CN103635484A

CN103635484A - 大环化合物及其制备方法

Info

Publication number: CN103635484A
Application number: CN201280026793.3A
Authority: CN
Inventors: S·J·摩斯; M·A·格雷戈里; B·威尔金森
Original assignee: Biotica Technology Ltd
Current assignee: Biotica Technology Ltd
Priority date: 2011-03-29
Filing date: 2012-03-29
Publication date: 2014-03-12
Anticipated expiration: 2032-03-29
Also published as: AU2012235961B2; US9139613B2; CN103635484B; JP2014514290A; KR20140071958A; MX2013011043A; TWI525098B; KR20140057481A; DK2691413T3; CL2013002739A1; US20120251581A1; CL2013002740A1; PL2691413T3; PT2691413E; HK1189237A1; BR112013024965A2; MY170618A; EA201391399A1; CN103619869B; MY170637A

Abstract

本发明特别提供了用于治疗病毒感染或用作免疫抑制剂的式(I)化合物。

Description

大环化合物及其制备方法

前言

本发明涉及萨菲菌素(sanglifehrin)类似物，其可用作亲环素抑制剂，例如在治疗通过病毒例如丙型肝炎病毒(HCV)、乙型肝炎病毒(HBV)和人免疫缺陷病毒(HIV)的病毒感染中，和/或用作免疫抑制剂，例如用于预防移植排斥，以及用作抗炎剂，例如用于炎性障碍。本发明还提供了其在医疗中使用的方法，特别是用于治疗HCV或HIV感染，以及用作免疫抑制剂或抗炎剂，用于其中抑制线粒体通透性转运孔(mPTP)是有用的疾病，例如肌肉萎缩，或者在产生进一步在医疗上有用的化合物中用作中间体。

发明背景

丙型肝炎

丙型肝炎病毒(HCV)是正链RNA病毒，并且感染是输血后肝炎的主要原因。HCV是最常见的慢性血液传染病，并且是美国肝病死亡的主要原因。世界卫生组织预测有超过1.7亿慢性HCV感染携带者，约为世界人口的3%。在未治疗的HCV感染患者中，约70%-85%发展成慢性HCV感染，从而具有发展成肝硬化和肝细胞癌的高风险性。在发达国家，50-76%的肝癌病例和三分之二的肝移植均是由于慢性HCV感染引起(Manns等人，2007)。

除肝病外，慢性感染的患者还可能发展成其它慢性HCV相关的疾病，并且成为向他人的传染源。HCV感染引起非肝并发症，例如关节痛(关节疼痛)、皮疹以及内脏器官损伤(主要是肾)。HCV感染代表了一类重要的全球健康保健负担，并且当前没有用于丙型肝炎的疫苗(Strader等人，2004；Jacobson等人，2007；Manns等人，2007；Pawlotsky，2005；Zeuzem&Hermann，2002)。

HCV的治疗

现有的标准护理(SoC)是皮下注射PEG化的干扰素-α(pIFNα)和口服给药抗病毒药物利巴韦林24-48周。治疗成功的定义为持续的病毒学响应(SVR)，其定义为在治疗结束和6个月后血清中无HCV RNA。SoC的总体响应率主要取决于基因型和治疗前HCV RNA水平。患有基因型2和3的患者相比感染基因型1的患者更易对SoC响应(Melnikova，2008；Jacobson等人，2007)。

大量HCV患者不能对SoC治疗产生充分响应，或者由于副作用不能耐受治疗，导致整个过程中频繁出现问题。SoC的总体临床SVR率仅为约50%(Melnikova，2008)。抗性的发展是治疗失败的另一潜在因素(Jacobson等人，2007)。SoC在某些不被视为治疗候选患者中是禁忌的，例如以往有显著抑郁或心脏病史的患者。通常导致治疗中断的SoC副作用包括流感样疾病、发烧、疲劳、血液学疾病、贫血、白细胞减少、血小板减少、脱发和抑郁(Manns等人，2007)。

考虑到应用SoC长期治疗的副作用、抗性的出现以及总成功率的次最佳，HCV感染治疗亟需更有效和更安全的新治疗方式。新治疗的目的包括改善的功效、改善的毒性、改善的抗性、改善的生命质量和产生的患者顺应性的改善。HCV生命周期较短，因此在药物治疗期间产生药物抗性是很常见的。

目前正在开发新的、特异性靶向丙型肝炎的抗病毒治疗(STAT-C)也称为直接作用的抗病毒(DAA)药物，其靶向病毒蛋白质例如病毒RNA聚合酶NS5B或病毒蛋白酶NS3(Jacobson等人，2007；Parfieniuk等人，2007)。此外，还正在开发靶向人蛋白质(例如亲环素)而非病毒靶标的新化合物，其可能预期使药物治疗过程中的抗性发生率降低(Manns等人，2007；Pockros，2008；Pawlotsky J-M，2005)。

亲环素抑制剂

亲环素(CyP)是一族细胞蛋白质，其显示促进蛋白质构象变化和折叠的肽基-脯氨酰基顺-反式异构酶活性。CyP涉及细胞过程，例如转录调节、免疫应答、蛋白质分泌和线粒体功能。人感染期间，HCV病毒在其生命周期内募集CyP。最初，认为CyP刺激促进RNA复制的HCV非结构蛋白质NS5B RNA聚合酶的RNA结合活性，尽管还存在若干假说，包括需要CyP PPIase活性。CyP的多种同种型，包括A和B，被认为与HCV的生命周期有关(Yang等人，2008；Appel等人，2006；Chatterji等人，2009；Gaither等人，2010)。在小鼠(Colgan等人，2000)和人T细胞(Braaten和Luban，2001)中产生敲除的能力表明CyPA对于细胞生长和生存而言是任选的。在细菌(Herrler等人，1994)、链孢霉属(Neurospora)(Tropschug等人，1989)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)(Dolinski等人，1997)中观察到CyPA同系物中断的类似结果，因此，抑制CyP代表了治疗HCV感染的新的和有吸引力的宿主靶点，以及对现有SoC或STAT-C/DAA药物的新的潜在添加，其目的是增加SVR，防止抗性出现并且降低治疗副作用。

已知环孢菌素A(Inoue等人，2003)(“CsA”)及其结构密切相关的非免疫抑制临床类似物DEBIO-025(Paeshuyse等人，2006；Flisiak等人，2008)、NIM811(Mathy等人，2008)和SCY-635(Hopkins等人，2009)结合亲环素，并且作为亲环素抑制剂在HCV感染的治疗中显示了体外和临床的效果(Crabbe等人，2009；Flisiak等人，2008；Mathy等人，2008；Inoue等人，2007；Ishii等人，2006；Paeshuyse等人，2006)。虽然早期关于CsA的抗性研究显示HCV NS5B RNA聚合酶中的突变，并且表明仅亲环素B与HCV复制过程有关(Robida等人，2007)，最近的研究表明亲环素A在HCV复制中是必要作用(Chatterji等人，2009；Yang等人，2008)。考虑到NS5A病毒蛋白质中的突变同样与CsA抗性相关，并且NS5A与CyPA和CypB都相互作用以产生特异性的肽基-脯氨酰基顺/反式异构酶(PPIase)活性，进一步表明了这两种亲环素在病毒生命周期中的作用(Hanoulle等人，2009)。

环孢菌素类似物的抗HCV作用独立于依赖于钙神经素的免疫抑制性质。这表明CyP结合是HCV活性所必需的，而不需要钙神经素结合。临床上最新的用于治疗HCV的亲环素抑制剂DEBIO-025在体外和体内显示了对抗四种最流行的HCV基因型(基因型1、2、3和4)的效力。抗性研究显示，导致DEBIO-025抗性的突变不同于聚合酶和蛋白酶抑制剂所报道的突变，并且没有与STAT-C/DAA抗性病毒复制子的交叉抗性。更重要的是，DEBIO-025还预防导致对蛋白酶和聚合酶抑制剂产生抗性的逃逸突变的形成(Crabbe等人，2009)。

然而，基于CsA的亲环素抑制剂在临床开发上具有许多问题，这些问题被认为与其共有的结构类型相关，包括：某些能引起治疗戒断和限制临床剂量水平的不良事件；能引起可变功效的可变药代动力学性质；以及能引起给药问题的药物-药物相互作用的风险增加。

接受DEBIO-025的患者最常发生的不良事件(AE)包括黄疸、腹痛、呕吐、疲劳和发热。临床上最重要的AE是高胆红素血症和血小板计数减少(血小板减少)。Peg-IFN可以引起显著的血小板减少，并且与DEBIO-025组合可以产生严重的临床问题。有关NIM-811的早期临床研究已描述了胆红素增加和血小板减少二者(Ke等人，2009)。尽管DEBIO-025临床研究中观察到的高胆红素血症在治疗停止后得以逆转，但其导致了16名患者中有4名由于该原因终止治疗，并且在未来的试验中使用的剂量水平下调。由于亲环素抑制剂对HCV的抗病毒作用是剂量相关的，剂量下降导致抗病毒作用的下降，并且当采用单一疗法时，许多后续的基于CsA的亲环素抑制剂试验显示HCV病毒载量无下降或下降很少(Lawitz等人，2009；Hopkins等人，2009；Nelson等人，2009)。DEBIO-025和环孢菌素A已知是胆汁转运蛋白例如胆汁盐输出泵和其它肝转运蛋白的抑制剂(特别是OAT1B1/OAT1B3/MRP2/MRP3/cMOAT/ABCC2)(Crabbe等人，2009)。已提出与胆汁转运蛋白特别是MRP2的相互作用可能是高剂量水平DEBIO-025下发现高胆红素血症的原因(Nelson等人，2009；Wring等人，2010)。通过抑制其它药物转运蛋白例如P-糖蛋白(Pgp/MDR1)、BSEP、OAT1B1和OAT1B3的CsA类相关的药物-药物相互作用(DDI)(Konig等人，2010)也可能是个问题，有可能限制某些组合和在经历共感染例如HIV治疗的一些患者中的使用(Seden等人，2010)。

此外，DEBIO-025和环孢菌素A是通过细胞色素P450(特别是CYP3A4)代谢的底物，并且已知是人P-糖蛋白(MDR1)的底物和抑制剂(Crabbe等人，2009)。已显示环孢菌素A是CYP3A4的体外抑制剂(Niwa等人，2007)。这表明与其它作为CYP3A4底物、诱导物或抑制剂的药物例如酮康唑、西米替丁和利福平之间可能存在增加的药物-药物相互作用风险。此外，与由P-糖蛋白转运的药物之间也可能发生相互作用(例如地高辛)，其在接受其它并发疾病的药物治疗的HCV患者中可能引起严重的药物-药物相互作用(Crabbe等人，2009)。已知CsA也具有高度可变的药代动力学，早期制剂显示口服生物利用度为1-89%(Kapurtzak等人，2004)。患者血水平若得不到昂贵的监测，可能导致由血浆水平升高引起的副作用发生增加，或者由血浆水平下降引起的临床响应降低。

考虑到亲环素抑制代表了HCV治疗的有希望的新途径，需要发现和开发更有效和安全的CyP抑制剂用于对抗HCV感染的联合治疗。

萨菲菌素

萨菲菌素A(SfA)及其天然同源物属于一类混合的非核糖体肽/聚酮，由链霉菌属物种(Streptomyces sp.)A92-308110(也称为DSM9954)产生(参见WO 97/02285)，其最初基于其对亲环素A(CyPA)的高亲和性而发现。SfA是发酵液中最丰富的组分，并且与CsA相比，其对于CyPA的亲和性要高约20倍。由此说明萨菲菌素可能可用于治疗HCV(WO2006/138507)。体外测试表明，相对于CsA，萨菲菌素显示更低的免疫抑制活性(Sanglier等人，1999；Fehr等人，1999)。SfA以高亲和性结合CyPA的CsA结合位点(Kallen等人，2005)。

萨菲菌素的生物合成

萨菲菌素通过混合的聚酮合酶(PKS)/非核糖体肽合成酶(NRPS)生物合成(参见WO2010/034243)。22-元大环内酯骨架由聚酮碳链和三肽链组成。肽链由一个天然氨基酸缬氨酸和通过酰胺键连接的两个非天然氨基酸：(S)-间-酪氨酸和(S)-六氢哒嗪-3-羧酸(piperazic acid)组成。苯丙氨酸的羟基化(或者在NRPS上原位或者在生物合成之前)以产生(S)-间-酪氨酸被认为通过sfaA的基因产物发生。

萨菲菌素的免疫抑制作用

SfA作用的免疫抑制机制不同于其它已知的结合亲免素的免疫抑制药物，例如CsA、FK506和雷帕霉素。SfA不抑制作为CsA靶标的钙神经素的磷酸酶活性(Zenke等人，2001)，相反其免疫抑制活性归于白介素-6(Hartel等人，2005)、白介素-12(Steinschulte等人，2003)的抑制和白介素-2-依赖性T细胞增殖的抑制(Zhang&Liu，2001)。然而，SfA发挥其免疫抑制作用所通过的分子靶标和机制目前尚不清楚。

SfA的分子结构复杂，并且其与CyPA的相互作用被认为很大程度上由分子的大环部分介导。实际上，由SfA氧化裂解产生的大环化合物(羟基大环)已显示对于CyPA具有强亲和性(Sedrani等人，2003)。X-射线晶体结构数据已显示，该羟基大环结合CyPA的位点与CsA相同。基于SfA大环部分的类似物同样先前显示缺乏免疫抑制性(Sedrani等人，2003)，这就提供了设计非免疫抑制CyP抑制剂有效用于HCV治疗的机会。

与此相反，也有机会开发具有低毒性的免疫抑制剂，其用于例如预防移植排斥、自身免疫、炎性和呼吸障碍，包括但不限于克隆病、贝赫切特综合征、葡萄膜炎、银屑病、特应性皮炎、类风湿性关节炎、肾炎综合征、再生障碍性贫血、胆汁性肝硬化、哮喘、肺纤维化、慢性阻塞性肺疾病(COPD)和乳糜泻的领域。萨菲菌素已显示具有新的免疫抑制活性机理(Zenke等人，2001)，有可能通过树突细胞趋化因子(Immecke等人，2011)起作用并且因此有机会开发具有与现行临床活性剂例如环孢菌素A、雷帕霉素和FK506不同的作用机理的活性剂。萨菲菌素A已显示比环孢菌素A的有效性低10倍，理想的新活性剂将具有改善的功效和/或治疗窗。

亲环素抑制剂的其它治疗用途

人免疫缺陷病毒(HIV)

亲环素抑制剂例如CsA和DEBIO-025已显示在抑制HIV复制中显示出潜在应用。亲环素抑制剂被认为在HIV逆转录的过程中/完成后干扰CyPA的功能(Ptak等人，2008)。然而，当临床试验时，DEBIO-025仅分别使9名患者和2名患者的HIV-1 RNA水平下降≥0.5和>1 log10拷贝/mL，而27名治疗的患者未显示HIV-1 RNA水平的下降(Steyn等人，2006)。随后，DEBIO-025在HCV/HIV共感染患者中进行了试验，并且显示对HCV具有更好的效果，并且HIV临床试验中断(参见Watashi等人，2010)。

HIV的治疗

世界范围内有3000万人以上感染HIV-1，每年新增300万例。自引入高活性抗逆转录病毒治疗后(HAART)(Schopman等人，2010)，治疗选择显著改善。到2008年，已许可约25种抗逆转录病毒药物用于治疗HIV-1，包括9种核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)、4种非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)、9种蛋白酶抑制剂(PI)、1种融合抑制剂、1种CCR5抑制剂和1种整合酶抑制剂(Shafer和Schapiro，2008)。然而，这些现有方案均不能导致病毒的完全清除，它们能导致严重的副作用，而且抗病毒抗性依然是一个主要的问题。因此，仍然需要新的抗病毒治疗，特别是没有批准药物的作用机制类型，例如亲环素抑制剂。

乙型肝炎病毒

乙型肝炎病毒是嗜肝DNA病毒科的DNA病毒，并且是乙型肝炎的病原体。与HCV和HIV的情况不同，非常少有关于亲环素抑制剂对抗乙型肝炎病毒的活性的报道。Ptak等人，2008描述了Debio-025对抗HBV的弱活性(IC50为4.1μM)，而Xie等人，2007描述了CsA对抗HBV的一些活性(IC50>1.3μg/mL)。这与HIV和HCV的情况大不相同，后者有众多关于亲环素抑制剂的纳摩尔浓度级的抗病毒活性报道。

HBV的治疗

HBV在世界范围内感染多达4亿人群，并且是慢性病毒性肝炎和肝细胞癌的主要原因。2008年为止有6种药物被许可用于治疗HBV；干扰素α和PEG化的干扰素α，三种核苷类似物(拉米夫定、恩替卡韦和替比夫定(telbivudine))和一种核苷酸类似物(阿德福韦二匹伏酯)。然而，由于抗性的高发率、耐受性较低和可能的副作用，需要新的治疗选择(Ferir等人，2008)。

线粒体通透性转运孔(mPTP)的抑制

线粒体上高电导通透性转运孔的打开引发了线粒体通透性转运(MPT)的发生。这是导致氧化应激、Ca²⁺毒性和缺血/再灌注后肝细胞坏死和凋亡的原因。通过亲环素抑制剂抑制亲环素D(也称为亲环素F)已显示能阻断通透性转运孔的开放，并且保护细胞在这些应激后得以存活。亲环素D抑制剂因此可用于涉及mPTP开放的适应证，例如肌营养不良，特别是Ullrich先天性肌营养不良和Bethlem肌病(Millay等人，2008；WO2008/084368；Palma等人，2009)、多发性硬化(Forte等人，2009)、糖尿病(Fujimoto等人，2010)、肌萎缩性侧索硬化(Martin，2009)、双相性精神障碍(Kubota等人，2010)、阿尔茨海默病(Du和Yan，2010)、亨廷顿病(Perry等人，2010)、心肌梗塞后恢复(Gomez等人，2007)和慢性饮酒(alchoholconsumption)(King等人，2010)。

其它治疗用途

亲环素抑制剂对于其它病毒具有潜在活性，因此可用于治疗其感染，例如水痘-带状疱疹病毒(Ptak等人，2008)、甲型流感病毒(Liu等人，2009)、严重急性呼吸器官综合征冠状病毒和其它人类和猫科冠状病毒(Chen等人，2005，Ptak等人，2008)、登革热病毒(Kaul等人，2009)、黄热病毒(Qing等人，2009)、西尼罗病毒(Qing等人，2009)、西方马脑炎病毒(Qing等人，2009)、巨细胞病毒(Kawasaki等人，2007)和痘苗病毒(Castro等人，2003)。

已有关于亲环素抑制剂和亲环素抑制在其它治疗领域的用途的报道，例如在癌症治疗中(Han等人，2009)。

对萨菲菌素的一般评论

化合物例如萨菲菌素的药物开发中的问题之一是快速代谢和葡萄苷酸化，导致低口服生物利用度。这可导致增加的食物作用机会、更频繁的从剂型中的不完全释放和更高的患者间差异性。

因此，仍然需要鉴定新的亲环素抑制剂，其特别可用于治疗HCV感染，还可用于治疗其它亲环素抑制可用的疾病领域，例如HIV感染、肌营养不良或有助于心肌梗塞之后的恢复或者免疫抑制或抗炎作用是有效的。优选地，所述亲环素抑制剂相对于现有可获得的亲环素抑制剂具有改善的性质，包括一种或多种下列性质：更长的半衰期或增加的口服生物利用度，这可能通过减少的P450代谢和/或减少的葡萄苷酸化实现；改善的水溶解性；改善的对抗HCV的能力；降低的毒性(包括肝毒性)；改善的药理学性质，例如对靶器官的高度暴露(例如在HCV的情况下是肝)和/或长的半衰期(使给药频率更低)；减少的药物-药物相互作用，例如通过降低CYP3A4代谢和抑制水平以及减少的(Pgp)抑制(使得多药物组合更容易)，和改善的副作用特征，例如与MRP2的低结合，使高胆红素血症几率下降；较低的免疫抑制效应；改善的对抗抗性病毒物种的活性，特别是CsA和CsA类似物(例如DEBIO-025)抗性病毒物种；以及更高的治疗(和/或选择性)指数。本发明公开了新的萨菲菌素类似物，其可具有一种或多种上述性质。特别地，本发明公开了新的突变合成的萨菲菌素类似物，其预期具有减少的通过P450的代谢或葡萄苷酸化，例如通过增加的微粒体半衰期所示，和/或具有减少的改善的对抗HCV的效力，例如通过低复制子EC₅₀所示。

此外，还需要开发新的免疫抑制剂，其可在预防移植排斥中或在治疗自身免疫、炎性和呼吸障碍中具有效用。优选地，此类免疫抑制剂相对于已知的天然萨菲菌素具有改善的性质，包括一种或多种下列性质：更长的半衰期或增加的口服生物利用度，这可能通过减少的P450代谢和/或减少的葡萄苷酸化实现；改善的水溶解性；改善的在免疫抑制活性方面的效力，例如可在T细胞增殖测定中观察到；降低的毒性(包括肝毒性)；改善的药理学性质，例如对靶器官的高度暴露和/或长的半衰期(使给药频率更低)；减少的药物-药物相互作用，例如通过降低CYP3A4代谢和抑制水平以及减少的(Pgp)抑制(使得多药物组合更容易)和改善的副作用特征。本发明公开了新的萨菲菌素类似物，其可具有一种或多种上述性质。特别地，本发明公开了新的衍生物，其具有减少的通过P450的代谢或葡萄苷酸化，例如通过增加的微粒体半衰期所示，和/或具有改善的免疫抑制效力，例如通过低t细胞增殖IC₅₀所示。

因此，如从实施例可以看出，本发明化合物具有以下有利的治疗相关性质：

-与现有技术亲环素抑制剂环孢菌素A、DEBIO-025(阿拉泊韦)和萨菲菌素A比较，具有改善的对抗HCV和HIV的抗病毒功效；

-与现有技术化合物萨菲菌素A比较，具有降低的清除率和增加的口服暴露；

-与现有技术化合物亲环素抑制剂环孢菌素A、DEBIO-025(阿拉泊韦)和萨菲菌素A相比，具有更有效的CypA PPIase活性抑制作用;

-如通过降低的胆红素转运蛋白(OATP-1B1、OATP-1B3、MRP2和MRP3)的抑制作用和降低的异生物质转运蛋白(Pgp和BSEP)的抑制作用证明，具有改善的副作用特性和降低的药物-药物相互作用。

发明概述

本发明提供了新的大环萨菲菌素类似物，其通过突变合成的萨菲菌素的半合成修饰产生。可以通过二羟基化突变合成的萨菲菌素(例如式IIA和式IIB中所述的)，随后裂解以产生醛大环，随后其它化学(包括Horner-Emmons型反应和其它涉及醛的偶联反应)以产生具有代替醛的多种取代基的分子，从而产生这些类似物。因此，本发明提供了大环萨菲菌素类似物，用于制备这些化合物的方法以及在医药中或者作为中间体在生产其它化合物中应用这些化合物的方法。

因此，本发明第一方面提供了根据下式(I)的大环萨菲菌素类似物及其衍生物，或其可药用盐：

其中：

部分X₁表示-OR₁、-NR₁R₂或R₃；

R₁、R₂和R₃独立地表示氢、烷基、链烯基、环烷基、环烯基、烷基环烷基、烷基环烯基、链烯基环烷基、链烯基环烯基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、链烯基芳基或链烯基杂芳基，任何所述基团可以任选被单环芳基或单环杂芳基取代；

并且其中不是芳基或杂芳基的部分的R₁、R₂和R₃中的一个或多个碳原子任选被选自O、N和S(O)_p的杂原子代替，其中p表示0、1或2并且其中R₁、R₂和R₃中的一个或多个碳原子任选被羰基代替；

或者R₁和R₂连接以使NR₁R₂表示含有指定氮原子的饱和或不饱和的杂环并且其中所述环的一个或多个碳原子任选被选自O、N和S(O)_p的其它杂原子代替，其中p表示0、1或2并且其中所述环的一个或多个碳原子任选被羰基代替并且所述杂环可以任选稠合至芳基或杂芳基环；

并且其中R₁、R₂和R₃基团的一个或多个碳原子可以任选被一个或多个卤素原子取代；

或者R₁和/或R₂表示氢；

R₉表示H或OH；

n表示单键或双键，除了当n表示双键时R₉表示H；

R₄、R₅、R₆、R₇和R₈独立地表示H、F、Cl、Br、链烯基或烷基，其中所述烷基的一个或多个碳原子任选被选自O、N和S(O)_p的杂原子代替，其中p表示0、1或2并且其中所述烷基的一个或多个碳原子任选被羰基代替并且所述烷基可以任选被一个或多个卤素原子取代；

X₂、X₃、X₄、X₅和X₆独立地表示C或N，并且在表示N的任何这些基团的情况下，所连接的取代基不存在；

条件是当R₄、R₆、R₇和R₈均表示H并且X₂、X₃、X₄、X₅和X₆均表示C时，R₅不能表示OH、-O烷基或-O(CO)烷基；

包括其任何互变异构体；并且包括其甲醇加合物，其中通过C-53酮和C-15羟基以及甲醇的结合形成缩酮。

上述结构显示了代表性的互变异构体，并且本发明包括式(I)化合物的所有互变异构体，例如说明烯醇化合物时的酮化合物，反之亦然。

包括在式(I)定义中的特别的互变异构体是其中(i)C-53酮与C-15羟基形成半缩酮，或(ii)C-15和C-17羟基可以与C-53酮结合形成缩酮的那些。所有的编号使用母体萨菲菌素A结构的系统。

式(I)化合物或其可药用盐可以任选以可药用溶剂化物例如水合物的形式存在。

定义

本文所用冠词“一种”和“一个”是指所述冠词的语法对象的一个或多于一个(即至少一个)。例如“一种类似物”表示一种类似物或多于一种类似物。

本文所用术语“类似物”是指结构上与另一种化合物类似的化合物，但在组成上有轻微差异(例如一个原子由另一个代替，或特别官能团的存在或不存在)。

本文所用术语“萨菲菌素”是指结构上类似萨菲菌素A但在组成上有轻微差异的化合物(例如一个原子由另一个代替，或特别官能团的存在或不存在)，特别是通过链霉菌属物种A92-308110发酵产生的那些。实例包括WO97/02285和WO98/07743中讨论的萨菲菌素样化合物，例如萨菲菌素B。

本文所用术语“突变合成的萨菲菌素”或“突变合成的萨菲菌素类似物”是指与萨菲菌素A、B、C或D结构类似但组成略微不同(例如一个或多个原子由另一个代替，或特别官能团的存在或不存在)的化合物，特别是通过链霉菌属物种A92-308110或其突变体的发酵(其中培养物用间-酪氨酸类似物补料)而产生的那些。

本文所用术语“间-酪氨酸类似物”是指与间-酪氨酸结构类似但组成略微不同(例如一个或多个原子由另一个代替，或特别官能团的存在或不存在)的化合物，特别是在式(III)中描述的那些。

本文所用术语“大环类似物”、“大环萨菲菌素类似物”或“大环萨菲菌素”是指上文所述以其最宽泛的范围代表本发明的化合物，例如以上式(I)化合物或其可药用盐。这些化合物也称为“本发明化合物”或“萨菲菌素衍生物”或“萨菲菌素类似物”，这些术语在本申请中可互换使用。

本文所用术语“HCV”是指丙型肝炎病毒，是单链的RNA包膜病毒，为黄病毒科(Flaviviridae)成员。

本文所用术语“HIV”是指人免疫缺陷病毒，是人获得性免疫缺陷综合征的病原体。

本文所用术语“生物利用度”是指施用后药物或其它物质在生物活性位点被吸收或变得可利用的程度或比率。该性质取决于多种因素，包括化合物的溶解性、肠吸收速率、蛋白质结合的程度和代谢等。本文中描述了本领域技术人员熟知的多种生物利用度试验(同样参见Egorin等人，2002)。

本申请中所用术语“水溶性”是指在水性介质中的溶解性，例如pH7.4的磷酸盐缓冲盐水(PBS)，或5%的葡萄糖溶液。下文实施例部分“水溶性分析”给出了水溶性试验。

本发明化合物例如式(I)化合物的可药用盐包括从可药用的无机或有机酸或碱形成的常规盐，以及季铵的酸加成盐。适合的酸盐的更特别的实例包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、羟基乙酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、棕榈酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟基萘酸、氢碘酸、苹果酸、硬脂酸、鞣酸等的盐。特别感兴趣的是盐酸盐。其它酸例如草酸虽然本身不是可药用的，但可用于制备获得本发明化合物及其可药用盐的中间体的盐。适合的碱盐的更特别的实例包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、N,N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因盐。下文所述的本发明化合物包括式(I)化合物及其可药用盐。

本文所用术语“烷基”表示直链或支链的烷基，通常含有1-10个碳原子，例如C_1-6烷基。“链烯基”是指含有2个或多个碳原子(例如2-10个碳，例如C_2-6链烯基)的烷基，其被一个或多个双键不饱和。

烷基的实例包括C_1-4烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基和正丁基。链烯基的实例包括C_2-4链烯基，例如-CH=CH₂和-CH₂CH=CH₂。

本文所用术语“环烷基”表示任选是支链的通常含有3-10个碳原子的环状烷基，例如环丁基、环戊基、环己基或环庚基。支链的实例为2-甲基环戊基。“环烯基”是指通常含有5-10个碳原子的环状烯基，例如环戊烯基、环己烯基或环庚烯基。环烷基和环烯基可以是例如单环或二环的(包括螺环的)，但是适合地是单环的。

本文所用术语“杂环基”表示其中一个或多个环碳原子(例如1、2或3个环碳原子，例如1或2个，例如1个)被选自O、N和S的杂原子代替的的环烷基。实例包括吗啉基、哌啶基、吡咯烷基、哌嗪基和N-甲基哌嗪基。

本文所用术语“杂环烯基(heterocyclenyl)”表示其中一个或多个环碳原子(例如1、2或3个环碳原子，例如1或2个，例如1个)被选自O、N和S的杂原子代替的环烯基。

芳基的实例包括(除指明之外)单环基团即苯基和二环(例如9和10元环)，其为芳族的或(在二环的情况下含有至少一个芳族环)。例如二环可以是完全芳族的例如萘基，或者可以是部分芳族的(例如含有一个芳族环)，例如四氢化萘、茚或茚满。优选的芳基是苯基。芳基可以任选例如被一个或多个(例如1、2或3个)例如选自烷基(例如C_1-4烷基)、羟基、CF₃、卤素、烷氧基(例如C_1-4烷氧基)、硝基、-SO₂Me、氰基和-CONH₂的取代基取代。

杂芳基的实例包括(除指明之外)单环基团(例如5和6元环)和二环(例如9和10元环)，其是芳族的或(在二环的情况下含有至少一个芳族环)并且含有一个或多个(例如1、2、3或4个)选自N、O和S的杂原子。5元杂芳基环的实例包括吡咯、呋喃、噻吩、

唑、二唑、噻唑和三唑。6元杂芳基环的实例包括吡啶、嘧啶和吡嗪。二环的实例包括完全芳族的环例如喹啉、喹唑啉、异喹啉、吲哚、噌啉、苯并噻唑、苯并咪唑、嘌呤和喹喔啉，以及部分芳族的环例如色烯、色满、四氢喹啉、二氢喹啉、异二氢吲哚和二氢吲哚。单环杂芳基是优选的。上述杂芳基可以如上文对于芳基所述的那样任选被取代。

当二环芳基和杂芳基是部分芳族的时，与分子其余部分的连接可以经由芳族部分或经由非芳族部分。

术语“治疗”包括预防性和治疗性治疗。

术语“式II”共同是指式IIA和式IIB。

图例

图1：化合物23的¹H NMR

图2：化合物24的¹H NMR

图3：化合物25的¹H NMR

图4：化合物26的¹H NMR

图5：化合物27的¹H NMR

图6：化合物28的¹H NMR

图7：化合物29的¹H NMR

图8：化合物30的¹H NMR

发明描述

如前所述，本发明提供了大环萨菲菌素类似物，制备这些化合物的方法和医疗中使用这些化合物的方法。

在一个实施方案中，化合物是其甲醇加合物，其中通过C-53酮和C-15羟基以及甲醇结合形成半缩酮。在另一个实施方案中，并非如此。

变量n、X ₂ -X ₆ 和R ₄ -R ₉

适合地，n表示单键。

适合地，R₉表示OH。

适合地，R₄、R₅、R₆、R₇和R₈独立地表示H、F、Cl、Br、C_2-6链烯基或C_1-10烷基，其中所述烷基的一个或多个碳原子任选被选自O、N和S(O)_p的杂原子代替，其中p表示0、1或2并且其中所述烷基的一个或多个碳原子任选被羰基代替并且所述烷基可以任选被一个或多个卤素原子取代。

在某些实施方案中，R₄、R₅、R₆、R₇和R₈中的一个或多个可以表示的C_1-10烷基(例如C_1-6烷基)的碳原子被杂原子代替。

如果-CH₃被N代替，那么形成的基团为-NH₂。如果-CH₂-被N代替，那么形成的基团为-NH-。如果-CHR-被N代替，那么形成的基团为-NR-。因此，R₄、R₅、R₆、R₇或R₈基团中的氮原子可以是伯、仲或叔氮原子。

如果-CH₃被O代替，那么形成的基团为-OH。

当R₄、R₅、R₆、R₇和R₈中的一个或多个可以表示的C_1-10烷基(例如C_1-6烷基)的碳原子被杂原子代替时，其适合地被O、S或N、特别是N或O、特别是O代替。

当R₄、R₅、R₆、R₇和R₈中的任一个含有基团S(O)_p时，变量p适合地表示0或1。在一个实施方案中，p表示0。在另一个实施方案中，p表示1。在另一个实施方案中，p表示2。

当R₄、R₅、R₆、R₇和R₈中的一个或多个可以表示的C_1-10烷基(例如C_1-6烷基)含有多于一个杂原子时，这些原子通常可以被两个或更多个碳原子隔开。

适合地，R₄、R₅、R₆、R₇和R₈中的一个或多个可以表示的C_1-10烷基(例如C_1-6烷基)的碳原子未被任何杂原子代替。

当R₄、R₅、R₆、R₇和R₈中的一个或多个可以表示的C_1-10烷基(例如C_1-6烷基)的碳原子被羰基代替时，羰基适合地位于另外的碳原子或氮原子的邻位。适合地，羰基未位于硫或氧原子的邻位。

例如R₄、R₅、R₆、R₇和R₈中的一个或多个可以表示-COC_1-3烷基，例如-COMe。

适合地，R₄、R₅、R₆、R₇和R₈中的一个或多个可以表示的C_1-10烷基(例如C_1-6烷基)的碳原子未被羰基代替。

R₄、R₅、R₆、R₇和R₈中的一个或多个可以表示的C_1-10烷基(例如C_1-6烷基)可以被一个或多个卤素原子取代。例如R₁、R₂、R₃、R₄和R₅中的一个或多个可以表示-CF₃。或者，R₄、R₅、R₆、R₇和R₈中的一个或多个可以表示被一个或多个(例如一个)Cl或F原子取代的C_1-10烷基(例如C_1-6烷基)(例如-CH₂CH₂Cl)。

适合地，R₄、R₅、R₆、R₇和R₈可以表示的C_1-10烷基(例如C_1-6烷基)未被卤素取代。

当R₄、R₅、R₆、R₇和R₈基团中的一个或多个表示C_1-10烷基(例如C_1-6烷基)时，适合地该基团表示C_1-4烷基(例如C_1-2烷基，例如甲基)。

在一个实施方案中，R₄、R₅、R₆、R₇和R₈中的一个或多个表示C_1-6烷基(例如C_1-2烷基)或C_2-3链烯基，例如R₄、R₅、R₆、R₇和R₈中的一个或多个表示甲基。

适合地，R₄表示H、F、Cl、CF₃、OH或C_1-6烷基(例如甲基)。更适合地，R₄表示H或F，特别是H。

适合地，R₅表示H、F、Cl、CF₃、OH、NH₂或C_1-6烷基(例如甲基)。更适合地，R₅表示H、F、OH或NH₂，特别是OH。

适合地，R₆表示H、F、Cl、CF₃、OH或C_1-6烷基(例如甲基)。更适合地，R₆表示H、Me或F。

适合地，R₇表示H、F、Cl、CF₃、OH或C_1-6烷基(例如甲基)。更适合地，R₇表示H或F。

适合地，R₈表示H、F、Cl、CF₃、OH或C_1-6烷基(例如甲基)。更适合地，R₈表示H或F，特别是H。

适合地，R₄、R₅、R₆、R₇和R₈中的一个或多个，更适合地两个或更多个(例如三个或更多个)不表示H。

适合地，R₄、R₅、R₆、R₇和R₈中的一个或多个、例如两个或更多个表示F。

适合地，R₆和/或R₇表示F。

适合地，X₂、X₃、X₄、X₅和X₆中的至少两个表示C；更适合地，至少三个、更适合地至少四个并且最适合地所有五个表示C。

在一个实施方案中，X₂表示N(因此R₄不存在)。在另一个更优选的实施方案中，X₂表示C。

适合地，X₃表示C。

适合地，X₄表示C。

适合地，X₅表示C。

适合地，X₆表示C。

在一个实施方案中，X₂、X₃、X₄、X₅和X₆各自表示C，R₄表示H，R₅表示OH，R₆表示H，R₇表示F并且R₈表示H。

在一个实施方案中，X₂、X₃、X₄、X₅和X₆各自表示C，R₄表示H，R₅表示OH，R₆表示Me，R₇表示H并且R₈表示H。

在一个实施方案中，X₂、X₃、X₄、X₅和X₆各自表示C，R₄表示H，R₅表示OH，R₆表示F，R₇表示F并且R₈表示H。

变量X ₁

在一个实施方案中，X₁表示-R₃。在一个实施方案中，X₁表示-NR₁R₂。在一个实施方案中，X₁表示-OR₁。

在某些实施方案中，R₁和/或R₂和/或R₃的碳原子被杂原子代替。

如果-CH₃被N代替，那么形成的基团为-NH₂。如果-CH₂-被N代替，那么形成的基团为-NH-。如果-CHR-被N代替，那么形成的基团为-NR-。因此，R₁、R₂、R₃基团中的氮原子可以是伯、仲或叔氮原子。

如果-CH₃被O代替，那么形成的基团为-OH。

当R₁和/或R₂和/或R₃的碳原子被杂原子代替时，其适合地被O或N，特别是O代替。

当R₁和/或R₂和/或R₃的碳原子被基团S(O)_p代替时，变量p适合地表示0或1。在一个实施方案中，p表示0。在另一个实施方案中，p表示1。在另一个实施方案中，p表示2。

当R₁和/或R₂和/或R₃含有多于一个杂原子时，这些原子可以例如被两个或更多个碳原子隔开。

适合地，R₁、R₂和R₃中没有碳原子被杂原子代替。

当R₁和/或R₂和/或R₃的碳原子被羰基代替时，羰基适合地位于另外的碳原子或氮原子的邻位。适合地羰基未位于硫或氧原子的邻位。

例如R₁和/或R₂和/或R₃可以表示-COC_1-4烷基，例如-COMe。

适合地，R₁的碳原子未被羰基代替。

适合地，R₂的碳原子未被羰基代替。

适合地，R₃的碳原子未被羰基代替。

当R₁和/或R₂和/或R₃基团中的一个或多个碳原子被一个或多个卤素原子取代时，示例性的卤素原子为F、Cl和Br，特别是F和Cl，特别是F。示例性的卤化的R₁和/或R₂和/或R₃部分为-CF₃。

例如，R₁、R₂和R₃中的一个或多个可以表示被一个或多个(例如一个)Cl或F原子取代的C_1-10烷基(例如C_1-6烷基)(例如-CH₂CH₂Cl)。

适合地，R₁、R₂和R₃的碳原子未被卤素取代。

当R₁、R₂和R₃基团中的一个或多个表示C_1-10烷基(例如C_1-6烷基)时，适合地该基团表示C_1-4烷基(例如C_1-2烷基，例如甲基)。

当R₁和/或R₂和/或R₃表示-烷基芳基时，实例包括C_1-2烷基芳基，例如苄基。

当R₁和/或R₂和/或R₃表示-链烯基芳基时，实例包括C_2-3链烯基芳基，例如-乙烯基苯基。

当R₁和/或R₂和/或R₃表示-烷基杂芳基时，实例包括C_1-2烷基杂芳基，例如-甲基吡啶基。

当R₁和/或R₂和/或R₃表示-链烯基杂芳基时，实例包括C_2-3链烯基杂芳基，例如-乙烯基吡啶基。

适合地，R₁不表示氢。

适合地，R₁和R₂不都表示氢。

适合地，R₂的碳原子未被任何杂原子代替。

当X ₁ 表示NR ₁ R ₂ 时

当X₁表示NR₁R₂时，R₁可以例如表示烷基、链烯基、环烷基、环烯基、烷基环烷基、烷基环烯基、链烯基环烷基、链烯基环烯基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、链烯基芳基或链烯基杂芳基。

R₂可以例如表示H、烷基(例如C_1-4烷基)、链烯基(例如C_2-4链烯基)或-O烷基(例如-OC_1-4烷基)，特别是H或烷基。

示例性的R₁基团包括被单环芳基或单环杂芳基取代的芳基或杂芳基、-C_1-4烷基、-OC_1-4烷基、-COC_1-4烷基或-C_2-4链烯基或者R₁可以表示烷基或-O烷基。上述示例性基团可以例如与表示H或烷基的R₂连在一起。

其它示例性的R₁基团包括甲基、-CF₃、乙基、异丙基、-CH₂CH=CH、异丁基、环己基。上述示例性基团可以例如与表示H或Me的R₂连在一起。

其它示例性的R₁基团包括任选取代的吡啶基或苯基，例如被苯基取代的苯基。上述示例性基团可以例如与表示H、Me或-OMe的R₂连在一起。

其它示例性的R₁基团包括-OMe、-OCF₃、-O乙基、O-异丙基、-SMe、O-正丙基、-O-正丁基、-O-叔丁基、O-异丁基、O-CH₂C(Me)₃。上述示例性基团可以例如与表示H、Me、乙基、异丙基或叔丁基的R₂连在一起。

其它示例性的R₁基团包括-O-(任选地取代的苯基)。上述示例性基团可以例如与表示H或Me的R₂连在一起。

或者，R₁和R₂可以连接以使NR₁R₂表示含有所示的特别氮原子的饱和或不饱和的杂环。

NR₁R₂可以表示的杂环通常含有4-8个环原子，例如5-7个环原子，特别是5或6个环原子。

NR₁R₂可以例如表示的杂环通常仅含有特别的氮原子(例如其表示吡咯烷或哌啶)或一个或两个(例如一个)其它杂原子，特别是氮或氧原子。

例如，NR₁R₂可以表示的杂环可以是吗啉基或1,2-

嗪烷(含有与N相邻的O的六元饱和环)。

当NR₁R₂表示含有特别的氮原子的饱和或不饱和的杂环并且其中所述环的一个或多个碳原子任选被选自O、N和S(O)_p的杂原子代替，其中p表示0、1或2并且其中所述环的一个或多个碳原子任选被羰基代替并且所述杂环稠合至芳基或杂芳基环时，实例是四氢喹啉基。

或者，适合的NR₁R₂表示5-7元杂环，例如吡咯烷、哌啶、吗啉或哌嗪环，其中哌嗪的4-氮任选被C_1-4烷基取代。

在另一个实施方案中，适合的NR₁R₂表示5-7元杂环，例如吡咯烷、哌啶、吗啉或哌嗪环，其中哌嗪的4-氮任选被C_1-4烷基取代，并且其中与环中的氮原子相邻的碳原子被羰基代替。因此，例如R₁和R₂与它们所连接的氮一起表示哌啶酮。

在另一个实施方案中，氧原子与R₁和R₂连接的氮原子相邻。例如，R₁可以表示烷基或链烯基，其中与R₁连接的氮原子相邻的亚甲基被O代替。例如，R₁可以表示-OC_1-4烷基，例如OMe。或者，R₁和R₂连接并且与R₁连接的氮原子相邻的碳原子被O代替，例如以形成1,2-嗪烷环或1,2-异

唑烷。

在另一个实施方案中，R₁和R₂连接以使NR₁R₂表示含有特别的氮原子的饱和或不饱和的杂环并且其中所述环的一个或多个碳原子任选被选自O、N和S(O)_p的其它杂原子代替，其中p表示0、1或2并且其中所述环的一个或多个碳原子任选被羰基代替并且所述杂环稠合至芳基或杂芳基环(例如稠合至苯基或吡啶基环)。

NR₁R₂可以一起形成的示例性部分包括吗啉基、

嗪烷(例如1,2-

嗪烷)以及下表中公开的那些：

包含芳基或杂芳基的上述-NR₁R₂部分也可以在所述基团上任选具有一个或多个(例如一个或两个，例如一个)环取代基，例如选自C_1-4烷基(例如甲基)、卤素(例如Cl或F)、C_1-4烷氧基(例如甲氧基)、羟基、CF₃、氰基、硝基、SO₂Me和CONH₂的基团。

上述-NR₁R₂部分可以任选被一个或多个(例如一个或两个)卤素(例如F或Cl)原子取代。

当X ₁ 表示OR ₁ 时

当X₁表示OR₁时，R₁可以例如表示烷基、链烯基、环烷基、环烯基、烷基环烷基、烷基环烯基、链烯基环烷基、链烯基环烯基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、链烯基芳基或链烯基杂芳基。

在一个实施方案中，R₁表示任选被单环芳基或单环杂芳基取代的芳基或杂芳基。R₁可以例如表示4-联苯基，其中苯基环中的任一个任选被取代。

在一个实施方案中，R₁可以表示被单环芳基或单环杂芳基取代的芳基或杂芳基、-C_1-4烷基、-OC_1-4烷基、-COC_1-4烷基或-C_2-4链烯基。

在一个实施方案中，R₁表示C_1-6烷基(例如C_4-6烷基)、C_2-6链烯基、C_1-4烷基C_4-7环烷基或C_1-4烷基C_5-7环烯基。

适合地，R₁选自C_2-10烷基(例如C_2-6烷基，例如C_4-6烷基)、C_2-10链烯基(例如C_2-6链烯基，例如C_4-6链烯基)、杂芳基和芳基。

因此，在一个实施方案中，R₁选自C_4-6烷基、C_2-6链烯基、杂芳基和芳基。

在一个实施方案中，R₁选自C_4-7环烷基、C_1-2烷基芳基和C_1-2烷基杂芳基。

示例性的R₁基团包括环己基、-甲基环戊基、-CH₂CH=CH₂、乙基、正丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、-CH₂C(Me)₃、正戊基、-CH₂CH₂C(Me)₃、正己基、正庚基、-环戊基、-甲基环己基、苯基、-甲基苯基、-甲基吡啶基、噻唑、三唑、咪唑、

唑、呋喃、噻吩和四唑，例如选自-CH₂CH=CH₂、正丁基、叔丁基、异丁基、-CH₂C(Me)₃、正戊基、-CH₂CH₂C(Me)₃、正己基、正庚基、-环戊基、-甲基环己基、苯基、-甲基苯基、-甲基吡啶基、噻唑、三唑、咪唑、

唑、呋喃、噻吩和四唑。

其它示例性R₁基团包括刚提及的那些芳基或杂芳基，其中所述芳基或杂芳基是取代的。

当X ₁ 表示R ₃ 时

当X₁表示R₃时，R₃可以例如表示烷基、链烯基、环烷基、环烯基、烷基环烷基、烷基环烯基、链烯基环烷基、链烯基环烯基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、链烯基芳基或链烯基杂芳基，任何所述基团可以任选被单环芳基或单环杂芳基取代；并且其中不是芳基或杂芳基的部分的R₃的一个或多个碳原子任选被选自O、N和S(O)_p的杂原子代替，其中p表示0、1或2，除了与连接R₃的羰基相邻的原子不是O或N并且其中R₃的一个或多个碳原子任选被羰基代替。

适合地，R₃可以例如表示烷基、链烯基、环烷基、环烯基、烷基环烷基、烷基环烯基、链烯基环烷基、链烯基环烯基、芳基、杂芳基、烷基芳基、烷基杂芳基、链烯基芳基或链烯基杂芳基。

适合地，R₃表示C_1-6烷基、C_2-6链烯基、C_1-4烷基C_4-7环烷基或C_1-4烷基C_5-7环烯基。

示例性的R₃基团包括-甲基环戊基、-乙基环戊基、正丙基、-CH(Me)(乙基)、叔丁基、-CH(乙基)₂、-CH(乙基)(异丙基)、-CH(Me)(异丁基)、CH(Me)(正丙基)、-CH(Me)(正丁基)、-CH(甲基)(正戊基)、-CH(乙基)(正丙基)、环戊基、四氢呋喃、环己基、环庚基、六氢氧杂、-甲基环己基、-乙基环己基、-CH(Me)(O乙基)、-CH(Me)(O-异丙基)、-CH(OMe)(乙基)、-CH(Me)(O乙基)、-CH(OMe)(异丙基)、-CH(Me)(OMe)、-CH(Me)(O-正丙基)、-CH(Me)(O-正丁基)、-CH(乙基)(O乙基)、-CH₂C(Me)₃、-CH₂CH₂C(Me)₃、噻唑、咪唑、三唑、四唑、

唑、呋喃、吡啶和苯基。

其它适合的实施方案

在本发明的适合实施方案中，X₁表示NMe(OMe)，R₄表示H，R₅表示OH，R₆表示H，R₇表示F，R₈表示H，X₂表示C，X₃表示C，X₄表示C，X₅表示C，X₆表示C，n表示单键并且R₉表示OH，如以下结构所示：

在本发明的另一个适合实施方案中，X₁表示NMe(OMe)，R₄表示H，R₅表示OH，R₆表示H，R₇表示F，R₈表示H，X₂表示C，X₃表示C，X₄表示C，X₅表示C，X₆表示C，n表示双键并且R₉表示H，如以下结构所示：

在本发明的另一个适合实施方案中，X₁表示NR₁R₂，其中R₁和R₂一起表示连接形成杂环的CH₂CH₂CH₂CH₂O，R₄表示H，R₅表示OH，R₆表示H，R₇表示F，R₈表示H，X₂表示C，X₃表示C，X₄表示C，X₅表示C，X₆表示C，n表示单键并且R₉表示OH，如以下结构所示：

在本发明的另一个适合实施方案中，X₁表示NR₁R₂，其中R₁和R₂一起表示连接形成杂环的CH₂CH₂CH₂CH₂O，R₄表示H，R₅表示OH，R₆表示Me，R₇表示H，R₈表示H，X₂表示C，X₃表示C，X₄表示C，X₅表示C，X₆表示C，n表示单键并且R₉表示OH，如以下结构所示：

在本发明的另一个适合实施方案中，X₁表示NMe(OMe)，R₄表示H，R₅表示OH，R₆表示F，R₇表示F，R₈表示H，X₂表示C，X₃表示C，X₄表示C，X₅表示C，X₆表示C，n表示单键并且R₉表示OH，如以下结构所示：

在本发明的另一个适合实施方案中，X₁表示NR₁R₂，其中R₁和R₂一起表示连接形成杂环的CH₂CH₂CH₂CH₂O，R₄表示H，R₅表示OH，R₆表示F，R₇表示F，R₈表示H，X₂表示C，X₃表示C，X₄表示C，X₅表示C，X₆表示C，n表示单键并且R₉表示OH，如以下结构所示：

在本发明的另一个适合实施方案中，X₁表示NH(2-吡啶基)，R₄表示H，R₅表示OH，R₆表示F，R₇表示F，R₈表示H，X₂表示C，X₃表示C，X₄表示C，X₅表示C，X₆表示C，n表示单键并且R₉表示OH，如以下结构所示：

在本发明的另一个适合实施方案中，X₁表示NH(2-吡啶基)，R₄表示H，R₅表示OH，R₆表示F，R₇表示H，R₈表示H，X₂表示C，X₃表示C，X₄表示C，X₅表示C，X₆表示C，n表示单键并且R₉表示OH，如以下结构所示：

在某些实施方案中，C26，27位的双键(通过参考萨菲菌素A的结构)可以是顺式形式，代替反式形式。

在本发明的适合实施方案中，C26，27位的双键是顺式形式，如以下式所示：

此类化合物可以在化学合成过程中制备。

通常，本发明化合物通过突变合成以产生式(II)化合物，随后半合成而制备。

适合的式(II)中的X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈基团如对于式(I)化合物所定义。

通常，用于制备式(I)化合物的前体或其可药用盐的方法包括：

·用萨菲菌素生产者(例如链霉菌属物种A92-308110，也称为DSM9954)或更优选地，sfaA基因或sfaA基因同源物失活或缺失的萨菲菌素生产者的培养物接种发酵液；

·用间酪氨酸类似物(如式(III)中所示)补料发酵液

·允许发酵继续直至产生式IIA和式IIB化合物

·提取和分离式IIA和式IIB化合物

·半合成衍生化式IIA和式IIB化合物以产生式I化合物。

式(III)化合物如下定义：

其中R₁₀表示H或酯形成基团例如烷基，例如C_1-6烷基，例如Me。

适合的式(III)中的X₂、X₃、X₄、X₅、X₆、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈基团如对于式(I)化合物所定义。

补料可以是式(III)化合物的外消旋形式或L-形式。

式(III)化合物或者是可商购获得的或者通过标准有机合成化学技术来制备。制备式(III)化合物的一种通用路径如下列流程图1所示。

流程图1：a)将式(IV)的醛与适合的片段例如(R₁₁O)₂P(O)CH(NHPG)CO₂R₁₀偶联，b)如有需要，氢化和脱保护。PG=保护基。

式(IV)的醛可以是可商购获得的或容易地通过本领域技术人员合成。保护和脱保护化学可能需要用于从式(IV)化合物产生式(III)化合物。这些技术为本领域技术人员已知的并且适合的保护基描述于Greene’sProtective Groups in Organic Synthesis(Wuts和Greene,第4版,2007)中。

产生式(IIA)和式(IIB)化合物后，本发明化合物通过半合成衍生化制备。用于产生萨菲菌素大环醛的半合成方法描述于US6,124,453；Metternich等人，1999；Banteli等人，2001和Sedrani等人，2003中。

通常，用于由萨菲菌素突变合成的类似物制备某些式(I)化合物或其可药用盐的半合成方法包括：

(a)二羟基化萨菲菌素类似物；

(b)氧化裂解1,2-二醇以获得醛；和

(c)使用式V化合物使所述醛与稳定的碳负离子(或其典型形式)例如膦酸酯碳负离子偶联。

逆合成如下所示：

其中，对于萨菲菌素A突变合成的类似物，

可以是相同或不同的R₁₁基团独立地表示烷基(例如C1-4烷基)或苄基。

因此，用于制备本发明化合物的方法包括将式(V)化合物与醛大环(式(VI)化合物)反应。

式(VI)化合物的制备可以通过与之前对于萨菲菌素A至其相应的醛大环的转化所述的(Metternich等人1999)类似方法进行。简言之，使用修饰的Sharpless条件(催化性四氧化锇)将式(II)化合物二羟基化。使用手性配体帮助促进选择性。然后可以使用例如高碘酸钠氧化性裂解所得的二醇。然后所得的式VI化合物可以用作底物用于衍生化成同源酰胺、酯或酮。典型地，将式(V)化合物溶于非质子溶剂中，冷却并且用碱例如氢化钠处理。然后加入式(VI)化合物并且在一定温度温热反应。适合时间后停止反应并且通过标准条件(例如制备型HPLC、制备型TLC等、正相快速色谱)纯化式I化合物。

可以在产生式VI化合物之前或在形成同源酰胺的反应之后进行引入R₉和n的变化的衍生化。简言之，可以通过在酸性条件下处理适合的底物以产生共轭的三烯而除去在R₉处的羟基。

式(V)化合物可以是已知的或者可以使用已知方法制备。

例如，其中X₁表示NR₁R₂的式(V)化合物可以由可得的胺(例如R₁R₂NH)容易地合成。如流程图1(下面)所示，胺可以用于处理氯乙酰氯或类似物以形成α-氯酰胺。然后，将α-氯酰胺在Arbuzov反应中处理以产生式V化合物。式V化合物的其它途径对本领域技术人员而言将是显而易见的。

流程图1

其中X₁表示R₃的其它式(V)化合物可以是已知的或者由可得的羧酸衍生物(例如R₃COX)容易地合成。如流程图2(下面)所示，羧酸衍生物可以在用碱处理膦酸酯后偶联至甲基膦酸酯上。这得到了式(V)化合物，虽然式V化合物的其它途径对本领域技术人员而言将是显而易见的。

流程图2

其中X₁表示OR₁的其它式(V)化合物可以是已知的或者由可得的醇(例如R₁OH)容易地合成。如流程图3(下面)所示，醇可以用于处理氯乙酰氯或类似物以形成α-氯酯。然后，将α-氯酯在Arbuzov反应中处理以产生式II化合物。式II化合物的其它途径对本领域技术人员而言将是显而易见的。

流程图3

如果希望或需要，可以使用保护基以保护在醛大环、大环、醇(R₁OH)、羧酸衍生物(R₁R₂R₃COX)或胺(R₁R₂NH)中或者在式V化合物中的官能度，如描述于T.W.Green,P.G.M.Wuts,Protective Groups in OrganicSynthesis,Wiley-Interscience,New York,1999中。

除了本文提供的具体方法和参考之外，本领域技术人员也可以参考用于合成方法的标准科教书参考，包括但不限于Vogel’s Textbook ofPractical Organic Chemistry(Furniss等人，1989)和March’s AdvancedOrganic Chemistry(Smith和March，2001)。

本发明的萨菲菌素类似物可以单独或与其它治疗剂组合施用。两种(或更多种)活性剂的共施用可以允许较低剂量的待使用的每种活性剂，从而降低副作用，可以获得改善的效力，从而获得更高的SVR，以及抗性的降低。

因此，在一个实施方案中，突变合成的萨菲菌素类似物与一种或多种用于治疗HCV感染的治疗剂共施用，所述治疗剂来自于护理治疗标准。这可以是干扰素(例如pIFNα和/或利巴韦林)。

在一个可选择的实施方案中，本发明的萨菲菌素大环与一种或多种其它抗病毒剂共施用，例如STAT-C(用于治疗HCV的特异性靶向剂)或DAA(直接作用的抗病毒剂)，其可以是以下一种或多种：非核苷聚合酶抑制剂(例如ABT-333、ABT-072、BMS791325、IDX375、VCH-222、BI207127、ANA598、VCH-916、GS9190、PF-00868554(非利布韦)或VX-759)、核苷或核苷酸聚合酶抑制剂(例如2’-C-甲基胞苷、2’-C-甲基腺苷、R1479、PSI-6130、R7128、R1626、PSI7977或IDX184)、蛋白酶抑制剂(例如ABT-450、ACH-1625、BI201355、BILN-2061、BMS-650032、CTS 1027、丹诺普韦、GS9256、GS9451、MK5172、IDX320、VX-950(替拉瑞韦(Telaprevir))、SCH503034(波普瑞韦(Boceprevir))、TMC435350、MK-7009(Vaneprivir)、R7227/ITMN-191、EA-058、EA-063或VX985)、NS5A抑制剂(例如A-831、BMS 790052、BMS 824393、CY-102或PPI-461)、水飞蓟素、NS4b抑制剂、丝氨酸C-棕榈酰基转移酶抑制剂、硝唑尼特或病毒进入抑制剂(例如PRO206)。

在可选择的实施方案中，本发明的萨菲菌素大环与用于治疗HIV的一种或多种其它抗病毒剂(例如高活性抗逆转录病毒疗法(HAART))共施用，其可以是以下一种或多种：核苷逆转录酶抑制剂(NRTI)(例如恩曲他滨或替诺福韦)、非核苷逆转录酶抑制剂(NNRTI)(例如利匹韦林(Rilipivirine)或依法韦伦)、蛋白酶抑制剂(PI)(例如利托那韦或洛匹那韦)、融合抑制剂(例如马拉维诺(Maraviroc)或恩夫韦地)、CCR5抑制剂(例如Aplaviroc或Vicriviroc)、成熟抑制剂(例如贝韦立马(Bevirimat))、CD4单克隆抗体(例如伊巴珠单抗(Ibalizumab))和整合酶抑制剂(例如埃替格韦(Eltiegravir))。

在可选择的实施方案中，本发明的萨菲菌素大环与用于治疗HBV的一种或多种其它抗病毒剂共施用，其可以是以下一种或多种：干扰素(例如干扰素α或聚乙二醇化干扰素α)、核苷或核苷酸类似物(例如拉米夫定、恩替卡韦、阿德福韦二匹伏酯或替比夫定)、其它免疫调节剂(例如胸腺素α、CYT107或DV-601)或HMG CoA还原酶抑制剂(例如辛伐他汀)。

制剂可以方便地以单位剂型存在，并且可以通过药学领域公知的任何方法制备。所述方法包括将活性成分(本发明化合物)与载体混合的步骤，所述载体构成一种或多种辅助成分。通常，制剂通过将活性成分与液体载体或精细粉碎的固体载体或两者均匀并且充分地混合而制备，如果需要的话，随后使产物成型。

本发明化合物通常以包含活性成分(任选以无毒有机或无机酸或碱加成盐形式)的药物制剂形式、以可药用的剂型口服施用。取决于所治疗的障碍和患者，以及施用途径，组合物可以以多种剂量施用。

例如，本发明化合物可以以片剂、胶囊剂、珠(ovules)、酏剂、溶液剂或混悬剂的形式口服、经颊或舌下施用，其可以含有矫味剂或着色剂，用于速释、缓释或控释应用。

所述片剂可以含有赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸，崩解剂例如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、羟乙酸淀粉钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐，以及颗粒粘合剂，例如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和阿拉伯胶。此外还可以包括润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石粉。

可以使用类似类型的固体组合物用作明胶胶囊剂的填充剂。这方面优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳中的糖(milk sugar)或高分子量聚乙二醇。对于水性混悬剂和/或酏剂，本发明化合物可以与多种甜味剂或矫味剂、着色物质或染料、乳化剂和/或助悬剂以及稀释剂例如水、乙醇、丙二醇和甘油及其组合进行组合。

片剂可以通过压制或模制制备，任选使用一种或多种辅助成分。压制片剂可以通过在适合的机器中压制活性成分制备，其中活性成分是自由流动的形式，例如粉末或颗粒，任选与粘合剂(例如聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羟乙酸淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合。模制片剂可以通过在适合的机器中模制用惰性液体稀释剂湿润的粉末化化合物的混合物制备。片剂可以任选被包衣或刻痕，并且可以配制以提供其中的活性成分的缓释或控释，例如应用多种比例的羟丙基甲基纤维素来提供需要的释放性质。

根据本发明的适合口服施用的制剂可以作为离散的单位存在，例如胶囊剂、扁囊剂或片剂，其各自含有预定量的活性成分；散剂或颗粒剂；在水性液体或非水性液体中的溶液剂或混悬剂；或作为水包油型液体乳剂或油包水型液体乳剂。活性成分也可以作为大丸剂、药糖剂(electuary)或糊剂存在。

应当理解的是，除了上述具体提到的成分外，本发明的制剂可以包括其它本领域的常规成分，其依据所考虑制剂的类型而定，例如适于口服施用的制剂可以包括矫味剂。

有利地，例如防腐剂和缓冲剂的成分可以溶于载体。为了提高稳定性，组合物可以在填充至小瓶中后冷冻，并且在真空下除去水分。随后将干燥的冻干粉末密封在小瓶中，并且可以提供用于在使用前重构液体的附加的一小瓶注射用水。

本发明化合物施用的剂量根据具体的化合物、涉及的疾病、个体以及疾病的性质和严重程度和患者的身体条件以及所选择的施用途径而不同。适合的剂量可以由本领域技术人员方便的确定。

取决于施用的方法，组合物可以含有0.1%重量、优选5-60%、更优选10-30%重量的本发明化合物。

本领域技术人员应当理解的是，本发明化合物的最优量和各剂量的施用间隔将由所治疗病症的性质和程度；施用的形式、途径和位点；以及所治疗的特别个体的年龄和状况决定，并且医生将最终确定使用的适合剂量。该剂量可以适当重复施用。如果出现副作用，可以根据正常的临床实践调整或减少剂量的量和/或频率。

本发明的其它方面包括：

-根据本发明的化合物，其用作药物；

-根据本发明的化合物，其用作治疗病毒感染(特别是RNA病毒感染)例如HCV或HIV感染，用作抗炎或用于预防器官移植排斥的药物；

-包含根据本发明的化合物和可药用稀释剂或载体的药物组合物；

-包含根据本发明的化合物和可药用稀释剂或载体以及第二种或后续的活性成分的药物组合物，所述第二种或后续的活性成分特别是用于治疗病毒感染例如HCV或HIV感染，用作抗炎或用于预防器官移植排斥的活性成分；

-治疗病毒感染(特别是RNA病毒感染)例如HCV或HIV感染、用作抗炎或用于预防器官移植排斥的方法，该方法包括给个体施用治疗有效量的根据本发明的化合物；

-根据本发明的化合物在制备用于治疗病毒感染例如HCV或HIV感染、用作抗炎或用于预防器官移植排斥的药物中的用途。

通用方法

材料和方法

菌株和生长条件

生产萨菲菌素的链霉菌属物种A92-308110(DSM编号9954，购自DSMZ，Braunschweig，德国)也称为BIOT-4253和BIOT-4370或其衍生物、例如BIOT-4585在培养基燕麦琼脂、MAM、ISP4或ISP2上于28℃维持(见下文)。

BIOT-4585(用于构建方法，参见实施例1)在燕麦琼脂上于28℃生长7-10天。将琼脂平板表面收集的孢子放入20%w/v无菌蒸馏甘油中，并且以0.5mL的等量贮存于-80℃。使用冷冻的孢子储备液接种种子培养基SGS或SM25-3。将接种的种子培养基在200和300rpm之间以5.0或2.5cm振幅(throw)在27℃振荡培养24小时。用2.5%-10%种子培养基接种发酵培养基SGP-2或BT6，并且在200和300rpm之间以5.0或2.5cm振幅在24℃振荡培养4-5天。随后收集培养物用于提取。

间-酪氨酸类似物

(2S)-2-氨基-3-(6-羟基(2-吡啶基))丙酸甲酯、L-3-氨基苯丙氨酸甲酯、L-4-甲基-间-酪氨酸甲酯、L-4-氟-间-酪氨酸甲酯和L-4,5-二氟-间-酪氨酸甲酯购自Netchem(USA)。

DL-3-氟苯丙氨酸和L-苯丙氨酸购自Sigma(UK)。

DL-间-酪氨酸购自Fluorochem(UK)。

L-间-酪氨酸购自Alfa Aesar(UK)。

(S)-2-氨基-3-(3-氟-5-羟基苯基)丙酸甲酯购自NetChem(USA)。(3-溴-5-氟茴香醚(9-1)购自Accela ChemBio Co.,Ltd.,(Shanghai,China)并且也可以购自Amfinecom Inc(USA)或Apollo Scientific Ltd.(UK))。

DL-5-氟-间-酪氨酸(8)、DL-5-氟-间-酪氨酸(9)、2-氨基-3-(3-氟-5-羟基苯基)丙酸甲酯(10)、2-氨基-3-(2-氟-5-羟基苯基)丙酸甲酯(11)、2-氨基-3-(2-氟-3-羟基苯基)丙酸甲酯(12)和2-氨基-3-(2,6-二氟-3-羟基苯基)丙酸甲酯(13)如下合成：

DL-4-氟-间-酪氨酸(8)

在-70℃向8-1(3g，19.5mmol)在干燥DCM(150mL)中的溶液中滴加BBr₃(4M，在DCM中，14.6mL，58.5mmol)。加入后，将反应混合物在-20℃搅拌3小时，小心加入冰水，并且用DCM萃取。用水和盐水洗涤有机层，经Na₂SO₄干燥，过滤并且浓缩。通过快速硅胶色谱纯化残留物，得到所需化合物8-2。

在室温向8-2(0.9g，6.4mmol)在丙酮(40mL)中的溶液中加入K₂CO₃(2.2g，16mmol)。将反应混合物在室温搅拌过夜。加入水，并且在真空下除去丙酮，然后用EtOAc萃取，用水和盐水洗涤有机层，经Na₂SO₄干燥，过滤并且浓缩。通过快速硅胶色谱纯化残留物，得到所需化合物8-3。

将8-3(1g，4.34mmol)、马尿酸(860mg，4.80mmol)、NaOAc(400mg)和Ac₂O(2.2mL)的混合物在80℃搅拌2小时。将黄色反应混合物冷却，并且加入冷的EtOH(10mL)，将混合物在冰浴中冷却15分钟，然后倒入30mL冰水中，冷冻，并且通过过滤收集产物。在真空中干燥固体，获得8-4。

将8-4(300mg，0.8mmol)和NaOAc(71mg，0.87mmol)在MeOH(50mL)中的溶液在室温搅拌过夜。通过旋转蒸发除去溶剂，并且将残留物溶于50mL EtOAc中，用水洗涤EtOAc溶液两次，并且浓缩，得到8-5。

将8-5(360mg，0.89mmol)在MeOH(50mL)中的溶液于标准压力下经10%Pd/C(77mg)氢化20小时。通过过滤除去催化剂后，蒸发溶剂，得到产物8-6。

将8-6(210mg)在3N HCl(10mL)中的溶液回流24小时。将溶液浓缩至干，并且通过反相-combiflash纯化残留物，得到目标产物8。

DL-5-氟-间-酪氨酸(9)和2-氨基-3-(3-氟-5-羟基苯基)丙酸甲酯(10)

在-78℃向9-1(20g，97.55mmol)在四氢呋喃(100mL)中的溶液滴加正丁基锂(43mL，2.5M，107.3mmol)。将其搅拌30分钟，并且在该温度加入N,N-二甲基甲酰胺(15.1mL，195.1mmol)。将其再搅拌30分钟，并且除去冷浴。1小时后，用饱和氯化铵水溶液猝灭反应。用水和饱和氯化钠水溶液洗涤有机层，干燥(硫酸钠)，过滤并且浓缩。通过硅胶色谱纯化残留物，得到9-2。

在-70℃向9-2(6g，38.9mmol)在干燥DCM(200mL)中的溶液滴加BBr₃(4M，在DCM中，30mL，116.8mmol)。加入后，将反应混合物在-20℃搅拌3小时，小心加入冰水，并且用DCM萃取。用水和盐水洗涤有机层，经Na₂SO₄干燥，过滤并且浓缩。通过快速硅胶色谱纯化残留物，得到所需化合物9-3。

在室温向2-(苄基氧基羰基氨基)-2-(二甲氧基磷酰基)乙酸甲酯(4.64g，14mmol)在DCM(150mL)中的溶液中加入DBU(4.26g，28mmol)。10分钟后，加入9-3(1.95g，14mmol)，并且将所得混合物在室温搅拌过夜。将溶液用EtOAc(150mL)稀释，分离，并且将有机层用1N HCl洗涤，经Na₂SO₄干燥，过滤并且浓缩。通过快速硅胶色谱纯化残留物，得到9-4。

将9-4(1g)在MeOH(20mL)中的溶液在标准压力下经200mg10%Pd/C氢化过夜。通过过滤除去催化剂后，蒸发溶剂，得到10。

向10(300mg，1.4mmol)在EtOH(30mL)中的溶液中加入NaOH水溶液(2N，4mL)，将反应在室温搅拌30分钟。除去溶剂，并且将残留物用2N HCl中和至pH=6，并且通过过滤收集形成的白色晶体，得到目标化合物9。

2-氨基-3-(3-氟-5-羟基苯基)丙酸甲酯(10)的可选择的途径

(3,5-二氟溴苯(9a-1)购自Darui Fine Chemicals Co.,Ltd.,(Shanghai,China)并且也可以购自Alfa Aesar或Sigma Aldrich)

9a-2的制备

在0℃，向BnOH(1.61mL，15.54mmol)在DMF(30mL)中的溶液中加入NaH(622mg，60%分散在矿物油中，15.54mmol)。在室温继续搅拌0.5小时，得到澄清的溶液。以保持温度低于40℃的速率加入9a-1(1.79mL，15.54mmol)。将混合物在室温搅拌过夜，得到黄色溶液。将反应通过水猝灭并且用石油醚萃取(35mL×4)。浓缩合并的有机层。通过硅胶色谱纯化残留物，用石油醚洗脱，得到9a-2(2.544g)，为无色油状物。

9a-3的制备

在氮气下向干燥的三个烧瓶中加入Mg(170.1mg，7.10mmol)、无水THF(10mL)和少量的碘。加入1/3的在THF(2mL)中的9a-2(1.664g，5.9192mmol)。加热混合物至回流。在此期间，黄色混合物逐渐变得亮黄色。然后滴加剩余的2/3的9a-2，并且将反应混合物再回流0.5小时。

在0℃向上述混合物中缓慢加入DMF(0.504mL，6.51mmol)。在室温继续搅拌0.5小时。加入HCl(2M，10mL)，并且蒸发THF。用乙酸乙酯(25mL×3)萃取残留物。并且将合并的有机层用盐水洗涤，并且真空浓缩。通过硅胶色谱纯化残留物，用石油醚至石油醚/乙酸乙酯=20/1洗脱，得到9a-3(694mg)，为无色油状物。

9a-5的制备

在室温向2-(苄基氧基羰基氨基)-2-(二甲氧基磷酰基)乙酸甲酯9a-4(993mg，3.00mmol)在DCM(30mL)中的溶液中加入DBU(832uL，5.57mmol)。10分钟后，加入9a-3(694mg，3.01mmol)，并且将所得混合物在室温搅拌1小时。用HCl(1M，10mL)洗涤溶液，并且将合并的有机层干燥，并且真空浓缩。通过快速硅胶色谱纯化残留物(用二氯甲烷/乙酸乙酯=10/1洗脱)，得到9a-5(1.11g)。

10的制备

在标准压力下将9a-5(100mg)在MeOH(50mL)中的溶液经20mg10%Pd/C氢化2小时。通过过滤除去催化剂后，蒸发溶剂，得到10(33mg)。

2-氨基-3-(2-氟-5-羟基苯基)丙酸甲酯(11)

在-78℃向化合物11-1(1.4g，9mmol)在50mL DCM中的溶液中滴加BBr₃(4M，在DCM中，3.6mL，13.5mmol)。加入后，将反应在-20℃搅拌4小时。然后缓慢加入冰/水，分离各层，用水和盐水洗涤有机层，经Na₂SO₄干燥，并且蒸发至干。残留物不经进一步纯化即可用于下一步骤。

在室温向2-(苄基氧基羰基氨基)-2-(二甲氧基磷酰基)乙酸甲酯(3g，9mmol)在100mL DCM中的溶液中加入DBU(2.8g，18mmol)，10分钟后，加入化合物11-2(来自最后一步的粗化合物)，在室温搅拌2小时。然后将溶液用DCM(50mL)稀释，用1N HCl(20mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，并且蒸发至干。通过硅胶色谱纯化残留物(石油醚/乙酸乙酯=5/1)，得到11-3。

将化合物11-3(500mg，1.5mmol)在MeOH(20mL)中的混合物在标准压力下经50mg10%Pd/C氢化过夜。通过过滤除去催化剂后，蒸发溶剂以得到粗产物，其通过反相-combiflash纯化，得到11，为白色固体。

2-氨基-3-(2-氟-3-羟基苯基)丙酸甲酯(12)

在-78℃向化合物12-1(1.4g，9mmol)在50mL DCM中的溶液中滴加BBr₃(4M，在DCM中，3.6mL，13.5mmol)。加入后，将反应在-20℃搅拌4小时。缓慢加入冰/水后，分离各层，用水和盐水洗涤有机层，经Na₂SO₄干燥，并且蒸发至干。残留物不经进一步纯化即可用于下一步骤。

在室温向2-(苄基氧基羰基氨基)-2-(二甲氧基磷酰基)乙酸甲酯(3g，9mmol)在100mL DCM中的溶液中加入DBU(2.7mL，18mmol)，10分钟后加入化合物12-2(来自最后一步的粗化合物)，在室温搅拌2小时。然后将溶液用DCM(100mL)稀释，用1N HCl(30mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，并且蒸发至干。通过硅胶色谱纯化残留物(石油醚/乙酸乙酯=5/1)，得到12-3。

将化合物12-3(500mg，1.44mmol)在MeOH(10mL)中的混合物在标准压力下经100mg10%Pd/C氢化过夜。通过过滤除去催化剂后，蒸发溶剂以得到粗产物，其通过反相-combiflash纯化，得到所需化合物12，为白色固体。

2-氨基-3-(2,6-二氟-3-羟基苯基)丙酸甲酯(13)

在0℃向2,4-二氟苯酚(2g，15.4mmol)在50mL DMF中的溶液中加入K₂CO₃(3.2g，23.1mmol)和BnBr(2.2mL，18.5mmol)。将反应在室温搅拌2小时。加入水(100mL)和EA(200mL)，将有机层用水(50mL)和盐水(50mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，并且蒸发至干。通过硅胶色谱纯化残留物(石油醚/乙酸乙酯=10/1)，得到粗13-1。

在-78℃向化合物13-1(2g，9mmol)在10mL THF中的溶液中滴加n-BuLi(4mL，2.5M)，并且搅拌30分钟。加入DMF(1.3g，0.018mmol)，并且再次搅拌30分钟。然后除去冷浴，并且将反应混合物在室温搅拌1小时，之后用水猝灭。将其用乙酸乙酯萃取(20mL×3)，经Na₂SO₄干燥，并且蒸发至干。通过硅胶色谱纯化残留物(石油醚/乙酸乙酯=10/1)，得到13-2，为黄色固体。

在室温向2-(苄基氧基羰基氨基)-2-(二甲氧基磷酰基)乙酸甲酯(728mg，2.2mmol)在20mL DCM中的溶液中加入DBU(319mg，2.1mmol)。10分钟后，加入化合物13-2(500mg，2mmol)，并且在室温搅拌2小时。然后将溶液用DCM(50mL)稀释，用1N HCl(20mL)洗涤，经Na₂SO₄干燥，并且蒸发至干。通过硅胶色谱纯化残留物(石油醚/乙酸乙酯=5/1)，得到13-3，为黄色油状物。

将在MeOH(20mL)中的化合物13-3(600mg，1.32mmol)在标准压力下经60mg10%Pd/C氢化过夜。通过过滤除去催化剂后，蒸发溶剂以得到粗产物，其通过反相-combiflash纯化，得到所需化合物13，为白色固体。

培养基配方

用于制备培养基的水使用Millipore Elix Analytical Grade WaterPurification System制备。

SGS种子培养基

灭菌前pH用10M NaOH/10M H₂SO₄调节至pH7.0

通过在121℃加热20-30分钟来灭菌(高压灭菌)

注意

^*消泡剂仅在种子发酵罐中使用，而非种子培养瓶

^**考虑种子体积相应调节最终体积

痕量元素溶液B

SGP2生产培养基

灭菌前pH用10M NaOH调节至pH6.8

通过在121℃加热20-30分钟来灭菌(高压灭菌)

注意

^*最终体积根据种子体积相应调节

^**消泡剂仅在发酵罐中使用，而非培养瓶

SM25-3培养基(也称为SM25)

灭菌前pH未经调节(即pH7.0)

ISP4培养基

以少量体积的冷水用淀粉制备糊剂并且调至500mL体积

将其它成分加至在500mL水中的溶液II，pH应该在pH7.0至pH7.4之间(pH7.3)，将两种溶液混合在一起并且加入琼脂

ISP痕量盐

在4℃贮存

燕麦琼脂(ISP3)

将20g燕麦片在热板(或微波)上于1L水中烹煮20分钟。

将煮的混合物通过棉布/粗棉布过滤并且调节至pH7.2，并且调整至1L。加入1mL ISP痕量元素溶液。然后在灭菌前加入18g/L琼脂。

MAM琼脂

在高压灭菌前pH5.8

BT6生产培养基

调节pH至7.0，然后加入CaCO₃

ISP2琼脂

在加入琼脂和灭菌前调节pH至7.3

通用发酵方法

将冷藏保存的BIOT-4585(用于构建方法，参见实施例1)孢子储备液在室温解冻。通过在具有泡沫塞(foam plug)的2L锥形瓶中将4.0mL孢子储备液转移到400mL培养基SM25中来制备营养培养物(种子培养物)。在27℃和250rpm(5.0cm振幅)下培养48小时。在具有泡沫塞的2L锥形瓶中将25mL种子培养物转移到250mL生产培养基SGP2+5%HP20中。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下培养24小时后，将2mL的所需前体在1M盐酸中的250mM外消旋体或125mM对映异构纯的溶液以及2mL的250mM DL-六氢哒嗪-3-羧酸的甲醇溶液加入至每个生产烧瓶中，得到最终浓度为1mM的前体的单独对映异构体。可以任选使用DMSO代替1M盐酸。可以任选不用DL-六氢哒嗪-3-羧酸。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下继续再培养四天。

通过LC-UV和LC-UV-MS分析培养液

加入培养液(1mL)和乙酸乙酯(1mL)，并且混合15-30分钟，随后离心10分钟。收集0.4mL有机层，蒸干，随后重溶于0.20mL乙腈中。

HPLC条件：

C18Hyperclone BDS C18柱3u，4.6mm×150mm

配备Phenomenex Analytical C18安全预柱(KJ0-4282)

柱温50℃

流速1mL/分钟

UV监测240nm

进样20uL等份

溶剂梯度：

0分钟：55%B

1.0分钟：55%B

6.5分钟：100%B

10.0分钟：100%B

10.05分钟：55%B

13.0分钟：55%B

溶剂A是水+0.1%甲酸

溶剂B是乙腈+0.1%甲酸

在这些条件下SfA在5.5分钟时洗脱

在这些条件下SfB在6.5分钟时洗脱

LCMS在整合的Agilent HP1100 HPLC系统与Bruker DaltonicsEsquire3000+电喷雾质谱仪(阳离子模式)上进行，使用前述的色谱和溶剂。

QC LC-MS方法

HPLC条件：

C18Hyperclone BDS C18柱3u，4.6mm×150mm

配备Phenomenex Analytical C18安全预柱(KJ0-4282)

柱温50℃

流速1mL/分钟

UV监测210、240和254nm

溶剂梯度：

0分钟：10%B

2.0分钟：10%B

15分钟：100%B

17分钟：100%B

17.05分钟：10%B

20分钟：10%B

溶剂A是水+0.1%甲酸

溶剂B是乙腈+0.1%甲酸

MS条件

MS在切换模式操作(正和负之间切换)，从150扫描到1500amu。

用于评价HCV抗病毒活性的体外复制子测定

对抗基因型1HCV的抗病毒效果可以如下测定：在加入试验物前1天，将含有HCV基因型1b I389luc-ubi-neo/NS3-3’/5.1复制子的Huh5.2细胞(Vrolijk等人，2003)在细胞生长培养基[DMEM(目录号41965039)，补充有10%FCS、1%非必需氨基酸(11140035)、1%青霉素/链霉素(15140148)和2%遗传霉素(10131027)；Invitrogen]中以1.3-1.4的比例传代培养，并且在75cm²组织培养瓶(Techno Plastic Products)中生长3-4天，收集并且接种在试验培养基(DMEM，10%FCS，1%非必需氨基酸，1%青霉素/链霉素)中，在96孔组织培养微量板(Falcon,Beckton Dickinson用于评价抗代谢作用，和CuLturPlate,Perkin Elmer用于评价抗病毒作用)中以密度6500个细胞/孔(100μL/孔)接种。将微量板温育过夜(37℃，5%CO₂，95-99%相对湿度)，产生未汇合的细胞单层。制备稀释液系列；各稀释液系列制备至少一式两份。分析建立后，将微量板温育72小时(37℃，5%CO₂，95-99%相对湿度)。

为了评价抗代谢作用，吸出试验培养基，用75μL5%MTS(Promega)在无酚红培养基中的溶液代替，并且温育1.5小时(37℃，5%CO₂，95-99%相对湿度)。在波长为498nm处测定吸光度(Safire²，Tecan)，并且将光密度(OD值)转化为未处理的对照的百分数。

为了评价抗病毒作用，吸出试验培养基，并且将细胞单层用PBS洗涤。吸出洗涤缓冲液，加入25μL Glo裂解缓冲液(目录号E2661，Promega)，然后在室温使裂解进行5分钟。随后加入50μL荧光素酶分析系统(目录号E1501，Promega)，并且立即定量荧光素酶的发光信号(1000ms积分时间/孔，Safire²，Tecan)。将相对发光单位转化为未处理的对照的百分数。

EC50和EC90(从剂量-响应曲线获得的值)分别表示观察到病毒复制被抑制50%和90%时的浓度。CC50(从剂量-响应曲线获得的值)表示细胞的代谢活性下降至未处理细胞的代谢活性的50%的浓度。选择性指数(SI)是化合物的治疗窗的指示，按照CC₅₀/EC₅₀计算。

一定浓度的化合物被认为能在HCV复制子系统中产生确切的抗病毒作用，此时该特定浓度下抗复制子作用高于70%的阈值，并且观察到不超过30%的代谢活性下降。

用于评价基因型1a和2a的HCV抗病毒活性的体外复制子测定

将复制子细胞(基因型1a(H77)和2a(JFH-1)的亚基因组复制子)在37℃于5%CO₂培养箱中于DuLbecco’s修饰必需培养基(DMEM)、10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素-链霉素(pen-strep)、1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、250μg/mL G418中生长。所有细胞培养物试剂可以购自Mediatech(Herndon,VA)。

使复制子细胞胰蛋白酶化并且以5×10³个细胞/孔接种于具有不含G418的上述培养基的96-孔平板中。第二天，将培养基用含有在存在5%FBS下系列稀释的化合物的DMEM代替。HCV复制子抗病毒测定检查一系列化合物稀释液中化合物的作用。简言之，将含有HCV复制子的细胞接种于96孔平板中。试验品用DMEM+5%FBS系列稀释。将所稀释的化合物应用至平板中的适合孔。在37℃温育72小时后，处理细胞。来自每个孔的细胞内RNA用RNeasy96kit(Qiagen)提取。HCV RNA水平通过逆转录酶-实时PCR测定，使用TaqMan

One-Step RT-PCR MasterMix Reagents(Applied Biosystems,Foster City,CA)和ABI Prism7900序列检测系统(Applied Biosystems)来测定，如前所述(Vrolijk等人，2003)。用TaqMan

核糖体RNA对照试剂(Applied Biosystems)作为细胞数的指示来测量细胞毒性作用。然后将HCV RNA和核糖体RNA的量用于获得适用的IC₅₀值(对复制子复制抑制50%的浓度)。

微粒体代谢评价(微粒体稳定性测定)

微粒体中的代谢率可以如下进行测试：

将小鼠或人肝微粒体用缓冲液C(0.1M磷酸钾缓冲液，1.0mMEDTA，pH7.4)稀释至2.5mg/mL的浓度。然后通过将50μL5μM化合物加标溶液(spiking solution)(在9.5μL ACN中的0.5μL 10mM DMSO储备液，加至990μL缓冲液C)加至50μL微粒体溶液(2.5mg/mL)、110μL缓冲液C并且充分混合来制备微粒体稳定性样品。所有样品在37℃预温育约15分钟。随后，通过在轻轻混合下加入40μL NADPH溶液(12.5mM)来引发反应。在0、15、30、45和60分钟时移取等份样品(40μL)，并且用含有内标的ACN(120μL)猝灭。通过离心(4000rpm，15分钟)除去蛋白质，并且通过LC-MS/MS分析样品平板的化合物浓度。然后通过标准方法计算半衰期，将分析物浓度与最初存在的量进行比较。

肝细胞稳定性评价

将先前存于液氮中的冷藏保存的肝细胞置于37±1℃振荡水浴中2分钟±15秒。然后将肝细胞加至10×体积的预温热的Krebs-Henseleit碳酸氢盐(KHB)缓冲液(2000mg/L葡萄糖，无碳酸钙和碳酸氢钠，Sigma)，轻轻混合，并且以500rpm离心3分钟。离心后，小心除去上清液，并且加入10×体积的预温热的KHB缓冲液以使细胞沉淀物重悬。将其轻轻混合，并且以500rpm离心3分钟。然后除去上清液并且弃去。然后通过细胞计数确定细胞存活力和产率，并且这些值用来产生人肝细胞悬浮液至适合接种密度(活细胞密度=2×10⁶个细胞/mL)。将2×给药溶液在预温热的KHB(1%DMSO)中制备(200μM加标溶液：在980μL DMSO中的20μL底物储备液(10mM)，2×给药溶液：10μL在990μL KHB中的200μM加标溶液(稀释后为2μM)。

将50μL预温热的2×给药溶液加至孔中，并且加入50μL预温热的肝细胞溶液(2×10⁶个细胞/mL)，并且开始计时。然后将平板在37℃温育。在轻轻混合下完成温育时间(0、15、30、60和120分钟)后将含有内标的100μL乙腈加至每个孔中，并且加入50μL预温热的肝细胞溶液(2×10⁶个细胞/mL)。在结束温育后，确定细胞存活力。将样品在4℃以4000rpm离心15分钟，上清液用超纯水稀释2倍，并且化合物水平通过LC-MS/MS分析。

水溶性评价

水溶性可以如下测定：在室温在100%DMSO中制备10mM萨菲菌素类似物的储备液。在琥珀色小瓶中用0.1M PBS pH7.3的溶液或100%DMSO一式三份将0.01mL等份试样制备至0.5mL。在室温在IKA

vibrax VXR振荡器上振荡所得0.2mM的溶液6小时，随后将所得溶液或混悬液转移至2mL Eppendorf管中，并且在13200rpm离心30分钟。随后如前所述通过LCMS方法分析上清液等份试样。

可选择的是，在pH7.4的PBS中的溶解度如下测定：使用在H₂O中的50%MeOH将试验化合物和对照化合物稀释至40μM、16μM、4μM、1.6μM、0.4μM、0.16μM、0.04μM和0.002μM，产生校准曲线。标准点随后进一步在MeOH:PBS1:1中以1:20稀释。1:20稀释后的终浓度为2000nM、800nM、200nM、80nM、20nM、8nM、2nM和1nM。标准品随后与含有内标(羟基大环，6)的同样体积(1:1)ACN混合。离心样品(5分钟，12000rpm)，随后通过LC/MS分析。

将试验化合物制备成10mM浓度的在DMSO中的储备液。将储备液一式两份用pH7.4的PBS在1.5mL Eppendorf管中稀释至目标浓度100μM，最终DMSO浓度为1%(例如，将4μL10mM DMSO储备液稀释入396μL 100mM的磷酸盐缓冲液)。样品管随后在室温下轻微振荡4小时。离心样品(10分钟，15000rpm)以沉淀不溶的颗粒。将上清液转移至新的管中并且用PBS稀释(各试验样品的稀释因子通过化合物在所用分析仪器上的信号水平验证)。将稀释的样品随后与同样体积(1:1)的MeOH混合。样品最终与同样体积(1:1)的含内标(羟基大环，6)的ACN混合用于LC-MS/MS分析。

细胞渗透性评价

细胞渗透性可以如下测定：将试验化合物以10mM溶于DMSO，随后进一步在缓冲液中稀释，产生最终10μM的给药浓度。荧光标记物荧光黄同样被纳入以监测膜完整性。随后将试验化合物应用于Caco-2细胞单层的顶表面，并且测定渗透到基底外侧区室的化合物。以反方向进行(基底外侧到顶部)来研究主动转运。使用LC-MS/MS定量试验化合物和标准对照化合物(例如普萘洛尔和醋丁洛尔)的水平。

体内药代动力学评价

体内分析也可以用于测定化合物的生物利用度。通常，将化合物通过静脉内(i.v.)和口服(p.o.)施用至试验动物(例如小鼠或大鼠)，并且在预定的间隔取血样测定药物相对于时间的血浆浓度如何变化。血浆浓度相对于时间的时间过程可以使用标准模型用于计算化合物的绝对生物利用度百分数。典型的方案的实例如下文所述。

给小鼠静脉内或口服给药1、10或100mg/kg的本发明化合物或其母体化合物。在5、10、15、30、45、60、90、120、180、240、360、420和2880分钟取血样，并且通过HPLC测定样品中本发明化合物或母体化合物的浓度。然后，血浆浓度的时间进程可以用于产生关键参数，例如血浆浓度-时间曲线下面积(AUC-其与到达体循环的未改变的药物总量成正比)、最大(峰值)血浆药物浓度、最大血浆药物浓度发生时的时间(峰值时间)、其它用于精确测定生物利用度的因素包括：化合物的终末半衰期、总体内清除率、稳态分配容积和F%。这些参数随后经非区室或区室方法分析获得计算的生物利用度百分数，该类方法的实例参见Egorin等人，2002及其参考文献。

口服和静脉内药代动力学的体内评价(特定方法)

对于萨菲菌素类似物，进行全血分析。将化合物在5%乙醇/5%cremophor EL/90%盐水中配制，用于口服和静脉内施用。用1mg/kg静脉内或者5或10mg/kg口服对3只雄性CD1小鼠的各组进行给药。在给药前和在0.25、0.5、2、8和24小时时通过隐静脉采集血液样品(40μL)，并且用等量的dH₂O稀释，并且立即置于干冰上。样品存于-70℃直至分析。通过LCMS如下确定样品中本发明化合物或母体化合物的浓度：将20μL血液:H₂O(1:1，v/v)/PK样品加入100ng/mL的20μL内标(羟基大环，6)、20μL工作溶液/MeOH和150μL ACN，以1500rpm涡旋1分钟，并且以12000rpm离心5分钟。然后将上清液注入LC-MS/MS。对血液浓度的时间过程作图，并且其用于获得全血浓度-时间曲线下面积(AUC-其直接与达到体循环的未变化药物的总量成比例)。如有可能，这些值用来产生PK参数。

细胞毒性的体外评价

将获自ATCC的Huh-7和HepG2细胞在含有10%胎牛血清(FBS)、1%青霉素-链霉素(pen-strep)和1%谷氨酰胺的DuLbecco修饰的必需培养基(DMEM)中生长；而将CEM细胞(获自ATCC的人T细胞白血病细胞)在含有10%FBS、1%pen-strep和1%谷氨酰胺的RPMI 1640培养基中生长。从获自至少两个正常筛选的宿主的全血分离新鲜人PBMC。简言之，通过低速离心使外周血细胞沉淀/洗涤2-3次，并且重悬浮于PBS中，以除去污染的血小板。然后将洗涤的血细胞用DuLbecco’s磷酸盐缓冲盐水(D-PBS)进行1:1稀释，并且于50mL离心管中经14mL淋巴细胞分离培养基(Lymphocyte Separation Medium)(LSM；Mediatech,Inc.的cellgrow；密度1.078+/-0.002g/mL；Cat.#85-072-CL)分层，并且以600×g离心30分钟。从所产生的界面小心吸取带条纹的PBMC，随后通过低速离心用PBS洗涤2×。最终洗涤后，通过台盼蓝排阻对细胞计数，并且以1×10⁷个细胞/mL在补充有15%胎牛血清(FBS)、2mM L-谷氨酰胺、4μg/mL PHA-P的RPMI 1640中重悬浮。使细胞在37℃温育48-72小时。在温育后，对PBMC进行离心，并且重悬浮于含有15%FBS、2mM L-谷氨酰胺、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10μg/mL庆大霉素和20U/mL重组人IL-2的RPMI 1640中。

通过试验每种化合物(一式三份)对抗上述细胞的半对数浓度来评价化合物的细胞毒性。仅含有培养基的细胞用作细胞对照(CC)。将Huh-7和HepG2细胞以5×10³个细胞/孔的浓度接种于96孔板中。第二天，吸取培养基，并且加入含有5%FBS的100μL相应培养基。在微量滴定管中以2×浓度制备试验药物稀释液，并且将100μL每种浓度置于标准格式的适合孔中。72小时后，处理细胞以用于细胞毒性评价。

将PBMC稀释于新鲜培养基中，并且以5×10⁴个细胞/孔(体积100L)平铺于96孔圆底微板的内部孔中。类似地，以1×10⁴个细胞/孔平铺CEM细胞。然后，将100μL2×试验药物制备物加至标准格式的适合孔中。将培养维持六至七天，然后处理以进行细胞毒性测定。

使用CytoTox-ONE^TM均质膜完整性测定试剂盒(Promega)确定细胞毒性。该测定以荧光、均质模式测量乳酸脱氢酶(LDH)从具有受损膜的细胞中的释放。用酶联测定测量释放到培养基中的LDH，该酶联测定导致刃天青转化成荧光试卤灵产物。所产生的荧光的量与所裂解细胞的数目成比例。将六个系列稀释浓度的每种化合物应用至细胞，以(适用时)获得TC50(降低细胞存活力50%的药物的毒性浓度)和TC90(降低细胞存活力90%的药物的毒性浓度)值。

MDR1和MRP2转运蛋白抑制的体外评价

为了评价MDR1(P-糖蛋白1)和MRP2转运蛋白的抑制和活化，可以使用Solvo Biotechnology Inc.的体外ATP酶测定法(Glavinas等人，2003)。在钒酸盐存在或不存在情况下，将化合物(0.1、1、10和100μM)与MDR1或MRP2膜囊泡温育，研究潜在的ATP酶活化。此外，在维拉帕米/柳氮磺胺吡啶存在下进行类似的温育，以检测可能的转运蛋白ATP酶活性抑制。ATP酶活性通过分光光度法定量无机磷酸盐而测定。从ATP酶活性的钒酸盐敏感性增加计算活化。通过维拉帕米/柳氮磺胺吡啶介导的ATP酶活性下降测定抑制。

使用MDCK细胞体外评价Pgp转运蛋白的抑制作用

为了评价P-糖蛋白(Pgp/MDR1)转运蛋白的抑制作用，使用来自Cyprotex的体外ATP酶测定。使用由NIH(Rockville,MD,USA)获得的MDR1-MDCK细胞。培养后，通过在pH7.4和37℃下用缓冲液冲洗基底外侧和顶部表面两次来制备单层。然后在37℃和5%CO₂并且95%的相对湿度下在顶部和基底外侧区室中用pH7.4缓冲液温育细胞40分钟以稳定生理学参数。对于顶部至基底外侧研究(A-B)，从顶部区室除去pH7.4的缓冲液，并且在放入‘伴侣’板中之前用洛哌丁胺给药溶液代替。该溶液通过用缓冲液在DMSO中稀释洛哌丁胺得到5μM的最终洛哌丁胺浓度(最终DMSO浓度调至1%)而制备。在给药溶液中也包括荧光完整性标记物荧光黄(Lucifer yellow)。在存在和不存在试验化合物(应用于顶部和基底外侧区室两者)下进行试验。对于基底外侧至顶部(B-A)研究，P-糖蛋白底物洛哌丁胺(最终浓度=5μM)放入基底外侧区室中。在存在和不存在试验化合物(应用于顶部和基底外侧区室两者)下进行试验。在5%CO₂气氛和95%的相对湿度下于37℃进行温育60分钟。温育期后，除去伴侣板并且稀释顶部和基底外侧样品用于LC-MS/MS分析。进行每种试验化合物浓度的单次测定。每个板上，还筛选阳性对照抑制剂。评价0.1、0.3、1、3、10、30和50μM的试验化合物。通过使用荧光分析监控荧光黄渗透来检查单层在整个试验中的完整性。分析后，计算IC₅₀(即，实现半数最大抑制作用的抑制剂浓度(试验药物))。

体外评价摄取转运蛋白的抑制作用

为了评价OAT1B1和OAT1B3摄取转运蛋白的抑制作用，使用来自Solvo Biotechnology Inc.的体外摄取转运蛋白测定。在稳定表达人SLC转运蛋白OATP1B1和OATP1B3的CHO细胞上进行用0.068、0.2、0.62、1.8、5.5、16.7和50μM的试验品(TA)的摄取试验。亲代细胞系CHO-K用作阴性对照。将细胞(1×10⁵个，在补充有5mM丁酸钠的200μL Dulbecco修饰的Eagle培养基和Ham’s F-12DMEM(F-12,Lonza,New Jersey,US)的1:1混合物中)置于标准96孔组织培养板上并且在试验前24小时于37℃在5%CO2和95%空气的气氛中温育。试验前通过真空抽吸抽去培养基，用2×100μL Krebs-Henseleit缓冲液pH7.3(由Sigma chemicals,Sigma-Aldrich,St Louis,MO制备)洗涤细胞。在37℃于50μL分别含有探针底物和TA或溶剂的Krebs-Henseleit缓冲液(pH7.3)中进行摄取试验。每个孔中的有机溶剂浓度是相等的，并且不超过1%v/v。OATP1B1测定的探针底物为E3S(0.1μM)，并且OATP1B3测定的探针底物为Fluo-3(10μM)。确定每个孔的探针底物的易位量(以cpm计)。从以下方程计算相对活性：

活性%=(A-B)/(C-D)×100

其中A=在存在TA下转染的细胞上底物的易位量，B=在存在TA下亲代细胞上底物的易位量，C=在存在溶剂下转染的细胞上底物的易位量，以及D=在存在溶剂下亲代细胞上底物的易位量。IC₅₀被定义为抑制探针底物转运50%所需的TA浓度。IC₅₀源自三参数逻辑方程；通过非线性回归拟合到相对活性对TA浓度图上的曲线。

体外评价外流性转运蛋白的抑制作用

为了评价MRP2、MRP3和BSEP外流性转运蛋白的抑制作用，使用来自Solvo Biotechnology的体外囊泡转运蛋白测定。试验品(TAs)(0.068、0.2、0.62、1.8、5.5、16.7和50μM)与外流性转运蛋白膜囊泡(SolvoBiotechnology Inc.)在不存在和存在4mM ATP下温育以区分转运蛋白介导的摄取和TA进入囊泡的被动扩散。在MRP2和MRP3转运蛋白的情况下，在存在2mM谷胱甘肽下进行反应。将反应混合物在37℃预温育10分钟。通过添加25μL 12mM MgATP(在测定中4mM最终浓度)或用于背景对照的测定缓冲液来起始反应。通过添加200μL冰冷的洗涤缓冲液来停止反应并且立即在96孔格式(滤板)中的玻璃纤维滤器上过滤。将闪烁缓冲液加至洗涤的并且干燥的滤板中，随后计数闪烁。BSEP囊泡的探针底物为牛磺胆酸盐(2μM)，并且MRP2和MRP3囊泡的探针底物为E₂17βG(1μM)。对于所有孔，确定探针底物的易位量(以cpm单位)。根据以下方程计算相对活性：

活性%=(A-B)/(C-D)×100

其中A=在存在TA和ATP下底物的易位量，B=在存在TA下底物的易位量，C=在存在溶剂和ATP下底物的易位量，以及D=在存在溶剂下底物的易位量。IC₅₀被定义为抑制探针底物转运50%所需的TA浓度。IC₅₀源自三参数逻辑方程；通过非线性回归拟合到相对活性对TA浓度图上的曲线。

用于评价HIV抗病毒活性的体外测定

可以如下试验对抗HIV的抗病毒效力：如前所述分离血液源性CD4+T-淋巴细胞和巨噬细胞(Bobardt等人，2008)。简言之，人PBMC从新鲜血液通过在Ficoll–Hypaque上分带(30分钟，800g，25℃)而纯化。原代人CD4+T细胞从PBMC通过用抗-CD4Dynabeads阳性选择及后续使用Detachabead释放而纯化。将细胞在补充有10%FCS、MEM氨基酸、L-谷氨酰胺、MEM维生素、丙酮酸钠和青霉素+链霉素的RPMI培养基1640(Invitrogen)中培养并且随后用细菌超抗原葡萄球菌肠毒素B(SEB；100ng/mL)和来自另外宿主的杀死丝裂霉素C的PBMC(10:1PBMC:CD4细胞比例)活化。刺激3天后，将细胞1:2分在含有IL-2的培养基(200单位/mL最终浓度)中。每2天将培养物1:2分在IL-2培养基中并且在刺激后7天用HIV感染。对于产生原代人巨噬细胞，通过阴性选择纯化来自人PBMC的单核细胞并且进行活化，并且以10⁶个/mL的细胞浓度在补充有10%FCS、MEM氨基酸、L-谷氨酰胺、MEM维生素、丙酮酸钠和青霉素(100单位/mL)、链霉素(100mg/mL)和50ng/mL重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的DMEM中培养并且在37℃维持于补充有5%CO₂的潮湿气氛中。为了获得单核细胞源性巨噬细胞，使细胞粘附至塑料制品并且培养6天以允许分化。

将CD4+HeLa细胞、Jurkat细胞、活化的CD4+外周血T-淋巴细胞和巨噬细胞(500,000个细胞/100μL)与pNL4.3-GFP(×4病毒)或pNL4.3-BaL-GFP(R5病毒)(100ng p24)在存在增加浓度的试验品下温育，48小时后，通过用FACS分析GFP阳性细胞的百分比对感染进行评分，并且计算EC₅₀。

用于评价HBV抗病毒活性的体外测定

可以如下试验对抗HBV的抗病毒效力：将HepG2 2.2.15细胞放入96孔微量滴定板中。16-24小时后，洗涤HepG2 2.2.15细胞的汇合单层并且一式三份地将培养基代替为含有不同浓度的试验化合物的完全培养基(例如六个半对数浓度)。3天后将培养基代替为含有适合稀释的试验化合物的新鲜培养基。初始施用试验化合物后六天，收集细胞培养物的上清液，用链霉蛋白酶处理，然后在实时定量TaqMan qPCR测定中使用。通过监测由猝灭的荧光探针分子(其与扩增的HBV DNA杂交)的外切核酸降解产生的荧光信号增加来实时监测PCR-扩增的HBV DNA，所述的荧光探针分子杂交为扩增的HBV DNA。对于每个PCR扩增，使用纯化的HBV DNA的稀释液同时产生标准曲线。从HBV DNA水平(IC₅₀)的下降计算抗病毒活性。然后采用染料摄取测定以测量细胞存活力，其用于计算毒性(TC₅₀)。治疗指数(TI)被计算为TC₅₀/IC₅₀。

用于评价免疫抑制活性的体外混合的淋巴细胞反应(MLR)测定

如下试验免疫抑制活性：应用经histopaque离心，纯化来自两个正常、不相关的自愿者供体(A&B)的血液的外周血单核细胞(PBMC)群。计数细胞并且以1×10⁵个细胞/孔放入96孔板内含有补充剂和2%人AB血清的RPMI培养基中。

培养条件包括：在不存在或存在试验化合物下，单独的细胞群A&B以及细胞A&B的混合群，各自为6种不同浓度。在10μM至0.0001μM的剂量范围下以1-log增量试验化合物。对照孔含有与存在于试验化合物孔中的浓度相当的介质(0.5%DMSO)浓度。一式三份地在96孔板中建立培养物并且于潮湿气氛中在37℃和5%CO₂下温育。在测定建立后第6天加入3H-胸腺嘧啶脱氧核苷并且在24小时后收集。然后比较在不同的培养条件下的增殖水平。

每种稀释的试验化合物在MLR中抑制增殖的能力以抑制作用百分数形式计算。这允许估计IC₅₀(试验化合物的导致每分钟计数下降50%的浓度)。为了计算IC₅₀，将X轴转化成对数比例。使用非线性回归拟合平均数据点。选择S形变化斜率。

Cyp-NS5A相互作用的ELISA分析

使用该测定来测量Cyp-NS5A复合物的破坏，其可以用于显示与亲环素D相互作用的能力。简言之，如前所述进行重组GST、GST-CypD和Con1NS5A-His蛋白质的生产及纯化(Chatterji等人，2010)。NuncMaxiSorb8-孔带状板在4℃用GST或GST-CypD包被16小时并且封闭。在4℃将在50μL结合缓冲液(20mM Tris pH7.9、0.5M NaCl、10%甘油、10mM DTT和1%NP-40)中的重组NS5A-His(1ng/mL)加至孔中16小时。随后使用小鼠抗-His抗体(1μg/mL)(抗-6xHis，Clontech)和兔抗-小鼠-辣根过氧化物酶磷酸酶(HRP)抗体(1:1000稀释)检测捕获的NS5A-His。使用两个不同批次的重组CypD和NS5A蛋白质进行所有试验两次。

亲环素抑制作用的抗-PPIAse分析

如下描述用于分析与亲环素的相互作用的替代方法：通过GST-CypA或D的凝血酶裂解而产生的重组CypA或D的PPIase活性通过如下N-琥珀酰基-Ala-Ala-Pro-Phe-对硝基苯胺被糜蛋白酶水解的速率来确定。糜蛋白酶仅水解反式形式的肽，并且顺式形式的水解，其浓度通过使用溶解于含有470mM LiCl的三氟乙醇中的储备液而最大化，受限于顺式-反式异构化的速率。CypA或D与所选的试验品使用0.1至20nM的药物浓度范围在5℃平衡1小时。通过添加肽开始反应，并且以每秒10个数据点以分光光度法监测吸光度的变化。从在存在CypA或D下的速率减去水解的空白速率(在不存在CypA或D下)。通过吸光度变化的时间过程的一级回归分析来分析酶促反应的初始速率。

实施例

实施例1-链霉菌属物种A92-308110(DSM9954)的sfaA缺失突变体的构建

1.1 sfaA缺失构建体的构建

通过用EcoRV和StuI消化来切断包含sfaA(核苷酸位置14396-21362，NCBI序列登录号FJ809786)的粘粒TL3006的～7kb EcoRV-StuI片段(SEQID NO.3)，将所得的分离片段直接连接到pKC1139中，pKC1139之前已用EcoRV消化并且用虾碱性磷酸酶(Roche)处理。该质粒被称为pSGK268。

使用由Gene Bridges供应的Red/ET重组试剂盒(目录号K006)进行包含在该克隆中的sfaA基因的框内缺失。

(SEQ ID NO.1)SfaA17161f5’-CGCTCTGTGGCGCCTGGTTTCCAAGCGGCTCGCGGACCGGCACCGGCACATGCATAATTAACCCTCACTAAAGGGCG-3’

(SEQ ID NO.2)SfaA17825r5’-TGGATGTATCGTCGCAGGACGCCCAGAATTCACCTGCGACGTCCTCCAGATGCATTAATACGACTCACTATAGGGCTC-3’

使用两种寡核苷酸SfaA17161f和SfaA17825r，使用KOD DNA聚合酶，由在试剂盒中提供的FRT-PGK-gb2-neo-FRT模板DNA扩增新霉素标记物。所产生的～1.7kb扩增产物通过凝胶电泳分离，并且用QiaEX树脂从凝胶纯化。

使用标准技术将质粒pSGK268转至大肠杆菌(E.coli)DH10B，并且在含有安普霉素(50μg/mL)的平板上选择。基本上按照Gene Bridges试剂盒方案进行缺失构建体的引入。使单个菌落在2TY安普霉素(50μg/mL)中生长过夜，并且用pRedET(tet)质粒转化，并且在30℃用安普霉素(50μg/mL)和四环素(3μg/mL)选择。在30℃于3mL2TY安普霉素(50μg/mL)和四环素(3μg/mL)中使用单个菌落制备该菌株的过夜培养物。在30℃使用0.5mL该培养物接种10mL2TY安普霉素(50μg/mL)和四环素(3μg/mL)，并且生长至OD_600nm～0.5。将1.4mL该培养物转移至2个Eppendorf管中的每个，并且将50μL10%阿拉伯糖加至一个管中以诱导Red/ET重组蛋白质的表达。在37℃将管振摇～1小时。将经诱导的和未经诱导的细胞在台式离心机中沉淀，并且用冷冻的无菌水洗涤两次；每次经过再混悬和离心，沉淀细胞。将所产生的沉淀物悬浮于约30-40μL水中，并且保持于冰上。将之前分离的1.7kb断裂片段加至经诱导的和未经诱导的管中，并且转移到在冰上的1mm Biorad电穿孔杯(electrocuvette)中。对样品进行电穿孔(Biorad MicropuLser，1.8kV，所得的时间常数～4ms)，并且加入1mL 2TY(无抗生素)，并且混合以除去杯中的细胞。将细胞在37℃于振荡(1100rpm，eppendorf小型热混合器)下温育～3小时，随后平铺在含有安普霉素(50μg/mL)和卡那霉素(25μg/mL)的2TY平板上，并且在37℃温育过夜。将来自经诱导的样品平板的菌落挑染到含有50μg/mL卡那霉素的2TY平板上，以纯化并且确认卡那霉素抗性盒(cassette)的引入。在各个细菌菌落上使用PCR来确认盒的引入。由这些培养物制备质粒，并且将其消化，以确认所期望的质粒pSGK270。然后用NsiI消化质粒以除去标记物片段，并且将剩余部分重新连接以生产sfaA框内缺失的构建体pSGK271。

1.2链霉菌属物种A92-308110(DSM9954)的接合和sfaA缺失的引入

使用标准技术将质粒pSGK271转入大肠杆菌ET12567 pUZ8002中，并且在含有安普霉素(50μg/mL)、卡那霉素(25μg/mL)和氯霉素(chloroamphenicol)(10μg/mL)的2TY平板上选择。将所得菌株接种于3mL含有安普霉素(50μg/mL)、卡那霉素(25μg/mL)和氯霉素(10μg/mL)的液体2TY中，并且在37℃、250rpm温育过夜。在50mL Falcon管中使用0.8mL该培养物接种10mL含有安普霉素(50μg/mL)、卡那霉素(25μg/mL)和氯霉素(10μg/mL)的液体2TY，并且在37℃、250rpm温育直到OD_600nm达到～0.5。将所得培养物在4℃以3500rpm离心10分钟，用10mL2TY培养基洗涤两次，每次洗涤后离心沉淀细胞。将所得沉淀物再悬浮于0.5mL2TY中，并且在使用前保持在冰上。该过程的时间安排与下述链霉菌属孢子的完全制备保持一致。

通过再悬浮于～3mL20%甘油中，从1-2周龄的汇合平板上收集链霉菌属物种A92-308110(DSM9954)(Biot-4370)的孢子。离心(5000rpm，10分钟，室温)孢子，并且用50mM TES缓冲液洗涤两次，之后再悬浮于1mL50mM TES缓冲液中，并且在2个eppendorf管之间平分。将这些管在50℃水浴中热休克10分钟，然后加入0.5mL2TY，并且在Eppendorf小型热混合器中于37℃温育4-5小时。

将所制备的大肠杆菌ET12567 pUZ8002 pSGK271和Biot-4370按比例1:1(各菌株250μL)和1:3(100μL大肠杆菌)混合，并且随即在R6平板上展开，并且转移到37℃培养箱中。温育约2小时后，将这些平板用2mL含有萘啶酸的无菌水覆盖，得到25μg/L的最终平板内浓度。将平板放回到37℃培养箱中过夜，随后用2mL含有安普霉素的无菌水覆盖，得到20-25μg/L的最终平板内浓度。Ex-接合体菌落在约4-7天后出现，将其置于含有安普霉素(25μg/L)和萘啶酸(25μg/L)的ISP4培养基上，并且在37℃温育。一旦观察到足够的菌丝生长，将菌株在37℃再转移到含有安普霉素(25μg/L)的ISP4培养基中，并且使孢子形成。随后通过转移到ISP4(无抗生素)以及在37℃温育3-4天，将菌株传代培养3次(促进除去温度敏感质粒)。最后将菌株转至ISP4，并且在28℃温育进行完全孢子生长(5-7天)。收集孢子，并且在28℃系列稀释至ISP4平板上，选择单个菌落。形成孢子的单个菌落一式二份转移至含或不含安普霉素(25μg/L)的ISP4平板，以确定质粒损失，并且使其生长～7天，然后试验萨菲菌素的生成。

1.3在falcon管中筛选菌株用于生产萨菲菌素

使用孢子形成良好的菌株的单个～7mm琼脂块接种7mL无菌SM25-3培养基，并且在27℃、200rpm下在2”振幅的振荡器中温育。48小时生长后，将0.7mL该培养物转移到含有7mL含5%HP20树脂的SGP2培养基的无菌falcon管中。使培养物在24℃、300rpm下在1英寸振幅振荡培养箱中生长5天，然后收集。移除0.8mL细胞培养物，并且将其等份分到2mL eppendorf管中，分装前保证树脂在整个培养物中充分分散。加入0.8mL乙腈和15μL甲酸，并且将管混合约30分钟。通过离心使混合物变澄清，并且将170μL提取液移入HPLC小瓶中，并且通过HPLC分析。

1.4恢复至野生型或sfaA表型的菌株分析

通过HPLC分析菌株提取物。生产萨菲菌素A和B的菌株没有进一步分析，因为其已恢复为野生型。缺少萨菲菌素A和B生成的菌株显示低水平(～1-2mg/L)的峰保留时间6.5分钟(显示萨菲菌素样生色团)。通过LCMS分析表明，该峰具有m/z1073，比期望的萨菲菌素m/z低16个单位。假定，该峰是由于在间-羟基酪氨酸不存在下掺入苯丙氨酸所致。

随后使显示萨菲菌素生产缺失的八个菌株再生长，评价潜在的sfaA突变是否可能用化学方法补充以使突变合成的方法生成新的萨菲菌素。将菌株在SM25-3种子培养基中生长48小时，然后转移至含有5%树脂的SGP2生产培养基。再生长24小时后，将菌株一式三份地用2mM DL间-羟基酪氨酸(添加100uL0.16M在1M HCL中的溶液)或2mM L-苯丙氨酸补料，未补料的菌株用作对照。也对菌株补料在甲醇中的2-哌啶酸(2mM)以增强产物产率。再生长4天后收集菌株，并且提取，并且通过HPLC分析。显示间-羟基酪氨酸完全补充sfaA突变，并且添加L-苯丙氨酸增加了-16amu化合物的水平。选择菌株Biot-4585作为sfaA缺失突变体用于进一步研究。

实施例2-用于构建sfaA缺失构建体的其它方法

可以使用其它方法产生sfaA缺失突变体。实例包括sfaA插入失活突变体(如来自WO2010/034243的实施例12)。该菌株如WO2010/034243中所述产生，并且给予该菌株名称BIOT-4452。

在产生sfaA缺失的替代方法中，使用作为模板的粘粒TL3006(SEQ IDNO.3)和KOD DNA聚合酶，使用两个寡核苷酸15209F5’-CAGAGAATTCGCGGTACGGGGCGGACGACAAGGTGTC-3’(SEQID NO.4)和17219R5’-GCGCATGCATGTGCCGGTGCCGGTCCGCGAGCCGCTTGG-3’(SEQ ID NO.5)来扩增同源物上游区域。扩增产物用T4多核苷酸激酶(NEB)处理，并且克隆入pUC18中，通过用虾碱性磷酸酶(Roche)处理已使pUC18脱磷酸化。通过限制消化来检查所产生的构建体，并且完全测序，以确保产生所需序列并且在聚合酶扩增期间未引入错误。用EcoRI和NsiI消化该构建体，并且通过凝胶电泳分析产物。从凝胶切除含有所需序列的条带(即上游同源性～2kb)，并且使用标准程序(QiaEX树脂)纯化。使用作为模板的粘粒TL3006(SEQ ID NO.3)和KOD DNA聚合酶，使用第二组寡核苷酸17766F5’-CCTCATGCATCTGGAGGACGTCGCAGGTGAATTCTGGGCG-3’(SEQ ID NO.6)和19763R5’-GGGCAAGCTTCTCCTGGCTGAGCTTGAACATCG-3’(SEQ ID NO.7)来扩增同源物下游区域。扩增产物用T4多核苷酸激酶(NEB)处理，并且克隆入pUC18中，通过用虾碱性磷酸酶(Roche)处理已使pUC18脱磷酸化。通过限制消化来分析所产生的构建体，并且完全测序，以确保产生所需序列并且在聚合酶扩增期间未引入错误。用HindIII和NsiI消化该构建体，并且通过凝胶电泳分析产物。从凝胶切除含有所需序列的条带(即下游同源物～2kb)，并且使用标准程序(QiaEX树脂)纯化。用EcoRI和HindIII消化载体pKC1139，并且将大载体片段通过凝胶电泳分离，并且通过标准方法(QiaEX树脂)纯化。然后将分离的上游和下游同源性片段以三方连接方式克隆入pKC1139的该片段，从而产生所需的sfaA缺失构建体。

在用于产生sfaA缺失构建体的进一步替代方法中，使用商业基因合成(即Genscript或其它供应商)产生含有所需序列(SEQ ID NO.8)的构建体。使用BamHI和XbaI消化该商购构建体，从而切除所关注的序列，并且通过凝胶电泳分析产物。从凝胶切除含有所需序列的条带(～4kb)，并且使用标准方法纯化。用BamHI和XbaI消化载体pKC1139，并且大片段通过凝胶电泳分离，并且通过标准方法来纯化。然后将两种分离片段连接在一起，从而产生所需的sfaA缺失构建体。

使用实施例1.2中所述的方法，通过二次杂交的接合和选择将这些替代sfaA缺失构建体引入至链霉菌属物种A92-308110(DSM9954)中。在该方法中构建的菌株的生长和分析也遵循实施例1.2中所述的方法。

实施例3-sfaA缺失突变体的阵列补料

在MAM、ISP4、ISP3或ISP2培养基上生长后制备sfaA破坏的突变体(BIOT-4452或BIOT-4585)的孢子储备液，并且保存于在蒸馏水中的20%w/v甘油中，并且存于-80℃。通过在带有泡沫塞的50mL离心管中将孢子储备液(1%v/v)接种到7mL种子培养基(SM25培养基)中来制备营养培养物(种子培养物)。将培养管在27℃、250rpm(5cm振幅)下温育48小时。在带有泡沫塞的50mL离心管中将10%种子培养物(v/v)转移到7mL生产培养基SGP-2中。在24℃和300rpm(2.5cm振幅)下进行培养。为了生产萨菲菌素突变合成类似物，接种后24小时将0.05mL 0.32M补料化合物(突变合成子)溶液(于1N HCl中)加至各管中，得到最终浓度为2mM。此外，在24小时时将0.05mL0.32M六氢哒嗪-3-羧酸溶液(于甲醇中)加至各管中，得到最终浓度为2mM。补料后将培养继续另外4天。

通过将0.8mL全培养液转移到2mL具塞eppendorf管中来提取样品。加入0.8mL乙腈，以及0.015mL甲酸。然后将混合物在vibrax上振摇30分钟。然后将管以13000rpm离心10分钟，并且移除0.15mL上清液用于分析。如通用方法所述分析提取液。

表1显示以这种方式补料的突变合成子，以及观察到的萨菲菌素突变合成产物的LCMS H+和Na+加合物、预期的分子量和保留时间。显示涉及萨菲菌素A类似物的主峰。在所有情况中，也观察到萨菲菌素B类似物的LCMS峰(质量-18)。

表1

实施例4-63-氟萨菲菌素A，中间体化合物14的分离

利用2-氨基-3-(3-氟-5-羟基苯基)丙酸甲酯和DL-六氢哒嗪-3-羧酸作为前体，如通用方法中所述进行发酵，在26小时时加入两者。

收集培养物后，将培养液混合，并且用甲酸调节至约pH3，并且离心(3300g)25分钟，从净化的培养液分离细胞和树脂。在试验确定存在少于5%的目标化合物后，弃去净化的培养液。使用磁力搅拌器将细胞和树脂与2体积乙腈搅拌1小时。通过离心或通过在重力下使其沉降，回收乙腈提取液。然后在相同条件下进行细胞和树脂的第二次乙腈提取。在减压下将合并的乙腈提取物浓缩至残留的含水体积，然后调节至pH6。将其用乙酸乙酯萃取两次，并且在减压下使合并的有机物干燥，得到最终粗品(1.3g)。

将粗提取物(1.3g)溶于乙酸乙酯(2mL)中，并且加样至用乙酸乙酯(500mL)调节的硅胶柱(10×2cm)上。将柱用乙酸乙酯洗脱，然后逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10%、20%、30%等)。收集约250mL级分，并且目标化合物通过分析型LC鉴定，合并并且使其干燥。将该材料(278mg)溶于甲醇(1.8mL)中，并且通过制备型HPLC纯化。使用Waters Xterra MSC18柱(10微米，19cm×250mm)，溶剂以21mL/分钟泵送。溶剂A为水并且溶剂B为乙腈。将柱等度运行，进样后以50%B进行6分钟，随后在30分钟时梯度至100%B。纯级分通过HPLC-UV鉴定并且合并。在减压下使这些级分干燥，获得目标化合物，为类白色无定形固体(20mg)。

实施例5-62,63-氟萨菲菌素A，中间体化合物15的分离

利用(S)-2-氨基-3-(3,4-二氟-5-羟基苯基)丙酸甲酯和DL-六氢哒嗪-3-羧酸作为前体，如通用方法中所述进行发酵，在26小时时加入两者。

收集培养物后，将培养液混合，并且用甲酸调节至约pH3并且离心(3300g)25分钟，从净化的培养液分离细胞和树脂。在试验确定存在少于5%的目标化合物后，弃去净化的培养液。使用磁力搅拌器将细胞和树脂与2体积乙腈搅拌1小时。通过离心或通过在重力下使其沉降，回收乙腈提取物。然后在相同条件下进行细胞和树脂的第二次乙腈提取。在减压下将合并的乙腈提取物浓缩至残留的含水体积，然后调节至pH6。将其用乙酸乙酯萃取两次，并且在减压下使合并的有机物干燥，得到最终粗品(1.6g)。

将粗提取物(1.6g)溶于2mL乙酸乙酯中，并且上样至用500mL乙酸乙酯调节的硅胶柱(10×2cm)上。将柱用乙酸乙酯洗脱，然后逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10%、20%、30%等)。收集约250mL级分，并且目标化合物通过分析型LC鉴定，合并并且使其干燥。将该材料(188mg)溶于1.8mL甲醇中，并且通过制备型HPLC纯化。使用Waters Xterra MSC18柱(10微米，19cm×250mm)，溶剂以21mL/分钟泵送。溶剂A为水并且溶剂B为乙腈。将柱等度运行，进样后以50%B进行6分钟，随后在30分钟时梯度至100%B。在减压下使这些级分干燥，获得目标化合物，为类白色无定形固体(15mg)。

实施例6-62-氟萨菲菌素A，中间体化合物16的分离

使用(S)-2-氨基-3-(4-氟-3-羟基苯基)丙酸甲酯和DL-六氢哒嗪-3-羧酸前体。根据通用方法进行，不同的是在27小时时加入前体。

收集培养物后，将培养液混合，并且用甲酸调节至约pH3，并且离心(3300g)25分钟，从净化的培养液分离细胞和树脂。在试验确定存在少于5%的目标化合物后，弃去净化的培养液。使用磁力搅拌器将细胞和树脂与2体积乙腈搅拌1小时。通过离心或通过在重力下使其沉降，回收乙腈提取物。然后在相同条件下进行细胞和树脂的第二次乙腈提取。

在减压下将合并的乙腈提取物浓缩至残留的含水体积，然后调节至pH6。将其用乙酸乙酯萃取两次，并且在减压下使合并的有机物干燥，得到最终的油状粗品(4.2g)。

将粗提取物(4.2g)溶于4mL乙酸乙酯中，并且上样至用500mL乙酸乙酯调节的硅胶柱(15×2cm)上。将柱用乙酸乙酯洗脱，然后逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10%、20%、30%等)。收集约250mL级分，并且目标化合物通过分析型LC鉴定，合并，并且使其干燥。将该材料(390mg)溶于2.4mL甲醇中，并且通过制备型HPLC纯化。使用Waters XterraMSC18柱(10微米，19cm×250mm)，溶剂以21mL/分钟泵送。溶剂A为水并且溶剂B为乙腈。将柱等度运行，进样后以50%B进行6分钟，随后在30分钟时梯度至100%B。纯级分通过HPLC-UV鉴定并且合并。在减压下使这些级分干燥，获得目标化合物，为类白色无定形固体(38mg)。

实施例7-62-甲基萨菲菌素A，中间体化合物17的分离

将冷藏保存的BIOT-4585孢子储备液在室温解冻。通过在带有泡沫塞的2L锥形瓶中将0.4mL孢子储备液转移到400mL培养基SM25中来制备营养培养物(种子培养物)。将培养在27℃和250rpm(2.5cm振幅)下进行48小时。在带有泡沫塞的2L锥形瓶中将种子培养物20mL转移到400mL生产培养基SGP2+5%HP20中。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下培养24小时后，将2mL的200mM(S)-2-氨基-3-(3-羟基-4-甲基苯基)丙酸甲酯在1M盐酸中的溶液和2mL400mM DL-六氢哒嗪-3-羧酸的甲醇溶液加至每个生产烧瓶，得到前体的单个对映异构体的1mM最终浓度。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下再继续培养4天。

将培养液混合，并且用甲酸调节至约pH3，并且离心(3300g)25分钟，从净化的培养液分离细胞和树脂。在试验确定存在少于5%的目标化合物后，弃去净化的培养液。使用顶置式桨式搅拌器将细胞和树脂与2体积乙腈搅拌1小时。通过在重力下使其沉降，回收乙腈提取物。然后在相同条件下进行细胞和树脂的第二次乙腈提取。在减压下将合并的乙腈提取物浓缩至残留的含水体积，然后调节至pH6。将其用乙酸乙酯萃取两次，并且在减压下使合并的有机物干燥，得到最终粗品(7.6g)。

将粗提取物(7.6g)溶于5mL乙酸乙酯中，并且上样至用500mL乙酸乙酯调节的硅胶柱(15×2cm)上。将柱用乙酸乙酯洗脱，然后逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10%、20%、30%等)。收集约250mL级分，并且目标化合物通过分析型LC鉴定，合并并且使其干燥。将该材料(319mg)溶于2.4mL甲醇中，并且通过制备型HPLC纯化。使用Waters Xterra MSC18柱(10微米，19cm×250mm)，溶剂以21mL/分钟泵送。溶剂A为水并且溶剂B为乙腈。将柱等度运行，进样后以50%B进行6分钟，随后在30分钟时梯度至100%B。纯级分通过HPLC-UV鉴定并且合并。在减压下使这些级分干燥，获得目标化合物，为类白色无定形固体(14.9mg)。

实施例8-61-脱羟基萨菲菌素A，中间体化合物18的分离

将冷藏保存的BIOT-4585孢子储备液在室温解冻。通过在带有泡沫塞的2L锥形瓶中将0.4mL孢子储备液转移到400mL培养基SM25中来制备营养培养物(种子培养物)。将培养在27℃和250rpm(2.5cm振幅)下进行48小时。在7L Applikon发酵罐中将种子培养物500mL转移到4.5L生产培养基SGP2+5%HP20中，并且在24℃、400rpm(级联DOT控制)、2.5L/分钟气流和30%DOT(级联搅拌控制)下培养。在培养24小时后，将7.5mL的667mM(S)-2-氨基-3-苯基丙酸在1M盐酸中的溶液加至发酵罐中，得到前体的1mM最终浓度。在24℃、400rpm(级联DOT控制)、2.5L/分钟气流和30%DOT(级联搅拌控制)下再继续培养4天。

将培养液混合，并且用甲酸调节至约pH3，并且离心(3300g)25分钟，从净化的培养液分离细胞和树脂。在试验确定存在少于5%的目标化合物后，弃去净化的培养液。使用顶置式桨式搅拌器将细胞和树脂与2体积乙腈搅拌1小时。通过在重力下使其沉降，回收乙腈提取物。然后在相同条件下进行细胞和树脂的第二次乙腈提取，但是第二次提取物通过离心回收。在减压下将合并的乙腈提取物浓缩至残留的含水体积，然后调节至pH6。将其用乙酸乙酯萃取两次，并且在减压下使合并的有机物干燥，得到最终粗品(55g)。

将粗提取物(55g)悬浮于在水中的80%甲醇中，并且用300mL己烷萃取两次。在甲醇/水部分中发现目标化合物，并且使其干燥。将该干燥的提取物(48g)溶于30mL乙酸乙酯中，并且上样至用1L乙酸乙酯调节的硅胶柱(20×5cm)上。将柱用乙酸乙酯洗脱，然后逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10%、20%、30%等)。收集约250mL级分，并且目标化合物通过分析型LC鉴定，合并并且使其干燥。将该材料(813mg)溶于甲醇中，并且通过制备型HPLC纯化。使用Waters Xterra MSC18柱(10微米，19cm×250mm)，溶剂以21mL/分钟泵送。溶剂A为水并且溶剂B为乙腈。将柱等度运行，进样后以50%B进行6分钟，随后在30分钟时梯度至100%B。纯级分通过HPLC-UV鉴定并且合并。在减压下使这些级分干燥，获得目标化合物，为类白色无定形固体(34mg)。

实施例9-58-脱(3-羟基苯基)-58-(3-羟基(2-吡啶基)-萨菲菌素A，中间体化合物19的分离

采用(2S)-2-氨基-3-(3-羟基(2-吡啶基))丙酸甲酯和DL-六氢哒嗪-3-羧酸前体。根据通用方法进行，不同的是在营养(种子)培养期间培养箱振幅为2.5cm。

将培养液混合，并且用甲酸调节至约pH3，并且离心(3300g)25分钟，从净化的培养液分离细胞和树脂。在试验确定存在少于5%的目标化合物后，弃去净化的培养液。使用顶置式浆式搅拌器将细胞和树脂与2体积乙腈搅拌1小时。通过在重力下使其沉降，回收乙腈提取物。然后在相同条件下进行细胞和树脂的第二次乙腈提取。在减压下将合并的乙腈提取物浓缩至残留的含水体积，然后调节至pH6。将其用乙酸乙酯萃取两次，并且在减压下使合并的有机物干燥，得到最终粗品(7g)。

将粗提取物(7g)溶于4mL乙酸乙酯中，并且上样至用500mL乙酸乙酯调节的硅胶柱(15×2cm)上。将柱用乙酸乙酯洗脱，然后逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10%、20%、30%等至100%丙酮，然后1%甲醇逐步至于丙酮中的5%甲醇)。收集约250mL级分，并且目标化合物通过分析型LC鉴定，合并并且使其干燥。将该材料(204mg)溶于甲醇中，并且通过制备型HPLC纯化。使用Waters Xterra MSC18柱(10微米，19cm×250mm)，溶剂以21mL/分钟泵送。溶剂A为水并且溶剂B为乙腈。将柱等度运行，进样后以50%B进行6分钟，随后在30分钟时梯度至100%B。纯级分通过HPLC-UV鉴定并且合并。在减压下使这些级分干燥，获得目标化合物，为类白色无定形固体(4mg)。

实施例10-61-脱羟基-61-氟萨菲菌素A，中间体化合物20的分离

将冷藏保存的BIOT-4585孢子储备液在室温解冻。通过在带有泡沫塞的2L锥形瓶中将0.4mL孢子储备液转移到400mL培养基SM25中来制备营养培养物(种子培养物)。将培养在27℃和250rpm(2.5cm振幅)下进行48小时。在带有泡沫塞的2L锥形瓶中将种子培养物20mL转移到400mL生产培养基SGP2+5%HP20中。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下培养24小时后，将2mL的400mM2-氨基-3-(3-氟苯基)丙酸在1M盐酸中的溶液和2mL400mM DL-六氢哒嗪-3-羧酸的甲醇溶液加至每个生产烧瓶中，得到前体的单个对映异构体的1mM最终浓度。在24℃和250rpm(2.5cm振幅)下再继续培养4天。

将培养液混合，并且用甲酸调节至约pH3，并且离心(3300g)25分钟，从净化的培养液分离细胞和树脂。在试验确定存在少于5%的目标化合物后，弃去净化的培养液。使用顶置式浆式搅拌器将细胞和树脂与2体积乙腈搅拌1小时。通过在重力下使其沉降，回收乙腈提取物。然后在相同条件下进行细胞和树脂的第二次乙腈提取。通过对残留的细胞和树脂混合物离心，获得第三次提取物。在减压下将合并的乙腈提取物浓缩至残留的含水体积，然后调节至pH6。将其用乙酸乙酯萃取两次，并且在减压下使合并的有机物干燥，得到最终粗品(10.5g)。

将粗提取物(10.5g)溶于7mL乙酸乙酯中，并且上样至用500mL乙酸乙酯调节的硅胶柱(15×2cm)上。将柱用乙酸乙酯洗脱，然后逐步增加丙酮(于乙酸乙酯中的10%、20%、30%等)。收集约250mL级分，并且目标化合物通过分析型LC鉴定，合并并且蒸发至干。将该材料(342mg)溶于甲醇中，并且通过制备型HPLC纯化。使用Waters Xterra MSC18柱(10微米，19cm×250mm)，溶剂以21mL/分钟泵送。溶剂A为水并且溶剂B为乙腈。将柱等度运行，进样后以53%B进行30分钟。纯级分通过HPLC-UV鉴定并且合并。在减压下使这些级分干燥，获得目标化合物，为类白色无定形固体(6mg)。

实施例11-(2-(1,2-嗪烷-2-基)-2-氧代乙基)膦酸二乙酯的合成

向21-1(ChemCollect,Germany)(100mg，0.81mmol)、Et₃N(246mg，2.43mmol)在干燥DCM(5mL)中的溶液中滴加氯乙酰氯(138mg，1.22mmol)。将反应混合物在室温搅拌3小时，倒入冰水中，并且用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤，并且经Na₂SO₄干燥，过滤，真空浓缩。残留物(21-2)用于下一步骤而无任何进一步纯化(123mg，90%收率)。

将21-2(123mg，0.75mmol)和亚磷酸三乙酯(250mg，1.50mmol)的混合物在140℃搅拌6小时。将反应混合物冷却至室温并且通过快速色谱纯化，获得21。

(2-(1,2-

嗪烷-2-基)-2-氧代乙基)膦酸二乙酯，21的合成的可选择的合成

用于制备21a-2的通用方法

在室温、向t-BuOK(84.0g，0.75mol)在四氢呋喃(2.0L)中的溶液中分批加入21a-1(50.0g，0.38mol)。将混合物在室温搅拌1小时。在室温滴加1,4-二溴丁烷(81.2g，0.38mol)。然后将混合物在80℃搅拌16小时。冷却后，加入水(2000mL)，将混合物用乙酸乙酯萃取(2×1000mL)。将合并的有机层经无水Na₂SO₄干燥16小时，过滤并且浓缩后，通过硅胶柱色谱(洗脱：石油醚:乙酸乙酯=100:1至10:1)纯化残留物，得到21a-2(57g)，为无色油状物。

用于制备21a-3的通用方法

在室温、向21a-2(55g，0.29mol)在叔丁基甲基醚TBME(80mL)中的溶液中加入4N HCl(600mL，于TBME中)溶液，将混合物在室温搅拌3小时。过滤沉淀的固体并且用TBME(50mL)洗涤，得到21a-3(30g)，为白色固体。

用于制备21的通用方法

在0℃、向21a-4(35g，0.18mol)、羟基苯并三唑(HOBT)(29g，0.21mol)和Et₃N(71mL，0.51mol)在无水二氯甲烷(550mL)中的搅拌溶液中分批加入1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDCI)(41g，0.21mol)。将反应混合物在0℃搅拌0.5小时，然后在0℃加入21a-3(24g，0.20mol)并且搅拌16小时。然后TLC(石油醚/乙酸乙酯：3/1)显示反应完全。此时在剧烈搅拌下将反应混合物缓慢倒入水(500mL)中。将混合物用二氯甲烷萃取(2×200mL)。将合并的有机层用盐水洗涤(2×100mL)，经Na₂SO₄干燥，过滤并且浓缩，得到粗产物。色谱(石油醚/乙酸乙酯，100:1至10:1)，得到21(38g)，为黄色油状物。

实施例12-(2-氧代-2-(吡啶-2-基氨基)乙基)膦酸二乙酯的合成

向22-1(1g，10.6mmol)、Et₃N(1.075g，10.6mmol)在干燥二氯甲烷(50mL)中的溶液中滴加氯乙酰氯(1.2g，10.6mmol)。将反应混合物在室温搅拌3小时，倒入冰水中，并且用乙酸乙酯萃取。将有机层用盐水洗涤并且经Na₂SO₄干燥，过滤并且真空浓缩。通过反相-combiflash纯化残留物，获得22-2。

将22-2(170mg，1.00mmol)和亚磷酸三乙酯(332mg，2.00mmol)的混合物在140℃搅拌6小时。将反应混合物冷却至室温并且通过快速色谱纯化，获得22。

实施例13-化合物23的制备

在室温、向14(430mg，0.38mmol)、(DHQ)₂PHAL(18.6mg，0.024mmol)、于叔丁醇中的四氧化锇(0.156mL，0.012mmol)(2.5wt%，0.079mmol/mL)和甲磺酰胺(74mg，0.77mmol)在20mL叔丁醇中的搅拌溶液中加入铁氰化钾(382mg，1.16mmol)和碳酸钾(160mg，1.16mmol)在20mL水中的溶液，形成棕色乳液。2小时后，加入亚硫酸钠溶液并且继续搅拌20分钟。将所得混合物用乙酸乙酯萃取(3×50mL)。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并且在减压下浓缩，通过反相快速色谱纯化，获得23-2，为白色固体。

向23-2(240mg，0.21mmol)在24mL的THF与水的2:1混合物中的搅拌溶液中加入高碘酸钠(91mg，0.42mmol)。将所得混合物在室温搅拌3小时，然后加入饱和碳酸氢钠水溶液。将该混合物用三份乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用一份水和两份饱和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并且在减压下浓缩。通过反相快速色谱纯化残留物，获得23-3。

在0℃、在搅拌下向(2-(甲氧基(甲基)氨基)-2-氧代乙基)膦酸二乙酯(91mg，0.368mmol)在THF(5.0mL)中的溶液中加入在无水THF(0.2mL)中的NaH(2.8mg，0.1104mmol)。然后将溶液在20℃搅拌直至其变得澄清。然后将23-3(70mg，0.092mmol)加至澄清溶液中并且将混合物在20℃搅拌2小时。将混合物用水(10mL)猝灭并且用乙酸乙酯萃取(3×30mL)。将有机层用盐水洗涤并且经Na₂SO₄干燥，过滤并且真空浓缩。通过制备型HPLC纯化残留物，获得23，为白色固体。

实施例14-化合物24的制备

在0℃、在搅拌下向21(42mg，0.168mmol)在THF(2.0mL)中的溶液中加入在无水THF(0.2mL)中的NaH(1.2mg，0.05mmol)。然后将溶液在20℃搅拌直至其变得澄清。然后将23-3(30mg，0.042mmol)加至澄清溶液中，并且将混合物在20℃搅拌2小时。将混合物用水(10mL)猝灭，并且用乙酸乙酯萃取(3×20mL)。将有机层用盐水洗涤，并且经Na₂SO₄干燥，过滤并且真空浓缩。通过制备型HPLC纯化残留物，获得24，为白色固体。

实施例15-化合物25的制备

在0℃、在搅拌下向22(48mg，0.168mmol)在THF(2.0mL)中的溶液中加入NaH(1.2mg，0.05mmol)的无水THF(0.2mL)溶液。然后将溶液在20℃搅拌直至其变得澄清。然后将23-3(30mg，0.042mmol)加至澄清溶液中，并且将混合物在20℃搅拌2小时。将混合物用水(10mL)猝灭，并且用乙酸乙酯萃取(3×20mL)。将有机层用盐水洗涤，并且经Na₂SO₄干燥，过滤并且真空浓缩。通过制备型HPLC纯化残留物，获得25，为白色固体。

实施例16-化合物26的制备

向溶解于二

烷(1mL)中的23(13mg，0.015mmol)溶液中加入HCl水溶液(2M，0.080mL，0.16mmol)。将反应在20℃搅拌24小时，并且将反应用水猝灭，并且用乙酸乙酯萃取(3×10mL)。将有机相经硫酸钠干燥并且蒸发。通过制备型HPLC纯化残留物，获得26，为白色固体。

实施例17-化合物27的制备

在室温、向17(99mg，0.09mmol)、(DHQ)₂PHAL(4.2mg，0.0054mmol)、于叔丁醇中的四氧化锇(0.034mL，0.0027mmol)(2.5wt%，0.079mmol/mL)和甲磺酰胺(18mg，0.18mmol)在5mL叔丁醇中的搅拌溶液中加入铁氰化钾(90mg，0.27mmol)和碳酸钾(37mg，0.27mmol)在5mL水中的溶液，得到棕色乳液。2小时后，加入亚硫酸钠溶液并且继续搅拌20分钟。将所得混合物用乙酸乙酯萃取(3×20mL)。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并且在减压下浓缩，通过反相快速色谱纯化，获得27-2，为白色固体。

向27-2(40mg，0.035mmol)在3mL的THF与水的2:1混合物中的搅拌溶液中加入高碘酸钠(15mg，0.07mmol)。将所得混合物在室温搅拌3小时，然后加入饱和碳酸氢钠水溶液。将该混合物用三份乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用一份水和两份饱和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并且在减压下浓缩。通过反相快速色谱纯化残留物，获得27-3，为白色固体。

在0℃、在搅拌下向21(28mg，0.104mmol)在THF(2.0mL)中的溶液中加入在无水THF(0.2mL)中的NaH(0.75mg，0.0312mmol)。然后将溶液在20℃搅拌直至其变得澄清。然后将27-3(19.6mg，0.026mmol)加至澄清溶液中，并且将混合物在20℃搅拌2小时。将混合物用水(10mL)猝灭，并且用乙酸乙酯萃取(3×10mL)。将有机层用盐水洗涤，并且经Na₂SO₄干燥，过滤，并且在减压下浓缩。通过制备型HPLC纯化残留物，获得27，为白色固体。

实施例18-化合物28的制备

在室温、向15(349mg，0.31mmol)、(DHQ)₂PHAL(14mg，0.0186mmol)、于叔丁醇中的四氧化锇(0.117mL，0.0093mmol)(2.5wt%，0.079mmol/mL)和甲磺酰胺(59mg，0.62mmol)在15mL叔丁醇中的搅拌溶液中加入铁氰化钾(128mg，0.93mmol)和碳酸钾(306mg，0.93mmol)在15mL水中的溶液，得到棕色乳液。2小时后，加入亚硫酸钠溶液，并且继续搅拌20分钟。将所得混合物用乙酸乙酯萃取(3×50mL)。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并且在减压下浓缩，通过反相快速色谱纯化，获得28-2，为白色固体。

向28-2(170mg，0.1466mmol)在15mL的THF与水的2:1混合物中的搅拌溶液中加入高碘酸钠(62mg，0.2931mmol)。将所得混合物在室温搅拌3小时，然后加入饱和碳酸氢钠水溶液。将该混合物用三份乙酸乙酯萃取。将合并的有机层用一份水和两份饱和盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，过滤，并且在减压下浓缩。通过反相快速色谱纯化残留物，获得28-3，为白色固体。

在0℃、在搅拌下向21(41mg，0.155mmol)在THF(1.0mL)中的溶液中加入在无水THF(0.2mL)中的NaH(2.3mg，0.0575mmol)。然后将溶液在20℃搅拌直至其变得澄清。然后将28-3(30mg，0.0387mmol)加至澄清溶液中，并且将混合物在20℃搅拌2小时。将混合物用水(10mL)猝灭，并且用乙酸乙酯萃取(3×20mL)。将有机层用盐水洗涤，并且经Na₂SO₄干燥，过滤，蒸发。通过制备型HPLC纯化残留物，获得28，为白色固体。

实施例19-化合物29的制备

在0℃、在搅拌下向22(42mg，0.155mmol)在THF(1.0mL)中的溶液中加入在无水THF(0.2mL)中的NaH(2.3mg，0.0575mmol)。然后将溶液在20℃搅拌直至其变得澄清。然后将28-3(30mg，0.0387mmol)加至澄清溶液中，并且将混合物在20℃搅拌2小时。将混合物用水(10mL)猝灭，并且用乙酸乙酯萃取(3×20mL)。将有机层用盐水洗涤，并且经Na₂SO₄干燥，过滤，蒸发。通过制备型HPLC纯化残留物，获得29，为白色固体。

实施例20-化合物30的制备

在0℃、在搅拌下向(2-(甲氧基(甲基)氨基)-2-氧代乙基)膦酸二乙酯(37mg，0.155mmol)在THF(1.0mL)中的溶液中加入在无水THF(0.2mL)中的NaH(2.3mg，0.0575mmol)。然后将溶液在20℃搅拌直至其变得澄清。然后将28-3(30mg，0.0387mmol)加至澄清溶液中，并且将混合物在20℃搅拌2小时。将混合物用水(10mL)猝灭，并且用乙酸乙酯萃取(3×20mL)。将有机层用盐水洗涤，并且经Na₂SO₄干燥，过滤，蒸发。通过制备型HPLC纯化残留物，获得30，为白色固体。

实施例21-生物学数据-HCV复制子和分析

如通用方法中所述，使用Huh5.2细胞在基因型1b复制子测定中分析化合物。包括环孢菌素A、1；DEBIO-025、2；萨菲菌素A、5；和羟基大环、6作为比较。

可以看出，与CsA、Debio-025、SfA和羟基大环比较，本发明化合物23、24、25、26和27在Huh5.2复制子测定中均显著更有效(如由低EC₅₀所示)，对抗细胞系有显著更高的选择性(如由高选择性指数所示)。

实施例22-生物学数据-对抗HIV的活性

如通用方法中所述，使用HeLa细胞在HIV抗病毒测定中分析化合物。包括环孢菌素A、1；DEBIO-025、2和HIV抗病毒剂恩曲他滨和替诺福韦作为比较。

化合物	HeLa细胞EC₅₀(μM)
		环孢菌素A、1	5.3
DEBIO-025、2	1.5
		恩曲他滨	0.4
替诺福韦	1.05
		24	0.13

可以看出，在该测定中，本发明化合物24在抑制HIV感染方面比CsA、DEBIO-025、恩曲他滨和替诺福韦显著更有效。

实施例23-生物数据-小鼠体内口服和静脉内PK

为了评价化合物在体内环境中的药代动力学，将化合物以10或5mg/kg口服和以1mg/kg静脉内给药至CD1小鼠各组。如通用方法中所述，进行药代动力学分析。PK参数如下所示。

可以看出，与萨菲菌素A比较，化合物23和24具有降低的清除率以及增加的口服暴露(如由高口服AUC_最后所示)。

实施例24-生物学数据-CypA PPIase活性的抑制作用

为了评价CypA肽基脯氨酰基顺式-反式异构酶(PPIase)活性的直接抑制作用，使用在通用方法中所述的方法。包括环孢菌素A、1；DEBIO-025、2和萨菲菌素A、5作为对照。

化合物	CypA PPIase IC₅₀(nM)
		环孢菌素A、1	9.7
DEBIO-025、2	0.8
		萨菲菌素A、5	2.4
23	0.33
		24	0.31
25	1.15
		27	0.35

可以看出，本发明化合物23、24、25和27均抑制CypA PPIase活性比萨菲菌素A、DEBIO-025和环孢菌素A更有效。

实施例25-生物学数据-胆红素转运蛋白的抑制作用

为了评价胆红素转运蛋白的脱靶抑制作用(据信是用DEBIO-025观察到的剂量-限制性高胆红素血症的原因)的潜力，如通用方法中所述地进行转运蛋白抑制作用的体外分析。

可以看出，本发明化合物24显示的对结合和未结合的胆红素转运蛋白的抑制作用远远低于DEBIO-025和环孢菌素A。

实施例26-生物学数据-异生物质转运蛋白的抑制作用

为了评价经由抑制异生物质转运蛋白的药物药物相互作用(DDI)的潜力，如通用方法中所述地进行P-糖蛋白(Pgp/MDR1)和胆汁盐输出泵(BSEP)抑制作用的体外分析。

化合物	Pgp IC₅₀(μM)	BSEP IC₅₀(μM)
			环孢菌素A、1	0.73	0.46
DEBIO-025、2	0.72	0.18
			24	>50	12.3

可以看出，本发明化合物24显示对异生物质转运蛋白(可能与药物药物相互作用有关)的抑制作用远远低于DEBIO-025和环孢菌素A。

参考文献

Appel, N., T. Schaller等人，(2006). “From structure to function: newinsights into hepatitis C virus RNA replication.” J Biol Chem 281(15):9833-6.

Banteli, R., J. Wagner等人，(2001). “Synthesis of derivatives of thenovel cyclophilin-binding immunosuppressant sanglifehrin A with reducednumbers of polar functions.” Bioorg Med Chem Lett 11(12): 1609-12.

Chatterji, U., M. Bobardt等人，(2009). “The isomerase active site ofcyclophilin a is critical for HCV replication.” J Biol Chem.

Colgan, J., M. Asmal等人，(2000). “Isolation, characterization andtargeted disruption of mouse ppia: cyclophilin A is not essential formammalian cell viability.” Genomics 68(2): 167-78.

Crabbe, R., G. Vuagniaux等人，(2009). “An evaluation of thecyclophilin inhibitor Debio 025 and its potential as a treatment for chronichepatitis C.” Expert Opin Investig Drugs 18(2): 211-20.

Dolinski, K., S. Muir等人，(1997). “All cyclophilins and FK506binding proteins are, individually and collectively, dispensable for viabilityin Saccharomyces cerevisiae.” Proc Natl Acad Sci U S A 94(24): 13093-8.

E. Lawitz, R. R., T. Nguyen, M. Huang, J. Ke, J. Praestgaard, D.Serra, M. Koziel, T. Evans (2009). “Safety And Antiviral Efficacy Of 14Days Of The Cycophilin Inhibitor Nim811 In Combination With PegylatedInterferon .2a In Relapsed Genotype 1 Hcv Infected Patients.” Journal of Hepatology 50(S1): S379.

Egorin,M.J.,T.F.Lagattuta等人，(2002).“Pharmacokinetics,tissuedistribution,and metabolism of 17-(dimethylaminoethylamino)-17-demethoxygeldanamycin(NSC707545)in CD2F1mice and Fischer344rats.”Cancer Chemother Pharmacol 49(1):7-19.

Fehr,T.,J.Kallen等人，(1999).“Sanglifehrins A,B,C and D,novelcyclophilin-binding compounds isolated from Streptomyces sp.A92-308110.II.Structure elucidation,stereochemistry and physico-chemicalproperties.”J Antibiot(Tokyo)52(5):474-9.

Flisiak,R.,A.Horban等人，(2008).“The cyclophilin inhibitorDebio-025shows potent anti-hepatitis C effect in patients coinfected withhepatitis C and human immunodeficiency virus.”Hepatology 47(3):817-26.

Furniss,B.S.,Furniss,A.I.,Vogel,A.I.,Ed.(1989).Vogel′s Textbook of Practical Organic Chemistry,Prentice Hall.

Gaither,L.A.,Borawski,J.,Anderson,L.J.,Balabanis,K.A.等人，(2010).“Multiple cyclophilins involved in different cellular pathwaysmediate HCV replication”Virology 397:43-55

Glavinas,H.,Krajcsi,P.,Cserepes,J.,Sarkadi,B.(2004).“The role ofABC transporters in drug resistance,metabolism and toxicity.”Curr. Drug.Deliv.1(1):27-42.

Gomez,L.,H.Thibault等人，(2007).“Inhibition of mitochondrialpermeability transition improves functional recovery and reducesmortality following acute myocardial infarction in mice.”Am J Physiol Heart Circ Physiol 293(3):H1654-61.

Goto,K.,Watashi,K.,Inoue,D.,Hijikata,M.,Shimotohno,K.(2009)“Identification of cellular and viral factors related to anti-hepatitis C virusactivity of cyclophilin inhibitor”Cancer Science 100(10):1943-1950

Hanoulle,X.,Badillo A,Wieruszeski JM,Verdegem D,Landrieu I,Bartenschlager R,Penin F,Lippens G(2009).“Hepatitis C virus NS5Aprotein is a substrate for the Peptidyl-Prolyl cis/trans isomerase activity ofCyclophilins A and B.”J Biol Chem.

Hartel,C.,P.Iblher等人，(2006).“Immunosuppressive activity of theimmunophilin-binding drug Sanglifehrin A in human whole blood:potentinhibition of interleukin-6produced by lymphocytes and monocytes.”Scand J Immunol 63(1):26-34.

Herrler,M.,H.Bang等人，(1994).“Cloning and characterization ofppiB,a Bacillus subtilis gene which encodes a cyclosporin A-sensitivepeptidyl-prolyl cis-trans isomerase.”Mol Microbiol 11(6):1073-83.

Hite,M.,Turner,S.,Federici,C.(2003).“Part1:Oral delivery ofpoorly soluble drugs”.Pharmaceutical Manufacturing and Packing Sourcer.Summer 2003 issue.

Immecke,S.N.,Baal.,N等人，(2011).“The Cyclophilin-Binding AgentSanglifehrin A Is a Dendritic Cell Chemokine and Migration Inhibitor.”PLOS one 6(3):e18406

Inoue,K.,K.Sekiyama等人，(2003).“Combined interferon alpha2band cyclosporin A in the treatment of chronic hepatitis C:controlled trial.”J Gastroenterol 38(6):567-72.

Inoue,K.,T.Umehara等人，(2007).“Evaluation of a cyclophilininhibitor in hepatitis C virus-infected chimeric mice in vivo.”Hepatology45(4):921-8.

Ishii,N.,K.Watashi等人，(2006).“Diverse effects of cyclosporine onhepatitis C virus strain replication.”J Virol 80(9):4510-20.

Ke J.,E.L.,R.Rozier,T.Marbury,N.Nguyen,D.Serra,K.Dole,J.Praestgaard,M.Huang,T.Evans(2009).“Safety,And Tolerability OfNim811,A Novel Cyclophilin Inhibitor For Hcv,Following Single AndMultiple Ascending Doses In Healthy Volunteers And Hcv-InfectedPatients.”Journal of Hepatology 50(S1):S229.

Jacobson,I.,McHutchison,JG,Sulkowski,M.(2007).Gastroenterol &Hepatol 3(S34):1-10.

Kallen,J.,R.Sedrani等人，(2005).“Structure of human cyclophilin Ain complex with the novel immunosuppressant sanglifehrin A at1.6Aresolution.”J Biol Chem 280(23):21965-71.

Kawasaki,H.,E.S.Mocarski等人，(2007).“Cyclosporine inhibitsmouse cytomegalovirus infection via a cyclophilin-dependent pathwayspecifically in neural stem/progenitor cells.”J Virol 81(17):9013-23.

Konig,J.H.,Glaeser,M.Keiser,K.Mandery,U.Klotz和M.F.Fromm(2010),Drug Metab Dispos,39,1097-1102.

Manns,M.P.,G.R.Foster等人，(2007).“The way forward in HCVtreatment--finding the right path.”Nat Rev Drug Discov 6(12):991-1000.

Martin Cabrejas,L.M.,S.Rohrbach等人，(1999).“MacrolideAnalogues of the Novel Immunosuppressant Sanglifehrin:New Applicationof the Ring-Closing Metathesis Reaction.”Angew Chem Int Ed Engl 38(16):2443-2446.

Mathy,J.E.,S.Ma等人，(2008).“Combinations of cyclophilininhibitor NIM811 with hepatitis C Virus NS3-4A Protease or NS5Bpolymerase inhibitors enhance antiviral activity and suppress theemergence of resistance.”Antimicrob Agents Chemother52(9):3267-75.

Melnikova,I.(2008).“Hepatitis C therapies.”Nature Rev Drug Disc 7:799-800.

Metternich,R.,Denni,D.,Thai,B,Sedrani,R.(1999).“Toward aTotal Synthesis of the Immunosuppressant Sanglifehrin A.Preparation ofTwo Relay Compounds by Degradation and Their Use in the Reassemblyof the Natural Product.”J.Org.Chem.64:9632-9639.

Millay,D.P.,M.A.Sargent等人，(2008).“Genetic and pharmacologicinhibition of mitochondrial-dependent necrosis attenuates musculardystrophy.”Nat Med 14(4):442-7.

Nelson,D.R.,Ghalib,R.H.,SuLkowski, M., Schiff, E., Rustgi, V.,Pockros,P.J.,Wang,C.,Decosterd Kerhuel,D.和P.Grosgurin,Porchet,H.,Crabbe,R.(2009).“Efficacy And Safety Of The Cyclophilin InhibitorDebio 025 In Combination With Pegylated Interferon Alpha-2a AndRibavirin In Previously Null-Responder Genotype 1 Hcv Patients.”Journal of Hepatology 50(S1):S40.

Niwa,T.,Yamamoto,S,Saito,M,Shiraga,T,Takagi,A.(2007).“Effect of Cyclosporine and Tacrolimus on Cytochrome P450 Activities inHuman Liver Microsomes.”Yakugaku Zasshi 127(1): 209--216.

Paeshuyse,J.,A.KauL等人，(2006).“The non-immunosuppressivecyclosporin DEBIO-025is a potent inhibitor of hepatitis C virus replicationin vitro.”Hepatology 43(4):761-70.

Parfieniuk,A.,J.Jaroszewicz等人，(2007).“Specifically targetedantiviral therapy for hepatitis C virus.”World J Gastroenterol 13(43):5673-81.

Pawlotsky,J.M.(2000).“Hepatitis C virus resistance to antiviraltherapy.”Hepatology 32(5):889-96.

Pawlotsky,J.M.(2005).“Current and future concepts in hepatitis Ctherapy.”Semin Liver Dis 25(1):72-83.

Pawlotsky,J.M.(2006).“Virology of hepatitis B and C viruses andantiviral targets.”J Hepatol 44(1Suppl):S10-3.

Pemberton,T.J.和J.E.Kay(2003).“Cyclophilin sensitivity tosanglifehrin A can be correlated to the same specific tryptophan residue ascyclosporin A.”FEBS Lett 555(2):335-40.

Pockros,P.(2008).“Emerging Therapies for Chronic Hepatitis CVirus.”Gastroenterol and Hepatology 4(10):729-734.

Ptak,R.G.,P.A.Gallay等人，(2008).“Inhibition of humanimmunodeficiency virus type1replication in human cells by Debio-025,anovel cyclophilin binding agent.”Antimicrob Agents Chemother 52(4):1302-17.

Qu,X.,Jiang,N.等人，(2011).“Cloning,sequencing andcharacterization of the biosynthetic gene cluster of sanglifehrin A,a potentcyclophilin inhibitor.”Mol.Biosyst.7:852-861

Robida,J.M.,H.B.Nelson等人，(2007).“Characterization ofhepatitis C virus subgenomic replicon resistance to cyclosporine in vitro.”J Virol 81(11):5829-40.

Hopkins,S.D.H.,E.Gavis,J.Lalezari,E.Glutzer,B.DiMassimo,P.Rusnak,S.Wring,C.Smitley,Y.和Ribeill(2009).“Safety,plasmapharmacokinetics,and anti-viral activity of SCY-635in adult patients withchronic hepatitis C virus infection.”Journal of Hepatology 50(S1):S36.

Sanglier,J.J.,V.Quesniaux等人，(1999).“Sanglifehrins A,B,C andD,novel cyclophilin-binding compounds isolated from Streptomyces sp.A92-308110.I.Taxonomy,fermentation,isolation and biological activity.”J Antibiot(Tokyo) 52(5):466-73.

Schneider,M.D.(2005).“Cyclophilin D:knocking on death’s door.”Sci STKE 2005(287):pe26.

Sedrani,R.,J.Kallen等人，(2003).“Sanglifehrin-cyclophilininteraction:degradation work,synthetic macrocyclic analogues,X-raycrystal structure,and binding data.”J Am Chem Soc 125(13):3849-59.

Seden,K.D.Back和S.Khoo(2010),J Antimicrob Chemother,65,1079-1085.

Smith,M.B.a.M.,J.,Ed.(2001).March’s advanced organic chemistry,John Wiley and Sons Inc.,UK.

Steinschulte,C.,T.Taner等人，(2003).“Cutting edge:sanglifehrin A,a novel cyclophilin-binding immunosuppressant blocks bioactive IL-12production by human dendritic cells.”J Immunol 171(2):542-6.

Strader,D.B.,T.Wright等人，(2004).“Diagnosis,management,andtreatment of hepatitis C.”Hepatology 39(4):1147-71.

Tropschug,M.,I.B.Barthelmess等人，(1989).“Sensitivity tocyclosporin A is mediated by cyclophilin in Neurospora crassa andSaccharomyces cerevisiae.”Nature 342(6252):953-5.

Vrolijk,J.M.,A.Kaul等人，(2003).“A replicon-based bioassay forthe measurement of interferons in patients with chronic hepatitis C.”J Virol Methods110(2):201-9.

Wring,S.,C.Wille,C.Rewerts,R.Randolph,A.Scribner和S.Hopkins(2010),Journal of Hepatology,52,S263.

Yang,F.,J.M.Robotham等人，(2008).“Cyclophilin A is an essentialcofactor for hepatitis C virus infection and the principal mediator ofcyclosporine resistance in vitro.”J Virol 82(11):5269-78.

Zenke,G.,U.Strittmatter等人，(2001).“Sanglifehrin A,a novelcyclophilin-binding compound showing immunosuppressive activity with anew mechanism of action.”J Immunol 166(12):7165-71.

Zeuzem,S.和E.Herrmann(2002).“Dynamics of hepatitis C virusinfection.”Ann Hepatol 1(2):56-63.

Zhang,L.H.和J.O.Liu(2001).“Sanglifehrin A,a novelcyclophilin-binding immunosuppressant,inhibits IL-2-dependent T cellproliferation at the G1phase of the cell cycle.”J Immunol 166(9):5611-8.

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