WO2022102612A1 - 歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤 - Google Patents

Abstract

歯ブラシの少なくともブラシ部の殺菌・ウイルス不活化のために用いられる、天然由来成分を有効量含有する歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤。好ましくは、天然由来成分の経口毒性の安全性が２，０００ｍｇ／ｋｇ以上、さらには１０，０００ｍｇ／ｋｇ以上である。好ましくは、殺菌・ウイルス不活化の効果が歯ブラシへの適用時から６時間、さらには１２時間、さらには２４時間継続するものである。好ましくは、前記天然由来成分がフムスエキスである。

Description

歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤

　本発明は、歯ブラシの少なくともブラシ部の殺菌・ウイルス不活化のために用いられる歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤に関する。

　口の中の歯周病菌は、唾液や血液により全身に運ばれ、脳梗塞、認知症、誤嚥性肺炎、心内膜炎、心筋梗塞、動脈硬化、糖尿病などの全身疾患を引き起こすことが知られている。そのため、歯磨き、マウスウォッシュなどにより口の中を清潔に保つ口腔ケアの重要性が強く認識されてきている。

　歯磨きに用いられる歯ブラシは、歯磨き後、水で洗浄した後にそのまま次の歯磨きの機会まで載置されるのが一般的であるが、その間に、歯ブラシの特にブラシ部に雑菌類やウイルスが多く付着してしまう。また、ブラシ部は水分を含んでいることが殆どであることから、付着した雑菌類が増殖しやすい。現状において、歯ブラシによる歯のブラシングで歯に付着した汚れを物理的に掻き落とすつもりが、実は歯ブラシに付着した雑菌類やウイルスを歯に付着させているという認識は余りなされていない。

　歯ブラシのブラシ部は、反発弾性の観点から多くはナイロン製であり、銀を用いて抗菌処理が施された製品もあるが、経口毒性といった安全面は不明な部分が多く、またその抗菌のレベルも「抗菌」を謳う程度のものに過ぎない場合が多い。

　たとえば特開２０００－１７８１５５号（特許文献１）には、界面活性剤とエチルアルコールとを含有する液体組成物を主剤とする歯ブラシ除菌フォーム用剤が開示されている。しかしながら、アルコール過敏症の人もいる一方で、揮発するとはいえアルコール類を口に入れるのに抵抗を覚える人もいる。

　また、たとえば実用新案登録第３１７８０５２号（特許文献２）には、二酸化塩素の水溶液を噴霧する除菌スプレーを用いた歯ブラシの除菌装置が開示されている。しかしながら、二酸化塩素は濃度によっては危険性を伴い、歯ブラシのように口の中に適用するものには安全性が求められる。

特開２０００－１７８１５５号 実用新案登録第３１７８０５２号

　本発明は、上記課題解決するためになされたものであり、口の中や周りに適用したとしても極めて高い安全性を有する、歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤を提供することである。

　本発明は、歯ブラシの少なくともブラシ部の殺菌・ウイルス不活化のために用いられる、天然由来成分を有効量含有する歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤である。

　本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤は、天然由来成分の経口毒性の安全性が２，０００ｍｇ／ｋｇ以上であることが好ましく、１０，０００ｍｇ／ｋｇ以上であることがより好ましい。

　本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤は、殺菌・ウイルス不活化の効果が歯ブラシへの適用時から６時間継続するものであることが好ましく、歯ブラシへの適用時から１２時間継続するものであることがより好ましく、歯ブラシへの適用時から２４時間継続するものであることがさらに好ましい。

　本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤において、前記天然由来成分がフムスエキスであることが好ましい。

　本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤において、前記天然由来成分が酵素をさらに含むことが好ましく、この場合、前記酵素はバチルスが分泌したものであることがより好ましい。

　本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤において、前記天然由来成分が有機酸を含むことが好ましい。

　本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤において、前記天然由来成分はフルボ酸およびフミン酸を含むことが好ましい。

　本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤は、天然由来の防腐剤をさらに含むことが好ましい。

　本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤は、スプレー、ミストまたはフォームの形態に製剤化されたものであることが好ましい。

　本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤は、５重量％未満のアルコールをさらに含有していてもよい。

　本発明によれば、口の中や周りに適用したとしても極めて高い安全性を有する、歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤を提供することができる。

追加実験例７でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｉｓについての試験菌液接種３分後の培地の写真である。 追加実験例７でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｉｓについての試験菌液接種３０分後の培地の写真である。 追加実験例７でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｉｓについての試験菌液接種２４時間後の培地の写真である。 追加実験例７でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｉｓの対照（滅菌生理食塩水）についての接種直後の培地の写真である。 追加実験例７でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｉｓの対照（滅菌生理食塩水）についての接種２４時間後の培地の写真である。 追加実験例７でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓについての試験菌液接種３分後の培地の写真である。 追加実験例７でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓについての試験菌液接種３０分後の培地の写真である。 追加実験例７でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓについての試験菌液接種２４時間後の培地の写真である。 追加実験例７でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓの対照（滅菌生理食塩水）についての接種直後の培地の写真である。 追加実験例７でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓの対照（滅菌生理食塩水）についての接種２４時間後の培地の写真である。 追加実験例７でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓについての試験菌液接種３分後の培地の写真である。 追加実験例７でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓについての試験菌液接種３０分後の培地の写真である。 追加実験例７でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓについての試験菌液接種２４時間後の培地の写真である。 追加実験例７でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの対照（滅菌生理食塩水）についての接種直後の培地の写真である。 追加実験例７でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの対照（滅菌生理食塩水）についての接種２４時間後の培地の写真である。 追加実験例７でのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓについての試験菌液接種３分後の培地の写真である。 追加実験例７でのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓについての試験菌液接種３０分後の培地の写真である。 追加実験例７でのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓについての試験菌液接種２４時間後の培地の写真である。 追加実験例７でのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの対照（滅菌生理食塩水）についての接種直後の培地の写真である。 追加実験例７でのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの対照（滅菌生理食塩水）についての接種２４時間後の培地の写真である。 追加実験例７でのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａについての試験菌液接種３分後の培地の写真である。 追加実験例７でのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａについての試験菌液接種３０分後の培地の写真である。 追加実験例７でのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａについての試験菌液接種２４時間後の培地の写真である。 追加実験例７でのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの対照（滅菌生理食塩水）についての接種直後の培地の写真である。 追加実験例７でのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの対照（滅菌生理食塩水）についての接種２４時間後の培地の写真である。 追加実験例８でのＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓについての試験菌液接種３０秒後の培地の写真である。 追加実験例８でのＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓについての試験菌液接種１分後の培地の写真である。 追加実験例８でのＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓについての試験菌液接種５分後の培地の写真である。 追加実験例８でのＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓについての試験菌液接種１時間後の培地の写真である。 追加実験例８でのＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの対照（滅菌生理食塩水）についての接種直後の培地の写真である。 追加実験例８でのＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの対照（滅菌生理食塩水）についての接種５分後の培地の写真である。 追加実験例８でのＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの対照（滅菌生理食塩水）についての接種１時間後の培地の写真である。 追加実験例８でのＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａについての試験菌液接種３０秒後の培地の写真である。 追加実験例８でのＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａについての試験菌液接種１分後の培地の写真である。 追加実験例８でのＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａについての試験菌液接種５分後の培地の写真である。 追加実験例８でのＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａについての試験菌液接種１時間後の培地の写真である。 追加実験例８でのＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの対照（滅菌生理食塩水）についての接種直後の培地の写真である。 追加実験例８でのＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの対照（滅菌生理食塩水）についての接種５分後の培地の写真である。 追加実験例８でのＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの対照（滅菌生理食塩水）についての接種１時間後の培地の写真である。 追加実験例８でのＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍについての試験菌液接種３０秒後の培地の写真である。 追加実験例８でのＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍについての試験菌液接種１分後の培地の写真である。 追加実験例８でのＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍについての試験菌液接種５分後の培地の写真である。 追加実験例８でのＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍについての試験菌液接種１時間後の培地の写真である。 追加実験例８でのＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍの対照（滅菌生理食塩水）についての接種直後の培地の写真である。 追加実験例８でのＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍの対照（滅菌生理食塩水）についての接種５分後の培地の写真である。 追加実験例８でのＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍの対照（滅菌生理食塩水）についての接種１時間後の培地の写真である。

　本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤は、歯ブラシの少なくともブラシ部の殺菌・ウイルス不活化のために用いられる、天然由来成分を有効量含有する。

　本発明において「天然由来成分」とは、天然物から抽出もしくは天然物を加工して得られた成分を指し、本発明には１または複数の天然由来成分が含まれ得る。

　また本発明において「有効量」とは、歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤として歯ブラシの少なくともブラシ部に適用した場合に、十分に殺菌・ウイルス不活化の効果を発揮できる天然由来成分の量を意味する。

　本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤によれば、従来のアルコール類、二酸化塩素を用いた場合とは異なり、天然由来成分を用いているため、口の中や周りに適用したとしても極めて高い安全性を有する。このように、歯ブラシ用の殺菌・抗ウイルス剤として天然由来成分を用いるという発想はこれまでにないものであり、従来、歯ブラシによる歯のブラシングで、実は歯ブラシに付着した雑菌類やウイルスを歯に付着させているという認識自体が余りなされていなかったことに鑑みれば、本発明は極めて画期的なものであるといえる。

　本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤は、実験例２（マウスを用いた急性経口毒性試験）で実証されているように、天然由来成分の経口毒性の安全性（ＬＤ_５０：半致死性）が好ましくは２，０００ｍｇ／ｋｇ以上であり、より好ましくは１０，０００ｍｇ／ｋｇ以上である。このように本発明は、人体に対する安全性を確保した天然由来成分を歯ブラシに適用するための殺菌・ウイルス不活化剤とする。

　また本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤は、後述する実験例３（抗菌力（レジオネラ）試験）、実験例５（抗菌力（常在菌）試験）、実験例６（インフルエンザウイルス不活化試験）、実験例７（ノロウイルス不活化試験）で実証されているように、殺菌・ウイルス不活化の効果が歯ブラシへの適用時から６時間継続するものであることが好ましい。さらには、実験例３、実験例６、実験例７で実証されているように、殺菌・ウイルス不活化の効果が歯ブラシへの適用時から１２時間継続するものであることがより好ましく、殺菌・ウイルス不活化の効果が歯ブラシへの適用時から２４時間継続するものであることが特に好ましい。

　ここで、従来用いられてきたアルコール類は即効性（短い時間で効果を発揮）の抗菌剤であり、その殺菌効果は短く、持続性に乏しいため、殺菌後のブラシ部への雑菌類の付着およびその後の雑菌類の増殖を防止することは難しいという問題もある。また同じく従来用いられてきた二酸化塩素は、空気に触れた瞬間に濃度が落ちてしまうため、アルコール類よりもさらに殺菌効果の持続性が極めて乏しく、殺菌後のブラシ部への雑菌類の付着およびその後の雑菌類の増殖を防止することは難しい。これに対し、本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤は、即効性を有するだけでなく、６時間、さらには１２時間、特には２４時間とその殺菌・ウイルス不活化効果が持続するものであることが好ましい。これにより、歯ブラシに適用後にブラシ部に雑菌類が付着したとしても殺菌効果が維持されているためその増殖を防ぐことができる。

　また、本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤は、好ましくは、実験例６および実験例７で立証されているように、エンベロープを有するウイルスであるインフルエンザウイルス、エンベロープを有さないウイルスであるノロウイルスの両方に不活化の効果を発揮する。

　本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤に用いられる天然由来成分としては、有効量で殺菌・ウイルス不活化効果を発揮し得るものであれば特に制限されるものではないが、特に好適な例としてフムスエキスを挙げることができる。フムスエキスとは、土壌菌を含む腐植土を発酵させたものの上澄み液として得られる土壌抽出液（エキス）を指し、それ自体は公知のものであり、公知の適宜の手法で製造することができるものである。好ましくは、後述する実験例１に記載のように滅菌処理を施し、希釈して用いられる。

　後述する実験例２～８はいずれもフムスエキスを検体として用いた試験であり、上述のように経口毒性の安全性（ＬＤ_５０：半致死性）が好ましくは２，０００ｍｇ／ｋｇ以上であり、より好ましくは１０，０００ｍｇ／ｋｇ以上であり、殺菌・ウイルス不活化の効果が即効性でありつつ、適用時から６時間、さらには１２時間、特には２４時間持続するものであることが立証されている。また皮膚刺激性もないため、口の中や周りに適用したとしても刺激もない。

　天然由来成分がフムスエキスである場合、本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤におけるその有効量は、好ましくは０．０００１重量％～１０．０重量％の範囲内であり、より好ましくは０．１重量％～１．０重量％の範囲内である。

　本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤における天然由来成分は、酸化還元反応のために酵素（酸化還元酵素）を含むことが好ましい。上述のように天然由来成分がフムスエキスである場合には、その中にバチルス（枯草菌：Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が含まれる。このように本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤における天然由来成分が酵素を含む場合、その酵素はバチルスが分泌したものであることが好ましい。

　天然由来成分がフムスエキスである場合、その中に、バチルスは好ましくは０．００００１重量％～１．０重量％の範囲内、より好ましくは０．０１重量％～０．１重量％の範囲内で含有される。

　また本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤における天然由来成分は、酸化還元反応のために有機酸を含むことが好ましい。上述のように天然由来成分がフムスエキスである場合には、その中に有機酸としてフルボ酸およびフミン酸が含まれる。このように本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤が有機酸を含む場合、有機酸は好ましくはフルボ酸およびフミン酸である。

　天然由来成分がフムスエキスである場合、その中に、フルボ酸は好ましくは１．６ｐｐｍ～１．０ｐｐｍの範囲内、より好ましくは１６ｐｐｍ～０．１ｐｐｍの範囲内で含有される。また天然由来成分がフムスエキスである場合、その中に、フミン酸は好ましくは１．６ｐｐｍ～１．０ｐｐｍの範囲内、より好ましくは１６ｐｐｍ～０．１ｐｐｍの範囲内で含有される。

　本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤は、天然由来の防腐剤をさらに含むことが好ましい。防腐剤としても天然由来のものを用いることで、人体に対する安全性がさらに確保される。天然由来の防腐剤としては、公知のものを特に制限なく用いることができ、たとえばトウモロコシ由来の１，３－ブチレングリコール（１，３－ＢＧ）、グレープフルーツを含む果実（グレープフルーツ種子抽出物であってもよい）、にがり、緑茶抽出物、タンニン、わさび、ヒノキチオール、ユーカリミントなどが挙げられる。

　本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤は、歯ブラシに適用しやすい形態であればどのように製剤化されてもよいが、スプレー、ミストまたはフォームの形態に製剤化されたものであることが好ましい。スプレー、ミストまたはフォームの形態への製剤化自体は公知の手法であり、適宜、当業者に慣用の方法で製造することができる。

　本発明の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤は、本発明の効果を阻害しない範囲で公知の適宜の添加剤が添加されていても勿論よく、また、５重量％以下であればエチルアルコールなどのアルコール類を含んでいてもよい。

　以下に実験例を挙げて、本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

　＜実験例１：フムスエキスの調製＞
　日本国内の腐植土から深層水を使用し、浸透させ成分を引き出し、３か月～２年熟成させてフムスエキス（性状：黄みを帯びた白濁液体）を調製した。得られたフムスエキスの希釈は、たとえば１０倍希釈の場合には、（１）攪拌機対応容器を用意、（２）容器に全体量９０重量％に該当するＲＯ水（逆浸透膜処理を施した水）を投入、（３）攪拌しながら徐々にフムスエキスを全体量１０重量％を投入、（４）全体量１００重量％に達したところで攪拌を停止、（５）上記攪拌用容器から配送用容器に充填を行う、との手順で行うことができる。なお、上記（２）に使用する水は、必ずしもＲＯ水でなくともよいが、安全性を考慮してＲＯ水と同等と思われる安全性を担保できる水を使用する。

　＜実験例２：マウスを用いた急性経口毒性試験＞
　実験例１で調製したフムスエキスを精製水で希釈し、４００ｍｇ／ｍＬの試験液を調製し、ＯＥＣＤ　Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｔｅｓｔｉｎｇ　ｏｆ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ　４０１（１９８７）に準拠し、マウスにおける急性経口毒性を調べた。

　試験動物であるマウスは、４週齢のＩＣＲ系雌雄マウスを日本エスエルシー株式会社から購入し、約１週間の予備飼育を行って一般状態に異常のないことを確認後、試験に使用した。試験動物はポリカーボネート製ケージに約５匹収容し、室温２３±２℃、照明時間１２時間／日に設定した飼育室において飼育した。飼料［マウス、ラット用固型飼料；ラボＭＲストック、日本農産工業株式会社］及び飲料水（水道水）は自由に摂取させた。

　１用量につき雌雄それぞれ１０匹を用いた。投与前に約４時間試験動物を絶食させた。体重を測定した後、試験群には雌雄ともに検体投与量として１７，０００、１４，７８０、１２，８５０、１１，１８０、９，７２０、８，４５０、７，３５０、６，３９０及び５，５６０ｍｇ／ｋｇの９用量（公比１．１５）を設定し、胃ゾンデを用いて強制単回経口投与した。対照群には雄では１．４ｍＬ、雌では１．２ｍＬの精製水を同様に投与した。観察期間は１４日間とし、投与日は頻回、翌日から１日１回の観察を行った。投与後７及び１４日に体重測定を行った。死亡例及び観察期間終了時の生存例を全て剖検した。死亡率からＰｒｏｂｉｔ法によりＬＤ_５０値を計算した。

　（結果）
　１）死亡例およびＬＤ_５０値
　死亡例数及び死亡率について、雄の結果を表１、雌の結果を表２に示す。

　死亡例は、投与後約５２分～２日に観察された。ＬＤ_５０値は、雄では１１，８７０ｍｇ／ｋｇ（９５％信頼限界９，６１３～１４，６５６ｍｇ／ｋｇ）、雌では９，２２９ｍｇ／ｋｇ（９５％信頼限界８，１２６～１０，４８１ｍｇ／ｋｇ）と計算された。対照群では、雌雄ともに観察期間中に死亡例は認められなかった。

　２）臨床症状
　臨床症状のうち自発運動の低下について、雄の結果を表３、雌の結果を表４に示す。臨床症状のうち体姿勢の異常（腹臥位）について、雄の結果を表５、雌の結果を表６に示す。臨床症状のうち下痢について、雄の結果を表７、雌の結果を表８に示す。

　試験群では、投与後約７分から自発運動の低下が雌雄ともにほぼすべての試験動物で見られた。また、投与後約４２分から体姿勢の異常（腹臥位）が雄では８，４５０ｍｇ／ｋｇ以上の投与群（９，７２０及び１２，８５０ｍｇ／ｋｇ投与群を除く。）、雌では９，７２０ｍｇ／ｋｇ以上の投与群で高用量ほど多数例で見られた。この他、雌の６，３９０及び１１，１８０ｍｇ／ｋｇ投与群を除くすべての投与群で投与当日から下痢が見られた。生存例では、自発運動の低下及び下痢は６日までに回復したが、体姿勢の異常（腹臥位）が見られた例はすべて死亡した。対照群では、雌雄ともに観察期間中に異常は見られなかった。

　３）体重変化
　体重変化について、雄の結果を表９、雌の結果を表１０に示す。

　試験群では、投与後７日の体重測定において、雄の１１，１８０及び１２，８５０ｍｇ／ｋｇ投与群で体重減少、８，４５０ｍｇ／ｋｇ投与群で体重増加抑制が認められた。雌では９，７２０及び１１，１８０ｍｇ／ｋｇ投与群で体重減少、７，３５０ｍｇ／ｋｇ投与群で体重増加抑制が認められた。投与後１４日の体重測定においては、雌雄ともに体重増加に異常は認められなかった。対照群では、雌雄ともに体重増加に異常は認められなかった。

　４）剖検所見
　死亡例の剖検所見についての雄の結果を表１１、雌の結果を表１２に示す。生存例の剖検所見についての雄の結果を表１３、雌の結果を表１４に示す。

　死亡例の剖検では、小腸内に淡黄白色半固形物の貯留、小腸粘膜（上部約５ｃｍ～小腸全体）の充血、出血または出血痕が多数例で見られた。前者は、投与当日ほど多数例に見られた。また、腺胃粘膜嚢の消失、前胃の菲薄化が見られ、投与後１日以降の死亡例では肝臓、腎臓及び脾臓のいずれかまたは全ての臓器と胃が接する部分の退色が見られた。この他、雄では胃内に水分及びガスの充満、脾臓の萎縮、雌では腺胃粘膜に出血痕が見られる例があった。生存例では、前胃の白変および腺胃粘膜の肥厚が見られた。また、雌では脾臓の萎縮が見られる例があった。対照群では、雌雄ともに主要臓器に異常は認められなかった。

　＜実験例３：抗菌力（レジオネラ）試験＞
　試験菌株としてＬｅｊｉｏｎｅｌｌａ　ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ　ＧＩＦＵ　９１３４（レジオネラ）を用い、Ｂ－ＣＹＥα寒天培地（栄研化学株式会社製）で３５℃±１℃、３日間培養後、再度Ｂ－ＣＹＥα寒天培地で３５℃±１℃、２～３日間培養し、菌体を精製水に懸濁させ、菌数が１０^８／ｍｌとなるように調製した。

　実験例１で調製したフムスエキスを精製水で２０倍希釈した検体１０ｍＬにレジオネラの菌液０．１ｍＬを接種（接種後の検体を試験液と呼称）後、４０℃±１℃で保存し、１、６及び２４時間後に試験液中の生菌数を菌数測定用培地を用いた平板塗抹培養法により測定した。なお、対照として精製水を用いて同様に試験した。ただし、生菌数の測定は開始時についても行った。結果を表１５に示す。

　＜実験例４：抗菌力（黄色ブドウ球菌、モラクセラ）試験＞
　ＪＩＳ　Ｌ　１９０２：２０１５「繊維製品の抗菌性試験方法及び抗菌効果」８．４　ハロー法（定性試験方法）を参考にして、抗菌力試験を行った。試験は以下に示す２菌株で実施し、平板培地は普通寒天培地をシャーレ（直径約９０ｍｍ）に１５ｍＬ分注して固化させた後、試験菌液０．１ｍＬを塗抹した。

　・Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ｓｕｂｓｐ．　ａｕｒｅｕｓ　ＮＢＲＣ　１２７３２（黄色ぶどう球菌）
　・Ｍｏｒａｘｅｌｌａ　ｏｓｌｏｅｎｓｉｓ　ＡＴＣＣ　１９９７６（モラクセラ）
　実験例１で調製したフムスエキスを精製水で２０倍希釈した検体約０．２ｇを試験片とし、平板培地の中央穿孔部を試験片を直接充填した。また、対照として精製水をペーパーディスク（直径１０ｍｍ）に０．０５ｍＬ含浸させたものを用いた。結果を表１６に示す。

　なお、ハローの幅Ｗ（ｍｍ）は、以下の式：
　　Ｗ＝（Ｔ－Ｄ）／２
により算出した（Ｔ：試験片の長さとハローの幅の合計（ｍｍ）、Ｄ：試験片の長さ（ｍｍ））。

　＜実験例５：抗菌力（常在菌）試験＞
　以下に示す３菌株
　・Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＦＯ　３９７２（大腸菌）
　・Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｅｎｔｅｒｉｌｉｄｉｓ　ＩＦＯ　３３１３（サルモネラ）
　・Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅｕｓ　ｓｕｂｓｐ．　ａｕｒｅｕｓ　ＩＦＯ　１２７３２（黄色ブドウ球菌）
を用いて抗菌力試験を行った。各試験菌株をＢｒａｉｎ　Ｈｅａｒｔ　Ｉｎｆｕｓｉｏｎ　Ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）で３５℃、１８～２４時間培養後、菌体をリン酸緩衝液に浮遊させ、菌数が約１０^６／ｍｌとなるように調製し、試験菌液とした。

　実験例１で調製したフムスエキスを精製水で２０倍希釈した検体２７ｍＬに試験菌液３ｍＬを接種し、試験液とした。これを室温で保存し、保存３０分、１、２、４及び６時間後に試験液１ｍＬをシャーレに採取し、菌数測定用培地（標準寒天培地（栄研器材株式会社製））を用いて混釈平板培養法（３５℃、２日間）で培養後、試験液１ｍＬ中の生菌数を測定した。なお、対照として、精製水を用いて同様に試験した。対照については接種直後及び６時間後について生菌数を測定した。結果を表１７に示す。

　＜実験例６：インフルエンザウイルス不活化試験＞
　細胞としてＭＤＣＫ（ＮＢＬ－２）細胞　ＡＴＣＣ　ＣＣＬ－３４株（大日本製薬株式会社製）を用い、細胞増殖培地（イーグルＭＥＭ培地「ニッスイ」（１）（日水製薬株式会社製）に牛胎仔血清を１０％加えたもの）を用いて使用培地を組織培養用フラスコ内に単層培養した。単層培養後にフラスコ内から細胞増殖培地を除き、試験ウイルスであるインフルエンザウイルスＡ型（Ｈ１Ｎ１）を接種した。

　次に、下記組成：
　　イーグルＭＥＭ培地「ニッスイ」（１）　　１０００ｍＬ
　　１０％　ＮａＨＣＯ_３　　　　　　　　　　　　 １４ｍＬ
　　Ｌ－グルタミン（３０ｇ／ｌ）　　　　　　　９．８ｍＬ
　　１００×ＭＥＭ用ビタミン液　　　　　　　　　３０ｍＬ
　　１０％　アルブミン　　　　　　　　　　　　　２０ｍＬ
　　０．２５％　トリプシン　　　　　　　　　　　２０ｍＬ
の細胞維持培地を加えて３７℃±１℃の炭酸ガスインキュベーター（ＣＯ_２濃度：５％）内で１～５日間培養した。

　培養後、倒立位相差顕微鏡を用いて細胞の形態を観察し、細胞に形態変化（細胞変性効果）が起こっていることを確認した。次に、培養液を遠心分離（３０００ｒ／ｍｉｎ、１０分間）し、得られた上澄み液をウイルス浮遊液とした。

　実験例１で調製したフムスエキスを精製水で２０倍希釈した検体１ｍＬにウイルス浮遊液０．１ｍＬを添加、混合し、作用液とした。室温で作用させ、３０分並びに６及び２４時間後に細胞維持培地を用いて１０００倍に希釈した。なお、対照として精製水を用いて同様に試験し、開始時についても測定を行った。

　細胞増殖培地を用い、使用培地を組織培養用マイクロプレート（９６穴）内で単層培養した後、細胞増殖培地を除き細胞維持培地を０．１ｍｌずつ加えた。次に、作用液の希釈液０．１ｍｌを４穴ずつに接種し、３７℃±１℃の炭酸ガスインキュベーター（ＣＯ_２濃度：５％）内で４～７日間培養した。培養後、倒立位相差顕微鏡を用いて細胞の形態変化（細胞変性効果）の有無を観察し、Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法により５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ_５０）を算出して作用液１ｍｌ当たりのウイルス感染価に換算した。結果を表１８に示す。

　なお、細胞維持培地で作用液を１０００倍に希釈することにより、検体の影響を受けずにウイルス感染価が測定できることを予備試験により確認した。

　＜実験例７：ノロウイルス不活化試験＞
　細胞としてＣＲＦＫ細胞（大日本製薬株式会社製）を用い、細胞増殖培地（イーグルＭＥＭ培地「ニッスイ」（１）（日水製薬株式会社製）に牛胎仔血清を１０％加えたもの）を用いて、使用培地を組織培養用フラスコ内に単層培養した。単層培養後にフラスコ内から細胞増殖培地を除き、試験ウイルスであるＦｅｌｉｎｅ　ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ　Ｆ－９　ＡＴＣＣ　ＶＲ－７８２（ネコカリシウイルス）を接種した。なお、ネコカリシウイルスは、細胞培養が不可能なノロウイルスの代替ウイルスとして広く使用されている。

　次に、細胞維持培地（イーグルＭＥＭ培地「ニッスイ」（１）［日水製薬株式会社］に牛胎仔血清を２％加えたもの）を加えて３７℃±１℃の炭酸ガスインキュベーター（ＣＯ_２濃度：５％）内で１～５日間培養した。

　培養後、倒立位相差顕微鏡を用いて細胞の形態を観察し、細胞に形態変化（細胞変性効果）が起こっていることを確認した。次に、培養液を遠心分離（３０００ｒ／ｍｉｎ、１０分間）し、得られた上澄み液を精製水で１０倍に希釈し、ウイルス浮遊液とした。

　実験例１で調製したフムスエキスを精製水で２０倍希釈した検体１ｍＬにウイルス浮遊液０．１ｍＬを添加、混合し、作用液とした。室温で作用させ、３０分並びに６及び２４時間後に細胞維持培地を用いて１００００倍に希釈した。なお、対照として精製水を用いて同様に試験し、開始時についても測定を行った。

　細胞増殖培地を用い、使用培地を組織培養用マイクロプレート（９６穴）内で単層培養した後、細胞増殖培地を除き細胞維持培地を０．１ｍｌずつ加えた。次に、作用液の希釈液０．１ｍｌを４穴ずつに接種し、３７℃±１℃の炭酸ガスインキュベーター（ＣＯ_２濃度：５％）内で４～７日間培養した。培養後、倒立位相差顕微鏡を用いて細胞の形態変化（細胞変性効果）の有無を観察し、Ｒｅｅｄ－Ｍｕｅｎｃｈ法により５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ_５０）を算出して作用液１ｍｌ当たりのウイルス感染価に換算した。結果を表１９に示す。

　なお、細胞維持培地で作用液を１００００倍に希釈することにより、検体の影響を受けずにウイルス感染価が測定できることを予備試験により確認した。

　＜実験例８：皮膚刺激性についての安全性評価＞
　実験例１で調製したフムスエキスを精製水で２０倍希釈して検体を調製した。２４時間閉塞ヒトパッチテスト（被験者２０名）により、検体の皮膚接触によって生じる試料の一次刺激性についての安全性を評価した。パッチテストユニットには、パッチテスター（鳥居薬品株式会社）を用いて貼付した。また、試験比較対象として、生理食塩水（大塚製薬株式会社製）、白色ワセリン（日興リカ株式会社製）の２剤を用いた。

　対象被験者は、日本在住の男女で、下記の除外基準に抵触しない者から選定した。また本試験に先立ち被験者本人より文書にて同意を得た。なお、以下の基準
　・パッチテスト予定部位に、湿疹やアザなど皮膚症状を有する者
　・試験品使用１週間以内に同部位に医薬品を外用していた者
　・テープ剤に対するアレルギーまたは過敏症を有する者
　・コントロール不良の全身性疾患を有する者
　・その他、医師が本試験の対象として不適当と判断する者
に該当する者は対象被験者から除外した。

　試験は、「化粧品・医薬部外品　製造販売ガイドブック２０１１－１２」第４章のヒトパッチ試験（ｐ１７６）に準拠して行った（ただし試験人数は２０名）。試験第１日目に、被験者の皮膚の適格性について確認を行った。試験物質をパッチテスターに適量塗布し、背部もしくは上腕に２４時間閉鎖貼付した。試験第２日目（２４時間後）にパッチテスターを除去した。その３０分後とさらに２４時間後（試験第３日目）に貼付部位の皮膚反応を評価した。被験者２０名（男性１４名、女性６名）の内訳は以下のとおりであった。

　なお、試験期間中に個々の被験者で、以下の中止基準項目：
　・被験者の安全性を損なう恐れがあると判断した場合
　・重篤な副作用が発現し、試験が継続できなくなった場合
　・その他、医師により被験者の試験中止が必要と判断された場合
に該当する者はいなかった。

　また、試験品を適用した被験者には、有害事象を認めなかった。ただし、パッチテスト部位における紅斑のみについては、本試験では有害事象として取り扱わなかった。

　結果を表２１に示す。

　以下の表２２に示すパッチテスト判定基準に従い、皮膚反応を皮膚科医師が判定した。

　須貝哲郎「Ｄｉｆｌｕｃｏｒｔｏｌｏｎｅ　ｖｅｌｅｒａｔｅ　軟膏およびクリームの皮膚安全性の検討」、皮膚１９：１０２－１０８．１９７７に記載された方法に従って、皮膚刺激指数（＝（被験品剥離後３０分、２４時間の反応の強い方の総評点和／被験者数）×１００）を２４時間後、４８時間後で算出し、以下の表２３に示すように皮膚科医師が安全品、許容品、要改良品、危険品の判定を行った。

　結果、フムスエキスの皮膚刺激性についての評価は「安全品」に分類された。
　＜追加実験例１－１＞
　re:sof（りそふ）^（商標）　歯ブラシ用スプレー液（株式会社日本ウエルネス製、ＢＭＦ２１^（商標））を試験液として、標準寒天培地法で一般生菌数を分析したところ、３０ＣＦＵ／ｍＬ未満であった。

　＜追加実験例１－２＞
　追加実験例１－１と同じ試験液について、乳糖ブイヨン－ブリリアントグリーン乳糖胆汁ブイヨン培地（ＬＢ－ＢＧＬＢ）法で大腸菌群を分析したところ、陰性であった。

　＜追加実験例１－３＞
　追加実験例１－１と同じ試験液について、特定酵素基質培地法で大腸菌を分析したところ、陰性であった。

　＜追加実験例１－４＞
　追加実験例１－１と同じ試験液について、ＮＩＨＳＪ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｈｅａｌｔｈ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　Ｊａｐａｎ）法に準用してサルモネラ属菌を分析したところ、陰性であった。

　＜追加実験例１－５＞
　追加実験例１－１と同じ試験液について、水素化物発生－ＩＣＰ（Ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ　Ｃｏｕｐｌｅｄ　Ｐｌａｓｍａ）発光分光分析法で砒素（Ａｓ）を分析したところ、０．００１ｍｇ／Ｌ未満であった。

　＜追加実験例１－６＞
　追加実験例１－１と同じ試験液について、ＩＣＰ発光分光分析法で重金属（Ｐｂとして）を分析したところ、０．０１ｍｇ／Ｌ未満であった。

　＜追加実験例２－１＞
　追加実験例１－１と同じ試験液について、フレーム原子吸光法でナトリウム（Ｎａ）を分析したところ、１５０ｍｇ／Ｌであった。

　＜追加実験例２－２＞
　追加実験例１－１と同じ試験液について、フレーム原子吸光法でカリウム（Ｋ）を分析したところ、３０ｍｇ／Ｌであった。

　＜追加実験例２－３＞
　追加実験例１－１と同じ試験液について、ＩＣＰ発光分光分析法でカルシウム（Ｃａ）を分析したところ、５８ｍｇ／Ｌであった。

　＜追加実験例２－４＞
　追加実験例１－１と同じ試験液について、ＩＣＰ発光分光分析法でマグネシウム（Ｍｇ）を分析したところ、１３ｍｇ／Ｌであった。

　＜追加実験例２－５＞
　追加実験例１－１と同じ試験液について、吸光光度法でリン（Ｐ）を分析したところ、０．０５ｍｇ／Ｌ未満であった。

　＜追加実験例２－６＞
　追加実験例１－１と同じ試験液について、ＩＣＰ発光分光分析法で鉄（Ｆｅ）を分析したところ、０．０４ｍｇ／Ｌであった。

　＜追加実験例２－７＞
　追加実験例１－１と同じ試験液について、ＩＣＰ発光分光分析法で亜鉛（Ｚｎ）を分析したところ、２０００ｍｇ／Ｌであった。

　＜追加実験例２－８＞
　追加実験例１－１と同じ試験液について、ＩＣＰ発光分光分析法で銅（Ｃｕ）を分析したところ、０．０１ｍｇ／Ｌ未満であった。

　＜追加実験例２－９＞
　追加実験例１－１と同じ試験液について、イオンクロマトグラフ法でヨウ素（Ｉ）を分析したところ、１ｍｇ／Ｌ未満であった。

　＜追加実験例２－１０＞
　追加実験例１－１と同じ試験液について、ＩＣＰ発光分光分析法でマンガン（Ｍｎ）を分析したところ、１．５ｍｇ／Ｌであった。

　＜追加実験例２－１１＞
　追加実験例１－１と同じ試験液について、水素化物発生－ＩＣＰ発光分光分析法でセレンを分析したところ、０．００１ｍｇ／Ｌ未満であった。

　＜追加実験例２－１２＞
　追加実験例１－１と同じ試験液について、ＩＣＰ発光分光分析法でクロム（Ｃｒ）を分析したところ、０．０１ｍｇ／Ｌ未満であった。

　＜追加実験例２－１３＞
　追加実験例１－１と同じ試験液について、ＩＣＰ発光分光分析法でモリブデン（Ｍｏ）を分析したところ、０．０２ｍｇ／Ｌ未満であった。

　＜追加実験例３＞
　追加実験例１－１と同じ試験液について、ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ及びＧＣ／ＭＳ／ＭＳによる分析に供し、残留農薬として、
（１）ＥＰＮ、
（２）アクリナトリン、
（３）アセタミブリド、
（４）アセフェート、
（５）アゾキシストロビン、
（６）アミスルブロム、
（７）アメトクラジン、
（８）アラクロール、
（９）アラニカルブ、
（１０）イソキサチオン、
（１１）イソピラザム、
（１２）イソフェタミド、
（１３）イソプロチオラン、
（１４）イプロジオン、
（１５）イミシアホス、
（１６）イミダクロプリド、
（１７）イミベンコナゾール、
（１８）インドキサカルブ、
（１９）インピルフルキサム、
（２０）エタボキサム、
（２１）エチプロール、
（２２）エトキサゾール、
（２３）エトフェンプロックス、
（２４）エマメクチン安息香酸塩、
（２５）オキサチアピプロリン、
（２６）オキサミル、
（２７）オキスポコナゾールフマル酸塩、
（２８）カズサホス、
（２９）カルバリル、
（３０）カルペンダジム、チオファネート、チオファネートメチル及びベノミル、
（３１）カルボスルファン、
（３２）カルボフラン、
（３３）キザロホップエチル及びキザロホップＰテフリル、
（３４）キノメチオナート、
（３５）キャプタン、
（３６）クレソキシムメチル、
（３７）クロチアニジン、
（３８）クロマフェノジド、
（３９）クロラントラニリプロール、
（４０）クロルピリホス、
（４１）クロルフェナピル、
（４２）クロルフルアズロン、
（４３）クロルプロファム、
（４４）クロロタロニル、
（４５）シアゾファミド、
（４６）シアナジン、
（４７）シアノホス、
（４８）シアントラニリプロール、
（４９）ジウロン、
（５０）ジエトフェンカルブ、
（５１）シエノピラフェン、
（５２）シクラニリプロール、
（５３）ジノテフラン、
（５４）シハロトリン、
（５５）ジフェノコナゾール、
（５６）シフルトリン、
（５７）シフルフェナミド、
（５８）ジフルベンズロン、
（５９）シフルメトフェン、
（６０）シプロジニル、
（６１）シペルメトリン、
（６２）シメコナゾール、
（６３）ジメトエート、
（６４）ジメトモルフ、
（６５）シモキサニル、
（６６）シラフルオフェン、
（６７）スピネトラム、
（６８）スピノサド、
（６９）スピロテトラマト、
（７０）スピロメシフェン、
（７１）スルホキサフロル、
（７２）ダイアジノン、
（７３）チアクロプリド、
（７４）チアメトキサム、
（７５）チオジカルブ及びメソミル、
（７６）テトラコナゾール、
（７７）テトラジホン、
（７８）テトラニリプロール、
（７９）テブコナゾール、
（８０）テブフェノジド、
（８１）テブフェンピラド、
（８２）テブフロキン、
（８３）テフルトリン、
（８４）テフルベンズロン、
（８５）デルタメトリン及びトラロメトリン、
（８６）トリアジメノール、
（８７）トリアジメホン、
（８８）トリクロルホン、
（８９）トリフルミゾール、
（９０）トリフルラリン、
（９１）トリフロキシストロビン、
（９２）トルクロホスメチル、
（９３）トルフェンピラド、
（９４）ニテンピラム、
（９５）ノバルロン、
（９６）ピカルブトラゾクス、
（９７）ピコキシストロビン、
（９８）ビフェントリン、
（９９）ビフルブミド、
（１００）ピメトロジン、
（１０１）ピラクロストロビン、
（１０２）ピラジフルミド、
（１０３）ピラフルフェンエチル、
（１０４）ピリオフェノン、
（１０５）ピリダベン、
（１０６）ピリダリル、
（１０７）ピリフルキナゾン、
（１０８）ピリプロキシフェン、
（１０９）ピリベンカルブ、
（１１０）ピリミジフェン、
（１１１）ピリミホスメチル、
（１１２）ファモキサドン、
（１１３）フィプロニル、
（１１４）フェナリモル、
（１１５）フェニトロチオン、
（１１６）フェノチオカルブ、
（１１７）フェノブカルブ、
（１１８）フェリムゾン、
（１１９）フェンアミドン、
（１２０）フェントエート、
（１２１）フェンバレレート、
（１２２）フェンピラザミン、
（１２３）フェンピロキシメート、
（１２４）フェンブコナゾール、
（１２５）フェンプロパトリン、
（１２６）フェンヘキサミド、
（１２７）フサライド、
（１２８）ブタミホス、
（１２９）ブプロフェジン、
（１３０）フルアクリピリム、
（１３１）フルアジナム、
（１３２）フルオピコリド、
（１３３）フルオピラム、
（１３４）フルキサピロキサド、
（１３５）フルキサメタミド、
（１３６）フルジオキソニル、
（１３７）フルシトリネート、
（１３８）フルスルファミド、
（１３９）フルチアニル、
（１４０）フルトラニル、
（１４１）フルバリネート、
（１４２）フルフェノクスロン、
（１４３）フルベンジアミド、
（１４４）プロクロラズ、
（１４５）プロシミドン、
（１４６）プロチオホス、
（１４７）フロニカミド、
（１４８）プロパルギット、
（１４９）プロピコナゾール、
（１５０）プロピザミド、
（１５１）プロヒドロジャスモン、
（１５２）プロベナゾール、
（１５３）フロメトキン、
（１５４）プロメトリン、
（１５５）ヘキサコナゾール、
（１５６）ヘキシチアゾクス、
（１５７）ペルメトリン、
（１５８）ペンシクロン、
（１５９）ベンジルアデニン、
（１６０）ベンチアバリカルブイソプロピル、
（１６１）ペンチオピラド、
（１６２）ペンディメタリン、
（１６３）ベンフラカルブ、
（１６４）ぺンフルフェン、
（１６５）ボスカリド、
（１６６）ホスチアゼート、
（１６７）ホルクロルフェニュロン、
（１６８）マラチオン、
（１６９）マンジプロパミド、
（１７０）マンデストロビン、
（１７１）ミクロブタニル、
（１７２）ミルベメクチン、
（１７３）メタフルミゾン、
（１７４）メタミドホス、
（１７５）タラキシル及びメフェノキサム、
（１７６）メチダチオン、
（１７７）メトキシフェノジド、
（１７８）メトコナゾール、
（１７９）メトラクロール、
（１８０）メトリブジン、
（１８１）メパニピリム、
（１８２）メプロニル、
（１８３）リニュロン、
（１８４）ルフェヌロン、
（１８５）レナシル、
（１８６）レピメクチン
はいずれも検出されなかった（検出限界値：０．０１ｐｐｍ）。

　＜追加実験例４＞
　追加実験例１－１と同じ試験液（被験物質）について、ＯＥＣＤ　Ｔｅｓｔ　Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ　Ｎｏ．４２０（ＯＥＣＤ　ＧＵＩＤＥＬＩＮＥＳ　ＦＯＲ　ｔｈｅ　ＴＥＳＴＩＮＧ　ｏｆ　ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ　Ａｃｕｔｅ　Ｏｒａｌ　Ｔｏｘｉｃｉｔｙ－Ｆｉｘｅｄ　Ｄｏｓｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）を参考にして、ラットにおける急性経口毒性を調べた。

　試験動物であるラットは、７週齢のＣｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）系統のＳＰＦ（ｓｐｅｃｉｆｉｃ－ｐａｔｈｏｇｅｎ－ｆｒｅｅ）ラット雌６匹（体重範囲：１６１～１７５ｇ）を日本チャールス・リバー株式会社から購入した。なお、このマウスは、齧歯類の急性毒性試験に多く使用され、ガイドラインで推奨されているため選択した。

　油性インクを用いて尾に線を付す方法でラットの個体識別を行った。なお、検疫馴化期間（赤色）及び試験期間（黒色）で色を変えた。検疫馴化期間中は、試験番号、性別、被験物質名、ケージ番号、管理番号、試験の種類、試験責任者名、検疫又は馴化期間を示す検疫／馴化中ラベルを、また、試験期間中は、試験番号、被験物質名、ケージ番号、動物番号、群名、性別、試験の種類、試験責任者名、試験実施期間を示す試験中ラベルを、各ケージに貼付した。

　ラット入荷後５－７日間、飼育環境に馴化させ、その間に検疫を行った。検疫馴化期間中に一般状態の観察及び体重測定を行い、健常と判断した全ての動物を群分けに供した。群分けは、まず、見当付け試験として１匹を試験に供し、投与前日に体重測定し、体重の一番重い動物を選別した。その後、主試験として、投与前日に体重測定し、体重の思い順に４匹を選別し試験に供した。試験に割り付けられなかった動物は除外した。

　以下の環境でラットの飼育を行った。
・温度：設定値２３℃（許容範囲２０－２６℃）
・相対湿度：設定値５０％（許容範囲３０－７０％）
・換気回数：１２回／時間（オールフレッシュエアー方式）
・照明時間：１２時間／日（午前６時点灯、午後６時消灯）
・ケージ：ポリカーボネート製平底ケージ（Ｗ２６０×Ｄ４２０×Ｈ１８０ｍｍ、株式会社夏目製作所）。１週間に１回以上の頻度で床敷と共に交換した
・給餌器：ケージ蓋一体型ステンレス製給餌器
・収容：検疫・馴化中…１ケージ当たり３匹
　　　　見当付け試験…１ケージ当たり１匹
　　　　主試験…１ケージ当たり２匹
・飼料：絶食期間を除き、固形飼料ＭＦ（オリエンタル酵母工業株式会社）を自由に摂取させた
・飲水：町営水道水を５μｍカートリッジフィルターに通過させ、さらに紫外線照射装置により殺菌したものを自動給水装置により自由に摂取させた
・床敷：パルプ床敷ペパークリーン（日本エスエルシー株式会社）。なお、絶食期間中は排除した。

　飼料は、オリエンタル酵母工業株式会社からロットごとに分析した結果を入手し、適正なものであることを確認した。飲水については、一般社団法人埼玉県環境検査研究協会に依頼し、水道法水質基準（１回／年）および浄水水質検査（１回／月）を行い、適正なものであることを確認した。また、床敷の分析は製造業者が行った分析試験成績書を入手し、適正なものであることを確認した。飼育室は、両性界面活性型殺菌消毒剤（ニッサンアノン：日油株式会社）を用いて、休日を除く毎日、清掃及び消毒した。

　投与前日の凡そ午後４時より、投与終了後３時間まで、動物を床網のみを敷いたポリカーボネート製平底ケージに移し、絶食を行った。投与時週齢は８週齢とし、投与時体重範囲は１７４－１８４ｇであった。主試験に供する動物の体重は見当付け試験の動物の体重の±２０％以内であり、差がないことを確認した。

　見当付け試験は、投与開始用量２０００ｍｇ／ｋｇとし、１匹のラット（動物番号：２００１）についての結果をＡ（死亡）、Ｂ（毒性あり）、Ｃ（毒性なし）の３段階で判定する。Ｂ、Ｃの場合にはその用量で主試験を行うものとし、Ａの場合には、３００ｍｇ／ｋｇの用量でＡ、Ｂ、Ｃをさらに判定する。Ｂ、Ｃの場合にはその用量で主試験を行うものとし、Ａの場合には、５０ｍｇ／ｋｇの用量でＡ、Ｂ、Ｃをさらに判定する。Ｂ、Ｃの場合にはその用量で主試験を行うものとし、Ａの場合には、５ｍｇ／ｋｇの用量でＡ、Ｂ、Ｃをさらに判定する。Ｂ、Ｃの場合にはその用量で主試験を行うものとし、５ｍｇ／ｋｇの用量でもＡであった場合には、ＧＨＳ（Ｔｈｅ　Ｇｌｏｂａｌｌｙ　Ｈａｒｍｏｎｉｚｅｄ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｌａｂｅｌｌｉｎｇ　ｏｆ　ＣＨＥＭＩＣＡＬＳ）分類を確認するための代替手段を検討する。

　主試験は、投与開始用量２０００ｍｇ／ｋｇとし、見当付け試験で用いたラット（動物番号：２００１）および４匹のラット（動物番号：２００２、２００３、２００４、２００５）についての結果をＡ（２匹以上死亡）、Ｂ（１匹以上毒性ありおよび／または１匹死亡）、Ｃ（毒性なし）の３段階で判定する。Ｂの場合にはＧＨＳ分類が「５」、Ｃの場合にはＧＨＳ分類が「５または区分外」とし、Ａの場合には、３００ｍｇ／ｋｇの用量でＡ、Ｂ、Ｃをさらに判定する。Ｂ、Ｃの場合にはＧＨＳ分類が「４」とし、Ａの場合には、５０ｍｇ／ｋｇの用量でＡ、Ｂ、Ｃをさらに判定する。Ｂ、Ｃの場合にはＧＨＳ分類が「３」とし、Ａの場合には、５ｍｇ／ｋｇの用量でＡ、Ｂ、Ｃをさらに判定する。Ｂ、Ｃの場合にはＧＨＳ分類が「２」とし、Ａの場合にはＧＨＳ分類が「１」とする。

　投与用量は体重１ｋｇ当たり１０ｍＬとし、投与日に測定した各個体の体重を基に投与液量を小数第２位で四捨五入し、小数第１位まで算出した。投与方法は、投与日に測定した各個体の体重を基に算出した投与量を、金属製胃ゾンデを装着した２．５ｍｌ　シリンジを用いて、午前８時－１２時の間に強制経口投与するようにした。投与試料の調製は用時調製とし、被験物質を目付付試験管に必要量秤量し、媒体を加え定容後よく混和して調製した。被験物質の秤量は、小数第２位まで正確に秤量し、２０００ｍｇ／ｋｇを２０ｗ／ｖ％の濃度で調製した。

　死亡率は投与動物数を分母とし、観察期間中の死亡数を分子として算出した。また、投与後１４日間にわたって動物の一般状態を観察し、異常の種類、発現日時および経過を記録した。投与日（投与０日）は投与１時間後までは連続して観察、その後、２、３、４、６時間後とし、投与翌日（投与１日後）からは１日１回行った。体重は、投与日（０日の投与前）及び投与１、２、３、７，１４日後に測定した。

　観察期間終了後、ペントバルビタールナトリウム腹腔内投与による深麻酔下での放血致死後、剖検して諸臓器の肉眼的観察を行った。

　２０００ｍｇ／ｋｇ用量での死亡状況及び死亡率を表２４に示す。２０００ｍｇ／ｋｇ用量で死亡例は認められず、死亡率は０％であった。

　２０００ｍｇ／ｋｇ用量での一般状態の観察結果を表２５に示す。いずれの動物においても異常は認められなかった。

　２０００ｍｇ／ｋｇ用量での体重の観察結果を表２６に示す。いずれの動物においても投与１日後から増加傾向で推移し、１４日間の増加量は５３－８１ｇであった。

　２０００ｍｇ／ｋｇ用量での剖検所見の結果を表２７に示す。いずれの動物においても異常は認められなかった。

　以上の結果、本試験条件下において試験液をラットに単回経口投与したときのＬＤ_５０は雌性において２０００ｍｇ／ｋｇを超えるものと推察され、ＧＨＳ区分は「区分５または区分外」であることが推察された。

　＜追加実験例５＞
　追加実験例１－１と同じ試験液（被験物質）について、ウサギを用いた急性皮膚刺激性試験を行った。試験動物であるウサギは、日本白色種（Ｋｂｓ；ＪＷ）の健康な１０週齢の雌４匹（体重範囲：１．９９～２．１４ｋｇ）を北山ラベス株式会社から購入した。なお、このウサギは、皮膚刺激性試験に多く使用され、ガイドラインで推奨されているため選択した。

　ウサギ個体は、油性インクを用いてウサギ耳介内側に番号を直接記入し、識別できるようにした。なお、検疫および馴化期間中は左側に管理番号、試験実施期間中は右側に動物番号を記入した。また、各ゲージには識別ラベルを貼付した。

　入荷後３日間を検疫期間、入荷後７～８日間を馴化期間とした。一般状態は１日１回観察し、体重は動物入荷日、入荷翌日、検疫終了日および群分け日に測定した。検疫馴化期間中に一般状態の観察、体重測定および除毛を行い、健常で皮膚に異常がないと判断した全ての動物を群分けに供した。投与時の週齢は１１週齢とした。

　以下の環境でウサギの飼育を行った。
・温度：設定値２３℃（許容範囲２０－２６℃）
・相対湿度：設定値５０％（許容範囲３０－７０％）
・換気回数：１２回／時間
・照明時間：１２時間／日（午前６時点灯、午後６時消灯）
・ケージ：アルミ製ケージ（Ｗ３５０×Ｄ５５０×Ｈ３５０ｍｍ、株式会社夏目製作所）
・給餌器：バスケット型ステンレス製給餌器
・収容：１ケージに１匹ずつ収容した
・飼料：固形飼料ＬＲＣ４（オリエンタル酵母工業株式会社）を１５０ｋｇ／ｄａｙの制限給餌とした
・飲水：町営水道水を５μｍカートリッジフィルターに通過させ、さらに紫外線照射装置により殺菌したものを自動給水装置により自由に摂取させた。

　飼料は、オリエンタル酵母工業株式会社からロットごとに分析した結果を入手し、適正なものであることを確認した。飲水は、一般社団法人埼玉県環境検査研究協会に依頼し、水道法水質基準（１回／年）および浄水水質検査（１回／月）を行い、適正なものであることを確認した。飼育室は両性界面活性型殺菌消毒剤（ニッサンアノン：日油株式会社）を用いて、休日を除く毎日、清掃及び消毒した。

　被験物質投与
　↓　４時間（半閉塞貼付）
　貼付辞去
　↓
　除去１時間後←判定
　↓
　除去２４時間後←判定
　↓
　除去４８時間後←判定
　↓
　除去７２時間後←判定
というような試験デザインで試験を行った。

　ウサギは、
・初回試験群：１匹（Ｎｏ．１）
・確認試験群：２匹（Ｎｏ．２、３）
というように群分けした。

　被験物質は、初回試験投与日に、投与試料をサンプル管に１ｍＬ分注した。これを１匹分とし、確認試験投与日には２匹分調製した。初回試験として動物１匹を用いた。投与部位には動物の除毛した背部の健常皮膚部とした。２．５×２．５ｃｍ大のリント布（ピップ株式会社）に投与試料を０．５ｍＬ含浸させ、粘着性伸縮包帯（デルマボア、アルケア株式会社）を用いて投与部位に貼付し、粘着性伸縮包帯（シルキーテックス、アルケア株式会社）を用いて固定して４時間の半閉塞貼付を行った。初回試験で重度の皮膚反応が観察されなかったため、確認試験として２匹の追加動物で初回試験と同様に４時間の半閉塞貼付を行った。

　貼付除去１、２４、４８および７２時間後に下記基準
［紅斑・痂皮形成］
０：紅斑なし
１：ごく軽度の紅斑（かろうじて識別できる）
２：明瞭な紅斑
３：中等度から高度の紅斑
４：高度の紅斑（肉赤色）から紅斑の類別を妨げる痂皮形成
［浮腫形成］
０：浮腫なし
１：ごく軽度の浮腫（かろうじて識別できる）
２：軽度の浮腫（領域の端が明瞭な隆起で定義される）
３：中等度の浮腫（約１ｍｍ隆起）
４：高度の浮腫（１ｍｍを上回り、曝露範囲を超えて隆起）
で判定した。初回試験については貼付除去後（０時間）も判定した。

　また、貼付除去２４および７２時間後の平均評点を平均して一次刺激性インデックス（Ｐ．Ｉ．Ｉ：Ｐｒｉｍａｒｙ　ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ　ｉｎｄｅｘ）を求め、次の基準
（評点）　　　　　　　　　　　評価区分
Ｐ．Ｉ．Ｉ＝０　　　　　　　無刺激物
０＜Ｐ．Ｉ．Ｉ≦２　　　　　弱い刺激物
２＜Ｐ．Ｉ．Ｉ≦５　　　　　中等度刺激物
５＜Ｐ．Ｉ．Ｉ≦８　　　　　強い刺激物
に基づいて安全性の評価を行った。

　試験期間中の一般状態を毎日１回観察した。また、体重は投与日と最終判定日に測定した。実験終了後は、麻酔剤（ペントバルビタールナトリウム）の過剰投与によりウサギを安楽致死させた。

　試験後の皮膚所見の一次刺激性インデックス（Ｐ．Ｉ．Ｉ．）の結果を表２８、初回試験の刺激性評点（個体別）の結果を表２９、確認試験の刺激性評点（個体別）を表３０に示す。また一般状態及び体重の結果を表３１に示す。

　初回試験並びに確認試験ともに、いずれの観察時においても皮膚反応はみられず、Ｐ．Ｉ．Ｉ．は０であった。観察期間中の一般状態に異常はみられず、体重も増加した。以上の結果より、本被験物質に皮膚刺激性は認められず、評価区分は無刺激物であると結論された。

　＜追加実験例６＞
　追加実験例１－１と同じ試験液（被験物質）について、ハムスターを用いた口腔粘膜刺激性試験を行った。試験動物であるハムスターは、５週齢のＳｙｒｉａｎ系（Ｓｌｃ：Ｓｙｒｉａｎ、クローズドコロニー）のＳＰＦハムスター雄４匹（体重範囲：６５．３～６７．７ｇ）を日本エスエルシー株式会社から購入した。なお、このハムスターは、口腔粘膜刺激性試験に多く使用され、ガイドラインで推奨されているため選択した。

　ハムスター個体は、油性インクを用いて被毛の一部を染色し、識別できるようにした。また、各ケージには識別ラベルを貼付した。

　入荷後６日間を検疫期間、入荷後６日間を馴化期間とした。一般状態は１日１回観察し、体重は動物入荷日、入荷翌日、検疫終了日（群分け日）に測定した。なお、入荷翌日に増加がみられなかった個体は、その翌日も測定を行い増加を確認した。検疫馴化期間中に一般状態の観察、体重測定を行い、健常で口腔に異常がないと判断した全ての動物を群分けに供した。投与時の週齢は６週齢とした。投与日に体重を測定して、体重の大きい順に３匹を割り付けた。なお、余剰のハムスターは試験から除外した。

　以下の環境でハムスターの飼育を行った。
・温度：設定値２３℃（許容範囲２０－２６℃）
・相対湿度：設定値５０％（許容範囲３０－７０％）
・換気回数：１２回／時間
・照明時間：１２時間／日（午前６時点灯、午後６時消灯）
・ケージ：ポリカーボネート製平底ケージ（Ｗ２６０×Ｄ４２０×Ｈ１８０ｍｍ、株式会社夏目製作所）。１週間に１回以上の頻度で床敷と共に交換した
・給餌器：ケージ蓋一体型ステンレス製給餌器
・収容：１ケージ当たり１匹ずつ収容した
・飼料：固形飼料ＭＦ（オリエンタル酵母工業株式会社）を自由に摂取させた
・飲水：町営水道水を５μｍカートリッジフィルターに通過させ、さらに紫外線照射装置により殺菌したものを自動給水装置により自由に摂取させた
・床敷：パルプ床敷ペパークリーン（日本エスエルシー株式会社）。なお、絶食期間中は排除した。

　飼料は、オリエンタル酵母工業株式会社からロットごとに分析した結果を入手し、適正なものであることを確認した。飲水は、一般社団法人埼玉県環境検査研究協会に依頼し、水道法水質基準（１回／年）および浄水水質検査（１回／月）を行い、適正なものであることを確認した。床敷は、製造業者から分析試験成績書を入手し、適正なものであることを確認した。飼育室は両性界面活性型殺菌消毒剤（ニッサンアノン：日油株式会社）を用いて、休日を除く毎日、清掃及び消毒した。

　試験に供した群構成を表３２に示す。

　各ハムスターの右側頬袋に対しては、被験物質の原液を脱脂綿（綿球＃１０、イワツキ株式会社、直径約１ｃｍ）に含浸させたものを投与試料とした。被験物質を脱脂綿に含浸させたもの１個を１匹分とし、各投与の直前に３個ずつ調製した。各ハムスターの左側頬袋に対しては、操作対照物質として生理食塩液を脱脂綿に含浸させたものを投与試料とし、被験物質と同様に調製した。被験物質の含浸量は０．３１５～０．３７２ｇ、対照物質の含浸量は０．３３３～０．３７７ｇであった。

　被験物質または生理食塩液の投与前に、動物用イソフルラン（マイラン製薬株式会社）による麻酔下で、両頬袋をリングピンセットで抜き出し、生理食塩液（日本薬局方、株式会社大塚製薬工場）を用いて傷つけないように洗浄操作を行い、下記基準
０：紅斑なし
１：ごく軽度の紅斑（かろうじて識別できる）
２：明瞭な紅斑
３：中等度の紅斑
４：高度の紅斑（肉赤色）から紅斑の類別を妨げる痂皮形成
で肉眼的評価を行った。その後、リングピンセットを用いて各投与試料を含浸させた脱脂綿１個を頬袋内に挿入し、首輪を装着した。これを１時間間隔で４回行った。４回目投与の１時間後に投与試料を取り出し、その２４時間後にペントバルビタールナトリウム腹腔内投与による深麻酔下で、両頬袋をリングピンセットで抜き出して生理食塩液を用いて傷つけないように洗浄操作を行い、上記基準で肉眼的評価を行った。

　また、最終判定終了後、深麻酔下で放血殺し両側頬袋を摘出し、病理組織学的検査に供した。摘出した組織はろ紙に固定させ、１０％中性緩衝ホルマリン液で固定した。固定した両側頬袋は、３か所（左側部、中央部、右側部）を切り出し、常法に従いパラフィン包埋して薄切した後、ＨＥ染色を施して標本を作製した。

　作製した標本について鏡検し、下記格付評価システム
［口腔、陰茎、膣組織反応の鏡検試験のための格付評価システム］
（１）上皮
０：正常、インタクト
１：細胞変性または消失
２：異形成
３：病巣浸食
４：広がった浸食
（２）白血球湿潤（／高倍率視野）
０：なし
１：最小（２５未満）
２：小（２６～５０）
３：中（５１～１００）
４：顕著（１００を超える）
（３）血管の鬱血
０：なし
１：最小
２：小
３：中
４：顕著（管の崩壊）
（４）浮腫
０：なし
１：最小
２：小
３：中
４：顕著
に従って、右側頬袋（被験物質）の病理組織評点について採点した。個体ごとの各項目の病理組織評点の平均を算出して加算し、３匹の平均評点の合計を個体数で除して群の平均評点を求めた。

　同様に左側頬袋（操作対照）における群の平均評点も算出し、群の平均評点の差を下記刺激性インデックス（ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ　ｉｎｄｅｘ）
平均評点　　　　　　　　　応答の記載
０　　　　　　　　　　　　　なし
１～４　　　　　　　　　　　最小
５～８　　　　　　　　　　　小
９～１１　　　　　　　　　　中
１２～１６　　　　　　　　　重篤
によって評価した。

　また試験期間中の一般状態を１日１回観察した。体重は、投与日及び最終判定日に測定した。

　口腔粘膜所見として、肉眼的評価の刺激性評点（最高点数４）を表３３、病理組織学的検査（最高点数１６）を表３４に示す。また、一般状態及び体重の結果を表３５に示す。

　表３３に示されるように、肉眼的評価は、右側頬袋（被験物質）ならびに左側頬袋（操作対照）ともに、いずれの観察時においても紅斑及び痂皮の形成はみられず、刺激性評点の平均は０であった。また表３４に示されるように、病理組織学的検査の結果として、右側頬袋（被験物質）において、上皮、白血球湿潤、血管の鬱血ならびに浮腫に変化はみられず、群の平均評点は０となった。左側頬袋（操作対照）において、平均評点０．３の白血球湿潤ならびに血管の鬱血が１例にみられた。上皮及び浮腫に変化はみられず、群の平均評点は０．２となった。また、表３５に示されるように、観察期間中の一般状態に異常はみられず、体重も増加した。以上の結果より、被験物質は、本試験条件下において、刺激性インデックスは平均評点０、なしと結論された。

　＜追加実験例７＞
　追加実験例１－１と同じ試験液（検体）について、抗菌力試験を行った。以下の５種
　・Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｉｓ　ＪＣＭ　５７０８
　・Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓ　ＮＢＲＣ　１０６０７１
　・Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ　ＮＢＲＣ　１００９１１
　・Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　ＮＢＲＣ　１４１６０
　・Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＮＢＲＣ　１３２７５
の試験菌を用いた。

　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓについては、試験菌をＧＡＭ寒天培地で３５℃、２４時間前培養（嫌気培養）した。前培養菌を滅菌生理食塩水に懸濁し、約１０^８個／ｍＬに調製したものを試験菌液とした。

　Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａについては、試験菌をＳＣＤＬＰ寒天培地で３０℃、２４時間前培養した。前培養菌を滅菌生理食塩水に懸濁し、約１０^８個／ｍＬに調製したものを試験菌液とした。

　検体１９．８ｇを滅菌バイアル瓶にとり、試験菌液を１％量（０．２ｍＬ）接種した。これを２５℃の恒温器で保存し、規定時間（３分、３０分、２４時間）後にその１ｇを採取して、希釈液（ＬＰ希釈液：ポリペプトン　１ｇ、エッグレシチン　０．７ｇ、ポリソルベート８０　２０ｇ、精製水　９８０ｍＬ）９ｍＬで希釈した。この希釈液をさらに段階希釈し、寒天平板混和法により生菌数を測定した。なお、対照として、滅菌生理食塩水についても同様に操作し、接種直後及び規定時間（２４時間）後に生菌数の測定を行った。

　試験結果を表３６に示す。

　ここで、追加実験例７でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｉｓについて、試験菌液接種３分後の培地の写真を図１、３０分後の培地の写真を図２、２４時間後の培地の写真を図３に示す。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｓａｎｇｕｉｎｉｓの対照（滅菌生理食塩水）についての接種直後の培地の写真を図４、２４時間後の培地の写真を図５に示す。

　追加実験例７でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓについて、試験菌液接種３分後の培地の写真を図６、３０分後の培地の写真を図７、２４時間後の培地の写真を図８に示す。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｉｔｉｓの対照（滅菌生理食塩水）についての接種直後の培地の写真を図９、２４時間後の培地の写真を図１０に示す。

　追加実験例７でのＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓについて、試験菌液接種３分後の培地の写真を図１１、３０分後の培地の写真を図１２、２４時間後の培地の写真を図１３に示す。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓの対照（滅菌生理食塩水）についての接種直後の培地の写真を図１４、２４時間後の培地の写真を図１５に示す。

　追加実験例７でのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓについて、試験菌液接種３分後の培地の写真を図１６、３０分後の培地の写真を図１７、２４時間後の培地の写真を図１８に示す。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓの対照（滅菌生理食塩水）についての接種直後の培地の写真を図１９、２４時間後の培地の写真を図２０に示す。

　追加実験例７でのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａについて、試験菌液接種３分後の培地の写真を図２１、３０分後の培地の写真を図２２、２４時間後の培地の写真を図２３に示す。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａの対照（滅菌生理食塩水）についての接種直後の培地の写真を図２４、２４時間後の培地の写真を図２５に示す。

　検体の試験条件下における、最大の殺菌率（％）とその作用時間は、
　（試験菌）　　　　　　　　　　　（作用時間）　　（殺菌率（％））
　Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ　　　　　　　３分　　　　　９９．９９
　Ｓ．ｍｉｔｉｓ　　　　　　　　　　　３分　　　　　９９．９９
　Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ　　　　　３分　　　　　９９．９９
　Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ　　　　３０分　　　　　９９．９９
　Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　　　　２４時間　　　　　９９．９９
であった。

　＜追加実験例８＞
　追加実験例１－１と同じ試験液（検体）について、抗菌力試験を行った。以下の３種
　・Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　ＪＣＭ１２２５７
　・Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　ＪＣＭ１２２４８
　・Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　ＪＣＭ８５３２
の歯周病菌を試験菌として用いた。Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓは、偏性嫌気性（酸素のある環境では生育できない）で、強力なタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）であり、４０歳以降の成人の多くが罹患する慢性歯周炎の歯周局所から分離（発生）することが知られている。Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａは、一般的で誰もがもっている菌であり、口腔を不潔にするだけで歯周病を引き起こす原因になり、思春期や妊娠期にもこの菌が増加し歯周病を起こすことが知られている。Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍは、代表的歯周病菌で大腸癌の原因菌とされる。

　Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ、Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍについては、各試験菌を、ヘミン・メナジオン添加（ヘミン溶液及びメナジオン溶液を、培地１００ｍＬに対してそれぞれ１ｍＬ添加した。ヘミン溶液：ヘミン５０ｍｇを１Ｎ　ＮａＯＨ　１ｍＬに溶解し、精製水を加えて１００ｍＬとした。メナジオン溶液：メナジオン５ｍｇをエタノール１ｍＬに溶解し、精製水を加えて１００ｍＬとした。）（以下Ｈ／Ｍ^＋とする）ＧＡＭ寒天培地で３５℃、４８時間、前々培養（嫌気培養）した。この前々培養液をＨ／Ｍ^＋ＧＡＭブイヨンに接種し、３５℃、４８時間、前培養（嫌気培養）した。前培養液をＨ／Ｍ^＋ＧＡＭブイヨンで希釈し、約１０^８個／ｍＬに調製したものを試験菌液とした。

　Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａについては、試験菌を、Ｈ／Ｍ^＋ＧＡＭ寒天培地で３５℃、２４時間、前々培養（嫌気培養）した。この前々培養液をＨ／Ｍ^＋ＧＡＭブイヨンに接種し、３５℃、２４時間、前培養（嫌気培養）した。前培養液をＨ／Ｍ^＋ＧＡＭブイヨンで希釈し、約１０^８個／ｍＬに調製したものを試験菌液とした。

　検体１９．８ｇを滅菌バイアル瓶にとり、試験菌液を１％量（０．２ｍＬ）接種した。これを２５℃の恒温器で保存し、規定時間（３０秒、１分、５分、１時間）後にその１ｇを採取して、Ｈ／Ｍ^＋ＧＡＭブイヨン９ｍＬで希釈した。この希釈液をさらに段階希釈し、寒天平板混和法により生菌数を測定した。なお対照として、滅菌生理食塩水についても同様に操作し、接種直後および規定時間（５分、１時間）後に生菌数の測定を行った。

　試験結果を表３７に示す。なお、生菌数測定平板において、１／１０^１希釈平板では抗菌剤の持ち込みによる生育阻害（キャリーオーバー）がみられたため、検出限界値は１０^２個／ｇとした。

　ここで、追加実験例８でのＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓについて、試験菌液接種３０秒後の培地の写真を図２６、１分後の培地の写真を図２７、５分後の培地の写真を図２８、１時間後の培地の写真を図２９に示す。Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ　ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓの対照（滅菌生理食塩水）についての接種直後の培地の写真を図３０、５分後の培地の写真を図３１、１時間後の培地の写真を図３２に示す。

　追加実験例８でのＰｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａについて、試験菌液接種３０秒後の培地の写真を図３３、１分後の培地の写真を図３４、５分後の培地の写真を図３５、１時間後の培地の写真を図３６に示す。Ｐｒｅｖｏｔｅｌｌａ　ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａの対照（滅菌生理食塩水）についての接種直後の培地の写真を図３７、５分後の培地の写真を図３８、１時間後の培地の写真を図３９に示す。

　追加実験例８でのＦｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍについて、試験菌液接種３０秒後の培地の写真を図４０、１分後の培地の写真を図４１、５分後の培地の写真を図４２、１時間後の培地の写真を図４３に示す。Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｎｕｃｌｅａｔｕｍの対照（滅菌生理食塩水）についての接種直後の培地の写真を図４４、５分後の培地の写真を図４５、１時間後の培地の写真を図４６に示す。

　検体の試験条件下における、最大の殺菌率（％）とその作用時間は、
　（試験菌）　　　　　　　　　　　（作用時間）　　（殺菌率（％））
　Ｐ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ　　　　　１時間　　　　　９９．９９
　Ｐ．ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａ　　　　　　５分　　　　　９９．９９
　Ｆ．ｎｕｃｌｅａｔｕｍ　　　　　　１時間　　　　　９９．９９
であった。

　＜追加実験例９＞
　追加実験例１－１と同じ試験液（検体）について、抗菌力試験を行った。以下の３種
　・Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　ＮＢＲＣ１３２７５（緑膿菌）
　・Ｃａｎｄｉｄａ　ａｌｂｉｃａｎｓ　ＮＢＲＣ１５９４（カンジダ）
　・Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ　ＮＢＲＣ９４５５（クロコウジカビ）
の試験菌を用いた。

　細菌であるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａについては、ＳＣＤ寒天培地で３２．５℃、２０時間前培養した。前培養菌を白金耳でかきとって滅菌生理食塩水に懸濁し、約１０^８個／ｍＬに調製したものを試験菌液とした。

　酵母であるＣ．ａｌｂｉｃａｎｓについては、サブロー・ブドウ糖寒天培地で２２．５℃、４８時間前培養した。前培養菌を白金耳でかきとって滅菌生理食塩水に懸濁し、約１０^８個／ｍＬに調製したものを試験菌液とした。

　カビであるＡ．ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓについては、サブロー・ブドウ糖寒天培地で２２．５℃、６～１０日間前培養した。前培養菌を白金耳でかきとってポリソルベート８０　０．０５％加滅菌生理食塩水に懸濁させ、四つ折にした滅菌ガーゼで濾過した後、約１０^７個／ｍＬに調製したものを試験菌液とした。

　試験菌１種につき検体２０ｇを滅菌バイアル瓶にとり、試験菌液を０．１５ｍＬ（検体１ｇあたり１０^５－１０^６個）接種した。それぞれ２２．５℃で保存し、７、１４、２１、２８日目に生菌数の測定を行った。生菌数の測定は、細菌についてはＳＣＤＬＰ寒天培地混釈法、真菌（酵母、カビ）についてははサブロー・ブドウ糖ＬＰ寒天培地混釈法により行った。

　接種前検体の菌数値を表３８に、接種後検体の菌数経時変化を表３９に示す。　体は、各試験菌に対して良好な保存効力を示した。

Claims (14)

1. 　歯ブラシの少なくともブラシ部の殺菌・ウイルス不活化のために用いられる、天然由来成分を有効量含有する歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤。
2. 　天然由来成分の経口毒性の安全性が２，０００ｍｇ／ｋｇ以上である、請求項１に記載の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤。
3. 　天然由来成分の経口毒性の安全性が１０，０００ｍｇ／ｋｇ以上である、請求項２に記載の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤。
4. 　殺菌・ウイルス不活化の効果が歯ブラシへの適用時から６時間継続するものである、請求項１～３のいずれか１項に記載の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤。
5. 　殺菌・ウイルス不活化の効果が歯ブラシへの適用時から１２時間継続するものである、請求項４に記載の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤。
6. 　殺菌・ウイルス不活化の効果が歯ブラシへの適用時から２４時間継続するものである、請求項５に記載の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤。
7. 　前記天然由来成分がフムスエキスである、請求項１～６のいずれか１項に記載の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤。
8. 　前記天然由来成分が酵素を含む、請求項７に記載の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤。
9. 　前記酵素はバチルスが分泌したものである、請求項８に記載の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤。
10. 　前記天然由来成分が有機酸を含む、請求項７～９のいずれか１項に記載の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤。
11. 　前記有機酸がフルボ酸およびフミン酸を含む、請求項１０に記載の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤。
12. 　天然由来の防腐剤をさらに含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤。
13. 　スプレー、ミストまたはフォームの形態に製剤化されたものである、請求項１～１２のいずれか１項に記載の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤。
14. 　５重量％以下のアルコールをさらに含有する、請求項７～１３のいずれか１項に記載の歯ブラシ用殺菌・ウイルス不活化剤。

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