CN106029089A - 诺如病毒灭活剂及其制造方法、诺如病毒灭活方法、诺如病毒灭活用溶菌酶类的制造方法、诺如病毒感染的预防药或治疗药以及诺如病毒灭活用皮肤外用剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种诺如病毒灭活剂，含有选自溶菌酶和/或其盐以及它们的改性物中的至少1种的溶菌酶类。

Description

诺如病毒灭活剂及其制造方法、诺如病毒灭活方法、诺如病毒 灭活用溶菌酶类的制造方法、诺如病毒感染的预防药或治疗 药以及诺如病毒灭活用皮肤外用剂
技术领域
本发明涉及一种含有溶菌酶和/或其盐以及它们的改性物中的至少1种的诺如病毒灭活剂及其制造方法、诺如病毒灭活方法、诺如病毒灭活用溶菌酶类的制造方法、诺如病毒感染的预防药或治疗药以及诺如病毒灭活用皮肤外用剂。
背景技术
诺如病毒对人的感染高，引起食物中毒、病毒性急性胃肠炎(感染症)。目前，诺如病毒没有疫苗，也没有有效的抗病毒剂，因此，若一旦发病，则治疗仅限于输液等对症疗法，但对于老年人等，也有重症化的情况。
诺如病毒的感染途径主要为经口感染。因此，为了预防食物中毒、感染症的发生和防止发生后的扩大，将环境中存在的诺如病毒灭活极其重要。
以往，以醇制剂为代表的许多消毒药对于诺如病毒的灭活无效，为了灭活，推荐85℃1分钟以上的加热或利用次氯酸钠进行处理。然而，次氯酸钠具有对金属的腐蚀作用、对皮肤的刺激作用、对衣物等的漂白作用，因此，实际上的使用受到限制。因此，期望开发一种灭活剂代替次氯酸钠。
对此，作为诺如病毒灭活剂的有效成分，提出了柿子提取物(柿单宁)(专利文献1)、葡萄的种子等中含有的原花青素(专利文献2)等。
即，在专利文献1中记载了应用2分钟柿子提取物的病毒基因组RNA数的抑制率为86～99％，另外，在专利文献2中记载了原花青素对于通过50％培养细胞感染浓度法得到的对照的感染效价(logTCID50/mL)在作用时间1分钟时为3。然而，均没有达到将诺如病毒充分灭活，基于诺如病毒的强感染力，期望开发一种具有更强的灭活效果的新的灭活剂。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：专利5092145号
专利文献2：日本特开2013－47196号公报
发明内容
本发明的课题在于提供一种将诺如病毒有效地灭活的技术。
本发明人还意外地发现溶菌酶和/或其盐以及它们的改性物中的至少1种对诺如病毒具有优异的灭活作用，想到了本发明。
1.本发明的一个形态的诺如病毒灭活剂含有选自溶菌酶和/或其盐以及它们的改性物中的至少1种的溶菌酶类。
2.根据上述1所述的诺如病毒灭活剂，其中，所述溶菌酶类的含量可以为0.05质量％以上。
3.根据上述1或2所述的诺如病毒灭活剂，其中，所述溶菌酶类的由下述定义规定的荧光强度为4000以上。
荧光强度：在以所述溶菌酶类的浓度以固体成分换算计为0.05质量％、且磷酸盐的浓度为0.2M的方式用磷酸缓冲液(pH7.0)稀释而得到的稀释液5mL中添加8mM的1,8－苯胺基萘磺酸的甲醇溶液25μL，使得到的液体在室温下反应30分钟后，在激发波长390nm(激发带宽10nm)和荧光波长470nm(荧光带宽10nm)的条件下对该液体进行测定而得到的荧光强度
4.根据上述1～3中任一项所述的诺如病毒灭活剂，其中，所述溶菌酶类的下述所规定的抗诺如病毒活性为2.0以上。
抗诺如病毒活性：将等量混合诺如病毒液和所述溶菌酶类的2质量％水溶液而得到的诺如病毒混合液在室温下放置1分钟时，从放置前的感染效价的对数减去放置后的感染效价的对数而得的值
5.根据上述1～4中任一项所述的诺如病毒灭活剂，其可以为液剂。
6.本发明的一个形态的诺如病毒的灭活方法可以包含使用选自溶菌酶和/或其盐以及它们的改性物中的至少1种的溶菌酶类将诺如病毒灭活的工序。
7.本发明的一个形态的诺如病毒灭活用溶菌酶类的制造方法是上述1～5中任一项所述的诺如病毒灭活剂中含有的诺如病毒灭活用溶菌酶类的制造方法，包含将溶菌酶和/或其盐加热改性的工序。
8.本发明的一个形态的诺如病毒灭活剂的制造方法包含含有选自溶菌酶和/或其盐以及它们的改性物中的至少1种的溶菌酶类的工序。
9.本发明的一个形态的诺如病毒灭活剂的制造方法是上述8所述的诺如病毒灭活剂的制造方法，包含将溶菌酶和/或其盐加热改性而得到加热改性物的工序和得到含有该加热改性物的诺如病毒灭活剂的工序。
10.根据上述9所述的诺如病毒灭活剂的制造方法，其中，所述得到加热改性物的工序可以包含：第1加热工序，对波长660nm的光的透射率超过70％、pH为5.0～7.0、且溶菌酶和/或其盐的浓度以固体成分换算计为0.5质量％～7质量％的溶菌酶和/或其盐的水溶液进行加热直到该水溶液的波长660nm的光的透射率成为70％；第2加热工序，在所述第1加热工序之后，将该水溶液加热至所述水溶液的波长660nm的光的透射率小于70％的极小值后，对该水溶液进行加热直到该水溶液的波长660nm的光的透射率成为70％；以及第3加热工序，在所述第2加热工序之后，在所述水溶液的波长660nm的光的透射率超过70％的状态下进一步对该水溶液加热。
11.根据上述10所述的诺如病毒灭活剂的制造方法，其中，所述第3加热工序的加热条件可以为在将该第3加热工序中得到的水溶液用0.45μm的膜过滤器过滤而得到的物质和乙醇以质量比1：1的比例混合时进行加热直到波长660nm的光的透射率成为85％以上的条件。
12.根据上述10或11所述的诺如病毒灭活剂的制造方法，其中，在所述第3加热工序之后，进一步包含使所述水溶液喷雾干燥或冷冻干燥而得到粉末状的所述改性物的工序。
13.本发明的一个形态的诺如病毒感染的预防药或治疗药包含选自溶菌酶和/或其盐以及它们的改性物中的至少1种的溶菌酶类。
14.本发明的一个形态的诺如病毒灭活用皮肤外用剂包含选自溶菌酶和/或其盐以及它们的改性物中的至少1种的溶菌酶类。
15.本发明的一个形态的溶菌酶类是用于诺如病毒的灭活的选自溶菌酶和/或其盐以及它们的改性物中的至少1种。
本发明的诺如病毒灭活剂中含有的选自溶菌酶和/或其盐以及它们的改性物中的至少1种的溶菌酶类对诺如病毒具有优异的灭活作用，特别是加热改性物能够在1分钟以内这样的极短的作用时间内使诺如病毒灭活。另外，溶菌酶一直以来就作为提高食品的耐存性的食品添加剂使用，氯化溶菌酶作为消炎剂使用，因此，本发明的诺如病毒灭活剂能够安全地使用。因此，本发明的诺如病毒灭活剂、本发明的诺如病毒的灭活方法、本发明的诺如病毒感染的预防剂或治疗药、本发明的诺如病毒灭活用皮肤外用剂对于抑制诺如病毒的繁殖、杀灭、预防诺如病毒感染、防止感染的扩大以及治疗感染有用。
特别是根据将溶菌酶或其盐或者它们的改性物与低级醇、多元醇等含醇液体混合而得到的诺如病毒灭活剂，发挥醇的除菌效果和所述溶菌酶类的诺如病毒灭活效果这两者，因此，能够日常进行住所环境的杀菌和诺如病毒的灭活。
另外，根据本发明的诺如病毒灭活剂的制造方法，能够简便地制造诺如病毒灭活剂，根据诺如病毒灭活用溶菌酶类的制造方法，能够制造诺如病毒灭活效果极高的溶菌酶类。
附图说明
图1是示意性地表示在本发明的诺如病毒灭活剂的制造方法中，在得到溶菌酶的加热改性物的工序中，第1加热工序、第2加热工序以及第3加热工序中的加热时间与透射率的关系的图。
图2是表示本发明的一个实施例中得到的溶菌酶类(溶菌酶和/或其盐的改性物)的电泳(SDS－PAGE)结果的照片。
图3中，图3(a)是诺如病毒的电子显微镜照片，图3(b)是溶菌酶类(在80℃下通过180分钟的加热而得到的溶菌酶改性物)的电子显微镜照片，图3(c)是从接触开始1分钟的时刻的诺如病毒和溶菌酶类(溶菌酶改性物)的电子显微镜照片。
图4中，图4(a)是从接触开始1小时的时刻的诺如病毒和溶菌酶类(通过80℃×180分钟的加热而得到的溶菌酶改性物)的电子显微镜照片，图4(b)是从接触开始1分钟的时刻的诺如病毒和溶菌酶类(非加热溶菌酶)的电子显微镜照片。
图5是使人诺如病毒和本发明的溶菌酶类(100℃×40分钟)接触1小时后，通过实时PCR法对人诺如病毒基因剂量进行分析的结果。
具体实施方式
以下，对本发明详细地进行说明。应予说明，在本发明中，只要没有特别说明，则“份”是指“质量份”，“％”是指“质量％”。
＜发明内容＞
本发明的诺如病毒灭活剂含有选自溶菌酶和/或其盐以及它们的改性物中的至少1种(以下，有时也简记为“溶菌酶类”)。溶菌酶类用于诺如病毒的灭活。即，本发明的诺如病毒灭活剂可以含有溶菌酶和/或其盐以及它们的改性物(以下，有时也将溶菌酶和/或其盐的改性物简记为“溶菌酶改性物”)中的1种或2种以上。
例如，本发明的诺如病毒灭活剂可以以溶菌酶类(例如，溶菌酶或其盐或者它们的改性物)作为有效成分。该诺如病毒灭活剂可以作为诺如病毒的消毒剂、诺如病毒感染的预防药或治疗药等使用。另外，根据使用形态，也可以作为外用剂或口服剂使用。
在本发明中，“诺如病毒的灭活(deactivate)”是指使通过感染小肠的上皮细胞并繁殖而引起呕吐、腹泻等症状的诺如病毒的活性降低，不仅包含将诺如病毒杀灭而降低活性，还包含在诺如病毒生存的状态下仅使活性降低。
＜溶菌酶和/或其盐＞
在本发明中，“溶菌酶”是指具有将N－乙酰葡萄糖胺和N－乙酰胞壁酸的β－1,4键水解的性质的蛋白质。
可以在本发明的诺如病毒灭活剂中含有的溶菌酶广泛存在于蛋、动物的组织、体液、植物等生物界，根据底物特异性和结构，大致分类为以下的5种类型。另外，可以将溶菌酶和/或其盐作为溶菌酶改性物的原料使用。
1.溶菌酶(细菌型)
2.溶菌酶(鸡型)
3.溶菌酶(鹅型)
4.溶菌酶(噬菌体型；V型)
5.溶菌酶(CH型)
在本发明中，5种类型均可以使用。这些溶菌酶中，作为本发明中使用的溶菌酶类、以及作为溶菌酶改性物的原料，从作为食品添加剂等广泛使用的观点考虑，优选蛋清溶菌酶、人溶菌酶等溶菌酶(鸡型)，进而，从低成本且获得容易的方面考虑，特别优选为蛋清溶菌酶和/或其改性物。
另外，作为溶菌酶的盐，可以举出作为食品添加剂可容许或药学上可容许的盐，例如可以举出：盐酸、碳酸、磷酸、硼酸、六偏磷酸、硝酸、硫酸等无机酸的盐、柠檬酸、酒石酸、琥珀酸、苹果、乙酸、谷氨酸、甘油磷酸、葡糖酸等有机酸的盐。溶菌酶的盐中，优选无机酸的盐，从作为消炎剂被广泛使用、确立了安全性的方面考虑，优选氯化溶菌酶等盐酸盐。
作为溶菌酶和/或其盐的改性方法，可以举出加热处理、酸处理、碱处理、酶处理、有机溶剂处理、表面活性剂处理、氧化处理、还原处理、高压力处理等。这些改性处理可以单独进行或者并用进行。应予说明，溶菌酶改性物中也含有将溶菌酶和/或其盐进行分解处理而得的来自溶菌酶的肽。
溶菌酶类中，从诺如病毒的灭活效果的方面考虑，优选将溶菌酶和/或其盐进行加热改性而得的物质(以下，也简称为“加热改性物”)。加热改性物与非加热的溶菌酶和/或其盐相比能够在短时间内使诺如病毒灭活。因此，本发明也包含将溶菌酶和/或其盐加热改性的方法作为诺如病毒灭活用溶菌酶的制造方法。
加热改性只要能适度地进行溶菌酶和/或其盐的改性，就不特别限定加热条件，但优选将溶菌酶和/或其盐在50℃～130℃、优选60℃以上、更优选70℃以上进行加热。
作为加热改性的方法，可以使溶菌酶和/或其盐溶解于溶剂并加热，也可以在粉末的状态下直接加热，使溶菌酶和/或其盐溶解并加热时，加热时间可以根据溶菌酶加热温度来决定，可以为1分钟～720分钟。在粉末的状态下加热时，加热时间优选为1天以上且小于30天。应予说明，上述溶剂只要为能够溶解溶菌酶和/或其盐的溶剂就没有限定，例如可以为水、含有水的有机溶剂。
＜得到加热改性物的工序＞
得到上述加热改性物的工序包含：第1加热工序(以下，也简称为“第1加热工序”)，对波长660nm的光的透射率超过70％(优选为80％以上，更优选为90％以上，通常为100％以下)、pH为5.0～7.0、且溶菌酶和/或其盐的浓度以固体成分换算计为0.5质量％～7质量％的溶菌酶的水溶液进行加热直到该水溶液的波长660nm的光的透射率成为70％；第2加热工序(以下，也简称为“第2加热工序”)，在上述第1加热工序之后，将该水溶液加热至该水溶液的波长660nm的光的透射率小于70％的极小值后，对该水溶液进行加热直到该水溶液的波长660nm的光的透射率成为70％；以及第3加热工序(以下，也简称为“第3加热工序”)，在上述第2加热工序之后，在上述水溶液的波长660nm的光的透射率超过70％的状态下进一步对该水溶液加热。通过上述第1加热工序、第2加热工序以及第3加热工序，可以得到溶菌酶改性物。
通过上述第1加热工序、第2加热工序以及第3加热工序，可以得到由上述定义规定的荧光强度为4000以上的溶菌酶改性物。
[加热的机理]
图1是示意性地表示在本实施方式的溶菌酶改性物的制造方法中，第1加热工序、第2加热工序以及第3加热工序中的加热时间与透射率的关系的图。本发明人等发现在对含有溶菌酶的水溶液进行加热时，波长660nm的光的透射率根据加热时间如图1所示那样发生变化。推测该透射率的变化由得到的溶菌酶改性物的表面疏水性的变化(主要是表面疏水性的增加)和水溶性的变化(水溶性的降低和随后的水溶性的增加)引起。
[第1加热工序]
如图1所示，通过第1加热工序，波长660nm的光的透射率超过70％的水溶液中的该光的透射率降低而成为70％是指该水溶液的透射率降低，例如，通过目视能够确认该水溶液的白浊。
即，推测在第1加热工序中，上述水溶液中的溶菌酶的立体结构和/或溶菌酶的表面的表面疏水性上升，疏水性部分互相吸引而凝聚，上述水溶液中的溶菌酶的溶解性降低，结果该水溶液的波长660nm的光的透射率从超过70％降低至70％。
(原料)
在第1加热工序中在水溶液中使用的作为原料的溶菌酶和/或其盐可以使用在上述的＜溶菌酶和/或其盐＞一栏中例示的溶菌酶和/或其盐。从低成本且获得容易的方面考虑，作为原料的溶菌酶和/或其盐优选为蛋清溶菌酶。
(原料的浓度)
从能够可靠地改变溶菌酶的立体结构、且能够防止溶菌酶的凝聚而提高诺如病毒的灭活作用的方面考虑，优选在第1加热工序中水溶液中的溶菌酶的浓度为1质量％以上，另一方面，优选为5质量％以下。
(溶菌酶和/或其盐的水溶液)
构成溶菌酶和/或其盐的水溶液的溶剂为水，但也可以在不影响溶菌酶和/或其盐在水中的溶解性的范围使用与水混合的有机溶剂。构成溶菌酶和/或其盐的水溶液的溶剂中的水的比例通常为80质量％～100质量％。另外，构成溶菌酶和/或其盐的水溶液的溶剂含有与水混合的有机溶剂时，构成溶菌酶和/或其盐的水溶液的溶剂中的该有机溶剂的比例通常为1质量％～20质量％。
作为上述有机溶剂，只要为与水混合的有机溶剂即可，例如可以举出甲醇、乙醇、1－丙醇、2－丙醇、乙二醇、丙二醇、甘油等醇系溶剂、丙酮、甲基乙基酮等酮系溶剂、乙腈、四氢呋喃、1,4－二烷等，它们可以单独使用或组合使用2种以上。
(pH)
从能够防止溶菌酶的凝聚、且能够提高得到的溶菌酶改性物的表面疏水性的方面考虑，在第1加热工序、第2加热工序以及第3加热工序中，上述水溶液的pH更优选为5.5以上，另一方面，更优选为6.5以下。
另外，可以根据需要使用酸(例如，盐酸、硫酸、硝酸等无机酸、柠檬酸、乙酸、磷酸等有机酸)、碱(例如，氢氧化钠、氢氧化钾等无机碱)或缓冲液(例如，乙酸缓冲液)将上述水溶液调整到上述范围的pH。
例如，溶菌酶为溶菌酶的盐(例如氯化溶菌酶)时，优选在使用酸、碱或缓冲液将水溶液的pH调整到上述范围的pH的基础上进行第1加热工序。
[第2加热工序]
在第2加热工序中，通过在加热至第1加热工序中得到的水溶液的波长660nm的光的透射率从70％到小于70％(优选小于60％，更优选小于50％，通常为0％以上)的极小值后进行加热直到第1加热工序中得到的水溶液的波长660nm的光的透射率成为70％，第1加热工序中得到的水溶液的光的透射率进一步降低(其结果，通过目视能够确认水溶液的白浊和/或沉淀)，然后，该透射率变为增加，能够确认该白浊和/或沉淀逐渐消失(其结果，通过目视能够确认逐渐变得透明)。
即，推测在第2加热工序中，随着上述水溶液中的溶菌酶的立体结构进一步发生变化、溶菌酶的表面疏水性进一步升高，溶菌酶的水溶性在暂时降低后升高，结果水溶液的波长660nm的光的透射率成为70％。
在第2加热工序中，随着溶菌酶的表面疏水性进一步升高，溶菌酶的水溶性在暂时降低后升高的机理尚未明确，但推测是因为通过第2加热工序，在第1加热工序中凝聚的溶菌酶彼此结合而变成线状的凝聚体，该凝聚体在上述水溶液溶解，因此，上述水溶液中的溶菌酶的溶解性上升。
第2加热工序可以在第1加热工序之后接着进行。即，第2加热工序可以与第1加热工序连续地进行。
[第3加热工序]
推测在第3加热工序中，上述水溶液中的溶菌酶的立体结构进一步发生变化，在维持溶菌酶的水溶性的状态下，溶菌酶的表面疏水性进一步升高，结果，能够维持水溶液的波长660nm的光的透射率超过70％的值。
更具体而言，在第3加热工序中，优选在该水溶液中不产生白浊和/或沉淀(维持该水溶液的透射率(透明性))。
从能够更可靠地改变上述水溶液中的溶菌酶的立体结构的方面考虑，第3加热工序更优选进行加热直到该水溶液的波长660nm的光的透射率成为75％以上，更优选进行加热直到该水溶液的波长660nm的光的透射率成为80％以上(通常为100％以下)。
进而，第3加热工序优选在将第3加热工序中得到的水溶液用0.45μm的膜过滤器过滤而得到的物质和乙醇以质量比1：1的比例混合时进行加热直到波长660nm的光的透射率成为85％以上，更优选进行加热直到波长660nm的光的透射率成为90％以上(通常为100％以下)。
将第3加热工序中得到的水溶液用0.45μm的膜过滤器过滤而得到的物质和乙醇以质量比1：1的比例混合时波长660nm的光的透射率成为85％以上可以设为得到由上述定义定义的荧光强度为4000以上的溶菌酶改性物的指标。
第3加热工序可以在第2加热工序之后接着进行。即，第3加热工序可以与第1加热工序和第2加热工序连续地进行。
在第3加热工序中，在上述透射率超过70％的状态下加热过的(透明化了的)水溶液即使返回到室温(例如25℃)也能够维持该透射率(能够维持透明性)。作为其原因，推测是因为即使在室温下也维持该水溶液中含有的溶菌酶等的形态(立体结构)。
(加热温度和加热时间)
在本实施方式的诺如病毒灭活剂的制造方法(溶菌酶改性物的制造)中，从能够实现高收率、且能够将该水溶液调整为第1加热工序、第2加热工序以及第3加热工序中各自规定的透射率的方面考虑，优选以使第1加热工序、第2加热工序以及第3加热工序中的该水溶液的中心品温为70℃以上的方式进行加热，从因加热时间短而能够缩短制造时间的方面考虑，更优选80℃以上，进一步优选90℃以上(可以为130℃以下，也可以为约100℃以下)。应予说明，第1加热工序、第2加热工序以及第3加热工序中的加热时间可以根据加热温度和处理量以满足各工序中规定的透射率的方式适当决定。
在相同加热温度下连续地进行第1加热工序、第2加热工序以及第3加热工序时，第1加热工序中的加热时间、第2加热工序中的加热时间以及第3加热工序中的加热时间优选以合计计在中心品温为70℃～75℃时为125分钟～720分钟，在中心品温超过75℃且为80℃以下时为80分钟～435分钟，在中心品温超过80℃且为85℃以下时为70分钟～305分钟，在中心品温超过85℃且为90℃以下时为50分钟～240分钟，在中心品温超过90℃且为95℃以下时为40分钟～185分钟，在中心品温超过95℃且为100℃以下时为25分钟～120分钟，在中心品温超过100℃时为10分钟～120分钟。
(喷雾干燥/冷冻干燥)
应予说明，在本发明的溶菌酶改性物的制造方法中，可以在上述第3加热工序之后，进一步包含使上述水溶液喷雾干燥或冷冻干燥而得到粉末状的溶菌酶改性物的工序。
]喷雾干燥和冷冻干燥根据常规方法进行即可。
＜诺如病毒灭活作用＞
在本发明中，诺如病毒灭活作用可以通过使用后述的实施例中所记载的方法(即，感染了诺如病毒的小鼠细胞)的系统进行评价。
(荧光强度)
对本发明的溶菌酶类而言，从表面疏水性更高、诺如病毒的灭活作用更优异的方面考虑，由下述定义规定的溶菌酶类(溶菌酶和/或其盐的改性物(以下，有时也记为“溶菌酶改性物”)、更具体而言为溶菌酶改性物的荧光强度优选为4000以上，更优选为5000以上，通常为10000以下。应予说明，在本发明中，“室温”是指20℃～25℃。
荧光强度：在以上述溶菌酶类的浓度以固体成分换算计为0.05质量％、且磷酸盐的浓度为0.2M的方式用磷酸缓冲液(pH7.0)稀释而得到的稀释液5mL中添加8mM的1,8－苯胺基萘磺酸的甲醇溶液25μL，使得到的液体在室温下反应30分钟后，在激发波长390nm(激发带宽10nm)和荧光波长470nm(荧光带宽10nm)的条件下对该液体进行测定而得到的荧光强度。
本发明中规定的溶菌酶类的荧光强度是溶菌酶类的表面疏水性的指标。即，可以说本发明中规定的溶菌酶类的荧光强度越高，溶菌酶类的表面疏水性越高。另外，有溶菌酶类的表面疏水性越高，诺如病毒的灭活效果(抗诺如病毒活性)越优异的趋势。
本发明人等发现有溶菌酶类的表面疏水性越高，诺如病毒的灭活作用越高的趋势。其中，作为溶菌酶加工品和/或其盐的本发明的溶菌酶改性物具有诺如病毒的灭活作用更优异这样的特征。应予说明，在本发明中，“溶菌酶加工品”是溶菌酶改性物，具有与溶菌酶和/或其盐不同的立体结构。
本发明的溶菌酶加工品和/或其盐具有优异的诺如病毒的灭活作用的原因尚未明确，但推测如下：第1，具有表面疏水性的溶菌酶加工品和/或其盐容易与诺如病毒的疏水性部位结合；第2，溶菌酶加工品和/或其盐为溶菌酶改性物，通过改性，溶菌酶加工品含有溶菌酶所具有的S－S键的至少一部分断开而得到的硫醇基(－SH)，该硫醇基与存在于诺如病毒的表面的S－S键键合；第3，溶菌酶加工品和/或其盐具有容易与诺如病毒结合的立体结构。
应予说明，以溶菌酶类的浓度以固体成分换算计为0.05质量％、磷酸盐的浓度为0.2M的方式用磷酸缓冲液稀释，具体而言是指例如在测定含有以固体成分换算计为1质量％的溶菌酶类的水溶液的荧光强度时，将上述水溶液5g和0.25M的磷酸缓冲液80mL放入100mL的容量瓶中后，用纯化水定容至100mL而进行调整。
在本发明中，溶菌酶类的荧光强度为通过Canadian Institute of Food Scienceand Technology 1985Vol.18No.4p.290-295中记载的方法测得的值。应予说明，本发明中的溶菌酶类的荧光强度的测定中使用的磷酸缓冲液是用磷酸二氢钠和磷酸氢二钠制备而成的。另外，本发明中的溶菌酶类的荧光强度为另外测定0.2M磷酸缓冲液(pH7.0、含有磷酸二氢钠和磷酸氢二钠作为磷酸盐)的荧光强度作为空白值并减去该空白值而得的值。
更具体而言，溶菌酶类的荧光强度为使用日本分光株式会社制的型号FP－8500荧光光谱光度计在激发波长390nm、激发带宽10nm、荧光波长470nm、荧光带宽10nm、响应0.5sec、灵敏度Low(约270±10V)(电源频率(50/60Hz))、使用Peristaltic Sipper SHP－820型的条件下测定时的值。应予说明，也可以使用其它荧光光谱光度计(例如，株式会社日立制作所制，型号F－2000荧光光谱光度计)进行测定，但此时需要使灵敏度等测定条件符合本申请中规定的条件。
(抗诺如病毒活性)
上述溶菌酶类优选下述所规定的抗诺如病毒活性为2.0以上。
抗诺如病毒活性：将等量混合诺如病毒液和所述溶菌酶类的2质量％水溶液而得到的诺如病毒混合液在室温下放置1分钟时，从放置前的感染效价的对数减去放置后的感染效价的对数而得的值
(二聚体和三聚体)
上述溶菌酶类(溶菌酶改性物，更具体而言，溶菌酶加工品和/或其盐)可以含有约29KDa(KDa＝103Da)的蛋白质和/或约36.5KDa的蛋白质。即，本发明的诺如病毒灭活剂可以含有约29KDa的蛋白质和/或约36.5KDa的蛋白质。在本发明的诺如病毒灭活剂以及上述溶菌酶类中含有约29KDa的蛋白质和/或约36.5KDa的蛋白质可以通过后述的实施例所示的电泳来确认。应予说明，电泳可以使用市售的电泳试剂盒进行。
推测约29KDa的蛋白质为溶菌酶改性物的二聚体，推测约36.5KDa的蛋白质为溶菌酶改性物的三聚体。
在本发明的诺如病毒灭活剂中，通过含有约29KDa的蛋白质和/或约36.5KDa的蛋白质，可提高抗诺如病毒活性。
＜溶菌酶和/或其盐的含量＞
在本发明的诺如病毒灭活剂中，溶菌酶类的优选的含量(固体成分换算)取决于该诺如病毒灭活剂中使用的溶菌酶的种类、诺如病毒灭活剂的剂型、使用形态等，可以为诺如病毒灭活剂的0.05质量％以上，进一步可以为0.1质量％以上，特别是可以为0.25质量％以上(例如，0.05质量％～100质量％)。在此，本发明的诺如病毒灭活剂含有溶菌酶类中的2种以上时，溶菌酶类的含量(固体成分换算)是指溶菌酶类的合计的含量。
＜配合材料＞
在本发明的诺如病毒灭活剂中，与溶菌酶类一起配合的配合材料可以根据诺如病毒灭活剂的剂型等适当选择，例如可以适当组合使用水；乙醇、异丙醇等碳原子数5以下的低级醇；甘油、聚乙二醇、丁二醇、丙二醇、二丙二醇、山梨醇等多元醇；甘氨酸、有机酸、甘油脂肪酸酯、蔗糖脂肪酸酯、苯甲酸钠、山梨酸钠、丙酸钠、脱氢乙酸钠、对羟基苯甲酸酯、亚硫酸钠、EDTA、苯扎氯铵、苄索氯铵、葡萄糖酸氯己定、盐酸烷基二氨基乙基甘氨酸、碘酊、碘伏、鲸蜡基磷酸苄烷铵、三氯生、氯二甲苯酚、异丙基甲基苯酚、ε-聚赖氨酸、乳铁蛋白、乳酸链球菌素、细菌素、食用土当归提取物、野茉莉提取物、茵陈蒿提取物、酶解薏苡提取物、鱼精蛋白提取物、苧侧素、果胶分解物等抑菌剂。
其中，通过使用水、低级醇和多元醇中的至少1种、特别是使用含有低级醇和多元醇中的至少1种的醇制剂，能够兼具醇的杀菌效果和溶菌酶类的诺如病毒灭活效果，作为消毒剂的便利性升高。
此外，本发明的诺如病毒灭活剂中也可以根据需要添加柠檬酸、柠檬酸钠、氢氧化钠、三乙醇胺等pH调节剂、生育酚乙酸酯等抗氧化剂、羧基乙烯基聚合物、羟乙基纤维素等增稠剂等添加剂。
＜剂型＞
本发明的诺如病毒灭活剂可以根据需要采用各种剂型，例如可以制成液剂，也可以制成粉末、片剂、胶囊等固形剂。
制成液剂时，其粘度可以根据使用方法适当确定。例如，通过制成可喷雾的粘度的液剂并填充于手扣式喷雾器、挤压容器、气雾剂容器等喷雾容器中，对手指、食品、烹调器具、住所环境、呕吐物、排泄物等喷雾含有该诺如病毒灭活剂的液滴，由此，可以方便地进行诺如病毒的灭活，也可以通过将灭活的对象物(例如，手指、食品、医疗设备、医疗器具、烹调器具、住所环境)浸在含有诺如病毒灭活剂的液剂中，方便地进行诺如病毒的灭活。另外，可以以湿润了含有诺如病毒灭活剂的液剂的片(sheet)的形式使用。进而，可以通过制成洗剂、乳膏等而作为皮肤外用剂使用，由此，诺如病毒即使附着于手指也会立即灭活，可以作为防止诺如病毒经口感染的感染预防药使用。
另一方面，制成固形剂时，例如通过预先口服，即使诺如病毒进入口中，也可以作为将其灭活而预防感染的感染预防药使用，另外，在因诺如病毒而导致感染症发病时，也可以作为将体内的诺如病毒灭活的治疗药使用。作为本发明的诺如病毒灭活剂的摄取方法，例如可以举出：口服、栓剂、输液、静脉注射等。
＜诺如病毒的灭活方法＞
本发明包含使用溶菌酶类在住所、食品厂、公共设施、医院等各种环境或状况中将诺如病毒灭活的方法。其中，不包括作为医疗实践的将诺如病毒灭活的情况。
溶菌酶以往作为食品添加剂使用，其溶菌酶的盐也作为抗菌剂使用。特别是氯化溶菌酶作为消炎剂被广泛使用，确立了安全性。因此，溶菌酶或其盐或者它们的改性物只要不会损害将诺如病毒灭活这样的本发明的有效成分的特异性，对使用方法就没有特别限制。
即，可以采用根据上述的诺如病毒灭活剂的剂型将诺如病毒灭活剂喷雾或涂布于将诺如病毒灭活的对象区域或者与将诺如病毒灭活的对象物混合而进行摄取等方法。
＜诺如病毒灭活剂的制造方法＞
本发明包含使作为将诺如病毒灭活的有效成分的溶菌酶类含有在各种固体或液体的载体中而制造诺如病毒灭活剂的方法。特别是，包含使溶菌酶类与含有低级醇和多元醇中的至少1种的液体混合而制造诺如病毒灭活剂的方法，其中，包含与醇制剂混合而制造诺如病毒灭活剂的方法。此时，含有溶菌酶类的对象只要不损害将诺如病毒灭活这样的本发明的有效成分的特异性就没有特别限制，例如只要将溶菌酶类和上述的配合材料混合，制备成期望的剂型即可。
＜关于作用效果＞
本发明的诺如病毒灭活剂的作为有效成分的溶菌酶类与以往作为诺如病毒灭活剂的有效成分已知的柿子提取物(柿单宁)和葡萄的种子等中含有的原花青素相比，对诺如病毒具有优异的灭活作用，特别是加热改性物能够在1分钟以内这样的极短的作用时间内使诺如病毒灭活。另外，溶菌酶一直以来就作为提高食品的耐存性的食品添加剂使用，氯化溶菌酶作为消炎剂使用，因此，本发明的诺如病毒灭活剂能够安全地使用。进而，柿子提取物(柿单宁)和葡萄的种子等中含有的原花青素均为多酚系·色素系的物质，在喷雾时存在餐具、器具着色等问题，但本发明的诺如病毒灭活剂为白色，不会使餐具、器具着色，因此，能够广泛使用。
实施例
以下，通过试验例对本发明具体地进行说明。
[试验例1]
[1]溶菌酶溶液的制备
作为诺如病毒灭活剂，如下制备：准备将蛋清(鸡蛋蛋清)溶菌酶(Kewpie株式会社制)溶解于蒸馏水，制成规定浓度后，在表1所示的条件下进行加热处理并空气冷却(试验编号2～14)。另外，将同样的蛋清溶菌酶(非加热溶菌酶)溶解于水并进行过滤灭菌，由此制备浓度10质量％的溶菌酶溶液(试验编号1)。将测定各溶液的诺如病毒活性，将得到的结果示于表1。
应予说明，各试验编号中的反应液(水溶液)的波长660nm的光的透射率利用吸光光度计(型号“UV－2450”、株式会社岛津制作所制)测定。
在试验编号8、9、11、13和14中，确认到作为上述第1加热工序、第2加热工序以及第3加热工序记载的反应液的透射率的变化。应予说明，在本试验例中，连续地进行第1加热工序、第2加热工序以及第3加热工序，表1的加热时间为第1、第2以及第3加热工序中的加热时间的合计。
更具体而言，在制备试验编号8、9、11、13和14的溶菌酶改性物时的加热工序中，确认到第1加热工序前的反应液的波长660nm的光的透射率超过70％(99％～100％)，但通过第1加热工序，该透射率降低，成为70％，接着，通过第2加热工序，该透射率进一步降低，该第2加热工序中的反应液的透射率的极小值小于70％(20％～30％)后，该透射率再次上升，成为70％后，通过接下来的第3加热工序，该透射率进一步上升，最终该第3加热工序结束后的反应液的透射率超过70％。
[2]感染效价的评价
通过空斑测定法如下评价各试验编号的感染效价。
(1)在6孔板中，将小鼠巨噬细胞株(RAW264.7细胞)培养至60～80％融合。
(2)另一方面，如下制备诺如病毒的感染效价(PFU/mL)为106～107PFU/mL左右的病毒液。
首先，将小鼠巨噬细胞株(RAW264.7细胞)培养至融合，对融合的细胞接种1mL的诺如病毒液，在2天、37℃、5％CO2条件下进行培养。此时，作为诺如病毒液，使用Murinenorovirus strain 1(MNV－1)(Effect of Food Residues on Norovirus Survival onStainless Steel Surfaces)。
培养后，通过目视确认细胞剥离，重复4次冻融将细胞破坏，释放细胞中的病毒。然后，分注于50mL离心管中，进行离心分离(8,000g、20分钟)，得到感染效价(PFU/mL)为106～107PFU/mL左右的诺如病毒液。该诺如病毒液在－80℃下保存，解冻使用。
(3)在试验编号1～14的溶菌酶溶液中加入等量的(2)中得到的诺如病毒液，将其作为试验编号1～14的评价用样品。
将各评价用样品在室温下放置规定的反应时间(0分钟、1分钟或60分钟)，由此使各评价用样品中的溶菌酶与诺如病毒反应。
反应后，将各评价用样品稀释10x倍，作为稀释样品。在此，x为整数，在后述的(8)中，设为能够通过目视数出空斑数的数。即，在(8)中，以空斑数为10～100左右的方式调整稀释倍率。
(4)在(1)的板中除去总量的培养液，将放置规定时间后稀释的稀释样品以500μL/well各2个孔地进行接种。
(5)一边以小鼠巨噬细胞株(RAW264.7细胞)不会干燥的方式振荡一边在室温下培养1小时，使小鼠巨噬细胞株感染诺如病毒。
(6)将板上的500μL/well的接种液总量除去，按2ml/well重叠1.5％Sea PlaqueAgarose－DMEM(37℃)，其凝固后，在37℃、5％CO2条件下培养2天。
(7)在培养2天后的板上按2mL/well重叠作为染色液的0.03％中性红溶液，在37℃、5％CO2条件下下培养1小时。
(8)在(7)的培养后除去总量的0.03％中性红溶液，通过目视数出空斑数。由得到的空斑数和稀释倍率算出感染效价(PFU/mL)。
(9)另外，基于表1所示的结果，由以下的式子算出试验编号3～14的抗诺如病毒活性。其结果，在荧光强度为4000以上的试验编号8、9、11、13以及14的任一情况下均确认到由以下的式子所规定的抗诺如病毒活性为2以上。
抗诺如病毒活性＝Log10(放置1分钟前的诺如病毒混合液的感染效价)－Log10(放置1分钟后的诺如病毒混合液的感染效价)
其结果，试验编号8、9、11、13以及14的溶菌酶改性物均能够通过与诺如病毒的接触而使诺如病毒的感染效价降低至1/102以下，确认到具有诺如病毒灭活效果。
另外，溶菌酶改性物(试验编号6)和非加热的溶菌酶(试验编号1)显示与试验编号2的溶菌酶改性物同等的诺如病毒的灭活效果，溶菌酶改性物(试验编号5)显示比试验编号2的溶菌酶改性物稍强的诺如病毒的灭活效果。
[试验例2]
在试验例1中，变更溶菌酶的加热时间和溶菌酶水溶液的浓度，得到具有表2所示的荧光强度的溶菌酶改性物。
表2
[试验例3]
在本试验例中，对溶菌酶改性物进行电泳。在本试验例中，改变试验例1中的加热条件(加热温度、加热时间和蛋清溶菌酶的浓度)来制备溶菌酶改性物。
更具体而言，在加热温度80℃下在加热时间0分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟以及120分钟的时刻采取蛋清溶菌酶的2质量％水溶液，在该水溶液50μL中加入样品缓冲液950μL，在100℃下加热10分钟后，冰冷，将10μL(以溶菌酶改性物计为10μg)填充于电泳凝胶。应予说明，作为样品缓冲液，使用未加入2－巯基乙醇的样品缓冲液(非还原)。电泳的凝胶使用SDS－PAGEmini(Tefco株式会社制，凝胶浓度4－10％，凝胶厚1mm)，以20mA的恒定电流进行泳动。染色液使用coomassie blue－R250。
图2是表示电泳的结果的照片。如图2所示，在加热时间60分钟、90分钟以及120分钟的时刻明显检测出表示约29KDa的蛋白质(推测为二聚体)和/或约36.5KDa的蛋白质(推测为三聚体)的条带。另外，确认到加热时间越长，表示这些蛋白质的条带变得越深(生成的上述蛋白质的量增加)。另外，推测在同一加热温度下，加热时间越长，该蛋白质的表面疏水性越增加，可得到诺如病毒灭活作用高的蛋白质。
[试验例4]
在本试验例中，使用电子显微镜拍摄诺如病毒与溶菌酶类的接触。
诺如病毒：作为诺如病毒，使用MNV-1(由华盛顿大学(Washington University)的Herbert W.Virgin博士提供)。另外，制作除去了培养基成分的诺如病毒液。诺如病毒液的制作方法如下。
试验样品：使用将蛋清溶菌酶2质量％水溶液分别在80℃下加热180分钟(试验编号9)而得到的溶菌酶改性物。加热使用恒温水槽。
诺如病毒与溶菌酶改性物的接触时间分别为1分钟和1小时。
试验方法(自然染色法(Native Staining Method))：
1)将试验样品滴加在石蜡膜上，使其在碳支承膜上接触2分钟。
2)使1)中得到的试验样品在2质量％乙酸铀上接触2分钟。
3)用滤纸从2)中得到的试验样品中吸取多余的液体，使该试验样品干燥。
4)用电子显微镜(JEOL JEM1200EX)以80kV拍摄电子显微镜照片。
考察：
在文献中，诺如病毒的大小(直径)为30～40nm。在图3(a)、图4(a)以及图4(b)中，“NV”是指诺如病毒，用圈围住的地方为诺如病毒。
如图3(a)所示，在本试验例中，可以观察到直径为30～40nm、与文献中所记载的诺如病毒的大小大致相同大小的球形的物体。根据大小进行判断，推定该球形的物体为诺如病毒。
另外，如图3(b)所示，可以观察到非球形的椭圆的物体。已知溶菌酶(非加热)是大小(直径)为3～4nm的粒子。因此，推定这些物体是溶菌酶通过加热而改性，形状发生变化的溶菌酶改性物。
如图3(c)所示，在与诺如病毒的接触开始1分钟的时刻，观察到推定是诺如病毒膨胀的诺如病毒的球体。
另外，如图4(a)所示，在与诺如病毒的接触开始1小时的时刻，也观察到在与诺如病毒的接触开始1分钟的时刻(图3(c))所观察到的推测是诺如病毒膨胀的诺如病毒的球体。另外，在该时刻，和与诺如病毒的接触开始1分钟的时刻相比，观察到诺如病毒数整体减少。这与如上所述利用通过在80℃下180分钟的加热而得到的溶菌酶改性物，诺如病毒的生存数减少至1000分之1以下的情况一致。
另一方面，如图4(b)所示，在诺如病毒与溶菌酶(非加热)的接触开始1分钟的时刻，未观察到诺如病毒的变化。
另外，与溶菌酶(或溶菌酶改性物)的溶液接触时的诺如病毒的直径如下。
诺如病毒：35.5±1.70nm
非加热溶菌酶：37.3±1.77nm
溶菌酶改性物(80℃×180分钟加热：49.1±2.12nm)
根据本试验例，确认到通过与溶菌酶改性物的接触，诺如病毒膨胀。因此，推测通过与溶菌酶改性物的接触，诺如病毒膨胀，结果诺如病毒被灭活。
[试验例5]
在本试验例中，使用实时PCR法研究溶菌酶改性物对人诺如病毒的效果。应予说明，本试验中使用的人诺如病毒液如下制备：将从患者的粪便中采取并在－80℃下冷冻保存的人诺如病毒原液在冰上解冻，将其用磷缓冲生理盐水稀释成10倍后，以10000rpm离心分离20分钟，除去沉淀物。
试验方法(实时PCR法)：
将人诺如病毒液与试验编号13的溶菌酶溶液或蒸馏水等量混合，放置1小时。接着，利用使用了Takara qPCR Norovirus(GI/GII)Typing kit的实时PCR法测定人诺如病毒基因剂量。
其结果，确认到残留在与试验编号13的溶菌酶溶液的混合液中的人诺如病毒基因剂量(图5右侧)比残留在与蒸馏水的混合液中的人诺如病毒基因剂量(图5左侧)少1.5log10particles/mL。这表示溶菌酶改性物将人诺如病毒杀灭(图5)。
[配合例1]
使用试验例1的溶菌酶改性物(试验编号9)制造内容物为下述配合的软胶囊。
＜配合比例＞
[配合例2]
使用试验例1的溶菌酶改性物(试验编号11)制造内容物为下述配合的下述配合的粉剂(颗粒剂)。
＜配合比例＞
[配合例3]
使用试验例1的溶菌酶改性物(试验编号13)制造内容物为下述配合的下述配合的片剂。
＜配合比例＞
产业上的可利用性
本发明在将诺如病毒灭活的各种场合是有效的，例如作为进行手指、身躯、医疗器具、学校、医院、福利设施等设施、工厂、住所等的消毒的消毒剂、食品添加剂、诺如病毒的除去剂、感染预防或治疗药是有用的。
以上是本发明的实施方式的说明。本发明包含与实施方式中说明的构成实质上相同的构成(例如，功能、方法和结果相同的构成、或目的和效果相同的构成)。另外，本发明包含将实施方式中说明的构成的非本质的部分置换的构成。另外，本发明包含与实施方式中说明的构成产生相同的作用效果的构成或能够实现相同目的的构成。另外，本发明包含在实施方式中说明的构成中附加了公知技术的构成。

Claims (15)

1.一种诺如病毒灭活剂，含有选自溶菌酶和/或其盐以及它们的改性物中的至少1种的溶菌酶类。
2.根据权利要求1所述的诺如病毒灭活剂，其中，所述溶菌酶类的含量为0.05质量％以上。
3.根据权利要求1或2所述的诺如病毒灭活剂，其中，所述溶菌酶类的由下述定义规定的荧光强度为4000以上，
所述荧光强度是如下测定的荧光强度，即，在以所述溶菌酶类的浓度以固体成分换算计为0.05质量％、且磷酸盐的浓度为0.2M的方式用pH7.0的磷酸缓冲液稀释而得到的稀释液5mL中添加8mM的1,8－苯胺基萘磺酸的甲醇溶液25μL，使得到的液体在室温下反应30分钟后，在激发波长390nm、激发带宽10nm和荧光波长470nm、荧光带宽10nm的条件下对该液体进行测定。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的诺如病毒灭活剂，其中，所述溶菌酶类的下述所规定的抗诺如病毒活性为2.0以上，
所述抗诺如病毒活性是将等量混合诺如病毒液和所述溶菌酶类的2质量％水溶液而得到的诺如病毒混合液在室温下放置1分钟时，从放置前的感染效价的对数减去放置后的感染效价的对数而得的值。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的诺如病毒灭活剂，其为液剂。
6.一种诺如病毒的灭活方法，包含使用选自溶菌酶和/或其盐以及它们的改性物中的至少1种的溶菌酶类将诺如病毒灭活的工序。
7.一种诺如病毒灭活用溶菌酶类的制造方法，是权利要求1～5中任一项所述的诺如病毒灭活剂中含有的诺如病毒灭活用溶菌酶类的制造方法，包含将溶菌酶和/或其盐加热改性的工序。
8.一种诺如病毒灭活剂的制造方法，包含含有选自溶菌酶和/或其盐以及它们的改性物中的至少1种的溶菌酶类的工序。
9.根据权利要求8所述的诺如病毒灭活剂的制造方法，其中，包含将溶菌酶和/或其盐加热改性而得到加热改性物的工序和得到含有该加热改性物的诺如病毒灭活剂的工序。
10.根据权利要求9所述的诺如病毒灭活剂的制造方法，其中，所述得到加热改性物的工序包含：
第1加热工序，对波长660nm的光的透射率超过70％、pH为5.0～7.0、且溶菌酶和/或其盐的浓度以固体成分换算计为0.5质量％～7质量％的溶菌酶和/或其盐的水溶液进行加热直到该水溶液的波长660nm的光的透射率成为70％；
第2加热工序，在所述第1加热工序之后，将该水溶液加热至所述水溶液的波长660nm的光的透射率小于70％的极小值后，对该水溶液进行加热直到该水溶液的波长660nm的光的透射率成为70％；以及
第3加热工序，在所述第2加热工序之后，在所述水溶液的波长660nm的光的透射率超过70％的状态下进一步对该水溶液进行加热。
11.根据权利要求10所述的诺如病毒灭活剂的制造方法，其中，所述第3加热工序的加热条件为在将该第3加热工序中得到的水溶液用0.45μm的膜过滤器过滤而得到的物质和乙醇以质量比1：1的比例混合时进行加热直到波长660nm的光的透射率成为85％以上的条件。
12.根据权利要求10或11所述的诺如病毒灭活剂的制造方法，其中，在所述第3加热工序之后，进一步包含使所述水溶液喷雾干燥或冷冻干燥而得到粉末状的所述改性物的工序。
13.一种诺如病毒感染的预防药或治疗药，包含选自溶菌酶和/或其盐以及它们的改性物中的至少1种的溶菌酶类。
14.一种诺如病毒灭活用皮肤外用剂，包含选自溶菌酶和/或其盐以及它们的改性物中的至少1种的溶菌酶类。
15.一种溶菌酶类，是用于诺如病毒的灭活的选自溶菌酶和/或其盐以及它们的改性物中的至少1种。
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