KR20090072858A

KR20090072858A - 진피로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는뇌질환의 예방 및 치료용 조성물

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Publication number: KR20090072858A
Application number: KR1020070141095A
Authority: KR
Inventors: 송경식; 양은주; 김예실; 이종원; 임선하
Original assignee: 주식회사 하이폭시; 학교법인 선목학원; 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2007-12-29
Filing date: 2007-12-29
Publication date: 2009-07-02

Abstract

본 발명은 진피(Fraxinus rhynchophylla Hance)로부터 분리된 화합물인 클레오미스코신 B 또는 이소프락시딘을 유효성분으로 함유하는 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 화합물들은 Aβ_25-35 유도 독성에 대한 뇌신경 세포 보호 효과, Aβ_25-35 유도 산화적 스트레스 억제 효과를 나타냄을 확인함으로써, 뇌질환의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품에 이용될 수 있다.

이소프락시딘, 클레오미스코신 B, 뇌질환

Description

진피로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 함유하는 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물{Composition comprising the compound isolated from Fraxinus rhynchophylla Hance for preventing and treating brain disease}

본 발명은 진피(Fraxinus rhynchophylla Hance)로부터 분리된 클레오미스코신 B 또는 이소프락시딘을 유효성분으로 함유하는 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] Rachael L. Neve and Nikolaos K. Robakis, Alzheimer’s disease; a re-examination of the amyloid hypothesis. TINS., 21(1), pp15-18, 1998

[문헌 2] 보건복지부, 「2004 보건복지백서」

[문헌 3] Martin Citron, Nature Neuroscience . 5, pp 1055-1057, 2002

[문헌 4] Maria E., Bamberger and Gary E. landreth, Inflammation, apoptosis and Alzheimer’s disease. Neuroscientist .8(3). pp276-283, 2002

[문헌 5] 중약대사전, 소학관편, 상해과학기술출판사, pp1330-1322, 1985

[문헌 6] Anna Arnoldi et al., Synthesis of the natural coumarinolignoids propacin and cleomiscosin A and B., An inpirical spectroscopic method to distinguish regioisomers of natural benzodioxane lignoids ., Heterocycles, 22(7), pp 1537-1544, 1984

[문헌 7] 최지현, 가죽나무로부터 피부 멜라닌 억제성분의 분리, 경상대학교 일반대학원, 2005

[문헌 8] Ban Ju-Yeon et al., Protective effect of Sanguisoba officinalis L. root against amyloid β, protein (25-35)-induced neuronal cell damage in cultured rat cortical neuron. Korean J. Med. Crop Sci., 13, pp219-226, 2005

[문헌 9] Ban Ju-Yeon and Seong Yeon-Hee, Protection of amyloid protein (25-35)-induced neurotoxicity by methanol extract of Smilacis chinaerhizome in cultured rat cortical neurons. Journal of Ethnopharmacology . 106, pp 230-237, 2006

[문헌 10] Park Min-Su et al., Metanol extract of Paeonia japonica root protects cultured rat cortical neurons against oxidative damage induced by hydrogen peroxide. Korean J. Medicinal Crop Sci ., 14(2), pp 70-76, 2006

치매 (dementia)란 중추신경계 내에서의 점진적인 퇴행성 질환을 말하며, 기억력 및 식별력 상실, 이상행동, 환각, 망상 등의 증세가 나타난다고 알려져 있다 (Rachael L. Neve and Nikolaos K. Robakis, Alzheimer’s disease; a re-examination of the amyloid hypothesis. TINS., 21(1), pp15-18, 1998).

현재 우리나라는 65세 이상 노인 인구가 급격히 증가하고 있는 추세이며, 이에 비례하여 치매 발병률도 증가하고 있다. 2004년 보건복지부의 조사에 따르면 2015년에는 65세 이상 노인 수가 약 800만 명에 이를 것으로 추정하였으며 치매 유병률도 약 9%까지 증가할 것으로 예상됨에 따라 환자 본인을 포함한 가족들까지 겪게 되는 정신적·육체적 고통 및 상당한 부양 비용 부담이 사회경제적으로 큰 문제로 대두되고 있어 치매의 예방 및 치료에 관한 연구가 시급한 실정이다 (보건복지부, 「2004 보건복지백서」).

이러한 치매의 대부분을 차지하고 있는 것이 알츠하이머병 (Alzheimer’s disease; AD)이며 AD의 주요 발병 기전으로는 amyloidogenesis로 알려져 있다. 이 과정에는 APP라고 하는 amyloid precursor protein이 β-secretase에 의해 절단되어 생성되는 Aβ 및 Aβ의 응집으로 인해 유도되는 신경 세포 독성 유발 등을 포함한다 (Martin Citron, Nature Neuroscience . 5, pp 1055-1057, 2002).

이러한 발병 기전들은 항치매 선도물질 개발 연구의 주요 target이 되고 있으나 그 중에서도 최근 활발히 연구되고 있는 부분은 이미 생성된 amyloid plaque에 의해 유도된 세포 독성을 감소시켜 세포 자살 (apoptosis)을 감소시키는 방법이다. 이 방법은 amyloid plaque가 뇌신경 세포에 침착되면 활성 산소종 (reactive oxygen species; ROS)이 상당량 발생하게 되며 이로 인한 산화적 스트레스는 정상적인 메커니즘을 교란시켜 결국 apoptosis가 유발됨에 따라 치매가 발병하게 된다는 이론을 근거로 하여 이러한 메커니즘을 저해할 수 있는 물질을 탐색하는 것이다 (Maria E., Bamberger and Gary E. landreth, Inflammation, apoptosis and Alzheimer’s disease. Neuroscientist .8(3). pp276-283, 2002).

Aβ로 유도된 뇌신경 세포 독성을 저해할 수 있는 물질에는 합성제제 등 여러 가지가 있을 수 있으나 그 중에서도 다양한 항산화 물질을 함유하는 천연물의 경우 저해제 개발에 매우 유용하다고 할 수 있다. 특히 식물의 2차 대사산물은 화합물의 다양함, 적은 분자량, 강한 지용성 등의 특징을 가진다는 점을 감안할 때 천연물에서 Aβ로 유도한 세포 독성 억제 물질을 탐색하는 것이 치매의 예방 또는 치료를 위한 선도 물질 개발의 측면에서 유리할 것으로 판단된다.

이러한 배경에 따라 천연물로부터 항치매 효과를 갖는 선도물질을 개발하기 위하여 Aβ_25-35 유도 세포 독성에 대한 억제 효과를 갖는 생약 추출물을 탐색한 결과, 예로부터 소염, 수렴, 해열 등에 효과가 있다고 알려져 있는 (중약대사전, 소학관편, 상해과학기술출판사, pp1330-1322, 1985) 진피 (秦皮, F. rhynchophylla Hance), 또는 목진피 (木秦皮)로 불리는 생약의 에탄올 (ethanol; EtOH) 추출물에 높은 활성이 관측되어 amyloidogenesis에 영향을 미칠 수 있는 활성물질을 분리· 동정하고 이들의 뇌신경 세포 보호 효과 메커니즘을 규명하고자 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 목적을 수행하기 위하여, 본 발명은 하기 구조식 (A) 또는 (B)로 표기되는 클레오미스코신 B 또는 이소프락시딘을 유효성분으로 함유하는 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 하기 구조식 (A) 또는 (B)로 표기되는 클레오미스코신 B 또는 이소프락시딘을 유효성분으로 함유하는 뇌질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

(A)

(B)

상기 화합물은 진피로부터 분리하거나 시중구입 가능하다.

본원에서 정의되는 진피는 진피의 수피, 뿌리, 잎, 줄기, 바람직하게는 수피임을 특징으로 한다.

상기 뇌질환은 알츠하이머, 뇌혈관성 치매증, 두부손상에 의한 치매, 파킨슨(Paekinson)병, 픽(Pick)병, 크루츠펠트-야곱(Creutzfeldt-jakob)병, 뇌경색, 중풍 또는 뇌출혈로부터 선택된 질환, 바람직하게는 알츠하이머병인 약학조성물임을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 화합물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 화합물은, 건조된 진피를 세절하여 건조 중량의 약 1 내지 50 배, 바람직하게는 10배의 물, C₁ 내지 C₄의 저급 알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물 및 에탄올의 혼합용매, 보다 바람직하게는 95% 에탄올로 상온에서 약 30분 내지 5일, 바람직하게는 약 1일 내지 4일 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 냉침 추출방법을 이용하고 감압 농축하여 조추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 조추출물을 물에 현탁한 후, 디클로로 메탄, 에틸아세테이트, N-부탄올, 물로 각각 추출하는 제 2단계; 제 2단계에서 수득한 디클로로메탄 용매 추출물을 n-헥산 : 에틸아세테이트 (200:1→1:1(v/v))와 디클로로메탄 : 메탄올(200:1→1:1(v/v)) 용출용매로 실리카 겔 컬럼크로마토그래피를 수행하여 본 발명의 클레오미스코신 B와 11개의 분획으로 나누는 제 3단계; 상기 제 3단계의 분획 중 12 내지 14번째 분획을 n-헥산 : 아세톤(8:1→1:1(v/v))을 용출용매로 실리카 겔 컬럼크로마토그래피를 실시하여 11개의 분획으로 나누는 제 4단계; 상기 제 4단계의 분획 중 8번째 분획을 100% 메탄올을 용매로 하여 세파덱스 LH-20 컬럼을 수행하여 분획을 얻는 제 5단계; 상기 제 5단계의 분획을 메탄올 : 물(1:6→1:2(v/v))를 용출용매로 하여 본 발명의 이소프락시딘을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기 제조방법으로 얻어지는 상기 구조식 (A) 또는 (B)로 표기되는 클레오미스코신 B 또는 이소프락시딘을 유효성분으로 함유하는 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산 제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오 지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 뇌질환의 예방 및 개선 효과를 나타내는 클레오미스코신 B 또는 이소프락시딘 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 뇌질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 조성물은 뇌질환의 예방 및 개선을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 화합물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 화합물은 뇌질환의 예방 및 개선을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등의 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 클레오미스코신 B 또는 이소프락시딘은 Aβ_25-35 유도 독성에 대한 뇌신경 세포 보호 효과, Aβ_25-35 유도 산화적 스트레스 억제 효과를 나타냄을 확인함으로써, 뇌질환의 예방 및 치료에 유용한 약학조성물 및 건강기능식품에 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 참고예, 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 참고예, 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 참고예, 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

참고예 1. 재료 및 시약

진피 (Fraxinus rhynchophylla Hance)는 대구 약령시 대유약업사에서 건조된 상태로 구입하였다. TLC 플레이트는 precoated Kiselgel 60 F₂₅₄(Merck, Art. 5715, 미국)와 RP-18 (Merck, Art. 1.15686, 미국)을, 컬럼 크로마토그래피 레진(column chromatography resin)은 Kiselgel 60 (Merck, Art. 7734, Art. 9385, 미국), RP-18 (Merck, Art. 10625, 미국) 및 Pharmacia Biotech Sephadex LH-20 (Uppsala, 스웨덴) 등을 사용하였다. 분석용 HPLC 컬럼은 ZORBAX Eclipse XDB C18 (Agilent, 4.6×150 mm)를 사용하였다. 세포 배양에 사용한 DMEM(Dulbecco’s modified eagle’s medium), N2 배지 및 H₂DCF-DA(2’,7’-dichlorofluorescin-diacetate)는 인비트로젠 사, FBS(fetal bovin serum), Aβ_25-35, MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium) 시약은 시그마사로부터 구입하였다. 기타 시약은 1급 또는 특급을 사용하였다.

참고예 2. 실험기기

¹H- 및 ¹³C-NMR은 Brucker Avance Digital 400 MHz NMR 분광계 (Bruker Co., 독일)로 측정하였으며 마이크로플레이트 형광 분석기(microplate fluorescence reader)는 Flx 800 (Bio-Tek, 미국)를 사용하였다. HPLC는 Jasco PU2080 pump, MD2010 디텍터(detector) (Jasco Co., 일본)를, LC-MS는 API 2000 (AB system, 미국)를 사용하였으며, 증발 산란광 검출기(evaporative light scattering detector)는 Alltech ELSD 2000 디텍터(detector) (Alltech, 미국)를 사용하였다.

실시예 1. 화합물의 분리

1-1. 진피 추출물의 제조

건조된 진피 4.0 kg을 95% 에탄올 40 L 로 3일 동안 5회 반복 냉침추출한 뒤, 추출액을 여과 후 감압 농축하여 에탄올 추출물 275 g을 얻었다. 이를 물에 분산시켜 디클로로메탄, 에틸아세테이트, n-부탄올 등의 유기 용매를 사용하여 각각 분획을 나누고 여과하여 농축하였고, 하기 실시예 1-2 및 1-3에서 사용하였다.

1-2. 클레오미스코신 B의 분리

상기 실시예 1-1에서 수득한 디클로로메탄 가용성 분획물은 n-헥산과 에틸아세테이트의 혼합용매 (200:1 → 1:1(v/v))와 디클로로메탄과 메탄올의 혼합용매 (200:1 → 1:1(v/v))를 순차적으로 사용하여 실리카 겔 컬럼크로마토그래피를 실시하였고, 이를 통해 본 발명의 화합물인 클레오미스코신 B 69.1 mg과 18개의 분획물을 수득하였다.

분리된 클레오미스코신 B는 백색의 무정형 분말 상태로 분리되었으며 각종 기기 분석과 문헌에 기재된 물성치와 비교하여 그 구조를 동정하였다(Anna Arnoldi et al., Synthesis of the natural coumarinolignoids propacin and cleomiscosin A and B., An inpirical spectroscopic method to distinguish regioisomers of natural benzodioxane lignoids ., Heterocycles, 22(7), pp 1537-1544, 1984)

¹H-NMR 스펙트럼에서 δ 6.47과 δ 7.77의 doublet 및 δ 6.76의 singlet peak로 미루어 쿠마린(coumarin) 계통의 화합물로 예상할 수 있었다. δ 3.80과 δ 3.71에서 관측된 단일 피크(singlet peak)는 각각 벤젠 고리(benzene ring)에 결합된 메톡실기(methoxyl group)로 확인되었고 δ 7.30∼δ7.45 사이의 피크(peak)로 보아 전형적인 1,3,4-trisubstituted benzene ring의 프로톤(proton)에 의한 결합(coupling) 현상임을 알 수 있었다. 또한 δ 5.61, δ 4.50, δ 4.33, δ 3.96의 signal로 미루어 CH₂-CH-CH-의 연결성(connectivity)을 추측할 수 있었다. 한편 ¹³C-NMR 스펙트럼에서는 δ 161.7, δ 113.0, δ 145.4에서 나타난 α,β-불포화 카보닐(α,β-unsaturated carbonyl) 탄소를 포함한 총 20개의 탄소가 관측되었다.

1-3. 이소프락시딘의 분리

상기 실시예 1-2에서 수득한 18개의 분획물 중에서 12 내지 14번째 분획물 5 g을 다시 n-헥산과 아세톤 혼합용매(8:1 → 1:1(v/v))를 용출용매로 하여 실리카 겔 컬럼크로마토그래피를 실시하여 11개의 분획물을 수득하였다. 그 중 8번째 분획물을 100% 메탄올을 용매로 하여 세파덱스 LH-20 컬럼을 수행하였고, 여기에서 얻은 분획물 1g을 메탄올과 물의 혼합용매 (1:6 → 1:2(v/v))를 사용하여 RP-18 컬럼으로 본 발명의 이소프락시딘 50mg을 수득하였다.

분리된 이소프락시딘은 황색의 무정형 분말 상태로 분리되었으며 각종 기기 분석과 문헌에 기재된 물성치와 비교하여 그 구조를 동정하였다 (최지현, 가죽나무로부터 피부 멜라닌 억제성분의 분리, 경상대학교 일반대학원, 2005).

¹H-NMR 스펙트럼에서 δ 6.33과 δ 7.97에 나타난 결합 상수(coupling constant)J=9.4 Hz의 더블 피크(doublet peak)는 쿠마린(coumarin) 계통의 화합물에서 발견되는 전형적인 피크(peak)로서 H-3과 H-4에 의한 것임을 알 수 있었다. 그리고 δ 7.03에서 목격된 singlet은 방향족(aromatic) 화합물에 결합된 프로톤(proton)으로 예상되었으며 δ 4.01과 δ 4.06에 나타난 두 개의 단일피크(singlet)는 두 개의 메톡실기(methoxyl group)에 의한 것으로 추정되었다. MS 스펙트럼에서는 Q1 positive mode로 분석하였을 때, [M+1]⁺ 피크(peak)가 m/z 223에 나오는 것을 확인할 수 있었다.

실험예 1. Aβ _25-35 로 유도한 뇌신경 세포 독성 저해 효과 측정

1-1. 세포배양

쥐 신경 세포종 (rat neuroblastoma)인 B103 세포는 DMEM에 10% FBS (v/v), 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin) (v/v)을 첨가하여 37 ℃, 5% CO₂의 조건에서 배양하였고, 24시간 마다 배지를 교체해 주었다. B103 세포는 서울대학교 묵인희 교수님과 강원대학교 이동석 교수님으로부터 분양 받아 실험하였다.

1-2. Aβ _25-35 유도 독성에 대한 뇌신경 세포 보호 효과 측정 (MTT assay)

상기 실시예 1-2 내지 1-3에서 수득한 화합물의 Aβ_25-35 유도 독성으로부터 세포를 보호할 수 있는 효과를 측정하기 위해, 문헌에 기재된 방법을 이용하여 MTT라 는 시약이 수용액 상태에서는 노란색이지만 살아있는 세포의 미토콘드리아 내 산화환원효소(oxidoreductase)에 의해 포르마잔(formazan)이라는 보라색 물질로 변하는 원리를 이용한 실험으로, 세포 생존율의 증감을 측정하였다 (Ban Ju-Yeon et al., Protective effect of Sanguisoba officinalis L. root against amyloid β, protein (25-35)-induced neuronal cell damage in cultured rat cortical neuron. Korean J. Med. Crop Sci., 13, pp219-226, 2005).

B103 세포를 5×10³/웰의 밀도로 96-웰 플레이트에 seeding하고 1시간 동안 배양한 후, 배지에 포함된 FBS는 Aβ_25-35의 독성을 감소시키는 효과가 있으므로 세럼을 포함하지 않는 N2 배지로 교체하였다. 30분 후에 세포가 부착된 것을 확인하고 화합물을 농도별로 처리하였다. 1시간 후에 Aβ_25-35를 첨가하여 24시간 배양하였고, 0.5 mg/ml의 MTT 용액을 처리하여 3시간 동안 반응시켰다. 반응 후에는 플레이트 내의 용액을 모두 제거하고 DMSO를 사용하여 물에 녹지 않는 포르마잔을 용해시켰다. 이를 1시간 이상 흔들어준 후 570 nm에서 OD 값 (A)를 측정하였으며, 하기 수학식 1을 이용하여 세포 생존율을 계산하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다 (도 1 참조).

측정 결과, 대조군의 세포 생존율을 100%로 했을 때 Aβ_25-35만을 처리한 구간 은 62.87± 2.91%로 감소하였다. 반면 클레오미스코신 B(cleomiscosin B)와 이소프락시딘(isofraxidin)을 처리한 구간에서는 각각 80.06± 1.30%, 75.05± 0.20%로 나타나 B103 세포 생존률의 현저한 증가를 보였다 (도 1 참조). 따라서 본 발명의 화합물들은 Aβ_25-35에 의해 유도된 세포 독성으로부터 뇌신경 세포를 보호할 수 있는 효과를 나타냄을 확인할 수 있었고, 아울러 이와 관련된 메커니즘에 관여하는 것으로 예상할 수 있었다.

실험예 2. Aβ _25-35 로 유도된 산화적 스트레스 억제 효과 측정

상기 실시예 1-2 내지 1-3에서 수득한 화합물의 Aβ_25-35로 유도된 활성 산소종 발생 억제 효과를 측정하기 위해 문헌에 기재된 반 & 성의 방법을 변형하여 하기와 같이 실험을 수행하였다 (Ban Ju-Yeon and Seong Yeon-Hee, Protection of amyloid protein (25-35)-induced neurotoxicity by methanol extract of Smilacis chinaerhizome in cultured rat cortical neurons. Journal of Ethnopharmacology. 106, pp 230-237, 2006).

H₂DCF-DA는 비형광물질로서, 세포 내부에 활성 산소종이 존재하면 산화되어 형광 물질인 DCF(dichlorofluorescein)로 변하는 원리를 이용하여 활성 산소종의 발생량을 구하는 방법이다 (Park Min-Su et al., Metanol extract of Paeonia japonica root protects cultured rat cortical neurons against oxidative damage induced by hydrogen peroxide. Korean J. Medicinal Crop Sci., 14(2), pp 70-76, 2006).

B103 세포에 화합물과 Aβ_25-35를 처리한 후, 0.05 mg/ml의 H₂DCF-DA 용액을 첨가하고 37 ℃에서 10분간 반응시킨 다음 마이크로플레이트 형광 측정법(microplate fluorescence reader)으로 하기 수학식 2를 이용하여 DCF의 생성률을 측정하였고 (여기(excitation); 485 nm, 방출(emission); 510 nm), 그 결과를 도 2에 나타내었다 (도 2 참조).

측정결과, Aβ_25-35만을 처리한 구간에서의 ROS 발생률을 100%로 했을 때 대조군은 86.88± 3.30%로 나타났으며, 클레오미스코신 B(cleomiscosin B)와 이소프락시딘(isofraxidin)을 각각 50 μM 씩 처리한 구간에서는 87.73± 5.00%, 92.61± 4.47%로 Aβ_25-35를 단독으로 처리한 구간에 비해 ROS 생성률이 현저히 낮아지는 것을 확인할 수 있었다 (도 2 참조). 이와 같은 결과를 종합해 볼 때, 본 발명의 화합물은 아폽토시스(apoptosis)에 주요 원인으로 작용하는 활성 산소종의 발생을 현저히 저하시킬 수 있으며, 이는 곧 산화적 스트레스를 억제시키는 강력한 항산화제로 작용하여 뇌신경 세포를 보호하고 세포 생존율을 높이는 것으로 판단되어짐을 알 수 있었다.

하기에 본 발명의 화합물을 포함하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

클레오미스코신 B 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

이소프락시딘 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

클레오미스코신 B 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

이소프락시딘 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO_4,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

클레오미스코신 B 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

이소프락시딘 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B1 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

클레오미스코신 B 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요계층, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

도 1은 B103 세포에서 클레오미스코신 B와 이소프락시딘의 Aβ_25-35 유도 독성에 대한 뇌신경 세포 보호 효과를 나타낸 도이고,

도 2는 B103 세포에서 클레오미스코신 B와 이소프락시딘의 Aβ_25- ₃₅ 로 유도된 산화적 스트레스 억제 효과를 나타낸 도이다.

Claims

하기 구조식 (A) 또는 (B)로 표기되는 클레오미스코신 B 또는 이소프락시딘을 유효성분으로 함유하는 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물:

(A)

(B)
제 1항에 있어서, 상기 화합물은 진피(Fraxinus rhynchophylla Hance)로부터 분리됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 상기 뇌질환은 알츠하이머, 뇌혈관성 치매증, 두부손상에 의한 치매, 파킨슨(Paekinson)병, 픽(Pick)병, 크루츠펠트-야곱(Creutzfeldt-jakob)병, 뇌경색, 중풍 또는 뇌출혈인 약학 조성물.
제 1항에 있어서, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
제 1항의 구조식 (A) 또는 (B)로 표기되는 클레오미스코신 B 또는 이소프락시딘을 유효성분으로 함유하는 뇌질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
제 5항에 있어서, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료인 건강기능식품.