도 2는 입자가 처리되지 않은 미세아교세포에 24시간 동안 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 형광 및 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다(붉은색은 MNPs@SiO2(RITC)의 RITC 형광을 나타낸 것이다.).
도 4는 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 7은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 형광 및 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다(초록색은 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm)의 자체 형광을 나타낸 것이다.).
도 8은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 9는 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 100 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 10은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 11은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 12는 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 13은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 14는 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm), 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm), 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm), 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm), 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm 및 100 nm), 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm), 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm), 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm) 와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 세포 생존율을 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).
도 15는 마우스 모델에 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물을 복강 내 주입하여 마우스의 뇌 해마 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)의 분포와 미세아교세포의 활성화 정도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).
도 16은 마우스 모델에 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물을 복강 내 주입하여 마우스의 뇌 시상 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)의 분포와 미세아교세포의 활성화 정도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).
도 17은 마우스 모델에 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물을 복강 내 주입하여 마우스의 뇌 대뇌 피질 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)의 분포와 미세아교세포의 활성화 정도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).
도 18은 마우스 모델에 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물을 복강 내 주입하여 마우스의 뇌 선조체 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)의 분포와 미세아교세포의 활성화 정도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).
도 19는 마우스 모델에 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물을 복강 내 주입하여 마우스의 뇌 소뇌 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)의 분포와 미세아교세포의 활성화 정도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).
도 2는 입자가 처리되지 않은 미세아교세포에 24시간 동안 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 형광 및 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다(붉은색은 MNPs@SiO2(RITC)의 RITC 형광을 나타낸 것이다.).
도 4는 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 5는 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 7은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 형광 및 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다(초록색은 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm)의 자체 형광을 나타낸 것이다.).
도 8은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 9는 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 100 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 10은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 11은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 12는 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 13은 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 나타낸 도면이다.
도 14는 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm), 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm), 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm), 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm), 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm 및 100 nm), 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm), 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm), 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm) 와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후 세포 생존율을 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).
도 15는 마우스 모델에 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물을 복강 내 주입하여 마우스의 뇌 해마 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)의 분포와 미세아교세포의 활성화 정도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).
도 16은 마우스 모델에 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물을 복강 내 주입하여 마우스의 뇌 시상 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)의 분포와 미세아교세포의 활성화 정도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).
도 17은 마우스 모델에 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물을 복강 내 주입하여 마우스의 뇌 대뇌 피질 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)의 분포와 미세아교세포의 활성화 정도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).
도 18은 마우스 모델에 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물을 복강 내 주입하여 마우스의 뇌 선조체 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)의 분포와 미세아교세포의 활성화 정도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).
도 19는 마우스 모델에 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물을 복강 내 주입하여 마우스의 뇌 소뇌 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)의 분포와 미세아교세포의 활성화 정도를 측정한 결과를 나타낸 도면이다(*P < 0.05, vs. 대조군, #P < 0.05, vs. MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 그룹).
이하에서는 본 발명을 구체적으로 설명한다.
본 발명자들은 글루타치온(glutathione, GSH)과 시트르산(citric acid)을 유효성분으로 포함하는 나노 독성 저해 조성물을 제조하였으며, 이는 나노입자 및 미세입자로 유도된 세포 내 ATP 감소 및 세포 생존율 감소, 염증 유발성의 형태학적 변화 및 세포 활성을 완화할 수 있음을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 펩타이드(peptide)계 화합물 및 유기산으로 이루어진 군에서 선택되는 일종 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 나노 독성 저해 조성물을 제공한다.
이때, 상기 펩타이드(peptide)계 화합물은 글루타치온(glutathione; GSH)이며, 상기 유기산은 시트르산(citric acid)인 것을 특징으로 하며, 상기 조성물은 펩타이드(peptide)계 화합물과 유기산을 (0.05 내지 10) : 1 의 농도비로 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 나노 독성 저해 조성물은 나노입자 또는 환경 유래 미세입자로 유도된 세포 내 독성을 저해하는 것으로, 세포 내 ATP 감소, 세포 생존율 감소, 세포의 염증 유발성 형태 변화 및 세포 활성을 완화 시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 나노입자에 의한 세포 내 ATP 감소는 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 완화될 수 있는 효과가 있다.
일반적으로 상기 나노입자는 평균 지름이 1-100 nm의 범위에 속하는 입자를 뜻하며, 미세입자(Particulate matter, PM)는 평균 지름이 10 μm (PM10) 인 입자와 평균 지름이 2.5 μm (PM2.5)인 초미세입자로 분류되며, 상기 나노입자 또는 환경 유래 미세입자는 자성 나노입자, 무기 나노입자, 금속 나노입자, 양자점 나노입자, 탄소나노튜브, 미세 플라스틱, 도시 미세입자로 이루어진 군 중에서 선택될 수 있다.
구체적으로, 화학적으로 결합된 로다민B 이소시아네이트를 포함하는 실리카-코팅된 자성 나노입자[MNPs@SiO2(RITC)], 실리카 나노입자, 은 나노입자, 금 나노입자, CdSe 양자점 나노입자, 폴리스티렌 미세 플라스틱, 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A), 티타늄옥사이드 나노입자, 탄소나노튜브일 수 있으나, 이에 제한되지 않으며, 나노입자 또는 미세입자라면 모두 가능하다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm), 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm), 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm), 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm), 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm 및 100 nm), 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm), 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm), 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm)에 의한 미세아교세포의 염증 유발성의 형태학적 변화가 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 완화될 수 있는 효과가 있다.
또한, 상기 MNPs@SiO2(RITC)(평균 지름 50 nm), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm), 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm), 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm), 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm), 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm 및 100 nm), 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm), 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm), 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm)에 의한 미세아교세포의 세포 생존율 감소가 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 완화될 수 있는 효과가 있다.
게다가, 상기 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm), 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm), 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm), 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm), 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm 및 100 nm), 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm), 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm), 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm)에 의한 미세아교세포의 filament 길이 감소 및 세포의 활성화에 따라 증가하는 단백질(Iba1, CD40, CD11b) 발현양의 증가가 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 완화될 수 있는 효과가 있다.
또한, 상기 세포는 미세아교세포, 신경세포, 별 아교세포 및 희돌기교세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 상기 나노 독성 저해 조성물을 유효 성분으로 포함하는 나노 또는 미세 물질에 의해 유도되는 세포 독성 예방 또는 치료용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물이 화장료 조성물인 경우, 상기 화장료 조성물은 유효성분인 글루타치온(glutathione, GSH) 또는 시트르산(citric acid) 또는 이의 혼합물 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.
상기 화장료 조성물의 제형은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 헤어토닉, 헤어컨디셔너, 헤어에센스, 헤어로션, 헤어영양로션, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 헤어크림, 헤어영양크림, 헤어모이스처크림, 헤어맛사지크림, 헤어왁스, 헤어 에어로졸, 헤어팩, 헤어영양팩, 헤어비누, 헤어클렌징폼, 머릿기름, 모발건조제, 모발보존처리제, 모발염색제, 모발용 웨이브제, 모발탈색제, 헤어겔, 헤어글레이즈, 헤어드레싱어, 헤어래커, 헤어모이스처라이저, 헤어무스 및 헤어스프레이 등으로 제형화 될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 나노 독성 저해 조성물을 유효 성분으로 포함하는 나노 또는 미세 물질에 의해 유도되는 세포 독성 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물이 약학 조성물인 경우, 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제 등으로 제형화 될 수 있다. 한편, 상기 약학 조성물은 상기 유효성분 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는데, 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 약품 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 약학적 조성물은 첨가제로서 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약제학적 조성물은 증상 정도에 따라 투여 방법이 결정되는데, 통상적으로는 국소 투여 방식이 바람직하다. 또한, 상기 약학적 조성물 중 유효성분의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 환자의 나이, 성별, 체중 등에 따라 달라질 수 있으며, 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 나노 독성 저해 조성물을 유효 성분으로 포함하는 나노 또는 미세 물질에 의해 유도되는 세포 독성 예방 또는 치료용 건강식품 조성물을 제공한다.
상기 건강식품 조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품 조성물은 유효성분인 본 발명에 따른 글루타치온(glutathione, GSH) 또는 시트르산(citric acid) 또는 이의 혼합물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를 들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 건강식품 조성물에 함유된 글루타치온(glutathione, GSH) 또는 시트르산(citric acid) 또는 이의 혼합물의 유효 용량은 상기 약학 조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.
상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.
나노입자 및 미세입자의 주된 독성은 활성산소의 증가 및 미토콘드리아 손상으로 인한 에너지 대사의 저하에 의해 나타나는데, 글루타치온의 항산화 효과와 시트르산의 에너지 대사 촉진 및 금속이온 킬레이트 작용의 동반 상승 효과로 인해 본 발명에서 효율적으로 독성을 저해하는 조성물을 개발하였다.
본 발명에 따르면, 상기 나노입자 및 미세입자가 처리된 백서 뇌 조직 유래 미세아교세포 (rat primary microglia)에서 ATP의 감소와 세포사멸 및 세포 형태의 변화 및 세포 활성이 관찰되었으며, 이는 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 세포 내 ATP가 증가되고, 세포 생존율이 증가하며, 세포의 활성화가 저감되는 것이 확인됨에 따라, 상기 나노입자 및 미세입자의 독성에 대한 저감물질로 사용될 수 있음을 확인하였다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<참고예> 실험재료
화학적으로 결합된 로다민B 이소시아네이트를 포함하는 실리카-코팅된 자성 나노입자[Silica-coated magnetic nanoparticles contanining chemically bound rhodamine B isothiocyanate; MNPs@SiO2(RITC)] (평균 지름 50 nm)는 BITERIALS(Korea)에서, 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm)는 Seo H, Kim S-W (2007) In Situ Synthesis of CdTe/CdSe Core-Shell Quantum Dots. Chemistry of Materials 19: 2715-2717; Kim J, Lee JE, Lee J, Jang Y, Kim S-W, An K, Yu JH, Hyeon T (2006a) Generalized Fabrication of Multifunctional Nanoparticle Assemblies on Silica Spheres. Angew Chem 45: 4789-4793 에서, 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm)는 Kim et al, 2006a; Seo & Kim, 2007 에서, 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm)는 Kim et al, 2006a; Seo & Kim, 2007에서, 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm)는 Kim et al, 2006a; Seo & Kim, 2007에서, 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm 및 100 nm)은 Sigma-Aldrich(USA) 에서, 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A)는 Sigma-Aldrich(USA)에서, 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm)는 US Research Nanomaterials(USA)에서, 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm)는 US Research Nanomaterials(USA)에서, 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm)는 US Research Nanomaterials(USA)에서 수득하였다.
<
실시예
1> MNPs@SiO
2
(
RITC
)가 처리된 미세아교세포 내 ATP(Adenosine triphosphate) 측정
1. 세포배양
생후 1일 된 백서의 뇌 조직을 적출하여, 적출된 뇌 조직으로부터 미세아교 세포만 분리하였다.
상기 세포를 10% 태아소혈청 및 100 units/ml 페니실린, 100 ng/μl 스트렙토마이신이 포함된 MEM(Minimum Essential Medium Eagle)에 부유시켰다. 이후 5% CO2, 37 ℃ 인큐베이터에서 배양 하였다.
2. 세포 내 ATP측정
배양 중인 미세아교세포에 0.01 μg/μl 혹은 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm)를 24시간 동안 처리하였다. 이때, 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물 그룹의 경우, 나노입자와 함께 처리하였다. 세포를 부유시킨 후 세포 수를 측정하여 동일세포 수로 맞추었다. 이 세포들은 루시퍼린 기반 ATP 발광 측정 키트 (Promega, USA)을 이용하여 ATP의 양에 따라 발광시켰고, 그 발광 정도를 luminometer (LMaxII384; Molecular Devices, USA)로 측정하였으며, ChemiDoc™ Touch Gel Imaging System (Bio-Rad)를 이용하여 이미지화 하였다.
그 결과, 배양 중인 미세아교세포에 0.01 μg/μl 혹은 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm)만을 처리한 그룹과 비교하여, 글루타치온 또는 시트르산을, 글루타치온과 시트르산 혼합물 함께 첨가했을 때, ATP 감소를 막아줌을 확인하였으며, 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm)만을 처리한 그룹과 비교하여, 각각 30%, 30%, 45% 만큼 증가된 것을 확인하였다(도 1).
상기 도 1의 막대 그래프 위의 검은 이미지는 실제로 관찰된 발광을 포집하여 생성된 것이며, 검은색에 가까울수록 ATP의 양이 높음을 의미하는 바, 막대 그래프 상의 결과와 잘 일치하여 글루타치온 또는 시트르산, 글루타치온과 시트르산 혼합물 함께 첨가했을 때 ATP 감소를 막아줌을 확인하였다.
<실시예 2> 나노입자 및 미세입자가 처리된 미세아교세포의 형태학적 분석
1. 형태학적 분석
상기 실시예 1의 세포배양 방법으로 배양한 미세아교세포에 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm), 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm), 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm), 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm), 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm 및 100 nm), 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm), 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm), 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm)를 24시간 처리한 후, 형광 및 광학현미경(Axio Vert 200M fluorescence microscopy, Zeiss, Jena, Germany)을 이용하여 촬영하였다. 형광을 띄는 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm) 및 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm)는 형광도 함께 촬영하였다. 나노입자 및 미세입자가 처리된 미세아교세포의 수의 변화 및 정상적인 형태(세포 가지를 뻗은 상태)와 염증 유발성의 형태(동그란 모양의 상태), 비정상적인 형태(입자에 파묻힌 형태)를 관찰하였다.
그 결과, 입자가 처리되지 않은 미세아교세포에 24시간 동안 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 세포 수의 변화나 형태학적 변화가 없는 것을 확인하였다(도 2).
또한, 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 형광 및 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, MNPs@SiO2(RITC)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타남을 확인하였다(도 3).
또한, 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타남을 확인하였다(도 4).
또한, 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타났다. 형태학적으로도 글루타치온과 시트르산 혼합물이 처리된 그룹에서 비활성(정상) 상태가 됨을 확인하였다(도 5).
또한, 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타났다. 형태학적으로도 글루타치온과 시트르산 혼합물이 처리된 그룹에서 비활성(정상) 상태가 됨을 확인하였다(도 6).
또한, 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 형광 및 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타났다. 형태학적으로도 글루타치온과 시트르산 혼합물이 처리된 그룹에서 비활성(정상) 상태가 됨을 확인하였다(도 7).
또한, 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타났다. 형태학적으로도 비활성(정상) 상태로 나타나는 것을 글루타치온과 시트르산 혼합물이 처리된 그룹에서 관찰하였다(도 8).
또한, 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 100 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 100 nm)으로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타났다(도 9).
또한, 미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 미세 플라스틱도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타났다(도 10).
미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타났다. 형태학적으로도 비활성(정상) 상태로 나타나는 것을 글루타치온과 시트르산 혼합물이 처리된 그룹에서 관찰하였다(도 11).
미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타났다. 형태학적으로도 뚜렷하게 비활성(정상) 상태로 나타나는 것을 글루타치온과 시트르산 혼합물이 처리된 그룹에서 관찰하였다(도 12).
미세아교세포에 24시간 동안 0.1 μg/μl의 실리카 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm)와 함께 글루타치온, 시트르산 및 글루타치온과 시트르산 혼합물을 처리한 후, 광학현미경으로 세포 형태학적 분석을 한 경우, 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm)로 인한 세포 수의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타났다. 형태학적으로도 비활성(정상) 상태로 나타나는 것을 글루타치온과 시트르산 혼합물이 처리된 그룹에서 관찰하였다(도 13).
<실시예 3> 나노입자 및 미세입자가 처리된 미세아교세포의 세포 생존율 측정
1. 세포 생존율 분석
상기 실시예 1의 세포배양 방법으로 배양한 미세아교세포에 0.1 μg/μl의 MNPs@SiO2(RITC) (평균 지름 50 nm), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 50 nm), 은 나노입자(Ag, 평균 지름 20 nm), 금 나노입자(Au, 평균 지름 10 nm), 양자점 나노입자(CdSe, 평균 지름 10 nm), 폴리스티렌 미세 플라스틱(PS, 평균 지름 2μm 및 100 nm), 도시 미세입자(Urban particulate matter; UPM, NIST 1648A), 실리카 나노입자(SiO2, 평균 지름 30 nm), 티타늄옥사이드 나노입자(TiO2, 평균 지름 40 nm), 탄소나노튜브(MWCNT, 평균 지름 25 nm)를 24시간 처리한 후, succinic dehydrogenase의 활성을 기반으로 세포 생존율을 분석하는 키트(CellTilter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega Corporation, Madison, WI)를 혼합하여, 세포의 생존율에 따른 formazan 형성 정도를 490 nm 흡광도를 통해 측정하였다.
그 결과, 나노입자 및 미세입자에 의한 세포 생존율의 감소가 글루타치온 혹은 시트르산에 의해 완화되었으며, 글루타치온과 시트르산 혼합물에서 가장 완화 효과가 크게 나타남을 확인하였다(도 14).
<실시예 4> 나노입자가 처리된 마우스의 뇌에서의 미세아교세포 활성화 측정
마우스 모델에 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물을 복강 내 주입하여 마우스 뇌에서 MNPs@SiO2(RITC)의 분포와 미세아교세포의 활성화 정도를 측정하였다.
8주령의 ICR 마우스에 100 mg/kg의 MNPs@SiO2(RITC) 및 글루타치온(1000 mg/kg)과 시트르산(200 mg/kg) 혼합물을 복강 내에 주입한 뒤, 5일 후에 파라포름알데하이드로 관류한 뒤, 뇌를 적출하여 대뇌 피질(cortex), 선조체(striatum), 해마(hippocampus), 시상(thalamus), 소뇌(cerebellum)으로 분리하여 면역조직화학 (Immunohistochemistry, IHC) 및 면역 블롯(immunoblot)으로 분석하였다(도 15a).
1. 면역조직화학 분석
적출된 뇌 조직을 동결절편하여 1% 소혈청알부민 및 10% 당나귀 혈청으로 blocking을 상온에서 2시간하였다. blocking된 조직에 항-Iba1 다클론성 염소 항체(1:100)를 4 ℃에서 16시간 결합시켰다. 조직을 0.4% Triton X-100이 포함된 인산완충식염수로 세척한 뒤, Alexa Fluor 488이 결합된 항-염소 IgG 항체(1:100)을 상온에서 2시간 결합시켰다. 조직을 0.4% Triton X-100이 포함된 인산완충식염수로 세척한 뒤, DAPI가 포함된 봉입제를 이용하여 커버글라스로 봉입하였다. 염색된 조직은 슬라이드 스캐너(Axio Scan Z1, Zeiss, Germany) 혹은 공초점 현미경(Nikon A1R HD25, Japan)을 이용하여 관찰 및 Z-stack 스캔하였다. 스캔된 이미지들을 Imaris 9.2 (Bitplane, Zurich, Switzerland) 프로그램을 통하여 3D rendering 모델을 구축하였다. 구축된 모델에서 미세아교세포의 filament들의 길이를 정량하였다.
도 15b는 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물이 주입된(Co-administrated) 마우스의 뇌 해마 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)와 미세아교세포의 형태에 대한 면역조직화학분석 결과이다. 미세아교세포는 단백질 마커인 Iba1으로 검출하였다. Iba1으로 염색된 미세아교세포의 형태는 Imaris 9.2 (Bitplane, Zurich, Switzerland) 프로그램을 통하여 3D rendering 모델을 구축하였고, 이에 따른 filament 길이의 감소(미세아교세포 활성화)를 정량분석 하였다(도 15c).
대조군(control)에 비하여 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 해마 부분에 분포하는 미세아교세포의 filament 길이가 통계적으로 유의미하게 감소하였으며, 이러한 감소는 글루타치온과 시트르산 혼합물이 함께 처리된 마우스(Co-administrated)에서 완화되었음을 확인하였다.
도 16a는 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물이 주입된(Co-administrated) 마우스의 뇌 시상 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)와 미세아교세포의 형태에 대한 면역조직화학분석 결과이다. MNPs@SiO2(RITC)를 처리함에 따라 filament 길이의 감소를 정량분석 하였다(도 16b).
대조군(control)에 비하여 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 시상 부분에 분포하는 미세아교세포의 filament 길이가 통계적으로 유의미하게 감소하였으며, 이러한 감소는 글루타치온과 시트르산 혼합물이 함께 처리된 마우스(Co-administrated)에서 완화되었음을 확인하였다.
도 17a는 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물이 주입된(Co-administrated) 마우스의 뇌 대뇌 피질 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)와 미세아교세포의 형태에 대한 면역조직화학분석 결과이다. MNPs@SiO2(RITC)를 처리함에 따라 filament 길이의 감소를 정량분석 하였다(도 17b).
대조군(control)에 비하여 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 대뇌 피질 부분에 분포하는 미세아교세포의 filament 길이가 통계적으로 유의미하게 감소하였으며, 이러한 감소는 글루타치온과 시트르산 혼합물이 함께 처리된 마우스(Co-administrated)에서 완화되었음을 확인하였다.
도 18a는 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물이 주입된(Co-administrated) 마우스의 뇌 선조체 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)와 미세아교세포의 형태에 대한 면역조직화학분석 결과이다. MNPs@SiO2(RITC)를 처리함에 따라 filament 길이의 감소를 정량분석 하였다(도 18b).
대조군(control)에 비하여 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 선조체 부분에 분포하는 미세아교세포의 filament 길이가 통계적으로 유의미하게 감소하였으며, 이러한 감소는 글루타치온과 시트르산 혼합물이 함께 처리된 마우스(Co-administrated)에서 완화되었음을 확인하였다.
도 19a는 MNPs@SiO2(RITC)와 글루타치온과 시트르산 혼합물이 주입된(Co-administrated) 마우스의 뇌 소뇌 부분에 분포하는 MNPs@SiO2(RITC)와 미세아교세포의 형태에 대한 면역조직화학분석 결과이다. MNPs@SiO2(RITC)를 처리함에 따라 filament 길이의 감소를 정량분석 하였다(도 19b).
대조군(control)에 비하여 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 소뇌 부분에 분포하는 미세아교세포의 filament 길이가 통계적으로 유의미하게 감소하였으며, 이러한 감소는 글루타치온과 시트르산 혼합물이 함께 처리된 마우스(Co-administrated)에서 완화되었음을 확인하였다.
2. 면역 블롯 분석
적출된 뇌 조직을 대뇌 피질, 선조체, 해마, 시상, 소뇌로 분리하여 20 mM Tris-HCl pH 7.5, 150 mM NaCl, 1 mM Na2 EDTA, 1 mM EGTA, 1% NP-40, 1% sodium deoxycholate, 2.5 mM sodium pyrophosphate, 1 mM β-glycerophosphate, 1 mM Na3VO4, 및 1 μg/ml leupeptin의 용액으로 용해하였다. 용해된 조직의 단백질 농도를 BCA Kit (Thermo Fisher Scientific, USA)으로 정량하였다. 동일 농도로 맞추어진 시료들을 폴리아크릴아마이드 겔 전기 영동법(SDS-PAGE)으로 크기에 따라 분리한 뒤, 단백질들을 nitrocellulose 막에 흡착시켰다. 단백질이 포함된 막은 3% 탈지유가 포함된 트리스완충식염수로 blocking 하였다. blocking된 막은 각각 항 Iba1, 항 CD40, 항 CD11b, 항 beta-actin 의 1차 항체들을 결합시켰다. 막을 0.1% Tween-20이 포함된 트리스완충식염수로 세척한 뒤, 각 1차 항체에 맞는 Horseradish peroxidase (HRP)가 결합된 2차 항체를 결합시켰다. 1% Tween-20이 포함된 트리스완충식염수로 세척한 뒤, 화학 발광용액과 반응시켜 나타나는 발광을 X-ray firm에 인화하였다. 나타난 단백질 밴드의 크기를 Image J 프로그램(National Institutes of Health, USA)을 이용하여 정량하였다.
도 15d는 마우스 뇌 조직에서 미세아교세포의 활성화에 따라 증가하는 단백질(Iba1, CD40, CD11b)의 발현양을 측정한 결과이다. 상기 세 가지 단백질들이 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 해마 부분에서 통계적으로 유의미하게 증가되는 것이 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 저해되는 것을 확인하였다(도 15e-g).
도 16c는 마우스 뇌 조직에서 미세아교세포의 활성화에 따라 증가하는 단백질(Iba1, CD40, CD11b)의 발현양을 측정한 결과이다. 상기 세 가지 단백질들이 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 시상 부분에서 통계적으로 유의미하게 증가되는 것이 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 저해되는 것을 확인하였다(도 16d-f).
도 17c는 마우스 뇌 조직에서 미세아교세포의 활성화에 따라 증가하는 단백질(Iba1, CD40, CD11b)의 발현양을 측정한 결과이다. 상기 세 가지 단백질들이 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 대뇌 피질 부분에서 통계적으로 유의미하게 증가되는 것이 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 저해되는 것을 확인하였다(도 17d-f).
도 18c는 마우스 뇌 조직에서 미세아교세포의 활성화에 따라 증가하는 단백질(Iba1, CD40, CD11b)의 발현양을 측정한 결과이다. 상기 세 가지 단백질들이 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 선조체 부분에서 통계적으로 유의미하게 증가되는 것이 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 저해되는 것을 확인하였다(도 18d-f).
도 19c는 마우스 뇌 조직에서 미세아교세포의 활성화에 따라 증가하는 단백질(Iba1, CD40, CD11b)의 발현양을 측정한 결과이다. 상기 세 가지 단백질들이 MNPs@SiO2(RITC)만 처리된 마우스의 뇌 소뇌 부분에서 통계적으로 유의미하게 증가되는 것이 글루타치온과 시트르산 혼합물에 의해 저해되는 것을 확인하였다(도 19d-f).
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (11)
- 펩타이드(peptide)계 화합물 및 유기산으로 이루어진 군에서 선택되는 일종 또는 이의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 나노 독성 저해 조성물.
- 제 1항에 있어서,
상기 펩타이드(peptide)계 화합물은 글루타치온(glutathione; GSH)이며,
상기 유기산은 시트르산(citric acid)인 것을 특징으로 하는 나노 독성 저해 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 조성물은 펩타이드(peptide)계 화합물을 0.1 내지 0.5 mM의 농도로, 유기산은 0.5 내지 2 mM의 농도로 포함하는 것을 특징으로 하는 나노 독성 저해 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 펩타이드(peptide)계 화합물과 유기산은 (0.05 내지 10) : 1 의 농도비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 나노 독성 저해 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 나노 독성 저해 조성물은,
나노입자 또는 환경 유래 미세입자로 유도된 세포 내 독성을 저해하는 것을 특징으로 하는 나노 독성 저해 조성물. - 제 1항에 있어서,
상기 나노 독성 저해 조성물은,
나노입자 또는 환경 유래 미세입자로 유도된 세포 내 ATP 감소, 세포 생존율 감소, 세포의 염증 유발성 형태 변화 및 세포 활성을 완화 시키는 것을 특징으로 하는 나노 독성 저해 조성물. - 제 5항 또는 제 6항에 있어서,
상기 나노입자 또는 환경 유래 미세입자는,
자성 나노입자, 무기 나노입자, 금속 나노입자, 양자점 나노입자, 탄소나노튜브, 미세 플라스틱, 도시 미세입자로 이루어진 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 나노 독성 저해 조성물. - 제 5항 또는 제 6항에 있어서,
상기 세포는,
미세아교세포, 신경세포, 별 아교세포 및 희돌기교세포로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 나노 독성 저해 조성물. - 제 1항에 따른 나노 독성 저해 조성물을 유효 성분으로 포함하는 나노 또는 미세 물질에 의해 유도되는 세포 독성 예방 또는 치료용 화장료 조성물.
- 제 1항에 따른 나노 독성 저해 조성물을 유효 성분으로 포함하는 나노 또는 미세 물질에 의해 유도되는 세포 독성 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제 1항에 따른 나노 독성 저해 조성물을 유효 성분으로 포함하는 나노 또는 미세 물질에 의해 유도되는 세포 독성 예방 또는 치료용 건강식품 조성물.
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| J Phys Chem C 2011, 2011, 115, 12797-12802* * |
| Small, 2005, 1, 3, 325-327 * |
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