JP7029749B2

JP7029749B2 - 真菌を原因とする皮膚疾患に対する予防・改善剤

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Publication number: JP7029749B2
Application number: JP2018012483A
Authority: JP
Inventors: 晋平川原井; 美佐望月
Original assignee: SCHOOL CORPORATION,AZABU VETERINARY MEDICINE EDUCATIONAL INSTITUTION
Current assignee: SCHOOL CORPORATION,AZABU VETERINARY MEDICINE EDUCATIONAL INSTITUTION
Priority date: 2018-01-29
Filing date: 2018-01-29
Publication date: 2022-03-04
Anticipated expiration: 2038-01-29
Also published as: JP2019131481A

Description

本発明は、真菌を原因とする皮膚疾患に対する予防・改善剤及び該予防・改善剤を皮膚に接触させることによりほ乳動物の皮膚疾患を予防・改善する方法に関するものである。

真菌は環境中に非常に多くの数と種類が存在し、ほ乳動物の皮膚に常在するものもある。そして、これら真菌を原因とする皮膚疾患は多く、その治療法は抗真菌薬剤によるものが一般的で種々の薬剤が開発されているが、副作用が生じるという問題がある。

更に、抗真菌薬剤の多用により、耐性菌が出現し始めている。実用化されている抗真菌薬剤の多くが類似の作用メカニズムを有しているため、耐性菌が出現すると交差耐性となり、複数の抗真菌薬剤が使えなくなるという問題がある。

真菌を原因とする皮膚疾患は発症数が多く、重症化すると長期にわたって抗真菌薬剤を用いなくてはならないことから、副作用と耐性菌の出現は大きな問題となる。中でも、皮膚に常在するマラセチア属真菌を原因とする皮膚疾患は、イヌの皮膚疾患の中で罹患率が高く、従来、抗真菌薬剤入りのシャンプーによる発症箇所の洗浄や抗真菌薬剤の内服による治療が行われている。しかし、内服治療には肝障害などの副作用を生じる場合があり、繰り返す外用治療では耐性菌の出現が問題となっている。また、常在するマラセチア属菌が再び過剰増殖した際には繰り返し使用しなければならないため、長期間使用できる安全な予防・改善剤が望まれる。

特許文献１には、マルバテイショウソウという植物の抽出物がマラセチア属真菌に対する抗菌作用を奏することが記載されているが、抽出物の製造には手間や費用がかかるという問題がある。

特開２０１４－６２０５８号公報

本発明は、副作用の心配がなく、抗真菌薬剤の多用による耐性菌出現のリスクを少なくすることにより、長期間にわたり安全に使用することが可能で、安価に簡単に製造できる、真菌を原因とする皮膚疾患の予防・改善剤を提案することを課題とする。

上記課題を解決する本発明は次の内容のものである。

（１）次の成分（A）と成分（Ｂ）と成分（Ｃ）と成分（Ｄ）及び水
（A）陽イオン
（B）陰イオン
（C）メタケイ酸
（D）メタホウ酸
を含有する液状体であって、
成分（Ａ）としてナトリウムイオン及びカルシウムイオンを含有し、
該液状体１ｋｇ当たり、ナトリウムイオンの含有量は下限値１ｇ、上限値１０ｇであり、
カルシウムイオンの含有量は下限値１ｇ、上限値１０ｇであり、
成分（Ｂ）として塩素イオンを含有し、
該液状体１ｋｇ当たり、塩素イオンの含有量は下限値２ｇ、上限値２５ｇであり、
成分（Ａ）と成分（Ｂ）と成分（Ｃ）と成分（Ｄ）との合計含有量が、該液状体１ｋｇ当たり、下限値５ｇ、上限値１２０ｇである。

前記液状体は、マラセチア属真菌を原因とするヒト以外のほ乳動物の皮膚疾患の予防・改善剤である。

マラセチア属真菌とは、担子菌酵母類真菌のマラセチア属に属する真菌である。

前記液状体は、マラセチア属真菌数を減少させる。

前記液状体１ｋｇ当たり、ナトリウムイオンの含有量は下限値１．５ｇ、上限値９ｇ、カルシウムイオンの含有量は下限値１．５ｇ、上限値９ｇ、塩素イオンの含有量は下限値４ｇ、上限値２０ｇである。

前記液状体１ｋｇ当たり、成分（C）の含有量は下限値０．０１ｇ、上限値２ｇである。

前記液状体１ｋｇ当たり、成分（D）の含有量は下限値０．０１ｇ、上限値２ｇである。

前記液状体は、マラセチア属真菌を原因とする皮膚疾患を罹患したヒト以外のほ乳動物の皮膚に接触させて使用する。

ヒト以外のほ乳動物のマラセチア属真菌を原因とする皮膚疾患の予防・改善方法は、前記皮膚疾患の予防・改善剤を皮膚に接触させる。

本発明の予防・改善剤は、真菌を原因とする皮膚疾患を予防したり、症状を軽減・改善したりすることができるものである。副作用の心配がなく、抗真菌薬剤の多用による耐性菌出現のリスクが少ないことから、長期間にわたり安全に使用でき、安価に簡単に製造できることから経済的に有利である。

マラセチア属真菌を原因とする皮膚炎を発症したイヌに本発明の予防・改善剤を使用したところ、紅斑及び脱毛範囲が減少し、症状が改善されたことを示す写真である。マラセチア属真菌を原因とする皮膚炎を発症したイヌに本発明の予防・改善剤を使用したところ、右前肢腋窩の苔癬化範囲が減少し、症状が改善されたことを示す写真である。マラセチア属真菌を原因とする皮膚炎を発症したイヌに本発明の予防・改善剤を使用したところ、飼い主による痒みスコアが減少したことを示すグラフである。マラセチア属真菌を原因とする皮膚炎を発症したイヌに本発明の予防・改善剤を使用したところ、皮膚上のマラセチア属真菌数が減少したことを示すグラフである。本発明の予防・改善剤にマラセチア属真菌を浸漬処理することにより、マラセチア属真菌のコロニー周辺のディクソン培地が透明になったことを示す写真である。本発明の予防・改善剤に浸漬処理したマラセチア属真菌のＲＮＡシークエンスをした結果、マラセチア属真菌の遺伝子発現レベルが変動したことを示すプロット図である。

本発明において「予防・改善」とは、真菌を原因とする皮膚疾患の発症の予防・抑制、症状の緩和・改善等でよい。好ましくは、真菌の発育・増殖の抑制や皮膚疾患の発症箇所又はその周辺等の皮膚上の真菌数の減少であればよく、真菌を死滅させることは必要としない。本発明の予防・改善剤は、医薬品、医薬部外品に限らず、化粧品、洗浄料などの皮膚外用剤も含む。その使用は治療的使用（医療行為）であっても非治療的使用（非医療的な行為）であってもよい。上記使用の対象は、特に限定はないが、好ましくはほ乳動物である。

本発明の予防・改善剤は、成分（Ａ）として陽イオン、成分（Ｂ）として陰イオン、成分（Ｃ）としてメタケイ酸、成分（Ｄ）としてメタホウ酸、及び水を含有する液状体である。

成分（Ａ）は、ナトリウムイオン及びカルシウムイオンを含み、その他の陽イオンを含んでもよい。その他の陽イオンに限定はなく、無機イオン、有機イオンのどちらでもよく、複数の陽イオンを含んでもよい。一例として、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、マグネシウム属元素イオン、アルミニウム属元素イオン、鉄族元素イオンなどが挙げられ、好ましくはカリウムイオン、バリウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、アルミニウムイオン、鉄イオンなどが挙げられる。

ナトリウムイオンの含有量の下限値は、予防・改善剤１ｋｇ当たり、例えば１ｇ、好ましくは１．５ｇ、より好ましくは２ｇであり、上限値は、例えば１０ｇ、好ましくは９ｇ、より好ましくは８ｇである。カルシウムイオンの含有量の下限値は、予防・改善剤１ｋｇ当たり、例えば１ｇ、好ましくは１．５ｇ、より好ましくは２ｇであり、上限値は、例えば１０ｇ、好ましくは９ｇ、より好ましくは８ｇである。

成分（Ｂ）は、塩素イオンを含み、その他の陰イオンを含んでもよい。その他の陰イオンに限定はなく、無機イオン、有機イオンのどちらでもよく、複数の陰イオンを含んでもよい。一例として、炭酸イオン、炭酸水素イオン、硫酸イオン、水酸イオン、臭素イオン、硫化水素イオン、ヨウ素イオン、フッ素イオンなどが挙げられる。その他に、酢酸、クエン酸、シュウ酸、スルホン酸などの有機酸イオンなどが挙げられる。

塩素イオンの含有量の下限値は、予防・改善剤１ｋｇ当たり、例えば２ｇ、好ましくは４ｇ、より好ましくは６ｇであり、上限値は、例えば２５ｇ、好ましくは２０ｇ、より好ましくは１６ｇである。

成分（Ｃ）の含有量の下限値は、予防・改善剤１ｋｇ当たり、例えば０．０１ｇ、好ましくは０．０２ｇであり、上限値は、例えば２ｇ、好ましくは１ｇである。

成分（Ｄ）の含有量の下限値は、予防・改善剤１ｋｇ当たり、例えば０．０１ｇ、好ましくは０．０２ｇとであり、上限値は、例えば２ｇ、好ましくは１ｇである。

成分（Ａ）と成分（B）と成分（C）と成分（Ｄ）との含有量の合計下限値は、予防・改善剤１ｋｇ当たり、例えば５ｇ、好ましくは８ｇ、より好ましくは１０ｇであり、上限値は、例えば１２０ｇ、好ましくは１００ｇ、より好ましくは８０ｇである。

本発明の予防・改善剤において使用する水は特に限定はない。

本発明の予防・改善剤のｐHは、生理学的又は薬理学的に許容できる範囲であれば限定されないが、例えば、ｐH４～９．５、好ましくはｐH４．５～９、より好ましくはｐH５～８．５とすることができる。

本発明の予防・改善剤の製造方法については特に限定はなく、一例として、水に塩（酸由来の陰イオンと塩基由来の陽イオンとがイオン結合した化合物）、メタケイ酸、メタホウ酸を溶解又は懸濁させることにより製造する。水の温度を上げたり、ｐHを調整したりすることにより、上記各成分を溶解又は懸濁させやすくするなどしてもよい。

用いる塩は、「薬理学的に許容される塩」を用いるのが好ましく、塩の水和物を含んでいてもよい。塩、メタケイ酸、メタホウ酸は一般に販売されているものを用いることができ、純度に限定はない。

塩は、少なくともナトリウムを含む塩、カルシウムを含む塩、塩素を含む塩を用いるのが好ましく、無機塩か有機塩かは問わない。ナトリウムを含む塩は、一例として、塩化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、硫酸ナトリウムなどの無機塩が挙げられる、その他に、一例として、カルボキシ基、スルホ基等を有する有機酸とナトリウムとの有機塩等が挙げられ、好ましくは、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、シュウ酸ナトリウム、スルホン酸ナトリウムなどが挙げられる。

カルシウムを含む塩は、一例として、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、炭酸水素カルシウム、硫酸カルシウムなどの無機塩が挙げられる。その他に、一例として、カルボキシル基、スルホ基等を有する有機酸とカルシウムとの有機塩等が挙げられ、好ましくは、酢酸カルシウム、クエン酸カルシウム、シュウ酸カルシウム、スルホン酸カルシウムなどが挙げられる。

塩素を含む塩は、一例として、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化アンモニウム、塩化マグネシウム、塩化鉄、塩化アルミニウム、塩化アンモニウムなどが挙げられる。

ナトリウムを含む塩、カルシウムを含む塩、塩素を含む塩を加える量は、ナトリウムイオン、カルシウムイオン、塩素イオンの各濃度が、本発明の予防・改善剤の範囲になるように加える。

ナトリウムイオンの含有量の下限値は、予防・改善剤１ｋｇ当たり例えば１ｇ、好ましくは１．５ｇ、より好ましくは２ｇとなり、上限値は、予防・改善剤１ｋｇ当たり例えば１０ｇ、好ましくは９ｇ、より好ましくは８ｇとなるように加える。カルシウムイオンの含有量の下限値は、予防・改善剤１ｋｇ当たり例えば１ｇ、好ましくは１．５ｇ、より好ましくは２ｇとなり、上限値は、予防・改善剤１ｋｇ当たり例えば１０ｇ、好ましくは９ｇ、より好ましくは８ｇとなるように加える。塩素イオンの含有量の下限値は、予防・改善剤１ｋｇ当たり例えば２ｇ、好ましくは４ｇ、より好ましくは６ｇとなり、上限値は、予防・改善剤１ｋｇ当たり例えば２５ｇ、好ましくは２０ｇ、より好ましくは１６ｇとなるように加える。

ナトリウムを含む塩、カルシウムを含む塩、塩素を含む塩以外の塩を加えてもよい、例えば、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩、マグネシウム属元素塩、アルミニウム属元素塩、鉄族元素塩などが挙げられる。好ましくはカリウム、バリウム、マグネシウム、亜鉛、アルミニウム、鉄を含む塩などが挙げられる。

メタケイ酸は、予防・改善剤１ｋｇ当たり、下限値は例えば０．０１ｇ、好ましくは０．０２ｇとなり、上限値は例えば２ｇ、好ましくは１ｇとなるように加える。メタホウ酸は、予防・改善剤１ｋｇ当たり、下限値は例えば０．０１ｇ、好ましくは０．０２ｇとなり、上限値は例えば２ｇ、好ましくは１ｇとなるように加える。

加える塩とメタケイ酸とメタホウ酸との合計量の下限値は、予防・改善剤１ｋｇ当たり例えば５ｇ、好ましくは８ｇ、より好ましくは１０ｇであり、上限値は、予防・改善剤１ｋｇ当たり例えば１２０ｇ、好ましくは１００ｇ、より好ましくは８０ｇとなるようにする。

本発明の予防・改善剤は、一例として、鉱泉に成分（Ａ）、成分（Ｂ）、成分（Ｃ）、成分（Ｄ）、水などを適宜加えたり、鉱泉を濃縮したりすることにより製造してもよい。鉱泉とは、地中から湧出する温水及び鉱水の泉水で、多量の固形物質、またはガス状物質、もしくは特殊な物質を含むか、あるいは泉温が、源泉周囲の年平均気温より常に著しく高いものをいう（鉱泉分析法指針（平成２６年改訂）、環境省自然環境局）。好ましくは、前記鉱泉分析法指針の定める塩化物泉が挙げられ、より好ましくはナトリウム－塩化物泉、カルシウム－塩化物泉などが挙げられる。前記鉱泉分析法指針の定める塩化物泉とは溶存物質（ガス性のものを除く）が１０００ｍｇ／ｋｇ以上のものであって、陰イオンの主成分が塩素イオンであるものをいい、陽イオンの主成分がナトリウムイオンのものをナトリウム－塩化物泉、陽イオンの主成分がカルシウムイオンのものをカルシウム－塩化物泉という。

温泉事業者が有する鉱泉を使用する場合、該鉱泉は温泉法に基づく成分の分析がなされているため、一例として、温泉法に基づく成分の分析結果を踏まえて、適宜、陽イオンを含む塩、陰イオンを含む塩、メタケイ酸、メタホウ酸、水などを加えることにより、本発明の予防・改善剤を製造してもよい。

鉱泉を使用する場合、鉱泉中の成分（Ａ）、成分（Ｂ）、成分（Ｃ）、成分（Ｄ）の含有量の測定方法に限定はなく、一般的に用いられる測定法により測定する。一例として、鉱泉分析法指針（平成２６年改訂）（環境省自然環境局）により測定することができる。

例えば、ナトリウムイオンは炎光法、カルシウムイオンは炎光法やキレート（ＥＤＴＡ）法、塩素イオンはイオン黒的グラフ法、メタケイ酸は重量法やモリブデンイエロー法による比色法、メタホウ酸はマンニット法などにより測定する。

本発明の予防・改善剤は、必要に応じて、滅菌工程を含めることができ、一例として、０．２２μｍのフィルターを用いた濾過滅菌や、１２１℃、１気圧、１５分間行う高圧蒸気滅菌などを用いる。

本発明の予防・改善剤は、本発明の効果を損なわない範囲で、医薬品、医薬部外品、化粧品等の外用剤として用いられ得る。その他に、本発明の予防・改善剤には、例えば、界面活性剤、油分、アルコール類、増粘剤、防腐剤、抗酸化剤、酸化防止剤、保存剤、キレート剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤、分散剤、香料、着色剤、色素等の添加剤を配合することができる。これらの添加剤は、１種を単独で又は２種以上を組み合わせて使用できる。

本発明の予防・改善剤は、本発明の効果を損なわない範囲で、その他の有効成分を含むことができる。有効成分の具体例としては、例えば、保湿成分、パール光沢付与剤、コンディショニング剤、スクラブ剤、血行促進成分、収斂成分、紫外線吸収成分、紫外線散乱成分、洗浄成分、抗菌成分、抗炎症剤、ビタミン類、ペプチド又はその誘導体、アミノ酸又はその誘導体、細胞賦活化成分などが挙げられる。

本発明の予防・改善剤は、医薬品、医薬部外品、化粧品・洗浄料などの外用剤などとして公知の形態であれば、特に限定されないが、例えば、液剤、懸濁剤、乳剤、ゲル剤、リニメント剤、ローション剤、エアゾール剤、不織布等のシートに外用組成物を含浸させたシート剤等の形態により、公知の方法で製剤化することができる。

本発明の予防・改善剤はヒト又はヒト以外のほ乳動物の皮膚疾患につき、皮膚に接触させて使用することができ、該皮膚疾患を引き起こす原因菌は、一例として真菌が挙げられ、好ましくは担子菌酵母類真菌が挙げられ、より好ましくはマラセチア属真菌が挙げられる。

皮膚疾患の原因となる真菌としては、一例として、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、マラセチア属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ）、ムーコル属（Ｍｕｃｏｒ）、フサリウム属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、クリプトコックス属（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、スポロトリクス属（Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ）、黒色真菌属（Ｄｅｍａｔｉａｃｅｏｕｓｆｕｎｇｉ）、トリコフィトン属（Ｔｒｉｃｈoｐｈｙｔｏｎ）、ミクロスポルム属（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｕｍ）、プロトテカ属（Ｐｒｏｔｏｔｈｒｃａ）などが挙げられる。真菌のうち、担子菌酵母類真菌は、一例として、カンジダ属、マラセチア属、クリプトコックス属などが挙げられる。担子菌酵母類真菌のうち、マラセチア属真菌は、一例として、マラセチアパチデルマチス（Ｍ．ｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ）、マラセチアグロボサ（Ｍ．ｇｌｏｂｏｓａ）、マラセチアレストリスタ（Ｍ．ｒｅｓｔｏｒｉｃｔａ）、マラセチアフルフル（Ｍ．ｆｕｒｆｕｒ）などが挙げられる。

マラセチア属真菌は、ほ乳動物全般の皮膚に常在する真菌であり、常在しているだけではなく様々な皮膚疾患との関わりを持っている。マラセチア属真菌を原因とする皮膚疾患としては、マラセチア性皮膚炎・癜風・マラセチア毛包炎・脂漏性皮膚炎・アレルギー（アトピーなど）性皮膚炎の悪化・脂漏性皮膚炎・脂漏性乾癬・ヒトの融合性細網状乳頭腫症に近い皮膚疾患などが挙げられる。

イヌやネコなどにおいては、マラセチア属真菌が原因となり、外耳炎、脂漏性皮膚炎、毛包炎を発症する。マラセチア属真菌はアトピー性皮膚炎の病変部で異常増殖し、皮膚炎を憎悪させる因子となることも知られている。また、再発性の皮膚炎も問題となっている。そして、マラセチア属真菌を原因とする皮膚疾患は、イヌの皮膚疾患の中で罹患率が高い。

本発明の予防・改善剤の使用方法は、ヒト又はヒト以外のほ乳動物の皮膚に予防・改善剤を接触させる方法を用いる。接触させる方法としては、予防・改善剤が皮膚に接触する態様であれば、特に限定はないが、一例として、皮膚に塗布する、噴霧する、塗布・噴霧した後に不織布や指等により塗り拡げる、予防・改善剤に皮膚を浸漬する、予防・改善剤で皮膚を洗浄することが挙げられる。

本発明の予防・改善剤の使用量や使用回数に、特に限定はなく、用途や製剤形態に応じて適宜設定するのが好ましい。直接塗布や噴霧して使用する場合には、一例として、１日数回、一回につき約０．２～０．５ｍｌ／１００ｃｍ^２使用する。患部などを浸漬する際の浸漬時間は、特に限定はないが、患者又は患畜の負担が大きくならないように留意するのが好ましい。患部などの洗浄に使用するに際しては、使用量等に限定はないが、洗浄の際の物理的刺激により、患部の炎症を悪化させないように留意するのが好ましい。

使用部位は特に限定はなく全身に使用することができる。一例として、真菌を原因とする皮膚疾患を発症している箇所やその周辺、皮膚疾患を発症しやすい箇所、皮膚疾患を発症する可能性がある箇所に使用する。

本発明の予防・改善剤は、一例として真菌を原因とする皮膚疾患の症状を予防、軽減、改善する。皮膚疾患の症状は、紅斑、湿疹、痒み、かぶれ、苔癬化、色素沈着、鱗屑、脱毛、脂漏、フケ、その他の炎症等が挙げられる。更に、真菌を原因とする皮膚疾患を発症した箇所やその周辺等の皮膚上の真菌の発育、増殖の抑制等や周辺等の皮膚上の真菌数の減少等に寄与する効果があることが好ましい。真菌の遺伝子の発現等に影響を及ぼす効果等があるケースもあり、一例としてプラントエスクパンシンに係る遺伝子の発現に影響を及ぼす。

ヒト又はヒト以外のほ乳動物におけるマラセチア属真菌を原因とする皮膚疾患においては、マラセチア性皮膚炎、癜風、マラセチア毛包炎、脂漏性皮膚炎、脂漏性角化症、アトピー性皮膚炎、外耳炎等の症状を改善し、皮膚疾患が生じている箇所の周囲や皮膚疾患を生じやすい箇所に使用することにより皮膚疾患部位が拡がることを予防し、皮膚疾患の前兆としてフケや痒みが生じた箇所に使用することにより皮膚疾患の発症を予防する。一例として、マラセチア属真菌を原因とするイヌの皮膚疾患に高い効果を奏する。

次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。

≪試験例１．皮膚炎改善・マラセチア属真菌数減少確認試験≫
マラセチア属真菌による皮膚炎を発症しているイヌに、本発明の予防・改善剤を使用することにより、皮膚炎が改善し、マラセチア属真菌数が減少することを確認する試験をおこなった。

（１）試料１の調整
静岡県静岡市焼津市栄町３－３６から湧出する鉱泉に含まれる成分につき、一般財団法人静岡県生活科学検査センターに依頼して鉱泉分析法指針（平成２６年改訂）（環境省自然環境局）に基づいて成分（Ａ）ないし成分（Ｄ）を測定した結果、該鉱泉は各成分及び各成分の含有量が本発明の予防・改善剤に含まれるものであり、本発明の予防・改善剤として使用できるものであることが分かった。そのため、該鉱泉を１２１℃、１気圧、１５分間行う高圧蒸気滅菌処理し、試料１とした。表１に試料１の各成分の含有量を示す。

（表１）

（２）試験例１の実施方法
マラセチア属真菌による皮膚炎により、脱毛、紅斑、丘疹、苔癬化、表皮肥厚、色素沈着、脂漏、鱗屑等の皮膚症状のあるイヌ５頭（症例１～症例５）に、１日１～２回、皮膚炎を発症している箇所と皮膚炎を発症しやすい箇所（外耳、四肢端、腋窩等）に試料１をスプレーした。試料１をスプレーした期間は、２週間以上とし、症状が改善して安定的に維持されたことを確認した時点で終了とした。試料１の使用量は体表面の1か所１回当たり０．２ｍｌ～０．５ｍｌ程度とした。尚、試験例１においては、各イヌの飼い主は、試料１を使用していることを認識している。

（３）目視による皮膚炎の改善確認
大学付属動物病院において皮膚科を主たる診療科目としている学識のある獣医師が、試験開始時と試験終了時におけるイヌの皮膚炎の状態を目視にて確認した。表２に症例１～５のイヌの疾患名、皮膚症状の箇所、使用期間、改善した症状などを示す。試験開始時と試験終了時における症例４の皮膚炎の状態を図１に、症例５の皮膚炎の状態を図２に示す。

（表２）

表２のとおり、試料１の使用により、イヌの皮膚炎は改善されたことが目視にて確認できた。

（３）痒みの軽減の確認
痒みの程度の指標として、飼い主による１１段階の痒みスコアを用いた。０を一般的な犬が掻くレベルとし、おおよそ３から５点を注意すると犬が掻くことを止めるレベル、おおよそ６から８点を注意しても犬が掻くことを止められないレベルとし、１０点を夜も眠れずに掻く動作を行っているレベルとした。試験１の実施期間中の痒みのレベルが何点であるか飼い主が評価した結果を図３に示す。図３から、いずれのイヌにおいても痒みは維持又は減少したことが分かる。痒みが増悪することにより、皮膚炎は悪化し、又は改善が困難になることから、痒みが維持又は減少することは皮膚炎の予防・改善に効果があると判断できる。

（４）マラセチア属真菌数の減少確認
マラセチア属真菌の菌数の変化を確認するために、皮膚炎を発症している皮膚表面の中央部の菌数を測定した。菌数は皮膚表面の迅速細胞診の検査法として一般的なテープ法を用いて測定した。具体的には、市販の１８ｍｍ幅の粘着性のある透明テープ（Ｓｃｏｔｃｈ（登録商標））を５ｃｍほど切りとり、皮膚炎発症している皮膚の中央部に該テープが約１～２ｃｍ貼付するようにくっつけた後、剥がしたテープをスライドグラスに軽く貼り付け、スライドグラスとテープの間に２５Ｇ針のついた１ｍｌシリンジを用いて染色液（ディフ・クイック染色液（登録商標）の第3液）を流し込んだ。余分な染色液を紙で吸い取った後、顕微鏡を用いて、テープに付着した菌数を、６００倍視野で５視野測定した。マラセチア属真菌は、球形から卵形の菌体がひとつあるいはダルマ状に分芽した特徴的な形態をもつため、容易に菌数を確認することができる。５視野に認める菌数が、おおよそ１視野あたりに認める最小から最大幅として、０～２個を１点、３～５個を２点、６～１０個を３点、１１～３０個を４点、３１個以上を５点の５段階に分けて評価した。例えば、1視野の菌数が０個、２個、０個、１個、０個の場合０～２個とし、１視野の菌数が３個、２個、５個、３個、３個の場合２～５個になるところ３～５個に含まれる範囲が多いことから３～５個とする。当該評価の結果を図４に示す。

症例１、５のイヌは、試料１の使用により、マラセチア属真菌の数は減少した。症例２、３、４のイヌは、試料１の使用により一旦菌数が減少したが、食物有害反応の症状を有するため、飼い主家族の子供などがこぼした食品を拾い食いした等の影響によりマラセチア属真菌の数が増加した。しかし、試料１の継続使用により、マラセチア属真菌数は再び減少した。

≪試験例２．二重盲検試験による皮膚炎改善・マラセチア属真菌数減少確認試験≫
（１）試験例２の実施方法
マラセチア属真菌による皮膚炎により、脱毛、紅斑、苔癬化、色素沈着、鱗屑等の皮膚症状のあるイヌ３頭（症例６～症例８）に、試料１を１日１～２回、皮膚炎を発症している箇所と皮膚炎を発症しやすい箇所（外耳、四肢端、腋窩等）に体表面の1か所１回当たり１ｍｌ～２ｍｌ程度スプレーした。１週間から１ヶ月程度休薬した後、蒸留水を１日１～２回、皮膚炎を発症している箇所を含めて全身の数か所に、３週間、体表面の1か所１回当たり１ｍｌ～２ｍｌ程度スプレーした。試験例２は、評価者と飼い主に使用する薬液の順序は伝えない二重盲検試験とした。評価者は、獣医皮膚科学会の認定医の資格をもっている皮膚科に秀でた獣医師とした。

（２）目視による皮膚炎の改善確認
試料１を使用開始時と3週間後におけるイヌの皮膚炎の状態を目視にて確認した。表３に症例６～８のイヌの疾患名、皮膚症状の箇所、改善した症状などを示す。

（表３）

表３のとおり、二重盲検試験においても、試料１を使用することによりイヌの皮膚炎は改善したことが目視にて確認できた。

（４）臨床スコアを用いた皮膚症状の軽減確認
皮膚炎の５種の症状（紅斑、苔癬化・色素沈着、鱗屑、脱毛、脂漏）について、飼い主又は評価者による４段階の評価（０点、１点、２点、３点）行い、その結果を臨床スコアとして表４に示す。臨床スコアの合計は最大１５点（５種×３点）である。

(表４)

表４のとおり、症例６、７においては、試料１を使用することにより蒸留水を使用したときに比べてイヌの臨床スコアは大きく減少し、皮膚症状が軽減したことが分かる。

（５）マラセチア属真菌数の減少確認
試験例１と同様にテープ法にてマラセチア属真菌数を確認した。試験例２では、１０００倍視野で１０視野において菌数を測定した。１０視野の合計菌数を表５に示す。

（表５）

表５のとおり、症例６、８においては、試料１を使用することにより蒸留水を使用したときに比べてマラセチア属真菌数は大きく減少したことが分かる。

（５）統計学的分析
上記臨床スコア及びマラセチア属真菌数の両データについて重複測定分散分析による統計解析を行った結果、それぞれ交互作用のＰ値が０．００７２１１と０．０００１９５になった。交互作用のP値が０．０１未満であることから、症例と測定時期に交互作用があり、試料１は皮膚炎の改善に効果があると判断できる。
≪試験例３．マラセチア属真菌に及ぼす作用試験≫
予防・改善剤がマラセチア属真菌に及ぼす作用について試験を行った。

（１）試料２の調整
静岡県静岡市焼津市栄町３－３６から湧出する鉱泉を、０．２２μｍのフィルターを用いて無菌チューブ内に濾過滅菌し、４℃の冷蔵庫内で保管したもの試料２とした。

（２）比較品１～９の調整
比較品１は滅菌した蒸留水を用い、比較品２～９は各採取地から採取した鉱泉を用いた。いずれも０．２２μｍのフィルターを用いて無菌チューブ内に濾過滅菌し、４℃の冷蔵庫内で保管したものを使用した。比較品２～９の成分（Ａ）～成分（Ｄ）の含有量は、各鉱泉の温泉分析結果を参考とした成分（Ａ）～成分（Ｄ）の合計含有量は、各鉱泉の温泉結果の溶存物質（ガス性のものを除く）の値を参考にした。

（３）使用したマラセチア属真菌
マラセチア属真菌による皮膚炎に罹患した３頭のイヌの皮膚炎から単離したマラセチア属真菌（菌株イ、菌株ロ、菌株ハ）及び健康なヒトの皮膚から単離したマラセチア属真菌（菌株ニ）を用いた。

菌株イ～ニの単離方法、同定方法、抗真菌薬剤耐性の有無の確認方法を以下に記載する。

（ｉ）菌株の単離方法
皮膚炎や脱毛などの皮膚症状を発症し、押捺標本検査にて患部からマラセチア属真菌が検出された３頭のイヌの病変部皮膚及び耳垢、そして健康なヒトの耳垢から医科用捲綿子を用いて、菌を採取した。採取した菌株を、クロラムフェニコールを２５ｇ／ｍｌ添加した低pHマイコフィル寒天培地（和光純薬株式会社製）に播種し、ディクソン寒天培地にて３日間培養を行い、酵母様真菌からなるコロニーを単離した。ディクソン寒天培地は、酵母エキス３．６質量％、ペプトン０．６質量％、オキシビル２．０質量％、ポリエチレン（２０）ソルビタンモノパルミタート（Ｔｗｅｅｎ（登録商標）４０）１．０質量％、グリセロール０．２質量％、オレイン酸０．２％質量、寒天１．５質量％であり、いずれも和光純薬工業株式会社製を用いた。

（ｉｉ）菌株の形態
単離した菌株イ～ニのコロニーをとり、蒸留水に混ぜ、スライドガラスに塗抹しグラム染色を行い、顕微鏡で菌の形態を確認したところ、マラセチア属真菌に特異的なダルマ状の形態が確認できたことから、菌株イ～ニはマラセチア属真菌属（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａｓｐ．）であることを確認した。

（ｉｉｉ）ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート等の利用能試験
クロラムフェニコール０．０５質量％とシクロヘキシミド０．０５質量％を添加した約１２０℃１５分間、１気圧のオートクレーブにて滅菌したサブロー寒天培地（関東化学株式会社製）にクロラムフェニコール０．０５質量％及びシクロヘキシミド０．０５質量％も添加した培地１６ｍｌを約６０℃まで冷却した後、１０^５ｃｆｕ/mlに調節した菌株イ～ハの菌液２ｍｌを混合し、シャーレに注入した。菌液を混合しサブロー寒天培地が固化した後、培地に直径約２mmの穴を４ヶ所空け、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０、和光純薬株式会社製）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミタート（Ｔｗｅｅｎ４０、和光純薬株式会社製)、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ６０、和光純薬株式会社製)、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ８０、和光純薬株式会社製)を５μｌずつ注入し、３２℃で７日間培養したところ、培地全体に一様にコロニーが出現した。以上より、単離した菌株イ～ハは生理学的にマラセチアパチデルマチス（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａｐａｃｈｙｄｅｒｍａｔｉｓ）であることが判明した。

（ｉｖ）菌株イ～ハ（マラセチアパチデルマチス）の遺伝子配列解析
遺伝子学的に菌種とその型を明らかにするために、酵母菌ゲノムのＩＧＳ（Intergenic spacer １）領域を、ＰＣＲ法を用いて遺伝子増幅した。シークエンス解析結果をSugita Tらの報告（DNA sequence diversity of intergenic spacer 1 region in the non-lipid-dependent species Malassezia pachydermatis isolated from animals. Med Mycol. 43(1):21-6.2005）に合わせて比較した結果、菌株イ～ハはいずれも配列において、４３０―４４９ｂｐの領域に（ＣＡＧＣＡ）の繰り返し配列が4回以上認められず、６０２ｂｐ－６２３ｂｐの領域に（ＣＡＧＣＡＴＡＡＣＡＴＡＡＣＡＣＡＣＡＡＣＡ）の配列があったことからグループ３であるとし、配列の相当性から３Ｄ型であるとした。３Ｄ型はイヌアトピー性皮膚炎の症例に由来が多い型として報告されている（Kobayashi Tら、Genotyping of Malassezia pachydermatis isolated from canine health skin and atopic dermatitis by internal spacer 1 (IGS1) region analysis. Veterinary Dermatology. 22(5):401-5. 2011）。

（ｖ）菌株イ～ハの抗真菌薬剤耐性試験
約１１５℃ １５分間、1気圧のオートクレーブにて滅菌したディクソン寒天培地を約６０℃まで冷却した後、培地１６ｍｌと１０^５cfu/mlに調節した菌株イ～ハの菌液２mlを混合して、シャーレに注入した。ディクソン寒天培地が固化した後、培地の中央部に直径約２ｍｍの穴を１ヶ所空け、滅菌蒸留水で100倍に希釈したミコナゾール硝酸塩０．０２ｇ／ｍｌとクロルヘキシジングルコン酸塩０．０２ｇ／ｍｌを含む抗真菌薬剤シャンプー溶液（マラセブ（登録商標）、キリカン洋行）を５μl注入し、３２℃で７日間培養したところ、菌株イ、ハは、抗真菌薬剤溶液を注入した穴の周囲は菌が生育せず阻止円が確認できたが、菌株ロは阻止円が確認できなかったことから、菌株イ、ハは抗真菌薬剤耐性がなく、菌株ロは抗真菌薬剤耐性を有することが確認できた。

菌株イ～ニについて、表６にまとめた。

（表６）

（４）マラセチア属真菌に及ぼす作用を確認する試験方法）
菌株イ～ニを、ディクソン寒天培地で１週間、３７℃で培養し、直径２ｍｍのコロニー１つを生理食塩水で洗浄した後、遠心分離を行い、上清を捨てた。残った菌株イ～ニにそれぞれ試料２を加えて懸濁し、３７℃で２４時間静置培養した後、培養液をディクソン寒天培地に播種し、３７℃で１週間培養した。

比較試験として、試料２の代わりに比較品１～９を用いて同様の試験を行った。試料２及び比較品１～９の陽イオン、陰イオン、非解離成分の含有量等を表４に示す。

（表７）

ディクソン培地は通常不透明な胆汁色であるところ、試料２に浸漬させた菌株イ～ハのコロニー周辺のみ、ディクソン培地が透明になったことが目視にて確認できた。図５に菌株ロのコロニー周辺の培地が透明になった写真を示す。一方、比較品１～９に浸漬させた菌株イ～ハのコロニー周辺のディクソン培地には何の変化もなかった。したがって試料２はマラセチア属真菌に何らかの影響を与え、発育のためには菌の栄養要求量が高まるような障害を与えているものと推測される。

≪試験例４．マラセチア属真菌遺伝子に及ぼす作用確認試験≫
試料２がマラセチア属真菌に与える影響を遺伝子レベルで確認するために、マラセチア属真菌の全ＲＮＡシークエンス解析を行った。

（１）試験菌の調整
ディクソン寒天培地で１週間、３７℃で培養した菌株ロの直径２ｍｍのコロニーを１つ、白金耳で釣菌して1mlの生理食塩水に混濁させた。マッシャーでやさしくすりつぶして１菌となるように菌を分離した後、遠心分離を行い、上清を捨てた。残った菌株ロに試料２を加えて懸濁し、３７℃で２４時間静置培養した。培養液をディクソン寒天培地に播種し、３７℃で１週間培養して得られた直径２ｍｍのコロニーを形成する菌を試験菌とした。尚、試験菌をディクソン寒天培地で培養すると、試験例３と同様に菌コロニーの周囲の培地が透明化した。

（２）比較菌の調整
比較品１（蒸留水）を用い、それ以外は試験菌と同様の方法で比較菌を得た。尚、比較菌をディクソン寒天培地で培養すると、試験例３と同様に菌コロニーの周囲の培地に変化はなかった。

（３）ＲＮＡの抽出・ＲＮＡ解析
試験菌及び比較菌について、市販のＲＮＡ抽出キットであるヌクレオスピン（登録商標）ＲＮＡプラス（タカラバイオ株式会社製）及びイーストプロセッシングリージェント（タカラバイオ株式会社製）を用いてＲＮＡを抽出した。ＲＮＡの抽出方法はＲＮＡ抽出キットの使用方法に従って行った。抽出したＲＮＡを株式会社アプロサイエンス（徳島県）に依頼してＲＮＡ解析を行った。

図６に示すとおり、試験菌は比較菌に比べ、発現に差のある遺伝子が８つ確認されたことから、試料２はマラセチア属真菌の遺伝子の発現に影響を及ぼす作用があることが分かった。発現に差が出た遺伝子のひとつはプラントエクスパンシン（Ｐｌａｎｔｅｘｐａｎｓｉｎ）に係る遺伝子であり、その発現が低下していたことが分かった。真菌由来のプラントエクスパンシンは、真菌の細胞壁リモデリング因子として作用し、植物由来のエクスパンシン同様に真菌の発育増殖に関係すると考えられている。（Tovar-Herrera OE, et al., A novel expansin protein from the white-rot fungus Schizophyllum commune. PLoS One. 2015 Mar 24;10(3):e0122296.）。

試料２は、プラントエクスパンシンに係る遺伝子の発現を低下させるような障害をあたえる。障害をうけることがマラセチア属真菌の発育成長を維持するために必要な栄養要求量を高めて、マラセチア属真菌のコロニー周辺の透明化に深く関与したと考えられる。動物の表皮は培養条件下と異なって栄養素が充分ではなく、その結果マラセチア属真菌の皮膚における発育を抑制したものと判断するのが妥当である。

プラントエクスパンシンに係る遺伝子は、真菌全般が有する遺伝子であるから、本発明の予防・改善剤は、真菌全般に障害をあたえる作用がある。

Claims

次の成分（A）と成分（B）と成分（C）と成分（Ｄ）及び水
（A）陽イオン
（B）陰イオン
（C）メタケイ酸
（D）メタホウ酸
を含有する液状体であって、
成分（Ａ）としてナトリウムイオン及びカルシウムイオンを含有し、
該液状体１ｋｇ当たり、ナトリウムイオンの含有量は下限値１ｇ、上限値１０ｇであり、
カルシウムイオンの含有量は下限値１ｇ、上限値１０ｇであり、
成分（Ｂ）として塩素イオンを含有し、
該液状体１ｋｇ当たり、塩素イオンの含有量は下限値２ｇ、上限値２５ｇであり、
成分（Ａ）と成分（B）と成分（C）と成分（Ｄ）との合計含有量が、該液状体１ｋｇ当たり、下限値５ｇ、上限値１２０ｇであることを特徴とする、
マラセチア属真菌数を減少させることによりマラセチア属真菌を原因とするヒト以外のほ乳動物の皮膚疾患の予防・改善剤。
前記液状体１ｋｇ当たり、ナトリウムイオンの含有量は下限値１．５ｇ、上限値９ｇ、カルシウムイオンの含有量は下限値１．５ｇ、上限値９ｇ、塩素イオンの含有量は下限値４ｇ、上限値２０ｇであることを特徴とする請求項１記載の予防・改善剤。
前記液状体１ｋｇ当たり、成分（C）の含有量は下限値０．０１ｇ、上限値２ｇであることを特徴とする請求項１又は請求項２記載の予防・改善剤。
前記液状体１ｋｇ当たり、成分（D）の含有量は下限値０．０１ｇ、上限値２ｇであることを特徴とする請求項１ないし請求項３のいずれかに記載の予防・改善剤
請求項１ないし請求項４のいずれかに記載の皮膚疾患の予防・改善剤を皮膚に接触させることを特徴とするヒト以外のほ乳動物のマラセチア属真菌を原因とする皮膚疾患の予防・改善方法。