KR101868084B1 - 대환식 화합물 및 그의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 예를 들면, 간염 C 바이러스(Hepatitis C virus, HCV), 간염 B 바이러스(HBV) 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)와 같은 바이러스에 의한 바이러스 감염의 치료시에 헤파티티스 사이클로필린 저해제(cyclophilin inhibitor)로서, 및/또는 예를 들면, 이식거부의 예방을 위한 면역억제제 및 염증질환을 위한 항염증제로서 모두 유용한 상글리페린 유사체에 관한 것이다. 또한 본 발명은 특히 근육병과 같은 미토콘드리아 침투성 전이 포아(Mitochondrial Permeability Transition Pore, mPTP)의 억제가 유용한 질병에서 HCV 또는 HIV 감염의 치료 및 면역억제제 또는 항염증제로서의 용도 또는 추가 약으로 유용한 화합물의 생성을 위한 중간체로서의 약물에서의 사용방법을 제공한다.
C형 간염(
Hepatitis
C)
C형 간염(Hepatitis C, HCV)은 양성 스트랜드 RNA 바이러스이며, 수혈후(post-transfusional) 감염이 주요한 감염의 원인이다. HCV는 가장 일반적인 만성 매개성 감염이며, 미국에서 간 질환 중에서 주요 사망 원인으로 꼽히고 있다. 세계보건기구는 세계 인구의 약 3%에 해당하는 1억7천만명 초과의 인구가 HCV 감염의 만성 보균자일 것이라고 추산하고 있다. 치료받지 않은 HCV-감염 환자 중에서 약 70%-85% 정도가 만성 HCV 감염이 발병하여 간경변증 및 간암으로 발병할 위험률이 크다. 선진국에서는 모든 경우의 간암 중에서 50-76% 그리고 모든 간 이식 중에서 2/3가 만성 HCV 감염으로 인한 것이다(Manns et al, 2007).
또한, 간질환에서 만성적으로 감염된 환자 또한 다른 만성 HCV 관련 질병이 발병될 수 있으며, 타인에게 감염원으로 작용할 수 있다. HCV 감염은 관절통(관절통증), 피부 발진 및 대부분 신장인 장기손상과 같은 간이 아닌 곳의 합병증을 일으킨다. HCV 감염은 중요하고 전 세계적인 건강-관리의 부담이며, 현재 C형 간염에 유효한 백신이 없는 상태이다(Strader et al., 2004; Jacobson et al. 2007; Manns et al., 2007; Pawlotsky, 2005; Zeuzem & Hermann, 2002).
HCV
의 치료
관리의 현재 표준(Current standard of care, SoC)는 페길화된 인터페론-α(interferon-α, plFNα)의 피하주사 그리고 24-48주의 기간동안 항바이러스제 리바비린(ribavirin)을 복용하는 것이다. 치료의 성공 여부는 지속적 바이러스 반응(sustained virologic response, SVR)에 의하여 정의되는데, 이는 치료 종료 6개월 후에도 혈청 내에 HCV RNA가 없는 것으로 정의된다. SoC에 대한 전체 반응율은 주로 유전자형 및 사전처리 HCV RNA 레벨에 따라 달라진다. 유전자형 2 및 3를 가진 환자는 유전자형 1에 감염된 환자보다 SoC에 더 잘 반응하는 것으로 보인다(Melnikova, 2008; Jacobson et al., 2007).
다수의 HCV 환자는 SoC 치료에 충분히 반응하지 않거나 또는 부작용으로 인하여 치료를 견디지 못하여 전 과정을 완료하는 것이 빈번하게 쟁점화되고 있다. SoC의 전체 임상 SVR 비율은 겨우 50%에 머문다(Melnikova, 2008).
내성이 나타나는 것은 치료가 실패하는 근본적인 요인이다(Jacobson et al. 2007). 또한 SoC는 우울증 또는 심장질환과 같은 과거 중요한 사건을 겪은 환자와 같이 치료를 위한 후보자로 인식되지 않은 몇몇 환자에게는 사용을 금한다. 치료가 불연속적으로 자주 일어나게 하는 SoC의 부작용은 감기 같은 질병, 발열, 피로, 혈액학 질병(haematological disease), 빈혈(anaemia), 백혈구 감소증(leucopaenia), 혈소판 감소증(thrombocytopaenia), 탈모증(alopecia) 및 우울증을 포함한다(Manns et al., 2007).
SoC를 사용한 장기간의 치료와 연관된 부작용을 고려해 볼 때, 내성의 발생, 최적미달의 전체 성공률, 보다 효과적이고 안전한 새로운 치료는 HCV 감염의 치료에 긴급하게 요구되고 있다. 새로운 치료의 목표는 향상된 효능, 향상된 유독성 프로필, 향상된 내성 프로필, 향상된 삶의 질 및 그 결과 발생하는 환자 준수사항의 향상을 포함한다. HCV는 짧은 라이프 사이클을 가지고 있으므로, 약제요법시 약제 내성의 발생은 일반적인 것이다.
C형 간염에 대한 신규하고 특이적으로 표적화된 항바이러스 요법(STAT-C) 또한 직접 작용하는 항바이러스(direct acting antiviral, DAA) 약제로 알려져 있는데, 바이러스 RNA 폴리머라제 NS5B 또는 바이러스 프로테아제 NS3와 같은 표적 바이러스 단백질을 개발시킨다(Jacobson et al, 2007; Parfieniuk et al., 2007). 더욱이 신규한 화합물은 바이러스 표적보다 표적 인간 단백질(예를 들면 사이클로필린)을 개발시키는데, 이는 약제요법 동안에 내성의 발생의 감소를 유도할 것으로 기대하고 있다(Manns et al., 2007; Pockros, 2008; Pawlotsky J-M, 2005).
사이클로필린
저해제
사이클로필린(cyclophilins, CyP)는 한 과의 세포내 단백질로서 단백질 구조 변화 및 폴딩을 용이하게 하는 펩티딜-프로필 cis - trans 이성화효소 활성을 가진다. CyPs는 전사조절, 면역반응, 단백질 분비 및 미토콘드리아 기능, 인간 감염 중 그 라이프사이클을 위한 HCV 바이러스 자원 CyPs세포내 공정에 연관되어 있다. CyPPlase 활성을 위한 요건을 포함한 몇몇 대체적인 가설이 제안되었다고 할지라도, 원래 CyPs는 RNA 복제를 자극하는 HCV 비구조적 단백질 NS5B RNA 폴리머라제의 RNA 결합 활성을 자극하는 것으로 생각되었다. A 및 B를 포함한 다양한 CyPs의 다양한 동형단백질은 HCV 라이프사이클 내에 연결된 것으로 알려져 있다(Yang et al., 2008; Appel et al., 2006; Chatterji et al., 2009; Gaither et al., 2010). 넉아웃 마우스(knockouts in mice, Colgan et al., 2000) 및 인간 T 세포(Braaten and Luban, 2001)를 생성시키는 능력은 CyPs가 세포 성장 및 생존을 위하여 선택적이라는 것을 가리킨다. 박테리아(Herrier et al., 1994), Neurospora(Tropschug et al., 1989) 및 Saccharomyces cerevisiae (Dolinski et al., 1997)에서의 CyPA유사체의 분열과 함께 유사한 결과가 관찰되었다. 그러므로CyPs을 억제하는 것은 SVR를 증가하는 목표를 가지고, 내성의 발생을 저해하고 치료 부작용을 감소시키는, HCV 감염을 치료하기 위한 신규하고 흥미 있는 호스트 표적, 및 현재 SoC 또는 STAT-C/DAA 약제에 새로운 잠재적인 추가를 의미한다.
사이클로스포린 A(cyclosporine A, Inoue et al. 2003)(“CsA”) 및 이와 밀접하게 구조적으로 연관된 비-면역억제성 임상 유사체 DEBIO-025 (Paechuyse et al. 2006; Flisiak et al. 2008), NIM811 (Mathy et al. 2008) 및 SCY-635 (Hopkins et al., 2009)는 사이클로필린에 결합되는 것으로 알려져 있으며, 사이클로필린 저해제로서 HCV 감염의 치료에서 생체외 및 임상적인 효능을 나타낸다(Crabbe et al., 2009; Flisiak et al. 2008; Mathy et al. 2008; Inoue et al., 2007; Ishii et al., 2006; Paeshuyse et al., 2006). CsA에 대한 초기 내성 연구는 HCV NS5B RNA 폴리머라제 내에서 돌연변이를 보여주고, 사이클로필린 B 만이 HCV 복제 공정 내에서 연관된다는 것을 시사한다고 할지라도(Robida et al., 2007), 최근 연구는 HCV 복제에서 사이클로필린 A에 대한 필수적인 역할을 시사하고 있다(Chatterji et al., 2009; Yang et al., 2008). NS5A 바이러스 단백질 내의 돌연변이가 CsA 내성과 연관이 되어 있으며, NS5A가 CyPA 및 CypB 모두와 그 특이적인 펩티딜-프로필 cis/trans 이성화효소(PPlase) 활성을 위하여 상호작용을 한다는 것을 고려해 볼 때, 바이러스 라이프 사이클에서 두 사이클로필린을 위한 역할 또한 추가로 시사하고 있다(Hanoulle et al., 2009).
사이클로스포린 유사체의 항-HCV 효과는 면역억제 성질에 무관하고, 칼시뉴린(calcineurin)에 의존적이다. 이는 HCV 활성을 위한 필수적인 요건이 CyP 결합이고, 칼시뉴린 결합은 필요하지 않다는 것을 가리킨다. HIV 치료를 위한 임상적으로 진보한 사이클로필린 억제제인 DEBIO-025는 4개의 가장 일반적인 HCV 유전자형(genotypes 1, 2, 3, 및 4)에 대한 생체외 및 생체내 효능을 보인다. 내성 연구는 DEBIO-025에 내성을 주는 돌연변이는 폴리머라제 및 프로테아제 억제제로 보고된 것과 다르며, 바이러스 리플리콘에 내성을 가진 STAT-C/DAA와 교체저항성을 가지지 않는다는 것을 보여주었다. 더욱 중요하게는 DEBIO-025 또한 프로테아제 및 폴리머라제 억제제 모두에 내성을 주는 탈출한 돌연변이체(escape mutations)의 개발을 억제하였다(Crabbe et al., 2009).
그러나 임상 개발에서 CsA-계 사이클로필린 억제제는 많은 쟁점을 가지며, 이는 그 공유된 구조적 클래스와 연관이 있는 것으로 보이는데, 치료법을 철회하도록 유도할 수 있고 임상 복용 수준을 제한하는 일정한 이상반응(adverse events); 가변적인 효능을 유도할 수 있는 가변적인 약물동태학(pharmacokinetics); 복용 문제를 유도할 수 있는 약제-약제 상호작용의 증가된 위험성;을 포함한다.
DEBIO-025을 받은 환자들에게 가장 흔하게 발생하는 이상반응(adverse events, AEs)은 황달(jaundice), 복통, 구토, 피로, 및 발열을 포함한다. 가장 임상적으로 중요한 AEs는 고빌리루빈혈증(hyperbilirubinemia)이고, 혈소판수의 감소(저혈소판증, thrombocytopaenia)이다. Peg-IFN는 심각한 저혈소판증을 일으킬 수 있으며, DEBIO-025와 결합한 경우에는 심각한 임상적인 문제점을 나타낼 수 있다. 빌리루빈의 증가 및 혈소판의 감소 모두 NIM-811의 초기 임상 연구에서 기술하였다(Ke et al., 2009). DEBIO-025 임상 연구하는 동안에 관찰된 고빌리루빈혈증이 치료를 중단한 후에 반전되었다고 할지라도, 16명의 환자 중에서 4명은 치료를 중지하고 향후 시도를 위한 복용량 수준의 감소를 가져왔다. HCV에서의 사이클로필린억제제항바이러스 효과는 복용량과 연관이 되어 있기 때문에, 복용량을 줄이는 것은 항바이러스 효과의 감소를 가져오며, 다수의 CsA-계 사이클로필린 억제제의 향후 치료는 모노쎄라피(monotherapy)로서 복용될 때, HCV 바이러스 유하량(viral load)이 감소되지 않거나 거의 감소되지 않는다(Lawitz et al., 2009; Hopkins et al., 2009; Nelson et al., 2009). DEBIO-025 및 사이클로스포린 A는 담즙산염 수송 펌프 및 다른 간전이(특히 OAT1B1/OAT1B3/MRP3/cMPAT/ABCC2)와 같은 담즙 운반체(biliary transporters)의 저해제인 것으로 알려져 있다(Crabbe et al., 2009). 담즙운반체, 특히 MRP2와의 상호작용은 DEBIO-025의 높은 복용량 레벨에서 보이는 고빌리루빈혈증의 원인이 될 수 있다(Nelson et al., 2009; Wring et al., 2010). P-당단백질(Pgp/MDR1), BSEP, OAT1B1 및 OAT1B3과 같은 다른 약제 운반체의 억제를 통한 CsA 클래스와 연관된 약제-약제 상호작용(DDIs) 또한 관심사가 될 수 있으며, 잠재적으로 제한하는 일정한 조합 및 HIV와 같은 공감염(co-infection)의 치료를 하는 몇몇 환자에서 사용될 수 있다(Seden et al., 2010).
더욱이, DEBIO-025 및 사이클로스포린 A는 시토크롬 P450 (특히 CYP3A4)에 의한 신진대사의 기질이며, 인간 P-당단백질(MDR1)의 기질 및 억제제인 것으로 알려져 있다(Crabbe et al., 2009). 사이클로스포린 A는 CYP3A4의 생체외 저해제인 것으로 나타났다(Niwa et al., 2007). CYP3A4, 케토코나졸(ketoconazole), 시메티딘(cimetidine) 및 리팜피신(rifampicin)과 같은 유도제 또는 억제제인 다른 약제와의 약제-약제 상호작용의 증가된 위험성이 있다는 것을 의미한다. 또한, P-당단백질(예를 들면, 디곡신(digoxin))에 의하여 운반되는 약제와 상호작용이 있을 것으로 예상되며, 이는 다른 동반질환(concomitant diseases)의 의학적 치료를 받는 HCV 환자에서 심각한 약제-약제 상호작용을 일어날 수 있다(Crabbe et al., 2009). CsA는 1-89%의 경구 생물학적 가용능(bioavailability)을 보이는 초기 제형으로 매우 가변적인 약물동태학을 가질 수 있다(Kapurtzak et al., 2004). 환자 혈액 수준의 값비싼 모니터링 없이는 증가된 플라즈마 수준으로 인한 부작용의 증가된 유행, 또는 저감된 플라즈마 수준으로 인한 감소된 임상 반응을 가져올 수 있다.
사이클로필린의 억제가 HCV의 치료를 위한 유망한 새로운 접근을 나타낸다는 것을 고려할 때, HCV 감염에 대한 병용 요법에 사용하는 보다 더 강력하고 안전한 CyP억제제를 발견하고 개발하는 것이 요구되고 있다.
상글리페린(
Sanglifehrins
)
상글리페린 A(SfA) 및 그 천연 칸저너(congeners)는 혼합 비-리보좀 펩티드/폴리케타이드의 클래스에 속하며, Streptomyces sp. A92-308110 (DSM 9954로도 알려진) (WO 97/02285 참조)에 의하여 생산되고, 본래 사이클로필린 A(CyPA)에 고친화도를 기초로 하여 발견되었었다. SfA는 발효 배지에서 가장 풍부한 성분이고, CsA에 비하여 약 20배의 고친화도를 보인다. 이는 상글리페린이 HCV의 치료에 유용할 수 있다는 것을 암시하였다(WO2006/138507). 상글리페린은 또한 생체외에서 테스트할 때 CsA보다 더 낮은 면역 억제성을 보이는 것 같았다(Sanglier et al., 1999; Fehr et al., 1999). SfA는 CyPA의 CsA 결합 부위에 높은 친화도를 가지면서 결합한다(Kallen et al., 2005).
상글리페린의
생합성
상글리페린은 혼합된 폴리케타이드 생합성효소(polyketide synthase, PKS)/비-리보좀펩타이드 생합성효소(non-ribosomal peptide synthetase, NRPS)에 의하여 생합성된다(WO2010/034243). 22원의 매트로라이드백본은폴리케타이드 탄소사슬 및 트리펩타이드 사슬로 구성되어 있다. 펩타이드 사슬은 하나의 천연 아미노산, 발린, 및 2개의 비천연 아미노산으로 구성되어 있다; 아마이드결합으로 결합된 (S)-메타-티로신 및 (S)-피페라직산. (S)-메타-티로신을 생성시키는 페닐알라닌(NRPS 상의 현장이거나 생합성 전에)의 하이드록실화는 sfaA의 유전자 생성물을 거쳐 일어나는 것으로 생각된다.
상글리페린의
면역억제성
활동
SfA의 면역억제성 메커니즘의 활동은 다른 공지의 면역억제 메카니즘은 CsA, FK506 및 라파마이신(rapamycin)과 같은 여타의 공지 이뮤노필린-결합 면역억제제과 다르다. SfA는 칼시뉴린의 포스파타아제 활성, CsA의 표적을 억제하지 않으며(Zenke et al., 2001), 대신 그 면역억제 활성은 인터류킨-6(Hartel et al., 2005), 인터류킨-12(Steinschulte et al., 2003) 및 인터류킨-2-의존성 T-세포 급증(Zhang & Liu, 2001)의 억제에 기여해 왔다. 그러나 SfA가 면역억제 효과를 가하는 분자성 표적 및 메카니즘은 지금까지 알려지지 않았다.
SfA의 분자 구조는 복합체이며, CyPA와의 상호작용은 분자의 대환식(macrocyclic) 부분에 의하여 대개 조정되는 것으로 인식되어 왔다. 사실상 SfA의 산화적 개열(oxidative cleavage)로부터 유래된 대환식 화합물(hydroxymacrocycle)은 CyPA에 대한 강한 친화도를 보여주었다(Sedrani et al., 2003). X-선 결정 구조 데이타는 하이드록시매크로사이클(hydroxymacrocycle)은 CsA처럼 CyPA의 동일한 활성 부위에 결합한다는 것을 보여주었다, HCV 요법에서 잠재적인 용도로 비-면역억제 CyP 억제제를 사용할 기회를 제공하면서, SfA의 매크로사이클 부분에 기초한 유사체는 이전에는 면역억제성이 전혀 없는 것으로 알려져 있다(Sedrani et al., 2003).
말하자면, 크론병(Crohn's disease), 베체트병(Behcet syndrome), 포도막염(uveitis), 건선(psoriasis), 아토피피부염, 류마티스 관절염, 신후 증후군, 재생불량성 빈혈, 담즙성 간경변증, 천식, 폐섬유증, 만성 폐쇄성 폐질환(COPD) 및 셀리악병을 포함하나, 이에 한정되지 않은 이식거부, 자기면역, 염증 및 호흡기 계통 질환의 질병 예방과 같은 분야에서 사용하는 저독성을 가진 면역억제제를 개발하기 위한 기회 또한 있다. 상글리페린은 수지상 세포 키모킨(dendritic cell chemokines)을 통하여 면역억제 활성(Zenke et al., 2001) 및 잠재적으로 활동(Immecke et al., 2011)하는 새로운 메카니즘을 보여주어 사이클로스포린 A, 라파마이신 및 FK506과 같은, 현 임상 치료제와 다른 메카니즘 활동을 가진 치료제를 개발하기 위한 기회가 있다. 상글리페린 A는 사이클로스포린 A보다 10배 덜 강한 것으로 나타났으므로, 이상적인 신규 치료제는 향상된 효능 및/또는 치료의 창을 가질 것이다.
사이클로필린
억제제의 기타 치료 용도
인간 면역결핍 바이러스(
HIV
)
또한 CsA 및 DEBIO-025와 같은 사이클로필린 억제제는 HIV 복제의 억제에 있어서 잠재적인 유용성을 나타내었다. HIV 역전사의 진행/완료되는 동안에 CyPA의 기능를 방해하는 것으로 인식되었다(Ptak et al., 2008). 그러나 임상적으로 테스트할 때, DEBIO-025만이 HIV-1 RNA 수준을 9명의 환자에서 2명의 환자 각각은 ≥0.5 및 >1 log10 copies/mL으로 감소시켰으며, 반면에 테스트 대상 환자 중에서 27명은 HIV-1 RNA 수준의 감소를 보이지 않았다(Steyn et al., 2006). 따라서 DEBIO-025는 HCV/HIV 공감염된 환자에서 시험하였으며, HCV에 대한 보다 더 나은 효능을 보여주었고, HIV 임상 시험은 중단되었다(Watashi et al., 2010 참조).
HIV
의 치료
세계적으로 3천만이 넘는 사람들이 HIV-1에 의하여 감염되었으며, 매년 3백만명이 늘어나고 있다. 매우 활성인 항레트로바이러스 치료(HAART)의 도입으로 치료법의 선택이 극적으로 향상되고 있다(Schopman et al., 2010). 9개의 뉴클레오시드 역전사효소 억제제(NRTI), 4개의 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제(NNRTI), 9개의 프로테아제 억제제(PI), 1개의 융합 억제제, 1개의 CCR5 억제제 및 1개의 인테그라아제를 포함하여 2008년까지 거의 25개의 항레트로바이러스 약제가 HIV-1의 치료용으로 허가를 받았다(Shafer and Schapiro, 2008). 그러나 이들 현재 식이요법 중에서 어떠한 것도 완벽하게 바이러스를 제거하지 못하며, 심각한 부작용을 일으킬 수 있고, 항바이러스 내성은 여전히 주요한 관심사로 남아 있다. 그러므로 특히 사이클로필린 억제제와 같은 케이스와 같이, 승인된 약제가 없는 활성 클래스의 메카니즘에서 새로운 항바이러스 요법이 요구되고 있다.
B형 간염 바이러스
B형 간염은 헤파드나바이러스과(family hepadnaviridae)의 DNA 바이러스이고, B형 간염의 병인이다. HCV 및 HIV의 경우와는 반대로, B형 간염 바이러스에 대한 사이클로필린 억제제의 활성에 대하여 공지된 경우가 거의 없다. Ptak et al. 2008에서 HBV에 대한 Debio-025의 약한 활성(IC50 of 4.1μM)에 대하여 언급한 반면에, Xie et al., 2007에서는 HBV에 대한 CsA의 어느 정도의 활성(IC50>1.3μg/mL)을 기재하였다. 이는 사이클로필린 억제제의 나노몰의 항바이러스 활성에 대한 많은 보고가 있는 HIV 및 HCV와 대조되는 것이다.
HBV
의 치료
HBV는 최대 4억명의 환자가 전세계적으로 감염되었으며, 만성 바이러스 간염 및 간암을 일으키는 주요한 원인이다. 2008년 현재 HBV의 치료를 위하여 6개의 약제가 허가되었다: 인터페론 알파 및 페길화된 인터페론 알파, 3개의 뉴클로에시드 유사체(lamivudine, entecavir 및 telbivudine) 및 1개의 뉴클로에티드 유사체(adefovir dipivoxil). 그러나 높은 내성률, 잘 견디지 못함 및 가능한 부작용으로 인하여, 새로운 치료의 선택 대안이 요구되고 있다(Ferir et al., 2008).
미토콘트리아
투과성 전이
포아의
저해(
mPTP
)
미토콘드리아에서의 높은 전도도 투과성 전이 포아의 오프닝으로 인하여 미토콘드리아 투과성 전이(mitochondrial permeability transition, MPT)를 시작한다. 이는 원인 이벤트로서, 괴사, 산화스트레스 후의 간세포의 아포토시스, Ca2+ 독성, 및 허혈 재관류(ischaemia/reperfusion)으로 이어진다. 사이클로필린 억제제에 의한 사이클로필린 D(사이클로피린 F로도 알려짐)의 억제는 투과성 전이 포아의 오프닝을 방해하고 상기 스트레스 후의 세포사를 방지하는 것으로 나타났다. 그러므로 사이클로필린 D 억제제는 특히 울리히 선천성 근육병(Ullrich congenital muscular dystrophy) 및 베드레헴 근병증(Bethlem myopathy)의 근육병(Mellay et al., 2008, WO2008/084368, Palma et al., 2009), 다발성 경화증(Forte et al., 2009), 당뇨병(Fujimoto et al., 2010), 루게릭병(Martin 2009), 조울증(Kubota et al., 2010), 알츠하이머병(Du and Yan, 2010), 헌팅턴병(Perry et al., 2010), 심근경색 후의 회복(Gomez et al., 2007) 및 만성의 알코올 소모(King et al., 2010)과 같이 mPTP 오프닝이 연루된 곳에서 유용한 것으로 나타날 수 있다.
추가의 치료 용도
사이클로필린 억제제는 수두대상포진 바이러스(Varicella-zoster virus, Ptak et al., 2008), 인플루엔자 A 바이러스(Liu et al., 2009), 중증 급성 호흡기 증후군 코로나바이러스 및 다른 인간 및 고양이 코로나바이러스(Chen et al., 2005, Ptak et al., 2008), 뎅기열 바이러스(Kaul et al., 2009), 황열 바이러스(Qing et al., 2009), 거대세포 바이러스(Kawasaki et al., 2007) 및 우두 바이러스(Castro et al., 2003)와 같은 다른 바이러스에 대한 잠재적인 활성을 가지므로, 감염 치료에 사용할 수 있다.
사이클로필린 억제제의 유용성 및 암과 같은 다른 요법 분야세어의 사이클로필린 억제에 대하여 보고되었다(Han et al., 2009).
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상글리페린의
일반적인 고찰
상글리페린과 같은 화합물의 약제 개발에 관한 쟁점 중의 하나는 빠른 신진대사 및 글루큐로닌 결합(glucuronidation)으로 낮은 생물학적 이용가능성으로 유도한다는 것이다. 이는 식효(food effect)의 증가된 가능성, 조제 형태의 보다 빈번한 불완전 방출 및 높은 환자간의 가변성을 유도할 수 있다.
그러므로 특히 HCV 감염 치료에 유용하고, 또한 사이클로필린의 억제가 유용할 수 있는 HIV 감염, 근육병 또는 심근경색증 후의 회복 촉진 또는 면역억제 또는 항염증 효과가 유용한 다른 질병 분야의 치료에서의 신규한 사이클로필린 억제제를 확인할 필요가 있다. 바람직하게는 상기 사이클로필린 억제제는 현재 사용가능한 사이클로필린 억제제보다 하나 또는 그 이상의 다음 성질을 포함하여 향상된 성질을 가지고 있다: 긴 반감기 또는 증가된 경구 생물학적 이용가능성, 감소된 P450 신진대사 및/또는 감소된 글루큐로닌 결합을 통해 가능함, 향상된 물 용해성, 향상된 HCV에 대한 효능, 감소된 독성(간독성 포함), 표적 기관에 고노출과 같은 향상된 약리 프로파일(예를 들면, HCV의 경우 간) 및/또는 긴 반감기(덜 빈번한 복용 가능함), CYP3A4 신진대사 및 억제의 감소된 수준을 통하거나 감소된 (Pgp) 억제(보다 용이한 다중약물 조합을 가능하게 함)와 같은 감소된 약제-약제 간 상호작용, MRP2로의 낮은 결합성과 같은 향상된 부작용 프로파일, 고빌리루빈혈증의 감소된 가능성, 낮은 면역억제 효과, 내성 바이러스 종에 대한 향상된 활성, 특히 CsA 및 CsA 유사체(예를 들면 DEBIO-025) 내성 바이러스 종 및 보다 높은 요법(및/또는 선택성) 지수를 유도함. 본 발명은 상기 성질을 하나 또는 그 이상을 가질 수 있는 신규한 상글리페린 유사체를 제공한다. 더욱 상세하게는 본 발명은 예를 들면 증가된 마이크로솜 반감기로 나타나는 P450 또는 글루큐로닌 결합을 통한 감소된 신진대사 및/또는 예를 들면, 저 리플리콘 EC50으로 나타나는 HCV에 대한 및/또는 감소된 향상된 효능이 있는 것으로 예상되는 신규한 뮤타합성 상글리페린 유사체를 제공한다.
또한 이식거부의 질병 예방, 또는 자기면역, 염증 및 호흡기 질환의 치료에서 유용한 신규한 면역억제제를 개발하기 위한 요구가 있다. 바람직하게는 상기 면역억제제는 하나 또는 그 이상의 하기의 성질을 포함하여 공지의 천연 상글리페린의 향상된 성질을 가질 것이다: 긴 반감기 또는 증가된 경구 생물학적 이용가능성, 감소된 P450 신진대사 및/또는 감소된 글루큐로닌 결합을 통해 가능함, 향상된 물 용해성, T-세포 증식 에세이에서 볼 수 있는 것과 같은 면역억제 활성에서의 향상된 효능, 감소된 독성(간독성 포함), 표적 기관에 고노출과 같은 향상된 약리 프로파일(예를 들면, HCV의 경우 간) 및/또는 긴 반감기(덜 빈번한 복용 가능함), CYP3A4 신진대사 및 억제의 감소된 수준을 통하거나 감소된 (Pgp) 억제(보다 용이한 다중약물 조합을 가능하게 함)와 같은 감소된 약제-약제 간 상호작용, 향상된 부작용 프로파일. 본 발명은 신규한 예를 들면 증가된 마이크로솜 반감기로 나타나는 P450 또는 글루큐로닌 결합을 통한 감소된 신진대사 및/또는 예를 들면, 낮은 T-세포 증식 IC50으로 나타나는 향상된 면역억제 효능이 있는 신규한 유사체를 제공한다.
그리하여 실시예에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화합물은 하기와 같은 유리한 약제학적으로 연관된 성질을 가진다:
- 선행기술인 사이클로필린 억제제 사이클로포린 A, DEBIO-025 (alisporivir) 및 상글리페린 A와 비교하였을 때 향상된 HCV 및 HIV에 대한 항바이러스 효능
- 선행기술의 화합물 상글리페린 A와 비교하였을 때 감소된 클리어런스 및 증가된 경구 노출
- 선행기술의 사이클로필린 억제제 사이클로스포린 A, DEBIO-025 (alisporivir) 및 상글리페린 A와 비교하였을 때 보다 효능있는 CypA PPlase 활성 억제
- 빌리루빈 운반체(OAPT-1B1, OATP-1B3, MRP2 및 MRP3)의 감소된 억제 및 생체이물 운반체(xenobiotic transporters, PgP 및 BSEP)의 감소되 억제로 증명된 향상된 부작용 프로파일 및 감소된 약제-약제 상호작용.
본 발명은 뮤타합성 상글페인의 반합성(semisynthetic) 변형에 의하여 생성된 대환식 상글리페린 유사체를 제공한다. 유사체는 화학식 IIA 및 화학식 IIB에 나타난 것과 같은 뮤타합성 상글리페린의 디하이드록실레이션 후에 알데히드 매크로사이클의 생성하기 위하여 분열시키고 호머-에몬스형 반응(Hormer-Emmons type reaction) 및 알데히드가 연관된 다른 커플링을 포함하는 추가의 반응에 의하여 제조할 수 있다. 그 결과 본 발명은 데환식 상글리페린 유사체, 상기 화합물의 제조방법, 의약 또는 추가 화합물의 생성에서의 중간체로서 상기 화합물의 용도를 위한 방법을 제공한다.
그러므로 본 발명의 일 실시예에서 본 발명은 하기 화학식 I로 표현되는 대환식 상글리페린 유사체, 또는 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 화합물을 제공한다.
[화학식 I]
그 호변 이성질체(tautomer)를 포함하고, 케탈은 C-53 케토 및 C-15 하이드록시기 및 메탄올의 조합에 의하여 형성되는 그 메탄올 부가물을 포함한다.
상기한 구조는 대표적인 호변이성질체를 보여주며, 본 발명은 화학식 I의 화합물의 모든 호변 이성질체를 포함하고, 그림으로 설명한 엔올 화합물 및 그 반대 화합물 케토 화합물을 예로 들 수 있다.
화학식 I의 정의 내에서 포함된 특정 호변 이성질체는 (i) C-53 케토기가 C-15 하이드록실을 가진 헤미케탈을 형성하거나 또는 (ii) C-15 및 C-17 하이드록시가 상기 C-53과 함께 결합하여 케탈을 형성할 수 있는 것이다. 모든 숫자는 상글리페린 A의 모핵(parent sanglifehrin A structure) 시스템을 사용한다.
화학식 I의 화합물, 또는 약제학적으로 허용가능한 그 염은 선택적으로 하이드레이트와 같은 약제학적으로 허용가능한 용매화합물(solvate)의 형태로 존재할 수 있다.
또 다른 실시예로서, 본 발명은 고상 결정성 형태(Form I)의 화학식 I에 따른 대환식상글리페린유사체를 제공한다.
정의
관사 “하나(a 및 an )”는 여기에서 관사의 문법적인 대상의 하나 또는 하나 이상 (곧, 적어도 하나)를 가리킨다. 예를 들어, “유사체(an analogue)”는 하나의 유사체 또는 하나 이상의 유사체를 의미한다.
여기에서 사용된 용어 “유사체( analogue (s))”는 구조적으로 서로 유사하나 조성이 약간 다른 화학적 화합물을 일컫는다(하나의 원소를 다른 원소로 교체하거나 특정 작용기가 존재하거나 존재하지 않음).
여기에서 사용된 용어 “상글리페린 ( sanglifehrin (s))”는 상글리페린 A와 구조적으로 서로 유사하나 조성이 약간 다른 화학적 화합물(하나의 원소를 다른 원소로 교체하거나 특정 작용기가 존재하거나 존재하지 않음), 특히 Streptomyces sp. A92-308110의 발효에 의하여 생성되는 것을 일컫는다. 상글리페린 B와 같은 WO97/02285 및 WO98/07743에서 언급된 상글리페린-유사 화합물을 포함한다.
여기에서 사용된 용어 “뮤타합성상글리페린 ( mutasyntheticsanglifehrin (s))” 또는 “뮤타합성상글리페린유사체(mutasyntheticsanglifehrin analogue(s))”는 상글리페린 A, B, C 또는 D와 구조적으로 서로 유사하나 조성이 약간 다른 화학적 화합물(하나의 원소를 다른 원소로 교체하거나 특정 작용기가 존재하거나 존재하지 않음), 특히 Streptomyces sp . A92-308110 또는 돌연변이체의 발효에 의하여 생성되는 것을 일컫는 여기에서 메타-티로신유사체와 함께 배양된다.
여기에서 사용된 용어 “메타 - 티로신유사체 ( meta - tyrosine analogue (s))”는 메타-티로신과 구조적으로 서로 유사하나 조성이 약간 다른 화학적 화합물(하나의 원소를 다른 원소로 교체하거나 특정 작용기가 존재하거나 존재하지 않음), 특히 화학식 3에 나타낸 화합물을 일컫는다.
여기에서 사용된 용어 “대환식유사체 ( macrocyclic analogue )” 또는 “대환식상글리페린유사체( macrocyclicsanglifehrin analogue )” 또는 “대환식상글리페린( macrocyclicsanglifehrin )”는 가장 넓은 양태의 본 발명을 대표하는 것으로서 상기에 언급한 화합물, 예를 들어 상기 화학식 I의 화합물, 또는 약제학적으로 허용가능한 그 염을 일컫는다. 이들 화합물은 또한 “본 발명에 의한 화합물( compounds of the invention )” 또는 “상글리페린의유도체( derivatives of sanglifehrin)” 또는 “상글리페린유사체 ( sanglifehrin analogues )”로 칭해지며, 이들 용어는 본 출원에서 교환가능하게 사용된다.
여기에서 사용된 용어 “HCV”는 싱글스트랜드이고, RNA며, 바이러스과Flaviviridae인 감싸여진 바이러스인 C형 간염 바이러스를 일컫는다.
여기에서 사용된 용어 “생물학적 이용가능성( bioavailability )”은 투입된 후에 약제 또는 다른 물질이 흡수되거나 생물학적 활성부위에서 이용 가능하게 되는 정도 또는 속도를 일컫는다. 이 성질은 화합물의 용해도, 내장 내에 흡수율, 단백질 결합 정도 및 신진대사 등을 포함한 다수의 인자에 의존한다. 본 분야의 당업자에게 알려진 다양한 생물학적 이용가능성 시험을 여기에 기술한다(Egorin et al.,2002도 참조).
본 출원에서 사용된 용어 “물에 대한 용해도( water solubility )”는 수용성 매체, 예를 들면 pH 7.4의 인산 완충 식염수(PBS) 또는 5% 글루코즈 용액에서의 용해도를 일컫는다. 물에 대한 용해도의 시험은 하기 실시예에서“물에 대한 용해도 에세이”로 기술한다.
화학식 I의 화합물과 같은 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염은 4차 암모늄산부가염뿐만 아니라 약제학적으로 허용가능한 무기 또는 유기산 또는 염기로부터 형성된 기존의 염을 포함한다. 적절한 산염의 더욱 상세한 예로는 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산, 과염소산, 푸마르산, 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 글리콜산, 개미산, 젖산, 말레산, 주석산, 구연산, 팔모인산, 말론산, 하이드록시말레인산, 페닐아세트산, 글루탐산, 벤조산, 살리실산, 푸마르산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 나프탈렌-2-설폰산, 벤젠설폰산, 하이드록시나프토산, 하이드로요오드산, 스테로인산, 탄닌산 등으로부터 유래한 것을 포함한다. 염산염이 특히 관심을 끌고 있다. 그 자체로 약제학적으로 허용가능하지 않은 다른 산들은 본 발명의 화합물 및 그 약제학적으로 허용가능한 염을 얻는 데에 중간체로서 수용한 염의 제조에 유용할 수 있다. 적절한 염기염의 보다 특정한 예로는 소듐, 리튬, 포타슘, 마그네슘, 알루미늄, 칼슘, 아연, N,N'-디벤질렌디아민, 클로로프로카인, 콜린, 디에탄올아민, 에틸렌디아민, N-메틸글루카민 및 프로카인염을 포함한다. 이후로 본 발명에 의한 화합물에 대한 언급은 화학식 I의 화합물 및 그 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
여기에 사용된 용어 “알킬(alkyl)”은 전형적으로 1-10 탄소원자, 예를 들어 C1 -6 알킬기를 포함하는 직쇄 또는 분지쇄알킬기를 나타낸다. 알킬기의 예로는 메틸, 에틸, n-프로필, i-프로필, 및 n-부틸과 같은 C1 -4 알킬기를 포함한다.
용어 “치료( treatment )”는 요법 치료뿐만 아니라 예방을 포함한다.
용어 “화학식 II”는 화학식 IIA 및 화학식 IIB를 집합적으로 일컫는다.
본 발명은 신규한 예를 들면 증가된 마이크로솜 반감기로 나타나는 P450 또는 글루큐로닌 결합을 통한 감소된 신진대사 및/또는 예를 들면, 낮은 T-세포 증식 IC50으로 나타나는 향상된 면역억제 효능이 있는 신규한 유사체를 제공한다.
그리하여 실시예에서 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화합물은 하기와 같은 유리한 약제학적으로 연관된 성질을 가진다:
- 선행기술인 사이클로필린 억제제 사이클로포린 A, DEBIO-025 (alisporivir) 및 상글리페린 A와 비교하였을 때 향상된 HCV 및 HIV에 대한 항바이러스 효능
- 선행기술의 화합물 상글리페린 A와 비교하였을 때 감소된 클리어런스 및 증가된 경구 노출
- 선행기술의 사이클로필린 억제제 사이클로스포린 A, DEBIO-025 (alisporivir) 및 상글리페린 A와 비교하였을 때 보다 효능있는 CypA PPlase 활성 억제
- 빌리루빈 운반체(OAPT-1B1, OATP-1B3, MRP2 및 MRP3)의 감소된 억제 및 생체이물 운반체(xenobiotic transporters, PgP 및 BSEP)의 감소되 억제로 증명된 향상된 부작용 프로파일 및 감소된 약제-약제 상호작용.
도 1은 화합물 24의 1H NMR이다.
도 2는 고상 결정성 형태의 화합물 24의 X-선 분말 회절 패턴이다.
도 2는 고상 결정성 형태의 화합물 24의 X-선 분말 회절 패턴이다.
본 발명은 상기에서 언급한 바와 같이 대식환 상글리페린유사체, 상기 화합물의제조방법 및 상기 화합물의 약물에서의 용도를 위한 방법을 제공한다.
일 실시예에서 화합물은 C-53 케토 및 C-15 하이드록시기 및 메탄올의 조합에 의하여 헤미-케탈이 형성된 그 메탄올 부가물이다. 다른 실시예에서는 그렇지 않다.
본 발명의 실시예에서, 하기 화학식에 나타낸 바와 같이, C26, 27 위치에서 이중결합은 cis 형태이다:
상기 화합물은 화학적 합성 중에 제조될 수 있다.
부가의 실시예에서, 고상 결정성 형태의 화학식 I의 대환식상글리페린유사체를 제공한다. 특히 메틸이소부틸케톤(MIBK)으로부터 화학식 I의 비정질 대식환 상글리페린유사체의 결정화에 의하여 얻을 수 있는 (또는 얻은) 화학식 I에 의한 대환식상글리페린유사체의고상 결정성 형태(Form I)를 제공한다. 일 실시예에서 상기 비정질 형태는 MIBK에서 슬러리화되며, 예를 들어 1시간, 2시간, 5시간, 24시간, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 2주의 총 기간 동안 최소 및 최고 온도 사이에서 온도는 순환된다. 일 실시예에서 온도는 실온과 60℃ 사이, 예를 들면 실온과 40℃ 사이에서 순환된다. 일 실시예에서, 온도는 2-8시간 마다, 예를 들면, 3-5시간마다 또는 4시간 마다 최소 및 최고 온도(및 역으로도) 사이에서 순환된다. 바람직한 실시예에서 온도는 4시간마다 총 5일 동안 실온과 40℃ 사이에서 순환된다.
화학식 I의 대환식상글리페린유사체의비정질 형태의 결정화 방법은 실시예에서 상세하게 설명한다.
결정성 다형체 Form I 형태의 화학식 I의 대환식상글리페린유사체는 도 2에 나타낸 바와 같이 실질적으로 X-선 분말 회절(XRPD) 패턴을 가진다. (실시예 8의) 표 2는 피크 목록 및 상대적인 세기를 보여준다. XRPD 데이터를 얻는 방법은 실시예에 기술한다.
그리하여 8.3, 8.5, 11.1, 12.6, 13.9, 14.3, 15.0, 16.9, 17.7, 18.6, 19.0, 20.1, 20.5, 20.9, 21.2, 21.7 및 23.0 (±0.2 degrees, 2-theta values)에서 적어도 하나(예를 들면, 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉, 열, 열하나, 열둘, 열셋, 열넷, 열다섯, 열여섯 또는 열일곱 모두의) 신호를 보여주는 XRPD 패턴을 가진 결정성 형태(Form I)의 화학식 I의 대환식상글리페린유사체를 제공하는데, 여기에서 신호는 Form I 다형체의 XRPD 패턴에서 주요한 신호를 구성한다. 8.3, 8.5, 11.1, 13.9, 17.7, 18.6, 19.0, 20.5, 20.9 및 23.0 derees 2-theta에서의 신호는 비교적 높은 상대세기(26% 초과, 도 2 참조)를 가지므로, 이들 중에서 적어도 하나(예를 들면 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯, 일곱, 여덟, 아홉 또는 열 모두)를 보는 것이 바람직하다. 13.9, 17.7, 19.0, 20.5 및 23.0 degrees 2-theta에서의 신호는 비교적 높은 상대세기(50% 초과, 도 2 참조)를 가지므로, 이들 중에서 적어도 하나(예를 들면 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯모두)를 보는 것이 바람직하다.
용어 “상대적인 세기”는 도 2에 도시한 바와 같이, (13.9 degrees 2-theta에서 의 피크에서 대응하는) 스펙트럼에서의 가장 높은 세기의 신호의 세기만큼의 퍼센트로 주어진 세기를 의미하는 것으로 이해될 것이다.
일반적으로 본 발명의 화합물은 화학식(II)의 화합물을 생성하기 위하여 뮤타합성을 하고 반합성을 함으로써 제조된다.
[화학식 IIA]
[화학식 IIB]
일반적으로 화학식 (I)의 화합물의 전구체 또는 그 약제학적으로 허용가능한 염을 제조하는 방법은 다음을 포함한다:
* (Streptomyces sp. A92-308110, DSM 9954로도 알려진) 상글리페린 생성자, 더욱 바람직하게는 sfaA유전자 또는 sfaA 유전자 유사체가 불활성화되거나 결실된 상글리페린 성자의 배양액에 발효 배지를 접종하는 공정;
* (화학식 (III)에 도시된, 예를 들면 (S)-메틸 2-아미노-3-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)프로파노에이트, DL-5-플루오로-메타-티로신 (9) 또는 메틸 2-아미노-3-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)프로파노에이트 (10)) 메타-티로신 유사체에 발효 배지를 피딩하는 공정
* 화학식 IIA 및 화학식 IIB의 화합물을 생성될 때까지 계속 발효를 시키는 공정
* 추출하고 화학식 IIA 및 화학식 IIB의 화합물을 분리하는 공정
* 화학식 IIA 및 화학식 IIB의 화합물의 반합성 유도체화하여 화학식 I의 화합물을 생성하는 공정
화학식 (III)의 화합물은 하기와 같이 정의된다:
[화학식 III]
상기 식에서 R10은 H 또는 알킬기 예를 들면 Me와 같은 C1 -6의 에스테르 형성기를 나타낸다.
피드(feed)는 라세믹 또는 화학식 (III)의 화합물의 L형일 수 있다.
화학식 (III)의 화합물은 상용화되거나 유기 합성 화학 기술에 의하여 제조된다. 화학식 (III)의 화합물에 대한 한 총괄적인 루트는 하기 도식 1a에 나타낸다.
[도식 1a]
반응식 1a:
a) 화학식 (IV)의 알데히드와 적절한 분절, 예를 들면 (R11O)2P(O)CH(NHPG)CO2R10와 커플링, PG = 보호화기(protecting group)
b) 필요시, 수소화 및 탈보호화
화학식 (IV)의 알데히드는 상용화되거나 본 분야의 당업자에 의하여 용이하게 합성될 수 있다. 보호화 및 탈보호화 화학반응은 화학식 (IV)의 화합물로부터 화학식 (III)의 화합물을 생성하는 데에 사용될 필요가 있을 수 있다. 이들은 본 분야의 당업자에게 공지의 기술이며, 적절한 보호화기는 Greene's Protective Groups in Organic Synthesis (Wuts and Greene, 4th Edition, 2007)에 기술되어 있다.
화학식 (IIA) 및 화학식 (IIB)의 화합물의 생성 후에 반-합성 유도체화에 의하여 본 발명의 화합물이 제조된다. 상글리페린 대환식 알데히드를 생성하는 반합성법은 US 6,124,453, Metternich et al., 1999, Banteli et al., 2001 및 Sedrani et al., 2003에 기술되어 있다.
일반적으로 상글리페린 뮤타합성 유사체로부터 화학식 (I) 또는 그 약제학적으로 허용가능한 염을 제조하는 반합성 공정은 하기를 포함한다:
(a) 상기 상글리페린 유사체의 디하이드록실레이션(dihydroxylation)시키고;
(b) 1,2-디올의 산화적 개열시켜 알데히드를 얻고;
(c) 화학식 V의 화합물을 이용하여, 상기 알데히드와 포스포네이트 카르보음이온과 같은 안정화된 카르보음이온(또는 그 캐노니컬 형태(canonical form))을 커플링시킨다.
이는 레트로합성으로(retrosynthetically) 하기와 같이 도시하였다:
R11기는 동일하거나 상이하며, 독립적으로 알킬 (예를 들면, C1-4 알킬) 또는 벤질기를 나타낸다.
그렇기 때문에, 본 발명에 의한 화합물을 제조하는 방법은 화학식 (V)의 화합물을 알데히드 매크로사이클(화학식 (VI))의 화합물)로 반응시키는 단계를 포함한다. 화학식 (VI)의 화합물의 제조방법은 상글리페린 A을 대응하는 알데히드 매크로사이클로 변환하기 위하여 이전에 기술된 것과 유사한 공정으로 실시될 수 있다(Metternich et al., 1999). 간단하게 설명하자면, 화학식 (II)의 화합물은 변형된 샤프리스 조건(Sharpless condition)을 사용하여 디하이록실레이션시킨다. 그리고 나서 예를 들면 소듐 페리오데이트를 사용하여, 결과 생성물인 디올을 산화적으로 개열시킨다. 화학식 VI의 결과 화합물은 호몰로게이트된(homologated) 아미드, 에스테르 또는 케톤으로 유도체화시키는 기질로서 사용될 수 있다. 전형적으로 화학식 (V)의 화합물은 비양자성 용매에서 용해되고, 냉각되고 염기, 예를 들면 소듐 하이드라이드로 처리한다. 그리고나서 화학식 (VI)의 화합물을 첨가하고 반응온도를 가열한다. 적절한 시간 후에 반응을 정지시키고, 화학식 I의 화합물을 표준 조건(예를 들면, 제조용 HPLC, 제조용 TLC 등, 정상 플래시 크로마토그래피)으로 정제한다.
화학식 (V)의 화합물은 공지되거나 공지의 방법을 사용하여 제조될 수 있다.
도식 1(하기)에 나타낸 바와 같이, 적절한 아민은 클로로아세틸 클로라이드 또는 유사한 것을 처리하여 알파-클로로아미드를 형성하는 데에 사용될 수 있다. 그리고 나서 알파-클로로아미드를 아르부조프 반응(Arbuzov reaction)으로 처리하여 화학식 V의 화합물을 생성한다. 화학식 V의 화합물에 이르는 다른 루트는 본 분야의 당업자에게 자명할 것이다.
도식 1
화학식 (V)의 또 다른 화합물은 공지이거나 사용가능한 카복실산 유도체(예를 들면 R3COX)로부터 용이하게 합성될 수 있으며, 여기에서 R3는 도식 2에 나타낸 1,2-옥사지난환(1,2-oxazinane ring))이다. 도식 2(하기)에 나타낸 바와 같이, 메틸 포스포네이트가 염기로 처리된 후에 카복실산 유도체는 메틸 포스포네이트 상으로 커플링될 수 있다. 화학식 V의 화합물에 대한 다른 루트가 본 분야의 당업자에게는 명백한 것이라 할지라도 이로써 화학식 (V)의 화합물을 생성한다.
도식 2
바람직하거나 필요하다면, T.W. Green, P.G.M.Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley-Interscience, New York, 1999에 기술된 바와 같이 알데히드 매크로사이클 또는 매크로사이클, 또는 화학식 V의 화합물 내의 기능성을 보호하기 위하여 보호화기를 사용할 수 있다.
여기에 제공된 특정한 방법 및 참조에 더하여 본분야의 당업자는 합성방법을 위한 표준 텍스트북 문헌을 찾아볼 수 있다. Vogel's Textbook of Practical Organic Chemistry (Furniss et al., 1989) and March's Advanced Organic Chemistry (Smith and March, 2001)을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 의한 상글리페린 유사체는 단독으로 또는 다른 약제와 혼합하여 투입될 수 있다. 두 개 (또는 그 이상의) 약제와 함께 투입하면 사용될 각각의 약제를 보다 덜 복용할 수 있어, 부작용을 줄일 수 있으며, 효능이 향상되어 높은 SVR를 가지고 내성을 줄일 수 있다.
그러므로 일 실시예에서, 뮤타합성 상글리페린 유사체는 치료 기준에 따라 HCV 감염의 치료를 위한 하나 또는 그 이상의 약제/들과 함께 같이 투입될 수 있다. 이는 인터페론(예를 들면, pIFNα 및/또는 리바비린(ribavirin))이 될 수 있다.
또 다른 실시예에서, 본 발명의 상글리페린 매크로사이클은 STAT-C(HCV의 치료를 위해 특이적으로 표적화된 약제)와 같은 하나 또는 그 이상의 다른 항바이러스제와 함께 투입되는데, 다음 중에서 하나 또는 그 이상일 수 있다: 비-뉴클레오시드 폴리머라제 억제제(예를 들면, ABT-333, ABT-072, BMS 791325, IDX375, VCH-222, BI207127, ANA598, VCH-916, GS 9190, PF-00868554 (Filibuvir) 또는 vx-759), 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 폴리머라제 억제제(예를 들면, 2'-메틸사이티딘, 2'-C-메틸아데노신, R1479, PSI6130, R7128, R1626, PSI 7977 또는 IDX 184), 프로테아제 억제제(예를 들면, ABT-450, ACH-1625, BI 201355, BILN-2061, BMS-650032, CTS 1027, Danoprevir, GS 9256, GS 9451, MK 5172, IDX 320, VX-950(Telaprevir), SCH503034(Boceprevir), TMC435350, MK-7009(Vaneprivir), R7227/ITMN-191, EA-058, EA-063 또는 VX 985), NS5A 억제제(예를 들면, A-831, BMS 790052, BMS 824393, CY-102 또는 PPI-461), 실리마린(silymarin), 세린 C-팔미토일트랜스퍼라제(palmitoyltransferase) 억제제, 니타족사나이드(Nitazoxinide) 또는 바이러스 침입 억제제(viral entry inhibitors)(예를 들면, PRO 206),
또 다른 실시예에서, 본 발명의 상글리페린 매크로사이클은 하나 또는 그 이상의 (HIV 치료용 고활성 항레트로바이러스 치료(HAART), 이는 다음 중에서 하나 또는 그 이상일 수 있다: 뉴클로에시드 역전사효소 억제제(NRTI) (예를 들면, 엠트리시타빈(Emtricitabine) 또는 테노포비르(Tenofovir)), 비-뉴클레오시드 역전사효소 억제제(NNRTI)(예를 들면, 릴리피비린(Rilipivirine) 또는 에파비렌즈(Efavirenz)), 프로테아제 억제제(PI)(예를 들면, 리토나비어(Ritonavir) 또는 로피나비어(Lopinavir)), 융합억제제(예를 들면, 메라비록(Maraviroc) 또는 엔푸비르타이드(Enfuvirtide)), CCR5 억제제(예를 들면, 아플라비록(Aplaviroc) 또는 비크리비록(Vicriviroc)), 돌연변이 억제제(예를 들면, 베비리매트(Bevirimat)), CD4 모노클로날 항체(예를 들면, 이발리주마브(Ibalizumab)) 및 인테그라제 억제제(예를 들면, 엘티그라비르(Eltiegravir)) 와 같은) 바이러스제와 함께 투입된다.
또 다른 실시예에서, 본 발명에 의한 상글리페린 매크로사이클은 하나 또는 그 이상의 HCV의 치료용 다른 항바이러스제와 함께 투입되는데, 이는 다음 중의 하나 또는 그 이상일 수 있다: 인터페론(예를 들면, 인터페론 알파 또는 페길화된 인터페론 알파), 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체(예를 들면, 라미부딘(lamivudine), 엔테카비르(entecavir), 인데포비르 디피복실(adefovir dipivoxil) 또는 텔비부딘(telbivudine)), 다른 면역조절인자(예를 들면, 티모신 알파(Thymosin alpha), CYT107 또는 DV-601) 또는 HMG CoA 리덕타제 억제제(예를 들면, 심바스타틴(Simvastatin)).
제형은 복용량 형태의 단위로 알맞게 제시될 수 있으며, 약제학 분야에서 잘 알려진 방법으로 제조될 수 있다. 상기한 방법들에는 활성성분(본 발명의 화합물)과 하나 또는 그 이상의 부성분으로 구성된 캐리어와 함께 연합하는 단계를 포함한다. 일반적으로 제형은 액상 캐리어 또는 미세하게 분리된 고상 캐리어 또는 두 캐리어와 함께 상기 활성 성분을 균일하고 직접적으로 연합시키고, 필요하다면 상기 생성물을 성형시킴으로써 제조된다.
본 발명의 화합물은 일반적으로 활성성분을 포함하는 제약적 제형의 형태로, 선택적으로는 비독성 유기, 또는 무기, 산, 또는 염기, 부가염의 형태로, 제약적으로 허용가능한 복용 형태로서 경구를 통해 투입될 것이다. 투입 경로뿐만 아니라 치료해야 할 질병 및 환자에 따라서 조성물의 투입 복용량은 달라질 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 화합물은 정제, 캡슐제, 환제(ovules), 엘리서제(elixirs), 액제 또는 현탁액제의 형태로 경구, 구강내 또는 설하로 투여될 수 있는데, 즉시방출형(immediate-), 지연방출형(delayed-), 지효성(controlled-release) 응용을 위해 향료 또는 착색제를 포함할 수 있다.
상기한 정제는 미정질 셀루로오스, 락토스, 소듐사이트레트, 칼슘카보네이트, 이염기성 칼슘 포스페이트 및 글리신, 전분(바람직하게는 옥수수, 감자 또는 타피오카전분)과 같은 정제분해물질(disintegrants), 소듐스타치 글리콜레이트, 크로스카멜로오스 소듐 및 복합체 실리케이트, 및 폴리비닐피롤리돈과 같은 과립화 바인더(granulation binders), 하이드록시프로필메틸셀루로오스(MPMC), 하이드록시-프로필셀룰로오스(HPC), 수크로스, 젤라틴 및 아카시아와 같은 부형제를 포함할 수 있다. 또한 마그네슘 스테아레이트, 스테아린산, 글리세릴 베헤네이트 및 탈크와 같은 윤활제를 포함할 수 있다.
유사한 형태의 고상 조성물 또한 겔라틴 캡슐의 필러로서 사용될 수 있다. 이와 관련하여 바람직한 부형제는 락토오스, 전분, 셀룰로오스, 유당 또는 고분자량 폴리에틸렌글리콜를 포함한다. 수용성 서스펜젼 및/또는 엘리서제를 위해서 본 발명의 화합물은 다양한 감미료 또는 향미료, 색소 또는 염료와 함께, 유화제 및/또는 서스펜션화제와 함께 그리고 물, 에탄올, 프로필렌글리콜 및 글리세린 및 그 혼합물과 같은 희석제와 함께 혼합될 수 있다.
정제는 선택적으로 하나 또는 그 이상의 부성분과 함께 압축 또는 몰딩을 함으로써 제조될 수 있다. 압축된 정제는 선택적으로 바인더(예를 들면, 포비돈, 젤라틴, 하이드록시프로필메틸 셀룰로오스), 윤활제, 비활성 희석제, 방부제, 정제분해물질(예를 들면, 소듐스타치 글리콜레이트, 가교결합된 포비돈, 가교결합된 소듐 카복실메틸 셀룰로오스), 표면활성 또는 분산제와 함께 혼합한 분말 또는 과립과 같은 자유유동형의 활성성분을 적절한 기계에서 압축시킴으로써 제조될 수 있다.주형정(moulded tablets)은 비활성 액체 희석제와 함께 분말화된 가습 화합물의 혼합물을 적절한 기계에서 몰딩함으로써 제조될 수 있다. 정제는 선택적으로 코팅되거나 새길 수 있으며, 예를 들면 바람직한 방출 프로파일을 제공하기 위하여 하이드록시프로필메틸셀룰오로스의 비율을 변화시키는 등의 그 안의 활성성분의 느린 또는 조절된 방출을 제공하기 위하여 제형화될 수 있다.
경구 투여에 적절한 본 발명에 따른 제형은 각각 활성성분의 예정된 양을 포함하는 캡슐, 카세(cachets) 또는 정제와 같은 별개의 단위로; 분말 또는 과립의 형태로; 수용성 액체 또는 비수용성 액체에서의 액제 또는 현탁액; 또는 수중유(oil-in-water) 액체 에멀젼 또는 유중수(water-in-oil) 액체 에멀젼의 형태로 제시될 수 있다. 활성성분은 또한 볼루스(bolus), 연약(electuary) 또는 페이스트의 형태로 제시될 수 있다.
상기에서 특히 언급한 성분 이외에 본 발명의 제형은 논의가 되고 있는 제형의 형태에 관하여 본 분야에서 공지된 다른 제제를 포함할 수 있는데, 예를 들면, 경구 투여에 적절한 것으로는 향미료를 포함할 수 있다.
유리하게는 방부제 및 완충제와 같은 제제는 비히클 내에서 용해될 수 있다. 안정성을 증강시키기 위하여, 조성물은 바이알 내로 충진시키고 진공 상태에서 물을 제거한 후에 동결시킬 수 있다. 그리고 나서 감압하에서 동결건조된 분말을 바이알로 밀봉하고 주사용 물이 봉해진 바이알은 사용하기 전에 액체를 부어 원상태로 만들어서 공급할 수 있다.
본 발명의 화합물의 투입 복용량은 특정 화합물, 관련 질병, 대상 및 질병의 성질 및 가혹함 및 대상의 물리적인 조건, 선택된 투여 루트에 따라서 변경될 것이다. 적절한 복용량은 본 분야의 당업자에 의하여 용이하게 결정될 수 있다.
조성물은 투여방법에 따라서, 본 발명의 화합물의 0.1중량% 이상, 바람직하게는 5-60중량%, 보다 바람직하게는 10-30중량%를 포함할 수 있다.
본 발명의 화합물의 최적의 양 및 각 복용의 간격은 치료해야 할 조건의 성질 및 정도, 투여 루트 및 부위, 및 치료해야 할 특정 대상의 나이 및 상태에 따라 결정될 것이며, 사용되어야 적절한 복용량을 의사가 궁극적으로 결정할 것이라는 것은 본 분야의 당업자에 의하여 인식될 것이다. 이와 같은 용량 결정은 적절한 선에서 자주 반복될 수 있다. 만약에 부작용이 발생한다면, 복용량 및/또는 복용 횟수는 일반 임상 실습에 따라 변경되거나 줄일 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 다음을 포함할 수 있다:
- 약제학적으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 화합물;
- HCV 또는 HIV 감염과 같은 바이러스 감염(특히 RNA 바이러스 감염)의 치료용, 항염증용 또는 장기이식거부의 질병 예방용으로 약제학적으로 사용하기 위한 본 발명에 따른 화합물;
- 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 캐리어와 함께 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 약제학적 조성물;
- 제2 또는 후속 활성성분, 특히 HCV 또는 HIV 감염과 같은 바이러스 감염의 치료용, 항염증용 또는 장기이식 거부의 질병 예방용으로 바람직한 활성성분을 더욱 포함하는 제약적으로 허용가능한 희석제 또는 캐리어와 함께 본 발명에 따른 화합물을 포함하는 제약학적 조성물;
- 본 발명에 따른 화합물의 치료적으로 유효한 양을 대상에 투여하는 것을 포함하는, (특히 RNA 바이러스 감염) HCV 또는 HIV 감염과 같은 바이러스 감염의 치료, 항염증 또는 장기이식 거부의 질병 예방을 위한 치료방법;
- HCV 또는 HIV 감염과 같은 바이러스 감염의 치료용, 항염증용 또는 장기이식 거부의 질병 예방용으로 약제를 제조하는 본 발명에 따른 화합물의 용도
실시예
물질 및 방법
박테리아 균주 및 성장 조건
BIOT-4253 및 BIOT-4370 또는 BIOT-4585와 같은 그 유도체인 상글리페린 생성자 Streptomyces sp. A92-308110 (DSM no 9954, DSMZ Braunschweig, Germany에서 구입)을 28℃의 오트밀, MAM, ISP4 또는 ISP2의 배지(하기 참조)상에서 유지하였다.
BIOT-4585(구축방법론을 위한, 실시예 1 참조)를 28℃의 오트밀 아가 상에서 7-10일 동안 성장시켰다. 아가 플레이트의 표면의 포자를 20%w.v의 증류 멸균 글리세롤로 수집하여 0.5-ml씩 나누어서 -80℃에서 저장하였다. 동결된 포자 스톡을 시드 배지 SGS 또는 SM25-3에 접종하기 위하여 사용하였다. 200rpm 내지 300rpm, 5.0 또는 2.5cm throw로 27℃에서 24시간동안 교반하면서 접종된 시드 배지를 접종하였다. 발효배지 SGP-2 또는 BT6를 2.5%-10%의 시드 배양액에 접종하였으며, 200rpm 내지 300rpm, 5 또는 2.5cm throw로 24℃에서 4-5일동안 교반하면서 접종하였다. 그리고 나서 배양액을 추출하기 위하여 수확하였다.
메타
-티로신 유사체
(S)-메틸 2-아미노-3-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)프로파노에이트는 NetChem(USA)에서 구입하였다. (3-브로모-5-플루오로아니솔 (9-1)는 Accela ChemBio Co., Ltd., (Shanghai, China)에서 구입하였으며, 또한 Amfinecom Inc (USA) 또는 Apo;;p Scientific Ltd. (UK)에서도 구입할 수 있다. DL-5-플루오로-메타-티로신(9) 및 메틸 2-아미노-3-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)프로파노에이트(10))는 다음과 같이 합성하였다.
DL
-5-
플루오로
-
메타
-티로신 (9) 및
메틸
2-아미노-3-(3-
플루오로
-5-
하이드록시페닐
)
프로파노에이트
(10)
9-1(20g, 97.55mol)의테트라하이드로퓨란(100mL) 용액에 n-부틸 리튬(43mL, 2.5M, 107.3mmol)을 -78℃에서 침적하였다. 30분동안 교반시키고, 상기 온도에서 N,N-디메틸포름아미드(15.1mL, 195.1mmol)을 첨가하였다. 다시 30분동안 교반시키고 냉각조를 제거하였다. 1시간 후에 반응을 포화 암모늄 클로라이드 수용액으로 ?칭시켰다. 유기층을 물 및 포화 소듐클로라이드 수용액으로 세척시키고, 건조(소듐설페이트), 필터링 및 농축시켰다. 잔여물은 실리카 상에서 크로마토그래피를 실시하여 정제함으로써 9-2를 얻었다.
9-2(6g, 38.9mmol)의 건조 DCM(200mL) 용액에 BBr3(4M in DCM, 30ml, 116.8ml)을 -70℃에서 침적하였다. 추가한 후에 반응 혼합물을 -20℃에서 3시간동안 교반시키고 냉수를 조심스럽게 첨가하고, DCM으로 추출하였다. 유기층을 물 및 브라인으로 세척시키고, Na2SO4로 건조시키고, 필터링 및 농축시켰다. 잔여물은 실리카 상에서 크로마토그래피를 실시하여 정제함으로써 원하는 화합물 9-3을 얻었다.
메틸 2-(벤질옥시카보닐아미노)2-(디메톡시포스포릴)아세테이트 DCM(150mL) 용액에 DBU(42.6g, 28mmol)을 실온에서 침적하였다. 10분 후에, 9-3(1.95g, 14mmol)을 첨가하고, 결과 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반시켰다. 용액을 EtOAc(150mL)으로 희석시키고, 분리하고 유기층을 1N HCl로 세척시키고, Na2SO4로 건조시키고, 필터링 및 농축시켰다. 잔여물은 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피를 실시하여 정제함으로써 9-4를 얻었다.
9-4(1g)의 MeOH(20mL) 용액을 200mg의 10% Pd/C으로 정상기압에서 밤새도록 수소화시켰다. 필터링에 의하여 촉매를 제거한 후에, 용매를 증발시켜 10을 얻었다.
10(300mg, 1.4mmol)의 EtOH(30mL) 용액에 NaOH 수용액(2N, 4mL)을 첨가하고, 실온에서 30분 동안 반응물을 교반하였다. 용매를 제거하고 잔여물은 2N HCl로 pH=6로 중성화시키고, 필터링을 하여 생성된 흰 색의 촉매를 수집하여 타겟 화합물 9를 얻었다.
메틸
2-아미노-3-(3-
플루오로
-5-
하이드록시페닐
)
프로파노에이트
(10)의 다른 루트
(3,5-디플루오로브로모벤젠 (9a-1)는 Darui Fine Chemicals Co., Ltd. (Shanghai, China)에서 구입하였으며, Alfa Aesar 또는 Sigma Aldrich에서도 구입할 수 있다.)
9a-2의 제조
BnOH(1.61mL, 15.54mmol)의 DMF(30mL) 용액에 NaH(622mg, 60% 미네랄 오일 분산액, 15.54mmol)을 0℃에서 첨가하였다. 0.5시간동안 실온에서 교반시켜 깨끗한 용액을 얻었다. 9a-1(1.79mL, 15.54mmol)을 상기한 속도로 첨가하고 40℃ 미안의 온도를 유지하였다. 혼합물을 실온에서 밤새도록 교반하여 노란 색의 용액을 얻었다. 반응을 물로 ?칭시키고 석유에테르(35mLx4)로 추출하였다. 혼합 유기층을 농축시켰다. 잔여물은 석유에테르로 용출하면서 실리카겔 크로마토그래피를 실시하여 정제함으로써 무색의 오일 9a- 2(2.544g)를 얻었다.
9a-3의 제조
건조된 3개의 플라스크에 Mg(170.1mg, 7.10mmol), THF 무수물(10mL), 소량의 요오드를 질소하에서 첨가하였다. 9a-2(1.664g, 5.9192mmol) 1/3의 THF(2mL) 용액을 첨가하였다. 혼합물을 가열하여 환류시켰다. 이러는 동안에 노란 색의 혼합물을 점차로 밝은 색의 노란색으로 변하였다. 그리고 나서 남아 있는 9a-2의 2/3을 침적하고, 반응 혼합물을 다시 0.5시간동안 환류시켰다.
상기 혼합물에 DMF(0.504mL, 6.51mmol)를 0℃에서 천천히 첨가하였다. 0.5시간동안 실온에서 교반시키고 HCl(2M, 10mL)을 첨가하고, THF를 증발시켰다. 잔여물을 에틸아세테이트(25mLx3)으로 추출하였다. 그리고 나서 혼합 유기층을 브라인으로 세척하고 진공내에서 농축시켰다. 잔여물을 석유에테르/에틸 아세테이트=20/1로 용출하면서 실리카겔 크로마토그래피를 실시하여 정제함으로써 무색의 오일 9a-3(694g)를 얻었다.
9a-5의 제조
메틸 2-(벤질옥시카보닐아미노)2-(디메톡시포스포릴)아세테이트 DCM(150mL) 용액에 9a-4(993mg, 3.00mmol)의 DCM(30mL), DBU(832㎕, 5.57mmol)를 실온에서 첨가하였다. 10분 후에 9a-3(694mg, 3.01mmol)을 첨가하고, 결과 혼합물을 실온에서 1시간동안 교반시켰다. 용액을 HCl(1M, 10mL)으로 세척시키고, 혼합 유기층을 건조시키고진공내에서 농축시켰다. 잔여물을 (디클로로메탄/에틸 아세테이트 =10/1로 용출하면서) 실리카 상에서 플래시 크로마토그래피를 실시하여 정제함으로써 9a-5(1.11g)를 얻었다.
10의 제조
9a-5(100mg)의 MeOH(50mL) 용액을 20mg의 10% Pd/C으로 정상기압에서 2시간동안 수소화시켰다. 필터링에 의하여 촉매를 제거한 후에, 용매를 증발시켜 10(33mg)을 얻었다.
배지 제조법
배지를 제조하는 데에 사용된 물을 Millipore Elix Analytical Grade Water Purification System를 사용하여 준비하였다.
SGS 시드 배지
성분 (및 공급처) 제조법
---------------------------------------------------------------
글루코오스(Sigma, G7021) 7.50g
글리세롤(Fisher scientific, G/0651/25) 7.50g
이스트 추출물(Becton Dickinson, 212770) 1.35g
말트 추출물(Becton Dickinson, 218630) 3.75g
감자 전분(용해성)(Signma, S2004) 7.5g
NZ-아민 A(Sigma, C0626) 2.50g
토스트 콩가루, Nutrisoy (ADM, 063-160) 2.50g
L-아스파라긴(Sigma, A0884) 1.00g
CaCO3(Calcitec, V/40S) 0.05g
NaCl(Fisher scientific, S/3160/65) 0.05g
KH2PO4(Sigma, P3786) 0.25g
K2HPO4(Sigma, P5379) 0.50g
MgSO47H2O(Sigma, M7774) 0.10g
미량원소 용액 B 1.00mL
아가 1.00g
SAG471 Antifoam (GE Silicones, SAG471) *0.20mL
RO H2O 최종 부피까지 **1.00L
예비살균 pH를 10M NaOH/10 H2SO4으로 pH7.0으로 조정
121℃로 20-30분동안 가열하여 살균(오토클레이브)
Notes
* 시드 발효조에만 사용된 거품억제제, 시드 플라스크 아님
** 시드 부피를 차지하는 데에 따라서 최종 부피 조정됨
미량원소 용액 B
성분 제조법
----------------------------------------------------
FeSO4.7H2O (Sigma, F8633) 5 .00g
ZnSO4.7H2O (Sigma, Z0251) 4.00g
MnCl2.4H2O (Sigma, M8530) 2.00g
CuSO4.5H2O (Aldrich, 20,919-8) 0.20g
(NH4)6Mo7O24 (Fisher scientific, A/5720/48)0.20g
CoCl2.6H2O (Sigma, C2644) 0.10g
H3BO3 (Sigma, B6768) 0.10g
KI (Alfa Aesar, A12704) 0.05g
H2SO4 (95%) (Fluka, 84720) 1.00mL
RO H2O 최종 부피 되기까지 1.00L
SGP2 생산 배지
성분 제조법
______________________________________________________
토스트 콩가루 (Nutrisoy) (ADM, 063-160) 20.00g
글리세롤 (Fisher scientific, G/0650/25) 40.00g
MES 버퍼 (Acros, 172595000) 19.52g
SAG471 거품억제제 (GE Silicones, SAG471) *0.20mL
RO H2O 최종 부피까지 **1.00L
예비살균 pH를 10M NaOH/10 H2SO4으로 pH6.8로 조정
121℃로 20-30분동안 가열하여 살균(오토클레이브)
Notes
* 시드 발효조에만 사용된 거품억제제, 시드 플라스크 아님
** 시드 부피를 차지하는 데에 따라서 최종 부피 조정됨
SM25-3 배지(SM25라고도 함)
성분
글리세롤 (Fisher scientific, G/0650/25) 40g
소이 펩톤 A3 SC (Organotechnie) 10g
말트 추출물(Difco) 21g
최종 부피까지 1L
예비살균 pH 조정하지 않음(곧, pH 7.0)
ISP4 배지
성분
용해성 전분 (Difco) 10g
K2HPO4 1g
MgSO4 7H2O 1g
NaCl 1g
(NH4)2SO4 2g
CaCO3 2g
ISP 미량 염용액 1mL
아가 20g
최종 부피까지 1L
적은 부피의 냉수에서 전분으로 페이스트를 만들고 500ml 부피를 만듦
다른 성분을 500mls 수용액 II에 첨가, pH를 pH 7.0 내지 pH 7.4 (pH 7.3)로 되어야 함, 두 용액을 혼합하고 아가를 첨가
ISP 미량 염
성분
FeSO4.7H2O 1g
MnCl2.4H2O 1g
ZnSO4.7H2O 1g
최종 부피까지 1L
4℃에서 저장
오트밀 아가 (ISP3)
성분 제조법
---------------------------------------------------------
오트밀 20.22g
ISP 미량원소 용액 1.00mL
박토 아가(Becton Dicknson) 18.00g
RO H2O 최종 부피까지 1L
20g 오트밀을 1L의 물에 넣고 핫플레이트(또는 전자레인지)에서 20분동안 조리한다. 조리된 혼합물을 무슬린(muslin)/치즈클로스(cheesecloth)를 이용하여 필터링하고 pH 7.2로 되게 하고 1L로 다시 만든다. 1mL ISP 미량원소 용액을 첨가한다. 1L 아가당 18g를 첨가하고 살균한다.
MAM 아가
성분 제조법
-----------------------------------------------------------
밀 전분(Sigma) 10.00g
옥수수 침지 분말(Roquette) 2.50g
이스트 추출물(Becton Dickinson) 3.00g
CaCO3 (Calcitec) 3.00g
FeSO4 (Sigma) 0.300g
박토 아가(Becton Dickinson) 20.00g
RO H2O 최종 부피까지 1.00L
pH 5.8 후에 오토클레이브
BT6 생산 배지
성분 제조법
____________________________________________________________
글루코오스(Sigma) 50.00g
Nutrisoy (ADM) 30.00g
NaCl (Fisher) 5.00g
(NH4)2SO4 (Sigma) 3.00g
CaCO3 (Calcitec) 6.00g
RO H2O 최종 부피까지 1.00L
pH 7.0으로 조정한 후에 CaCO3 첨가
ISP2 아가
성분 제조법
_________________________________________________________
이스트 추출물(Becton Dickinson) 4.00g
말트 추출물(Becton Dickinson) 10.0g
텍스트로오스(Sigma) 4.00g
박토 아가(Becton Dickinson) 20.00g
RO H2O 최종 부피까지 1.00L
pH 7.3으로 조정한 후에 아가 첨가 및 살균
일반 발효법
BIOT-4585의 저온보존된 포자 스톡(구축방법론을 위한, 실시예 1 참조)을 실온에서 해동시켰다. 포자 스톡 4.0mL을 폼플러그를 포함한 2L 삼각플라스크의 배지 SM25 400mL에 이동하여 영양 배양(vegetative cultures, 시드 배양)을 준비하였다.
27℃, 250rpm (5.0cm throw)에서 48시간동안 배양을 실시하였다. 시드 배양액 25mL으로부터 폼플러그를 포함한 2L 삼각플라스크의 제조 배지 SGP2+5% HP20 250mL로 이동시켰다. 24℃ 및 250rpm (2.5cm throw)에서 24시간동안 배양한 후에, 1M 염산 내의 250mM 라세믹 또는 125mM 원하는 전구체의 거울상 이성질체적으로 순수한 용액 (예를 들면, (S)-메틸 2-아미노-3-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)프로파노에이트, DL-5-플루오로-메타-티로신 (9) 또는 메틸 2-아미노-3-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)프로파노에이트 (10)) 2mL 및 250mM DL-피페라진산(piperazic acid) 메탄올 용액 2mL를 각각 제조 플라스크에 첨가하여 전구체의 각 상 이성질체의 최종 농도가 1mM이 되게 하였다. DMSO는 선택적으로 1M 염산 대신에 사용할 수 있다. DL-피페라진산은 선택적으로 삭제할 수 있다. 4일 동안 24℃ 및 250rpm (2.5cm throw)에서 배양을 계속하였다.
LC
-
UV
및
LC
-
UV
-
MS
에 의한 배양
브로스의
분석
배양 브로스(1mL) 및 에틸 아세테이트(1mL)를 첨가하고 15-30분동안 혼합한 후에 10분 동안 원심분리하였다. 유기층 0.4mL를 수집, 증발하여 건조시키고 20mL의 아세트니트릴에서 재용해시켰다.
HPLC 조건:
C18 하이퍼클론 BDS C18 칼럼 3u, 4.6mm x 150mm
Phenomenex Analytical C18 보안 가드 카트리지 (KJ0-4282) 갖춤
칼럼 온도 50℃
유량 1mL/min
모니터 UV 240nm
20㎕씩 주입
용매 경사:
0min: 55% B
1.0min: 55% B
6.5min: 100% B
10.0min: 100% B
10.05min: 55% B
13.0min: 55% B
용매 A는 물 + 0.1% 포름산
용매 B는 아세토니트릴 + 0.1% 포름산
이 조건에서 SfA를 5.5분 용출
이 조건에서 SfB를 6.5분 용출
Bruker Daltonics Esquire 3000 + 크로마토그래피 및 상기 기재된 용매를 사용하여 양성 이온 모드(positive ion mode)로 작동하는 전기분무 질량 스펙트로미터(electrospray mass spectrometer)를 조합한 통합 Agilent HP1100 HPLC 시스템에서 LCMS를 실시한다.
OC
LC
-
MS
방법
HPLC 조건:
C18 하이퍼클론 BDS C18 칼럼 3u, 4.6mm x 150mm
Phenomenex Analytical C18 보안 가드 카트리지 (KJ0-4282) 갖춤
칼럼 온도 50℃
유량 1mL/min
모니터 UV 210, 240 및 254nm
용매 경사:
0min: 10% B
2.0min: 10% B
15min: 100% B
17min: 100% B
17.05min: 10% B
20min: 10% B
용매 A는 물 + 0.1% 포름산
용매 B는아세토니트릴 + 0.1% 포름산
MS 조건:
MS는 스위칭 모드(양성 및 음성 사이에서 스위칭)에서 150와 1500amu 사이에서스캐닝하면서 작동한다.
X-선 분말
회절
(
XRPD
) 방법
약 2mg의 시료를 비스듬하게 자른 실리카 시료 홀더의 XRPD 제로 백그라운드 싱글 상에서 부드럽게 압축시켰다. 그리고 나서 시료를 Philips X-pert MPD 회절분석기에 놓고 다름 실험 조건에서 분석하였다:
튜브 음극: Cu
생성기 장력: 40kV
튜브 전류: 40mA
파장 알파1: 1.5406A
파장 알파2: 1.5444A
시작각 [2theta]: 5
종료각 [2theta]: 50
연속 스캔
HCV
항바이러스 활성의 평가를 위한
생체외
리플리콘
에세이
유전자형 1HCV에 대한 항바이러스 효능을 다음과 같이 시험할 수 있다: 시험 대상 물질을 첨가하기 하루 전에 HCV 유전자형 1b 1389luc-ubi-neo/NS3-3'/5.1리플리콘을 포함하는 Huh5.2 cells (Vrolijk et al., 2003)를 세포 성장 배지[DMEM (Cat No. 41965039), 10% FCS, 1% 비 필수아미노산(11140035), 1% 페니실린/스트렙토마이신(15140148) 및 2% 제네티신(10131027)으로 보충; Invitrogen]에서 1.3-1.4의 비율로 계대배양하고 75cm2 조직 배양 플라스크(Techno Plastic Products)에서 3-4일동안 성장시키고, 에세이 배지(DMEM, 10% FCS, 1% 비-필수아미노산, 1% 페니실린/스트렙토마이신)에서 6500cells/well (100㎕/well)의 밀도로 96-well 조직배양 마이크로타이터 플레이트(항-신진대사 효과의 평가를 위한 Falcon, Beckton Dickinson 및 항바이러스 효과를 위한 CulturPlate, Perkin Elmer)에서 수확 및 시딩하였다. 마이크로타이터 플레이트를 밤새도록 접종하였다(37℃, 5% CO2, 95-99%, 상대습도), 비융합성 세포 단분자층을 생산하였다.
희석 계열을 준비하고, 각 희석 계열을 최소한 복사본에서 실시하였다. 에세이 셋업 후에 마이크로타이터 플레이트를 72시간동안 배양하였다(37℃, 5% CO2, 95-99% 상대습도).
항-신진대상 효과를 측정하기 위하여, 에세이 배지를 흡입시키고, 페놀 레드-프리 배지 내의 5% MTS (Promega) 용액 75㎕으로 대체시키고, 1.5시간동안 배양하였다(37℃, 5% CO2, 95-99% 상대습도). 498nm의 파장에서 흡광도를 측정하고(Safire2, Tecan), 광학밀도(OD values)를 비처리한 대조군의 퍼센트로 변환하였다.
항바이러스 효과를 측정하기 위하여, 에세이 배지를 흡입시키고, 세포 단분자층을 PBS로 세척하였다. 세척 버퍼를 흡입시키고, 5분동안 실온에서 용균(lysis)이 이루어지도록 한 후에, 25㎕의 Glo Lysis 버퍼(Cat. N0, E2661, Promega)를 첨가하였다. 그 후에, 50㎕의 루시퍼라제 에세이 시스템(Luciferase Assay System, Cat. N0, E1501, Promega)를 첨가하고, 루시퍼라제 루미네선스 신호를 즉시 정량하였다(1000ms 통합 시간/well, Safire2, Tecan).상대 루미네선스 단위를 미처리된 대조군의 퍼센트로 변환하였다.
EC50 및 EC90 (복용량-반응 곡선에서 유래한 값)은 바이러스 복제의 50% 및 90%가 각각 관찰되는 농도를 나타낸다. CC50 (복용량-반응 곡선에서 유래한 값)은 세포의 신진대사 활성이 미처리된 대조군의 신진대사 활성의 50%로 감소되는 농도를 나타낸다. 화합물의 치료의 창을 나타내는 선택도(SI)는 CC50/EC50으로 계산된다.
그 특정한 농도에서 항-리플리콘 효과가 70% 한계값을 초과하고 신진대사 활성이 기껏해야 30%의 감소가 관찰될 때, 화합물의 농도는 HCV 복제 시스템의 진짜 항바이러스 효과를 끌어내는 것으로 간주된다.
유전자형 1a 및 2a에서
HCV
항바이러스 활성의 평가를 위한
생체외
리플리콘
에세이
리플리콘 세포(유전자형 1a(H77) 및 2a(JFH-1)의 서브게노믹 리플리콘)를 둘베코의 변형 필수 배지(DMEM), 10% 소태아혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신(pen-strep), 1% 글루타민, 1% 비-필수아미노산, 250㎕/ml G418 그리고 37℃의 5% CO2 인큐베이터에서 성장시켰다. 모든 세포 배양 시약은 Mediatech (Herndon, VA)로부터 구입할 수 있다.
리플리콘 세포를 트립신으로 처리하고 G418이 없는 상기 배지의 96-well 플레이트에서 웰 당 5x103cells로 시딩하였다. 다음 날에 5% FBS의 존재하에 순차적으로 희석시킨 화합물을 포함하는 DMEM으로 배양 배지를 대체하였다. HCV 리프리콘 항바이러스 에세이는 연속 화합물 희석에서의 화합물의 효과를 검사하였다. 간단하게 말하자면, HCV 리플리콘을 포함하는 세포를 96-well 플레이트 내로 시딩하였다. 검사 대상을 DMEM과 5% PBS로 연속으로 희석시켰다. 희석된 화합물을 플레이트 내의 적절한 웰로 적용하였다. 37℃에서 72시간동안 인큐베이션한 후에 세포를 프로세싱하였다. 각 웰의 세포내 RNA를 RNeasy 96키트(Quagen)로 추출하였다. 이전에 기술된 대로(Vrolijk et al., 2003), TaqMan® 원스텝 RT-PCR 마스터 믹스 시약(Applied Biosystems, Foster City, CA) 및 ABI Prism 7900 서열 감지 시스템(Applied Biosystems)을 사용한 역전사효소-리얼 타임 PCR 에세이에 의하여 HCV RNA의 수준을 결정하였다. TaqMan® 리보좀 RNA 컨트롤 시약(Applied Biosystems)을 가지고 세포수로 표시하여 세포독성 효과를 측정하였다. 그리고 나서 적용가능한 IC50 값(리플리콘 복제를 50% 억제하는 농도)을 얻기 위하여 HCV RNA 및 리보좀 RNA의 양을 사용하였다.
마이크로솜
신진대사의 평가(
마이크로솜
안정성 에세이)
마이크로솜의 신진대사율을 다음과 같이 테스트하였다:
마우스 또는 인간 간 마이크로솜을 버퍼 C (0.1M 포타슘 포스페이트 버퍼, 1.0mM EDTA, pH 7.4)로 2.5mg/mL의 농도로 희석시켰다. 그리고 나서 50㎕의 5μM 화합물 스파이킹 용액(9.5㎕ACN 내의 0.5㎕ 10mM DMSO 스톡 용액, 990㎕ 버퍼 C 첨가)을 마이크로솜 용액 50㎕(2.5mg/mL), 110㎕ 버퍼 C에 첨가하고 잘 혼합하여 마이크로솜 안정성 시료를 준비하였다. 모든 시료를 37℃에서 약 15분 동안 예비 인큐베이션시켰다. 그 후에, 40㎕의 NADPH 용액(12.5mM)을 부드럽게 혼합하면서 첨가하여 반응을 개시하였다. 분취량(40㎕)을 0, 15, 30, 45 alc 60분에서 제거하고, 내부 기준(120㎕)을 포함하는 ACN으로 ?칭하였다. 단백질을 원심분리(4000rpm, 15분)하여 제거하였으며, LC-MS/MS에 의하여 시료 플레이트의 화합물 농도를 분석하였다. 그리고 나서 반감기를 표준 방법으로 계산하여 원래 존재했던 양과 분석액의 농도를 비교하였다.
간세포 안정성의 평가
액체 질소에서 이전에 저장되고 저온보존된 간세포를 37±1℃의 교반수조 내에서 2분±15초동안 방치한다. 그리고 나서 미리 데운 Krebs-Henseleit 바이카보네이트(KHB) 버퍼(2000mg/L 글루코오스, 칼슘 카보네이트 및 소듐 바이카보네이트 없음, Sigma)의 10X 부피에 간세포를 첨가하고, 부드럽게 혼합한 후에 500rpm에서 3분동안 원심분리한다. 원심분리한 후에, 상층액을 조심스럽게 제거하고 미리 데운 KHB 버퍼 10X 부피를 첨가하고 세포 펠렛을 다시 서스펜션시킨다. 이를 조심스럽게 혼합하고, 500rpm에서 3분동안 원심분리한다. 그리고 나서 상층액을 제거하고 버린다. 세포 생존능력 및 수득률을 세포수로 결정하였으며, 이들 수치는 적절한 시딩 밀도에 대한 인간 간세포 서스펜션(생균밀도=2x106cells/mL)을 생성하기 위하여 사용한다. 2X 투약 용액을 미리 데운 KHB(1% DMSO)(200μM 스파이킹 용액; 980㎕의 DMSO 내의 20㎕의 기질 스톡 용액(10mM), 2X 투약 용액: 990㎕의 KHB 내의 200μM의 스파이킹 용액 10㎕ (희석한 후에 2μM))에서 준비한다.
미리 데운 2X 투약 용액 50㎕를 웰에 첨가하고, 미리 데운 간세포 용액(2x106cells/mL) 50㎕를 첨가하고 시간을 정해 시작한다. 그리고 나서 플레이트를 37℃에서 인큐베이션시킨다. 인큐베이션 시간(0, 15, 30, 60 및 120분)을 완료한 후에 웰에 내부표준을 포함하는 아세토니트릴 100㎕를 각각 첨가하고 부드럽게 혼합한 후에 미리 데운 간세포 용액 50㎕를 첨가한다(2x106cells/mL). 인큐베이션의 종료시에, 세포 생존능력을 결정한다. 시료를 4000rpm에서 15분 동안 4℃에서 원심분리시키고, 상층액을 초고순도 물로 2배 희석시켰으며, 화합물 수준을 LC-MS/MS로 분석한다.
물에 대한 용해도의 평가
물에 대한 용해도를 다음과 같이 테스트할 수 있다: 실온에서 100% DMSO에서 상글리페린 유사체의 10mM 스톡 용액을 준비하였다. 엠버 바이알 내의 0.1M PBS, pH 7.3 용액 또7는 100% DMSO 중 하나로 3중의 0.01mL의 분취량을 0.5mL로 만들었다. 실온에서 IKA® vibrax VXR 쉐이커에서 6시간동안 결과물 0.2mM 용액을 쉐이킹하고 결과 용액 또는 서스펜션을 2mL의 에펜도르프 튜브내로 이동시키고 30분동안 13200rpm에서 원심분리시켰다. 상층액의 유체의 분취액을 상기에 기재된 LCMS 방법으로 분석하였다.
선택적으로 pH 7.4의 PBS의 용해도는 다음과 같이 테스트하였다: 테스트 화합물 및 대조군 화합물을 40μM, 16μM, 4μM, 1.6μM, 0.4μM, 0.16μM, 0.04μM 및 0.002μM으로 H2O 내의 50% MeOH를 사용하여 희석시킴으로써 보정곡선을 생성하였다. 그리고 나서 표준점은 MeOH:PBS 1:1 내에서 1:20으로 더욱 희석시켰다. 그리고 나서 표준시약을 동일한 부피(1:1)의 내부표준(하이드록시매크로사이클, 6)을 포함하는 CAN과 혼합하였다. 시료를 원심분리(5분, 12000rpm)시키고 나서 LC/MS 분석하였다.
용액 (μL) |
MeOH/H2O (1:1) (μL) |
워킹용액 (μM) |
용액 (μL) |
MeOH:버퍼 (1:1) (μL) |
최종 용액 (μM) |
|||
10mM | 10 | 240 | → | 400 | ||||
400μM | 50 | 150 | → | 40 | 20 | 380 | → | 2000 |
20 | 180 | → | 16 | 20 | 380 | → | 800 | |
40μM | 50 | 450 | → | 4 | 20 | 380 | → | 200 |
16μM | 50 | 450 | → | 1.6 | 20 | 380 | → | 80 |
4μM | 50 | 450 | → | 0.4 | 20 | 380 | → | 20 |
1.6μM | 50 | 450 | → | 0.16 | 20 | 380 | → | 8 |
0.4μM | 50 | 450 | → | 0.04 | 20 | 380 | → | 2 |
0.04μM | 50 | 950 | → | 0.002 | 20 | 380 | → | 1 |
10mM 농도의 스톡 DMSO 용액으로서 테스트 화합물을 준비한다. 스톡 용액을 1.5mL 에펜도르프 튜브 안의 PBS, pH 7.4 내로 이중으로 희석시켜 1%의 DMSO 최종 농도의 100μM의 타겟 농도가 되게 하였다(예를 들면, 4㎕의 10mM DMSO 스톡 용액을 396㎕의 100mM 포스페이트 버퍼로 함). 그리고 나서 시료 튜브를 4시간 동안 실온에서 쉐이킹시킨다. 시료를 원심분리시켜(10분, 15000rpm), 용해되지 않은 입자를 침전시킨다. 상층액을 새로운 튜브로 이동시키고 PSB로 희석시킨다(응용 분석 기구 상에 화합물의 신호 수준으로서 개별의 검사 대상에 대한 희석 인자를 확인한다.). 그리고 나서 희석된 시료를 동일한 부피(1:1)의 MeOH와 혼합한다. 최종적으로 시료를 LC-MS/MS 분석을 위하여 내부표준(하이드록시매크로사이클, 6)을 포함하는 ACN의 동일한 부피(1:1)와 혼합하였다.
세포 투과성의 평가
세포 투과성을 다음과 같이 테스트할 수 있다: 테스트 화합물을 DMSO에서 10mM으로 용해시키고 나서 버퍼에서 더욱 희석시켜 최종 10μM의 투입 농도가 되도록 한다. 형광 마커 루시퍼 엘로우 또한 멤브레인 보전을 모니터하기 위하여 포함한다. 테스트 화합물을 Caco-2- 세포 단분자막의 선단 표면에 적용시키고 기저측 구획내로의 화합물 침투를 측정한다. 이는 역방향(기저측->정단)으로 실시하여 활성수송을 검사한다. 테스트 및 표준 대조군 화합물 모두의 수준을 정량하는 데에 LC-MS/MS를 사용한다(Propanolol 및 Acebutolot과 같은).
약물동태학의
생체내평가
화합물의 생물학적 가용능을 측정하기 위하여 생체내 에세이를 사용할 수도 있다. 일반적으로 화합물을 테스트 동물(예를 들면, 마우스 또는 랫)에 정맥주사(i.v.)로 그리고 경구(p.o.)로 투입하고 혈액 시료를 일정한 간격으로 채취하여 약제의 플라즈마 농도가 시간에 대하여 어떻게 변하는지를 검사한다. 표준 모델을 사용한 퍼센트로서 화합물의 절대 생물학적 가용능을 계산하는 데에 플라즈마 농도의 시간에 따른 시간경과를 사용할 수 있다.
본 발명의 화합물 또는 모화합물의 1, 10 또는 100mg/kg를 i.v. 또는 p.o.로 마우스에 투여한다. 혈액 시표를 5, 10, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 420 및 2880분에 채취하고 시료 내의 본 발명의 화합물 또는 모화합물의 농도는 PHLC로 결정한다. 플라즈마 농도-시간 곡선(AUC-체순환(systemic circulation)에 도달하는 변하지 않은 약제의 총량에 직접 비례하는)에서의 면적, 최대 (피크) 플라즈마 약제 농도, 최대 플라즈마 약제 농도가 발생하는 시간(피크타임)과 같은 중요한 파라미터를 얻는 데에 플라즈마 농도의 시간-경과를 사용하며 생물학적 가용능을 정확하게 결정하는 데에 사용하는 추가의 인자는 하기를 포함한다: 화합물의 최후 반감기, 총 바디 클리어런스(body clearance), 정상상태의 분포 부피 및 F%. 그리고 나서 비-구획성 또는 구획성 방법으로 이들 파라미터를 분석하여 생물학적 가용능 퍼센트의 계산치를 구한다. 이 방법의 유형의 예를 들면, Egorin et al., 2002 및 참조문헌.
경구 및
정맥내
약물동태학의
생체내
평가(특정 방법)
상글리페린 유사체에 대하여 전체 혈액을 분석한다. p.o. 및 i.v. 투여를 위하여 화합물을 5% 에탄올/5% 크레모포르 EL/90% 살라인에서 제형화한다. 3마리의 수컷 CD1 마우스 그룹에 1mg/kg i.v. 또는 5 또는 10mg/kg p.o. 중 하나로 투여한다. 혈액 시료(40㎕)를 복재정맥(saphenous vein)에서 예비-투여 및 0.25, 0.5, 2, 8 및 24시간 후에 채취하고 dH2O의 동량으로 희석시키고 즉시 건조 얼음 상에 방치한다. 분석할 때까지 시료를 -70℃에서 저장한다. 시료 내의 본 발명의 화합물 또는 모화합물의 농도를 다음과 같이 LCMS를 이용하여 결정한다: 20㎕의 혈액:H2O(1:1, v/v)/PK 시료를 100ng/mL의 내부표준(하이드록시매크로사이클, 6) 20㎕, 20㎕의 워킹용액/MeOH 및 150㎕의 ACN에 첨가하고, 1500rpm에서 1분동안 볼텍싱하고 12000rpm에서 5분동안 원심분리한다. 그리고 나서 상층액을 LC-MS/MS내로 주입한다. 혈액 농도의 시간 경과의 그래프를 그리고 전혈 농도-시간 곡선에서의 면적(AUC-체순환(systemic circulation)에 도달하는 변하지 않은 약제의 총량에 직접 비례)을 얻는데 사용한다. 이들 값은 가능한 PK 파라미터를 생성하는 데에 사용한다.
세포독성의
세포외
평가
ATCC로부터 얻은 Huh-7 및 HepG2 세포를 10% 소태아혈청(FBS), 1% 페니실린-스트렙토마이신(pen-strep), 1% 글루타민을 포함하는 둘베코 변형 필수 배지(DMEM)에서 성장시키는데, 반면에 CEM 세포(ATCC에서 얻은 인간 T-세포 백혈병 세포)을 10% FBS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 1% 글라타민을 함유한 RPMI 1640 배지에서 성장시킨다. 신선한 인간 PBMCs를 적어도 2개의 정상 스크리닝된 도우너로부터 얻은 전혈로부터 분리한다. 간단하게 말하자면, 말초혈 세포를 저속 원심분리에 의하여 2-3회 펠렛화/세척시키고 PBS에서 댜시 서스펜션화시켜 오염 펠렛을 제거한다. 그리고 나서 세척된 혈액 세포를 둘베코 인산 완충 식염수(D-PBS)으로 1:1:로 희석시키고 50mL의 원심분리 튜브 내의 14mL의 림프구 분리 배지(Lymphocyte Separation Medium, LSM: cellgrow by Mediatech, Inc.; 밀도 1.078+/-0.002g/ml; Cat.# 85-072-CL) 위에 적층시키고 600Xg에서 30분동안 원심분리시킨다. 줄모양의 PBMCs를 결과 계면으로부터 부드럽게 흡입시키고, 이어 저속 원심분리에 의하여 PBS X2로 세척한다. 최종 세척 후에 트립판 블루 배제법(trypan blue exclusion)을 이용하여 세포의 수를 세고 15% 소태야혈청(FBS), 2mM L-글루타민, 4μg/mL PHA-P으로 보충된 RPMI 1640에서 1x107cells/mL에서 다시 서스펜션화시킨다. 세포를 37℃에서 48-72시간동안 인큐베이션시킨다. 인큐제이션 후에 PBMSs를 원심분리시키고 15% FBS, 2mM L-글루타민, 10U/mL 페니실린, 100μg/mL 스트렙토마이신, 10μg/mL 젠타마이신, 및 20U/mL 재조합 인간 IL-2를 함유한 RPMI 1640에서 다시 서스펜션화시킨다.
상기에 기재된 세포에 대한 각 화합물의 하프-로그 농도를 3중으로 테스트함으로써 화합물 세포독성을 평가한다. 배지 함유 세포 단독을 세포 대조군(CC)으로 하였다. Huh-7 및 HepG2 세포를 96-well 플레이트에서 세포당 5 x 103cells의 농도로 시딩한다. 다음날, 배지를 흡입시키고 5% FBS 함유 대응 배지 100㎕를 첨가한다. 테스트 약제 희석액을 마이크로타이터 튜브에서 2X 농도로 준비시키고 각 농도의 100㎕를 표준포맷의 적절한 웰에 둔다. 72시간 후에 세포독성 평가를 위해 세포를 프로세싱한다.
신선한 배지에서 PBMCs를 희석시키고 100L의 부피의 5 x 104cells/well의 96 웰 둥근 바닥 마이크로플레이트의 내부 웰 내에 플레이팅한다. 이와 유사하게 CEM 세포를 1 x 104cells/well로 플레이팅한다. 그리고 나서 테승트 약제의 2X 제조액의 100㎕를 표준포맷의 적절한 웰에 첨가한다. 배양액을 6일 내지 7일 동안 유지하고 세포독성 결정을 위해 프로세싱한다.
CytoTox-ONETM 동질적 멤브레인 통합 에세이 키트(homogeneous membrane integrity assay kit, Promega)를 사용하여 세포독성을 결정한다. 상기 에세이는 형광검출, 동질적 포맷의 손상 멤브레인을 포함한 세포로부터 락테이트 디하이드로게나제(lactate dehydrogenase, LDH)의 방출을 측정한다. 레자주린이 형광 레조루핀(resorufin) 생성물로 변환하는 결과를 보이는 커플링된 효소 에세이로서 세포 배지내로 방출되는 LDH를 측정한다. 형광 생성물의 양은 용해된 세포수에 비례한다. 6개의 순차적으로 희석된 농도의 각 화합물을 세포로 적용하여 적용가능한 TC50(세포 생존능을 50% 감소시키는 약제의 독성 농도) 및 TC90(세포 생존능을 90% 감소시키는 약제의 독성 농도) 값을 구한다.
MDR1
및
MDR2
운반체의 억제의
생체외
평가
MDR1 (P-당단백질 1) 및 MRP2 운반체의 억제 및 활성화를 평가하기 위하여, Solvo Biotechnology Inc.의 생체외 ATPase 에세이를 사용할 수 있다(Glavinas et al., 2003). 바나듐산염이 없을 경우 및 존재할 경우 모두에서의 잠재적인 ATPase 활성을 연구하기 위하여 (0.1, 1, 10 및 100μM의) 화합물을 MDR1 또는 MRP2 멤브레인 소포와 함께 인큐베이션한다. 또한 운반체 ATPase 활성의 가능한 억제를 감지하기 위하여 유사한 인큐베이션을 베라파밀/설파살라진(verapamil/sulfasalazine)의 존재하에 실시한다. 무기 포스페이트를 분광측광학적으로 정량함으로써 ATPase 활성을 측정한다. ATPase 활성 내의 바나듐산염 민감도 증가량으로부터 활성을 계산한다. 베라파밀/설파살라진 중재 ATPase 활성의 감소량에 의하여 억제량을 결정한다.
MDCK
세포를 사용한
Pgp
운반체의 억제의
생체외
평가
P-당단백질(Pgp/MDR1) 운반체의 억제를 평가하기 위하여, Cyprotex의 생체외 ATPase 에세이를 사용하였다. NIH(Rockvile, MD, USA)로부터 얻은 MDR1-MDCK 세포를 사용하였다. 배양 후에 기저측 및 선단 표면 모두를 pH 7.4 및 37℃의 버퍼로 2회 세척함으로써 단분자막을 준비하였다. 생리학적 파라미터를 안정화시키기 위하여 37℃, 5% CO2, 95%의 상대습도의 기저측 및 선단 구획 모두에서 세포를 pH 7.4의 버퍼와 함께 인큐베이션시켰다. 선단에서 기저측으로의 연구(A-B)를 위하여 pH 7.4의 버퍼를 선단 구획에서 제거하고 로페라미드(loperamide) 투약 용액으로 교체하고 '동반' 플레이트('companion' plates) 내에 방치하였다. 로페라미드의 최종 농도를 5μM이 되도록 DMSO 내의 로페라미드를 버퍼로 희석시킴으로써 용액을 준비하였다(DMSO의 최종 농도를 1%로 조절함). 또한 형광 통합 마커 루시퍼 옐로우를 투약 용액에 포함시켰다. 테스트 화합물이 존재하는 경우와 존재하지 않는 경우에서 실험을 실시하였다(선단 및 기저측 구획 모두에 적용). 기저측에서 선단으로의 연구(B-A)를 위하여, P-당단백질 기질, 로페라미드(최종 농도=5μM)를 기저측 구획 내에 두었다. 테스트 화합물이 존재하는 경우와 존재하지 않는 경우에서 실험을 실시하였다(선단 및 기저측 구획 모두에 적용). 5% CO2, 95%의 상대습도 및 37℃의 분위기에서 60분 동안 인큐베이션을 실시하였다. 인큐베이션 후에, 동반 플레이트를 제거하고 선단 및 기저측 시료를 LC-MS/MS 분석을 위하여 희석시켰다. 각 테스트 화합물의 농도의 단일 결정을 실시하였다. 각 플레이트 상에서, 양성 대조군 억제자 또한 스크리닝하였다. 테스트 화합물을 0.1, 0.3, 1.3, 10, 30 및 50μM에서 평가하였다. 형광측정 분석을 이용한 루시퍼 옐로우 투과성을 모니터함으로써 실험을 통한 단분자막의 통합을 체크하였다. 분석한 후에 IC50를 계산하였다(곧, 반최대 억제 효과(half maximal inhibition effect)를 달성하는 억제자 농도(테스트 약제)).
섭취 운반체(
uptake
transporters
)의
생체외
억제 평가
OAT1B1 및 OAT1B3 섭취 운반체의 억제를 평가하기 위하여 Solvo Biotechnology의 생체외 섭취 운반체 에세이를 사용하였다. 인간 SLC 운반체 OATP1B1 및 OATP1B3을 안정하에 발현하는 CHO 세포 상에서 0.068, 0.2, 0.62, 1.8, 5.5, 16.7 및 50μM의 테스트 대상(Test Article, TA)의 섭취 실험을 실시하였다. 부모 세포주 ChO-K를 음성 대조군으로 사용하였다. 세포(200㎕의1 x 105, 둘베코 변형 이글 배지 및 Ham? F-12 DMEM(F-12, Lonza, New Jersey, US)의 1:1 혼합물이 5mM 소듐 부티레이트에 보충됨)를 표준 96-well 조직 배양 플레이트 상에 플레이팅하고 24시간 동안 인큐베이션한 후에 5% CO2 및 95% 공기의 분위기 및 37℃에서 실험을 실시하였다. 실험을 실시하기 전에 배지를 진공 석션으로 흡입시키고, pH 7.3 크렙스-헨젤라이트 버퍼(Krebs-Henseleit buffer, Sigma chemicals, Sigma-Aldrich, ST Louis, MO으로부터 준비됨)의 2 x 100㎕로 세포를 세척하였다. 프로브 기질 및 TA 또는 용매를 함유하는 37℃의 크렙스-헨젤라이트 버퍼(pH 7.3) 50㎕에서 섭취 실험을 각각 실시하였다. 유기 용매 농도는 각 웰에서 같았으며, 1% v/v를 넘지 않았다. OATP1B1 에세이의 프로브 기질은 E3S (0.1μM)이었으며, OOA1B3 에세이의 프로브 기질은 Fluo-3 (10μM)이었다. 프로브 기질의 전위시킨(translocated) 양을 각 웰에서 cpm으로 결정하였다. 상대 활성을 하기 식에 의하여 계산하였다.
활성% = (A-B)/(C-D)x100
상기 식에서 A=트랜스펙션된 세포 상에서 TA의 존재하에 전위된 기질의 양
B=부모 세포 상에서 TA의 존재하에 전위된 기질의 양
C=트랜스펙션된 세포 상에서 용매의 존재하에 전위된 기질의 양
D=부모 세포 상에서 용매의 존재하에 전위된 기질의 양
IC50는 프로브 기질의 운반을 50%로 억제할 때 필요한 TA의 농도로 정의되었다. IC50는 3개의 매개변수를 가진 로지스틱 방정식; 상대 활성 대 TA 농도로 비선형회귀에 의하여 그려진 곡선으로부터 구하였다.
유출 운반체(
efflux
transporters
)의
생체외
억제 평가
MRP2, MRP3 및 BSEP 유출 운반체의 억제를 평가하기 위하여, Solvo Biotechnology Inc.의 생체외 소포 운반체(vesicular transporter) 에세이를 사용하였다. 운반체 중재 섭취 및 소포 내로 TA의 수동확산을 구별하기 위하여 4mM ATP의 부존재 및 존재할 경우 모두에서 (0.068, 0.2, 0.62, 1.8, 5.5, 16.7 및 50μM의) 테스트 대상(TAs)을 유출 운반체 멤브레인 소포(Solvo Biotechnology Inc.)와 함께 인큐베이션시켰다. 2mM 글루타티온의 존재하에서 MRP2 및 MRP3 운반체 반응을 실시하였다.
37℃에서 10분 동안 반응 혼합물을 예비 인큐베이션시켰다. 12mM MgATP 25㎕ (에세이에서 4mM 최종 농도) 또는 백그라운드 대조군을 위한 에세이 버퍼를 첨가함으로써 반응을 시작하였다. 냉각된 세척 버퍼 200㎕를 첨가함으로써 반응을 중지시키고 즉시 96-well 포맷(필터 플레이트) 내의 글래스 화이버 필터 상에서 필터시켰다.
세척하고 건조된 필터 플레이트에 신틸레이션 버퍼를 첨가하고 나서 신틸레이션을 카운트하였다. BSEP 소포의 프로브 기질은 타우로산염(2μM)이고, MRP2 및 MRP3 소포의 프로브 기질은 E217βG(1μM)이었다.
프로브 기질의 전위시킨(translocated) 양을 모든 웰에서 cpm으로 결정하였다. 상대 활성을 하기 식에 의하여 계산하였다.
활성% = (A-B)/(C-D)x100
상기 식에서 A=TA 및 ATP의 존재하에 전위된 기질의 양
B=TA의 존재하에 전위된 기질의 양
C=용매 및 ATP의 존재하에 전위된 기질의 양
D=용매의 존재하에 전위된 기질의 양
IC50는 프로브 기질의 운반을 50%로 억제할 때 필요한 TA의 농도로 정의되었다. IC50는 3개의 매개변수를 가진 로지스틱 방정식; 상대 활성 대 TA 농도로 비선형회귀에 의하여 그려진 곡선으로부터 구하였다.
HIV
항바이러스 활성의 평가를 위한
생체외
에세이
HIV에 대한 항바이러스 효능을 다음과 같이 테스트할 수 있다: 혈액 유래 CD4+ T- 림프구 및 매크로파지(macrophage)를 이전에 기재한 대로 분리한다(Bobardt et al., 2008). 간단하게 말하자면, 항-CD4 Dynabeads의 양성 선택 및 Detachabead를 사용한 연속 방출에 의하여 인간 PBMCs를 신선한 혈액으로부터 정제하였다. 10% FCS, MEM 아미노산, L-글루타민, MEM 비타민, 소듐 피루베이트 및 페니실린에 더하여 스트렙토마이신으로 보충된 RPMI 배지 1640 (Invitrogen)에서 세포를 배양하고 이어서 박테리아 슈퍼항원 스타필로코커스 성장독소 B(bacterial superantigen staphylococcal enterotoxin B, SEB: 100ng/ml) 및 다른 도우너로부터 미토마이신 C-사멸시킨 PBMC(10:1 PBMC:CD4 세포비)로 활성화시켰다. 자극을 준 3일 후에, IL-2(200units/ml 최종 농도)를 포함하는 배지에서 세포를 1:2로 나누었다. 그리고 나서 2일마다 IL-2 배지에서 1:2로 배양액을 나누고, 자극을 준 7일 후에 HIV로 감염시켰다. 1차 인간 매크로파지를 생성하기 위하여, 음성 선택에 의하여 인간 PBMCs로부터 단핵구(monocytes)를 정제하고, 10% FCS, MEM 아미노산, L-글루타민, MEM 비타민, 소듐 피루베이트, 및 페니실린(100units/ml), 스트렙토마이신(100mg/ml), 및 50ng.ml 재조합 인간 과립구-래크로파지 콜로니-자극 인자(GM-CSF)으로 보충된 DMEM의 106/ml의 세포 농도에서 배양하고, 5% CO2로 보충된 37℃의 가습 분위기에서 유지하였다. 단핵구-유래 매크로파지를 얻기 위하여 플라스틱에 세포를 고정시키고 6일동안 배양하여 분화하였다.
테승트 대상의 농도가 증가될 때 CD4+ HeLa 세포, 주르카트 세포(Jurkat cells), 활성화된 CD4+ 말초혈액 T-림프구 및 매크로파지(500,000cells/100㎕)를 pNL-4-GTP(X4 바이러스) 또는 pNL 4.3-BaL-GFP (R5 바이러스)(p24 100ng)와 함께 배양하였으며, 48시간 후에, 계산된 FACS 및 EC50으로 GFP-양성 세포의 퍼센트를 분석함으로써 감염도의 점수를 매겼다.
HBV
항바이러스 활성의 평가를 위한
생체외
에세이
HBV에 대한 항바이러스 효능을 다음과 같이 테스트할 수 있다: HepG2 2.2. 15 세포를 96-well 마이크로타이터 플레이트 내에 둔다. 16-24시간 후에 HepG2 2.2. 15 세포의 융합 단분자막을 세척하고 배지를 다양한 농도의 테스트 화합물이 3중(예를 들면, 6개의 반-로그 농도)으로 포함된 완전 배지로 대체한다. 3일 후에 적절하게 희석된 테스트 화합물을 포함하는 신선한 배지로 배양 배지를 대체한다. 테스트 화합물의 초기 투입 6일 후에, 세포 배양 상층액을 수집하고, 프로나제로 처리하고 그리고 나서 리얼-타임 정량 TagMan qPCT 에세이에 사용한다. 증폭된 HBV DNA에 하이브리다이제이션시키는, ?칭된 형광 프로브 분자의 엑소뉴클레올리틱 분해(exonuleolytic degradation)를 일으키는 형광 신호의 증가를 모니터함으로써 PCR-증폭된 HBV DNA를 감지한다. 각각의 PCR 증폭을 위하여,정제된 HBV DNA의 희석을 이용함으로써 표준곡선이 자동적으로 생성된다. 항바이러스 활성을 HBV DNA 수준(IC50)의 감소치로 계산한다. 염료 섭취 에세이를 이용하여 세포 생존능을 측정하고, 이는 독성(TC50)을 계산하는 데에 사용한다. TC50/IC50으로 치료지수(therapeutic index, TI)를 계산한다.
면역억제 활성의 평가를 위한
세포외
혼합 림프구 반응(
mixed
lymphocyte
reaction,
MLR
) 에세이
면역억제 활성을 다음과 같이 테스트하였다: 히스토페이크(histopaque)를 통한 원심분리를 이용하여 2개의 정상, 연관되지 않은 자원 도우너(A & B)의 혈액으로부터 말초혈액 단핵 세포(PBMC) 개체군을 정제하였다. 세포를 카운팅하고 보충물 및 2% 인간 AB 세럼을 포함한 RPMI 배지 내의 96웰 플레이트의 웰 당 1 x 105cells로 플레이팅하였다.
배양 조건은 다음을 포함한다: 테스트 화합물의 부재 또는 존재 하에 세포 개체군 A & B 단독 및 세포 A & B의 혼합 개체군, 6개의 다른 농도 각각. 10μM 내지 0.0001μM의 범위에서 1-log 증가량의 투입량에서 화합물을 테스트하였다. 대조군 웰은 테스트 화합물 웰 내에 존재하는 것에 비교할 수 있는 비히클의 농도(0.5% DMSO)를 포함한다. 96웰 플레이트 내에서 배양액을 3중으로 하였으며, 5% CO2, 37℃의 가습 분위기에서 인큐베이션하였다. 에세이 셋업하고 6일 후에 3H-티미딘을 첨가하고 24시간 후에 수확하였다. 다른 배양 조건에 따른 증식의 수준을 비교하였다.
테스트 화합물의 각각의 희석액이 MLR에서 증식을 억제하는 능력을 퍼센트 억제로 계산하였다. 이는 IC50(분당 50%의 카운트 감소를 보이는 테스트 화합물의 농도)의 추정이 가능하게 하였다. IC50를 계산하기 위하여, X축을 로그 스케일로 변환하였다. 비선형 회귀를 사용하여 평균 데이터 포인트를 맞췄다. 에스자형(sigmoidal) 변수 경사를 선택하였다.
Cyp
-
NS5A
상호작용의
ELISA
분석
이 에세이를 사용하여 Cyp-NS5A 복합체의 분열을 측정하였으며, 이는 사이클로필린 Ddml 상호작용의 효능을 보여주기 위하여 사용될 수 있다. 간단하게 말하자면, 재조합 GST, GST-CypD 및 Con1 NS5A-His 단백질의 생산 및 정제를 상기에 기재된 대로 실시하였다(Chatterji et al., 2010). Nunc MaxiSorb 8-well 스트립 플레이트를 GST 또는 GST-CypD로 4℃에서 16시간 동안 코팅하였으며, 블록킹하였다. 재조합 NS5A-His(1ng/mL)를 바인딩 버퍼(20mM Tris pH 7.9, 0.5M NaCl, 10% 글리세롤, 10mM DTT 및 1% NP-40) 50㎕ 내의 웰에 4℃에서 16시간 동안 첨가하였다. 이후에 마우스 항-His 항체(1μg/mL)(anti-6xHis, Clontech) 및 토끼 항-마우스-겨자무 과산화효소 포스파타제(horseradish peroxidase phosphatase, HRP) 항체(1:1000 희석)를 사용하여 포착된 NS5A-His를 감지하였다. 모든 실험은 2개의 다른 재조합 CypD 및 NS5A 단백질 배치를 이용하여 2회 실시하였다.
사이클로필린
억제의 항-
PPIAse
분석
사이클로필린과의 상호작용을 분석하기 위한 대체 방법론은 다음과 같다: GST-CypA 또는 D의 트롬빈 분열에 의하여 생산된 재조합 CypA 또는 D의 PPlase 활성을 키모트립신에 의한 N-석시닐-Ala-Ala-Pro-Phe-p-니트로알닐라이드의 가수분해의 속도를 다음에 의하여 결정하였다. 키모트립신는 펩티드의 트랜스 형태를 가수분해만을 시키며, 470mM LiCl를 함유한 트리플루오로에탄올 내에 용해된 스톡을 이요함으로써 최대화된 농도인 시스 형태의 가수분해는 시스-트랜스 이성질체화의 속도에 의하여 제한된다. CypA 또는 D를 5℃에서 1시간 동안 0.1 내지 20nM 범위의 약제 농도를 사용하여 선택된 테스트 대상으로 평형화시켰다. 펩티드를 첨가함으로써 반응을 개시하였으며, 가수분해의 속도의 ?화를 초당 10 데이터 포인트에서 분광측정학적으로 모니터하였다. 가수분해의 블랭크 속도(CypA 또는 D의 부재시)를 CypA 또는 D의 존재시의 속도에서 감하였다. 효소 반응의 초기 속도를 흡광도의 변화의 시간 경과에 따른 1차 회귀 분석에 의하여 분석하였다.
실시예
실시예
1 ?
treptomyces
sp
. A92-308110 (
DSM9954
)의
sfaA
결실 돌연변이의 제조
1.1
sfaA
결실 구조의 제조
sfaA (뉴클레오티드 위치 14396-21362, NCBI 서열가입 번호 FJ809786)를 포함하는 코스미드 TL2006 (SEQ ID NO. 3)의 ~7kb EcoRV - Stul 분절을 EcoRV 및 Stul으로 다이제스쳔시킴으로써 절단하고 그 결과 분리된 분절을, 이전에 EcoRv으로 다이제스쳔했던 pKC1139 내로 리게이션시키고 새우 알칼리 포스파타제(Roche)으로 처리하였다. 이 플라스미드를 pSGK268으로 표기하였다.
Gene Bridges에 의하여 공급된 Red/ET 재조합 키트를 사용하여 이 클론 내에 포함된 sfaA 유전자의 인프레임 결실을 실시하였다(카탈로그 번호 K006).
(SEQ ID No. 1) SfaA17161f 5'-
CGCTCTGTGGCGCCTGGTTTCCAAGCGGCTCGCGGACCGGCACCGGCACATGCATAATTAACCCTCACTAAAGGGCG-3'
(SEQ ID NO. 2) SfaA17825r 5'-
TGGATGTATCGTCGCAGGACGCCCAGAATTCACCTGCGACGTCCTCCAGATGCATTAATACGACTCACTATAGGGCTC-3'
KOD DNA 폴리머라제를 사용하여 키트 내에 공급된 FRT-PGK-gb2-neo-FRT 템플레이트 DNA로부터 네오마이신 마커를 증폭시키기 위하여 2개의 올리고뉴클레오티드인 SfaA17161f 및 SfaA17825r를 사용하였다. 그 결과 ~1.7kb의 증폭된 생성물을 겔 전기영동을 실시하여 분리하고 QiaEX 수지를 가진 겔로부터 정제하였다.
표준기술을 사용하여 플라스미드 pSGK268를 E. coli DH10B로 트랜스폼시키고 아프라마이신(50 mg/ml)을 포함하는 플레이트를 선택하였다. Gene Bridges 키트 프로토콜을 필수적으로 따라서 결실 구조물의 도입을 실시하였다. 2TY 아프라마이신(50 mg/ml) 내에서 단일 콜로니를 밤새도록 성장시키고 pRedET (tet) 플라스미드와 함께 트랜스폼시키고, 30°C에서 아프라마이신(50mg/ml) 및 테트라사이클린(3mg/ml) 상에서 선택하였다. 30°C에서 10ml 2TY 아프라마이신(50mg/ml) 및 테트라사이클린(3mg/ml)을 접종하기 위하여 상기 배양액의 0.5ml를 사용하고 OD600nm~0.5에 이르도록 성장시켰다. 상기 배양액의 1.4ml를 2개의 에펜도르포 튜브에 이동시키고, 50㎕의 10% 아라비노즈를 하나의 튜브에 첨가하여 Red/ET 재조합 단개빌의 발현을 유도하였다. 튜브를 37℃에서 ~1시간동안 쉐이킹하였다. 유도된 그리고 유도되지 않은 세포를 벤치탑 원심분리기에서 펠렛화시키고 냉각 살균수로 2회 세척하였다; 재서스펜션화 및 원심분리를 하여 각 시간에 세포를 펠렛화하였다. 결과 펠렛을 약 30-40㎕의 물 내에서 서스펜션시키고 얼음 상에서 방치하였다. 이전에 분리된 1.7kb 분열 분절을 첨가하고 유도된 그리고 유도되지 않은 튜브를 얼음 위의 1mm Biorad 일렉트로큐베트로 이동시켰다. 시료를 전기천공(Biorad Micropulser at 1.8kv, 결과 타임 상수 ~4ms)시키고, 1ml 2TY (항생제 없음)를 첨가하고 혼합하여 큐베트에서 세포를 제거하였다. 37℃에서 ~3시간동안 세포를 쉐이킹하면서 인큐베이션하고(1100rpm, 에펜도르프 써모믹서 컴팩트), 아프라마이신(50mg/ml) 및 카나마이신(25mg/ml)을 포함하는 2TY 플레이트 상으로 플레이팅시키고 37℃에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 유도된 시료 플레이트의 콜로니를 50mg/ml의 카라마이신을 포함하는 2TY 플레이트 상에 스트릭킹하여 정제하고 카나마이신 내성 카셋트의 도입을 확인하였다. 개개의 박테리아 콜로니 상의 PCR를 사용하여 카세트의 도입을 확인하였다. 플라스미드를 이들 배양액으로부터 준비하고 예상된 플라스미드 pSGK270을 확인하기 위하여 다이제스쳔시켰다. 그리고 나서 플라스미드를 Nsil로 다이제스쳔시켜 마커 분절을 제거하고 잔여물을 다시 리게이션하여 sfaA 인프레임 결실 구조물 pSGK271를 생성하였다.
1.2
Sterptomayces
sp
. A92-308110 (
DSM9954
)의
콘쥬게이션
및
sfaA
결실의 도입
표준 기술을 이용하여 플라스미드 pSGK271를 E. coli ET12567 pUZ8002내로 형질전환시키고 아프라마이신(50mg/ml), 카나마이신(25mg/ml) 및 클로로암페니콜(10mg/ml)을 포함하는 2TY 플레이트 상에서 선택하였다. 아프라마이신(50mg/ml), 카나마이신(25mg/ml) 및 클로로암페니콜(10mg/ml)를 포함하는 3ml의 액체 2TY 내로 생성된 균주를 접종시키고 37℃, 250rpm에서 밤새도록 인큐베이션시켰다. 상기 배양액 0.8ml를 사용하여 50ml의 팔콘 튜브에 들어 있는 아프라마이신(50mg/ml), 카나마이신(25mg/ml) 및 클로로암페니콜(10mg/ml)을 포함하는 10ml의 액체 2TY을 접종시키고 37?C, 250rpm에서 OD600nm ~0.5에 도달할 때까지 인큐베이션시켰다. 그 결과 생성된 배양액을 3500rpm, 4℃에서10분동안 원심분리시키고 원심분리를 이용하여 10ml의 2TY 배지로 세척하여 각각의 세척 후에 세포를 펠렛화시켰다. 그 결과 생성된 펠렛을 0.5ml의 2TY 내에 다시 서스펜션시키고, 사용하기 전에는 얼음 위에 보관하였다. 상기 공정의 시간은 하기 기재된 Streptomyces포자의 제조를 완성하는 데에 걸리는 시간과 일치시켰다.
20%의 글리세롤 ~3ml을 다시 서스펜션시킴으로써 1-2주의 융합성 플레이트로부터 Streptomyces sp. A92-308110 (DSM9954) (Biot-4370)의 포자를 수확하였다. 포자를 원심분리하고(5000rpm, 10분, 실온), 50mM TES 버퍼로 2회 세척하고 나서 1ml의 50mM TES 버퍼로 다시 서스펜션시키고 2개의 에펜도르프 튜브로 나누었다. 상기 튜브를 50℃에서 10분동안 수조 내에서 열충격을 주고 0.5ml의 2TY를 첨가하고 37℃에서 4-5시간 동안 에펜도르프 써모믹서 컴팩트(Eppendorf Thermomixer compact) 내에서 인큐베이션시켰다.
준비된 E. coli ET12567 pUZ8002 pSGK271 및 Biot-4370를 1:1 (각 균주 250mL) 및1:3 (100 mL E. coli)의 비율로 혼합하고 나서 즉시 R6 플레이트 상에 스프레딩하고 37℃의 인큐베이터에 이동시켰다. 약 2시간 동안 원심분리를 한 후에 이들 플레이트를 날리딕스산(nalidixic acid)을 포함하는 멸균수 2ml로 덮어 씌워 최종 인-플레이트 농도를 25mg/L가 되게 하였다. 밤새도록 플레이트를 37℃의 인큐베이터로 이동시키고 아프라마이신을 포함하는 2ml의 멸균수로 덮어 씌워 최종 인-플레이트 농도를 20-25mg/L가 되게 하였다. 아프라마이신(25mg/L) 및 날리딕스산(25mg/L)을 포함하는 ISP4 배지에 ~4-7일 후에 보이는 접합완료체(ex-conjugant)콜로니를 패칭했다. 적절한 균사체의 성장이 관찰되면, 37℃에서 아프라마이신(25mg/L)를 포함하는 ISP4 배지로 균주들을 다시 패칭해서 포자가 형성되게 하였다. 그리고 나서 (항생제 없이) ISP4에 패칭함으로써 (감온 플라스미드(temperature sensitive plasmid)의 제거를 촉진하기 위하여) 균주를 3회 계대배양하고 37℃에서 3-4일 동안 인큐베이션시켰다. 종국에는 ISP4에 균주를 패칭하고 28℃에서 인큐베이션시켜 완전한 포자 형성(5-7일)이 이루어지게 하였다. 포자를 수확하고 28℃에서 ISP4 플레이트 상에서 순차적으로 희석시켜 단일 콜로니를 선택하게 하였다. 아프라마이신이 있는(25mg/L) 경우와 없는 경우에 포자가 형성된 단일 콜로니를 ISP4 플레이트로 이중으로 패칭시켜 플라스미드의 손실을 확인하고 ~ 7일 성장시키고 상글리페린의 생산을 위한 테스트를 실시하였다.
1.3
팔콘
튜브 내의
상글리페린의
생산을 위한 스크리닝 균주
포자 형성이 잘된 균주의 단일 ~7mm의 아가 플러그를 사용하여 멸균된 7ml의 멸균 SM25-3 배지를 접종하고 27℃, 200rpm, 및 2”throw교반기에서 인큐베이션시켰다. 성장 48시간 후에, 5% HP20 수지를 포함하는 7ml의 SGP2 배지를 포함하는 멸균 팔콘 튜브로 이 배양액의 0.7ml를 이동시켰다. 배양액을 1인치의 드로우 쉐이킹 인큐베이터 상에서 5일동안 24℃ 및 300rpm에서 성장시키고 수확하였다. 0.8ml의 박테리아 배양액을 제거하고 분취하기 전에 배양 공정 전체에서 수지가 적절하게 분산되는 것을 확인하면서 2ml 에펜도르프 튜브 내로 분취하였다. 0.8ml의 아세트니트릴 및 15ml의 포름산을 첨가하고 튜브를 30분동안 혼합하였다. 상기 혼합물을 원심분리하고 170ml의 추출물을 HPLC 바이알로 제거하고 HPLC 분석을 하였다.
1.4 야생형 또는
sfaA
유전자형으로의 전환을 위한 균주의 분석.
균주 추출물을 HPLC 분석하였다.상글리페린 A 및 B를 생산하는 균주는 야생형으로 전환되었던 것이므로, 더 이상 분석하지 않았다. 상글리페린 A 및 B이 결여된 균주는 피크 보존시간의 낮은 수준(~1-2mg/L)인 6.5분이었는데, 이는 상글리페린 유사 클로모포로 나타났다. LCMS 분석은 이 피크를 보여주며, 이 피크는 m/z 1073, 상글리페린의 예상 m/z의 -16유닛을 나타냈다. 이 피크는 메타-하이드록시티로신의 부재에서 페닐알라닌의 투입으로 기인한 것으로 가정되었다.
상글리페린 생산의 감소를 보이는 여덟 개의 균주는 잠재적인 sfaA 돌연변이가 화학적으로 보완되어 신규한 상글리페린을 제조하는 뮤타생합성이 일어나게 하는 지를 평가하기 위하여 후속적으로 재성장시켰다. 균주를 SM25-3 시드 배지에서 48시간동안 성장시키고 5% 수지를 포함하는 SGP2 생산 배지로 이동시켰다. 추가의 24시간의 성장후에 균주를 2mM의 DL 메타-하이드록시티로신(1M HCL 내의 0.16M 용액 100ul)으로 3중으로 피딩시키거나 대조군으로서 피딩되지 않은 균주를 사용하면서 2mM의 L-페닐알라닌으로 하였다. 또한 균주를 메탄올 내의 피페콜린산(2mM)으로 피딩시켜 생산 수율을 증가시켰다. 추가적으로 4일 성장시킨 후에 균주를 수확하고, 추출하고 HPLC 분석하였다. 메타-하이드록시 티로신은 sfaA 돌연변이 및 -16amu 화합물의 L-페닐알라닌의 증가된 레벨의 첨가를 화학적으로 보완하는 것으로 나타났다. sfaA 결실 돌연변이의 추가 연구를 위하여 균주 Biot-4585를 선택하였다.
Example
2 -
sfaA
결실 구조물의 제조를 위한 다른 방법
sfaA 결실 돌연변이체를 생성하기 위하여 다른 방법을 사용할 수 있다. 실시예는 (WO2010/034243의 실시예 12와 같은) sfaA 삽입 불활성화 돌연변이체를 포함한다. WO2010/034243에 기재된 대로 균주를 생성하고, BIOT-4452라고 균주를 칭한다.sfaA2개의 올리고뉴클레오티드의 결실을 생산하는 대체적인 공정으로서, 15209F 5'-CAGAGAATTCGCGGTACGGGGCGGACGACAAGGTGTC-3' (SEQ ID NO. 4) 및 17219R 5'-GCGCATGCATGTGCCGGTGCCGGTCCGCGAGCCGCTTGG-3' (SEQ ID NO. 5)를 사용하여 템플레이트로서 코스미드 TL3006 (SEQ ID NO. 3)와 KOD DNA 폴리머라제를 사용한 업스트림 부위의 상동성을 증폭시킨다. 증폭된 생성물을 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(NEB)으로 처리하고 새우 알칼리 포스파타제(Roche)로 처리함으로써 디포스포릴레이션시킨 pUC18 내로 클로닝시킨다. 그 결과 생성된 구조물은 제한 다이제스쳔으로 확인하고 원하는 서열이 생성되고 폴리머라제 증폭과정 동안에 에러가 발생되지 않았는지를 확인하기 위하여 전체적으로 시퀀싱한다. 이 구조물을 EcoRI 및 NsiI으로 다이제스쳔시키고 생성물을 겔 전기영동으로 분석한다. 겔로부터 원하는 서열-함유 밴드(곧, 업스트림 상동성 ~2kb)를 절단하고 표준 공정을 이용하여 정제한다(QiaEX 수지). 2번째 시리즈의 올리고뉴클레오티드:
17766F 5'-CCTCATGCATCTGGAGGACGTCGCAGGTGAATTCTGGGCG-3' (SEQ ID NO. 6)
및 19763R 5'-GGGCAAGCTTCTCCTGGCTGAGCTTGAACATCG-3' (SEQ ID NO. 7) 를 사용하여 템플레이트로서 코스미드 TL3006 (SEQ ID NO. 3)와 KOD DNA 폴리머라제를 사용한 업스트림 부위의 상동성을 증폭시킨다. 증폭된 생성물을 T4 폴리뉴클레오티드 키나제(NEB)으로 처리하고 새우 알칼리 포스파타제(Roche)로 처리함으로써 디포스포릴레이션시킨 pUC18 내로 클로닝시킨다. 그 결과 생성된 구조물은 제한 다이제스쳔으로 확인하고 원하는 서열이 생성되고 폴리머라제 증폭과정 동안에 에러가 발생되지 않았는지를 확인하기 위하여 전체적으로 시퀀싱한다. 이 구조물을 HindIII 및 NsiI으로 다이제스쳔시키고 생성물을 겔 전기영동으로 분석한다. 겔로부터 원하는 서열-함유 밴드(곧, 업스트림 상동성 ~2kb)를 절단하고 표준 공정을 이용하여 정제한다(QiaEX 수지).벡터 pKC1139를 EcoRI 및 HindIII로 다이제스쳔시키고 거대 벡터 분절을 겔 전기영동으로 분리하고 표준 방법(QiaEX 수지)으로 정제한다. 분리된 업스트림 및 다운스트림 상동성 분절을 3방향 리게이션으로 pKC1139의 이 분절 내로 클로닝하여 원하는 sfaA 결실 구조물을 생성한다.
sfaA 결실 구조물의 추가의 대체적인 공정에서 원하는 서열(SEQ ID NO. 8)을 함유한 구조물을 생성하는 데에 상용화 유전자 합성(곧, Genscript 또는 다른 판매회사)를 사용한다. 이 구입한 구조물을 BamHI 및 XbaI으로 다이제스쳔시켜 관심대상 서열을 절단하고 생성물을 겔 전기영동 분석한다. 겔로부터 원하는 서열-함유 밴드(~4kb)를 절단하고 표준 방법을 사용하여 정제한다. 벡터 pKC1139를 BamHI 및 XbaI으로 다이제스쳔시키고 거대 분절을 겔 전기영동으로 분리하고 표준 방법으로 정제한다. 그리고 나서 2개의 분리된 분절을 함께 리게이션시켜 원하는 sfaA 결실 구조물을 생성한다.
콘쥬게이션과 실시예 1.2에 기재된 방법을 사용한 2차 크로스 선택에 의하여 이 대체적인 sfaA결실 구조물을 Streptomyces sp. A92-308110 (DSM9954) 내로 도입한다. 이와 같은 방법으로 제조된 균주의 성장 및 분석은 실시예 1.2에 기재된 방법에 따른다.
실시예
3 -
sfaA
결실 돌연변이 어레이 피드(
array
feed
)
MAM, ISP4, ISP3 or ISP2 배지 상에서 성장시킨 후에 sfaA (BIOT-4452 or BIOT-4585) 내에서 분열시킨 돌연변이 포자 스톡을 준비하고 증류수 내의 20% w/v 글리세롤에 보존시키고 -80㎕p서 저장하였다. 폼 플러그가 없는 50mL의 원심분리튜브 내의 7mL의 시드 배지(SM25 배지) 내로 포자 스톡(1% v/v)을 접종시킴으로써 영양 배양액(시드 배양)을 제조하였다. 27℃, 250rpm (5cm throw)에서 48시간동안 배양 튜브를 인큐베이션시켰다. 시드 배양액 10%(v/v)으로부터 폼 플러그가 없는 50mL의 원심분리튜브 내의7mL 제조 배지 SGP-2로 이동시켰다. 24℃ 및 300rpm(2.5cm throw)에서 배양을 실시하였다. 상글리페린 뮤타생합성 유사체의 생산을 위하여 접종 24시간 후에 피드 화합물(뮤타신톤(mutasynthon))의 0.32M 용액(in 1N HCl) 0.05mL을 각 튜브에 첨가하여 최종 농도가 2mM이 되도록 하였다. 또한 0.05ml의 0.32M 피페라진 용액(in methanol)을 각 튜브에 24시간에 간에 첨가하여 최종 농도가 2mM이 되도록 하였다. 피딩 후에 추가적으로 4일 동안 배양을 계속하였다.
2ml의 뚜껑을 덮은 에펜도르프 튜브 내로 0.8ml의 전배양액(whole broth)을 이동시킴으로써 시료를 추출하였다. 0.8ml의 아세토니트릴을 첨가하고 이어서0.015ml의 포름산을 첨가하였다. 그리고 나서 혼합물을 비브렉스(vibrax)에서 30분동안 쉐이킹하였다. 그리고 나서 튜브를 13000rpm에서 10분동안 원심분리시키고 상층액 0.15ml를 제거하여 분석에 사용하였다. 상기 일반적인 방법에 기재된 대로 추출물을 분석하였다.
표 1은 LCMS H+ 및 Na+ 부가물과 함께 이와 같은 방법으로 피딩된 뮤타신톤, 측정한 상글리페린 뮤타합성 생성물의 예상 분자량 및 보존시간을 나타낸다. 상글리페린 A 유사체와 연관된 주요 피크를 보여준다. 모든 경우에 상글리페린 B 유사체(Mass-18)에 대해서 LCMS 피크가 나타났다.
뮤타신톤 피드 |
뮤타신톤명 | [M-H]- 관측치 (m/z) |
[M+Na]+ 관측치 (m/z) |
분자량(amu) | 보존시간 (분) |
2-아미노-3-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)프로파노익산 | 1106.4 | 1130.4 | 1107.4 | 5.7 | |
메틸 2-아미노-3-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)프로피오네이ㅌm | 1106.4 | 1130.4 | 1107.4 | 5.7 |
실시예
4 - 중간체 화합물 14 63-
플루오로
상글리페린
A의 분리
메틸 2-아미노-3-(3-플루오로-5-하이드록시페닐)프로파노에이트및 전구체로서 DL-피페라진산을 이용한 일반적인 방법에 기재된 대로 발효를 실시하였고, 둘 다 26시간 후에 첨가하였다.
배양 브로스를 수확한 후에 모으고 포름산으로 pH 3로 조정하고 25분동안 원심분리(3300g)하여 정제 브로스로부터 세포와 수지를 분리하였다. 5% 미만의 표적 화합물이 존재하는 것을 확인한 에세이 후에 분리된 브로스를 버렸다. 자석 교반기를 사용하여 1시간 동안 2부피의 아세토니트를과 함께 세포 및 수지를 교반하였다. 아세토니트릴 추출물을 원심분리 또는 비중에 따라 가라앉힘으로써 회수하였다. 그리고 나서 세포 및 수지의 2번째 추출을 동일한 조건에서 실시하였다. 혼합한 아세토니트릴 추출물을 감압하에서 잔여 수용성 부피로 농축시키고 나서 pH 6로 조정하였다. 이를 아세토아세테이트로 2회 추출하고 감압하에서 혼합된 유기물을 건조하여 최종 조추출물(1.3g)을 얻었다.
조추출물(1.3g)을 에틸아세테이트(2ml)에서 용해시키고, 에틸아세테이트(500ml)로 조건을 맞춘 실리카겔 칼럼(10 x 2cm) 상에 로딩시켰다. 에틸아세테이트로 칼럼을 용출시키고 나서 아세톤을 단계별로 증가시켰다(에틸아세테이트 내의 10%, 20%, 30%, 등). 약 250mL의 분획을 수집하고 표적 화합물을 분석 LC로 확인하고 합하여 건조시켰다. 이 물질(278mg)를 메탄올(1.8ml)에 용해시키고 분석용 HPLC로 정제하였다. 용매가 21mL/min로 펌핑되는 Waters Xterra MSC18 칼럼(10icron, 19cm x 250mm)을 사용하였다. 용매 A는 물이었고, 용매 B는 아세토니트릴이었다. 칼럼을 50% B에서 6분동안 이소크래티컬하게(isocratically) 주입을 실시하고 100% B로 30분동안 경사를 실시하였다. 순수한 분획을 HPLC-UV로 확인하고 합하였다. 이들 분획을 취하여 감압하에서 건조하여 표적 화합물을 황백색의 비정질 고체로 얻었다(20mg).
실시예
5 -
디에틸
(2-(1,2-
옥사지난
-2-일)-2-
옥소에틸
)
포스포네이트
(
diethyl
2(1,2-oxazinan-2-yl)-2-oxoethyl)phosphonate)의 합성
건조 DCM(5mL)의 21-1(ChemCollect, Germany)(100mg, 0.81mmol) 및 Et3N(246mg, 2.43mmol) 용액에 클로로아세틸 클로라이드(chloroacetyl chloride, 138mg, 1.22mmol)를 침적하였다. 반응 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반시키고, 얼음물에 붓고, 에틸아세테이로 추출하였다. 유기층을 브라인으로 세척하고 Na2SO4로건조, 필터링시키고 진공에서 농축시켰다. 잔여물(21-2)을 추가의 정제를 하지 않고 다음 단계에 사용하였다(123mg, 90% yield).
21-2(123mg, 0.75mmol) 및 트리에틸 포스파이트(triethyl phosphite, 250mg, 1.50mmol)의 혼합물을 140℃에서 6시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉각시키고 플래시 크로마토크래피로 정제하여 21를 얻었다.
디에틸
(2-1,2-
옥사지난
-2-일)-2-
옥소에틸
)
포스포네이트
(
diethyl
(2-(1,2-
oxazinan
-2-
yl
)-2-
oxoethyl
)
phosphonate
) 21의 합성의 대체 합성
21a-2의 제조를 위한 일반적인 공정
실온에서 테트라하이드로퓨란(2.0L) 내의 t-BuOK(84.0g, 0.75mol)의 용액에 21a-1(50.0g, 0.38mol)일 소량씩 첨가하고 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 1,4-디브로모부탄(1,4-Dibromobutane, 81.2g, 0.38mol을 실온에서 침적시켰다. 그리고 나서 혼합물을 80℃에서 16시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후에 물(2000mL)을 첨가하고 혼합물을 에틸아세테이트(2 x 1000mL)로 추출하였다. 합한 유기층을 Na2SO4무수물로 16시간 동안 건조시키고, 필터 및 농축시킨 후에 잔여물을 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 정제하여(용출액: 석유에테르:에틸아세테이트=100:1 내지 10:1), 무색의 오일 21a-2(57g)를 얻었다.
21a-3
의 제조를 위한 일반적인 방법
21a-2(55g, 0.29mol)의 tert-부틸메틸에테르 용액에 TBME(80mL)의 4N HCl(600ml, in TBME) 용액을 실온에서 첨가하고, 혼합물을 실온에서 3시간동안 교반하였다. 침전된 고체를 필터링하고 TBME(50mL)으로 세척하여 하얀색의 고체 21a-3(30g)를 얻었다.
21의 제조를 위한 일반적인 방법
디클로로메탄 무수물(550mL) 내의 21a-4(35g, 0.18mol)의 교반된 용액, 하이드록시벤조트리아졸(hydroxybenzotriazole, HOBT)(29g, 0.21mol) 및 Et3N(71mL, 0.51mol)에 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카보디이미드(1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, EDCI)(41g, 0.21mol)를 0℃에서 소량씩 첨가하였다. 반응혼합물을 0℃에서0.5시간동안 교반하고, 그리고 나서 21a-3(24g, 0.20mol)을 0℃에서 첨가하고 16시간 동안 교반하였다. 그리고 나서 TLC(석유에테르/에틸에테르: 3/1)는 반응이 완전하였다는 것을 보여주었다. 동시에 격렬하게 교반하면서 반응혼합물을 물(500mL)로 천천히 부었다. 혼합물을 디클로로메탄(2×200mL)으로 추출하였다. 합한 유기층을 브라인(2×100mL)으로 세척하고 Na2SO4으로 건조시키고 필터링하고 농축시켜 조생성물을 얻었다. 크로마토그래피(석유에테르/에틸아세테이트, 100:1 내지 10:1)를 하여 노란색의 오일 21(38g)을 얻었다.
실시예 6 - 중간체 화합물 23-3의 제조
Tert-부틸알코올(2.5wt%, 0.079mmol/ml) 내의 교반된 14(430mg, 0.38mmol)용액, (DHQ)2PHAL(18.6mg, 0.024mmol), 오스뮴 테트록사이드(osmium tetroxide, 0.156mL, 0.012mmol), 및 20mL의 tert-부틸알코올 내의 메탄설폰아미드(methanesulfonamide, 74mg, 0.77mmol)을 실온에서 첨가하고, 20mL의 물 내의 포타슘 페리시아나이드(tion of potassium ferricyanide, 382mg, 1.16mmol) 및 포타슘 카보네이트(potassium carbonate, 160mg, 1.16mmol)를 실온에서 첨가하여 갈색의 에멀젼을 얻었다. 2시간 후에 소듐설파이트를 첨가하고 20분동안 교반을 계속하였다. 그 결과 생성된 혼합물을 에틸아세테이트(3 x 50ml)로 추출하였다. 합한 유기층을 브라인으로 세척하고 무수물로 건조, 필터링 및 감압하에서 농축시키고 역상 플래시 크로마토그래피로 정제하여 하얀색의 고체 23-2를 얻었다.
THF과 물의 2:1 혼합물 24mL 내의 교반된 23-2(240mg, 0.21mmol) 용액에 소듐 페리오데이트(sodium periodate, 91mg, 0.42mmol)를 첨가하였다. 그 결과 생성된 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하고 나서 소듐 바이카보네이트 수용액을 첨가하였다. 혼합물을 에틸아세테이트 3부로 추출하였다. 합한 유기층을 물 1부 및 포화 브라인 2부로 세척하고, 소듐 설페이트 무수물로 건조하고 감압에서 농축시켰다. 잔여물을 역상 플래시 크로마토그래피에 의하여 정제하여 23-3를 얻었다.
실시예
7 - 화합물 24의 제조
21(42mg, 0.168mmol)의 THF(2.0 mL) 용액에 NaH(1.2mg, 0.05mmol)의 THF(0.2mL) 용액을 0℃에서 교반하면서 첨가하였다. 그리고 나서 20℃에서 깨끗해질 때까지 용액을 교반하였다. 그리고 나서 상기 깨끗한 용액에 23-3(30mg, 0.042mmol)을 첨가하고 20℃에서 2시간 동안 혼합물을 교반하였다. 혼합물을 물(10mL)로 ?칭시키고 에틸아세테이트(3 x 20mL)로 추출하였다. 유기층을 브라인으로 세척하고, Na2SO4로 건조하고 필터링하고 진공으로 감압시켰다. 잔여물을 분석용 HPLC로 정제하여 비정질 하얀색 고체인 24를 얻었다.
실시예
8 - 상 결정형의 화합물 24의 제조(
Form
I)
비정질 화합물 2410mg을 메틸이소부틸케톤(MIBK, (500μL, 50volumes) 내에서 슬러리화시키고 그리고 나서 총 5일동안 4시간마다 실온과 40℃ 사이에서 온도를 사이클링시켰다. 과량의 용매를 디캔팅하고 진공하에서 건조시킴으로써 생성된 고체를 분리하여 고상 결정형(Form I)의 화합물 24를 얻었다. 화합물 24의 Form I의 XRPD 패턴을 도 2에 나타내었고, 그 피크 및 상대세기를 하기 표 3에 나타내었다.XRPD 데이터를 얻는 방법은 일반적인 방법에 기재한다.
피크 No. | 위치[°2Theta] | 상대세기[%] |
1 | 6.2097 | 6.86 |
2 | 6.5031 | 7.76 |
3 | 8.2581 | 27.43 |
4 | 8.4838 | 33.64 |
5 | 9.5994 | 23.88 |
6 | 10.0981 | 8.54 |
7 | 11.0546 | 29.76 |
8 | 12.05883 | 14.81 |
9 | 13.1703 | 7.1 |
10 | 13.9184 | 100 |
11 | 14.2891 | 13.04 |
12 | 14.9759 | 10.37 |
13 | 15.3159 | 5.81 |
14 | 16.8844 | 18.15 |
15 | 17.1816 | 9.72 |
16 | 17.7384 | 53.03 |
17 | 17.1703 | 9.02 |
18 | 18.5613 | 32.19 |
19 | 19.0241 | 52.81 |
20 | 19.4201 | 5.08 |
21 | 20.0954 | 13.7 |
22 | 20.449 | 63.25 |
23 | 20.8962 | 43.44 |
24 | 21.1871 | 15.02 |
25 | 21.6388 | 16.08 |
26 | 23.0029 | 50.8 |
27 | 23.2869 | 17.19 |
28 | 23.6883 | 17.16 |
29 | 24.1071 | 13.7 |
30 | 24.2587 | 19.55 |
31 | 24.9948 | 13.34 |
32 | 25.209 | 26.16 |
33 | 25.9577 | 10.06 |
34 | 26.4298 | 9.38 |
35 | 27.3687 | 11.1 |
36 | 29.0171 | 7.95 |
37 | 29.5603 | 5.14 |
38 | 30.0609 | 7.35 |
39 | 30.5824 | 6.5 |
40 | 32.1814 | 4.39 |
41 | 32.6521 | 6.74 |
42 | 33.5957 | 6.6 |
43 | 34.7946 | 9.04 |
실시예
9 - 생물학적 데이터 -
HCV
리플리콘
및 분석
일반적인 방법에서 기재된 대로 Huh5.2 세포를 이용한 유전자형 1b 리플리콘 에세이를 이용하여 화합물을 분석하였다. 비교하기 위하여 사이클로포린 A, 1, DEBIO-025, 2, 상글리페린 A, 5,및 하이드로매크로사이클 6을 포함시켰다.
화합물 | EC50(μM) | CC50(μM) | 선택도 지수 (CC50/EC50) |
사이클로스포린 A, 1 | 0.62 | 28 | 52 |
DEBIO-025, 2 | 0.096 | 11.2 | 111 |
상글리페린 A, 5 | 0.318 | 9.1 | 28.7 |
하이드록시매크로사이클, 6 | 8.4 | 83.6 | 9.9 |
24 | 0.033 | >100 | >3030 |
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 화합물 24는 CsA, Debio-025, SfA 및 하이드록시매크로사이클과 비교하였을 때, Huh5.2 리플리콘 에세이(낮은 EC50로 나타난 바와 같이)에서 상당히 높은 효능을 가지고 있으며, (높은 선택지수로 나타난 바와 같이) 세포주에 대하여 상당히 높은 선택도를 가진다.
실시예
10 - 생물학적 데이터 -
HIV
에 대한 활성
일반적인 방법에서 기재된 대로 HeLa 세포를 이용한 HIV 항바이러스 에세이를 이용하여 화합물을 분석하였다. 비교하기 위하여 사이클로포린 A, 1, DEBIO-025, 2, 및 HIV 항바이러스 엠트리시타빈 및 테노보비르를 포함시켰다.
화합물 | HeLa 세포 EC50 (μM) |
사이클로스포린 a, 1 | 5.3 |
DEBIO-025, 2 | 1.5 |
엠트리시타빈 | 0.4 |
테노포비르 | 1.05 |
24 | 0.13 |
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 화합물 24는이 에세이에서 HIV감염을 억제하는 데에 있어서, CsA, DEBIO-025, 엠트리시타빈 및 테노보비르보다 상당히 높은 효능을 가진다.
실시예
11 - 생물학적 데이터 -
생체내
구강 및
iv
PK
의 마우스
생체내 셋팅에서 화합물의 약물동태학을 평가하기 위하여 CD1 마우스 그룹에 po으로 화합물 10 또는 5mg/kg를 iv로 1mg/kg를 투여하였다. 일반적인 방법에 기재된 대로 약물동태학 분석을 실시하였다. PK 파라미터는 아래에 기재한다.
화합물 | 복용량 수준 (mg/kg) |
클리어언스 (L/hr/kg) |
po AUClast (ng*hr/mL) |
상글리페린 A, 5 | 10 | 0.054 | 2332 |
24 | 5 | 0.017 | 8223 |
상기에서 보는 바와 같이, 화합물 24는 상글리페린 A와 비교하였을 때, 클리어런스(clearance)를 감소시키고, (높은po AUClast로 나타난 바와 같이) 구강 노출(oral exposure)을 증가시켰다.
실시예
12- 생물학적 데이터 -
CypA
PPIase
활성
CypA 펩티딜 프롤릴 cis-trans 이소머라제 (CypA Pepridyl Prolyl cis-trans Isomerase, PPIase)의 직접적인 억제를 평가하기 위하여, 일반적인 방법에 기재된 방법을 사용하였다. 대조군으로 사이클로스포린 A, 1, DEBIO-025, 2및 상글리페린 A, 5를 포함시켰다.
화합물 | CypA PPlase IC50(nM) |
사이클로포린 A, 1 | 9.7 |
DEBIO-025, 2 | 0.8 |
상글리페린 A, 5 | 2.4 |
24 | 0.31 |
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 화합물 24는,CypA PPIase 활성에 있어서 상글리페린 A, DEBIO-025 및 및 사이클로스포린 A보다 강하게 억제한다.
실시예
13 - 생물학적 데이터 - 빌리루빈 운반체의 억제
DEBIO-025에 나타나는 복용량을 제한하는 고빌리루빈혈증의 원인이 되는 것으로 생각되는, 잠재적인 빌리루빈 운반체의 오프-타켓 억제를 평가하기 위하여, 운반체 억제의 생체외 분석을 일반적인 방법에 기재된 대로 실시하였다.
화합물 | OATP1B1 IC50 (μM) |
OATP1B3IC50 (μM) |
MRP2 IC50(μM) | MRP3 IC50(μM) |
사이클로스포린 A, 1 | 0.85 | 0.13 | 4.1 | 3.1 |
DEBIO-025, 2 | 0.45 | 0.19 | 16.0 | >50 |
24 | 4.3 | 1.8 | >50 | >50 |
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 화합물 24는 DEBIO-025 및 사이클로포린 A와 비교하였을 때, 콘쥬게이션된 및 콘쥬게이션 되지 않은 빌리루빈 운반체의 매우 낮은 억제능을 보여준다.
실시예
14 - 생물학적 데이터
생체이물
운반체(
xenobiotic
transporters
)의 억제
생체이물 운반체를 통한 약제-약제 상호작용(Drug Drug Interactions, DDIs)의 잠재력을 평가하기 위하여 P-당단백질(Pgp/MDR1) 및 담즙염 유출 펌프(Bile Salt Export Pump, BSEP) 억제를 일반적인 방법에 기재된 대로 실시하였다.
화합물 | PgP IC50 (μM) | BSEP IC50 (μM) |
사이클로스포린 A, 1 | 0.73 | 0.48 |
DEBIO-025, 2 | 0.72 | 0.18 |
24 | >50 | 12.3 |
상기에서 보는 바와 같이, 본 발명의 화합물 24는 DEBIO-025 및 사이클로포린 A와 비교하였을 때, 약제-약제 상호작용에 잠재적으로 관련된 생체이물 운반체의 보다 낮은 억제능을 보여준다.
<110> NEUROVIVE PHARMACEUTICAL AB
<120> MACROCYCLIC COMPOUND AND METHODS FOR ITS PRODUCTION
<130> IP13-014/SE/NVP
<150> GB 1105293.3
<151> 2011-03-29
<150> GB 1113629.8
<151> 2011-08-08
<150> GB 1202060.8
<151> 2012-02-07
<160> 8
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 1
cgctctgtgg cgcctggttt ccaagcggct cgcggaccgg caccggcaca tgcataatta 60
accctcacta aagggcg 77
<210> 2
<211> 78
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2
tggatgtatc gtcgcaggac gcccagaatt cacctgcgac gtcctccaga tgcattaata 60
cgactcacta tagggctc 78
<210> 3
<211> 46596
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Cosmid
<400> 3
acaccggcca caccggcggc ggcctgcgtg tgcccgatgt tggacttcac cgaaccgagc 60
cacagcggct cgtcccgctc ctgcccgtag gtggcgagca gcgcctgcgc ctcgatcggg 120
tcgcccagcc gcgtgcccgt accgtgcgcc tccaccgcgt ccacgtccgc gggcgtgagc 180
ccggcaccgg agagcgcctg acggatcacc cgctgctgcg aaggaccgtt cggggccgtc 240
agaccgttcg acgcgccgtc ctggttgatc gcggtgccgc gtacgacggc cagtacctgg 300
tggccgtggc ggcgggcgtc ggagagccgt tccacgagga gcatgccggc gccctcggac 360
cagccggtgc cgtcggccgc ggcggcgaag gacttgcagc ggccgtccac ggccaggccg 420
cgctggcggg agaagtcgac gaagacgtcg ggggcggaca tgacggtgac accgccggcc 480
agcgccatcg agcactcgcc gctgcgcagc gcctggatcg cccagtgcag ggcgaccagc 540
gacgccgagc acgcggtgtc cacggtgacc gcagggcctt ccaggccgag gacgtaggcg 600
atgcggcccg acagcacgct ggcggagttg ccgatgccga cgtagccctc cgcgctctcg 660
acggtcctgc gcacgagctg ggcatagtcc tggccgttgg tgccgaggta gacgccgacg 720
tccgcgccgc gcagggactt cgggtcgatg ccggcgcgtt cgacggcctc ccaggcggtc 780
tccagggcca gccgctgctg cgggtccatc gccagcgcct cgcgcggcga gatcccgaag 840
aagtccgcgt cgaacccggc gacgtccgcg aggaagccgc cctcccgcac gtacgacgtg 900
cccgcgtgct ccggatccgg gtggaagagg cccgcgaggt cccagccccg gtcgtcgggg 960
aacggggtga gcgcgtcgcg ctcgtcggcg agcagccgcc acaggtcctc gggcgaggtc 1020
acgccgccgg ggtaccggca cgccatgccg acgatcgcga tgggatcgtc gtcggcgggg 1080
cgggcgacgg cgggcaccgg cgccgtctcc tcggcgcgtt cgccgaggag ttcggccagc 1140
aggtggccgg ccagggagcg cgggttgggg tggtcgaaca cgagggtcgc gggcaggcgc 1200
agcccggtgg cggcggacag ccggttgcgg agttcgacgg cggtcagcga gtcgaagccc 1260
agttccttga acgcccggcc gggggtcacg gcggtgtcgt cggtgtggcc gaggaccacg 1320
gcggcgtgcg agcggacgag cgtgagcagg gtccgttcgc gttccgcggc ggtgagtccg 1380
gtgagctttc cggccagggt gtccggtccg gcgcccgcgg tggcggcgcg ccggacgggg 1440
ccacggacca gccggcgcat cagcgcgggt acggcggtga cgccggtggc gaacgaggtg 1500
aggtccagcc aggcggggac gacgacgggg gcggagccgg cggtggcgcg gtcgaacagg 1560
gcgagcgcgt cgggcgtcgg cagcggcacc acgccgtcgc gggccgcgcg ccgcaggtcg 1620
gcgccgccca ggtggccggt catgccgctg gcgtgcgccc acaggcccca cacctgggag 1680
gtggcgggca ggccctgggc gcggcggtgt gccgcgagcg cgtccacgaa ggcgttgccc 1740
gccgcgtagt tgccctgtcc gggcgccccg aagaggccgg aggtggagga gaacagcacg 1800
aagacggccg gccggtgcgg ggcggtgagt tcgtgcaggt tccaggcggc gtcgaccttg 1860
gggcggagca ccttggcgag ccgctcgggg gtctgggagg cgatgacgcc gtcgtccagg 1920
acgccggcgg cgtggacgac tccggtcagg gggtgctcgg cggtgatccg gtcgagcagg 1980
gcggccagtt cggtgcggtc ggcggcgtcg caggcggcga cggtcacctc ggcgccgagg 2040
gcgcgcagtt cgccggcgag ggtcacggcg tcgggggccg cgtcgccgcg ccgtccggcc 2100
aggaccagcc ggcgtacgcc gtgctcggtg accaggtggc gggcgcagag ggcgccgagc 2160
gtgccggtgc cgccggtgac gaggacgacg ccgtcggacg gccacagggc cgcctggctc 2220
gtgggctcgt cggtgcgcgg ggcgcggacc agccggggtg cgaggacccg gccggagcgc 2280
acggcgatct cgggttcgcc ggtggcgagg acagcgggca gctgttgcag tgcgtcgggg 2340
ccgtcgatgt cgaccagcac cagcctgccg gggtgttcgg cgcgggcgga gcggatcagg 2400
ccccacacgg gcgcgtgggc gaggtcggtg acgtcctcgt gctcgaccgg gaccgcgccg 2460
tgggtgagga cggccagacg ggtgccggcc agtcgctcgt cggcgagcca ctcctgaaga 2520
gcggtcagca cgcgccgggc gccggcgtgg gccgcgccgg cggtgtcgtc ggccgactgc 2580
tgccgacacg gcagcacgag ggtgccgggc acggtgtcca gggcggcgac ggcggcgagg 2640
tcggggcagg aggggtatcc gggcagcgga aggccgccga gcacggcgat gccgtcgacg 2700
tcggccgcgg gcagcggcac gggcgtccac tcgacccggt acagctcgtg gtcgcggccg 2760
gggccggccg tggccggcgg gcgcagggtc accgcgtcga cggtgagcac ggcggctccg 2820
ctgtcgtcgg tggcgtgcag ggtgaccgtg tgctcgcccg cggggtgcag gcgtacccgc 2880
agccgggtgg cgcccacggc gtgcagggtg acgccgtgcc aggcgccggg gaccaggccg 2940
gggtgtacgg ccgcgagggc gtcggtgagc agggcggggt gtacgcccca gccgccggcg 3000
gtctcgtcgg tcagctcaac ggtcacgtcg gtcagctcga cggtcacgtc ggtgtccggg 3060
tcccctggcg cggcggccgg ggcggtgccg gtgtgcggga ggaggacgcc ggtcgcgtgc 3120
cgggtccagg gctggtcgtc gtcggcgtcg gcggggcggg agtggacggc gaccgggcgg 3180
gcgccgtcct cgttctccgc gcccagggtg acctggaggc ggcgggcttc gccgacggtg 3240
tcgagcggtg cctcctcggt cagttcgccg agcgtcctgc cgtcggccgc gtgcagggcc 3300
aggtcgagta cggcgccggc cggcagctcg gtgccggccg gcacgcgccc ggtgaacacc 3360
tgtccgccgg atccggcgag cggggtgacg gcgccgagca gcgggtgccc ggcgccggtc 3420
aggcccaggc cggcggcgtc ggaggcgacc gggccgctgg gccagaagcg gcggcgctgg 3480
aaggcgtagg tgggcaggtc gacgtggcgt ccgtcggggc agcccaccgt ccagtcgacg 3540
gacacgccgt ggacggcggc ctcggcgagc gaggtgagga ggcggcgcgg gccgtcctcg 3600
tcgcggcgga gggtgccgac gacgacggcg gtccgctcgg tggcctccgc cgtctcctgc 3660
acggcggccg tcagcaccgg gtgcgggctg atctccacga acacggcgtg gccggagtcg 3720
agcaggccgc gcaccacggg ctcgaaccgt acgggctccc gcaggttgcg gtaccagtag 3780
ccggcgtcga gccgtgtctc gccgaggggg ccgcccagca gggtggagtg gaaggcgatg 3840
ccggcctcac cgggccgcag ttcggcgagc gcggcgcgca actcggcttc gagggactcg 3900
acatgggccg agtgggaggc gtagtcgacc gcgatgcggc gcagtcgtac cccgtcggcc 3960
gaccaggcgg ccatcacctc gtccagcgca tcggggtcgc cgctgaggac caccgacgac 4020
gggccgttga gggcggcgac gcaaacgcgt ccggaccacg gtgcgagccg ccgtgtgacg 4080
gtggcctcgg gcagggcgac ggagaccatg ccgccgcgcc cggccagccg ctcggcgatg 4140
agccgcgacc gcagggcgac gatccgggcg ccgtccgcca gcgacagcac acccgccaca 4200
caagcagccg cgatctcccc ctgcgaatga ccgaccacag ccgacggcac gacaccgtac 4260
gaacgccaca cctccgccaa cgacaccatc accgcccaca acaccggctg aacgacatcc 4320
acccgctcca acgccaccgg atcacccagc acaccacgca acgaccagcc cacgaacggc 4380
tccaacgcca ccgcacactc agccatccgc cccgcgaaca ccggcgacga atccagcaga 4440
tccaccgcca tccccaccca ctgcgccccc tgacccggga acacgaacac cacccggccc 4500
tcacccggca acccggcaac acccgacacc acaccctcca ccggctcccc cgcggccaac 4560
gccgccagag aagcccgcgc accggccaca tcagcggcca ccaccaccgc acgatgcggc 4620
aacaacgccc gcgacgcggc aagggaccag gagaggtcca ccgggtccag gccggggtgg 4680
gtgtcgaggt gggcggcgag ccgggtggcc tgctcggcga gggcggcctg ggagcgggcg 4740
gagagcagcc acggcaccca gcgcggcgcg gcgccgcgcg cgggcgcggc cggttccgcc 4800
ggggcctcct ccaggatgag gtgggcgttg gtgccgctgg cgccgaacga cgacacgccc 4860
gcgcggcgcg gccggtcggt cgggggccag acggcggcgc cggtgacgag ttcgacggag 4920
ccggaggccc agtcgatgtg cggtgagggg gcgtccacgt gcagggtgcg gggcacttcg 4980
ccggcgcgca gcgcgagcac cgtcttgatc acgccggcca cgcccgccgc ggggccggtg 5040
tggccgatgt tggacttcag cgagcccagc cgcagcggct gtgcgcggtc ctggccgtag 5100
gtggccagca gggcgttggc ctcgatgggg tcgccgaggg tggtgccggt gccgtgtgcc 5160
tccacgacgt cgacgtcggc ggcggtgagg ccggcggcgg ccagcgcgga gcggatgacc 5220
cgctgctggg cggagccgtt gggggcggtg agcccggagg aggcgccgtc ctggttgatc 5280
gccgagccgc ggaccacggc cagcacgggg tggccgttgc ggcgggcgtc ggacagccgc 5340
tccagcacga ccacgcccgc gccctcggac cagccgatgc cgtccgcggc ggcggcgaac 5400
gccttgcagc ggccgtcggg ggcgaggccg cgctgccggg agaactccac gaaggcacgc 5460
ggggtcgaca tgaccatcac gccgccggcg agggccagcg agcattcgcc gctgcgcagg 5520
gactggccgg ccaggtgcag ggcgacgagc gaggacgagc aggcggtgtc cacgctgacg 5580
gccgggcctt ccaggccgag ggtgtaggcc acccggccgg agagcacgct ggcgtagttc 5640
ccggtgccga gcagcccctc gtccacgccg gcgaccgcgc cgtgccgtga gtcgtagcgc 5700
tggtcggtga cgcccgcgaa gacgccggtg gcgctgccgc gcaggccgtg cggatcgacg 5760
ccggcgtgct cgaacgcctc ccaggcgact tcgaggaaca gccgctgctg cgggtccatc 5820
gccagcgcct cgcgcgggct gatgccgaag aagtcggcgt cgaagccggc ggcgtcgttc 5880
aggaagccgc cctggcgcag gtaggtgtgt ccggcccggt ccgggtcggg gtcgtagagg 5940
ccgtcgaggt cccagccgcg gtcggcgggg aagtcgccga tgacgtcacg gccttcggcg 6000
aggagctgcc acaggtcgtc gggcgaggcc actccgccgg ggaagcggca ggccatgccg 6060
accacggcca gcggctcgtc ggccggggtg gcgcggacgg cggggcgggc cgggacgggc 6120
gcgccgtcga gccgggtgag cagatggtcg gtgagggcgg ccgggttcgg gtggtcgaag 6180
acgacgctgc tggccagcgt caggccggtc gcctcggtca gcgcggtgcg cagccgcagg 6240
gaggcgaggg agtcgaagcc gagggcggcg aaaccgcggt gcggttcgat cgcggcgggg 6300
tcggcgtggc cgagcacggc ggcggtccgc agccgtacca ggtccatgac gcggtgccgg 6360
cgttcggcgg gggtcagccc ggccagctcg tcgcgccagg gcgtgccctc gtcggcggtc 6420
cgctgcgcgg ggagcgcgac gggggtggcg gccgggggca gcgggcgggc cgctgcgtcc 6480
acgggcggcc agtaccggtc gcgctggaag gcgtacgtcg gcaggtcggc cgggtgggct 6540
ccggtgcccc ggaagaaggc ggtccagtcg atgcgcacgc cgtgcgtgtg cgcctcggcc 6600
aggttggtca gcagggtcgg caggccggcc cggtcgcgct ggagggtgcc gacgaccgcg 6660
gctccggtct ccgtgcgctc gacggtctcc tgggtgccga cggtcagtac ggggtgcgga 6720
ctgacctcga tgaagccccg gtggccctgg gcgagcaggg cggcgacggc gtcggcgtag 6780
cggacgggtt cgcgcaggtt gcggtaccag tagccggcgt ccagcgccgt gccgtccgcc 6840
cactcccccg tcacggtgga gaacagcgga accgtgccct cacccggccg cacgccctcc 6900
agatcagcca gcagagcctc acgcaccggc tccaccagca ccgaatgcga ggcatagtcg 6960
acagcgatac gccgggcccg caccccccga cccccgcaat gagccaggaa ctcctccagc 7020
gccaccccct cacccgcgac gacgaccgac tcaggaccgt tgaccgcagc caccgccaac 7080
cggcccgccc agcccaccaa cagctcctcg acaccggacg gcccggcagc gaccgacacc 7140
atccccccac tgcccgccag cgccgtcaaa gccctgctgc gcagggcgac gacccgggcg 7200
ccgtccgcca gcgacaacac acccgccaca caagcagccg cgatctcccc ctgcgaatga 7260
ccgaccacag ccgacggcac gacaccgtac gaacgccaca cctccgccaa cgacaccatc 7320
accgcccaca acaccggctg aacgacatcc acccgctcca acgccaccgg atcacccagc 7380
acaccacgca acgaccagcc cacgaacggc tccaacgcca ccgcacactc agccatccgc 7440
cccgcgaaca ccggcgacga atccagcaga tccaccgcca tccccaccca ctgcgccccc 7500
tgacccggga acacgaagac ggcgcggccg tcgccgacgg cgcggccgcg caccacgtcg 7560
gccgactcgg cgccttccgc cacggcggtc aggccggcga gcagggtgtc gtggtccgcg 7620
ccgaggacga ccacgcggtg ttcgaaggcc gtacgggtgg tggcgagggc gagggccacg 7680
tcgtgggggg cggcgtcgtg cgcgggccgg tgggcgagga ggcgttcggc ctgggcgcgc 7740
agtccggccg ccgtccggga ggacagcgtc cacgggacga ccggcagggt gcggtccgtg 7800
gcctcgtcgg tgggctcggg ccgggcgggt gcctgctcca ggatggcgtg ggcgttggtg 7860
ccggacacgc cgaacgacga cacgcccgcg cggcgcggct gctccccgcc cggccagtcc 7920
cgctcctcgg tgagcagttc cacggcgccg gcggtccagt cgacgtgcgg tgacgcctcg 7980
tccacgtgga gcgtgcgcgg cagcgtgccg tggcgcatgg cctgcaccat cttgatcaca 8040
ccggccacac cggcggcggc ctgcgtgtgc ccgatgttgg acttcaccga accgagccac 8100
agcggctcgt cccgctcctg gccgtaggtg gcgaggaggg cctgcgcctc gatcgggtcg 8160
cccagccggg tgcccgtacc gtgcgcctcc acggcgtcga cctggctcgc ggccaggcgg 8220
gcgtcggcca gcgcctggcg gatcacgcgc tgctgggcga gtccgttggg ggcggtgagt 8280
ccgctgctcg cgccgtcctg gttgatggcg gtgccgcgga ccacggccag cacggggtgg 8340
ccgttgcggc gggcgtccga gagccgttcc aggacgagca tgcccgcgcc ctcggcgaag 8400
ccgaacccgt cggccgccgc ggcgaacgcc ttgcagcggc cgtcggccgc gagggcccgc 8460
tgccggctgt actcggtgaa cacgccgggc gtggacagca cggtcgcccc gccggtgagc 8520
gccagcgtgc actccccggc gcgcagcgag cggaccgcga ggtgcagggc gaccagggac 8580
gaggagcagg cggtgtccac ggagagggcg gggccctcca ggccgagggt gtaggcgacc 8640
cggccggaga gcacgctggg cgaggtgccg gtgacgacgt acccctccag ctcggtggcc 8700
accgggccgg tgatgtcgga gtagtcctcg ctgctgaagc cgacgaacac gccggtggcg 8760
gtggagcgca ggccggccgg gtcgatgcca gcccgctcca gggcctccca tgaggtctcc 8820
agcaccagcc gctgctgcgg gtccatggcc agcgcctcgc gcgggctgat gccgaagaag 8880
ccggcgtcga agtccgcggc gccgtcgagg aatccgcctt cgcgggcgta ggaggttccg 8940
ggccggtcgg ggtccgggtc gtagaccgag gccatgtccc agccgcggtc ggcggggaac 9000
gccgagaccg cgtcggtccc atcggtcacc agccgccaca ggtcctcggg cgaggtcacg 9060
ccgccggggt agcggcaggc catgcccacg atcgcgatcg gttcgcggtc gcgggcctcg 9120
gcctcgcgca gccggcgccg ggcgacctgg agatcgcccg tgacctgctt gaggtagtcg 9180
agcagtttgg cctcgtcagc catcggtgca cccccgtgcg gttcgttcgg cgcgggtcac 9240
gagacgcccc ggtcgatcag gtcgaagagt tcgtcggcgg tgacgccgtc cagagcggcc 9300
cgctcgggtg tgccgtcggt cgtgccggcg tcccagcggg ccgcgaggtc ccgcaggtgc 9360
gccgccaccc gggcgcggtc ggtgccgtcg gccggcagtg cgccgagcgc gctctccacg 9420
cgggccagtt cggcgatgat ccggtcggcg ctcgcctcgc cggactcgct cggcaggagc 9480
gcgtcgagga ggtggtcggc gagcgcggcc gggttcgggt ggtcgaacac gatggtggtg 9540
ggcagtcgca ggccggtggc ggtgccgagg cggttgcgca gttccacggc ggtcagcgag 9600
tcgaagccca gttccttgaa gccgcggtcg ggtgccaccg cgtcgcgtcc ccggtgtccc 9660
aggacgtcgg cgacctggcc gcggacgacg tcgagcaggg cgggggcgcg ctcgggcgcg 9720
ggcagcccgg tgatccgcgc caccagggcc gccgcaccgg gcaccgggcg ggcggcggcc 9780
gggccggccg gggtggcgac caggccgcgc agcagcggcg gggtgggcgc ggcggaggcg 9840
gtggcgaggt ccaggcgcgc ggtgacggtc acggcgtcgc cggtggcggt ggccgtgtcg 9900
aacagggcca gtccttcggc ggcggccatc ggcacgatgc ggttgcggcc ggcgcgggcg 9960
acgtcggcgg cgtccaggtg ccgggtgagg ccggtggcgt cggcccacag gccccaggcc 10020
gcggcggtgc cgggcaggcc ggcggcgcgg cgccgttcgg cgagcgcgtc gaggaaggcg 10080
ttggcggcgg cgtagttggc ctgcgcgggg gtgccgaggg tggccgccgc ggaggagaac 10140
agcacgaagg cggacaggtc cttgtcctcg gtgagttcgt gcaggtgcca ggcggcgtcg 10200
gccttcgggc gcagtacgcc cggcagccgg ccggcgccga gttcggtcag cacgccgtcg 10260
tcgagggcgc ccgcggtgtg caccaccgcg gtcagcgggg cctcggcggt cagcttggcg 10320
agcagcgcgt cgagggcggc gcggtcggtg acgtcgcagg tctcgaagcg gacggtggcg 10380
cccgccgcgg ccagttcggc gaccaggtcc gcgctgccgg gggcggcggc gccgcgccgg 10440
ctggccagca ccaggtcacg ggcgccgtgt tcggacacca gatgccgggc gagcatgccg 10500
ccgagcacgc cggcgccggt gatcaggacg gtgccgtcgg cgtacggggc gacggtgagc 10560
acgatcttgc cggtgtgccg ggcctgggcc atgaaccgga acgcggtgcg cgcgtcggcg 10620
aggggccagg tccgggtggg cagcccggtc agctcgcccg cctcggcgtg ggcgacgacc 10680
tcggtcagca ggctctggac gcggtcgggg ccggcgtcca gcagcaggtc gaacgggagg 10740
tagtcgacac cgggcaggcc ggcggggtcg cggcggtcgg tcttgccgag ttccacgaac 10800
cgtccgccgg gacggagcag tcgcagcgac gcgtccacga actcacccgt gagggagttc 10860
agcacgacgt ccatctccgg gaaccgctgc gcgaactccg tatcccgcga cgacgccaca 10920
cgcgcctcgt ccagaccggc cgcccgcagc acctcgtgct tgccgggact cgccgtcgca 10980
tacacctcgg cgcccagcag ccgcgccacc cgcaccgcgg ccatgcccac accaccggcc 11040
gccgcgtgca ccagcacccg ctcccccgcc cgcaccccgg ccacatcgcg cagcgcgaac 11100
caggcggtgg cgaacacgga cggcagggcc gcggcgcgga cccaggacca gccggcggga 11160
acgggcacca cgagccgccg gtccaccacg gcgagggtgc cgaagccgcc cggcaccatg 11220
ccgaggactc ggtcgccgac ggcgaggtcg gtgacgtccg gggcgaccgc gaccacggtg 11280
cccgcggcct cggagccgat cgcgtcgacc tcgtccgggt acatgtcgag cgcgcacagc 11340
acgtcgcgga agttcaggcc cgccgcgcgg acggcgatgc ggacctggcc gggtgccagg 11400
ggggcggtgg cgtcgggagc ggcgacggcg tcgacgccgt cgatgctgcc gggccggacc 11460
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gtgagccggg cgacgaggcg ttcgccgtcg cggagcgcgg tctgcggctc gtcgccgacg 11580
gccggcacag cgtccaggga ggcgggtgtg ccgtcggtgt cgacgagcag gaaccggtcg 11640
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aacagcgcgt cgcgcgtgcc ggcggcggcc acggcgcgga gctgcccggc cgacgcgggc 12060
cgcagccgca gcgcggccag ctccacgacg ggccggccct cgcggtcggt cgcggtgagg 12120
ctcagcgtgt cggcgctctc ccgggcggcg cgcacccgca ggacccgggc cgggccgggg 12180
tgcacggtca cgccggtcca ggtgaacggc agcagcagcg gcgcgtcctc gggctcggcg 12240
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tcgacggtgt cggggagttc gacctcggcg tagacctcgg tgtcccggcg ccacagggcg 12360
cgcaggccct ggaaggcggg cccgtagccg tagccgcggg cggcgaaacg gtcgtacacg 12420
ccgtccaccg ggaccggctc agcgcccgcc gggggccacg cgccggtctc gggctccgcc 12480
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tcgcgcaggt tgcggtacca gtagcgggcg cccagttcgc tgccgtcgat ccagtcggcg 13260
gtgacggtgg agtagagggg cacgtcgccg tcccgggggc ggatgccctt gaggtcggcg 13320
agcagccgct gccgtacggc ctccacctgc ggggagtgcg aggcgtagtc ggcggcgacg 13380
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gagcaggcgg tgtccaccgt gaaggcgggg ccttccaggc cgaggacgta ggagatgcgg 15060
ccggccacca cgctggccag gcggccggtc agggcgtgcc cgtcgccgcc ttccgggatg 15120
ccggcgagca gcgaggagta ggactgggcg ttggcgccga cgaacacgcc gacgcgtccg 15180
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gaaggtggtg gtctcggtgg ggccgtagcc gttgacgacc gtcaggtccg ggtgggcgcc 24420
gcgcacgcgg gccacggtcg ccggggacac ggtgtcgccg ccgacgacga gttcgcggac 24480
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acgtacgccc agtacgtggc cgcgccggct tctgacctgg ctcacaagcc ggccggtatc 37380
gaccacgtgc aggcggccgg ggcgccgatg gccgtgctca cggcctggca gtacctggtc 37440
gacctcggcc acgaggtgcc gtctcctttc accggccagg tgcaccagcc ggtgccgatc 37500
acgccgggga tgaccgtgct ggtcaacggg gccgccggtg gagtgggcca tttcgcggtg 37560
caattggcga aatggaaggg ggcacacgtc atcgcggtgg cctcaagtcg gcacgagcgg 37620
ttcctgcgcg agctcggtgc cgatgagttc atcgactaca ccacgacgca ggccgcggac 37680
gtggtcagcg gtgtcgacct ggtgatcgac accgtcggcg gcccggacgg ctcacgcttc 37740
ctgaccgtac tcaagcgcgg cggcaccctg ctcccggtgt tcttcgccga gtacgacccg 37800
gaagagacgg cgagtctgga catcaccgtc tcgaacattc aggtacgttc ccacggcccc 37860
cagctcgccg agatcgggcg cctgttcgac gagggcacac tccgggtcgg ggtggacagc 37920
acctacccgc tgtccgaagc ggtcagcgca cacacgcgag ccgcgcaggg ccacatccaa 37980
ggcaagatcg tgctgacggt ggcctcgtga tcgccgaaac tccagcaggc ggtggcgaac 38040
tacgcccacg ccttggacga gttgcatata cccgagctgg aaacggtcct ggccgaagac 38100
accacctgga ccgtcacgat gcccggacag gggatgctcg gccccgtcgc cggacgcgcg 38160
gccgcggcgg tgctcgactt catcttcatc ccccgtgtca gctcggtgag cggtgtccca 38220
gaccggcccg ggacctcagc agttgcccag ccgacccgat gagcgcgggc gccgagttgc 38280
ccgcgagcag ccgcggcgcc atcttgacgg gcaggcccag tcgcgctgcc gcgtcggatt 38340
cacgccggtt tcctcgggtc gctgtcggcc aagtcagcgg tcattgtgcc acccgtccca 38400
cttcggaaga cgctgaccgc cgctcccccg atcctggatg cggcggcttt cacggcacgc 38460
tgctccgctg ccgtgccgac gaggtctccg gacggctgag ccgtgctgcg catgccgcgc 38520
cgcctcggcg accgatcgcc gcgcagcgtc agatgcgccg gactttcgcc acggcaaggg 38580
cgtccgcgac ctcccggacg acacgcttcg cgtcgtcggg gctgttcacc acgtcggtgc 38640
ggttcatgtc gatcacgagg acatcgctgg cggaatagtg ctcgtgcacc cagtcgtcgt 38700
acccggccca aagcgtccgg tagtactcga cgagactttg gtcctgctcg aagtcacgcc 38760
cccgcagtcc gatgcggcgc agcaccgtct cgaagtccgc tctgagatac accatgagat 38820
cgggtgcctt gcgatagggc aggccgtcga tctcacgcat catctccgcg agcaacccct 38880
cgtacacctg catctccagg gaactgatcc tgccgaggtc gtgattgact ttggcgaagt 38940
accagtcctc gtagatcgac cggtcgagga cgttgtcgtc ctgtttgtac gcctccttga 39000
tcgcggcgaa tcgcgtctgc aagaagtaga gctggagaag gaagggatag cgcttcgccg 39060
ctatctcctc aggaccggcg gtgtagaaga gcggcaggat cgggttgtcc tccacgctct 39120
cgtagaagac catgctcccc agctctttgg cgatcagctc ggccacgctt gtcttcccga 39180
tcccgatcat gccgccgacg cagatcactg ccatacctcg cttctttccc gggacaccgt 39240
ccgcgggcgc gattcccgcg caccggctct tccacggcac acgcaccgcc gcggagcgca 39300
gtcgtggaag cgccccaggc gcaggtgacg agcctggcct ccgtcggacg accgaagcgg 39360
catcatatcg gcacggaggg gtgttcgaat ctacgtgctc gtgccctgga tggaagacgc 39420
tggtgcaccg ggtagcggga tcatcggagg tgatcatgta gcgggtgggc ggaacgacgc 39480
ggaacgacgg agtggtggga caggggccac tgacgcacgt atccgcagcc gcgctggagt 39540
cgccgacctc cacaggttca ctctcaccgg tgaccaagga aagatcgccc gcatgccagg 39600
ctcgcccgct cctccccgga acagcgcgta caccgatcag gagaacgacg ccgcgacccc 39660
gagcgagcag ccgagcctgt gtggacgccg aacgtgtcgg ttaccactcg acgaccagcc 39720
ttgacacacc gcgcgtcgcg aggccctccc gccatacgag ggcctcgtcc cccggtgcga 39780
gtcgcaggcc ggggaagcgc tgccacaagc gggtcagcgc gatcttcatc tggagaagaa 39840
ccagtggcgc gcccatgcac cggtgggcgc cgtgtccgaa tgtgaggtgt gcaggccggc 39900
gggcgctgct cttcgcaccc gatgtgcaaa atacttcggc gtcatgattg ccgtgcagca 39960
acgagacgat gacggcctct ccttggcgca ccgtcgtccc gcccaggaca aggtcctcga 40020
tggccactcg gggaaaactg ataggtgtgg acggcgtctt gcggagcagc tcctcaacca 40080
gatcctccac ggattgcccg tcgagcgcgt caccggtgag cagttcgagt atggcaaggc 40140
tcaattgatg ggcggtggtc tcgtaaccgg ccatgagaag tgccagtccg aggttgatca 40200
actcgatgcg ggatatctca cccgactgct caacccgcac cagcgcgctc aggagatcct 40260
gcccgggcgc atccctcttt ctttcgatca gtgaggacat gtacttgata agagtcagga 40320
tatggcggcc tcttctgcgg gttccctgag gcgtcatgtc gaacagcgca gtcacggcgg 40380
cgtcgaaaac gggccgctcc gccgccggca cgccgagcag tgagctcaac gcgaccatgg 40440
gaaggggcga agcataaccg ctgaccaggt cggcgcctgg ccccgcaacc tgtagccgat 40500
ccagcagtgc gtcggcggcc tcctcgatca ccgctgcctg tgcggtgact cgggcgctgg 40560
tgaacgctgc tccggcgacc cggcgcagcc gggcgtggtc cgcaccgtcc agactcatga 40620
tcgagttggg tgagaggtcg acggatcccc atttcggagc atcggggtgg gtggccgcag 40680
ctctgctgag acgtgtgtcg gcgagcgcgg cgcgccccac ggcgtagtcg gtgaccagcc 40740
acatgtgatc accagtgggc atccgcaccc gtttgacggc ctcacttgat ggcgctgcca 40800
ggaagggcgg cagggggccg accctgtggt gatcgaaagt gccggacatg gtcgattact 40860
cctgttcggt cggaaacgcc gcggggtgtc tgtctcccct gccgccgacg gccgtgggag 40920
acgacccatc gggtggcggc cgggtcgggc gagcgggctt tttccaccgc ccggaaggcg 40980
gcccgctgtt cggtctgcac gctgttcggg ctgcccggct tcggcggaca gaccggcttt 41040
ggcggacaga ccggctgccg gatgttcgtc acgtagcgcg cacggtgtgt tccctgcctc 41100
tcagcgcatc ccgccgtcgc ggcctgacgc gttggacgcc tgtggtctca gccgagcgtg 41160
ggcaccgaac tgcgtcggcc cgtcgacctg cgctctgcgg gacaggacga ggtcccggag 41220
tcgctgtggc agggcgtcgt caaagcggag gtggtccggc accgtgacgc cggcgttgcg 41280
cagcggcgtc gcgatctcgc ggcaggtggt gctgagccag ttgaggaccg cgggatctcc 41340
cgagcggccc gcgaccggcg tccaggtggc cacttccggc tgccggaggc cggcgtcgag 41400
gaacgtccgg gtgaggcggg ggccgaagtc ggggacggcg ccggccgcca ggaaggggcc 41460
gggccacagc gcgtagtact cgtcccactc cggcagcggc ggacgtgacg gcgacgtgtt 41520
ggtgaagtcc atctcgtgca tgacgacgat cccgtccggt ttcagcaggg acgtcagacg 41580
gcgcagtgcg gatgcgggat cgggcaggta catcaggatg tacctgccga ccaggacgtc 41640
gaacttcatc ggccaggtga agtcggccag gtccgcggct tcgtaccgca ccgagtccgc 41700
gagccccgcc tcctgtgcca ggatccgcgc cttgtggacg gttccggggt cgcgctcgat 41760
tcccacgacg tgtccgccgg gcccgaccag ttgggcggcc agcagagaga cgtatcccag 41820
tccggcaccg atgtcgagga cgctcatccc cggacgtact ccggccgacc gcagggtgcg 41880
ttcggtgaac ggcgagatcg cctcgttctg aagggtcagc ctttggtgct cgctatcgga 41940
gtaaccgagc aggtatgcgt cgtgcgccat gcgaggcctc cagggccggt cgtgcgggga 42000
gttccccacg gcaggtggcc agggggctcc gcggtgtctg gagcactgag tgccctgtag 42060
cggccgtgcg gtgtggtccg gtgttccggg tatgtcacgc accggagcgg gacatgtacg 42120
tgtccgaagg cggcgggcgg cgcagagcct tgccgctgga ggtgcgtgcg atcccgccgc 42180
gccgcacgaa ctcgatcgtg tcgggtgtga tgcccagctc ggccaccaca cgtgcgcgga 42240
tgtgttgcgt cgtggcacga cggctcgcct cgtcgtgccg cgtcgtctcg acgacgagcc 42300
cgaggcggcc tccctcgtcg ctccagatct gctcggccag gacgccgtgg acgaggaggc 42360
cgggtgtgtc ccgcacgacc gcctcgatgt cgctcgccca gtggttcgcg ccgaagacga 42420
tgatcacctc tttcgtgcgg cccacgatgt acagctcgcc gtcgtgccac aggcccaggt 42480
caccggtcgc caaccagccg cccggaagga ggacgcgacg gctctcttcg gggtggcggt 42540
cgtacccggt gctcgtgacg gacgcccccc ggacctcgac ggcgccgacc gtgccgggca 42600
cggccggtgc gccgctcgcg gtggtgagcc ggacctcggt acgccgcacc ggcgttccca 42660
cactgaccag ttcgcgacac ggcccggcgc cggacggcac cggtacgtaa cggccccggt 42720
tcagttcgtc ccggtcggca cgcagcacct tggccgggcg gccgagggga gggaaggcga 42780
ccgccagggt cgcctccgcc agtccgtagg ccggcaggaa gacgttctcg gacagtccgg 42840
cgggcgcgaa acgctcggcg aaggcgtcct gaagccgccg gtcgaccggc tcggcgccgt 42900
tcaccgcgat gcgccagcgg gagagatcga ggccggccgg cggcgccgcg tcgcgcctca 42960
ggacgtagcg gtagccggag tcaggagcca tggtgaaggt cgcccccagc cgccccatgg 43020
cccggatcca gtcacccgga ctgcgcaggt agtcctccgg tgtcagcaga tggatgtcga 43080
cgtcgtgcag cagcggtgtc aagaaggaac cgatcaggcc catgtcgtgg aagaggggca 43140
gccaggtgca gccgacgtcg gtcctggcga gccgtgtgcc atgggcgatg gccgccaccc 43200
cggccgccac gttgccgtgg ctgagcacga cgccccgcgg ttcgctgctc gtgcccgacg 43260
tgtactgaac gacggccggg tccgacgccg cccgcgcgac gtgggccgcg gacggctcgg 43320
ccacctccgg caccaggagt acgtcgaccg ggcgggcgcc gtcggacagt ccaggaccga 43380
gcagcgggcg catggccgga gccgtcagca cggtccgtac ccgagagcgg cgcagggccg 43440
cggaggtgcg ccggagatag gcgtcggacg acccgaaggg cgcgggaccg ggcagcggca 43500
ccgcgaccgc gcccgccgcc agcacgccga agaaggcgcg cgcgaagtcc accgacgtcg 43560
gcaggacgag ggcgacccgc tcgccgggtc gcaccccgcg cgacagcagc cccgcggcca 43620
cccgcccggc ctcggcgaag aggtcgctgt aggacagcgc gtcgccgtcc tggccccggc 43680
gcagcacgtg catgccccgt ccggagcctt gtgcggcgac gcggccgagc gcggcgaaca 43740
gggtcacgac agcggttccg tgccggcctc cgcgatcacc ttggtgatcg cggccgcgaa 43800
ctcccgcacg gtgctcgtct cgaagacgat gcggtcctcc acctcgatgt cgtagtgctg 43860
ctcgatctcc agcacgatct ggagcgcgtg gatcgagtcg aagcgcggca aggagcgcag 43920
atcggtgtcc acgcccacct cctcgacacc gatgcgcagt tgctcggcga cggatcggcg 43980
gacggtctgt tcgatgtcgg tgacactcgc ctgtgacatg gcgtggtgtt gtcctgttct 44040
gtgaggccgg cgcgtcgggg cgcggcggga ggcggacgcc gggactgacg gtcagcgagc 44100
gccgggccgg cgggccaggg cgcgcagctt ggctttgatg tcccgcgggg tctccaacga 44160
gtcgtcgtcc gccaggagcc ggacgatcga catcaccttg gcgtccgcgg cgtccaccga 44220
gtcgtgctgg atggtctcga tacggcggat gccggccgtg gatgtggaat gcgggtagaa 44280
catgcccgcc gggtgcttga cgccgttgct acggtccgcg agccagatgt aggccatgcg 44340
cagcgcggcg gcctgatggg ccggatcgct gtcgcacagt tcccgcatga agacggagaa 44400
cgcacggcag tgccgggcct cgtcgcgggc caggagccgc cagattctgc ggatcaccgg 44460
ctccgacaca tgggcggcga gcgccttgta gagggcggac gcgcgtgact ccgagatcac 44520
gttcatcatg agggtggcgg agcgcacgtc gccctgcgga tacggctctc gtttgtagag 44580
cgcgtgcttc gaacggagtg agaccccgat ccggtccagg tagcgggcct ggaccagtga 44640
gtgccgggat tcctccgcac cccattgcag tgcccaggag gagaagctga cctcgtcctg 44700
ccattcccgc aggaagttgt gagcgccggg tagggtgccg aactcgatga cggccgcctc 44760
ggtgaggaag tccacggtcc gttcgtcgag catgccgtgc tcgatgcggt ccaggtccac 44820
ctcggtccag tcccagcgcg tcgtctcgaa ccagtcgaag atcttgttga aggtcatgtc 44880
gaggtagtag tcggtgtaga ggtcgtccgt catcagcgcg cggtgcgccc gcagggccag 44940
ttcgaccgag gtggtgaacc cttcgggcgc caccgcggcg ggccggacga tgtcctcgac 45000
gtccagtgct tccgcccagc cgggaaccgg gcccgccgta tcgggcccga cgacgtacac 45060
ccgggtccgg ttgaacttcg agtgcgaccg cagcgcccgg acggcgggca gcggctcggc 45120
gtccgccccg atccacaccg ccgcgagctc ggatgacggt tcgaactcgt gcaggtagcg 45180
gtgccagtcg gcgtgtgccg gccggtccac ggtgacgtcg ccgaaggcgg ggacggtgag 45240
cctttcggcg ggggagactg cggtggtggg tgccagcagg gcgatggtgt gcgggggcac 45300
ggagggcgtc ctctctgtcg gtctgcgcag gccgtcggcg agcaccttgc cgcgcgttgt 45360
gtggggctcg gctccgtaac acgtgcgtgc cgcgacgtca gagccgcccg tactccgcgg 45420
cagggccgag gagtacgggc agcgcctcga tgctgttgct gacgaacgag ggcacgggcc 45480
gcacggtcca cgtgtcggac ggggccagcc gcacgtcggg gaaccgggtg aagaatccgg 45540
ccagtgccgt ctccagctgg agacgggcca ggtgtgtccc gatacagaag tgcgggccgt 45600
gcccgaagcc gaggtggccg gcctgccgcc ggcggacgtc gaagaggtcc gcgtccggcc 45660
cgtggtgcgc cgggtcccgg cccgccgagc cgaaggacgc gaggatggct tctccccggt 45720
ggatcgtctg gccggcgatg acgacgtcct cggtcgggta gcgcatcggg aactggttca 45780
ccgcgccgtt ccagcgcatc gtctcctcga ccaccgcact ccacgggacc tccccggcgc 45840
gggcggaggc cagttgctcg gggtgggtga gcagcgcgtg gcaggcgttg acgagtacgt 45900
tgatgacgct ctggtggccg gcgaagaaca tcagcaggat catgccgtgc agttcgctgt 45960
cggtgagccg gtcgtctccg tcctggcgtg ccgtgagcag gacgctgatg aggtcgtccc 46020
gggggacgtc gcgacgttcg gcgacgatct cccggagcag cgcttcgatc cgtccgtcga 46080
tctcctggac ctgttcgggg gagttgttcg tacgggtctg catgccggtg agcacgtgca 46140
gcagacgccg cttgcgctgc gggatcccca gcaggtccga gatgacggtg gtggggatgg 46200
ggtaggcgaa agccttgcgg agatccaccg gccggtcttc cggccgtgtg gcgagctggt 46260
cgaggagccc gtcgacgagg cgttccaccc ccgggcgcat ggcctccacc cgttccgggg 46320
tcagtgcctg gtcgaccagt ccgcgcagcc gccggtgatc cgcgccgtgc gaattgatga 46380
cgctgtcggt cgcgacgaag cccatcaacg gccacccgtc cggcacttcg ccgcgggccg 46440
ctgcctccca gtgcgtgatt cccttggcga ccctgggatc cgtcagcact cggcgcaggt 46500
cctcgtggtg cggaatcgcc cacgcccgca caccgccggg gagttggacc ggaacggctc 46560
tccccgccgc ccgcaggcgg gcgttctccg cgtgct 46596
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 4
cagagaattc gcggtacggg gcggacgaca aggtgtc 37
<210> 5
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 5
gcgcatgcat gtgccggtgc cggtccgcga gccgcttgg 39
<210> 6
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 6
cctcatgcat ctggaggacg tcgcaggtga attctgggcg 40
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 7
gggcaagctt ctcctggctg agcttgaaca tcg 33
<210> 8
<211> 3994
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA fragment
<400> 8
cagaggatcc gcggtacggg gcggacgaca aggtgtcgtt gccgcgccgg cactcggact 60
ctcgcagcct cacaacgctg ctggccgcgg cggtgtacct cacgtcgcgg gcggtggacg 120
acgcgctgga tctgctgaag gtcctgatcg cgacgaagct tgcagaccgg ctgcacatcc 180
tggacggcgg tgctggacgc cacattcgaa aagcgcctgc tcaatacccg cccccaacgg 240
agacgaggtt gaacgacaag ctcagggcgt ctgagtactt cggttgagta gttctgccca 300
tgtgaggggc agggccgtcg agacaggctg tgtacacaac gccgcggtgc gcagagcgct 360
cggcgaagag accagtagcg gtcatctatg aggggatact tcatgtccaa gcgccttgtc 420
gtctcgtcgc tcgccgtggc cgcagccgtc gttgccggca ccgtggtgtt cgtctcctcg 480
gccgacgccg ctgtgccggc caagccggag atctcaaagg ccaccgccca ctacaccagt 540
acggccggtg ggagcgcctc gctcaccttc agcgccaccg tggccgacaa ctccggaatc 600
aagagcctgc gggtgctcgc ctggccggcg agttcgggcc ttgcgcccac ggcgggcgag 660
atgcgggatg tcgaggaagc cacgtgcaag gcgacttccg cgacggcctc ggtgtgcacc 720
tacaccgtga agagctcggc caaggaagcc gccgcgttgc ccaagggcgt ctggcacgta 780
tccgtgctgg ccaccgccaa ggaccacgac acgaccttcg cgccccaagg cgccacgttc 840
accgtcaagc actgacggct ccgccccgcc ggaatgatga tcgcggcccg cgcgccgggc 900
ggaccgtatc gcgacctcca ttggacccgt tgaaccgcac gacgcggtga actccgccca 960
ccctgcccca gggcggacgg agttcacctg ggggcgacgc cgcgcatctg acgcgcgctg 1020
ccacgatgcc gcaccactcc gcgcgcgggc ggatgcaggc gaagtgactc ccagctcgac 1080
gcgctcgcca aacacggcat ctcgcgcgac tacatcttcg gcgagaagat cagcacccgg 1140
gcgcggggca gcccgaagtt ccgggaggag gcgctgaggg cggcgcggga ggtcaaggcg 1200
cacgccccac actgccgtgt catcttcacg gtgtacgagc ggaagcggct cggtcgcaac 1260
gccgccgaac tcaccgccct cgccgaccac ctcaccgccc acggcttggt cctggagata 1320
ttcgccgggc cctgtcgaag gactcccgga gccgtggaac ccggcgccca cccgacgcga 1380
cagcccgacg cggcagttgg ggcgctcccg cgcggcctgc ccggacaccg aaacgcccgg 1440
caccacaagc gaaagagcgt ccgtcggcaa gctgacgggt cctcatgaag gatttaggcc 1500
agtgatttgg gacacacccg aacgcgccgg ccggatctga ggaatcgcct agggcccgct 1560
cctatcggga acttgaagcc gccctgccga gccaacgctt gactccggtt ccggcggtgc 1620
ggatgacgat aatttccggt gagtctgccc aaaagggtac atagcgggcg catagaaaac 1680
tcttgcgagt gctgcgggtg gcttgtaggg tcctaatgaa tcggctggac aagggaaggt 1740
tgatgcgggc gtccgaacca aaatagcttc ggacagcaac tgctgccttc tgtcgatgga 1800
agtaggggga agttcgtgga aatcggctcg ggcgcgcccg aattaaccgc gtcgtcggtg 1860
tatcagcagc ggcgtgacca aatcgccgca agcgctgccg cctatgtgcc cggcgagccc 1920
attccagagg tcgagtacac ggacgccgag cacgctctgt ggcgcctggt ttccaagcgg 1980
ctcgcggacc ggcaccggca catgcatctg gaggacgtcg caggtgaatt ctgggcgtcc 2040
tgcgacgata catccattga aaaactaatg gcggttgata tatgacccgg ctcgcagagc 2100
aatcatccac tgcgcagcag agcccggaat cagaagtact ggacgtcacc ggaatcggat 2160
tcggtgccgc gaatctcgcc ctggcggtgg cgctccatga atccgaagcc gccgggaagg 2220
cccttttcct ggagaagcag aaggaattcg gctggcatcg ggggatgctc ctggggggct 2280
cctcgctcca ggtgtccttt ctcaaggaca tcgccacgat gcgcaatccc accagtgatt 2340
tcggattcct gtcctatctc caggagaagg accggctggt cgacttcatc aaccagcaca 2400
ccctgctgcc ctcccggatc gagtaccacg actacctcca gtgggccgcc gaccggctga 2460
accacctggt cgagtacggc gtggaggcca ccggtgtgcg gccggtgacc gaagccggtg 2520
aggtcgtcgc gctcgacgtg ctcgccgggg accgggtggt cgcccggacc agaaacctcg 2580
tcctcgcctc cggcctgcgc ccccggctgc ccgagggcgc ggagaccggc gaacgcgtct 2640
ggcacagctc ccagttgctg caccggctgc ccgcgttcga cgaacgcccg ccccgccggg 2700
ccgtcgtggt cggcgccggc cagagcgcgg ccgaggtcgc cgcgcacctc atggaccgct 2760
acccgcaggc cgaggtgtgc gcggtgttcg cccgctacgg ctacagcgtc gccgactcca 2820
gcccgttcgc caaccgcgtc ttcgacccgg ccgccgtgga cgacttctac ttcgccccgc 2880
ccgaggtcaa gcaggccatc atgcgctacc acggcggcac caactacgcc gtcgtcgacg 2940
aggacgtcct ccagggcctc taccgccgcc agtacgagca gaaggtgtcc ggcgccccgc 3000
ggctgcgggt gatgaacgcc tcccgcctgg tgtccgtcga accgcgccag gaatccgccg 3060
ccgtacgcgt ggagttcctg cccacgggcg aacacaccga cctggacgcc gacctggtcg 3120
tgtacgccac cgggtacgac tccaccgacc cggccgaact gctcggcggc gtctccggcg 3180
ccctccgccg ggacgaggcg ggggagttgc tgatcggccg cgactaccgg ctcggcacca 3240
ccggggattt ccggtgcggc atctacgtcc agggcgccac cgaggcgacc cacggcatcg 3300
cctccaccct gctgtccatg gtggcggtcc gcgcgggcga gatcgcccgg tcgatcaccg 3360
gcggccggtg cgacccggac cgctccaccg gaagcaaggc agcagcgggg aacaggggct 3420
gaagtgtacg aacgtccgct gtaccgggag gattgcgacg gcgtcgtcct ggcgtttctg 3480
cgacacaacc cactggcaat ggtcgtcacc tcgcacgacg acgtcccggt ggccacccac 3540
gcgccggtgc tgttccggca cggacccgac ggcgccgacg ccgaggccgt cgccgcgggc 3600
accgtcccgc tcgccggctc caccctgatc ggccacatga acgtcgagaa cccgcagtgg 3660
cgccggatgc gctccggcga ccgggcgctc atcgtcttcc agggcccgca cggctatgtc 3720
tcgccgacgg tctacggggt cacgcccgcg gcccccacct gggacttcat cgccgtccac 3780
gtgaacggca cagtggagcc caccgccgac cccgccgccg tgctggacat cgtctccgac 3840
accgcccggc ggctggagtc cggcttcggg cgcggctggg accaggagtc ctccctcgac 3900
tacttccgcc agatcgcgcc cggcgtgggc gccttcaccc tgcgggtcga ttccgtgcag 3960
acgatgttca agctcagcca ggagtctaga gccc 3994
Claims (11)
- 제1항에 있어서,
고상 결정성 형태인 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제2항에 있어서,
상기 화합물은 다음의 XRPD 데이터를 가지는 Form I 결정성 다형체의 형태인 것을 특징으로 하는 화합물.피크 No. 위치[°2Theta] 상대세기[%] 1 6.2097 6.86 2 6.5031 7.76 3 8.2581 27.43 4 8.4838 33.64 5 9.5994 23.88 6 10.0981 8.54 7 11.0546 29.76 8 12.5883 14.81 9 13.1703 7.1 10 13.9184 100 11 14.2891 13.04 12 14.9759 10.37 13 15.3159 5.81 14 16.8844 18.15 15 17.1816 9.72 16 17.7384 53.03 17 18.1703 9.02 18 18.5613 32.19 19 19.0241 52.81 20 19.4201 5.08 21 20.0954 13.7 22 20.449 63.25 23 20.8962 43.44 24 21.1871 15.02 25 21.6388 16.08 26 23.0029 50.8 27 23.2869 17.19 28 23.6883 17.16 29 24.1071 13.7 30 24.2587 19.55 31 24.9948 13.34 32 25.209 26.16 33 25.9577 10.06 34 26.4298 9.38 35 27.3687 11.1 36 29.0171 7.95 37 29.5603 5.14 38 30.0609 7.35 39 30.5824 6.5 40 32.1814 4.39 41 32.6521 6.74 42 33.5957 6.6 43 34.7946 9.04
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
약제학적인 용도로 사용되는 것을 특징으로 하는 화합물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus, HCV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV)에서 선택되는 바이러스 감염의 치료용 약제 또는 면역억제제 또는 항염증제로 사용되는 것을 특징으로 하는 화합물.
- C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus, HCV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV)에서 선택되는 바이러스 감염의 치료용 약제 또는 면역억제제 또는 항염증제로 사용되는 약제학적 조성물로서, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 캐리어를 함께 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus, HCV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus, HIV)에서 선택되는 바이러스 감염의 치료용 약제 또는 면역억제제 또는 항염증제로 사용되는 약제학적 조성물로서, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 기재된 화합물 및 약제학적으로 허용가능한 희석제 또는 캐리어를 포함하고, 제2 또는 부가의 활성 성분을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 제3항에 따른 Form I 결정성 다형체의 형태의 화학식 I의 화합물의 제조방법으로서, 메틸 이소부틸 케톤으로부터 화학식 I의 화합물을 결정화하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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