KR101475609B1

KR101475609B1 - 억새꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물

Info

Publication number: KR101475609B1
Application number: KR1020130067263A
Authority: KR
Inventors: 이복희
Original assignee: 중앙대학교 산학협력단
Priority date: 2013-06-12
Filing date: 2013-06-12
Publication date: 2014-12-23

Abstract

본 발명은 억새꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것으로서, 상기 억새꽃 추출물은 높은 항산화능을 보이며 세포내의 티로시나제 활성을 억제하여 멜라닌 합성을 조절할 뿐 아니라 α-MSH를 함유한 B16F1 흑색종(melanoma) 세포에 처리할 경우에도 기존 미백제인 아스코르브산보다 멜라닌 합성을 억제하는 효과가 뛰어나므로, 안전하고 효과적인 미백제로서 널리 사용할 수 있다.

Description

억새꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물{Composition for whitening comprising extract of Miscanthus sinensis var. purpurascens}

본 발명은 억새꽃(Miscanthus sinensis var. purpurascens) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

일반적으로 피부의 색은 자외선이나 신호전달물질 등의 내·외부적 요인에 의한 멜라닌(melanin)의 생성과 분포에 따라 결정된다. 멜라닌은 자외선과 물리·화학적 외부 독성물질로부터 피부를 보호하지만 과잉생성이 일어나게 되면 기미, 주근깨, 과색소침착, 피부노화와 같은 문제를 야기한다.

또한, 피부는 여러 유해환경 및 자외선에 노출됨으로써 활성산소종(reactive oxygen species, ROS)으로 인한 광산화적 손상을 지속적으로 받게 된다. 활성산소종은 일중항 산소(¹O₂), 수퍼옥사이드 라디칼(O^-2), 과산화수소(H₂O₂), 하이드록시 라디칼(·OH), 지질과산화물(RO·, ROO·) 등이 있으며 음식물, 약물, 화학물질 등의 생화학적 반응으로 인해 생성된다. 특히 일중항 산소와 하이드록시 라디칼은 피부 노화를 주도하는 물질로써 신체 내에서는 셀레늄, 마그네슘 등의 미네랄의 섭취와 대사를 통해 생성되는 항산화 효소가 이러한 활성 산소의 공격으로부터 인체를 방어한다. 하지만 과도한 활성산소가 발생할 시 체내의 항산화 반응은 활성산소를 제거하는 데 충분치 않다.

체내에서 과량의 활성산소가 생성되면 이는 각질형성세포(keratinocytes)에 작용하여 멜라닌 합성에 관여하는 다양한 멜라닌 형성 효소의 분비를 촉진시킨다. 과량의 활성산소는 단백질 산화 및 체내의 DNA 손상을 일으켜 멜라닌 합성 과정에 영향을 줌으로써 멜라닌의 합성과 흑색종(melanoma) 세포의 증식을 증가시킨다는 메커니즘이 밝혀지면서, 천연물질에 대한 항산화능의 검증과 이를 이용한 미백물질의 개발이 이루어지고 있다.

한편, 합성 항산화제인 아스코르브산, 코지산, 알부틴 등은 티로시나제를 억제하여 효과적인 미백제로 화장품에 널리 사용되고 있으나, 코지산이나 알부틴의 경우 뛰어난 미백 효과를 보이지만 제품의 안전성이 낮다는 문제점을 가지고 있다.

일반적으로 천연 식물 추출물은 합성 항산화제보다 높은 안전성을 가지며 항염증 작용, 자외선 흡수, 피부 보습 작용, 엘라스타제와 콜라게나제 등의 효소 억제, 활성산소 소거 그리고 티로시나제를 억제하는 등의 다양한 효과를 나타내며 피부 건강을 증진시키고 보호하는데 도움을 준다.

한편, 한국공개특허 제2013-0027338호에서는 억새 유래의 COMT 유전자 및 이의 용도를 개시하고 있을지라도, 억새꽃 추출물의 의학적 용도에 대해서는 전혀 언급한 바 없다.

본 발명의 목적은 억새꽃(Miscanthus sinensis var. purpurascens) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 억새꽃(Miscanthus sinensis var. purpurascens) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

상기 억새꽃 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 용매로 추출할 수 있다.

본 발명의 조성물은 눈개승마(Aruncus dioicus var. kamtschaticus), 말오줌때(Euscaphis japonica), 밀몽화(Buddleja officinalis Maxim.), 산조팝나무(Spiraea blumei G. Don .) 및 황근(Hibiscus hamabo)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 꽃 추출물을 더 포함할 수 있다.

상기 조성물은 조성물 100 중량부에 대하여 상기 억새꽃 추출물을 0.1 내지 50 중량부를 포함할 수 있다.

상기 조성물은 약학조성물, 건강식품조성물 또는 화장료조성물 중에서 선택될 수 있다.

본 발명에 따른 억새꽃 추출물은 높은 항산화능을 보이며 세포내의 티로시나제 활성을 억제하여 멜라닌 합성을 조절할 뿐 아니라 α-MSH를 함유한 B16F1 흑색종(melanoma) 세포에 처리할 경우에도 기존 미백제인 아스코르브산보다 멜라닌 합성을 억제하는 효과가 뛰어나므로, 안전하고 효과적인 미백제로서 널리 사용할 수 있다.

도 1은 각 꽃 추출물을 125 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1,000 ppm 농도로 희석하여 처리한 B16F1 흑색종(melanoma) 세포의 생존율을 나타낸 것이고(AA: 아스코르브산, ADK: 눈개승마 추출물, EJ: 말오줌때 추출물, BOM: 밀몽화 추출물, SB: 산조팝나무 추출물, MSP: 억새 추출물, HH: 황근 추출물, RMD: 황두견화 추출물),
도 2는 각 농도별 꽃 추출물의 버섯형 티로시나제 활성 억제 효과를 나타낸 것이고(AA: 아스코르브산, ADK: 눈개승마 추출물, EJ: 말오줌때 추출물, BOM: 밀몽화 추출물, SB: 산조팝나무 추출물, MSP: 억새 추출물, HH: 황근 추출물, RMD: 황두견화 추출물),
도 3은 각 농도별 꽃 추출물의 세포 내 티로시나제 활성 억제 효과를 나타낸 것이고(AA: 아스코르브산, ADK: 눈개승마 추출물, EJ: 말오줌때 추출물, BOM: 밀몽화 추출물, SB: 산조팝나무 추출물, MSP: 억새 추출물, HH: 황근 추출물, RMD: 황두견화 추출물),
도 4는 각 농도별 꽃 추출물의 세포 내 멜라닌 함량 변화를 나타낸 것이다(AA: 아스코르브산, ADK: 눈개승마 추출물, EJ: 말오줌때 추출물, BOM: 밀몽화 추출물, SB: 산조팝나무 추출물, MSP: 억새 추출물, HH: 황근 추출물, RMD: 황두견화 추출물).

본 발명에서는 54종의 꽃 추출물을 대상으로 폴리페놀 및 플라보노이드를 측정한 예비실험을 통해 항산화능을 평가한 후, 그 중 높은 항산화능을 나타내었으나 현재까지 미백 관련 연구가 미미한 7가지 꽃 추출물을 선발하였고, 이렇게 선발된 꽃 추출물을 B16F1 흑색종(melanoma) 세포에 농도별로 처리하여 흑색종 세포의 생존율을 평가하였고, 또한 미백 효능 검증을 위하여 꽃 추출물의 농도별 버섯형 티로시나제 활성과 세포 내 티로시나제 활성, 세포 내 멜라닌 함량 측정을 통해 억새꽃 추출물의 미백효능을 검증함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 억새꽃(Miscanthus sinensis var. purpurascens) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

상기 억새꽃 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 용매로 추출할 수 있으며, 바람직하게는 억새꽃 메탄올 추출물일 수 있다.

상기 조성물은 눈개승마(Aruncus dioicus var. kamtschaticus), 말오줌때(Euscaphis japonica), 밀몽화(Buddleja officinalis Maxim.), 산조팝나무(Spiraea blumei G. Don.) 및 황근(Hibiscus hamabo)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 꽃 추출물을 더 포함할 수 있다.

상기 조성물은 조성물 100 중량부에 대하여 상기 억새꽃 추출물을 0.1 내지 50 중량부를 포함할 수 있다. 억새꽃 추출물의 함량이 상기 범위를 벗어나면 미백 활성이 약하거나 독성이 야기될 수 있다.

상기 조성물은 약학조성물, 건강식품조성물 또는 화장료조성물 중에서 선택된 다양한 형태로 제공될 수 있다.

상기 약학조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용가능한 담체, 부형제 또는 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 또는 광물유 등을 들 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물은 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제할 수 있다.

또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물의 유효성분인 억새꽃 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중, 질환에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 200mg/kg으로, 바람직하게는 1 내지 100mg/kg을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다.　

또한, 본 발명에 따른 억새꽃 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 기관지내 흡입, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 억새꽃 추출물은 천연 식물 추출물로서 이미 안정성이 확보된 것이다.

또한, 상기 화장료 조성물은 유효성분인 억새꽃 추출물 외에 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 썬 크림, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

상기 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

상기 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

상기 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해 화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

상기 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

또한, 상기 건강식품조성물은 분말, 과립, 정제, 캡슐, 시럽 또는 음료의 형태로 제공될 수 있으며, 상기 건강식품조성물은 유효성분인 본 발명에 따른 억새꽃 추출물 이외에 다른 식품 또는 식품 첨가물과 함께 사용되고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 그의 사용 목적 예를들어 예방, 건강 또는 치료적 처치에 따라 적합하게 결정될 수 있다.

상기 건강식품조성물에 함유된 억새꽃 추출물의 유효용량은 상기 약학조성물의 유효용량에 준해서 사용할 수 있으나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 유효성분은 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있음은 확실하다.

상기 건강식품의 종류에는 특별한 제한이 없고, 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 억새꽃 추출물 제조

본 실험에 사용된 꽃 추출물(눈개승마: Aruncus dioicus var. kamtschaticus, 말오줌때: Euscaphis japonica, 밀몽화: Buddleja officinalis Maxim., 산조팝나무: Spiraea blumei G. Don., 억새: Miscanthus sinensis var. purpurascens, 황근: Hibiscus hamabo, 황두견화: Rhododendron molle ( Blume ) G. Don.)은 한국생명공학연구소 한국식물추출물은행에서 분양받아 사용하였다. 분석에 사용하기 위하여 20 mg의 시료에 50% 메탄올 1 mL를 가하여 37℃ 수욕(water bath) 상에서 24시간 동안 추출한 후 0.2 ㎛ 시린지 필터(filter (PALL Life Sciences, USA)로 여과하여 125, 250, 500, 1,000 ppm 농도가 되도록 희석하였다. 희석한 샘플은 빛을 차단한 후 냉장보관하면서 이후 실험에 사용하였다.

< 실시예 2> 억새꽃 추출물의 항산화능 측정

1. 총 폴리페놀 함량 측정

총 폴리페놀 함량은 폴린-데니스(Folin-Denis, J Food Biochem 2001; 25(5): 361-377)법을 약간 변형하여 측정하였다. 50% 메탄올에 희석한 각각의 꽃 추출물 시료 0.5 mL에 폴린-데니스 시약(Folin-Denis reagent; Fluka, Switzerland)을 0.5 mL씩 가한 후 혼합하고 3분간 실온에 방치하였다. 정확히 3분 후 10% 소듐 카보네이트 용액(sodium carbonate solution; Samchun, Korea) 0.5 mL를 첨가하여 다시 실온에서 방치하였다. 1시간 후, 상등액을 취하여 UV-VIS 분광광도계(spectrophotometer; 7315, JENWAY, Bibby Scientific Ltd, UK)를 이용하여 760 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 흡광도는 타닉산(tannic acid; Yakuri Pure Chemicals Co., Ltd, Japan)을 이용하여 작성한 표준곡선으로부터 폴리페놀 함량을 구하였다. 타닉산(tannic acid) 표준곡선은 70% 메탄올 10 mL에 타닉산(tannic acid) 0.01g을 녹이고 최종 농도가 0.1%, 0.05%, 0.025%, 0.0125%, 0.00625%가 되도록 하여 위와 같은 방법으로 760 nm에서 흡광도를 측정하여 작성하였다.

2. 총 플라보노이드 함량 측정

총 플라보노이드 함량은 종래 알려진 방법(Korean J Nutr 2001; 34(3): 285-298)에 따라 측정하였다. 즉, 50% 메탄올에 희석한 각각의 꽃 추출물 시료 0.5 mL에 디에틸렌 글리콜(diethylene glycol; Junsei Chemicals, Japan)을 5 mL씩 가하여 혼합하였다. 그 후 1N NaOH(Duksan Pure Chemicals, Korea)를 0.5 mL 가하여 다시 한번 잘 혼합한 후 37℃ 수욕(water bath) 상에서 1시간 방치하였다. 정확히 1시간 후 UV-VIS 분광광도계(spectrophotometer; 7315, JENWAY, Bibby Scientific Ltd, UK)를 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 측정된 값은 나린진(naringin; Tokyo Kasei Kogyo Co., Ltd, Japan)을 이용하여 표준검량곡선을 작성하였다. 나린진(naringin) 0.01 g에 99.8% EtOH 10 mL을 가하여 0.1%를 만든 후에 0.05%, 0.025%, 0.0125%로 반씩 희석하여 위와 같은 방법으로 420 nm에서 흡광도를 측정하였고, 이를 이용하여 시료의 흡광도를 % 나린진 당량(naringin equivalent)으로 환산하였다.

3. 결과

억새 추출물을 포함한 꽃 추출물의 총 폴리페놀 및 플라보노이드 측정 결과는 표 1과 같다. 억새(183.06±4.44 mg/g extract), 밀몽화(159.72±9.64 mg/g extract) 및 눈개승마(140.28±6.57 mg/g extract)이 다른 추출물에 비해 유의적으로 높은 플라보노이드 함량을 나타내었고, 특히 억새는 가장 낮은 값을 보인 황근(64.44±0.28 mg/g extract)보다 플라보노이드 함량이 3배 가량 높게 나타났다.

꽃추출물	총 폴리페놀 (mg/추출물 중량, g)	총 플라보노이드 (mg/추출물 중량, g)
눈개승마	168.14±6.58	140.28±6.57
말오줌때	307.47±0.00	116.67±3.33
밀몽화	162.80±3.36	159.72±9.64
산조팝나무	129.35±8.95	119.44±6.09
억새	158.12±8.68	183.06±4.44
황근	180.51±5.00	64.44±0.28
황두견화	139.55±4.13	106.39±2.65

< 실시예 3> 세포 독성 평가

1. 세포 배양

본 실험에서 사용한 B16F1 흑색종(melanoma) 세포는 한국세포주은행(Korean Cell Line Bank, Korea)에서 분양받아 사용하였다. 10% FBS와 1% 항생제(Gibco, USA)가 첨가된 DMEM (HyClone, USA) 배지에서 37℃, 5% CO₂ 조건으로 배양하여 실험에 사용하였다.

2. 세포 독성 평가

세포독성시험은 CCK-8(Cell Counting Kit, Sigma, USA) 에세이를 이용하여 세포생존율을 산출함으로써 평가하였다. 세포독성시험에 사용된 B16F1 흑색종(melanoma) 세포를 1.7×10³ cells/well이 되도록 96-well plate에 각각 분주한 뒤 5% CO₂, 37℃의 배양기에서 24시간 동안 예비배양하였다. 각 꽃 추출물 시료는 4개의 농도(125, 250, 500, 1,000 ppm)로 희석하여 각 well당 10 ㎕씩 넣고 24시간 동안 위와 동일한 조건에서 배양하였고 CCK-8 시약을 각 well당 10 ㎕씩 분주하였다. 음성대조군은 아무것도 첨가하지 않은 DMEM 배지만을 사용하여 측정하였고, 양성대조군으로는 아스코르브산을 사용하였으며, 트리톤 X-100(Sigma, USA)을 블랭크로 사용하였다. 약 2시간 정도 배양시킨 후, 대조군과의 발색차이가 가장 클 때 450 nm(test wavelength)와 650 nm(reference wavelength)에서 ELISA 리터(EMAX, Idexx Laboratories, France)를 이용하여 흡광도를 측정하였으며, 세포생존율의 계산식은 아래와 같다.

3. 결과

도 1은 각 꽃 추출물을 125 ppm, 250 ppm, 500 ppm, 1,000 ppm 농도로 희석하여 처리한 B16F1 흑색종(melanoma) 세포의 생존율을 나타낸 것으로서, 125 ppm 농도에서의 평균 생존률은 94.69±1.28%로, 황근(108.44±0.47%), 산조팝나무(99.51±2.10%) 및 억새(95.58±0.05%)의 생존률이 평균보다 높게 나타났다. 250 ppm 농도에서는 억새(101.29±0.52%), 산조팝나무(99.69±0.54%) 외에 황두견화(99.23±1.36%), 황근(98.22±0.61±0.35%), 밀몽화(94.45%)등이 평균 세포 생존율보다 높은 생존율을 보였으며, 500 ppm에서도 비슷한 양상을 보이는 것으로 나타났다. 한편 1,000 ppm의 고농도 추출물을 처리하였을 때 황두견화(94.38±0.41%), 산조팝나무(92.33±0.30%)는 평균 생존율(66.59±4.67)보다 각각 27.79%, 25.74% 높은 결과를 보여 매우 높은 세포 생존율을 나타냈으나 눈개승마(43.55±0.19), 말오줌때(39.3±3.33), 밀몽화(41.0±0.25)는 매우 낮은 세포생존율을 보였다. 특히, 모든 농도에서 산조팝나무와 억새 추출물은 각각의 농도에서의 전체 추출물의 평균 생존율보다 높은 결과를 나타내 B16F1 흑색종(melanoma) 세포에서 매우 낮은 독성을 가지는 것으로 나타났다.

상기 결과를 토대로 본 발명에서는 500 ppm을 미백소재 개발에 가장 적정한 농도로 결정하였다.

< 실시예 4> 미백효과 검토

1. 버섯형 티로시나제 ( mushroom tyrosinase ) 활성 분석

각 꽃 추출물 시료가 버섯형 티로시나제 활성에 미치는 영향을 평가하기 위하여 종래 알려진 방법(Biochemistry 2003; 68(4): 487-491)을 변형하여 실험을 수행하였다. 50% DMSO로 희석한 각 꽃 추출물 시료(125, 250, 500, 1,000 ppm) 30 ㎕에 0.1 M 소듐 포스페이트 완충액(pH 7.4)을 60 ㎕ 첨가하고 50 U/mL의 버섯형 티로시나제액 (Sigma, USA) 30 ㎕를 넣은 뒤 1.5 mM의 L-DOPA(Sigma-Aldrich, USA) 30 ㎕를 첨가하고 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 10분간 반응시켰다. 10분 뒤 ELISA 리터(SpectraMax 190, Molecular Devices, USA)를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 음성대조군으로 시료 대신 0.1 M 소듐 포스페이트 완충액(pH 6.5)을 사용하였고, 양성대조군은 L-아스코르브산을 사용하였으며 ELISA 리더를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였다. 버섯형 티로시나제 활성(%)은 다음 식에 따라 계산하였다.

도 2는 각 농도별 꽃 추출물의 버섯형 티로시나제 활성 억제 효과를 나타낸 것으로서, 억새 추출물을 포함한 각 꽃 추출물들이 농도 의존적으로 버섯형 티로시나제에 대한 억제 활성을 나타내었다.

2. 세포 내 티로시나제 ( cellular tyrosinase ) 활성 분석

B16F1 흑색종(melanoma) 세포 내의 티로시나제 활성을 측정하기 위하여 종래 알려진 방법(Cancer Res 1985; 45: 1474-1478)을 변형하여 실험을 수행하였다. B16F1 흑색종(melanoma) 세포는 24 well plate에 8×10⁴ cells/well이 되도록 분주하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 동안 예비배양한 후, 4가지 농도(125, 250, 500, 1,000 ppm)로 DMEM 배지에 희석시킨 시료를 각각의 well에 200 ㎕씩 처리하였다. 72시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양한 세포를 소듐 포스페이트 완충액(pH 7.4)으로 두 번 세척하고 1% 트리톤 X-100이 포함된 PBS(pH 7.4)를 첨가하고 -70℃에서 급속 냉동시킨 후 60℃에서 해동시키는 과정을 3번 반복하여 세포막을 파괴하였다. 8,000 rpm으로 30분간 원심분리한 후 각각의 상층액 50 ㎕에 10 mM L-DOPA를 첨가한 0.1M 포타슘 포스페이트 완충액(pH 6.8)을 40 ㎕ 가하고 37℃ 수욕 상에서 1시간 동안 반응시켰다. 음성대조군으로 아무것도 첨가하지 않은 DMEM 배지만을 사용하여 측정하였고, 양성대조군은 L-아스코르브산을 사용하였으며 ELISA 리더를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였고 세포성 티로시나제 활성(%)은 다음 식에 따라 계산하였다.

도 3은 각 농도별 꽃 추출물의 세포 내 티로시나제 활성 억제 효과를 나타낸 것으로서, 억새 추출물을 포함한 각 꽃 추출물들이 농도 의존적으로 세포성 티로시나제에 대한 억제 활성을 나타내었다.

3. 세포 내 멜라닌( cellular melanin ) 함량 분석

B16F1 흑색종(melanoma) 세포 내의 멜라닌 함량 측정은 종래 알려진 방법(Cancer Res 1985; 45: 1474-1478)을 변형하여 실험을 수행하였다. B16F1 흑색종(melanoma) 세포는 8×10⁴ cells/well이 되도록 24 well plate에 분주하였고 0.4 μM의 α-멜라노사이트 자극 호르몬(α-melanocyte stimulating hormone, α-MSH)이 포함된 DMEM 배지를 공급하여 37℃, 5% CO₂의 조건에서 24시간 예비배양 하였다. 5가지 농도(125, 250, 500, 1,000 ppm)로 DMEM 배지에 희석시킨 시료를 각각의 well에 200 ㎕씩 처리하고 72시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양한 세포를 소듐 포스페이트 완충액(pH 7.4)으로 두 번 세척하였다. 1% 트리톤 X-100이 포함된 PBS(pH 7.4)를 각각의 well에 첨가하여 10분간 혼합하여 세포를 용해시켰다. 10분 후 8,000 rpm으로 30분간 원심분리한 후 각각의 펠렛에 10% DMSO(Daejung Co., Ltd, Korea)가 포함된 100 ㎕의 1N NaOH (Duksan Pure Chemicals, Korea)를 첨가하여 섞어준 후 60℃ 수욕 상에서 1시간 반응시켰다. 음성대조군으로 아무것도 첨가하지 않은 DMEM 배지만을 사용하여 측정하였고, 양성대조군은 L-아스코르브산을 사용하였으며 ELISA 리더를 이용하여 475 nm에서 흡광도를 측정하였고 세포 내 멜라닌 함량(%)은 다음 식에 따라 계산하였다.

도 4는 각 농도별 꽃 추출물의 세포 내 멜라닌 함량 변화를 나타낸 것으로서, 억새 추출물을 포함한 각 꽃 추출물들이 농도 의존적으로 낮은 세포 내 멜라닌 함량을 나타내었다.

하기에 본 발명에 따른 억새꽃 추출물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

< 처방예 1> 약학조성물의 처방예

<처방예 1-1> 산제의 제조

억새꽃 추출물 100 mg, 유당 100 mg 및 탈크 10 mg을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<처방예 1-2> 정제의 제조

억새꽃 추출물 100 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2 mg을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<처방예 1-3> 캅셀제의 제조

억새꽃 추출물 50 mg, 옥수수전분 100 mg, 유당 100 mg 및 스테아린산 마그네슘 2mg을 혼합한 후 통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<처방예 1-4> 주사제의 제조

억새꽃 추출물 30 mg, 주사용 멸균 증류수 적량 및 pH 조절제 적량을 혼합한 후 통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조하였다.

<처방예 1-5> 연고제의 제조

억새꽃 추출물 50mg, PEG-4000 250mg, PEG-400 650mg, 백색바셀린 10mg, 파라옥시안식향산메칠 1.44mg, 파라옥시안식향산프로필 0.18mg 및 잔량의 정제수를 혼합한 후 통상의 연고제의 제조방법에 따라서 연고제를 제조하였다.

< 처방예 2> 화장료 조성물의 처방예

<처방예 2-1> 영양 로션의 제조

프로필렌글리콜 3.0 중량부, 카르복시폴리머 0.1 중량부, 방부제 미량과 잔량의 정제수를 혼합교반하면서 80 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고, 폴리솔베이트60 1.0 중량부, 솔비탄 세스퀴올레이트 0.5 중량부, 유동 파라핀 10.0 중량부, 솔비탄 스테아레이트 1.0 중량부, 친유형 모노스테아린산 글리세린 0.5 중량부, 스테아린산 1.5 중량부, 글리세릴스테아레이트/PEG-400 스테아레이트 1.0 중량부, 트리에탄올아민 0.2 중량부를 80 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃까지 열 냉각한 뒤 향료 미량을 투입하고, 45℃까지 냉각한 뒤 색소 미량을 투입하고, 35℃에서 억새꽃 추출물을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.

<처방예 2-2> 영양 크림의 제조

카르복시폴리머 0.3 중량부, 부틸렌글리콜 5.0 중량부, 글리세린 3.0 중량부 및 잔량의 정제수를 혼합교반하면서 80 내지 85℃로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고, 스테아린산 2.0 중량부, 세틸알콜 2.0 중량부, 글리세릴모노스테아레이트 2.0 중량부, 폴리옥시에틸렌솔비탄모노스테아레이트 0.5 중량부, 솔비탄세스퀴올레이트 0.5 중량부, 글리세릴모노스테아레이트/글리세릴스테아레이트/폴리옥시에틸렌스테아레이트 1.0 중량부, 왁스 1.0 중량부, 유동파라핀 4.0 중량부, 스쿠알란 4.0 중량부, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 4.0 중량부를 80 내지 85℃로 가열하여 투입한 뒤 트리에탄올아민 0.5 중량부를 투입하여 유화하였다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 35℃까지 냉각한 뒤 억새꽃 추출물을 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.

<처방예 2-3> 워시폼의 제조

TEA-코코일 글루타메이트 30.0 중량부, 디소듐 라우레스 설포숙시네이트글리세린 10.0 중량부, 글리세린 10.0 중량부, 코카마이드 DEA 2.0 중량부, PEG-120 메칠글루코오스 디올리에이트 1.0 중량부, 메칠글루세스-20 0.5 중량부, PEG-150 펜타에리트리틸 테트라 스테아레이트 0.5 중량부, 테트라소듐 EDTA 0.05 중량부 및 방부제 미량을 순차적으로 제조부에 투입하고 60 내지 65℃로 가열한 후 15분 동안 교반하였다. 교반이 끝나면 정제수의 일부를 투입하여 30분 동안 교분한 후, 다시 정제수의 일부를 천천히 투입하고 30분 동안 교반한 후 35℃까지 냉각하고, 억새꽃 추출물과 향료를 투입하여 25℃까지 냉각한 뒤 숙성시켰다.

<처방예 3> 건강보조식품

<처방예 3-1> 건강식품의 제조

억새꽃 추출물 5 ㎎, 비타민 혼합물 적량(비타민 A 아세테이트 70 ㎍, 비타민 E 1.0 ㎎, 비타민 B 1 0.13 ㎎, 비타민 B 2 0.15 ㎎, 비타민 B 6 0.5 ㎎, 비타민 B 12 0.2 ㎍, 비타민 C 10 ㎎, 비오틴 10 ㎍, 니코틴산아미드 1.7 ㎎, 엽산 50 ㎍, 판토텐산 칼슘 0.5 ㎎) 및 무기질 혼합물 적량(황산제1철 1.75 ㎎, 산화아연 0.82 ㎎, 탄산마그네슘 25.3 ㎎, 제1인산칼륨 15 ㎎, 제2인산칼슘 55 ㎎, 구연산칼륨 90 ㎎, 탄산칼슘 100 ㎎, 염화마그네슘 24.8 ㎎)을 혼합한 다음 과립을 제조하고 통상의 방법에 따라 건강식품을 제조하였다.

<처방예 3-2> 건강음료의 제조

억새꽃 추출물 5 ㎎, 구연산 1000 ㎎, 올리고당 100 g, 매실농축액 2 g, 타우린 1 g 및 정제수를 가하여 전체 900 ㎖가 되도록 하며, 통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

억새꽃(Miscanthus sinensis var. purpurascens) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 억새꽃 추출물은 물, C1 내지 C4의 저급 알코올, 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide; DMSO) 및 이들의 혼합용매로 구성된 군으로부터 선택된 용매로 추출한 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 눈개승마(Aruncus dioicus var. kamtschaticus), 말오줌때(Euscaphis japonica), 밀몽화(Buddleja officinalis Maxim.), 산조팝나무(Spiraea blumei G. Don.) 및 황근(Hibiscus hamabo)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 꽃 추출물을 더 포함한 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 조성물 100 중량부에 대하여 상기 억새꽃 추출물을 0.1 내지 50 중량부를 포함하는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.
청구항 1에 있어서, 상기 조성물은 약학조성물, 건강식품조성물 또는 화장료조성물 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 피부 미백용 조성물.