WO2017142255A1 - 한약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 스트레스 또는 우울증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents

한약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 스트레스 또는 우울증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDF

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최고야
임아랑
김영화
채성욱
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for the prevention, improvement or treatment of stress or depression containing the herbal extract as an active ingredient.
  • Stress refers to physical or psychological stress, which is caused by factors that are prevalent in everyday life and contributes to the development of almost all psychiatric and medical diseases. However, if left untreated without stress, psychological reactions such as depression, anxiety, fatigue, anger, and mood changes result, and physiological reactions such as ⁇ -wave decrease in EEG, blood pressure and pulse rate increase. Repeated reactions lead to illnesses such as depression, anxiety and sleep disorders, causing personal, family and social losses, and lowering a person's quality of life.
  • depression refers to the psychological state of stagnant mood characterized by feelings of sadness, hopelessness and frustration. That is, it means a state that has developed into a major depressive disorder through normal feelings of "depression” and dysthymic disorders.
  • Major symptoms include changes in appetite, weight or sleep patterns, psychomotor agitation or retardation, loss of thinking ability, concentration or decision making, lack of vitality and fatigue, feelings of worthlessness, feelings of guilt or guilt, frequent deaths Or major depressive episodes, combined with some of the thoughts of suicide, planning to commit suicide, or a period of time that represents a stagnation of daily mood or loss of interest or enjoyment in most activities.
  • the root of the root of the name is the name of the hibiscus ( Hibiscus syriacus L.), the name of the roots of the neck ( ⁇ ⁇ , ⁇ ⁇ ⁇ ), mokgieun ( ⁇ ⁇ ), mokgija ( ⁇ ⁇ ).
  • Mugunghwa is a deciduous shrub belonging to the Malvaceae family, which is planted in Pyeongnam and Gangwon-do in Korea, and the stem and root bark of Mugunghwa in Korea's Pharmacopoeia (Medicinal Herb) standard collection. It is prescribed. According to the consent record, 'weakness is mild, non-toxic, long winds and bloodstains, diarrhea after diarrhea severely drunk when you drink is effective, and sleep well.
  • Korean Patent Laid-Open Publication No. 2005-0080428 discloses that the roots are effective for migraine headaches. It is disclosed about the composition and food for the sake, and Korean Patent Publication No. 2010-0059302 discloses that the extract of the neck roots has the effect of moisturizing the skin, healing the wounds and anti-aging, but so far the rooting or rooting extract of the present invention It has not been disclosed as a composition for the prevention, improvement or treatment of stress diseases, especially depression due to stress containing as an active ingredient.
  • the present invention is derived by the above requirements, the present invention relates to a composition for the prevention or treatment of stress or depression containing the herbal medicine extract as an active ingredient, in detail the root and neck of the present invention the active ingredient
  • the root muscle extract has neuroprotective activity, reduces the gene expression level of inflammatory factors caused by stress, and confirmed the antidepressant effect in stress-induced depression in animal models, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of stress disorders containing the root extract as an active ingredient.
  • the present invention provides a health functional food composition for the prevention or improvement of depression due to stress or stress containing the root extract as an active ingredient.
  • the present invention relates to a composition for the prevention, improvement or treatment of stress or stress-induced depression containing herbal extracts as an active ingredient, specifically, the roots of Hibiscus syriacus Linne ) and roots ( Hibiscus syriacus) Linne ) extract has a protective activity of nerve cells, decreases the expression of inflammatory factors induced by stress, and is effective in stress-induced depression.
  • Figure 2 shows the results of confirming the neuronal protective activity of the myocardium and myocardium extract according to the treatment of corticosterone.
  • Con is a control, no treatment cells, Veh is a control treated with corticosteroids.
  • ### means that the cell proliferation of the corticosteroid treated group compared to the normal group (Con) was statistically significant, which means that p ⁇ 0.001. **, *** is a statistically significant difference in cell proliferation when treated with myocardium or myocardium extract compared to the control, ** is p ⁇ 0.01, *** is p ⁇ 0.001.
  • Fluoxetine is a positive control treated with 10 ⁇ M of fluoxetine.
  • Figure 3 is the result of confirming the mRNA expression changes of inflammatory factors in the cell by the myocardium and myocardium extract according to the treatment of corticosterone.
  • A is a change in the mRNA expression level of IL-1 ⁇
  • B is a change in the mRNA expression level of IL-6
  • C is a change in the mRNA expression level of IL-8
  • D is a TNF- ⁇ mRNA expression level changes.
  • **, *** is a statistically significant decrease in the mRNA expression of the group orally administered the root muscle extract compared to the stress-only control group, ** is p ⁇ 0.01, *** is p ⁇ 0.001.
  • Figure 4 is a result of confirming whether the root muscle extract affects depressive behavior by using the sucrose preference experiment (SPT) after restraint stress exposure.
  • SPT sucrose preference experiment
  • * Indicates that the stressed control group (Veh) had a statistically significant decrease in sucrose intake compared to the normal group, indicating p ⁇ 0.05.
  • # And ## were significantly increased in sucrose intake of the group administered orally to the myocardium extract, compared to the stress-only control group. # Is p ⁇ 0.05 and ## is p ⁇ 0.01.
  • Figure 5 is a result of confirming whether the root muscle extract affects depressive behavior by using a forced swimming test (FST) after restraint stress exposure.
  • FST forced swimming test
  • * Means that the stress-only control group (Veh) had a statistically significant increase in the duration of immobilization compared to the normal group, which means that p ⁇ 0.05.
  • #, ## is a statistically significant decrease in the immobility duration of the group administered orally to the root muscle extract compared to the stress-only control, # is p ⁇ 0.05 and ## is p ⁇ 0.01.
  • Figure 7 is a result of measuring the concentration of cortisol (cortisol) in the mouse blood after restraint stress exposure to determine whether the effect of the root muscle extract stress hormones.
  • *** means that the stressed control group (Veh) had a statistically significant increase in cortisol production compared to the normal group, and *** means p ⁇ 0.001.
  • ### was significantly lower in cortisol production in the group treated with oral root extract compared to the stress-only control group.
  • ### was p ⁇ 0.001.
  • #, ### is a statistically significant increase in serotonin in the group administered orally to the root muscle extract compared to the stress-only control group, where # is p ⁇ 0.05 and ### is p ⁇ 0.001.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of stress disorders containing the extract of Hibiscus syriacus as an active ingredient. It is preferable that the extract of the myrtle root is extracted from myocardium, myocardium or outpost.
  • the stressful disease is preferably any one selected from stress-induced depression, sleep disorders, and anxiety disorders, and more preferably, depression is caused by stress, but is not limited thereto.
  • the extraction solvent of the root of the root extract is preferably at least one selected from water, C 1 ⁇ C 4 lower alcohol, acetone, ethyl acetate, butyl acetate, 1,3-butylene glycol and hexane, more preferably water, C Although lower alcohols of 1 to C 4 or mixtures thereof are used, the present invention is not limited thereto.
  • the extraction method conventional methods in the art such as filtration, hot water extraction, dipping extraction, reflux cooling extraction, and ultrasonic extraction may be used.
  • the extraction solvent is preferably extracted by adding 2 to 40 times the amount of dried root.
  • the extraction temperature is preferably 20 to 100 ° C, most preferably 80 to 95 ° C, but is not limited thereto.
  • the extraction time is preferably 0.5 to 10 hours, more preferably 1 to 4 hours, and most preferably 3 hours, but not always limited thereto.
  • Concentration is preferably reduced pressure concentration using a vacuum vacuum concentrator or vacuum rotary evaporator, but is not limited thereto.
  • the drying is preferably reduced pressure drying, vacuum drying, boiling drying, spray drying or freeze drying, but is not limited thereto.
  • compositions of the present invention may be in various oral or parenteral formulations.
  • it may be prepared using conventional diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, surfactants, but is not limited thereto.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, which may comprise at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose or lactose (at least one compound). lactose) and gelatin. In addition to simple excipients, lubricants such as magnesium stearate, talc and the like are also used.
  • Liquid preparations for oral administration include suspensions, solutions, emulsions or syrups, and include various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances or preservatives, in addition to the commonly used simple diluents such as water and liquid paraffin. Can be.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations or suppositories.
  • non-aqueous solvent and the suspension solvent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oil such as olive oil, injectable ester such as ethyl oleate, and the like can be used.
  • injectable ester such as ethyl oleate, and the like
  • suppositories witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerol, gelatin, and the like may be used.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally or parenterally, and it is preferable to select externally or intraperitoneally, rectally, intravenously, intramuscularly, subcutaneously, intradural dural or cerebrovascular injection methods for parenteral administration. I never do that.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • the pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat the disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to the medical treatment, and the effective dose level refers to the type, severity, drug activity, and drug of the patient. Sensitivity, time of administration, route of administration and rate of release, duration of treatment, factors including concurrent use of drugs, and other factors well known in the medical arts.
  • the compositions of the present invention may be administered as individual therapeutic agents or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be single or multiple doses. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can achieve the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be readily determined by one skilled in the art.
  • the dosage of the composition of the present invention varies depending on the weight, age, sex, health condition, diet, time of administration, administration method, excretion rate and severity of the disease of the patient, the daily dosage is based on the amount of the root extract It is 0.01 to 1000 mg / kg, preferably 30 to 500 mg / kg, more preferably 50 to 300 mg / kg, can be administered 1 to 6 times a day, the route of administration, the severity of obesity, sex
  • the dosage may be increased or decreased depending on the weight, age, and the like, and the above dosage does not limit the scope of the present invention by any method.
  • the present invention relates to a health functional food composition for the prevention or improvement of stress caused by stress or stress containing the root extract as an active ingredient. It is preferable that the extract of the root of the root is extracted from the roots of the roots, the roots of the roots, the roots of the roots, or the outpost, and more preferably the roots of the roots or the roots.
  • the dietary supplement composition containing the root extract of the present invention as an active ingredient may be added to food as it is or used with other foods or food ingredients, and may be appropriately used according to a conventional method.
  • the mixing amount of the active ingredient can be suitably determined according to the purpose of use (prevention or improvement).
  • the amount of the root extract contained in the dietary supplement may be added to 0.1 to 90 parts by weight of the total dietary supplement weight.
  • the amount may be below the above range, and the active ingredient may be used in an amount above the above range because there is no problem in terms of safety. .
  • nutraceutical composition of the present invention When the nutraceutical composition of the present invention is used as a beverage, there are no special limitations on the other ingredients except for containing the above-mentioned root extract of the active ingredient as an essential ingredient in the indicated ratio, and various flavors or natural ingredients such as ordinary drinks Carbohydrates and the like may be included as additional components.
  • natural carbohydrates include monosaccharides such as glucose, fructose and the like; Disaccharides such as maltose, sucrose and the like; And conventional sugars such as polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, and erythritol.
  • natural flavoring agents tauumatin, stevia extract (e.g., Rebaudioside A, glycyrrhizin, etc.) and synthetic flavoring agents (saccharin, aspartame, etc.) can be advantageously used. have.
  • the health functional food composition of the present invention in addition to the active ingredient, in addition to nutritional agents, vitamins, electrolytes, flavors, coloring agents, enhancers, pectic acid and salts thereof, alkonic acid and salts thereof, organic acids, protective colloid thickeners, pH regulators, At least one selected from stabilizers, preservatives, glycerin, alcohols and carbonation agents used in carbonated beverages may be further added.
  • the health functional food composition of the present invention may contain a flesh for the production of natural fruit juices and vegetable drinks. The pulp may be used independently or in combination.
  • the proportion of the various additives is not critical, but is generally selected from the range of 0.1 to about 20 parts by weight per 100 parts by weight of the roots extract of the present invention.
  • Mokeunhwa used in the present invention was used to extract the rose of sharon of Daejeon area, the root of the root was used to purchase the root of the Korean Mugunghwa in the mountain of Yeongcheon, Gyeongbuk. 250 g of roots were added to 20 times 30% (v / v) ethanol and refluxed at 90 ⁇ 2 ° C. for 3 hours, and 1.8 kgs of roots were added to 10 times 70% (v / v) ethanol. To reflux for 3 hours at 84 ⁇ 2 °C. After the primary sieve filter, it was concentrated by filtration with a secondary cotton, it was lyophilized and powdered. After concentrating, the yield of 27.6% and 7.2% were obtained.
  • SK-N-SH cells which are human neuroblastoma, were distributed from Korea Cell Line Bank and cultured in DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium) medium in 10% bovine serum and 1% penicillin / straptomycin (37 ° C). , 5% CO 2 incubator). When cells formed a monolayer, trypLE 1 ⁇ solution was treated to release the cells and passaged.
  • Corning BioCoat collagen I 96 well plates were seeded with 3x10 4 / well SK-N-SH cells. Thereafter, 10, 50, 100 and 200 ⁇ g / ml of the myocardium and myocardium extract were treated for 24 hours, an MTS assay was performed, and the absorbance was measured by using an enzyme-linked immunoabsorbent assay (ELISA) plate reader. Cell viability was confirmed.
  • ELISA enzyme-linked immunoabsorbent assay
  • corticosterone corticosterone
  • Corning BioCoat collagen I 96 well plates were seeded with 3x10 4 / well SK-N-SH cells. Thereafter, 10, 50, 100, 200 ⁇ g / ml of the myocardium and myocardium extract were pretreated for 24 hours, and 0.25 mM corticosterone was treated for 1 hour to induce oxidative stress, followed by MTS assay
  • Cell proliferation was confirmed by measuring absorbance using an ELISA (enzyme-linked immunoabsorbent assay) plate reader.
  • the myocardium extract and myocardium extract which are the active ingredients of the present invention, have activity to protect nerve cells from the toxicity caused by corticosterone.
  • FIG. 2 it was confirmed that the cells were reduced by about 50% by the treatment of corticosterone, and when the corticosteroid and the active ingredient of the present invention were simultaneously treated, 50 to 200 ⁇ g / ml of the myocardium.
  • the extract and the root muscle extract increased cell growth (%) in a concentration-dependent manner than when only corticosterone was treated, and the cell growth was more effective than the positive control fluoxetine.
  • SK-N-SH cells were seeded in 6-well plates, and 10, 50, 100 ⁇ g / ml of the myocardium extract and myocardium The extracts were pretreated for 24 hours and treated with 0.25 mM corticosterone for 1 hour to induce stress, RNA was extracted from the cells and complementary DNA was obtained using a reverse transcription kit. RNA was quantified by amplification with a real-time gene amplification system (QuantStudio 6, Applied Biosystems) using TaqMan RNA Assay (Applied Biosystems). mRNA gene expression was determined using TaqMan probe (FAM dye-labeled, ABI, USA) and human actin probe as internal standard. As a positive control, 10 ⁇ M of Fluoxetine (Sigma, St. Louis, Mo., USA) was treated instead of the rooting or rooting root extract.
  • the extract of the myocardium and the myocardium extract showed increased inhibitory effect on inflammatory factors by corticosteroids.
  • gene expression levels of inflammation-related factors, IL-1 ⁇ , IL-6, IL-8, and TNF- ⁇ were increased compared to the normal group. It was confirmed that the amount of gene expression in one group was suppressed.
  • mice used as experimental animals were supplied from Samtaco Bio Korea.
  • the positive control group (Fluoxetine, n 16)
  • Fluoxetine a positive control, was dissolved in physiological saline at a dose of 20 mg / kg and orally administered at 11 AM for 22 days. In the control group that gave only stress without drug administration, physiological saline (300 ⁇ l) was orally administered at the same dose. Fluoxetine was used as the product of Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA).
  • Example 5 restraint stress was applied to the control group and the experimental group for 22 days, and the experimental group was administered with the administration of the root muscle extract for each concentration. Restraint stress was performed by putting mice one by one in a 50 ml conical tube, which was vented to allow breathing in all groups except the normal group, and started at 1 pm, 2 hours after drug administration, for 2 hours. Proceeded. The control group was raised in another nursery to avoid contact with the stressed group, and on the eve of the forced swimming and tail hanging experiments, water and food were freely provided except for deprivation of food and water.
  • sucrose preference experiment was confirmed by measuring the day 1 and after the end of the experiment.
  • sucrose solution feeding test 8 mice per group were kept in individual cages, and sucrose solution was fed to two buckets to recognize 2% sucrose solution. After 24 hours, one bucket was converted into physiological saline and supplied, and after 24 hours, the positions of the physiological saline and sucrose solution buckets were changed to eliminate feeding preference according to the positions.
  • the feeding preference was calculated as follows.
  • the amount of sucrose in the control group was significantly decreased in comparison with the control group, and in contrast, in the positive control group, the fluoxetine showed a significant increase in comparison with the stress control group. It was.
  • the myocardium extract 100 and 200mg / kg treated group also showed a significant increase in sucrose intake compared to the stress control (Vehicle).
  • the forced swimming experiment was started after the restraint stress period was terminated using Porsolt et al. (1997) to determine the antidepressant effects of the roots.
  • Porsolt et al. 1997) to determine the antidepressant effects of the roots.
  • one rat was placed in the tank one by one, and the first two minutes of the total 6 minutes were not measured by the adaptation time. immobility) was measured.
  • the floating state was defined as the case where the head was standing up and not moving with only minimal movement to expose only the head above the water, and the time change of the floating state was used as a measure of improving depressive behavior.
  • control group significantly increased the dead time compared to the control group (Control)
  • positive control group significantly reduced the dead time compared to the control (Vehicle)
  • myocardium extract 200 and 400mg / kg treated group also showed a significant decrease in dead time compared to the control (Vehicle).
  • the tail hanging experiment was performed using the method of Can et al. After attaching the fixation device to the end of the experimental rat tail about 1cm, hang it at a distance of 50cm from the ground, and the first 2 minutes of the total 6 minutes of measurement were not measured by the adaptation time, and the immobilized state of the experimental animals for the last 4 minutes. The immobility time was measured and the floating state was considered to be completely stationary without any movement from the suspended state.
  • control group (Vehicle) increased the dead time compared to the control group (Control), on the contrary, the positive control group (Fluoxetine) was found to decrease the dead time compared to the control group (Vehicle).
  • the positive control group (Fluoxetine) was found to decrease the dead time compared to the control group (Vehicle).
  • the group treated with 200 and 400 mg / kg of the myocardium extract there was a significant decrease in dead time compared to the control (Vehicle).
  • the blood cortisol (cortisol) production of the mice was measured, the control (Vehicle) significantly increased the production of cortisol (cortisol) compared to the control group (Control), on the contrary positive control group Fluoxetine significantly reduced cortisol production compared to the control vehicle.
  • the myocardium extract 100, 200, 400mg / kg treated group also showed a significant decrease in cortisol (cortisol) production compared to the control (Vehicle).
  • Serotonin was measured using a competitive enzyme immunoassay (Abcam Inc, Cambridge, UK) according to the manufacturer's protocol. Samples were prepared by diluting mouse serum to assay buffer at 20/20 and in standard well plates, 100 ⁇ l of standard solution or 100 ⁇ l of sample, 50 ⁇ l of Serotonin Alkaline Phosphatase Conjugate, 50 ⁇ l of Serotonin An antibody (Serotonin antibody) was added thereto and reacted at room temperature for 2 hours. Then, 200 ⁇ l of pNPP substrate was added and reacted at room temperature for 1 hour. 50 ⁇ l of stop solution was added, followed by absorbance at 405 nm with a micro spectrophotometer (Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA). Was measured.
  • control group (Vehicle) reduced the production of serotonin compared to the control group (Control), on the contrary, in the positive control group (Fluoxetine) significantly compared to the control (Vehicle) production of serotonin significantly Increased.
  • the myocardium extract 200, 400mg / kg treated group also showed a significant increase in serotonin production compared to the control (Vehicle).

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Abstract

본 발명은 한약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 스트레스 또는 우울증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 목근화 추출물과 목근근 추출물이 신경세포의 보호 활성이 있으며, 스트레스에 의해 증진된 염증인자의 발현을 줄일 뿐만 아니라, 스트레스성 우울증에 효과가 있다는 것을 확인하였다.

Description

한약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 스트레스 또는 우울증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물
본 발명은 한약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 스트레스 또는 우울증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
사회가 급격히 발전하고 다변화됨에 따라 현대인들은 여러 가지 역할을 요구받고 있다. 이에 따라, 각종 스트레스로 인한 우울증, 불안장애 또는 수면장애 등 정신질환을 호소하는 사람들이 증가하고 있다. 보건복지부에서 18~64세 이하의 성인을 대상으로 시행한 2006년도 정신질환실태 역학조사에 따르면, '정신질환 1년 유병률'이 17.1%인 것으로 나타났다. 또한, 평생 동안 한가지 이상의 정신질환 경험 인구비율인 '정신질환 평생 유병률'도 성인 3명 중 1명인 30%로 나타났다(2006년 기준). 아울러, 최근 과도한 학구열 등의 원인으로 인해 청소년 정신질환이 증가하는 추세이다.
스트레스는 신체적 또는 심리적인 압박 상태를 말하는 것으로, 일상에 만연되어 있는 요소로 유발되며 거의 모든 정신과적 질환과 의학적 질병의 발생에 기여한다. 하지만, 스트레스에 대처하지 못하고 그대로 방치하게 되면 우울, 불안, 피로, 분노, 기분변화와 같은 심리반응이 초래되고, 뇌파 중 α-파 감소, 혈압과 맥박수의 증가 등의 생리 반응을 초래하게 되는데 이러한 반응이 계속 반복되면 우울증, 불안증, 수면 장애와 같은 질병이 나타나고 개인, 가족 및 사회적 손실을 야기하며, 개인의 삶의 질을 낮추는 원인이 된다.
스트레스로 인한 질환 중에서 우울증은 슬픔, 절망감 및 좌절감의 감정을 특징으로 하는 침체된 기분의 심리적 상태를 말하는 것이다. 즉, 정상적인 감정인 "울적함", 감정부전 장애(dysthymic disorder)를 거쳐 주요 우울 장애(major depressive disorder)로 발전한 상태를 의미한다. 주요 증상에는 입맛, 체중 또는 수면 패턴의 변화, 정신운동 초조 또는 지체(psychomotor agitation or retardation), 사고 능력, 집중력 또는 결정능력의 감소, 활력의 부족 및 피로감, 무가치함의 감정, 자책감 또는 죄책감, 빈번한 죽음 또는 자살 생각, 자살할 계획 또는 시도 중 일부와 조합된, 일상적인 기분의 침체 또는 대부분의 활동에서의 흥미 또는 즐거움의 상실을 나타내는 기간인, 주요 우울 에피소드(major depressive episode)를 특징으로 한다.
한편, 목근은 무궁화(Hibiscus syriacus L.)의 이명으로, 목근피(木槿皮), 목근화(木槿花), 목근근(木槿根), 목근자(木槿子)를 생약명으로 사용하고 있다. 무궁화는 아욱과(Malvaceae)에 속한 낙엽관목으로서 대한민국에서는 평남 및 강원도 이남에서 재식하고 있으며, 대한민국 약전외 한약(생약)규격집에서는 무궁화의 줄기껍질 및 뿌리껍질을 목근피(木槿皮. Hibisci Cortex)'로 규정하고 있다. 동의보감의 기록에 의하면, '약성은 순하고, 독이 없으며 장풍과 사혈을 멎게 하고 설사한 후 갈증이 심할 때 달여 마시면 효과가 있고, 잠을 잘 자게 한다. 꽃은 약성이 차고 독이 없으며, 적 이질, 백 이질을 고치고 장풍, 사혈이 있을 때 볶아서 먹거나 또는 차로 달여서 먹는다고 기재되어 있으며, 본초강목에는 부인들의 적 대하증, 백 대하증 치료에 종기의 통증을 멎게 하고, 옴 치료제로 사용하고 달인 물로 눈을 씻으면 눈이 맑아지고, 혈액순환을 돕는 것으로 기재되어 있다.
현재까지 알려진 목근근 또는 목근화 추출물 관련 기술의 일례로, 한국공개특허 제2005-0080428호에 목근이 편두통에 효과가 있다는 것이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1451952호에 목근근을 함유한 숙취해소용 조성물 및 식품에 대해 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2010-0059302호에 목근피 추출물이 피부 보습, 상처치유 및 항노화 효능이 있다는 것이 개시되어 있으나, 아직까지는 본 발명의 목근화 또는 목근근 추출물을 유효성분으로 함유하는 스트레스성 질환, 특히 스트레스로 인한 우울증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물로 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 한약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 스트레스 또는 우울증의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 유효성분인 목근화 및 목근근 추출물이 신경세포 보호 활성이 있으며, 스트레스에 의한 염증인자의 유전자 발현량을 감소시키고, 스트레스에 의한 우울증이 유발된 동물모델에서 항우울 효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 목근 추출물을 유효성분으로 함유하는 스트레스성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 목근 추출물을 유효성분으로 함유하는 스트레스 또는 스트레스로 인한 우울증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
본 발명은 한약재 추출물을 유효성분으로 함유하는 스트레스 또는 스트레스에 의한 우울증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 목근화(Hibiscus syriacus Linne) 및 목근근(Hibiscus syriacus Linne) 추출물이 신경세포의 보호활성이 있으며, 스트레스에 의한 증가에 의해 유도된 염증인자의 발현이 감소하고, 스트레스에 의한 우울증에 효과가 있다.
도 1은 목근화 및 목근근 추출물의 세포 생존률(%)를 확인한 결과이다.
도 2는 코르티코스테론의 처리에 따른, 목근화 및 목근근 추출물의 신경세포 보호 활성을 확인한 결과이다. Con은 대조군로서, 아무것도 처리하지 않는 세포이며, Veh는 코르티코스테론을 처리한 대조군이다. ###는 정상군(Con) 대비 코르티코스테론 처리군의 세포 증식이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.001임을 의미한다. **, ***는 대조군 대비 목근화 또는 목근근 추출물을 처리했을 때의 세포 증식이 대조군과 차이가 통계적으로 유의미하다는 것으로, **는 p<0.01이고, ***는 p<0.001이다. 플루옥세틴은 양성 대조군으로, 10μM의 플루옥세틴을 처리한 것이다.
도 3은 코르티코스테론의 처리에 따른, 목근화 및 목근근 추출물에 의한 세포 내 염증인자의 mRNA 발현량 변화를 확인한 결과이다. (A)는 IL-1β의 mRNA 발현량 변화이고, (B)는 IL-6의 mRNA 발현량 변화이며, (C)는 IL-8의 mRNA 발현량 변화이고, (D)는 TNF-α의 mRNA 발현량 변화이다. **, ***는 스트레스만 받은 대조군 대비 목근근 추출물을 경구투여한 군의 mRNA 발현량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, **는 p<0.01이고, ***는 p<0.001이다.
도 4는 구속 스트레스 노출 후 자당 선호 실험(SPT)을 이용하여, 목근근 추출물이 우울 행동 개선에 영향을 미치는지를 확인한 결과이다. *는 스트레스를 받은 대조군(Veh)이 정상군에 비하여 자당 섭식량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로 p<0.05임을 의미한다. #, ##는 스트레스만 받은 대조군 대비 목근근 추출물을 경구투여한 군의 자당 섭식량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, #는 p<0.05이고, ##는 p<0.01이다.
도 5는 구속 스트레스 노출 후 강제수영 실험(FST)을 이용하여, 목근근 추출물이 우울 행동 개선에 영향을 미치는지를 확인한 결과이다. *는 스트레스만 받은 대조군(Veh)이 정상군에 비하여 부동상태 지속시간이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.05임을 의미한다. #, ##는 스트레스만 받은 대조군 대비 목근근 추출물을 경구투여한 군의 부동상태 지속시간이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, #는 p<0.05이고, ##는 p<0.01이다.
도 6은 구속 스트레스 노출 후 꼬리 매달기 실험(TST)을 이용하여, 목근근 추출물이 우울 행동 개선에 영향을 미치는지를 확인한 결과이다. #는 스트레스만 받은 대조군 대비 목근근 추출물을 경구투여한 군의 부동상태 지속시간이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, #는 p<0.05이다.
도 7은 구속 스트레스 노출 후 마우스 혈중 코티졸(cortisol) 농도를 측정하여 목근근 추출물이 스트레스 호르몬에 영향을 미치는지를 확인한 결과이다. ***는 스트레스를 받은 대조군(Veh)이 정상군에 비하여 코티졸(cortisol) 생성이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로 ***는 p<0.001임을 의미한다. ###는 스트레스만 받은 대조군 대비 목근근 추출물을 경구투여한 군의 코티졸(cortisol) 생성이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로 ###은 p<0.001이다.
도 8은 구속 스트레스 노출 후 마우스 혈중 세로토닌(serotonin) 농도를 측정하여 목근근 추출물이 신경 전달 물질에 영향을 미치는지를 확인한 결과이다. #, ###는 스트레스만 받은 대조군 대비 목근근 추출물을 경구투여한 군의 세로토닌(serotonin)이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로 #는 p<0.05이고, ###는 p<0.001이다.
본 발명은 목근(Hibiscus syriacus) 추출물을 유효성분으로 함유하는 스트레스성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 상기 목근 추출물은 목근화, 목근근 또는 전초로부터 추출한 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 목근화 또는 목근근으로부터 추출한 것이지만 이에 한정하는 것은 아니다.
상기 스트레스성 질환은 스트레스에 의해 유발되는 우울증, 수면장애 및 불안장애 중에서 선택된 어느 하나인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 스트레스에 의한 우울증인 것이지만 이에 한정하지 않는다.
상기 목근 추출물의 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌 글리콜 및 헥산 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물을 사용하는 것이지만, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 목근 추출물의 제조 방법에 있어서, 추출 방법으로는 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 추출용매는 건조된 목근 분량의 2 내지 40배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20 내지 100℃인 것이 바람직하며, 80 내지 95℃인 것이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 0.5 내지 10시간인 것이 바람직하며, 1 내지 4시간이 더욱 바람직하고, 3시간인 것이 가장 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다. 농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 감압농축인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.
경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제(base)로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강 내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하지만 이에 제한하지 않는다.
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 목근 추출물의 양을 기준으로 0.01 내지 1000㎎/㎏이고, 바람직하게는 30 내지 500㎎/㎏이고, 더욱 바람직하게는 50 내지 300㎎/㎏이며, 하루 1~6회 투여될 수 있으나, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 목근 추출물을 유효성분으로 함유하는 스트레스 또는 스트레스로 인한 우울증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다. 상기 목근 추출물은 목근화, 목근근, 목근피 또는 전초로부터 추출한 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 목근화 또는 목근근으로부터 추출한 것이지만 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 목근 추출물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중에 포함되는 상기 목근 추출물의 양은 전체 건강기능식품 중량의 0.1 내지 90 중량부로 가할 수 있다. 하지만, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료로 사용되는 경우, 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분인 목근 추출물을 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 증진제, 펙트산 및 그의 염, 알킨산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 및 탄산음료에 사용되는 탄산화제 중에서 선택된 하나 이상을 더 첨가하여 함유할 수 있다. 이외에도 본 발명의 건강기능식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 상기 과육은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 다양한 첨가제의 비율은 중요하진 않지만, 본 발명의 목근 추출물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
실시예 1. 목근화 및 목근근 추출물의 제조
본 발명에 사용된 목근화는 대전 지역의 무궁화 꽃잎을 채취한 것을 사용하였으며, 목근근은 경북 영천 산지의 국산 무궁화 뿌리를 구입하여 사용하였다. 250g의 목근화를 20배의 30%(v/v) 에탄올에 첨가하여 90±2℃에서 3시간 동안 환류 추출하였고, 1.8kg의 목근근을 10배의 70%(v/v) 에탄올에 첨가하여 84±2℃에서 3시간 동안 환류추출하였다. 1차 거름망 필터 후, 2차 솜으로 필터하여 농축하였으며, 이를 동결건조하여 분말화하였다. 농축 후, 목근화는 27.6%, 목근근은 7.2%의 수율을 획득하였다.
실시예 2. 세포 배양
인간 신경세포종인 SK-N-SH 세포는 한국세포주은행에서 분양받아 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에 10% 소혈청과 1% 페니실린/스트랩토마이신이 포함된 배지에서 배양하여 사용하였다(37℃, 5% CO2 배양기). 세포가 단층을 형성하면 TrypLE 1×용액을 처리하여 세포를 유리시켜 계대배양 하였다.
실시예 3. 세포독성 확인 및 신경세포 보호 활성의 측정
인간 신경세포종에서 본 발명의 유효성분인 목근화 및 목근근 추출물의 세포독성을 확인하였다. Corning BioCoat 콜라겐 I 96웰 플레이트에 SK-N-SH 세포를 3×104/웰로 접종(seeding) 하였다. 이후, 10, 50, 100 및 200㎍/㎖의 목근화 및 목근근 추출물을 24시간 동안 처리하였고, MTS 어세이를 수행하였으며, ELISA(enzyme-linked immunoabsorbent assay) 플레이트 리더를 이용하여 흡광도를 측정함으로써 세포의 생존률(cell viability)을 확인하였다.
그 결과, 도 1에 개시한 바와 같이 목근화 및 목근근 추출은 세포 독성이 전혀 없다는 것을 확인하였다.
또한, 코르티코스테론(corticosterone)에 의한 독성으로부터 인간 신경세포종에서 신경세포의 보호 활성 여부를 확인하였다. Corning BioCoat 콜라겐 I 96웰 플레이트에 SK-N-SH 세포를 3×104/웰로 접종(seeding) 하였다. 이후, 10, 50, 100, 200㎍/㎖의 목근화 및 목근근 추출물을 24시간 동안 전처리하고, 0.25mM의 코르티코스테론을 1시간 동안 처리하여 산화적 스트레스를 유도한 후 MTS 어세이를 수행하였으며, ELISA(enzyme-linked immunoabsorbent assay) 플레이트 리더를 이용하여 흡광도를 측정함으로써 세포의 증식(cell proliferation)을 확인하였다.
양성 대조군으로 목근화 또는 목근근 추출물 대신에 10μM의 플루옥세틴(Fluoxetine) (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 처리하였다.
그 결과, 본 발명의 유효성분인 목근화 추출물과 목근근 추출물이 코르티코스테론에 의한 독성으로부터 신경세포를 보호하는 활성이 있다는 것을 확인하였다. 도 2에 개시한 바와 같이, 코르티코스테론의 처리에 의해 세포가 50% 정도 감소하였음을 확인하였고, 코르티코스테론과 본 발명의 유효성분을 동시에 처리하였을 때, 50~200㎍/㎖의 목근화 추출과 목근근 추출물은 농도 의존적으로 세포 증식(%)이 코르티코스테론만 처리했을 때보다 증가하는 것을 확인할 수 있었고, 양성대조군인 플루옥세틴보다 효과적으로 세포를 증식시키는 것을 확인하였다.
실시예 4. 세포 내 염증인자의 mRNA 발현 억제 효과 확인
코르티코스테론에 의해 증가된 세포 내의 염증 인자 발현 억제를 확인하기 위하여, SK-N-SH 세포를 6웰 플레이트에 접종(seeding) 하고, 10, 50, 100㎍/㎖의 목근화 추출물과 목근근 추출물을 24시간 동안 전처리하고, 0.25mM의 코르티코스테론을 1시간 동안 처리하여 스트레스를 유도한 후, 상기 세포에서 RNA를 추출하고 역전사 키트를 사용하여 상보적 DNA를 획득하였다. TaqMan RNA 어세이(Applied Biosystems)를 이용하여 실시간 유전자증폭 시스템(QuantStudio 6, Applied Biosystems)으로 증폭을 하여 RNA를 정량하였다. mRNA 유전자 발현은 TaqMan 프로브(FAM dye-labeled, ABI, USA)를, 내부 표준(internal standard)으로 인간 액틴 프로브를 사용하였다. 양성 대조군으로 목근화 또는 목근근 추출물 대신에 10 μM의 플루옥세틴(Fluoxetine) (Sigma, St. Louis, MO, USA)을 처리하였다.
그 결과, 도 3에 개시한 바와 같이 목근화 추출물과 목근근 추출물은 코르티코스테론에 의해 증가된 염증인자 억제 효능을 보여주었다. 코르티코스테론을 처리한 경우, 염증관련 인자인 IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α의 유전자 발현량이 정상군에 비해서 증가하였음을 알 수 있었고, 목근화와 목근근 추출물을 처리한 군에서의 유전자 발현량이 억제됨을 확인하였다.
실시예 5. 구속 스트레스 동물 모델을 이용한 목근근 추출물의 항우울 효과 확인
1) 실험동물
실험동물로 사용된 7주령 수컷 C57BL/6 마우스는 ㈜ 샘타코 바이오 코리아에서 공급 받아 사용하였다. 실험동물은 한국한의학연구원의 SPF(specific pathogen free) 시설인 실험동물연구센터에서 7일간 적응시킨 후 스트레스를 주지 않는 정상군(Control, n=16), 스트레스만 주는 스트레스 대조군(Vehicle, n=16), 스트레스와 시판 항우울제를 투여하는 양성대조군(Fluoxetine, n=16), 스트레스와 목근근 추출물을 투여하는 실험군(100, 200, 400mg/kg, n=16) 등 총 6군으로 구분하였다. 실험방법은 한국한의학연구원 실험동물 윤리위원회의 심의 (승인번호:15-102)를 거쳤으며, 실험동물 사육 및 유지는 한국한의학연구원 실험동물연구센터의 동물 관리 및 사용 규정에 입각하여 온도 23±1℃, 습도 50±10% 내외, 12시간 명암주기로 일정하게 유지된 사육실에서 IVC(individually ventilated cage)에 5마리씩 넣어 사육하였다.
양성대조군인 플루옥세틴(fluoxetine)은 생리식염수에 20㎎/㎏의 용량으로 녹여 매일 22일 동안 오전 11시에 경구투여 하였다. 약물 투여 없이 스트레스만 주는 대조군은 동일한 용량에 생리식염수(300㎕)를 경구투여 하였다. 상기 플루옥세틴(fluoxetine)은 시그마 알드리치(St. Louis, MO, USA)의 제품을 사용하였다.
2) 구속 스트레스 (Immobility Stress)
본 실시예 5에서는 구속 스트레스를 대조군과 실험군에 22일 동안 적용하였고, 실험군은 농도별로 목근근 추출물의 투여를 병행하였다. 구속 스트레스는 정상군을 제외한 모든 군에 호흡이 가능하도록 구멍을 낸 50㎖ conical tube에 마우스를 한 마리 씩 넣고 움직일 수 없게 하여 시행하였으며, 약물 투여 2시간 후인, 오후 1시에 시작하여 2시간 동안 진행하였다. 정상군(Control)은 스트레스가 적용되는 집단과 접촉을 피하도록 다른 사육실에서 사육하였고, 강제수영 실험 및 꼬리 매달기 실험 전날, 먹이와 물을 박탈하는 것 이외에는 물과 먹이를 자유롭게 공급하였다.
3) 자당 선호 실험 (Sucrose preference test, SPT )
자당선호 실험은 실험 1일째와 실험 종료 후에 측정하여 확인하였다. 자당용액 섭식검사 기간 동안 실험군별 8마리의 마우스를 개별 cage에서 사육했으며, 2% 자당용액을 인식시키기 위하여 두 개의 물통에 자당용액을 넣어 섭식할 수 있게 하였다. 24시간 후 1개의 물통을 생리식염수로 전환하여 공급하였고, 24시간 후 생리식염수 물통과 자당용액 물통의 위치를 바꾸어, 위치에 따른 섭식 선호도를 없애고자 하였다. 섭식 선호도는 다음과 같이 계산하였다.
그 결과, 도 4에 개시한 바와 같이 스트레스 대조군(Vehicle)은 정상군(Control)에 비해 자당 섭식량이 유의적으로 감소하였으며, 반대로 양성대조군(Fluoxetine)에서는 스트레스 대조군(Vehicle)에 비해 현저한 증가를 나타내었다. 또한, 목근근 추출물 100 및 200mg/kg 처리군에서도 스트레스 대조군(Vehicle)에 비해 유의적인 자당 섭식량 증가를 나타내었다.
4) 강제수영 실험(Forced Swimming Test, FST)
강제수영실험은 목근근 추출물의 항우울 효과를 측정하기 위해 Porsolt 등 (1997)의 방법을 이용하여 구속 스트레스 실험기간 종료 후 시작하였다. 1L 비커에 온도 23±1℃의 물을 750㎖까지 채운 후, 실험용 쥐를 한 마리씩 수조에 넣고 총 6분 중 최초 2분은 적응시간으로 측정하지 않고, 마지막 4분 동안의 실험동물 부동상태(immobility) 시간을 측정하였다. 부동상태는 머리만을 물 위로 드러내기 위한 최소한의 움직임만 하면서 똑바로 서서 움직이지 않고 떠 있는 경우로 정의하였고, 상기 부동상태의 시간 변화를 우울 행동 개선의 척도로 삼았다.
그 결과, 도 5에 개시한 바와 같이 대조군(Vehicle)은 정상군(Control)에 비해 부동시간이 현저히 증가하였으며, 반대로 양성대조군(Fluoxetine)에서는 대조군(Vehicle)에 비해 부동시간이 유의적으로 감소한 것으로 나타났다. 또한, 목근근 추출물 200 및 400mg/kg 처리군에서도 대조군(Vehicle)에 비해 유의적인 부동시간 감소를 나타내었다.
5) 꼬리 매달기 실험(Tail Suspension Test, TST )
꼬리 매달기 실험은 Can 등의 방법을 이용하였다. 실험용 쥐 꼬리 끝 1㎝ 정도에 고정 장치를 장착 후 지면에서 50㎝ 떨어진 위치에 매달고, 총 6분 동안의 측정 중 최초 2분은 적응시간으로 측정하지 않고 마지막 4분 동안의 실험동물 상태 중 부동상태(immobility) 시간을 측정하였으며, 매달려있는 상태에서 아무런 움직임 없이 완전히 멈춰 있는 상태를 부동상태로 간주하였다.
그 결과, 도 6에 개시한 바와 같이, 대조군(Vehicle)은 정상군(Control)에 비해 부동시간이 증가하였으며, 반대로 양성대조군(Fluoxetine)에서는 대조군(Vehicle)에 비해 부동시간이 감소한 것으로 나타났다. 또한, 목근근 추출물 200, 400mg/kg 처리군에서도 대조군(Vehicle)에 비해 유의적인 부동시간 감소를 나타내었다.
6) 코티졸( Cortisol ) 측정
실험 종료 후, 실험동물을 마취시키고 심장에서 혈액을 채취한 뒤 원심 분리하여(1,000xg, 15분) 혈청을 얻었다. 코티졸은 경쟁적 효소 면역측정법을 이용하여(Cayman chemical, MI, USA) 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다. 96웰 플레이트에 표준액 또는 샘플 50㎕을 넣고 4℃에서 하루 동안 반응시키고 세정액으로 세척한 후, 200㎕ Ellman’s Reagent를 넣어주고, 필름을 덮은 후, 2시간 정도 반응시키고, 마이크로 스펙트로 포토미터(Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)로 405 nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 7에서 개시한 바와 같이, 생쥐의 혈중 코티졸(cortisol) 생성을 측정한 결과, 대조군(Vehicle)은 정상군(Control)에 비해 코티졸(cortisol)의 생성이 현저히 증가하였으며, 반대로 양성대조군(Fluoxetine)에서는 대조군(Vehicle)에 비해 코티졸(cortisol)의 생성이 유의적으로 감소한 것으로 나타났다. 또한, 목근근 추출물 100, 200, 400mg/kg 처리군에서도 대조군(Vehicle)에 비해 유의적인 코티졸(cortisol) 생성의 감소를 나타내었다.
7) 세로토닌 측정
실험 종료 후, 실험동물을 마취시키고 심장에서 혈액을 채취한 뒤 원심 분리하여(1,000xg, 15분) 혈청을 얻었다. 세로토닌은 경쟁적 효소 면역측정법을 이용하여(Abcam Inc, Cambridge, UK) 제조사의 프로토콜에 따라 측정하였다. 마우스 혈청을 20분의 1로 어세이 버퍼에 희석하여 샘플을 준비하고 96웰 플레이트에 표준액 또는 100㎕의 샘플, 50㎕의 세로토닌 알칼라인 포스파타아제 컨쥬게이트(Serotonin Alkaline Phosphatase Conjugate), 50㎕의 세로토닌 항체(Serotonin antibody)를 넣고 상온에서 2시간을 반응시켰다. 그리고 200㎕의 pNPP 기질(substrate)를 넣은 후 상온에서 1시간 반응시키고, 50㎕의 반응정지 용액(stop solution)을 넣은 뒤 마이크로 스펙트로 포토미터(Molecular Device, Sunnyvale, CA, USA)로 405nm에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 8에서 개시한 바와 같이, 대조군(Vehicle)은 정상군(Control)에 비해 세로토닌의 생성이 감소하였으며, 반대로 양성대조군(Fluoxetine)에서는 대조군(Vehicle)에 비해 세로토닌의 생성이 유의적으로 증가한 것으로 나타났다. 또한, 목근근 추출물 200, 400mg/kg 처리군에서도 대조군(Vehicle)에 비해 유의적인 세로토닌 생성의 증가를 나타내었다.

Claims (9)

  1. 목근(Hibiscus syriacus) 추출물을 유효성분으로 함유하는 스트레스성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 목근 추출물은 목근화 또는 목근근 추출물인 것을 특징으로 하는 스트레스성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 스트레스성 질환은 스트레스에 의한 우울증인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 목근 추출물의 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 1,3-부틸렌 글리콜 및 헥산 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 스트레스성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 추가로 부형제 또는 희석제를 포함하는 것을 특징으로 하는 스트레스성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 경구 또는 비경구 투여하는 것을 특징으로 하는 스트레스성 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 목근 추출물을 유효성분으로 함유하는 스트레스 또는 스트레스로 인한 우울증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 목근 추출물은 목근화 또는 목근근 추출물인 것을 특징으로 하는 스트레스 또는 스트레스로 인한 우울증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
  9. 제7항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 추가로, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 증진제, 펙트산 및 그의 염, 알킨산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 및 탄산음료에 사용되는 탄산화제 중에서 선택된 하나 이상을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 스트레스 또는 스트레스로 인한 우울증의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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