KR102154063B1

KR102154063B1 - 목근 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면 장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102154063B1
Application number: KR1020180059715A
Authority: KR
Inventors: 이미영; 김유리; 박보경; 김영화
Original assignee: 한국 한의학 연구원
Priority date: 2018-05-25
Filing date: 2018-05-25
Publication date: 2020-09-09
Also published as: EP3815543B1; US11541088B2; EP3815543A1; WO2019225981A1; EP3815543A4; KR20190134271A; US20210145912A1

Abstract

본 발명은 목근 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면 장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 목근 추출물은 스트레스에 의한 수면 시간을 개선하는 효과가 있으며, 혈액 내 스트레스에 의해 증가된 혈액 내 코르티코스테론의 함량을 낮추며, 세로토닌의 함량은 증가시키는 효과가 있다. 또한, 스트레스에 의해 대뇌피질에서의 감소된 GABAR A α1의 발현이 목근 추출물을 투여한 군에서 유의하게 증가하는 효과가 있다. 따라서 목근 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 수면장애의 예방, 개선 또는 치료용 건강기능식품 조성물 또는 약학 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

목근 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면 장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, improving or treating sleep disturbance comprising Hibiscus syriacus extract as effective component}

본 발명은 목근 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면 장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

수면이란 눈이 감긴 채 의식 활동이 쉬는 상태를 말하며 우리가 낮 동안에 활동하느라 사용한 에너지를 보충하고 신체활동으로 인해 쌓인 피로를 회복하는 중요한 과정이다. 수면은 에너지와 피로 회복을 하는 시간일 뿐 아니라 사람의 성장에 꼭 필요한 성장호르몬이 가장 많이 분비되는 시간이다.

우리 몸에서 뇌는 생명 유지를 위한 모든 생리적 기능을 총괄하는 곳으로 이 뇌가 적절한 활동의 균형을 유지하기 위해서는 휴식이 필요하며 이러한 휴식은 대부분 수면 시간에 이루어진다. 현대 생활의 소모적이고 바쁜 일상 속도, 비만 유병률의 증가, 인구의 고령화 등으로 수면 문제로 진단받고 치료받는 환자의 숫자는 최근 수년간 증가해왔으며 향후에도 지속적으로 증가할 것으로 예상된다.

여러가지 수면장애 중 불면증은 매우 흔한 수면장애로 수면의 어려움을 호소하는 증상으로 잠드는 것이 어렵거나, 잠을 유지하는 것의 어려움, 빨리 깨는 것, 수면의 질이 좋지 않은 것으로 정의되고 있다. 불면증의 정도와 상관없이 성인 10명 중 3명이 수면장애에 시달리고 있으며, 여성이나 노인에서는 그 비율이 더 높은 것으로 보고된 바 있다(J Korean Neuropsychiatr Assoc. 50: 62-8(2010)).

현대인의 수면시간이 크게 줄어든 이유는 장래에 대한 불안, 우울증, 불안장애, 스트레스와 같은 심리적 이유에 의한 정신질환 증가, 직업과 사회적 다변화에 따른 주야간 교대 근무, 그리고 바르지 못한 생활습관 등 다양한 원인에 기인한다. 즉, 사회가 복잡해짐에 따라 할 일이 많아지고 스트레스도 늘어나면서 만성적 수면부족이 생겨난 것이다. 또한 커피 등 카페인이 함유된 음료를 더 많이 섭취하는 것도 이유 중 하나로 꼽히고 있다. 일시적인 스트레스, 수면습관의 변화로 인한 불규칙한 수면습관 등으로 인하여 일시적인 급성불면증이 쉽게 발생하게 되며, 이러한 급성불면증은 규칙적인 수면습관을 유지하고, 불면증을 유발한 스트레스나 원인인자를 제거하게 되면 정상적인 수면습관으로 돌아오게 된다. 하지만, 잘못된 수면습관을 유지하거나 왜곡된 불면증에 대한 대처는 매일 잠을 못자는 만성불면증을 일으키게 된다. 만성불면증상은 삶의 질을 떨어뜨리고, 우울증의 발생을 10배 이상 증가시키며, 또한 불면증으로 인한 수면장애는 고혈압이나 혈당 조절 문제, 비만 등의 문제를 야기시켜 각종 질병의 유병률을 높일 뿐만 아니라, 의료비 지출의 증가, 주간의 사고 위험성 증가, 직장에서의 업무수행능력 저하 등 환자의 사회적인 부분에서도 영향을 미치고 있다.

한편, 목근은 무궁화(Hibiscus syriacus L.)의 이명으로, 목근피(木槿皮), 목근화(木槿花), 목근근(木槿根), 목근자(木槿子)를 생약명으로 사용하고 있다. 무궁화는 아욱과(Malvaceae)에 속한 낙엽관목으로서 대한민국에서는 평남 및 강원도 이남에서 재식하고 있으며, 대한민국 약전외 한약(생약)규격집에서는 무궁화의 줄기껍질 및 뿌리껍질을 목근피(木槿皮. Hibisci Cortex)'로 규정하고 있다. 동의보감의 기록에 의하면, '약성은 순하고, 독이 없으며 장풍과 사혈을 멎게 하고 설사한 후 갈증이 심할 때 달여 마시면 효과가 있고, 잠을 잘 자게 한다. 꽃은 약성이 차고 독이 없으며, 적 이질, 백 이질을 고치고 장풍, 사혈이 있을 때 볶아서 먹거나 또는 차로 달여서 먹는다고 기재되어 있으며, 본초강목에는 부인들의 적 대하증, 백 대하증 치료에 종기의 통증을 멎게 하고, 옴 치료제로 사용하고 달인 물로 눈을 씻으면 눈이 맑아지고, 혈액순환을 돕는 것으로 기재되어 있다.

현재까지 알려진 목근에 대한 수면장애 관련 기술로는, 무궁화 꽃잎, 및 무궁화 꽃즙을 포함하는 국화장의 불면증 해소 효과를 개시하고 있는 중국공개특허 제106360532호가 있고, 목근피 외에 16종의 한약재를 포함하는 복합물이 불면증 치료효과가 있다고 개시되어 있는 중국등록특허 105194490호가 있으나, 아직까지는 본 발명의 목근 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면 장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 개시된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 목근 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면 장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, 유효성분인 목근 추출물이 스트레스에 의해 저하된 수면을 개선하는 효과가 있으며, 혈액 내 코르티코스테론의 함량을 낮추고, 세로토닌의 함량을 증가시키는 효과가 있으며, 대뇌피질에서 GABAR A α1의 발현을 증가시키는 효과가 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 목근(Hibiscus syriacus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 목근(Hibiscus syriacus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명은 목근 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면 장애 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 스트레스에 의한 수면장애 동물모델에서 수면 중 각성(wake)를 감소시킬 뿐만 아니라 REM(rapid eye movement; REM) 및 NonREM 수면을 증가시켜 수면장애를 개선하는 효과가 있고, 스트레스에 의해 증가된 혈액 내 코르티코스테론의 함량을 낮추며, 세로토닌의 함량은 증가시키는 효과가 있다. 또한, 스트레스에 의해 대뇌피질에서의 감소된 GABAR A α1의 발현이 목근 추출물을 투여한 군에서 유의하게 증가하는 효과가 있다.

도 1은 스트레스에 의한 수면장애 실험의 진행과정을 도표로 나타낸 것이다.
도 2는 발바닥 전기충격 스트레스에 의해 수면장애가 유발된 SD 랫트에게 50, 100, 200mg/kg의 목근화 추출물 및 양성대조군(PC)인 200mg/kg의 세인트존스워트(St. John's wort)를 5일 동안 투여하고 EEG를 측정하여 각성(wake) 시간을 측정한 결과이다. ***은 정상군(Nor)에 비해 스트레스군(Stress)의 각성(wake) 시간이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로 p<0.001임을 의미하고, #는 스트레스 군에 비해 본 발명의 목근화 추출물을 투여한 실험군에서 유의미하게 각성 시간이 감소하였다는 것으로, p<0.05이다.
도 3은 발바닥 전기충격 스트레스에 의해 수면장애가 유발된 SD 랫트에게 50, 100, 200mg/kg의 목근화 추출물 및 양성대조군(PC)인 200mg/kg의 세인트존스워트(St. John's wort)를 5일 동안 투여하고 EEG를 측정하여 REM(Rapid eye movement sleep) 수면 시간을 측정한 결과이다. **은 정상군(Nor)에 비해 스트레스군(Stress)의 REM 시간이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로 p<0.01임을 의미하고, #는 스트레스 군(Stress)에 비해 본 발명의 목근화 추출물을 투여한 실험군에서 유의미하게 REM 수면 시간이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.05이다.
도 4는 발바닥 전기충격 스트레스에 의해 수면장애가 유발된 SD 랫트에게 50, 100, 200mg/kg의 목근화 추출물 및 양성대조군(PC)인 200mg/kg의 세인트존스워트(St. John's wort)를 5일 동안 투여하고 EEG를 측정하여 NonREM(Non-Rapid eye movement sleep) 시간을 측정한 결과이다. *은 정상군(Nor)에 비해 스트레스군(Stress)의 nonREM 시간이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로 p<0.05임을 의미한다.
도 5는 발바닥 전기충격 스트레스에 의해 수면장애가 유발된 SD 랫트에게 50, 100, 200mg/kg의 목근화 추출물 및 양성대조군(PC)인 200mg/kg의 세인트존스워트(St. John's wort)를 5일 동안 투여하고 혈액에서 코르티코스테론의 함량을 효소면역측정법으로 측정한 결과이다. ****은 정상군(normal)에 비해 스트레스군(stress)의 코르티코스테론의 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.0001임을 의미하고, ##, ###는 스트레스 군에 비해 양성대조군 또는 본 발명의 목근화 추출물 투여군의 혈액 내 코르티코스테론의 함량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, ##는 p<0.01이고, ###는 p<0.001이다.
도 6은 발바닥 전기충격 스트레스에 의해 수면장애가 유발된 SD 랫트에게 50, 100, 200mg/kg의 목근화 추출물 및 양성대조군(PC)인 200mg/kg의 세인트존스워트(St. John's wort)를 5일 동안 투여하고 혈액에서 세로토닌(serotonin)의 함량을 효소면역측정법으로 측정한 결과이다. #는 스트레스 군에 비해 본 발명의 목근화 추출물 투여군의 혈액 내 세로토닌의 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.05이다.
도 7은 발바닥 전기충격 스트레스에 의해 수면장애가 유발된 SD 랫트에게 50, 100, 200mg/kg의 목근화 추출물 및 양성대조군(PC)인 200mg/kg의 세인트존스워트(St. John's wort)를 5일 동안 투여하고 대뇌피질에서 GABAR A α1의 발현량을 단백질 검출 실험법으로 측정한 결과이다. ##는 스트레스 군에 비해 본 발명의 목근화 추출물 투여군의 대뇌피질에서 GABAR A α1의 발현량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.01이다.

본 발명은 목근(Hibiscus syriacus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면장애의 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물에 관한 것이다.

상기 목근 추출물의 추출용매는 물, C₁~C₄의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌 글리콜 및 헥산 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 물, C₁~C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이지만, 더욱더 바람직하게는 에탄올이지만, 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 목근 추출물의 제조 방법에 있어서, 추출 방법으로는 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 추출용매는 건조된 목근 분량의 2~40배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20~100℃인 것이 바람직하며, 80 내지 95℃인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 0.5~10시간인 것이 바람직하며, 1~4시간이 더욱 바람직하고, 3시간인 것이 가장 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다. 농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 감압농축인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 목근 추출물은 목근의 전초 또는 특정 부위(목근피, 목근근, 목근화 등)를 사용하여 추출할 수 있으나, 바람직하게는 목근의 꽃을 추출하는 것이 바람직하다. 하지만 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 수면장애는 스트레스에 의한 불면증인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 목근 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중에 포함되는 상기 목근 추출물의 양은 전체 건강기능식품 중량의 0.1~90 중량부로 가할 수 있다. 하지만, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료로 사용되는 경우, 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분인 목근 추출물을 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 증진제, 펙트산 및 그의 염, 알킨산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 및 탄산음료에 사용되는 탄산화제 중에서 선택된 하나 이상을 더 첨가하여 함유할 수 있다. 이외에도 본 발명의 건강기능식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 상기 과육은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 다양한 첨가제의 비율은 중요하진 않지만, 본 발명의 목근 추출물 100 중량부 당 0.1~20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제(base)로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강 내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하지만 이에 제한하지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 목근 추출물의 양을 기준으로 0.01~1000㎎/㎏이고, 바람직하게는 30~500㎎/㎏이고, 더욱 바람직하게는 50~300㎎/㎏이며, 하루 1~6회 투여될 수 있으나, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

<실험 방법>

1. 시료의 제조 및 준비

목근 꽃잎을 10~15배의 30%(v/v) 에탄올 용매에 넣고 3시간 동안 환류추출을 실시하였다. 추출된 용매는 1차 거름망 필터 후 2차 솜 필터하여 농축하였으며 동결건조하여 분말화하였다.

2. 시료의 투여 및 실험군 분류

스트레스를 가하기 30분 전에 약물을 0.1㎖씩 경구투여하였고, 정상군(normal)과 스트레스 대조군(stress)은 용매 0.1㎖씩 경구투여하였다. 실험을 총 6그룹[normal, control(stress), positive control (PC, St. John's wort), 목근 추출물 50, 100, 200mg/kg]으로 나누어 진행하였고 각 그룹당 6마리씩 총 36마리로 진행하였다.

3. 뇌파 전위 기록술(electroencephalography, EEG)을 위한 수술

수컷 7주령의 랫트는 실험 당일까지 고형사료와 물을 적정하게 공급하고, 온도 23~25℃, 습도 45~60%, 조명 200~300LUX, 12 시간 명암 주기의 환경을 유지하며 1주 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 수술을 위해 7주령의 SD(Sprague Dawley) 랫트의 복강 내에 40mg/kg의 펜토바르비탈(pentobarbital)을 주사하여 마취하여 입체 고정기(stereotaxic instrument, Stoelting CO, USA)에 위치시키고 정수리점(bregma) 및 시옷점(lambda)이 수평이 되게 고정하였다. 두피 하에 출혈을 억제한 다음, 털을 깎고 두피 절개 및 골막(periosteum)을 제거하여 두개골(skull)을 노출시켰다. Paxinos & Watson의 해부도에 따라 드릴로 구멍을 내고 전극(electrode)을 경막에 닿도록 삽입하고 근전도 기록을 위해 목 근육에 두 가닥의 은선 전극을 삽입하였다. 뇌파 기록 전극 및 근전도 기록 전극이 연결된 핀들을 소뇌상부 두개골 위에 위치시키고 치과용 시멘트를 발라서 두개골 상부에 고정하였다. 수술이 끝난 랫트를 사육실의 사육 상자에 1마리씩 넣고 1주일 동안 회복시켰다.

4. 스트레스에 의한 수면장애 유발 모델

수술 회복 후, 실험은 도 1과 같이 진행되었고, 총 5일 동안 매일 발바닥 전기충격 스트레스 실험을 실시하였다. 수면장애를 유발하기 위해 랫트를 발바닥에 5분(3초당 10회씩) 동안 랜덤하게 1mA의 세기로 전기충격을 주었다.

5. 뇌파 전위 기록술(EEG) 측정

5일의 스트레스 후, 랫트에 경구투여로 각각의 약물을 투여하고 30분 후 빛이 차단된 아크릴로 제작된 실린더에서 EEG 레코딩(PM 8:00~AM 8:00)을 진행하였다. 각성(Wake) 시간 및 수면(REM, Non-REM) 시간은 동물수면 전문분석 프로그램인 SleepSign Ver. 3 소프트웨어(Kissei Comtec, Nagano, Japan)로 기록하였다.

6. 혈청 내 코르티코스테론(corticosterone) 측정

실험 종료 후 각 실험동물로부터 분리한 혈청에서 코르티코스테론의 함량을 측정하였다. 먼저 코르티코스테론 ELISA Kit(Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA)의 메뉴얼 대로 goat anti-mouse IgG coated microplate의 non-specific binding 웰에 100㎕의 ELISA 완충용액을 가하고, B₀ 웰에는 50㎕의 ELISA 완충용액을 넣었다. 표준 및 시료 웰에 각각의 준비한 시료를 50㎕를 가하고, 블랭크 웰(Blank well), 총 활성 웰(Total activity well)을 제외한 모든 웰에 희석한 코르티코스테론 AChE Tracer를 50㎕를 주입하였다. Blank well, Total activity well, non-specific binding well를 제외한 웰에 희석한 50㎕의 코르티코스테론 ELISA 항 혈청을 첨가하였다. 4℃에서 overnight 반응한 후 5번의 세척과정을 거친 뒤, 희석한 200㎕의 Ellman's 시약을 각 웰에 반응시키고, Total activity well에는 5㎕의 Ellman's Reagent를 더해서 총량을 맞춰주었다. 90~120분 동안 orbital shaker를 이용하여 교반, 반응시킨 후 405nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

7. 혈청 내 세로토닌 측정

실험 종료 후 각 실험동물로부터 분리한 혈청에서 세로토닌 양을 측정하였다. 먼저 세로토닌 ELISA kit (Abcam Inc, Cambridge, UK)의 메뉴얼대로 goat anti-rabbit IgG microplate의 non-specific binding well에 150㎕, B₀ well에 100㎕의 분석 버퍼를 넣고, 스탠다드와 샘플 웰에는 각각 100㎕를 넣은 후, 총 활성 웰(Total activity well)과 블랭크 웰을 제외하고, 세로토닌 Alkaline Phosphase Conjugate를 50㎕씩 주입하였다. 블랭크 웰, 총 활성 웰, 비특이적 결합 웰(non-specific binding well)을 제외하고 B0와 스탠다드, 실험군에는 세로토닌 항체를 넣어주었다. 상온에서 500rpm으로 2시간 교반하고 3번의 세척 후, 총 활성 웰에만 세로토닌 Alkaline Phosphase Conjugate을 20배 희석하여, 5㎕ 넣었다. 최종적으로 200㎕씩 pNpp 기질 용액을 넣고, 교반 없이 1시간 동안 상온에 반응시켰다. 50㎕의 정지 용액으로 발색반응을 중지시킨 후 반응을 종료하여 microplate reader로 405nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

8. 웨스턴 블랏

적출한 대뇌피질 조직을 300㎕의 분해 완충용액(lysis buffer)에 넣고 조직파쇄(homogenization)한 후, 13000rpm으로 20분 동안 원심분리한 후 용해물을 얻었다. 이 용해물을 SDS-PAGE Gel에서 분리하고 멤브레인에 옮겨서 blocking한 후 GABAR A α1 항체를 16시간 동안 4℃에서 반응시켰다. HRP가 링크된 2차 항체를 1시간 동안 실온에서 반응시키고 LAS-3000 image analyzer (Fuji Photo Film Co., Tokyo, Japan)로 현상하여 분석하였다.

9. 통계처리

결과는 평균±표준편차(standard deviation)로 표기하였으며, 실험군 사이의 통계학적 비교는 Tukey honestly Significant Difference (HSD)을 통해 one-way measures analysis of variance (ANONA)를 시행하였으며, p < 0.05는 통계적으로 유의하다고 간주하였다.

실시예 1. 스트레스에 의한 수면장애가 유발된 SD 랫트에서 목근 추출물이 수면 중 Wake 시간에 미치는 효과 확인

SD 랫트에 스트레스(stress)를 가하여 수면장애를 유발시킨 SD 랫트에서 목근 추출물이 수면 중 Wake 시간에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실험법에 따라 경구투여 방법으로 스트레스를 가하지 않은 정상군과 스트레스 대조군에는 용매를 투여하였고, 양성대조군에는 200 mg/kg의 St. John's wort 추출물 및 본 발명의 목근 추출물 투여군에는 50, 100, 200mg/kg의 목근 추출물을 투여하였다.

5일 동안 각 그룹에 해당하는 물질을 경구 투여한 30분 후, 정상군을 제외한 SD 랫트에 발바닥 전기충격을 가하여 스트레스에 의한 수면장애를 유발하였으며, 랫트의 Wake 시간을 측정하였다.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 수면 중 Wake 시간은 정상군과 비교하여 스트레스 대조군에서 통계적으로 유의미하게 증가하는 것으로 나타났고, 목근 추출물과 St. John's wort를 투여한 군에서는 스트레스 대조군에 대비하여 감소하는 것으로 나타났으며, 100mg/kg의 목근 추출물을 투여한 군에서는 통계적으로 유의미하게 감소하였다.

실시예 2. 스트레스에 의한 수면장애가 유발된 SD 랫트에서 목근 추출물이 수면 중 REM 시간에 미치는 효과 확인

SD 랫트에 스트레스(stress)를 가하여 수면장애를 유발시킨 SD 랫트에서 목근 추출물이 수면 중 REM 시간에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실험법에 따라 경구투여 방법으로 스트레스를 가하지 않은 정상군과 스트레스 대조군에는 용매를 투여하였고, 양성대조군에는 200 mg/kg의 St. John's wort 추출물 및 본 발명의 목근 추출물 투여군에는 50, 100, 200mg/kg의 목근 추출물을 투여하였다.

5일 동안 각 그룹에 해당하는 물질을 경구 투여한 30분 후, 정상군을 제외한 SD 랫트에 발바닥 전기충격을 가하여 스트레스에 의한 수면장애를 유발하였으며, 랫트의 REM 시간을 측정하였다.

그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 수면 중 REM 시간은 정상군과 비교하여 스트레스 대조군에서 통계적으로 유의미하게 감소하는 것으로 나타났고, 목근 추출물과 St. John's wort를 투여한 군에서는 스트레스 대조군에 대비하여 증가하는 것으로 나타났으며, 100mg/kg의 목근 추출물을 투여한 군에서는 통계적으로 유의미하게 증가하였다.

실시예 3. 스트레스에 의한 수면장애가 유발된 SD 랫트에서 목근 추출물이 수면 중 NonREM 시간에 미치는 효과 확인

SD 랫트에 스트레스(stress)를 가하여 수면장애를 유발시킨 SD 랫트에서 목근 추출물이 수면 중 NonREM 시간에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실험법에 따라 경구투여 방법으로 스트레스를 가하지 않은 정상군과 스트레스 대조군에는 용매를 투여하였고, 양성대조군에는 200 mg/kg의 St. John's wort 추출물 및 본 발명의 목근 추출물 투여군에는 50, 100, 200mg/kg의 목근 추출물을 투여하였다.

5일 동안 각 그룹에 해당하는 물질을 경구 투여한 30분 후, 정상군을 제외한 SD 랫트에 발바닥 전기충격을 가하여 스트레스에 의한 수면장애를 유발하였으며, 랫트의 NonREM 시간을 측정하였다.

그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, 수면 중 NonREM 시간은 정상군과 비교하여 스트레스 대조군에서 통계적으로 유의미하게 감소하는 것으로 나타났고, 목근 추출물과 St. John's wort를 투여한 군에서는 스트레스 대조군에 대비하여 증가하는 것으로 나타났다.
상기 실시예 1~3의 결과로부터, 본 발명의 목근(Hibiscus syriacus)화 에탄올 추출물은 수면 중 각성(wake) 시간을 감소시키고, REM 수면(Rapid eye movement sleep) 및 NonREM 수면(Non-Rapid eye movement sleep) 시간을 증가시키므로, 비기질적 수면각성 주기장애에 효과가 있는 것으로 판단하였다.

실시예 4. 수면장애가 유발된 SD 랫트에서 목근 추출물이 혈중 코르티코스테론( corticosterone)에 미치는 효과

수면장애가 유발된 SD 랫트에서 목근 추출물이 혈액 내에서 코르티코스테론의 함량에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실험방법에 따라 5일 동안의 시료투여 및 스트레스 후 부검 시 랫트의 혈액을 회수하여 원심분리 한 후, 혈장(plasma)에서 효소면역측정법으로 코르티코스테론의 함량을 측정하였다

그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 코르티코스테론의 함량은 스트레스 대조군에 비교하여 목근 추출물을 투여한 군에서 유의미하게 감소하는 것으로 나타났다.

실시예 5. 수면장애가 유발된 SD 랫트에서 목근 추출물이 혈중 세로토닌( serotonin)에 미치는 효과

수면장애가 유발된 SD 랫트에서 목근 추출물이 혈액 내에서 세로토닌의 농도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실험방법에 따라 5일 동안의 시료투여 및 스트레스 후 부검 시 랫트의 혈액을 회수하여 원심분리 한 후, 혈장에서 효소면역측정법으로 세로토닌의 함량을 측정하였다.

그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 세로토닌의 함량은 스트레스 대조군에 비교하여 목근 추출물을 투여한 군에서 유의미하게 증가하는 것으로 나타났다.

실시예 6. 수면장애가 유발된 SD 랫트에서 목근 추출물이 대뇌피질의 GABAR A α1 발현에 미치는 효과

수면장애가 유발된 SD 랫트에서 목근 추출물이 대뇌피질의 GABAR(GABA receptor) A α1 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실험방법에 따라 5일 동안의 시료투여 및 스트레스 후 부검 시 랫트의 대뇌피질을 회수하여 완충용액과 원심분리 한 후, 용해물에서 단백질 검출 실험법으로 GABAR A α1의 발현 양을 측정하였다.

그 결과 도 7에 나타난 바와 같이, GABAR A α1의 발현은 스트레스 대조군에 비교하여 목근 추출물을 투여한 군에서 유의하게 증가하는 것으로 나타났다.

Claims

목근(Hibiscus syriacus)화 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면 중 각성(wake) 시간을 감소시키고, REM 수면(Rapid eye movement sleep) 및 NonREM 수면(Non-Rapid eye movement sleep) 시간을 증가시키는 것을 특징으로 하는 비기질적 수면각성 주기장애의 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 수면 중 각성(wake) 시간을 감소시키고, REM 수면 및 NonREM 수면 시간을 증가시키는 것을 특징으로 하는 비기질적 수면각성 주기장애의 예방 또는 개선용 건강기능성식품 조성물.
목근(Hibiscus syriacus)화 에탄올 추출물을 유효성분으로 포함하는 수면 중 각성(wake) 시간을 감소시키고, REM 수면(Rapid eye movement sleep) 및 NonREM 수면(Non-Rapid eye movement sleep) 시간을 증가시키는 것을 특징으로 하는 비기질적 수면각성 주기장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제6항에 있어서, 상기 목근화 에탄올 추출물 이외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 비기질적 수면각성 주기장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물.