KR102002168B1

KR102002168B1 - 에스쿨린을 유효성분으로 포함하는 우울증 및 불안장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102002168B1
Application number: KR1020180033584A
Authority: KR
Inventors: 이미영; 김유리; 박보경; 김영화
Original assignee: 한국 한의학 연구원
Priority date: 2018-03-23
Filing date: 2018-03-23
Publication date: 2019-07-23
Anticipated expiration: 2038-03-23
Also published as: WO2019182379A1

Abstract

본 발명은 에스쿨린을 유효성분으로 포함하는 우울증 및 불안장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 스트레스에 의한 우울증 동물모델에서 체중, 간무게, 코르티솔과 세로토닌을 정상수치로 회복시킬 뿐만 아니라 열린 공간 및 강제 수영 시험법에서 우울증 및 불안장애와 같은 행동을 개선하는 효과가 있다.

Description

에스쿨린을 유효성분으로 포함하는 우울증 및 불안장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, ameliorating or treating depression and anxiety disorders comprising esculin as effective component}

본 발명은 에스쿨린을 유효성분으로 포함하는 우울증 및 불안장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

우울증은 흔한 정신질환으로 마음의 감기라고도 부르며, 원활하지 못한 대인관계를 야기할 수 있고, 심한 경우 자살이라는 심각한 결과에 이를 수 있는 뇌질환이다. 다행히도 우울증은 효과적으로 치료될 수 있는 질환이며, 초기 완쾌율이 2개월 내에 70~80%에 이르는 의학적 질환이다. 우울증에는 상담과 정신과 치료가 필수적이며 중등도 이상의 우울증은 항우울제 투여도 반드시 필요하다. 특히 최근 개발된 항우울제들은 뇌 내의 저하된 세로토닌을 증가시켜 우울 증상을 호전시키고, 부작용이 거의 없이 안전하게 우울증을 개선할 수 있다. 우울증의 원인은 다양한데, 그 중에서 생물학적인 원인 있는 경우는 뇌의 신경전달물질의 불균형으로 인한 것이다. 대표적인 신경전달 물질의 예로 히스타민, 세로토닌, 도파민 등이 있다. 흔히 세로토닌이라는 뇌 내 신경전달물질의 저하가 우울증과 관련이 높은 것으로 알려져 있다. 또한, 생활 및 환경 스트레스가 원인이 될 수 있는데, 사랑하는 사람의 죽음, 이별, 외로움, 실직, 경제적인 걱정과 같은 스트레스가 우울증을 유발하거나 악화시킬 수 있으며, 신체적인 질환이나 약물 등에 의해 발생할 수 있다. 일례로, 암, 내분비계 질환, 뇌의 혈액순환장애에 의하여 일어나는 급격한 의식장애와 운동마비를 수반하는 뇌졸중 등 다양한 질환이 우울증을 유발할 수 있다.

불안장애는 다양한 형태의 비정상적, 병적인 불안과 공포로 인하여 일상 생활에 장애를 일으키는 정신 질환을 통칭한다. 불안과 공포는 정상적인 정서 반응이지만, 정상적 범위를 넘어서면 정신적 고통과 신체적 증상을 초래한다. 불안으로 교감신경이 흥분되어 두통, 심장 박동 증가, 호흡수 증가, 위장관계 이상 증상과 같은 신체적 증상이 나타나 불편하고 가정생활, 직장생활, 학업과 같은 일상 활동을 수행하기 어려운 경우 불안장애로 진단할 수 있다. 이러한 불안장애에는 다양한 진단이 있으며, 각각 특징적인 정의와 진단 기준이 마련되어 있다. 불안장애에 해당하는 질환으로는 공황 장애, 특정 공포증(고소 공포증, 혈액 공포증, 뱀 공포증 등), 사회 공포증, 강박 장애, 외상 후 스트레스 장애, 범 불안장애, 급성 스트레스 장애가 포함된다. 불안장애에는 각기 다른 성격의 여러 정신질환이 속해 있어, 복합적이라 원인을 한마디로 규정하기는 어렵다. 일반적으로 불안이나 우울 등의 정서적인 부분을 담당하는 뇌신경 내의 신경전달물질의 부족 또는 과다, 유전적으로 타고난 소인, 뇌영상 연구에서 밝혀진 뇌의 기능적 또는 구조적 변화를 포함하여, 사회심리학적인 측면, 과거의 경험과 현재의 받아들인 정보를 해석하고 판단하는 인지행동적인 부분까지도 병적인 불안을 일으키는 원인이 될 수 있다. 특히 외상 후 스트레스 장애나 급성 스트레스 장애는 극심한 정신적 충격을 일으키는 사고나 재해 등이 원인으로 주로 발병한다.

한편, 에스쿨린 관련 기술로는 한국공개특허 제2013-0025074호에 에스쿨린 유도체를 포함하는 피부 미백용 조성물이 개시되어 있고, 한국등록특허 제1540640호에 에스쿨린 용해물 및 이를 포함하는 화장료 조성물이 개시되어 있으며, 한국등록특허 제1512669호에 에스쿨린을 유효성분으로 하는 피피지-키토산 하이드로겔 마스크 시트 및 이의 제조방법이 개시되어 있으나, 본 발명의 에스쿨린을 유효성분으로 포함하는 우울증 및 불안장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 대해서는 개시된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 에스쿨린을 유효성분으로 포함하는 우울증 및 불안장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물을 제공하고, 발바닥 전기충격과 구속 스트레스에 의해 우울증이 유발된 동물모델의 체중, 간 무게, 코르티솔과 세로토닌의 함량 변화를 확인하고, 열린 공간 및 강제 수영 시험법을 통한 행동변화를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1의 에스쿨린, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 수화물을 유효성분으로 포함하는 우울증 및 불안장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

[화학식 1]

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 에스쿨린, 이의 식품학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 수화물을 유효성분으로 포함하는 우울증 및 불안장애의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 에스쿨린을 유효성분으로 포함하는 우울증 및 불안장애의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 스트레스에 의한 우울증 동물모델에서 체중, 간 무게, 코르티솔과 세로토닌을 정상수치로 회복시킬 뿐만 아니라 열린 공간 및 강제 수영 시험법에서 우울증 및 불안장애와 같은 행동을 개선하는 효과가 있다.

도 1은 스트레스에 의한 우울증 실험의 진행과정을 도표로 나타낸 것이다.
도 2는 발바닥 전기충격과 구속 스트레스에 의해 우울증이 유발된 C57BL/6 마우스에게 50mg/kg의 에스쿨린 및 15mg/kg의 독세핀(doxepin)을 14일 동안 투여하기 전 0일째, 투여 7일째 및 투여 14일째 측정한 체중의 증가율을 나타낸 것이다. ####은 정상군 대비 전기충격과 구속 스트레스로 인해 우울증이 유발된 대조군의 체중이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.0001임을 의미하고, *는 우울증이 유발된 대조군(control)에 비해 본 발명의 에스쿨린 투여군의 체중이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.05임을 의미한다.
도 3은 발바닥 전기충격과 구속 스트레스에 의해 우울증이 유발된 C57BL/6 마우스에게 50mg/kg의 에스쿨린 및 15mg/kg의 독세핀(doxepin)을 14일 동안 투여하고 15일째 측정한 간 무게 지수(liver weight/body weight×100)를 나타낸 것이다. ####은 정상군 대비 전기충격과 구속 스트레스로 인해 우울증이 유발된 대조군의 간 무게 지수가 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.0001임을 의미하고, ***, ****는 우울증이 유발된 대조군(control)에 비해 본 발명의 에스쿨린 투여군 및 독세핀(doxepin) 투여군의 간 무게 지수가 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, ***는 p<0.001임을 의미하며, ****는 p<0.0001임을 의미한다.
도 4는 발바닥 전기충격과 구속 스트레스에 의해 우울증이 유발된 C57BL/6 마우스에게 50mg/kg의 에스쿨린 및 15mg/kg의 독세핀(doxepin)을 14일 동안 투여하고 15일째 측정한 열린 공간 시험법 결과를 나타낸 것이다. ####은 정상군 대비 전기충격과 구속 스트레스로 인해 우울증이 유발된 대조군이 중앙으로 들어가는 횟수(number of entry into center)가 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.0001임을 의미하고, **는 우울증이 유발된 대조군(control)에 비해 본 발명의 에스쿨린 투여군이 중앙으로 들어가는 횟수가 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.01임을 의미한다.
도 5는 발바닥 전기충격과 구속 스트레스에 의해 우울증이 유발된 C57BL/6 마우스에게 50mg/kg의 에스쿨린 및 15mg/kg의 독세핀(doxepin)을 14일 동안 투여하고 16일째 측정한 강제 수영 시험법 결과를 나타낸 것이다. #은 정상군 대비 전기충격과 구속 스트레스로 인해 우울증이 유발된 대조군의 부동시간이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.05임을 의미하고, ***는 우울증이 유발된 대조군(control)에 비해 본 발명의 에스쿨린 투여군의 부동시간이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.001임을 의미한다.
도 6은 발바닥 전기충격과 구속 스트레스에 의해 우울증이 유발된 C57BL/6 마우스에게 50mg/kg의 에스쿨린 및 15mg/kg의 독세핀(doxepin)을 14일 동안 투여하고 17일째 얻은 혈액에서 세로토닌(serotonin)의 농도를 효소면역측정법으로 측정한 결과이다. ##은 정상군 대비 전기충격과 구속 스트레스로 인해 우울증이 유발된 대조군의 혈중 세로토닌 함량이 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, p<0.01임을 의미하고, **는 우울증이 유발된 대조군(control)에 비해 독세핀의 혈중 세로토닌 함량이 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.01임을 의미한다.
도 7은 발바닥 전기충격과 구속 스트레스에 의해 우울증이 유발된 C57BL/6 마우스에게 50mg/kg의 에스쿨린 및 15mg/kg의 독세핀(doxepin)을 14일 동안 투여하고 17일째 얻은 혈액에서 코르티솔(cortisol)의 농도를 효소면역측정법으로 측정한 결과를 나타낸 것이다. ####은 정상군 대비 전기충격과 구속 스트레스로 인해 우울증이 유발된 대조군의 혈중 코르티솔 농도가 통계적으로 유의미하게 증가하였다는 것으로, p<0.0001임을 의미하고, *, **는 우울증이 유발된 대조군(control)에 비해 본 발명의 에스쿨린 투여군 및 양성 대조군인 독세핀의 혈중 코르티솔 농도가 통계적으로 유의미하게 감소하였다는 것으로, *는 p<0.05임을 의미하며, **는 p<0.01임을 의미한다.

본 발명은 하기 화학식 1의 에스쿨린, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 수화물을 유효성분으로 포함하는 우울증 및 불안장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 에스쿨린은 물푸레나무 추출물로부터 분리한 것이 바람직하며, 상기 물푸레나무 추출물은 물푸레나무 줄기 껍질 또는 가지 껍질의 진피 추출물인 것이 특징이지만 이에 한정하지 않는다.

상기 물푸레나무 추출물은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:

(1) 물푸레나무에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

(2) 단계 (1)의 추출물을 여과하는 단계; 및

(3) 단계 (2)의 여과한 추출물을 농축하고 건조하여 추출물을 제조하는 단계.

상기 단계 (1)에서 추출용매는 물, C₁~C₄의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물 중에서 선택하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 에탄올이며, 더욱더 바람직하게는 70%(v/v) 에탄올이지만 이에 한정하지 않는다. 상기 제조방법에 있어서, 추출방법은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 당 업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 추출용매는 물푸레나무 중량의 1~20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 5~15배 첨가하는 것이고, 더욱더 바람직하게는 10배 첨가하는 것이다. 추출온도는 60~100℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 1~48시간인 것이 바람직하며, 1~24시간이 더욱 바람직하고, 3시간이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 방법에 있어서, 단계 (3)의 농축은 진공 회전 농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무 건조 또는 동결건조하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 동결건조이나 이에 한정하지 않는다.

상기 우울증 및 불안장애는 스트레스에 의한 우울증 및 불안장애인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다. 상기 불안장애는 분리 또는 격리 불안증, 편집증, 범공포증, 범강박증, 신경불안증 및 공황장애 중에서 선택된 하나 이상인 것이 바람직하지만 이에 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 통상적으로 사용하는 담체, 부형제 또는 희석제를 사용하여 조제할 수 있으나 이에 한정하는 것은 아니다.

경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제 또는 보존제 등이 포함될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제, 동결건조제제 또는 좌제 등이 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제(base)로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤, 젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 비경구 투여시 피부 외용 또는 복강 내, 직장, 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 방식을 선택하는 것이 바람직하지만 이에 제한하지 않는다.

본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, 약학적으로 유효한 양은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물의 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하며, 일일 투여량은 물푸레나무 추출물의 양을 기준으로 0.01 내지 1000㎎/㎏이고, 바람직하게는 30 내지 500㎎/㎏이고, 더욱 바람직하게는 50 내지 300㎎/㎏이며, 하루 1~6회 투여될 수 있으나, 투여 경로, 비만의 중증도, 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있으므로 상기 투여량이 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1의 에스쿨린, 이의 식품학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 수화물을 유효성분으로 포함하는 우울증 및 불안장애의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

본 발명에 따른 화학식 1의 에스쿨린, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 수화물을 유효성분으로 함유하는 건강기능식품 조성물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중에 포함되는 상기 유효성분의 양은 전체 건강기능식품 중량의 0.1~90 중량부로 가할 수 있다. 하지만, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물이 음료로 사용되는 경우, 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 유효성분을 함유하는 것 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 증진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 및 탄산음료에 사용되는 탄산화제 중에서 선택된 하나 이상을 더 첨가하여 함유할 수 있다. 이외에도 본 발명의 건강기능식품 조성물은 천연 과일 쥬스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 상기 과육은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 상기 다양한 첨가제의 비율은 중요하진 않지만, 본 발명의 물푸레나무 추출물 100 중량부 당 0.1 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

<실험 방법>

1. 시료 준비 및 투여

50mg/kg의 에스쿨린(Sigma-Aldrihich, St. Louis, MO, USA; 0.5 % CMC 용액에 용해) 및 15mg/kg의 양으로 증류수에 용해시킨 독세핀(doxepin)를 투여량에 맞게 분주하여 스트레스를 가하기 1시간 전에 약물을 경구투여하였다. 정상군(normal)과 스트레스 대조군(control)은 0.5% CMC 용액을 경구투여하였고, 본 발명의 에스쿨린 투여군은 50mg/kg의 에스쿨린을, 양성대조군인 독세핀(doxepin) 투여군은 15mg/kg의 독세핀을, 각각 0.1㎖씩 투여하였다.

2. 스트레스에 의한 우울증 유발 모델

수컷 7주령의 C57BL/6(20~22g)는 대한바이오링크(eumseong-gun, chungcheongbugdo, Korea)에서 공급받았고, 동물은 실험 당일까지 고형사료 (항생제 무첨가, 삼양사료 Co.)와 물을 충분히 공급하고, 온도 22±2℃, 습도 55±15%, 12 시간 명암주기를 유지하며 1주 동안 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 실험은 도 1과 같이 진행되었고, 총 14일 동안 매일 AM 09:00부터 PM 01:00 사이에 발바닥 전기충격과 구속 스트레스를 가하였다. 우울증을 유발하기 위해 마우스의 발바닥에 셔틀박스(JEUNG DO BIO & PLANT CO, LTD, Seoul, Korea)를 사용하여 2분 (10초당 1초씩) 동안 0.5 mA의 세기로 전기충격을 준 후 아크릴로 제작된 반원통형의 속박장치(acrylic hemi-cylindric restraint cage, JEUNG DO BIO & PLANT CO, LTD, Seoul, Korea)에 마우스를 2시간 동안 구속하였다.

3. 체중 및 간 무게 측정

스트레스 및 시료투여에 의한 체중 및 간 무게 변화를 확인하기 위하여 스트레스 시작 전 (0일, basal), 스트레스 시작 후 7, 14일째에 마우스의 체중을 측정하였고 부검 시 간 무게를 측정하여 평가하였다.

4. 열린 공간 시험법 (Open Field Test)

열린 공간 시험법은 낯선 공간에 처음 들어간 마우스의 자발적인 움직임을 측정하여, 우울 증상인 불안의 정도를 확인하는 것이다. 마우스를 30×30×30cm 크기의 흰색 아크릴박스 중앙에 놓고 Video tracking software(Ethovision XT, Noldus, Nederland)을 이용하여 10분 동안 임의로 지정한 아크릴박스의 중앙(10×10cm)으로 들어가는 빈도수(Number of entry into center)를 측정하여 분석하였다.

5. 강제 수영 시험법 (Forced Swim Test, FST)

강제 수영 시험법은 발과 꼬리가 닿지 않는 깊이의 실린더에서 마우스의 부동성을 측정하여, 우울 증상인 절망의 정도를 확인하는 것이다. 실험은 첫날 15분간 물에 노출시키는 예비실험(pretest)과 24시간 후에 시행하는 본 실험(test)으로 구분하여 시행하였다. 예비실험은 25℃ 내외의 물을 아크릴로 된 투명한 원통(45㎝ 깊이×18cm 직경)의 바닥으로부터 30㎝까지 채우고 마우스를 물에 노출시켜 15분간 강제로 예비수영을 시켰다. 그리고 24시간 후에 6분 동안 마우스를 물에 노출시켜 본 실험을 진행하게 되는데 Video tracking software (Smart3.0, Panlab, S.L.U, spain)를 이용하여 최종 4분 동안 부동시간(immobile time)을 측정하여 분석하였다.

6. 혈청 내 코르티솔 측정

상기 발바닥 전기충격과 구속 스트레스 실험 종료 후, 각 실험동물로부터 분리한 혈청에서 코르티솔(cortisol) 양을 측정하였다. Cortisol ELISA Kit(Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA)의 매뉴얼에 따라 goat anti-mouse IgG coated microplate의 non-specific binding well에 100㎕의 EIA 버퍼를 가하고, B₀ well에는 100㎕의 EIA 버퍼를 넣었다. standard와 sample well에 각각의 준비한 시료를 50㎕를 가하고, Blank well, Total activity well을 제외한 모든 well에 희석한 코르티솔 AChE Tracer를 50㎕를 주입하였다. Blank well, Total activity well, non-specific binding well를 제외한 웰에 희석한 50㎕의 코르티솔 EIA 모노클로날 항체를 첨가하였다. 4℃에서 밤새 반응한 후 5번의 세척과정을 거친 뒤, 희석한 200㎕ Ellman's Reagent를 각 웰에 반응시키고, Total activity well에는 Ellman's Reagent를 5㎕를 더해서 총량을 맞춰주었다. 90~120분 동안 orbital shaker를 이용하여 교반, 반응시킨 뒤 405nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

7. 혈청 내 세로토닌 측정

실험 종료 후 각 실험동물로부터 분리한 혈청에서 세로토닌을 측정하였다. 세로토닌 ELISA kit (Abcam Inc, Cambridge, UK)의 매뉴얼에 따라 goat anti-rabbit IgG microplate의 non-specific binding well에 150㎕, B₀ well에 100㎕의 어세이 완충용액을 넣고, standard와 sample well에는 각각 100㎕를 넣은 후, Total activity well과 blank well를 제외하고, Serotonin Alkaline Phosphase Conjugate를 50㎕씩 주입하였다. Blank well, Total activity well, non-specific binding well을 제외하고 B₀와 standard, 실험군에는 세로토닌 항체를 넣어주었다. 상온에서 500rpm으로 2시간 교반하고 3번의 세척 후, Total activity well에만 Serotonin Alkaline Phosphase Conjugate을 20배 희석하여, 5㎕를 첨가하였다. 최종적으로 200㎕씩 pNpp substrate solution을 넣고, 교반하지 않고, 1시간 동안 상온에 반응시켰다. 50㎕의 stop solution으로 발색반응을 중지시킨 후 반응을 종료하여 microplate reader로 405nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.

8. 통계처리

결과는 평균±표준편차(standard deviation)로 표기하였으며, 실험군 사이의 통계학적 비교는 사후검증 (Tukey)을 통해 one-way measures analysis of variance (ANONA)를 시행하였으며, p<0.05 이하를 통계적으로 유의하다고 판단하였다.

실시예 1. 우울증이 유발된 C57BL /6 마우스에서 에스쿨린(Esculin)이 체중에 미치는 효과

우울증이 유발된 C57BL/6 마우스에서 에스쿨린이 체중에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실험방법에 따라, 우울증을 유발한 C57BL/6에 경구투여 방법으로 정상군과 스트레스 대조군에 0.5% CMC 용액을 투여하였고, 양성대조군에는 15mg/kg의 독세핀(doxepin, Sigma-Aldrich)을, 에스쿨린 투여군에는 50mg/kg의 에스쿨린을 투여하였다. 1시간 후에 발바닥 전기충격과 구속을 가하여 14일 동안 우울증을 유발하였고, 마우스의 체중은 스트레스 시작 전 (0일, basal), 스트레스 시작 후 7, 14일째에 측정하여 증가율을 나타내었다.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 정상군은 시간이 지남에 따라 체중이 증가하는 경향을 보였으나 스트레스 대조군은 스트레스 7일째와 14일째 정상군에 비하여 체중이 유의적으로 감소하는 것을 확인하였고, 14일째 대조군에 비하여 에스쿨린과 독세핀을 투여한 군은 유의미하게 체중이 회복되는 것을 확인하였다.

실시예 2. 우울증이 유발된 C57BL /6 마우스에서 에스쿨린이 간 무게에 미치는 효과

우울증이 유발된 C57BL/6 마우스에서 에스쿨린이 간 무게에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실험방법에 따라, 14일 동안의 시료투여 및 스트레스 후 부검 시 간 무게를 측정하였다.

그 결과 도 3에 나타난 바와 같이, 스트레스 대조군은 간 무게가 유의적으로 증가하는 것으로 나타났고, 대조군에 비하여 에스쿨린과 독세핀을 투여한 군에서는 유의미하게 간 무게가 감소되는 것을 확인하였다.

실시예 3. 우울증이 유발된 C57BL /6 마우스에서 에스쿨린이 열린 공간 시험법(Open Filed Test)에 미치는 효과

우울증이 유발된 C57BL/6 마우스에서 에스쿨린이 우울증과 같은 행동(불안)에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실험방법에 따라, 14일 동안의 시료 투여와 스트레스 후 15일째에 열린 공간 시험법을 실시하였다.

그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, 스트레스 대조군은 중앙으로 들어가는 횟수(number of entry into center)가 유의미하게 감소하는 것을 확인하였으며, 대조군에 비하여 에스쿨린을 투여한 군은 중앙으로 들어가는 횟수가 유의미하게 증가하는 것을 확인하였다.

실시예 4. 우울증이 유발된 C57BL /6 마우스에서 에스쿨린이 강제 수영 검사 (forced swim test)에 미치는 효과

우울증이 유발된 C57BL/6 마우스에서 에스쿨린이 우울증과 같은 행동(절망)에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실험방법에 따라, 14일 동안의 시료 투여와 스트레스 후 15일째에 예비실험 및 16일째에 강제 수영 시험법을 실시하였다.

그 결과 도 5에 나타난 바와 같이, 스트레스 대조군은 부동시간(immobile time)이 유의미하게 증가하는 것을 확인하였으며, 대조군에 비하여 에스쿨린과 독세핀을 투여한 군은 부동시간이 유의미하게 감소하는 것을 확인하였다.

실시예 5. 우울증이 유발된 C57BL /6 마우스에서 에스쿨린이 혈중 세로토닌( serotonin)에 미치는 효과

우울증이 유발된 C57BL/6 마우스의 혈액 내에서 에스쿨린이 세로토닌의 농도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실험방법에 따라, 14일 동안의 시료투여 및 스트레스 후 부검 시 우울증을 유발한 마우스의 혈액을 회수하여 원심분리한 후, 혈청 부분을 효소면역측정법으로 세로토닌의 농도를 측정하였다.

그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 스트레스 대조군은 혈중 세로토닌의 농도가 유의적으로 감소하는 것으로 나타났고, 에스쿨린 및 독세핀을 투여한 군은 대조군에 비하여 세로토닌의 농도가 증가하는 경향을 보였다.

실시예 6. 우울증이 유발된 C57BL /6 마우스에서 에스쿨린이 혈중 코르티솔( cortisol )에 미치는 효과

우울증이 유발된 C57BL/6 마우스의 혈액 내에서 에스쿨린이 코르티솔의 농도에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실험방법에 따라, 14일 동안의 시료투여 및 스트레스 후 부검 시 우울증을 유발한 마우스의 혈액을 회수하여 원심분리 한 후, 혈청 부분을 효소면역측정법으로 코르티솔의 농도를 측정하였다.

그 결과 도 7에 나타난 바와 같이, 스트레스 대조군은 혈중 코르티솔의 농도가 유의적으로 증가하는 것으로 나타났고, 에스쿨린과 독세핀을 투여한 군은 코르티솔의 농도가 유의적으로 감소하는 것으로 나타났다.

Claims

하기 화학식 1의 에스쿨린, 이의 약학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 수화물을 유효성분으로 포함하는 우울증 및 불안장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서, 상기 에스쿨린은 물푸레나무 추출물로부터 분리한 것을 특징으로 하는 우울증 및 불안장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제2항에 있어서, 상기 물푸레나무 추출물은 물푸레나무 줄기 껍질 또는 가지 껍질의 진피 추출물인 것을 특징으로 하는 우울증 및 불안장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 불안장애는 분리 또는 격리 불안증, 편집증, 범공포증, 범강박증, 신경불안증 및 공황장애 중에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 우울증 및 불안장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 우울증 및 불안장애는 스트레스에 의한 것임을 특징으로 하는 우울증 및 불안장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 추가로 담체, 부형제 또는 희석제를 포함하는 것을 특징으로 하는 우울증 및 불안장애의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
하기 화학식 1의 에스쿨린, 이의 식품학적으로 허용 가능한 염 또는 이의 수화물을 유효성분으로 포함하는 우울증 및 불안장애의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
[화학식 1]
제7항에 있어서, 상기 우울증 및 불안장애는 스트레스에 의한 것임을 특징으로 하는 우울증 및 불안장애의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
제7항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 추가로, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 증진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 및 탄산음료에 사용되는 탄산화제 중에서 선택된 하나 이상을 더 함유하는 것을 특징으로 하는 우울증 및 불안장애의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.