ES2533437T3 - Compuesto macrocíclico y métodos para su producción - Google Patents

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Abstract

Compuesto de fórmula (I):**Fórmula** incluyendo cualquier tautómero del mismo; o un isómero del mismo en el que el enlace C>=C en C26, 27 mostrado como trans es cis; e incluyendo un aducto de metanol del mismo en el que se forma un cetal mediante la combinación del grupo ceto en C-53 (si está presente) y el grupo hidroxilo en C-15 y metanol; o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN
Compuesto macrocíclico y métodos para su producción
Introducción
La presente invención se refiere a un análogo de sangliferina, que es útil tanto como inhibidor de ciclofilina, por ejemplo en el tratamiento de una infección viral producida por virus tales como el virus de la hepatitis C (VHC), el virus de la hepatitis B (VHB) y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y/o como inmunosupresor por ejemplo para su uso en la profilaxis de rechazo de trasplantes, y como agente antiinflamatorio, por ejemplo para su uso en trastornos inflamatorios. La presente invención también proporciona el compuesto para su uso en métodos en medicina, en particular para el tratamiento de una infección por VHC o VIH y para su uso como agente inmunosupresor o antiinflamatorio, en enfermedades en las que es útil la inhibición del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP) tal como distrofia muscular o como producto intermedio en la generación de otros compuestos útiles en medicina.
Antecedentes de la invención
Hepatitis C
El virus de la hepatitis C (VHC) es un virus ARN de cadena positiva, y su infección es la principal causa de hepatitis tras una transfusión. El VHC es la infección crónica portada por la sangre más común y es la principal causa de muerte por enfermedad hepática en los Estados Unidos. La Organización Mundial de la Salud estima que hay más de 170 millones de portadores crónicos de infección por VHC, lo que constituye aproximadamente el 3% de la población mundial. Entre los pacientes infectados por VHC no tratados, aproximadamente el 70%-85% desarrollan infección crónica por VHC, y por tanto están en alto riesgo de desarrollar cirrosis hepática y carcinoma hepatocelular. En los países desarrollados, el 50-76% de todos los casos de cáncer hepático y dos tercios de los trasplantes de hígado se deben a infección crónica por VHC (Manns et al, 2007).
Además de las enfermedades hepáticas, los pacientes infectados de manera crónica también pueden desarrollar otras enfermedades crónicas relacionadas con el VHC, y sirven como fuente de transmisión a otros. La infección por VHC produce complicaciones no hepáticas tales como artralgias (dolor articular), exantema cutáneo y daño a órganos internos, principalmente al riñón. La infección por VHC representa una importante carga para la atención sanitaria global, y actualmente no hay ninguna vacuna disponible para la hepatitis C (Strader et al., 2004; Jacobson et al. 2007; Manns et al., 2007; Pawlotsky, 2005; Zeuzem & Hermann, 2002).
Tratamiento del VHC
El tratamiento de referencia (standard of care, SoC) actual son inyecciones subcutáneas de interferón-α pegilado (pIFNα) y dosificación oral del fármaco antiviral ribavirina durante un periodo de 24-48 semanas. El éxito en el tratamiento se define por una respuesta virológica sostenida (SVR), que se define por la ausencia de ARN de VHC en el suero al final del periodo de tratamiento y 6 meses después. Las tasas de respuesta global a SoC dependen principalmente del genotipo y los niveles de ARN de VHC antes del tratamiento. Es más probable que los pacientes con genotipo 2 y 3 respondan a SoC que los pacientes infectados con el genotipo 1 (Melnikova, 2008; Jacobson et al., 2007).
Un número significativo de pacientes con VHC no responden adecuadamente al tratamiento SoC, o no pueden tolerar la terapia debido a efectos secundarios, lo que conduce a problemas frecuentes relacionados con la finalización del ciclo completo. La tasa de SVR clínica global de SoC es sólo de aproximadamente el 50% (Melnikova, 2008). El desarrollo de resistencia es otro factor subyacente para el fracaso del tratamiento (Jacobson et al. 2007). El SoC también está contraindicado en algunos pacientes que no se consideran candidatos para el tratamiento, tales como pacientes con episodios significativos pasados de depresión o enfermedad cardiaca. Los efectos secundarios del SoC, que conducen frecuentemente a interrupción del tratamiento, incluyen enfermedad seudogripal, fiebre, fatiga, enfermedad hematológicas, anemia, leucopenia, trombocitopenia, alopecia y depresión (Manns et al., 2007).
Considerando los efectos secundarios asociados con los prolongados tratamientos usando SoC, el desarrollo de resistencia y la tasa global de éxito por debajo del nivel óptimo, se necesitan urgentemente nuevos tratamientos más eficaces y más seguros para el tratamiento de la infección por VHC. Los objetivos de los nuevos tratamientos incluyen potencia mejorada, perfil de toxicidad mejorado, perfil de resistencia mejorado, calidad de vida mejorada y la mejora resultante en el cumplimiento de los pacientes. El VHC tiene un ciclo de vida corto y por tanto es común el desarrollo de resistencia a fármacos durante la terapia farmacológica.
Se está desarrollando una terapia antiviral dirigida específicamente para la hepatitis C (STAT-C) novedosa, también conocida como fármacos antivirales de acción directa (DAA) que selecciona como diana proteínas virales tales como la ARN polimerasa viral NS5B o la proteasa viral NS3 (Jacobson et al, 2007; Parfieniuk et al., 2007). Además, también se están desarrollando compuestos novedosos que seleccionan como diana proteínas humanas (por ejemplo ciclofilinas) en lugar de dianas virales, lo que podría esperarse que conduciría a una reducción en la incidencia de resistencia durante la terapia farmacológica (Manns et al., 2007; Pockros, 2008; Pawlotsky J-M, 2005).
5 Inhibidores de ciclofilina
Las ciclofilinas (CyP) son una familia de proteínas celulares que desempeñan una actividad peptidil-prolil cis-trans isomerasa que facilita los cambios conformacionales y el plegamiento de la proteína. Las CyP están implicadas en procesos celulares tales como regulación de la transcripción, respuesta inmunitaria, secreción de proteínas y función 10 mitocondrial. El virus VHC recluta CyP para su ciclo de vida durante la infección de seres humanos. Originalmente, se pensó que las CyP estimulan la actividad de unión al ARN de la proteína no estructural del VHC ARN polimerasa NS5B que promueve la replicación del ARN, aunque se han propuesto varias hipótesis alternativas incluyendo una necesidad de la actividad PPIasa de CyP. Se cree que diversas isoformas de CyP, incluyendo A y B, están implicadas en el ciclo de vida del VHC (Yang et al., 2008; Appel et al., 2006; Chatterji et al., 2009; Gaither et al., 15 2010). La capacidad para generar desactivaciones en células T de ratones (Colgan et al., 2000) y seres humanos (Braaten y Luban, 2001) indica que CyPA es opcional para el crecimiento y la supervivencia celulares. Se han observado resultados similares con la alteración de homólogos de CyPA en bacterias (Herrler et al., 1994), Neurospora (Tropschug et al., 1989) y Saccharomyces cerevisiae (Dolinski et al. 1997). Por tanto, la inhibición de CyP representa un objetivo en el huésped novedoso y atractivo para tratar la infección por VHC, y una posible nueva
20 adición a SoC o STAT-C/fármacos DAA, con el objetivo de aumentar la SVR, prevenir la aparición de resistencia y disminuir los efectos secundarios del tratamiento.
imagen1
Ciclosporina A, 1 DEBIO-025, 2
imagen2
Se sabe que la ciclosporina A (Inoue et al. 2003) (“CsA”) y sus análogos clínicos no inmunosupresores
30 estructuralmente relacionados de manera estrecha DEBIO-025 (Paeshuyse et al. 2006; Flisiak et al. 2008), NIM811 (Mathy et al. 2008) y SCY-635 (Hopkins et al., 2009) se unen a las ciclofilinas, y como inhibidores de ciclofilina han mostrado eficacia in vitro y clínica en el tratamiento de la infección por VHC (Crabbe et al., 2009; Flisiak et al. 2008; Mathy et al. 2008; Inoue et al., 2007; Ishii et al., 2006; Paeshuyse et al., 2006). Aunque estudios de resistencia anteriores en CsA mostraron mutaciones en la ARN polimerasa NS5B de VHC y sugirieron que sólo la ciclofilina B
35 estaría implicada en el proceso de replicación del VHC (Robida et al., 2007), estudios recientes han sugerido un papel esencial para la ciclofilina A en la replicación del VHC (Chatterji et al. 2009; Yang et al., 2008). Considerando que las mutaciones en la proteína viral NS5A también están asociadas con la resistencia a CsA y que NS5A interacciona tanto con CyPA como con CypB para su actividad peptidil-prolil cis/trans isomerasa (PPIasa) específica, se sugiere adicionalmente un papel para ambas ciclofilinas en el ciclo de vida viral (Hanoulle et al., 2009).
El efecto anti-VHC de los análogos de ciclosporina es independiente de la propiedad inmunosupresora, que es dependiente de calcineurina. Esto indicó que la necesidad esencial para la actividad de VHC es la unión de CyP y que no es necesaria la unión de calcineurina. DEBIO-025, el inhibidor de ciclofilina clínicamente más avanzado para el tratamiento del VHC, ha mostrado potencia in vitro e in vivo contra los cuatro genotipos más prevalentes de VHC (genotipos 1, 2, 3 y 4). Estudios de resistencia mostraron que las mutaciones que conferían resistencia a DEBIO-025 eran diferentes de las notificadas para inhibidores de polimerasa y proteasa, y que no había resistencia cruzada con replicones virales resistentes a STAT-C/DAA. Y lo que es más importante, DEBIO-025 también prevenía el desarrollo de mutaciones de escape que confieren resistencia a inhibidores tanto de proteasa como de polimerasa (Crabbe et al., 2009).
Sin embargo, los inhibidores de ciclofilina basados en CsA en desarrollo clínico presentan varios problemas, que se cree que están relacionados con su clase estructural compartida, incluyendo: determinados acontecimientos adversos que pueden conducir a una retirada de la terapia y han limitado los niveles de dosis clínicos; farmacocinética variable que puede conducir a eficacia variable; y un aumento del riesgo de interacciones fármacofármaco que pueden conducir a problemas de dosificación.
Los acontecimientos adversos (AA) que se produjeron con más frecuencia en pacientes que recibieron DEBIO-025 incluyeron ictericia, dolor abdominal, vómitos, fatiga y pirexia. Los AA más importantes clínicamente fueron hiperbilirrubinemia y reducción en el recuento de plaquetas (trombocitopenia). Peg-IFN puede producir trombocitopenia profunda y la combinación con DEBIO-025 podría representar un problema clínico significativo. También se ha descrito tanto un aumento en la bilirrubina como una disminución en las plaquetas en estudios clínicos anteriores con NIM-811 (Ke et al., 2009). Aunque la hiperbilirrubinemia observada durante los estudios clínicos con DEBIO-025 se revirtió tras el cese del tratamiento, fue la causa de abandono del tratamiento en 4 de 16 pacientes, y una reducción en los niveles de dosis para ensayos futuros. Puesto que el efecto anti-viral de los inhibidores de ciclofilina en VHC está relacionado con la dosis, una reducción en la dosis ha conducido a una reducción en el efecto anti-viral, y varios ensayos posteriores con inhibidores de ciclofilina basados en CsA han mostrado ausencia de reducciones o reducciones escasas en la carga viral de VHC cuando se administra como monoterapia (Lawitz et al., 2009; Hopkins et al., 2009; Nelson et al., 2009). Se sabe que DEBIO-025 y ciclosporina A son inhibidores de transportadores biliares tales como bombas de exportación de sales biliares y otros transportadores hepáticos (especialmente OAT1B1/OAT1B3/MRP2/MRP3/cMOAT/ABCC2) (Crabbe et al., 2009). Se ha sugerido que la interacción con transportadores biliares, en particular MRP2, puede ser la causa de la hiperbilirrubinemia observada a altos niveles de dosis de DEBIO-025 (Nelson et al., 2009, Wring et al., 2010). Las interacciones fármaco-fármaco (DDI) relacionadas con la clase de CsA a través de la inhibición de otros transportadores de fármacos tales como glicoproteína P (Pgp/MDR1), BSEP, OAT1B1 y OAT1B3 (Konig et al., 2010) también pueden constituir una preocupación, limitando potencialmente determinadas combinaciones y uso en algunos pacientes que se someten a tratamiento para coinfecciones tales como VIH (Seden et al., 2010).
Además, DEBIO-025 y ciclosporina A son sustratos para el metabolismo mediado por el citocromo P450 (especialmente CYP3A4), y se sabe que son sustratos e inhibidores de la glicoproteína P humana (MDR1) (Crabbe et al., 2009). También se ha mostrado que la ciclosporina A es un inhibidor de CYP3A4 in vitro (Niwa et al., 2007). Esto indica que podría haber un aumento del riesgo de interacciones fármaco-fármaco con otros fármacos que son sustratos, inductores o inhibidores de CYP3A4 tales como por ejemplo ketoconazol, cimetidina y rifampicina. Además, también se esperan interacciones con fármacos que se someten a transporte por la glicoproteína P (por ejemplo digoxina), lo que podría producir graves interacciones fármaco-fármaco en pacientes con VHC que reciben tratamientos médicos por otras enfermedades concomitantes (Crabbe et al. 2009). También se sabe que la CsA tiene farmacocinética altamente variable, mostrando las formulaciones iniciales biodisponibilidad oral del 1-89% (Kapurtzak et al., 2004). Sin una cara monitorización de los niveles en sangre de los pacientes, esto puede conducir a una prevalencia aumentada de efectos secundarios debido a niveles en plasma aumentados, o a una respuesta clínica reducida debido a niveles en plasma disminuidos.
Considerando que la inhibición de ciclofilinas representa un nuevo enfoque prometedor para el tratamiento del VHC, existe la necesidad de descubrir y desarrollar inhibidores de CyP más potentes y más seguros para su uso en terapia de combinación contra infección por VHC.
Sangliferinas
La sangliferina A (SfA) y sus congéneres naturales pertenecen a una clase de policétidos/péptidos no ribosómicos mixtos, producidos por Streptomyces sp. A92-308110 (también conocido como DSM 9954) (véase el documento WO 97/02285), que se descubrieron originalmente basándose en su alta afinidad por ciclofilina A (CyPA). SfA es el componente más abundante en caldos de fermentación y presenta una afinidad aproximadamente 20 veces superior para CyPA en comparación con CsA. Esto ha conducido a sugerir que las sangliferinas podrían ser útiles para el tratamiento del VHC (documento WO2006/138507). También se ha mostrado que las sangliferinas presentan una actividad inmunosupresora inferior que CsA cuando se someten a prueba in vitro (Sanglier et al., 1999; Fehr et al., 1999). SfA se une con alta afinidad al sitio de unión a CsA de CyPA (Kallen et al., 2005).
imagen3
Sangliferina A, 5 Hidroximacrociclo, 6
imagen4
Sangliferina B, 7 10 Biosíntesis de sangliferinas
Las sangliferinas se biosintetizan por una policétido sintasa (PKS)/péptido sintetasa no ribosómica (NRPS) mixta (véase el documento WO2010/034243). La estructura principal de macrólido de 22 miembros consiste en una
15 cadena carbonada de policétido y una cadena tripeptídica. La cadena peptídica consiste en un aminoácido natural, valina, y dos aminoácidos no naturales: (S)-meta-tirosina y (S)-ácido piperázico, unidos mediante un enlace amida. Se cree que la hidroxilación de fenilalanina (o bien in situ en la NRPS o bien antes de la biosíntesis) para generar (S)-meta-tirosina se produce a través del producto génico de sfaA.
20 Acción inmunosupresora de las sangliferinas
El mecanismo de acción inmunosupresor de SfA es diferente del de otros fármacos inmunosupresores de unión a inmunofilina conocidos tales como CsA, FK506 y rapamicina. SfA no inhibe la actividad fosfatasa de la calcineurina, la diana de CsA (Zenke et al. 2001), en cambio su actividad inmunosupresora se ha atribuido a la inhibición de la
25 interleucina-6 (Hartel et al., 2005), la interleucina-12 (Steinschulte et al., 2003) y la inhibición de la proliferación de células T dependiente de interleucina-2 (Zhang & Liu, 2001). Sin embargo, hasta ahora se desconocen la diana molecular y el mecanismo a través del cual SfA ejerce su efecto inmunosupresor.
La estructura molecular de SfA es compleja y se cree que su interacción con CyPA está mediada en gran medida
30 por la parte macrocíclica de la molécula. De hecho, un compuesto macrocíclico (hidroximacrociclo) derivado de la escisión oxidativa de SfA ha mostrado fuerte afinidad por CyPA (Sedrani et al., 2003). Los datos de estructura cristalina por rayos X han mostrado que el hidroximacrociclo se une al mismo sitio activo de CyPA que CsA. También se ha mostrado previamente que análogos basados en el resto macrociclo de SfA están desprovistos de propiedades inmunosupresoras (Sedrani et al., 2003), proporcionando la oportunidad para diseñar inhibidores de
35 CyP no inmunosupresores para su uso potencial en terapia contra VHC.
En oposición a esto, también existe la oportunidad de desarrollar agentes inmunosupresores con baja toxicidad para su uso en áreas tales como la profilaxis de rechazo de trasplantes, trastornos autoinmunitarios, inflamatorios y respiratorios, incluyendo pero sin limitarse a, enfermedad de Crohn, síndrome de Behcet, uveítis, psoriasis, 40 dermatitis atópica, artritis reumatoide, síndrome nefrítico, anemia aplásica, cirrosis biliar, asma, fibrosis pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y enfermedad celiaca. Se ha mostrado que las sangliferinas
tienen un mecanismo novedoso de actividad inmunosupresora (Zenke et al., 2001), actuando potencialmente a través de quimiocinas de células dendríticas (Immecke et al., 2011), y por tanto existe la oportunidad de desarrollar agentes con un mecanismo de acción diferente a los agentes clínicos actuales, tales como ciclosporina A, rapamicina y FK506. Se ha mostrado que la sangliferina A es 10 veces menos potente que la ciclosporina A, por lo que el agente novedoso ideal tendría potencia y/o ventana terapéutica mejoradas.
Otros usos terapéuticos de inhibidores de ciclofilina
Virus de la inmunodeficiencia humana (VIH)
Los inhibidores de ciclofilina, tales como CsA y DEBIO-025 también han mostrado utilidad potencial en la inhibición de la replicación del VIH. Se cree que los inhibidores de ciclofilina interfieren con la función de CyPA durante la progresión/finalización de la transcripción inversa del VIH (Ptak et al., 2008). Sin embargo, cuando se sometieron a prueba clínicamente, DEBIO-025 sólo redujo los niveles de ARN de VIH-1 ≥0,5 y >1 log10 copias/ml en nueve y dos pacientes respectivamente, mientras que 27 de los pacientes tratados no mostraron reducción en los niveles de ARN de VIH-1 (Steyn et al., 2006). Tras esto, se sometió a ensayo DEBIO-025 en pacientes coinfectados por VHC/VIH y mostró mejor eficacia contra VHC, y se interrumpieron los ensayos clínicos de VIH (véase Watashi et al., 2010).
Tratamiento del VIH
Más de 30 millones de personas están infectadas por VIH-1 en todo el mundo, con 3 millones de casos nuevos cada año. Las opciones de tratamiento han mejorado espectacularmente con la introducción de la terapia antirretroviral altamente activa (HAART) (Schopman et al., 2010). Hacia 2008, se habían autorizado casi 25 fármacos antirretrovirales para el tratamiento del VIH-1, incluyendo nueve inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa (NRTI), cuatro inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa (NNRTI), nueve inhibidores de proteasa (PI), un inhibidor de fusión, un inhibidor de CCR5 y un inhibidor de integrasa (Shafer y Schapiro, 2008). Sin embargo, ninguno de estos regímenes actuales conduce a aclaramiento viral completo, pueden conducir a efectos secundarios graves y la resistencia antiviral es todavía una preocupación importante. Por tanto, sigue habiendo la necesidad de nuevas terapias antivirales, especialmente en clases de mecanismos de acción en las que no hay fármacos aprobados, tal como es el caso para inhibidores de ciclofilina.
Virus de la hepatitis B
La hepatitis B es un virus ADN de la familia Hepadnaviridae, y es el agente causante de la hepatitis B. A diferencia de los casos con VHC y VIH, ha habido muy pocos informes publicados de la actividad de inhibidores de ciclofilina contra el virus de la hepatitis B. Ptak et al. 2008 han descrito una débil actividad de Debio-025 contra VHB (CI50 de 4,1 µM), mientras que Xie et al., 2007 describieron cierta actividad de CsA contra VHB (CI50 >1,3 µg/ml). Esto es en contraste con VIH y VHC, donde hay numerosos informes de actividad antiviral nanomolar de inhibidores de ciclofilina.
Tratamiento del VHB
El VHB infecta hasta 400 millones de personas en todo el mundo y es una causa principal de hepatitis viral crónica y carcinoma hepatocelular. En 2008, había seis fármacos autorizados para el tratamiento del VHB; interferón alfa e interferón alfa pegilado, tres análogos de nucleósido (lamivudina, entecavir y telbivudina) y un análogo de nucleótido (adefovir dipivoxil). Sin embargo, debido a las altas tasas de resistencia, a la escasa tolerancia y a los posibles efectos secundarios, se necesitan nuevas opciones terapéuticas (Ferir et al., 2008).
Inhibición del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP)
La apertura de los poros de transición de permeabilidad de alta conductancia en mitocondrias inicia el comienzo dela transición de permeabilidad mitocondrial (MPT). Éste es el acontecimiento causante, que conduce a necrosis y apoptosis en hepatocitos tras estrés oxidativo, toxicidad de Ca2+ e isquemia/reperfusión. Se ha mostrado que la inhibición de la ciclofilina D (también conocida como ciclofilina F) por inhibidores de ciclofilina bloquea la apertura de los poros de transición de permeabilidad y protege de la muerte celular tras este estrés. Los inhibidores de ciclofilina D pueden ser útiles por tanto en indicaciones en las que está implicada la apertura de mPTP, tal como distrofia muscular, en particular distrofia muscular congénita de Ullrich y miopatía de Bethlem (Millay et al., 2008, documento WO2008/084368, Palma et al., 2009), esclerosis múltiple (Forte et al., 2009), diabetes (Fujimoto et al., 2010), esclerosis lateral amiotrófica (Martin 2009), trastorno bipolar (Kubota et al., 2010), enfermedad de Alzheimer (Du y Yan, 2010), enfermedad de Huntington (Perry et al., 2010), recuperación tras infarto de miocardio (Gomez et al., 2007) y consumo de alcohol crónico (King et al., 2010).
Otros usos terapéuticos
Los inhibidores de ciclofilina tienen actividad potencial contra, y por tanto en el tratamiento de, infecciones de otros virus, tales como el virus de la varicela-zóster (Ptak et al., 2008), virus influenza A (Liu et al., 2009), coronavirus del síndrome respiratorio agudo grave y otros coronavirus humanos y felinos (Chen et al., 2005, Ptak et al., 2008), virus del dengue (Kaul et al., 2009), virus de la fiebre amarilla (Qing et al., 2009), virus del Nilo occidental (Qing et al., 2009), virus de la encefalitis equina occidental (Qing et al., 2009), citomegalovirus (Kawasaki et al., 2007) y virus vaccinia (Castro et al., 2003).
También hay informes de utilidad de inhibidores de ciclofilina e inhibición de ciclofilina en otras áreas terapéuticas, tal como en cáncer (Han et al., 2009).
Comentarios generales sobre las sangliferinas
Uno de los problemas en el desarrollo de fármacos de compuestos tales como sangliferinas es el rápido metabolismo y la glucuronidación, que conducen a baja biodisponibilidad oral. Esto puede conducir a una posibilidad aumentada de efecto de los alimentos, liberación incompleta más frecuente de la forma farmacéutica y variabilidad entre pacientes superior.
Por tanto sigue habiendo la necesidad de identificar inhibidores de ciclofilina novedosos, que pueden tener utilidad, particularmente en el tratamiento de infección por VHC, pero también en el tratamiento de otras áreas de enfermedad en las que puede ser útil la inhibición de ciclofilinas, tal como infección por VIH, distrofia muscular o ayuda en la recuperación tras infarto de miocardio o cuando es útil el efecto de inmunosupresión o antiinflamatorio. Preferiblemente, tales inhibidores de ciclofilina tienen propiedades mejoradas con respecto a los inhibidores de ciclofilina disponibles actualmente, incluyendo una o más de las propiedades siguientes: semivida más larga o biodisponibilidad oral aumentada, posiblemente a través de glucuronidación reducida y/o metabolismo por P450 reducido, solubilidad en agua mejorada, potencia mejorada contra VHC, toxicidad (incluyendo hepatotoxicidad) reducida, perfil farmacológico mejorado, tal como alta exposición al órgano diana (por ejemplo, el hígado en el caso de VHC) y/o semivida larga (que permite la dosificación menos frecuente), interacciones fármaco-fármaco reducidas, tal como a través de niveles reducidos de metabolismo por CYP3A4 e inhibición e inhibición reducida (Pgp) (que permite combinaciones de múltiples fármacos más fáciles) y perfil de efectos secundarios mejorado, tal como baja unión a MRP2, que conduce a una posibilidad reducida de hiperbilirrubinemia, efecto inmunosupresor inferior, actividad mejorada contra especies de virus resistentes, en particular especies de virus resistentes a CsA y análogos de CsA (por ejemplo DEBIO-025) y un índice terapéutico (y/o selectividad) superior. La presente invención da a conocer un análogo de sangliferina novedoso que puede tener una o más de las propiedades anteriores. En particular, la presente invención da a conocer un análogo de sangliferina mutasintético novedoso, que se prevé que tiene metabolismo reducido a través de P450 o glucuronidación, por ejemplo tal como se muestra mediante semivida de microsoma aumentada y/o potencia mejorada reducida contra VHC, por ejemplo tal como se muestra por una CE50 de replicón baja.
Además, también existe la necesidad de desarrollar un agente inmunosupresor novedoso, que puede tener utilidad en la profilaxis de rechazo de trasplantes, o en el tratamiento de trastornos autoinmunitarios, inflamatorios y respiratorios. Preferiblemente, un inmunosupresor de este tipo tendrá propiedades mejoradas con respecto a las sangliferinas naturales conocidas, incluyendo una o más de las propiedades siguientes: semivida más larga o biodisponibilidad oral aumentada, posiblemente a través de glucuronidación reducida y/o metabolismo por P450 reducido, solubilidad en agua mejorada, potencia mejorada en actividad inmunosupresora, tal como podría observarse en ensayos de proliferación de células T, toxicidad (incluyendo hepatotoxicidad) reducida, perfil farmacológico mejorado, tal como alta exposición al órgano diana y/o semivida larga (que permite la dosificación menos frecuente), interacciones fármaco-fármaco reducidas, tal como a través de niveles reducidos de metabolismo por CYP3A4 e inhibición e inhibición reducida (Pgp) (que permite combinaciones de múltiples fármacos más fáciles) y perfil de efectos secundarios mejorado. La presente invención da a conocer un análogo de sangliferina novedoso que puede tener una o más de las propiedades anteriores. En particular, la presente invención da a conocer un derivado novedoso, que tiene metabolismo reducido a través de P450 o glucuronidación, por ejemplo tal como se muestra mediante semivida de microsoma aumentada y/o potencia inmunosupresora mejorada, por ejemplo tal como se muestra por una CI50 de proliferación de células T baja.
Por tanto, tal como puede observarse a partir de los ejemplos, el compuesto de la invención tiene las siguientes propiedades terapéuticamente relevantes favorables:
-potencia antiviral mejorada contra VHC y VIH en comparación con los inhibidores de ciclofilina de la técnica anterior ciclosporina A, DEBIO-025 (alisporivir) y sangliferina A;
-aclaramiento reducido y exposición oral aumentada en comparación con el compuesto de la técnica anterior sangliferina A;
-inhibición más potente de la actividad PPIasa de CypA en comparación con los inhibidores de ciclofilina de la técnica anterior ciclosporina A, DEBIO-025 (alisporivir) y sangliferina A;
-perfil de efectos secundarios mejorado e interacciones fármaco-fármaco reducidas tal como se demuestra mediante la inhibición reducida de transportadores de bilirrubina (OATP-1B1, OATP-1B3, MRP2 y MRP3) e inhibición reducida de transportadores xenobióticos (Pgp y BSEP).
Sumario de la invención
5 La presente invención proporciona un análogo de sangliferina macrocíclico novedoso, que se ha generado mediante la modificación semisintética de sangliferinas mutasintéticas. Este análogo puede generarse mediante la dihidroxilación de una sangliferina mutasintética, tal como se describe en la fórmula IIA y la fórmula IIB, seguido por escisión para generar el macrociclo aldehídico, seguido por química adicional, incluyendo reacciones de tipo Horner-Emmons y otras reacciones de acoplamiento que implican un aldehído. Como resultado, la presente invención
10 proporciona un análogo de sangliferina macrocíclico, métodos para la preparación de este compuesto, y métodos para el uso de este compuesto en medicina o como producto intermedio en la producción de otros compuestos.
Por tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un análogo de sangliferina macrocíclico según la fórmula (I) a continuación, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo:
15
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Fórmula (I)
20 incluyendo cualquier tautómero del mismo; e incluyendo un aducto de metanol del mismo en el que se forma un cetal mediante la combinación del grupo ceto en C-53 y el grupo hidroxilo en C-15 y metanol.
La estructura anterior muestra un tautómero representativo y la invención abarca todos los tautómeros del compuesto de fórmula (I) por ejemplo un compuesto ceto en el que se ilustra un compuesto enol y viceversa.
25 Los tautómeros específicos que se incluyen dentro de la definición de la fórmula (I) son aquellos en los el que (i) el grupo ceto en C-53 forma un hemicetal con el hidroxilo en C-15, o (ii) el hidroxilo en C-15 y C-17 puede combinarse con el ceto en C-53 para formar un cetal. Todas las numeraciones usan el sistema para la estructura de sangliferina A original.
30 El compuesto de fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, puede estar presente opcionalmente en forma de un solvato farmacéuticamente aceptable, tal como un hidrato.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un análogo de sangliferina macrocíclico según la fórmula 35 (I) en forma cristalina sólida (forma I).
Definiciones
Los artículos “un” y “una” se usan en el presente documento para hacer referencia a uno o a más de uno (es decir al 40 menos uno) de los objetos gramaticales del artículo. A modo de ejemplo “un análogo” significa un análogo o más de un análogo.
Tal como se usa en el presente documento, el término “análogo(s)” se refiere a compuestos químicos que son estructuralmente similares a otro pero que difieren ligeramente en la composición (como en la sustitución de un 45 átomo por otro o en presencia o ausencia de un grupo funcional particular).
Tal como se usa en el presente documento, el término “sangliferina(s)” se refiere a compuestos químicos que son estructuralmente similares a sangliferina A pero que difieren ligeramente en la composición (como en la sustitución de un átomo por otro o en presencia o ausencia de un grupo funcional particular), en particular los generados por la fermentación de Streptomyces sp. A92-308110. Los ejemplos incluyen los compuestos similares a sangliferina comentados en los documentos WO97/02285 y WO98/07743, tal como sangliferina B.
Tal como se usa en el presente documento, el término “sangliferina(s) mutasintética(s)” o “análogo(s) de sangliferina mutasintético(s)” se refiere a compuestos químicos que son estructuralmente similares a sangliferina A, B, C o D pero que difieren ligeramente en la composición (como en la sustitución de uno o más átomos por otro o en presencia o ausencia de un grupo funcional particular), en particular, los generados por la fermentación de Streptomyces sp. A92-308110 o un mutante del mismo, cuando el cultivo se alimenta con un análogo de metatirosina.
Tal como se usa en el presente documento, el término “análogo(s) de meta-tirosina” se refiere a compuestos químicos que son estructuralmente similares a meta-tirosina pero que difieren ligeramente en la composición (como en la sustitución de uno o más átomos por otro o en presencia o ausencia de un grupo funcional particular), en particular, los descritos en la fórmula (III).
Tal como se usa en el presente documento, el término “análogo macrocíclico”, “análogo de sangliferina macrocíclico”
o “sangliferina macrocíclica”, se refiere a un compuesto mencionado antes como que representa la invención en su aspecto más amplio, por ejemplo un compuesto según la fórmula (I) anterior, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. Estos compuestos también se denominan “compuestos de la invención” o “derivados de sangliferina” o “análogos de sangliferina” y estos términos se usan de manera intercambiable en la presente solicitud.
Tal como se usa en el presente documento, el término “VHC” se refiere a virus de la hepatitis C, un virus con envuelta, ARN, monocatenario de la familia viral Flaviviridae.
Tal como se usa en el presente documento, el término “VIH” se refiere a virus de la inmunodeficiencia humana, el agente causante del síndrome de la inmunodeficiencia adquirida humana.
Tal como se usa en el presente documento, el término “biodisponibilidad” se refiere al grado en el que o la tasa a la que el fármaco u otra sustancia se absorbe o se hace disponible en el sitio de la actividad biológica tras la administración. Esta propiedad depende de varios factores incluyendo la solubilidad del compuesto, la tasa de absorción en el intestino, el grado de unión a proteínas y el metabolismo, etc. En el presente documento se describen diversas pruebas para la biodisponibilidad que resultarán familiares para un experto en la técnica (véase también Egorin et al. 2002).
El término “solubilidad en agua” tal como se usa en esta solicitud se refiere a la solubilidad en medios acuosos, por ejemplo solución salina tamponada con fosfato (PBS) a pH 7,4, o en disolución de glucosa al 5%. Las pruebas para la solubilidad en agua se facilitan a continuación en los ejemplos como “ensayo de solubilidad en agua”.
Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención tal como el compuesto de fórmula (I) incluyen sales convencionales formadas a partir de sales de adición de bases o ácidos orgánicos o inorgánicos así como de ácido de amonio cuaternario farmacéuticamente aceptables. Ejemplos más específicos de sales de ácidos adecuados incluyen clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, fosfórico, nítrico, perclórico, fumárico, acético, propiónico, succínico, glicólico, fórmico, láctico, maleico, tartárico, cítrico, palmoico, malónico, hidroximaleico, fenilacético, glutámico, benzoico, salicílico, fumárico, toluenosulfónico, metanosulfónico, naftaleno-2-sulfónico, bencenosulfónico, hidroxinaftoico, yodhídrico, málico, esteroico, tánico y similares. Las sales de ácido clorhídrico son de particular interés. Otros ácidos tales como el oxálico, aunque no son farmacéuticamente aceptables por sí mismos, pueden ser útiles en la preparación de sales útiles como productos intermedios en la obtención de los compuestos de la invención y sus sales farmacéuticamente aceptables. Ejemplos más específicos de sales básicas adecuadas incluyen sales de sodio, litio, potasio, magnesio, aluminio, calcio, zinc, N,N’-dibenciletilendiamina, cloroprocaína, colina, dietanolamina, etilendiamina, N-metilglucamina y procaína. Las referencias a continuación en el presente documento a un compuesto según la invención incluyen tanto un compuesto de fórmula (I) como sus sales farmacéuticamente aceptables.
Tal como se usa en el presente documento, el término “alquilo” representa un grupo alquilo de cadena lineal o ramificado, que contiene normalmente 1-10 átomos de carbono, por ejemplo un grupo alquilo C1-6. Los ejemplos de grupos alquilo incluyen grupos alquilo C1-4 tales como metilo, etilo, n-propilo, i-propilo y n-butilo.
El término “tratamiento” incluye tratamiento profiláctico así como terapéutico.
El término “fórmula II” se refiere a fórmula IIA y fórmula IIB colectivamente.
Leyendas de las figuras
Figura 1: 1H-RMN del compuesto 24.
Figura 2: Patrón de difracción de rayos X de polvo del compuesto 24 en forma cristalina sólida (forma I).
Descripción de la invención
5 La presente invención proporciona un análogo de sangliferina macrocíclico, tal como se expuso anteriormente, métodos para la preparación de este compuesto y métodos para el uso de este compuesto en medicina.
En una realización, el compuesto es un aducto de metanol del mismo en el que se forma un hemicetal mediante la 10 combinación de los grupos ceto en C-53 e hidroxilo en C-15 y metanol. En otra realización no lo es.
En una realización de la invención, el doble enlace en la posición C26, 27 está en la forma cis, tal como se representa por la siguiente fórmula:
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Un compuesto de este tipo puede producirse durante síntesis química.
En una realización adicional, se proporciona un análogo de sangliferina macrocíclico según la fórmula (I) en forma
20 cristalina sólida. En particular, se proporciona una forma cristalina sólida (forma I) de un análogo de sangliferina macrocíclico según la fórmula (I) que puede obtenerse (o se obtiene) mediante la cristalización del análogo de sangliferina macrocíclico amorfo según la fórmula (I) en metil isobutil cetona (MIBK). En una realización, dicha forma amorfa se suspende en MIBK y se realizan ciclos de temperatura entre una temperatura mínima y una máxima durante un periodo de tiempo total de, por ejemplo, 1 hora, 2 horas, 5 horas, 24 horas, 1 día, 2 días, 3 días, 4 días, 5
25 días, 6 días, 7 días o 2 semanas. En una realización, se realizan ciclos de temperatura entre temperatura ambiente y 60ºC, por ejemplo entre temperatura ambiente y 40ºC. En una realización, se realizan ciclos de temperatura entre la temperatura mínima y la máxima (y viceversa) cada 2-8 horas, por ejemplo, cada 3-5 horas o cada 4 horas. En una realización preferida, se realizan ciclos de temperatura entre temperatura ambiente y 40ºC cada 4 horas durante un total de 5 días.
30 En el ejemplo 8 se describe en detalle un método de cristalización de la forma amorfa del análogo de sangliferina macrocíclico según la fórmula (I).
Un análogo de sangliferina macrocíclico según la fórmula (I) en forma del polimorfo cristalino de forma I tiene un
35 patrón de difracción de rayos X de polvo (XRPD) sustancialmente tal como se muestra en la figura 2. La tabla 2 (del ejemplo 8) muestra la lista de picos y las intensidades relativas. El método de obtención de los datos de XRPD se describe en los Métodos generales.
Por tanto, se proporciona un análogo de sangliferina macrocíclico según la fórmula (I) en forma cristalina (forma I)
40 que tiene un patrón de XRPD con al menos una (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis o las diecisiete) señal a 8,3, 8,5, 11,1, 12,6, 13,9, 14,3, 15,0, 16,9, 17,7, 18,6, 19,0, 20,1, 20,5, 20,9, 21,2, 21,7 y 23,0 (± 0,2 grados, valores de 2-theta), señales que constituyen las señales principales en el patrón de XRPD del polimorfo de forma I. Las señales en 8,3, 8,5, 11,1, 13,9, 17,7, 18,6, 19,0, 20,5, 20,9 y 23,0 grados 2-theta tienen comparativamente alta intensidad relativa (más del 26% -véase la
45 figura 2) y por tanto se prefiere observar al menos una (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o las diez) de éstas. Las señales a 13,9, 17,7, 19,0, 20,5 y 23,0 grados 2-theta tienen particularmente alta intensidad relativa (más del 50% -véase la figura 2) y por tanto se prefiere observar al menos una (por ejemplo, una, dos, tres, cuatro o las cinco) de éstas.
El término “intensidad relativa” se entenderá que significa la intensidad dada como porcentaje como la intensidad de 5 la señal más alta en el espectro (que corresponde al pico a 13,9 grados 2-theta), tal como se ilustra mediante la figura 2.
En general, el compuesto de la invención se prepara mediante mutasíntesis para generar compuestos de fórmula (II), seguido por semisíntesis.
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Fórmula (IIA)
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Fórmula (IIB)
En general, un procedimiento para preparar precursores de un compuesto de fórmula (I) o una sal 20 farmacéuticamente aceptable de los mismos comprende:
• inocular un caldo de fermentación con un cultivo de un productor de sangliferina (tal como Streptomyces sp. A92308110, también conocido como DSM 9954) o más preferiblemente, un productor de sangliferina con el gen sfaA o el homólogo del gen sfaA inactivado o delecionado;
25
• alimentar el caldo de fermentación con un análogo de meta-tirosina (tal como se muestra en la fórmula (III), por ejemplo (S)-2-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo, DL-5-fluoro-meta-tirosina (9) o 2-amino-3-(3fluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo (10))
30 • permitir que continúe la fermentación hasta que se produzcan los compuestos de fórmula IIA y fórmula IIB
• extraer y aislar los compuestos de fórmula IIA y fórmula IIB
• derivatizar de manera semisintética los compuestos de fórmula IIA y fórmula IIB para generar el compuesto de 35 fórmula I.
Los compuestos de fórmula (III) se definen tal como sigue: Fórmula (III)
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5 en la que R10 representa H o un grupo de formación de éster tal como un grupo alquilo, por ejemplo alquilo C1-6 tal como Me.
La alimentación puede ser racémica o la forma L de un compuesto de fórmula (III).
10 Los compuestos de fórmula (III) o bien están comercialmente disponibles o bien se preparan mediante técnicas de química de síntesis orgánica convencionales. Una ruta genérica para los compuestos de fórmula (III) es tal como se muestra en el siguiente esquema 1a.
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15 Esquema 1a: a) acoplamiento de aldehído de fórmula (IV) con un fragmento adecuado, por ejemplo (R11O)2P(O)CH(NHPG)CO2R10, y b) hidrogenación y desprotección según sea necesario. PG = grupo protector.
Los aldehídos de fórmula (IV) pueden estar comercialmente disponibles o sintetizarse fácilmente por un experto en
20 la técnica. Puede ser necesario emplear química de protección y desprotección en la generación de compuestos de fórmula (III) a partir de compuestos de fórmula (IV). Un experto en la técnica conoce estas técnicas y los grupos protectores adecuados tal como se describe en Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis (Wuts y Greene, 4ª Edición, 2007).
25 Tras la generación de los compuestos de fórmula (IIA) y fórmula (IIB), se preparan los compuestos de la invención mediante derivatización semisintética. Los métodos semisintéticos para generar el aldehído de sangliferina macrocíclico se describen en el documento US6.124.453, Metternich et al., 1999, Banteli et al., 2001 y Sedrani et al., 2003.
30 En general, el procedimiento semisintético para preparar determinados compuestos de fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos a partir de un análogo de sangliferina mutasintético comprende:
(a) dihidroxilación del análogo de sangliferina;
35 (b) escisión oxidativa del 1,2-diol para producir un aldehído; y
(c) acoplamiento de dicho aldehído con un carbanión estabilizado (o forma canónica del mismo), tal como un carbanión de fosfonato, usando un compuesto de fórmula V.
40 Esto se muestra de manera retrosintética a continuación: En la que para los análogos de sangliferina A mutasintéticos, R12 =
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imagen12
Los grupos R11, que pueden ser iguales o diferentes, representan independientemente alquilo (por ejemplo alquilo C1-4) o bencilo.
Por tanto, un procedimiento para preparar un compuesto de la invención comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (V) con un macrociclo aldehídico (compuesto de fórmula (VI)).
La preparación de compuestos de fórmula (VI) puede realizarse mediante un procedimiento análogo al descrito anteriormente para la conversión de sangliferina A en su macrociclo aldehídico correspondiente (Metternich et al. 1999). Brevemente, el compuesto de fórmula (II) se dihidroxila usando condiciones de Sharpless modificadas (tetraóxido de osmio catalítico). El uso de los ligandos quirales ayuda a promover la selectividad. Entonces puede escindirse oxidativamente el diol resultante, usando por ejemplo peryodato de sodio. Entonces puede usarse el compuesto de fórmula VI resultante como sustrato para derivatización a una amida, éster o cetona homologados. Normalmente, se disuelve un compuesto de fórmula (V) en un disolvente aprótico, se enfría y luego se trata con una base, por ejemplo hidruro de sodio. Entonces se añade un compuesto de fórmula (VI) y aumenta la temperatura de la reacción. Tras un periodo de tiempo adecuado, se detiene la reacción y se purifica el compuesto de fórmula I mediante condiciones convencionales (por ejemplo HPLC preparativa, CCF preparativa, etc., cromatografía ultrarrápida en fase normal).
Los compuestos de fórmula (V) pueden conocerse o pueden prepararse usando métodos conocidos.
Tal como se muestra en el esquema 1 (a continuación) puede usarse la amina apropiada para tratar cloruro de cloroacetilo o similar para formar una alfa-cloroamida. Entonces se trata la alfa-cloroamida en una reacción de Arbuzov para generar un compuesto de fórmula V. Otras rutas para los compuestos de fórmula V resultarán evidentes para un experto en la técnica.
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fórmula V
Esquema 1
10 Otros compuestos de fórmula (V) pueden conocerse o pueden sintetizarse fácilmente a partir de derivados de ácido carboxílico disponibles (por ejemplo R3COX) en los que R3 es el anillo de 1,2-oxazinano mostrado en el esquema 2. Tal como se muestra en el esquema 2 (a continuación) el derivado de ácido carboxílico puede acoplarse en un fosfonato de metilo una vez que el fosfonato se ha tratado con una base. Esto produce un compuesto de fórmula (V), aunque otras rutas para obtener compuestos de fórmula V resultarán evidentes para un experto en la técnica.
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X = Cl o O-alquilo
20 Esquema 2
Si se desea o es necesario, pueden emplearse grupos protectores para proteger la funcionalidad en el macrociclo o macrociclo aldehídico, o en compuestos de fórmula V tal como se describe en T. W. Green, P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley-Interscience, Nueva York, 1999.
25 Además de los métodos específicos y las referencias proporcionadas en el presente documento, un experto en la técnica también puede consultar referencias en libros de texto convencionales para métodos de síntesis, incluyendo, pero sin limitarse a Vogel’s Textbook of Practical Organic Chemistry (Furniss et al., 1989) y March’s Advanced Organic Chemistry (Smith y March, 2001).
30 Un análogo de sangliferina según la invención puede administrarse solo o en combinación con otros agentes terapéuticos. La coadministración de dos (o más) agentes puede permitir que se usen menores dosis de cada uno, reduciendo así los efectos secundarios, puede conducir a potencia mejorada y por tanto a SVR superior, y a una reducción en la resistencia.
35 Por tanto en una realización, el análogo de sangliferina mutasintético se coadministra con uno o más agentesterapéuticos para el tratamiento de infección por VHC, tomado de los tratamientos de referencia. Éste podría ser un interferón (por ejemplo pIFNα y/o ribavirina).
40 En una realización alternativa, se coadministra macrociclo de sangliferina de la invención con uno o más agentes antivirales distintos, tales como un STAT-C (agente dirigido específicamente para el tratamiento de VHC) o DAA (antivirales de acción directa), que podría ser uno o más de los siguientes: inhibidores no nucleósidos de la polimerasa (por ejemplo ABT-333, ABT-072, BMS 791325, IDX375, VCH-222, BI 207127, ANA598, VCH-916, GS 9190, PF-00868554 (Filibuvir) o VX-759), inhibidores nucleósidos o nucleótidos de la polimerasa (por ejemplo 2’-Cmetilcitidina, 2’-C-metiladenosina, R1479, PSI-6130, R7128, R1626, PSI 7977 o IDX 184), inhibidores de proteasa (por ejemplo ABT-450, ACH-1625, BI 201355, BILN-2061, BMS-650032, CTS 1027, Danoprevir, GS 9256, GS 9451, MK 5172, IDX 320, VX-950 (Telaprevir), SCH503034 (Boceprevir), TMC435350, MK-7009 (Vaneprivir), R7227/ITMN191, EA-058, EA-063 o VX 985), inhibidores de NS5A (por ejemplo A-831, BMS 790052, BMS 824393, CY-102 o PPI-461), silimarina, inhibidores de NS4b, inhibidores de serina C-palmitoiltransferasa, nitazoxanida o inhibidores de la entrada viral (por ejemplo PRO 206).
En una realización alternativa, se coadministra macrociclo de sangliferina de la invención con uno o más agentes antivirales distintos (tal como terapia antirretroviral altamente activa (HAART)) para el tratamiento de VIH, que podría ser uno o más de los siguientes: inhibidores nucleósidos de la transcriptasa inversa (NRTI) (por ejemplo emtricitabina o tenofovir), inhibidores no nucleósidos de la transcriptasa inversa (NNRTI) (por ejemplo rilipivirina o efavirenz), inhibidores de proteasa (PI) (por ejemplo ritonavir o lopinavir), inhibidores de fusión (por ejemplo maraviroc o enfuvirtida), inhibidores de CCR5 (por ejemplo aplaviroc o vicriviroc), inhibidores de maduración (por ejemplo bevirimat), anticuerpos monoclonales anti-CD4 (por ejemplo Ibalizumab) e inhibidores de integrasa (por ejemplo eltiegravir).
En una realización alternativa, se coadministra un macrociclo de sangliferina de la invención con uno o más agentes antivirales distintos para el tratamiento de VHB, que podría ser uno o más de los siguientes: interferones (por ejemplo interferón alfa o interferón alfa pegilado), análogos de nucleósido o nucleótido (por ejemplo lamivudina, entecavir, adefovir dipivoxil o telbivudina), otros inmunomoduladores (por ejemplo timosina alfa, CYT107 o DV-601)
o inhibidores de HMG CoA reductasa (por ejemplo simvastatina).
Las formulaciones pueden presentarse convenientemente en forma farmacéutica unitaria y pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Tales métodos incluyen la etapa de asociar el principio activo (compuesto de la invención) con el portador que constituye uno o más componentes adicionales. En general, las formulaciones se preparan asociando uniforme e íntimamente el principio activo con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos, y entonces, si es necesario, se conforma el producto.
Los compuestos de la invención normalmente se administrarán por vía oral en forma de una formulación farmacéutica que comprende el principio activo, opcionalmente en forma de una sal de adición de base o ácido orgánico o inorgánico no tóxico, en una forma farmacéutica farmacéuticamente aceptable. Dependiendo del trastorno y del paciente que va a tratarse, así como de la vía de administración, las composiciones pueden administrarse en dosis variables.
Por ejemplo, los compuestos de la invención pueden administrarse por vía oral, bucal o sublingual en forma de comprimidos, cápsulas, óvulos, elixires, disoluciones o suspensiones, que pueden contener agentes aromatizantes o colorantes, para aplicaciones de liberación inmediata, retardada o controlada.
Tales comprimidos pueden contener excipientes tales como celulosa microcristalina, lactosa, citrato de sodio, carbonato de calcio, fosfato de calcio dibásico y glicina, disgregantes tales como almidón (preferiblemente almidón de maíz, patata o tapioca), glicolato sódico de almidón, croscarmelosa de sodio y determinados silicatos complejos, y aglutinantes de granulación tales como polivinilpirrolidona, hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC), hidroxipropilcelulosa (HPC), sacarosa, gelatina y goma arábiga. Adicionalmente, pueden incluirse agentes lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico, behenato de glicerilo y talco.
También pueden emplearse composiciones sólidas de tipo similar como cargas en cápsulas de gelatina. Los excipientes preferidos a este respecto incluyen lactosa, almidón, una celulosa, azúcar de leche o polietilenglicoles de alto peso molecular. Para suspensiones acuosas y/o elixires, los compuestos de la invención pueden combinarse con diversos agentes edulcorantes o aromatizantes, colorantes o materia colorante, con agentes de emulsión y/o suspensión y con diluyentes tales como agua, etanol, propilenglicol y glicerina, y combinaciones de los mismos.
Un comprimido puede obtenerse mediante compresión o moldeo, opcionalmente con uno o más componentes adicionales. Los comprimidos sometidos a compresión pueden prepararse comprimiendo en una máquina adecuada el principio activo en forma fluida tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclado con un aglutinante (por ejemplo povidona, gelatina, hidroxipropilmetilcelulosa), lubricante, diluyente inerte, conservante, disgregante (por ejemplo glicolato sódico de almidón, povidona reticulada, carboximetilcelulosa de sodio reticulada), agente tensioactivo o dispersante. Los comprimidos moldeados pueden obtenerse moldeando en una máquina adecuada una mezcla del compuesto en polvo humedecido con un diluyente líquido inerte. Los comprimidos pueden recubrirse
o ranurarse opcionalmente y pueden formularse para proporcionar la liberación lenta o controlada del principio activo usando en los mismos, por ejemplo, hidroxipropilmetilcelulosa en proporciones variables para proporcionar un perfil de liberación deseado.
Las formulaciones según la presente invención adecuadas para administración oral pueden presentarse como unidades diferenciadas tales como cápsulas, sellos o comprimidos, conteniendo cada uno una cantidad predeterminada del principio activo; como un polvo o gránulos; como una disolución o una suspensión en un líquido acuoso o un líquido no acuoso; o como una emulsión líquida de aceite en agua o una emulsión líquida de agua en aceite. El principio activo también puede presentarse como un bolo, electuario o pasta.
Debe entenderse que además de los componentes mencionados particularmente antes, las formulaciones de esta invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica teniendo en cuenta el tipo de formulación en cuestión, por ejemplo los adecuados para administración oral pueden incluir agentes aromatizantes.
Ventajosamente, pueden disolverse agentes tales como conservantes y agentes tamponantes en el vehículo. Para potenciar la estabilidad, puede congelarse la composición tras el llenado en el vial y puede retirarse el agua a vacío. El polvo liofilizado seco se sella entonces en el vial y puede suministrarse un vial adjunto de agua para inyección para reconstituir el líquido antes de su uso.
La dosificación que va a administrase de un compuesto de la invención variará según el compuesto particular, la enfermedad implicada, el sujeto, y la naturaleza y la gravedad de la enfermedad y el estado físico del sujeto, y la vía de administración seleccionada. La dosificación apropiada puede determinarse fácilmente por un experto en la técnica.
Las composiciones pueden contener desde el 0,1% en peso, preferiblemente desde el 5-60%, más preferiblemente desde el 10-30% en peso, de un compuesto de invención, dependiendo del método de administración.
Se reconocerá por un experto en la técnica que la cantidad y separación óptimas de las dosificaciones individuales de un compuesto de la invención se determinarán por la naturaleza y el grado del estado que esté tratándose, la forma, la vía y el sitio de administración, y la edad y estado del sujeto particular que esté tratándose, y que un médico determinará en última instancia las dosificaciones apropiadas que han de usarse. Esta dosificación puede repetirse tan a menudo como sea apropiado. Si se desarrollan efectos secundarios, puede alterarse o reducirse la cantidad y/o frecuencia de la dosificación, según la práctica clínica normal.
Los aspectos adicionales de la invención incluyen:
-un compuesto según la invención para su uso como producto farmacéutico;
-un compuesto según la invención para su uso como producto farmacéutico para el tratamiento de infecciones virales (especialmente infecciones por virus ARN) tal como infección por VHC o VIH, para su uso como antiinflamatorio o para profilaxis de rechazo de trasplantes de órganos;
-una composición farmacéutica que comprende un compuesto según la invención junto con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable;
-una composición farmacéutica que comprende un compuesto según la invención junto con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable que comprende además un segundo principio activo o principio activo posterior, especialmente un principio activo indicado para el tratamiento de infecciones virales tales como infección por VHC o VIH, para su uso como antiinflamatorio o para profilaxis de rechazo de trasplantes de órganos;
También se describen:
-un método de tratamiento de infecciones virales (especialmente infecciones por virus ARN) tal como infección por VHC o VIH, para su uso como antiinflamatorio o para profilaxis de rechazo de trasplantes de órganos que comprende administrar a un sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto según la invención;
-uso de un compuesto según la invención para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de infecciones virales tales como infección por VHC o VIH, para su uso como antiinflamatorio o para profilaxis de rechazo de trasplantes de órganos.
Métodos generales
Materiales y métodos
Cepas bacterianas y condiciones de crecimiento
El productor de sangliferina Streptomyces sp. A92-308110 (DSM n.º 9954, adquirido de DSMZ, Braunschweig, Alemania) también denominado BIOT-4253 y BIOT-4370 o sus derivados, tales como BIOT-4585 se mantienen en medio de agar de harina de avena, MAM, ISP4 o ISP2 (véase a continuación) a 28ºC.
Se hizo crecer BIOT-4585 (para la metodología de construcción, véase el ejemplo 1) en agar de harina de avena a 28ºC durante 7-10 días. Se recogieron las esporas de la superficie de la placa de agar en glicerol estéril al 20% p/v en agua destilada y se almacenaron en alícuotas de 0,5 ml a -80ºC. Se usó la reserva de esporas congeladas para inocular medios de siembra SGS o SM25-3. Se incubó el medio de siembra inoculado con agitación entre 200 y 300 rpm con un desplazamiento vertical de 5,0 ó 2,5 cm a 27ºC durante 24 horas. Se inoculó el medio de fermentación SGP-2 o BT6 con el 2,5%-10% del cultivo sembrado y se incubó con agitación entre 200 y 300 rpm con un desplazamiento vertical de 5 ó 2,5 cm a 24ºC durante 4-5 días. Entonces se recogió el cultivo para su extracción.
5 Análogo de meta-tirosina
Se adquirió (S)-2-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo de NetChem (EE.UU.). Se adquirió 3-bromo5-fluoroanisol (9-1) de Accela ChemBio Co., Ltd., (Shanghai, China) y también puede adquirirse de Amfinecom Inc
10 (EE.UU.) o Apollo Scientific Ltd. (RU)). Se sintetizaron DL-5-fluoro-meta-tirosina (9) y 2-amino-3-(3-fluoro-5hidroxifenil)propanoato de metilo (10)) tal como sigue.
DL-5-fluoro-meta-tirosina (9) y 2-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo (10)
imagen15
A una disolución de 9-1 (20 g, 97,55 mmol) en tetrahidrofurano (100 ml) se le añadió gota a gota n-butil-litio (43 ml, 2,5 M, 107,3 mmol) a -78ºC. Se agitó durante 30 minutos y se añadió N,N-dimetilformamida (15,1 ml, 195,1 mmol) a esta temperatura. Se agitó durante otros 30 minutos y se retiró el baño frío. Tras 1 hora, se extinguió la reacción con
20 cloruro de amonio saturado acuoso. Se lavó la fase orgánica con agua y cloruro de sodio saturado acuoso, se secó (sulfato de sodio), se filtró y se concentró. Se purificó el residuo mediante cromatografía en sílice para dar 9-2.
A una disolución de 9-2 (6 g, 38,9 mmol) en DCM seco (200 ml) se le añadió gota a gota BBr3 (4 M en DCM, 30 ml, 116,8 mmol) a -70ºC. Tras la adición, se agitó la mezcla de reacción a -20ºC durante 3 horas, se añadió agua helada
25 cuidadosamente y se extrajo con DCM. Se lavaron las fases orgánicas con agua y salmuera, se secaron sobre Na2SO4, se filtraron y se concentraron. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida en sílice para dar el compuesto deseado 9-3.
A una disolución de 2-(benciloxicarbonilamino)-2-(dimetoxifosforil)acetato de metilo (4,64 g, 14 mmol) en DCM
30 (150 ml) se le añadió DBU (4,26 g, 28 mmol) a temperatura ambiente. Tras 10 min, se añadió 9-3 (1,95 g, 14 mmol) y se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante la noche. Se diluyó la disolución con EtOAc (150 ml), se separó y se lavó la fase orgánica con HCl 1 N, se secó sobre Na2SO4, se filtró y se concentró. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida en sílice para dar 9-4.
35 Se hidrogenó una disolución de 9-4 (1 g) en MeOH (20 ml) sobre 200 mg de Pd al 10%/C a presión normal durante la noche. Tras la eliminación del catalizador mediante filtración, se evaporó el disolvente para dar 10.
A una disolución de 10 (300 mg, 1,4 mmol) en EtOH (30 ml) se le añadió NaOH ac. (2 N, 4 ml), se agitó la reacción a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se eliminó el disolvente y se neutralizó el residuo hasta pH=6 con HCl 2 N y se recogieron los cristales blancos que se formaron mediante filtración para dar el compuesto 9 objetivo.
Vía alternativa para 2-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo (10)
Se adquirió (3,5-difluorobromobenceno (9a-1) de Darui Fine Chemicals Co., Ltd., (Shanghai, China) y también puede adquirirse de Alfa Aesar o Sigma Aldrich.)
imagen16
10 Preparación de 9a-2
A una disolución de BnOH (1,61 ml, 15,54 mmol) en DMF (30 ml) se le añadió NaH (622 mg, dispersión al 60% en aceite mineral, 15,54 mmol) a 0ºC. Se continuó con la agitación a temperatura ambiente durante 0,5 h para dar una disolución transparente. Se añadió 9a-1 (1,79 ml, 15,54 mmol) a una tasa tal para mantener la temperatura por
15 debajo de 40ºC. Se agitó la mezcla a temperatura ambiente durante la noche para dar una disolución amarilla. Se extinguió la reacción mediante agua y se extrajo con éter de petróleo (35 ml X 34). Se concentraron las fases orgánicas combinadas. Y se purificó el residuo mediante cromatografía en gel de sílice eluyendo con éter de petróleo para proporcionar 9a-2 (2,544 g) como aceite incoloro.
20 Preparación de 9a-3
A un matraz seco de tres bocas se le añadieron Mg (170,1 mg, 7,10 mmol), THF anhidro (10 ml) y una pequeña cantidad de yodo bajo nitrógeno. Se añadió 1/3 de 9a-2 (1,664 g, 5,9192 mmol) en THF (2 ml). Se calentó la mezcla a reflujo. Durante este tiempo, la mezcla amarilla se convirtió gradualmente en amarillo brillante. Entonces, se
25 añadieron los restantes 2/3 de 9a-2 gota a gota, y se sometió a reflujo la mezcla de reacción durante otras 0,5 h.
A la mezcla anterior se le añadió DMF (0,504 ml, 6,51 mmol) lentamente a 0ºC. Se continuó con la agitación durante 0,5 h a temperatura ambiente. Se añadió HCl (2 M, 10 ml) y se evaporó el THF. Se extrajo el residuo con acetato de etilo (25 ml X 3). Y se lavaron las fases orgánicas combinadas con salmuera y se concentraron a vacío. Se purificó
30 el residuo mediante cromatografía en gel de sílice eluyendo con de éter de petróleo a éter de petróleo/acetato de etilo = 20/1 para dar 9a-3 (694 mg) como aceite incoloro.
Preparación de 9a-5
35 A una disolución de 2-(benciloxicarbonilamino)-2-(dimetoxifosforil)acetato de metilo, 9a-4 (993 mg, 3,00 mmol) en DCM (30 ml) se le añadió DBU (832 ul, 5,57 mmol) a temperatura ambiente. Tras 10 min, se añadió 9a-3 (694 mg, 3,01 mmol) y se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 1 h. Se lavó la disolución con HCl (1 M, 10 ml), y se secaron las fases orgánicas combinadas y se concentraron a vacío. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida en sílice (eluyendo con diclorometano/acetato de etilo = 10/1) para dar 9a-5 (1,11 g).
40 Preparación de 10
Se hidrogenó una disolución de 9a-5 (100 mg) en MeOH (50 ml) sobre 20 mg de Pd al 10%/C a presión normal durante 2 h. Tras la eliminación del catalizador mediante filtración, se evaporó el disolvente para dar 10 (33 mg).
45 Fórmulas de los medios
Se preparó el agua usada para preparar los medios usando el sistema de purificación de agua de calidad analítica Elix de Millipore Medio de siembra SGS Componente (y proveedor) Fórmula
Glucosa (Sigma, G7021)
7,50 g
Glicerol (Fisher scientific, G/0650/25)
7,50 g
extracto de levadura (Becton Dickinson, 212770)
1,35 g
extracto de malta (Becton Dickinson, 218630)
3,75 g
almidón de patata (soluble) (Sigma, S2004)
7,50 g
NZ-amina A (Sigma, C0626)
2,50 g
harina de soja tostada, Nutrisoy (ADM, 063-160)
2,50 g
L-asparagina (Sigma, A0884)
1,00 g
CaCO3 (Calcitec, V/40S)
0,05 g
NaCl (Fisher scientific, S/3160/65)
0,05 g
KH2PO4 (Sigma, P3786)
0,25 g
K2HPO4 (Sigma, P5379)
0,50 g
MgSO4.7H2O (Sigma, M7774)
0,10 g
disolución de oligoelementos B
1,00 ml
Agar
1,00 g
Antiespumante SAG471 (GE Silicones, SAG471)
* 0,20 ml
H2O OI hasta un vol. final de
** 1,00 l
se ajusta el pH antes de la esterilización a pH 7,0 con NaOH 10 M/H2SO4 10 M se esteriliza calentando a 121ºC, 20-30 min (en autoclave) Notas
* el antiespumante se usa sólo en fermentadores de siembra, NO en matraces de siembra ** volumen final ajustado en consecuencia para tener en cuenta el volumen de siembra
Disolución de oligoelementos B
Componente Fórmula
FeSO4.7H2O (Sigma, F8633) ZnSO4.7H2O (Sigma, Z0251) MnCl2.4H2O (Sigma, M8530) CuSO4.5H2O (Aldrich, 20,919-8) (NH4)6Mo7O24 (Fisher scientific, A/5720/48) CoCl2,6H2O (Sigma, C2644) H3BO3 (Sigma, B6768) KI (Alfa Aesar, A12704) H2SO4 (95%) (Fluka, 84720) H2O OI hasta un vol. final de
5,00 4,00 2,00 0,20 0,20 0,10 0,10 0,05 1,00 1,00 g g g g g g g g ml l
10
Medio de producción SGP2
Componente
Fórmula
harina de soja tostada (Nutrisoy) (ADM, 063-160)
20,00 g
Glicerol (Fisher scientific, G/0650/25)
40,00 g
tampón MES (Acros, 172595000)
19,52 g
Antiespumante SAG471 (GE Silicones, SAG471)
*0,20 ml
H2O OI hasta un vol. final de
**1,00 l
se ajusta el pH antes de la esterilización a pH 6,8 con NaOH 10 M se esteriliza calentando a 121ºC, 20-30 min (en autoclave) Notas
* volumen final ajustado en consecuencia para tener en cuenta el volumen de siembra ** el antiespumante se usó sólo en fermentadores, no en matraces
Medio SM25-3 (también denominado SM25)
Componente
Glicerol (Fisher scientific, G/0650/25) 40 g Peptona de soja A3 SC (Organotechnie) 10 g Extracto de malta (Difco) 21 g hasta un vol. final de 1 l
No se ajusta el pH antes de la esterilización (es decir, pH 7,0)
Medio ISP4
Componente Almidón soluble (Difco) 10 g K2HPO4 1 g MgSO4.7H2O 1 g NaCl 1 g (NH4)2SO4 2 g CaCO3 2 g Disolución de sales de oligoelementos ISP 1 ml Agar 20 g hasta un volumen final de 1 l Hacer una pasta con el almidón en un pequeño volumen de agua fría y llevar hasta un volumen de 500 ml Añadir otros componentes a la disolución II en 500 ml de agua. El pH debe estar entre pH 7,0 y pH 7,4 (pH 7,3). Mezclar dos disoluciones juntas y añadir agar
Sales de oligoelementos ISP
Componente FeSO4.7H2O 1 g MnCl2.4H2O 1 g ZnSO4.7H2O 1 g hasta un volumen final de 1 l Almacenar a 4 grados C
Agar de harina de avena (ISP3)
Componente Fórmula
Harina de avena
20,00 g
Disolución de oligoelementos ISP
1,00 ml
Agar Bacto (Becton Dickinson)
18,00 g
H2O IO
hasta un volumen final de 1,00 l
Se cuecen 20 g de harina de avena en 1 l de agua sobre una placa caliente (o microondas) durante 20 minutos. Se filtra la mezcla cocida a través de gasa rectilínea/muselina y se lleva a pH 7,2 y se vuelve a llevar a 1 l. Se añade 1 ml de disolución de oligoelementos ISP. Entonces se añaden 18 g por l de agar antes de esterilizar.
Agar MAM
Componente Fórmula Extracto de levadura (Becton Dickinson) 4,00 g Extracto de malta (Becton Dickinson) 10,00 g Dextrosa (Sigma) 4,00 g Agar Bacto (Becton Dickinson) 20,0 g H2O IO hasta un volumen final de 1,00 l Ajustar el pH a 7,3 antes de añadir agar y esterilizar
Almidón de trigo (Sigma) Polvo de maceración de maíz (Roquette) Extracto de levadura (Becton Dickinson) CaCO3 (Calcitec) FeSO4 (Sigma) Agar Bacto (Becton Dickinson) H2O IO hasta un volumen final de pH 5,8 antes de someter al autoclave
10,00 2,50 3,00 3,00 0,300 20,00 1,00 g g g g g g l
15
Medios de producción BT6
Componente Glucosa (Sigma) Nutrisoy (ADM) NaCl (Fisher) (NH4)2SO4 (Sigma) CaCO3 (Calcitec) H2O IO hasta un volumen final de Ajustar el pH a 7,0, entonces añadir CaCO3
Fórmula 50,00 30,00 5,00 3,00 6,00 1,00 g g g g g l
Agar ISP2
Componente
Fórmula
Método de fermentación general
Se descongelaron reservas de esporas crioconservadas de BIOT-4585 (para la metodología de construcción, véase
5 el ejemplo 1) a temperatura ambiente. Se prepararon cultivos vegetativos (cultivos de siembra) transfiriendo 4,0 ml de reserva de esporas a 400 ml de medio SM25 en matraces Erlenmeyer de 2 l con tapón de espuma. Se llevó a cabo el cultivo durante 48 horas a 27ºC y 250 rpm (desplazamiento vertical de 5,0 cm). A partir del cultivo de siembra, se transfirieron 25 ml a 250 ml demedio de producción SGP2 + HP20 al 5% en matraces Erlenmeyer de 2 l con tapón de espuma. Tras 24 horas de cultivo a 24ºC y 250 rpm (desplazamiento vertical de 2,5 cm), se añadieron
10 2 ml de una disolución racémica 250 mM o enantioméricamente pura 125 mM del precursor deseado (por ejemplo (S)-2-amino-3-(3-fluoro-5-hidroxifenil)propanoato de metilo, DL-5-fluoro-meta-tirosina (9) o 2-amino-3-(3-fluoro-5hidroxifenil)propanoato de metilo (10)), en ácido clorhídrico 1 M y 2 ml de una disolución metalónica 250 mM de ácido DL-piperázico a cada matraz de producción para dar una concentración final 1 mM de los enantiómeros individuales de los precursores. Puede usarse opcionalmente DMSO en lugar de ácido clorhídrico 1 M. Puede
15 omitirse opcionalmente el ácido DL-piperázico. Se continuó con el cultivo durante cuatro días a 24ºC y 250 rpm (desplazamiento vertical de 2,5 cm).
Análisis de caldos de cultivo mediante CL-UV y CL-UV-EM
20 Se añaden caldo de cultivo (1 ml) y acetato de etilo (1 ml) y se mezclan durante 15-30 min seguido por centrifugación durante 10 min. Se recogen 0,4 ml de la fase orgánica, se evaporan hasta la sequedad y entonces se vuelven a disolver en 0,20 ml de acetonitrilo.
Condiciones de HPLC: 25 Columna C18 Hyperclone BDS C18, 3 u, 4,6 mm x 150 mm
Dotada de un cartucho de seguridad C18 analítico de Phenomenex (KJ0-4282)
30 Temperatura de la columna a 50ºC
Velocidad de flujo 1 ml/min
Monitorizar UV a 240 nm 35 Inyectar alícuota de 20 ul
Gradiente de disolventes:
40 0 min: 55%de B
1,0 min: 55% de B
6,5 min: 100% de B 45 10,0 min: 100% de B
10,05 min: 55% de B
50 13,0 min: 55% de B
El disolvente A es agua + ácido fórmico al 0,1%
El disolvente B es acetonitrilo + ácido fórmico al 0,1% 55 En estas condiciones SfA eluye a los 5,5 min
En estas condiciones SfB eluye a los 6,5 min
60 Se realiza CL-EM en un sistema de HPLC HP1100 de Agilent integrado en combinación con un espectrómetro de masas por electropulverización Esquire 3000+ de Bruker Daltonics que funciona en modo de ión positivo usando la
cromatografía y los disolventes descritos anteriormente.
Método de CL-EM QC
Condiciones de HPLC:
Columna C18 Hyperclone BDS C18, 3 u, 4,6 mm x 150 mm
Dotada de un cartucho de seguridad C18 analítico de Phenomenex (KJ0-4282)
Temperatura de la columna a 50ºC
Velocidad de flujo 1 ml/min
Monitorizar UV a 210, 240 y 254 nm
Gradiente de disolventes:
0 min: 10% de B
2,0 min: 10% de B
15 min: 100% de B
17 min: 100% de B
17,05 min: 10% de B
20 min: 10% de B
El disolvente A es agua + ácido fórmico al 0,1%
El disolvente B es acetonitrilo + ácido fórmico al 0,1%
Condiciones de EM: La EM funciona en modo de intercalación (intercalando entre positivo y negativo), explorando desde 150 hasta 1500 uma.
Método de difracción de rayos X de polvo (XRPD)
Se comprimieron de manera suave aproximadamente 2 mg de muestra en el soporte de muestras de sílice cortado
en oblicuo individual con ruido de fondo cero de XRPD. Entonces se cargó la muestra en un difractómetro X-Pert MPD de Philips y se analizó usando las siguientes condiciones experimentales: Ánodo del tubo: Cu Tensión del generador: 40 kV Corriente del tubo. 40 mA Longitud de onda alfa1: 1,5406 Å Longitud de onda alfa2: 1,5444 Å Ángulo de inicio [2 theta]: 5 Ángulo de finalización [2 theta]: 50 Exploración continua Ensayo de replicón in vitro para la evaluación de la actividad antiviral contra VHC Puede someterse a prueba la eficacia antiviral contra el genotipo 1 de VHC tal como sigue: Un día antes de la
adición del artículo de prueba, se recogieron células Huh5.2 que contenían el genotipo 1b, replicón 1389luc-ubineo/NS3-3’/5.1 de VHC (Vrolijk et al., 2003) y subcultivadas en medio de crecimiento de células [DMEM (n.º de catálogo 41965039) complementado con FCS al 10%, aminoácidos no esenciales al 1% (11140035), penicilina/estreptomicina al 1% (15140148) y geneticina al 2% (10131027); Invitrogen] a una razón de 1,3-1,4 y crecidas durante 3-4 días en matraces de cultivo tisular de 75 cm2 (Techno Plastic Products), y se sembraron en medio de ensayo (DMEM, FCS al 10%, aminoácidos no esenciales al 1%, penicilina/estreptomicina al 1%) a una densidad de 6500 células/pocillo (100 µl/pocillo) en placas de microtitulación de cultivo tisular de 96 pocillos (Falcon, Becton Dickinson para la evaluación del efecto antimetabólico y CulturPlate, Perkin Elmer para la evaluación del efecto antiviral). Se incuban las placas de microtitulación durante la noche (37ºC, 5% de CO2, humedad relativa del 95-99%), produciendo una monocapa de células no confluente.
Se preparan series de dilución; cada serie de dilución se realiza al menos por duplicado. Tras configurar el ensayo, se incuban las placas de microtitulación durante 72 horas (37ºC, 5% de CO2, humedad relativa del 95-99%).
Para la evaluación de los efectos antimetabólicos, se aspira el medio de ensayo, se sustituye por 75 µl de una disolución al 5% de MTS (Promega) en medio libre de rojo fenol y se incuba durante 1,5 horas (37ºC, 5% de CO2, humedad relativa del 95-99%). Se mide la absorbancia a una longitud de onda de 498 nm (Safire2, Tecan) y las densidades ópticas (valores de DO) se convierten en porcentajes de los controles no tratados.
Para la evaluación de los efectos antivirales, se aspira el medio de ensayo y se lavan las monocapas de células con PBS. Se aspira el tampón de lavado, se añaden 25 µl de tampón de lisis Glo (n.º de catálogo E2661, Promega) tras lo cual se permite que continúe la lisis durante 5 min a temperatura ambiente. Posteriormente, se añaden 50 µl de sistema de ensayo de luciferasa (n.º de catálogo E1501, Promega) y se cuantifica inmediatamente la señal de luminiscencia de luciferasa (tiempo de integración de 1000 ms/pocillo, Safire2, Tecan). Se convierten las unidades de luminiscencia relativa en porcentajes de los controles no tratados.
Las CE50 y CE90 (valores obtenidos a partir de la curva de dosis-respuesta) representan las concentraciones a las que se observaría inhibición de replicación viral del 50% y el 90%, respectivamente. La CC50 (valor obtenido a partir de la curva de dosis-respuesta) representa la concentración a la que la actividad metabólica de las células se reduciría al 50% de la actividad metabólica de las células no tratadas. El índice de selectividad (IS), indicativo de la ventana terapéutica del compuesto, se calcula como CC50/CE50.
Se considera que una concentración de compuesto provoca un efecto antiviral genuino en el sistema de replicón de VHC cuando, a esa concentración particular, el efecto anti-replicón está por encima del 70% del umbral y no se observa una reducción de más del 30% en la actividad metabólica.
Ensayo de replicón in vitro para la evaluación de la actividad antiviral contra VHC en los genotipos 1a y 2a
Se hacen crecer células con replicón (replicones subgenómicos de genotipo 1a (H77) y 2a (JFH-1)) en medios esenciales modificados por Dulbecco (DMEM), suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina-estreptomicina (penestrep) al 1%, glutamina al 1%, aminoácidos no esenciales al 1%, G418 250 µg/ml en un incubador con el 5% de CO2 a 37ºC. Todos los reactivos del cultivo celular pueden adquirirse de Mediatech (Herndon, VA).
Se someten las células con replicón a tripsinización y se siembran a 5 x 103 células por pocillo en placas de 96 pocillos con los medios anteriores sin G418. Al día siguiente, se sustituye el medio de cultivo con DMEM que contienen compuestos diluidos en serie en presencia de FBS al 5%. El ensayo antiviral de replicón de VHC examina los efectos de los compuestos en una serie de diluciones de compuestos. Brevemente, se siembran las células que contienen replicón de VHC en placas de 96 pocillos. Se diluye en serie el artículo de prueba con DMEM más FBS al 5%. Se aplica el compuesto diluido a los pocillos apropiados e la placa. Tras 72 h de incubación a 37ºC, se procesan las células. Se extrae el ARN intracelular de cada pocillo con un kit RNeasy 96 (Qiagen). Se determina el nivel de ARN de VHC mediante un ensayo de PCR en tiempo real con transcriptasa inversa usando los reactivos de mezcla maestra de RT-PCR de una etapa TaqMan® (Applied Biosystems, Foster City, CA) y un sistema de detección de secuencias ABI Prism 7900 (Applied Biosystems) tal como se describió anteriormente (Vrolijk et al., 2003). Se miden los efectos citotóxicos con los reactivos de control de ARN ribosómico TaqMan® (Applied Biosystems) como una indicación del número de células. Entonces se usa la cantidad de ARN de VHC y ARN ribosómico para obtener los valores de CI50 aplicables (concentración que inhibe la replicación del replicón en el 50%).
Evaluación del metabolismo de microsomas (ensayo de estabilidad de microsomas)
Puede someterse a prueba la tasa de metabolismo en microsomas tal como sigue:
Se diluyeron microsomas de hígado de ratón o ser humano con tampón C (tampón fosfato de potasio 0,1 M, EDTA 1,0 mM, pH 7,4) hasta una concentración de 2,5 mg/ml. Entonces se prepararon muestras para determinar la estabilidad microsómica añadiendo 50 µl de disolución con adiciones conocidas de compuesto 5 µM (0,5 µl de disolución madre de DMSO 10 mM en 9,5 µl de ACN, añadidos a 990 µl de tampón C) a 50 µl de disolución microsómica (2,5 mg/ml), 110 µl de tampón C y se mezclaron bien. Se preincubaron todas la muestras durante aproximadamente 15 minutos a 37ºC. Tras esto, se inició la reacción añadiendo 40 µl de la disolución de NADPH (12,5 mM) con mezclado suave. Se retiraron alícuotas (40 µl) a 0, 15, 30, 45 y 60 minutos y se extinguió con patrón interno que contenía ACN (120 µl). Se retiraron las proteínas mediante centrifugación (4000 rpm, 15 min) y se analizó la placa de muestra para determinar la concentración del compuesto mediante CL-EM/EM. Entonces se
5 calcularon las semividas mediante métodos convencionales, comparando la concentración del analito con la cantidad originalmente presente.
Evaluación de la estabilidad de hepatocitos
10 Se colocan hepatocitos crioconservados, previamente almacenados en nitrógeno líquido en un baño de agua con agitación a 37 ± 1ºC durante 2 min ± 15 s. Entonces se añaden los hepatocitos a volúmenes 10X de tampón bicarbonato de Krebs-Henseleit (KHB) precalentado (glucosa 2000 mg/l, sin carbonato de calcio ni bicarbonato de sodio, Sigma), se mezclan suavemente y se centrifugan a 500 rpm durante 3 minutos. Tras la centrifugación, se retira cuidadosamente el sobrenadante y se añade un volumen 10X de tapón KHB precalentado para resuspender el
15 sedimento de células. Esto se mezcla suavemente y se centrifuga a 500 rpm durante 3 minutos. Entonces se retira el sobrenadante y se desecha. Entonces se determinan la viabilidad y el rendimiento celulares mediante recuentos de células, y estos valores se usan para generar suspensiones de hepatocitos humanos a la densidad de siembra apropiada (densidad de células viables = 2 x 106 células/ml). Se prepara una disolución de dosificación 2X en KHB precalentado (DMSO al 1%) (disolución con adiciones conocidas 200 µM: 20 µl de disolución madre de sustrato
20 (10 mM) en 980 µl de DMSO, disolución de dosificación 2X: 10 µl de disolución con adiciones conocidas 200 µM en 990 µl de KHB (2 µM tras la dilución).
Se añaden 50 µl de disolución de dosificación 2X precalentada a los pocillos y se añaden 50 µl de disolución de hepatocitos precalentada (2 X 106 células/ml) y se comienza la medición del tiempo. Entonces se incuba la placa a
25 37ºC. Se añaden 100 µl de patrón interno que contiene acetonitrilo a cada uno de los pocillos tras la finalización del tiempo de incubación (0, 15, 30, 60 y 120 minutos), se mezcla suavemente y se añaden 50 µl de disolución de hepatocitos precalentada (2 X 106 células/ml). Al final de la incubación, se determina la viabilidad celular. Se centrifugan las muestras a 4000 rpm durante 15 minutos a 4ºC, se diluyen dos veces los sobrenadantes con agua ultrapura y se analizan los niveles de compuesto mediante CL-EM/EM.
30 Evaluación de la solubilidad en agua
Puede someterse a prueba la solubilidad en agua tal como sigue: Se prepara una disolución madre 10 mM del análogo de sangliferina en DMSO al 100% a temperatura ambiente. Se llevan alícuotas de 0,01 ml por triplicado a
35 0,5 ml con o bien disolución de PBS 0,1 M, pH 7,3 o bien DMSO al 100% en viales de color ámbar. Se agitan las disoluciones 0,2 mM resultantes, a temperatura ambiente en un agitador IKA® vibrax VXR durante 6 h, seguido por la transferencia de las disoluciones o suspensiones resultantes a tubos Eppendorf de 2 ml y centrifugación durante 30 min a 13200 rpm. Entonces se analizan alícuotas del fluido sobrenadante mediante el método de CL-EM tal como se describió anteriormente.
40 Alternativamente, puede someterse a prueba la solubilidad en PBS a pH 7,4 tal como sigue: Se genera una curva de calibración diluyendo los compuestos de prueba y los compuestos control hasta 40 µM, 16 µM, 4 µM, 1,6 µM, 0,4 µM, 0,16 µM, 0,04 µM y 0,002 µM, con MeOH al 50% en H2O. Entonces se diluyen adicionalmente los puntos patrón 1:20 en MeOH:PBS 1:1. Las concentraciones finales tras la dilución 1:20 son 2000 nM, 800 nM, 200 nM, 80
45 nM, 20 nM, 8 nM, 2 nM y 1 nM. Entonces se mezclan los patrones con el mismo volumen (1:1) de patrón interno que contiene ACN (hidroximacrociclo, 6). Se centrifugan las muestras (5 min, 12000 rpm), luego se analizan mediante CL/EM.
Disolución (µl)
MeOH/H2O (1:1) (µl) Disolución de trabajo (µM) Disolución (µl) MeOH/ Tampón (1:1) (µl) Disolución final (nM)
10 mM
10 240 → 400
400 µM
50 450 → 40 20 380 → 2000
20
480 → 16 20 380 → 800
40 µM
50 450 → 4 20 380 → 200
16 µM
50 450 → 1,6 20 380 → 80
4 µM
50 450 → 0,4 20 380 → 20
1,6 µM
50 450 → 0,16 20 380 → 8
0,4 µM
50 450 → 0,04 20 380 → 2
0,04 µM
50 950 → 0,002 20 380 → 1
50 Se preparan los compuestos de prueba como disoluciones madre en DMSO a una concentración de 10 mM. Se diluyen las disoluciones madre por duplicado en PBS, pH 7,4 en tubos Eppendorf de 1,5 ml a una concentración objetivo de 100 µM con una concentración de DMSO final del 1% (por ejemplo 4 µL de disolución madre de DMSO 10 mM en 396 µl de tampón fosfato 100 mM). Entonces se agitan suavemente los tubos de muestra durante 4 horas a temperatura ambiente. Se centrifugan las muestras (10 min, 15000 rpm) para precipitar las partículas no disueltas. Se transfieren los sobrenadantes a tubos nuevos y se diluyen (el factor de dilución para el artículo de prueba individual se confirma mediante el nivel de señal del compuesto en el instrumento analítico aplicado) con PBS. Entonces se mezclan las muestras diluidas con el mismo volumen (1:1) de MeOH. Se mezclan finalmente las muestras con el mismo volumen (1:1) de patrón interno que contiene ACN (hidroximacrociclo, 6) para análisis de CL-EM/EM.
Evaluación de la permeabilidad celular
Puede someterse a prueba la permeabilidad celular tal como sigue: Se disuelve el compuesto de prueba hasta 10 mM en DMSO y entonces se diluye adicionalmente en tampón para producir una concentración de dosificación final de 10 µM. También se incluye el marcador de fluorescencia amarillo Lucifer para monitorizar la integridad de la membrana. Entonces se aplica el compuesto de prueba a la superficie apical de monocapas de células Caco-2 y se mide la permeación del compuesto al interior del compartimento basolateral. Esto se realiza en el sentido inverso (de basolateral a apical) para investigar el transporte activo. Se usa CL-EM/EM para cuantificar los niveles tanto de compuestos de prueba como control patrón (tal como propanolol y acebutolol).
Evaluación in vivo de la farmacocinética
También pueden usarse ensayos in vivo para medir la biodisponibilidad de un compuesto. Generalmente, un compuesto se administra a un animal de prueba (por ejemplo ratón o rata) tanto por vía intravenosa (i.v.) como por vía oral (v.o.) y se extraen muestras de sangre a intervalos regulares para examinar cómo varía la concentración plasmática del fármaco a lo largo del tiempo. Puede usarse la evolución en el tiempo de la concentración plasmática a lo largo del tiempo para calcular la biodisponibilidad absoluta del compuesto como porcentaje usando modelos convencionales. A continuación se describe un ejemplo de un protocolo típico.
Se administró a ratones 1, 10 ó 100 mg/kg del compuesto de la invención o el compuesto original por vía i.v. o por
v.o. Se extraen muestras de sangre a 5, 10, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240, 360, 420 y 2880 minutos y se determina la concentración del compuesto de la invención o el compuesto original en la muestra mediante HPLC. Entonces pueden usarse la evolución en el tiempo de las concentraciones plasmáticas para obtener parámetros clave tales como el área bajo la curva de concentración plasmática-tiempo (AUC – que es directamente proporcional a la cantidad total de fármaco sin cambiar que alcanza la circulación sistémica), la concentración plasmática del fármaco máxima (pico), el tiempo en que se produce la concentración plasmática del fármaco máxima (tiempo de pico); los factores adicionales que se usan en la determinación precisa de la biodisponibilidad incluyen: la semivida terminal del compuesto, el aclaramiento corporal total, el volumen de distribución en estado estacionario y % de F. Entonces se analizan estos parámetros mediante métodos compartimentales y no compartimentales para dar una biodisponibilidad en porcentaje calculada, para un ejemplo de este tipo de método véase Egorin et al. 2002, y referencias en el mismo.
Evaluación in vivo de farmacocinética oral e intravenosa (método específico)
Para determinar análogos de sangliferina, se analiza sangre completa. Los compuestos se formulan en el 5% de etanol / el 5% de Cremophor EL / el 90% de solución salina para administración tanto por v.o. como por vía i.v. Se administra a grupos de 3 ratones CD1 macho o bien 1 mg/kg por vía i.v. o bien 5 ó 10 mg/kg por v.o. Se extraen muestras de sangre (40 µl) a través de la vena safena, antes de la administración y a las 0,25, 0,5, 2, 8 y 24 horas, y se diluyen con una cantidad igual de dH2O y se colocan en hielo seco inmediatamente. Se almacenan las muestras a -70ºC hasta el análisis. Se determina la concentración del compuesto de la invención o compuesto original en la muestra mediante CL-EM tal como sigue: se añaden 20 µl de sangre:H2O (1:1, v/v)/muestra PK con 20 µl de patrón interno (hidroximacrociclo, 6) a 20 µl de disolución de trabajo 100 ng/ml/MeOH y 150 µl de ACN, se agita con vórtex durante 1 minuto a 1500 rpm, y se centrifuga a 12000 rpm durante 5 min. Entonces se inyecta el sobrenadante en CL-EM/EM. Se representa gráficamente la evolución en el tiempo de las concentraciones en sangre y se usa para obtener el área bajo la curva de concentración en sangre completa-tiempo (AUC – que es directamente proporcional a la cantidad total de fármaco sin cambiar que alcanza la circulación sistémica). Estos valores se usan para generar parámetros PK cuando sea posible.
Evaluación in vitro de la citotoxicidad
Se hacen crecer células Huh-7 y HepG2 obtenidas de la ATCC en medios esenciales modificados por Dulbecco (DMEM) que contienen suero bovino fetal (FBS) al 10%, penicilina-estreptomicina (pen-estrep) al 1% y glutamina al 1%; mientras que se hacen crecer células CEM (células de leucemia de células T humanas obtenidas de la ATCC) en medio RPMI 1640 con FBS al 10%, pen-estrep al 1% y glutamina al 1%. Se aíslan CMSP humanas recientes de sangre completa obtenida al menos de dos donantes examinados normales. Brevemente, las células de sangre periférica se sedimentan/lavan 2-3 veces mediante centrifugación a baja velocidad y resuspensión en PBS para eliminar las plaquetas contaminantes. Las células sanguíneas lavadas se diluyen entonces 1:1 con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (D-PBS) y se estratifican sobre 14 ml de medio de separación de linfocitos (LSM; crecimiento celular realizado por Mediatech, Inc.; densidad 1,078+/-0,002 g/ml; N.º de catálogo 85-072-CL) en un tubo de centrífuga de 50 ml y se centrifugan durante 30 minutos a 600 X g. Se aspiran suavemente las CMSP dispuestas en bandas de la superficie de contacto resultante y posteriormente se lavan 2X con PBS mediante centrifugación a baja velocidad. Tras el lavado final, se cuentan las células mediante exclusión con azul de tripano y se resuspenden a 1 x 107 células/ml en RPMI 1640 complementado con suero bovino fetal (FBS) al 15%, Lglutamina 2 mM, PHA-P 4 µg/ml. Se permite incubar las células durante 48-72 horas a 37ºC. Tras la incubación, se centrifugan las CMSP y se resuspenden en RPMI 1640 con FBS al 15%, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 µg/ml, gentamicina 10 µg/ml e IL-2 humana recombinante 20 U/ml.
Se evalúa la citotoxicidad del compuesto sometiendo a prueba concentraciones semilogarítmicas de cada compuesto por triplicado contra las células descritas anteriormente. El medio que contenía células solo sirve como control celular (CC). Se siembran células Huh-7 y HepG2 en placas de 96 pocillos a una concentración de 5 x 103 células por pocillo. Al día siguiente, se aspiran los medios y se añaden 100 µl de medios correspondientes que contienen FBS al 5%. Se preparan diluciones del fármaco de prueba a una concentración 2X en tubos de microtitulación y se colocan 100 µl de cada concentración en los pocillos apropiados en un formato convencional. Tras 72 horas, se procesan las células para la evaluación de la citotoxicidad.
Se diluyen CMSP en medio reciente y se siembran en los pocillos interiores de una microplaca de 96 pocillos de fondo redondo a 5 x 104 células/pocillo en un volumen de 100 l. De manera similar, se siembran en placa células CEM a 1 x 104 células/pocillo. Entonces, se añaden 100 µl de preparaciones 2X de los fármacos de prueba en los pocillos apropiados en un formato convencional. Se mantienen los cultivos durante de seis a siete días y entonces se procesan para la determinación de la citotoxicidad.
La citotoxicidad se determina usando el kit de ensayo de integridad de membrana homogéneo CytoTox-ONE™ (Promega). El ensayo mide la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) de células con membranas dañadas en un formato fluorométrico homogéneo. La LDH liberada al medio de cultivo se mide con un ensayo enzimático acoplado que da como resultado la conversión de resazurina en un producto de resorufina fluorescente. La cantidad de fluorescencia producida es proporcional al número de células lisadas. Se aplican seis concentraciones diluidas en serie de cada compuesto a las células para obtener cuando sea aplicable los valores de CT50 (concentración tóxica del fármaco que disminuye la viabilidad celular en un 50%) y CT90 (concentración tóxica del fármaco que disminuye la viabilidad celular en un 90%).
Evaluación in vitro de la inhibición de transportadores MDR1 y MRP2
Para evaluar la inhibición y la activación de los transportadores MDR1 (glicoproteína P 1) y MRP2, puede usarse un ensayo de ATPasa in vitro de Solvo Biotechnology Inc. (Glavinas et al., 2003). Se incuban los compuestos (a 0,1, 1, 10 y100 µM) con vesículas de membrana MDR1 o MRP2 tanto en ausencia como en presencia de vanadato para estudiar la posible activación de ATPasa. Además, se realizan incubaciones similares en presencia de verapamilo/sulfasalazina con el fin de detectar la posible inhibición de la actividad ATPasa del transportador. La actividad ATPasa se mide cuantificando el fosfato inorgánico espectrofotométricamente. La activación se calcula a partir del aumento sensible a vanadato en la actividad ATPasa. La inhibición se determina mediante la disminución en la actividad ATPasa mediada por verapamilo/sulfasalazina.
Evaluación in vitro de la inhibición de transportadores Pgp usando células MDCK
Para evaluar la inhibición del transportador glicoproteína P (Pgp/MDR1), se usó un ensayo de ATPasa in vitro de Cyprotex. Se usaron células MDR1-MDCK obtenidas del NIH (Rockville, MD, EE.UU.). Tras el cultivo, se prepararon las monocapas aclarando las superficies tanto basolateral como apical dos veces con tampón a pH 7,4 y 37ºC. Entonces se incubaron las células con tampón a pH 7,4 en los compartimentos tanto apical como basolateral durante 40 min a 37ºC y el 5% de CO2 con una humedad relativa del 95% para estabilizar los parámetros fisiológicos. Para el estudio de apical a basolateral (A-B), se retiró el tampón a pH 7,4 del compartimento apical y se sustituyó por disoluciones de dosificación de loperamida antes de colocarse en las placas “complementarias”. Se prepararon las disoluciones diluyendo loperamida en DMSO con tampón para dar una concentración final de loperamida de 5 µM (la concentración final de DMSO se ajusta al 1%). También se incluyó el marcador de integridad fluorescente amarillo Lucifer en la disolución de dosificación. Se realizó el experimento en presencia y ausencia del compuesto de prueba (aplicado a los compartimentos tanto apical como basolateral). Para el estudio de basolateral a apical (B-A), se colocó el sustrato de la glicoproteína P, loperamida (concentración final = 5 µM) en el compartimento basolateral. Se realizó el experimento en presencia y ausencia del compuesto de prueba (aplicado a los compartimentos apical y basolateral). Se llevaron a cabo incubaciones en una atmósfera del 5% de CO2 con una humedad relativa del 95% a 37ºC durante 60 min. Tras el periodo de incubación, se retiró la placa complementaria y se diluyeron las muestras apical y basolateral para su análisis mediante CL-EM/EM. Se realizó una única determinación de cada concentración de compuesto de prueba. En cada placa, también se examinó un inhibidor de control positivo. Se evaluó el compuesto de prueba a 0,1, 0,3, 1, 3, 10, 30 y 50 µM. Se comprobó la integridad de las monocapas a lo largo de todo el experimento monitorizando la permeación de amarillo Lucifer usando análisis fluorimétrico. Tras el análisis, se calculó una CI50 (es decir, concentración de inhibidor (fármaco de prueba) que logra la mitad del efecto de inhibición máxima).
Evaluación in vitro de inhibición de transportadores de captación
Para evaluar la inhibición de los transportadores de captación OAT1B1 y OAT1B3, se usó un ensayo de transportador de captación in vitro de Solvo Biotechnology Inc. Se realizaron experimentos de captación con artículo de prueba (AP) a 0,068, 0,2, 0,62, 1,8, 5,5, 16,7 y 50 µM, en células CHO que expresan de manera estable los transportadores SLC humanos OATP1B1 y OATP1B3. Se usó la línea celular parental CHO-K como control negativo. Se sembraron en placa células (1 x 105 en 200 µl de mezcla 1:1 de medio de Eagle modificado por Dulbecco y DMEM-F12 de Ham (F-12, Lonza, Nueva Jersey, EE.UU.) complementado con butirato de sodio 5 mM) en placas de cultivo tisular de 96 pocillos convencionales y se incubaron 24 horas antes del experimento a 37ºC en una atmósfera del 5% de CO2 y el 95% de aire. Antes de los experimentos, se aspiró el medio mediante succión a vacío, se lavaron las células con 2 x 100 µl de tampón de Krebs-Henseleit, pH 7,3 (preparado a partir de Sigma chemicals, Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Se llevaron a cabo los experimentos de captación a 37ºC en 50 µl de tampón de Krebs-Henseleit (pH 7,3) que contenía el sustrato de sonda y el AP o disolvente, respectivamente. La concentración del disolvente orgánico fue igual en cada pocillo y no superó el 1% v/v. El sustrato de sonda para el ensayo de OATP1B1 fue E3S (0,1 µM) y para el ensayo de OATP1B3 fue Fluo-3 (10 µM). Se determinó la cantidad translocada de sustrato de sonda para cada pocillo en cpm. Se calcularon las actividades relativas a partir de la ecuación:
% de actividad = (A-B)/(C-D)x100
En la que A= cantidad translocada de sustrato en presencia de AP en células transfectadas, B= cantidad translocada de sustrato en presencia de AP en células parentales, C= cantidad translocada de sustrato en presencia de disolvente en células transfectadas y D= cantidad translocada de sustrato en presencia de disolvente en células parentales. La CI50 se definió como la concentración de AP necesaria para inhibir el transporte del sustrato de sonda en un 50%. La CI50 se obtuvo de la ecuación logística de tres parámetros; una curva ajustada en la representación gráfica de la actividad relativa frente a la concentración de AP mediante regresión no lineal.
Evaluación in vitro de inhibición de transportadores de flujo de salida
Para evaluar la inhibición de los transportadores de flujo de salida MRP2, MRP3 y BSEP, se usó un ensayo de transportador vesicular in vitro de Solvo Biotechnology Inc. Se incubaron los artículos de prueba (AP) (a 0,068, 0,2, 0,62, 1,8, 5,5, 16,7 y 50 µM) con vesículas de membrana de transportador de flujo de salida (Solvo Biotechnology Inc.) tanto en ausencia como en presencia de ATP 4 mM para distinguir entre captación mediada por transportador y difusión pasiva de AP al interior de las vesículas. En el caso de los transportadores MRP2 y MRP3, se llevaran a cabo las reacciones en presencia de glutatión 2 mM. Se preincubaron las mezclas de reacción durante diez minutos a 37ºC. Se iniciaron las reacciones mediante la adición de 25 µl de MgATP 12 mM (concentración final de 4 mM en el ensayo) o tampón de ensayo para los controles de fondo. Se detuvieron las reacciones añadiendo 200 µl de tampón de lavado helado y seguido inmediatamente por filtración en filtros de fibra de vidrio en un formato de 96 pocillos (placa de filtro). Se añadió tampón de centelleo a la placa de filtro lavada y secada y posteriormente se realizó el recuento de centelleo. Se sometieron los sustratos de sonda a taurocolato (2 µM) para las vesículas de BSEP y a E217βG (1 µM) para las vesículas de MRP2 y MRP3. Para todos los pocillos, se determinó la cantidad translocada del sustrato de sonda en unidades de cpm. Se calcularon las actividades relativas con la siguiente ecuación:
% de actividad = (A-B)/(C-D)x100, en la que A= cantidad translocada de sustrato en presencia de AP y ATP, B= cantidad translocada de sustrato en presencia de AP, C= cantidad translocada de sustrato en presencia de disolvente y ATP y D= cantidad translocada de sustrato en presencia de disolvente. La CI50 se definió como la concentración de AP necesaria para inhibir el transporte del sustrato de sonda en un 50%. La CI50 se obtuvo de la ecuación logística de tres parámetros; una curva ajustada en la representación gráfica de la actividad relativa frente a la concentración de AP mediante regresión no lineal.
Ensayo in vitro para evaluar la actividad antiviral contra VIH
Puede someterse a prueba la eficacia antiviral contra VIH tal como sigue: Se aíslan macrófagos y linfocitos T CD4+ derivados de sangre tal como se describió anteriormente (Bobardt et al., 2008). Brevemente, se purificaron CMSP humanas de sangre reciente obteniendo bandas en Ficoll-Hypaque (30 min, 800 g, 25ºC). Se purificaron células T CD4+ humanas a partir de las CMSP mediante selección positiva con perlas Dynabead anti-CD4 y posterior liberación usando Detachabead. Se cultivaron las células en medio RPMI 1640 (Invitrogen) complementado con FCS al 10%, MEM-aminoácidos, L-glutamina, MEM-vitaminas, piruvato de sodio y penicilina más estreptomicina y se activaron posteriormente con el superantígeno bacteriano enterotoxina B de Staphylococcus (SEB; 100 ng/ml) y células CMSP destruidas con mitomicina C de otro donante (razón de células CMSP:CD4 10:1). Tres días tras la estimulación, se repartieron las células 1:2 en medio que contenía IL-2 (concentración final 200 unidades/ml).
Entonces se repartieron los cultivos 1:2 cada 2 días en medio de IL-2 y se infectaron con VIH a los 7 días tras la estimulación. Para generar macrófagos humanos primarios, se purificaron monocitos a partir de CMSP humanas mediante selección negativa y se activaron y se cultivaron a una concentración celular de 106/ml en DMEM, complementado con FCS al 10%, MEM-aminoácidos, L-glutamina, MEM-vitaminas, piruvato de sodio y penicilina (100 unidades/ml), estreptomicina (100 mg/ml) y factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) humano recombinante 50 ng/ml y se mantuvieron a 37ºC en una atmósfera humidificada complementada con el 5% de CO2. Para obtener macrófagos derivados de monocitos, se permitió que las células se adhirieran al plástico y se cultivaron durante 6 días para permitir la diferenciación.
Se incubaron células HeLa CD4+, células de Jurkat, linfocitos T de sangre periférica CD4+ activados y macrófagos
(500.000 células/100 µl) con pNL4.3GFP (virus X4) o pNL4.3-BaL-GFP (virus R5) (100 ng de p24) en presencia de concentraciones crecientes del artículo de prueba. Cuarenta y ocho horas después, se puntuó la infección analizando el porcentaje de células positivas para GFP mediante FACS y se calculó la CE50.
Ensayo in vitro para evaluar la actividad antiviral contra VHB
Puede someterse a prueba la eficacia antiviral contra VHB tal como sigue: Se siembran en placa células HepG2
2.2.15 en placas de microtitulación de 96 pocillos. Tras 16-24 horas, se lava la monocapa confluente de células HepG2 2.2.15 y se sustituye el medio por medio completo que contiene diversas concentraciones de un compuesto de prueba por triplicado (por ejemplo, seis concentraciones semilogarítmicas). Tres días después, se sustituye el medio de cultivo por medio reciente que contiene los compuestos de prueba diluidos de manera apropiada. Seis días tras la administración inicial del compuesto de prueba, se recoge el sobrenadante del cultivo celular, se trata con pronasa y luego se usa en un ensayo de qPCR TaqMan cuantitativo en tiempo real. Se detecta el ADN de VHB amplificado por PCR en tiempo real monitorizando los aumentos en las señales de fluorescencia que resultan de la degradación exonucleotídica de una molécula de sonda fluorescente extinguida que se hibrida con el ADN de VHB amplificado. Para cada amplificación por PCR se genera simultáneamente una curva patrón usando diluciones de ADN de VHB purificado. Se calcula la actividad antiviral a partir de la reducción en los niveles de ADN de VHB (CI50). Entonces se emplea un ensayo de captación de colorante para medir la viabilidad celular, que se usa para calcular la toxicidad (CT50). Se calcula el índice terapéutico (IT) como CT50/CI50.
Ensayo de reacción linfocitaria mixta (MLR) in vitro para la evaluación de la actividad inmunosupresora
Se sometió a prueba la actividad inmunosupresora tal como sigue: Se purificaron poblaciones de células mononucleares de sangre periférica (CMSP) de la sangre de dos donantes voluntarios no relacionados normales (A y B), usando centrifugación en Histopaque. Se contaron las células y se sembraron en placa a 1 x 105 células por pocillo en placas de 96 pocillos en medios RPMI, con complementos y suero de AB humano al 2%.
Las condiciones de cultivo incluyeron: poblaciones de células A y B solas y población de células A y B mixta en ausencia o presencia de compuestos de prueba, cada uno a 6 concentraciones diferentes. Se sometieron a prueba los compuestos a dosis que oscilaban entre 10 µM y 0,0001 µM en incrementos de 1 log. Los pocillos control contenían una concentración comparable de vehículo (DMSO al 0,5%) a la presente en los pocillos con compuesto de prueba. Se establecieron los cultivos por triplicado en una placa de 96 pocillos y se incubaron a 37ºC en el 5% de CO2 en una atmósfera humidificada. Se añadió 3H-timidina en el día 6 tras establecer el ensayo y se recogieron 24 h después. Entonces se compararon los niveles de proliferación entre las diferentes condiciones de cultivo.
Se calculó la capacidad de cada dilución de compuesto de prueba para inhibir la proliferación en la MLR como inhibición en porcentaje. Esto permitió una estimación de la CI50 (concentración de compuesto de prueba que dio como resultado una reducción del 50% de los recuentos por minuto). Con el fin de calcular la CI50, se transformó el eje X en una escala logarítmica. Se usó regresión no lineal para ajustar a los puntos de datos medios. Se seleccionó una pendiente variable sigmoidea.
Análisis de ELISA de la interacción Cyp-NS5A.
Se usó este ensayo para medir la alteración de complejos Cyp-NS5A, lo que puede usarse para mostrar la potencia de interacción con ciclofilina D. Brevemente, se llevó a cabo la producción y purificación de las proteínas recombinantes GST, GST-CypD y Con1 NS5A-His tal como se describió anteriormente (Chatterji et al., 2010). Se recubrieron placas en tiras de 8 pocillos Nunc MaxiSorb con GST o GST-CypD durante 16 h a 4ºC y se bloquearon. Se añadió NS5A-His recombinante (1 ng/ml) a los pocillos en 50 µl de tampón de unión (Tris 20 mM, pH 7,9, NaCl 0,5 M, glicerol al 10%, DTT 10 mM y NP-40 al 1%) durante 16 h a 4ºC. Se detectó posteriormente NS5A-His capturada usando anticuerpos de ratón anti-His (1 µg/ml) (anti-6xHis, Clontech) y anticuerpos de conejo antifosfatasa-peroxidasa del rábano (HRP) de ratón (dilución 1:1000). Todos los experimentos se realizaron dos veces usando dos lotes diferentes de proteínas recombinantes CypD y NS5A.
Análisis anti-PPIasa de la inhibición de ciclofilina
Se describe una metodología alternativa para analizar la interacción con ciclofilinas tal como sigue: Se determinó la
actividad PPIasa de CypA o D recombinante, producida por la escisión por trombina de GST-CypA o D, siguiendo la tasa de hidrólisis de N-succinil-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilida mediante quimiotripsina. La quimiotripsina sólo hidroliza la forma trans del péptido, y la hidrólisis de la forma cis, cuya concentración se maximiza usando una disolución madre disuelta en trifluoroetanol que contiene LiCl 470 mM, está limitada por la tasa de isomerización cis5 trans. Se equilibró CypA o D durante 1 h a 5ºC con el artículo de prueba seleccionado usando una concentración de fármaco que oscila entre 0,1 y 20 nM. La reacción comenzó mediante la adición del péptido, y se monitorizó espectrofotométricamente el cambio en la absorbancia a 10 puntos de datos por segundo. Se restaron las tasas de hidrólisis del blanco (en ausencia de CypA o D) de las tasas en presencia de CypA o D. Se analizaron las tasas iniciales de la reacción enzimática mediante análisis de regresión de primer orden de la evolución en el tiempo del
10 cambio en la absorbancia.
Ejemplos
Ejemplo 1 -Construcción de un mutante de deleción de sfaA de Streptomyces sp. A92-308110 (DSM9954)
15
1.1 Construcción del constructo de deleción de sfaA
Se escindió el fragmento de EcoRV-StuI de ∼7 kb del cósmido TL3006 (SEQ ID NO. 3) que engloba sfaA (posición de nucleótido 14396-21362, número de registro de secuencia de NCBI, FJ809786) mediante digestión con EcoRV y
20 StuI y se ligó el fragmento aislado resultante directamente en pKC1139 que se había digerido previamente con EcoRV y se trató con fosfatasa alcalina de gamba (Roche). Este plásmido se denominó pSGK268.
Se realizó una deleción en marco del gen sfaA contenido dentro de este clon usando el kit de recombinación Red/ET suministrado por Gene Bridges (número de catálogo K006).
25
imagen17
30 Se usaron dos oligonucleótidos, SfaA17161f y SfaA17825r para amplificar el marcador de neomicina del ADN de molde FRTPGK-gb2-neo-FRT suministrado en el kit usando la ADN polimerasa de KOD. Se aisló el producto amplificado resultante de ∼1,7 kb mediante electroforesis en gel y se purificó del gel con resina QiaEX.
Se transformó el plásmido pSGK268 en E. coli DH10B usando técnicas convencionales y se seleccionó en placas
35 que contenían apramicina (50 µg/ml). La introducción del constructo de deleción se realizó esencialmente siguiendo el protocolo del kit de Gene Bridges. Se hizo crecer una única colonia durante la noche en 2TY-apramicina (50 µg/ml) y se transformó con el plásmido pRedET (tet) y se seleccionó en apramicina (50 µg/ml) y tetraciclina (3 µg/ml) a 30ºC. Se usó una única colonia para preparar un cultivo durante la noche de esta cepa en 3 ml de 2TYapramicina (50 µg/ml) y tetraciclina (3 µg/ml) a 30ºC. Se usaron 0,5 ml de este cultivo para inocular 10 ml de 2TY
40 apramicina (50 µg/ml) y tetraciclina (3 µg/ml) a 30ºC y se hicieron crecer hasta una DO600nm ∼0,5. Se transfirieron 1,4 ml de este cultivo a cada uno de 2 tubos Eppendorf y se añadieron 50 µl de arabinosa al 10% a un tubo para inducir la expresión de las proteínas de recombinación Red/ET. Se agitaron los tubos durante ∼1 hora a 37ºC. Se sedimentaron las células inducidas y no inducidas en una centrífuga de sobremesa y se lavaron dos veces con agua estéril fría, resuspendiendo y centrifugando para sedimentar las células cada vez. Se suspendieron los sedimentos
45 resultantes en aproximadamente 30-40 µl de agua y se mantuvieron en hielo. Se añadió el fragmento de alteración de 1,7 kb aislado previamente a los tubos inducidos y no inducidos y se transfirió a electrocubetas de 1 mm de Biorad en hielo. Se sometieron las muestras a electroporación (micropulsador de Biorad a 1,8 kV, constante de tiempo resultante ∼4 ms) y se añadió 1 ml de 2TY (sin antibióticos) y se mezcló para retirar las células de la cubeta. Se incubaron las células durante ∼3 horas a 37ºC con agitación (1100 rpm, termomezclador compacto Eppendorf)
50 antes de sembrar en placas con 2TY que contenía apramicina 50 µg/ml y kanamicina 25 µg/ml y se incubaron durante la noche a 37ºC. Se dispusieron las colonias de las placas de muestra inducidas en franjas sobre placas con 2TY que contenía kanamicina a 50 µg/ml para purificar y confirmar la introducción del casete de resistencia a kanamicina. Se usó PCR en colonias de bacterias individuales para confirmar la introducción del casete. Se prepararon plásmidos a partir de estos cultivos y se digirieron para confirmar el plásmido esperado pSGK270.
55 Entonces se digirieron los plásmidos con NsiI para eliminar el fragmento marcador, y se volvió la ligar el resto para producir el constructo de deleción en marco de sfaA pSGK271.
1.2 Conjugación de Streptomyces sp. A92-308110 (DSM9954) e introducción de una deleción de sfaA
Se transformó el plásmido pSGK271 en E. coli ET12567 pUZ8002 usando técnicas convencionales y se seleccionó en placas con 2TY que contenía apramicina (50 µg/ml), kanamicina (25 µg/ml) y cloranfenicol (10 µg/ml). Se inoculó la cepa resultante en 3 ml de 2TY líquido que contenía apramicina (50 µg/ml), kanamicina (25 µg/ml) y cloranfenicol (10 µg/ml) y se incubó durante la noche a 37ºC, 250 rpm. Se usaron 0,8 ml de este cultivo para inocular 10 ml de 2TY líquido que contenía apramicina (50 µg/ml), kanamicina (25 µg/ml) y cloranfenicol (10 µg/ml) en un tubo Falcon de 50 ml y se incubó a 37ºC, 250 rpm, hasta que se alcanzó una DO600nm ∼0,5. Se centrifugó el cultivo resultante a 3500 rpm durante 10 minutos a 4ºC, se lavó dos veces con 10 ml de medios 2TY usando centrifugación para sedimentar las células tras cada lavado. Se resuspendió el sedimento resultante en 0,5 ml de 2TY y se mantuvo en hielo antes de su uso. Se cronometró este procedimiento para que coincidiera con la preparación completa de esporas de Streptomyces descrita a continuación.
Se recogieron esporas de Streptomyces sp. A92-308110 (DSM9954) (Biot-4370) de una placa confluente de 1-2 semanas resuspendiendo en ∼3 ml de glicerol al 20%. Se centrifugaron las esporas (5000 rpm, 10 minutos a temperatura ambiente) y se lavaron dos veces con tampón TES 50 mM antes de resuspender en 1 ml de tampón TES 50 mM y repartir entre 2 tubos Eppendorf. Se sometieron a choque térmico estos tubos a 50ºC durante 10 minutos en un baño de agua antes de añadir 0,5 ml de 2TY e incubar en un termomezclador compacto Eppendorf a 37ºC durante 4-5 horas.
Se mezclaron las E. coli ET12567 pUZ8002 pSGK271 y Biot-4370 preparadas a razones de 1:1 (250 µl de cada cepa) y 1:3 (100 µl de E. coli) y se extendieron inmediatamente sobre placas R6 y se transfirieron a un incubador a 37ºC. Tras aproximadamente 2 horas de incubación se recubrieron estas placas con 2 ml de agua estéril que contenía ácido nalidíxico para dar una concentración final en placa de 25 µg/l. Se devolvieron las placas al incubador a 37ºC durante la noche antes de recubrir con 2 ml de agua estéril que contenía apramicina para dar una concentración final en placa de 20-25 µg/l. Se dispusieron en parches las colonias exconjugantes que aparecieron tras ∼4-7 días en medios ISP4 que contenían apramicina (25 µg/L) y ácido nalidíxico (25 µg/L) y se incubaron a 37ºC. Una vez que se observó crecimiento micelial adecuado, se volvieron a disponer en parches las colonias en medios ISP4 que contenían apramicina (25 µg/L) a 37ºC y se permitió que esporularan. Entonces se subcultivaron las cepas tres veces (para promover la eliminación del plásmido sensible a temperatura) disponiendo en parches en ISP4 (sin antibiótico) e incubando a 37ºC durante 3-4 días. Finalmente se dispusieron en parches las cepas en ISP4 y se incubaron a 28ºC para permitir la esporulación completa (5-7 días). Se recogieron las esporas y se realizaron diluciones en serie en placas con ISP4 a 28ºC para permitir la selección de colonias individuales. Se dispusieron en parches doblemente las colonias individuales esporuladas en placas con ISP4 con o sin apramicina (25 µg/l) para confirmar la pérdida del plásmido y se permitió que crecieran ∼7 días antes de someter a prueba la producción de sangliferinas.
1.3 Examen de cepas para la producción de sangliferinas en tubos Falcon
Se usó un único tapón de agar de ∼7 mm de una cepa bien esporulada para inocular 7 ml de medios SM25-3 estériles y se incubó a 27ºC, 200 rpm, en un agitador con un desplazamiento vertical de 2”. Tras 48 horas de crecimiento, se transfirieron 0,7 ml de este cultivo a un tubo Falcon esterilizado que contenía 7 ml de medios SGP2 con resina HP20 al 5%. Se hicieron crecer los cultivos a 24ºC, 300 rpm, en un incubador con agitación con desplazamiento vertical de 1 pulgada durante 5 días antes de la recogida. Se retiraron 0,8 ml de cultivo bacteriano y se añadieron alícuotas a un tubo Eppendorf de 2 ml, asegurándose de la dispersión adecuada de la resina por todo el cultivo antes de añadir las alícuotas. Se añadieron 0,8 ml de acetonitrilo y 15 µl de ácido fórmico y se mezcló el tubo durante aproximadamente 30 minutos. Se aclaró la mezcla mediante centrifugación y se retiraron 170 µl del extracto en un vial de HPLC y se analizaron mediante HPLC.
1.4 Análisis de las cepas para determinar la reversión al tipo natural o fenotipo de sfaA.
Se analizaron extractos de cepas mediante HPLC. Las cepas que producían sangliferina A y B no se analizaron adicionalmente, ya que habían revertido al tipo natural. Las cepas que carecían de producción de sangliferina A y B mostraron pequeños niveles (∼1-2 mg/l) de un pico con un tiempo de retención de 6,5 minutos que presentó la sangliferina como un cromóforo. El análisis mediante CL-EM indicó que este pico tenía una m/z 1073, -16 unidades de la m/z esperada de sangliferina. Se postuló que este pico se debía a la incorporación de fenilalanina en ausencia de meta-hidroxitirosina.
Posteriormente se hicieron crecer de nuevo ocho cepas que mostraron pérdida de producción de sangliferina para evaluar si la posible mutación de sfaA podía complementarse químicamente permitiendo un procedimiento mutasintético para obtener sangliferinas novedosas. Se hicieron crecer las cepas en medios de siembra SM25-3 durante 48 horas antes de transferir a los medios de producción SGP2 con resina al 5%. Tras un crecimiento adicional de 24 horas se alimentaron las cepas por triplicado con DL-meta-hidroxitirosina 2 mM (adición de 100 ul de una disolución 0,16 M en HCl 1 M) o L-fenilalanina 2 mM con una cepa no alimentada usada como control. También se alimentó a las cepas con ácido pipecólico (2 mM) en metanol) para potenciar los rendimientos de producto. Se recogieron las cepas tras un crecimiento adicional de 4 días y se extrajeron y analizaron mediante HPLC. Se mostró que la meta-hidroxitirosina complementaba completamente la mutación de sfaA y la adición de L-fenilalanina aumentaba los niveles del compuesto -16 uma. Se eligió la cepa Biot-4585 para estudiar adicionalmente como mutante de deleción de sfaA.
Ejemplo 2 – Otros métodos para la construcción del constructo de deleción de sfaA
Pueden usarse otros métodos para generar mutantes de deleción de sfaA. Los ejemplos incluyen mutantes de inactivación por inserción de sfaA (tal como ejemplo 12 del documento WO2010/034243). Esta cepa se generó tal como se describe en el documento WO2010/034243, y se le dio la designación de cepa BIOT-4452.
En un procedimiento alternativo para generar la deleción de sfaA, se usan dos oligonucleótidos
15209F 5’-CAGAGAATTCGCGGTACGGGGCGGACGACAAGGTGTC-3’ (SEQ ID NO. 4) y
17219R 5’-GCGCATGCATGTGCCGGTGCCGGTCCGCGAGCCGCTTGG-3’ (SEQ ID NO. 5)
para amplificar una región de homología en el sentido de 5’ usando el cósmido TL3006 (SEQ ID NO. 3) como molde y la ADN polimerasa de KOD. Se trata el producto amplificado con la polinucleótido cinasa de T4 (NEB) y se clona en pUC18 que se ha desfosforilado mediante tratamiento con fosfatasa alcalina de gamba (Roche). Se comprueba el constructo resultante mediante digestión de restricción y se secuencia completamente para garantizar que se genera la secuencia deseada y que no se han introducido errores durante la amplificación con polimerasa. Se digiere este constructo con EcoRI y NsiI y se analizan los productos mediante electroforesis en gel. Se escinde la banda que contiene la secuencia deseada (es decir homología en el sentido de 5’ de ∼2 kb) del gel y se purifica usando procedimientos convencionales (resina QiaEX). Se usa una segunda serie de oligonucleótidos:
17766F 5’-CCTCATGCATCTGGAGGACGTCGCAGGTGAATTCTGGGCG-3’ (SEQ ID NO. 6) y
19763R 5’-GGGCAAGCTTCTCCTGGCTGAGCTTGAACATCG-3’ (SEQ ID NO. 7)
para amplificar una región de homología en el sentido de 3’ usando el cósmido TL3006 (SEQ ID NO. 3) como molde y la ADN polimerasa de KOD. Se trata el producto amplificado con la polinucleótido cinasa de T4 (NEB) y se clona en pUC18 que se ha desfosforilado mediante tratamiento con fosfatasa alcalina de gamba (Roche). Se analiza el constructo resultante mediante digestión de restricción y se secuencia completamente para garantizar que se genera la secuencia deseada y que no se han introducido errores durante la amplificación con polimerasa. Se digiere este constructo con HindIII y NsiI y se analizan los productos mediante electroforesis en gel. Se escinde la banda que contiene la secuencia deseada (es decir homología en el sentido de 3’ de ∼2 kb) del gel y se purifica usando procedimientos convencionales (resina QiaEX). Se digiere el vector pKC1139 con EcoRI y HindIII y se aísla el fragmento de vector grande mediante electroforesis en gel y se purifica mediante métodos convencionales (resina QiaEX). Entonces se clonan los fragmentos de homología en el sentido de 5’ y de 3’ aislados en este fragmento de pKC1139 en una ligación de tres vías para generar el constructo de deleción de sfaA deseado.
En un procedimiento alternativo adicional para la generación de un constructo de deleción de sfaA se usa síntesis génica comercial de constructo de deleción (es decir Genscript u otro proveedor) para generar un constructo que contiene la secuencia deseada (SEQ ID NO. 8). Se digiere este constructo adquirido usando BamHI y XbaI para escindir la secuencia de interés y se analizan los productos mediante electroforesis en gel. Se escinde la banda que contiene la secuencia deseada (∼4 kb) del gel y se purifica usando procedimientos convencionales. Se digiere el vector pKC1139 con BamHI y XbaI y se aísla el fragmento grande mediante electroforesis en gel y se purifica mediante métodos convencionales. Entonces se ligan entre sí los dos fragmentos aislados para generar el constructo de deleción de sfaA deseado.
Estos constructos de deleción de sfaA alternativos se introducen en Streptomyces sp. A92-308110 (DSM9954) mediante conjugación y selección para el cruzamiento secundario usando los métodos descritos en el ejemplo 1.2. El crecimiento y el análisis de las cepas construidas de esta forma también siguen los métodos descritos en el ejemplo 1.2.
Ejemplo 3 – Alimentación en serie de mutante de deleción de sfaA
Se prepararon reservas de esporas de un mutante con alteración en sfaA (BIOT-4452 o BIOT-4585) tras el crecimiento en medio MAM, ISP4, ISP3 o ISP2, y se conservaron en glicerol al 20% p/v en agua destilada y se almacenaron a -80ºC. Se prepararon cultivos vegetativos (cultivos de siembra) inoculando la reserva de esporas (1% v/v) en 7 ml de medio de siembra (medio SM25) en tubos de centrífuga de 50 ml con tapones de espuma. Se incubaron los tubos de cultivo a 27ºC, 250 rpm (desplazamiento vertical de 5 cm) durante 48 h. A partir del cultivo de siembra se transfirió un 10% (v/v) a 7 ml de medio de producción SGP-2 en tubos de centrífuga de 50 ml con tapones de espuma. Se llevó a cabo el cultivo a 24ºC y 300 rpm (desplazamiento vertical de 2,5 cm). Para la producción de análogos mutasintéticos de sangliferina, se añadieron 0,05 ml de una disolución 0,32 M (en HCl 1 N) del compuesto alimentado (mutasintón) a cada tubo a las 24 horas tras la inoculación para dar una concentración final de 2 mM. Adicionalmente, se añadieron 0,05 ml de una disolución 0,32 M de ácido piperázico (en metanol) a cada tubo a las 24 horas para dar una concentración final de 2 mM. Se continuó con el cultivo durante cuatro días
5 adicionales tras la alimentación.
Se extrajeron muestras transfiriendo 0,8 ml del caldo completo a un tubo Eppendorf tapado de 2 ml. Se añadieron 0,8 ml de acetonitrilo, junto con 0,015 ml de ácido fórmico. Entonces se agitó la mezcla durante 30 minutos en un dispositivo Vibrax. Entonces se centrifugó el tubo a 13000 rpm durante 10 minutos y se retiraron 0,15 ml del
10 sobrenadante para su análisis. Se analizaron los extractos tal como se describe en los Métodos generales.
La tabla 1 muestra los mutasintones que se alimentaron de esta forma, junto con los aductos de H+ y Na+ mediante CL-EM, la masa molecular prevista y el tiempo de retención de los productos mutasintéticos de sangliferina observados. Se muestran los picos principales, relacionados con los análogos de sangliferina A. En todos los casos,
15 también se observaron los picos de CL-EM para los análogos de sangliferina B (Masa -18).
Tabla 1
mutasintón alimentado
nombre del mutasintón [M-H]observada (m/z) [M+Na]+ observada (m/z) masa molecular (uma) tiempo de retención (minutos)
imagen18
ácido 2-amino-3-(3-fluoro-5hidroxifenil)propanoico 1106,4 1130,4 1107,4 5,7
2-amino-3-(3-fluoro-5hidroxifenil)propionato de metilo
1106,4 1130,4 1107,4 5,7
20 Ejemplo 4 – Aislamiento de 63-fluoro-sangliferina A, compuesto intermedio 14
Se llevó a cabo la fermentación tal como se describió en los Métodos generales utilizando 2-amino-3-(3-fluoro-5hidroxifenil)propanoato de metilo y ácido DL-piperázico como precursores, añadiéndose ambos a las 26 horas.
25 Tras la recogida, se reunieron los caldos de cultivo y se ajustaron a aproximadamente pH 3 con ácido fórmico y se centrifugaron (3300g) durante 25 min para separar las células y la resina del caldo clarificado. Se desechó el caldo clarificado tras haber confirmado el ensayo que estaba presente menos del 5% del compuesto objetivo. Se agitaron las células y la resina con 2 volúmenes de acetonitrilo durante 1 h usando un agitador magnético. Se recuperó el extracto de acetonitrilo o bien mediante centrifugación o bien permitiendo que se sedimentara por gravedad.
30 Entonces se realizó una segunda extracción con acetonitrilo de las células y la resina en las mismas condiciones. Se concentraron los extractos de acetonitrilo combinados hasta un volumen acuoso residual a presión reducida y luego se ajustaron a pH 6. Esto se extrajo dos veces con acetato de etilo y los extractos orgánicos combinados se llevaron hasta la sequedad a presión reducida para dar el producto en bruto final (1,3 g).
35 Se disolvió extracto en bruto (1,3 g) en acetato de etilo (2 ml) y se cargó en una columna de gel de sílice (10 x 2 cm) acondicionada con acetato de etilo (500 ml). Se eluyó la columna con acetato de etilo y luego con incrementos graduales en acetona (10%, 20%, 30%, etc., en acetato de etilo). Se recogieron fracciones de aproximadamente 250 ml y se identificó el compuesto objetivo mediante CL analítica, se combinaron y se llevaron hasta la sequedad. Se disolvió este material (278 mg) en metanol (1,8 ml) y se purificó mediante HPLC preparativa. Se usó una columna
40 Xterra MSC18 de Waters (10 micrómetros, 19 cm x 250 mm) con disolvente bombeado a 21 ml/min. El disolvente A fue agua y el disolvente B fue acetonitrilo. Se ejecutó la columna isocráticamente al 50% de B durante 6 minutos tras la inyección seguido por un gradiente hasta el 100% de B a los 30 minutos. Se identificaron las fracciones puras mediante HPCL-UV y se combinaron. Se llevaron estas fracciones hasta la sequedad a presión reducida para producir el compuesto objetivo como un sólido amorfo blanquecino (20 mg).
45
Ejemplo 5 – Síntesis de (2-(1,2-oxazinan-2-il)-2-oxoetil)fosfonato de dietilo
imagen19
A una disolución de 21-1 (ChemCollect, Alemania) (100 mg, 0,81 mmol), Et3N (246 mg, 2,43 mmol) en DCM seco (5 ml) se le añadió gota a gota cloruro de cloracetilo (138 mg, 1,22 mmol). Se agitó la mezcla de reacción a
5 temperatura ambiente durante 3 h, se vertió en agua helada y se extrajo con acetato de etilo. Se lavó la fase orgánica con salmuera y se secó sobre Na2SO4, se filtró, se concentró a vacío. Se usó el residuo (21-2) para la siguiente etapa sin purificación adicional. (123 mg, rendimiento del 90%).
Se agitó una mezcla de 21-2 (123 mg, 0,75 mmol) y fosfito de trietilo (250 mg, 1,50 mmol) a 140ºC durante 6 h. Se
10 enfrió la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente y se purificó mediante cromatografía ultrarrápida para producir 21.
Síntesis alternativa de (2-(1,2-oxazinan-2-il)-2-oxoetil)fosfonato de dietilo, 21
imagen20
Procedimiento general para la preparación de 21a-2
imagen21
20 A una disolución de t-BuOK (84,0 g, 0,75 mol) en tetrahidrofurano (2,0 l) se le añadió 21a-1 (50,0 g, 0,38 mol) en porciones a temperatura ambiente. Se agitó la mezcla durante 1 h a temperatura ambiente. Se añadió 1,4-dibromobutano (81,2 g, 0,38 mol) gota a gota a temperatura ambiente. Entonces se agitó la mezcla a 80ºC durante 16 h. Tras enfriar, se añadió agua (2000 ml), se extrajo la mezcla con acetato de etilo (2 x 1000 ml). Se secó
25 la fase orgánica combinada sobre Na2SO4 anhidro durante 16 h, tras filtración y concentración, se purificó el residuo mediante cromatografía en columna en gel de sílice (eluyente: éter de petróleo:acetato de etilo = de 100:1 a 10:1) para dar 21a-2 (57 g) como un aceite incoloro.
Procedimiento general para la preparación de 21a-3 30
imagen22
A una disolución de 21a-2 (55 g, 0,29 mol) en terc-butil metil éter, TBME (80 ml) se le añadió una disolución de HCl 4 N (600 ml, en TBME) a temperatura ambiente, se agitó la mezcla durante 3 h a temperatura ambiente. Se filtró el 35 sólido precipitado y se lavó con TBME (50 ml) para dar 21a-3 (30 g) como un sólido blanco.
Procedimiento general para la preparación de 21
imagen23
A una disolución agitada de 21a-4 (35 g, 0,18 mol), hidroxibenzotriazol (HOBT) (29 g, 0,21 mol) y Et3N (71 ml, 0,51 mol) en diclorometano anhidro (550 ml) se le añadió 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida (EDCI) (41 g,
5 0,21 mol) en porciones a 0ºC. Se agitó la mezcla de reacción a 0ºC durante 0,5 h, entonces se añadió 21a-3 (24 g, 0,20 mol) a 0ºC y se agitó durante 16 h. Entonces la CCF (éter de petróleo/acetato de etilo: 3/1) mostró que la reacción estaba completa. En ese momento, se vertió lentamente la mezcla de reacción en agua (500 ml) con agitación vigorosa.
10 Se extrajo la mezcla con diclorometano (2x200 ml). Se lavó la fase orgánica combinada con salmuera (2x100 ml), se secó con Na2SO4, se filtró y se concentró para proporcionar el producto en bruto. La cromatografía (éter de petróleo/acetato de etilo, de 100:1 a 10:1) dio 21 (38 g) como un aceite amarillo.
Ejemplo 6 -preparación del compuesto intermedio 23-3
15
imagen24
A una disolución agitada de 14 (430 mg, 0,38 mmol), (DHQ)2PHAL (18,6 mg, 0,024 mmol), tetraóxido de osmio (0,156 ml, 0,012 mmol) en alcohol terc-butílico (2,5% en peso, 0,079 mmol/ml) y metanosulfonamida (74 mg, 20 0,77 mmol) en 20 ml de alcohol terc-butílico se le añadió a temperatura ambiente una disolución de ferricianuro de potasio (382 mg, 1,16 mmol) y carbonato de potasio (160 mg, 1,16 mmol) en 20 ml de agua, dando como resultado una emulsión marrón. Tras 2 h, se añadió una disolución de sulfito de sodio, y se continuó con la agitación durante 20 min. Se extrajo la mezcla resultante con acetato de etilo (3 x 50 ml). Se lavaron las fases orgánicas combinadas con salmuera, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida, se
25 purificaron mediante cromatografía ultrarrápida de fase inversa para producir 23-2 como un sólido blanco.
A una disolución agitada de 23-2 (240 mg, 0,21 mmol) en 24 ml de una mezcla 2:1 de THF y agua se le añadió peryodato de sodio (91 mg, 0,42 mmol). Se agitó la mezcla resultante a temperatura ambiente durante 3 h, y entonces se añadió bicarbonato de sodio saturado acuoso. Se extrajo esta mezcla con tres porciones de acetato de
30 etilo. Se lavaron las fases orgánicas combinadas con una porción de agua y dos porciones de salmuera saturada, se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se concentraron a presión reducida. Se purificó el residuo mediante cromatografía ultrarrápida de fase inversa para producir 23-3.
Ejemplo 7 -preparación del compuesto 24
imagen25
A una disolución de 21 (42 mg, 0,168 mmol) en THF (2,0 ml) se le añadió NaH (1,2 mg, 0,05 mmol) en THF anhidro
5 (0,2 ml) a 0ºC con agitación. Entonces se agitó la disolución a 20ºC hasta que se volvió transparente. Entonces se añadió 23-3 (30 mg, 0,042 mmol) a la disolución transparente y se agitó la mezcla a 20ºC durante 2 h. Se extinguió la mezcla con agua (10 ml) y se extrajo con acetato de etilo (3 x 20 ml). Se lavó la fase orgánica con salmuera y se secó sobre Na2SO4, se filtró y se redujo a vacío. Se purificó el residuo mediante HPLC preparativa para obtener 24 como un sólido blanco amorfo.
10
Ejemplo 8 -preparación del compuesto 24 en forma cristalina sólida (forma I)
Se suspendieron 10 mg de compuesto 24 amorfo en metil isobutil cetona (MIBK) (500 µl, 50 volúmenes) y luego se realizaron ciclos de temperatura entre temperatura ambiente y 40ºC cada 4 horas durante un total de 5 días. Se aisló
15 el sólido resultante eliminando por decantación el disolvente en exceso seguido por secado a vacío para producir el compuesto 24 en forma cristalina sólida (forma I). El patrón de XRPD de la forma I del compuesto 24 se ilustra en la figura 2 y los picos y sus intensidades relativas se enumeran en la tabla 2 a continuación. El método de obtención de los datos de XRPD se describe en los Métodos generales.
20 Tabla 2
N.º de pico
Posición [º2 Theta] Intensidad relativa [%]
1
6,2097 6,86
2
6,5031 7,76
3
8,2581 27,43
4
8,4838 33,64
5
9,5994 23,88
6
10,0981 8,54
7
11,0546 29,76
8
12,5883 14,81
9
13,1703 7,1
10
13,9184 100
11
14,2891 13,04
12
14,9759 10,37
13
15,3159 5,81
14
16,8844 18,15
15
17,1816 9,72
16
17,7384 53,03
17
18,1703 9,02
18
18,5613 32,19
19
19,0241 52,81
20
19,4201 5,08
21
20,0954 13,7
22
20,449 63,25
23
20,8962 43,44
24
21,1871 15,02
25
21,6388 16,08
26
23,0029 50,8
27
23,2869 17,19
28
23,6883 17,16
29
24,1071 13,7
30
24,2587 19,55
31
24,9948 13,34
32
25,209 26,16
33
25,9577 10,06
34
26,4298 9,38
35
27,3687 11,1
36
29,0171 7,95
37
29,5603 5,14
38
30,0609 7,35
39
30,5824 6,5
40
32,1814 4,39
41
32,6521 6,74
42
33,5957 6,6
43
34,7946 9,04
Ejemplo 9 – Datos biológicos – replicón de VHC y análisis
Se analizaron los compuestos en el ensayo de replicón de genotipo 1b usando células Huh5.2 tal como se describe en los Métodos generales. Se incluyeron ciclosporina A, 1, DEBIO-025, 2, sangliferina A, 5, y el hidroximacrociclo, 6 como comparación.
Compuesto
CE50 (µM) CC50 (µM) Índice de selectividad (CC50/CE50)
Ciclosporina A, 1
0,62 28 52
DEBIO-025, 2
0,096 11,2 111
Sangliferina A, 5
0,318 9,1 28,7
Hidroximacrociclo, 6
8,4 83,6 9,9
24
0,033 >100 >3030
Tal como puede observarse, el compuesto de la invención, 24 es significativamente más potente en el ensayo de
10 replicón Huh5.2 (tal como se muestra por la baja CE50), con una selectividad significativamente mejor frente a la línea celular (tal como se muestra mediante un alto índice de selectividad) en comparación con CsA, Debio-025, SfA y el hidroximacrociclo.
Ejemplo 10 – Datos biológicos -actividad contra VIH
15 Se analizaron los compuestos en un ensayo antiviral contra VIH usando células HeLa tal como se describe en los Métodos generales. Se incluyeron ciclosporina A, 1, DEBIO-025, 2 y los antivirales contra VIH emtricitabina y tenofovir como comparación.
Compuesto
Células HeLa
CE50 (µM)
Ciclosporina A, 1
5,3
DEBIO-025, 2
1,5
Emtricitabina
0,4
Tenofovir
1,05
24
0,13
20 Tal como puede observarse, el compuesto de la invención, 24, es significativamente más potente que CsA, DEBIO025, emtricitabina y tenofovir en la inhibición de la infección por VIH en este ensayo.
Ejemplo 11 – Datos biológicos – PK oral e i.v. in vivo en ratón
25 Para evaluar la farmacocinética de los compuestos en un entorno in vivo, se administraron los compuestos por v.o. a 10 ó 5 mg/kg y por vía i.v. a 1 mg/kg a grupos de ratones CD1. Se llevaron a cabo análisis farmacocinéticos tal como se describe en los Métodos generales. Los parámetros PK se muestran a continuación.
Compuesto
Nivel de dosis (mg/kg) Aclaramiento (l/h/kg) AUCfinal por v.o. (ng*h/ml)
Sangliferina A, 5
10 0,054 2332
24
5 0,017 8223
Tal como puede observarse, los compuestos 24 tienen aclaramiento reducido y exposición oral aumentada (tal como se muestra mediante una alta AUCfinal por v.o.), en comparación con sangliferina A.
Ejemplo 12 – Datos biológicos -inhibición de actividad PPIasa de CypA
Para evaluar la inhibición directa de la peptidil-prolil cis-trans isomerasa (PPIasa) de CypA, se usó un método tal como se describe en los Métodos generales. Se incluyeron ciclosporina A, 1, DEBIO-025, 2 y sangliferina A, 5 como controles.
Compuesto
PPIasa de CypA CI50 (nM)
Ciclosporina A, 1
9,7
DEBIO-025, 2
0,8
Sangliferina A, 5
2,4
24
0,31
Tal como puede observarse, el compuesto de la invención, 24, inhibe la actividad PPIasa de CypA de manera más potente que sangliferina A, DEBIO-025 y ciclosporina A.
10 Ejemplo 13 – Datos biológicos -inhibición de transportadores de bilirrubina
Para evaluar el potencial de inhibición inespecífica de los transportadores de bilirrubina, que se piensa que es el motivo de la hiperbilirrubinemia limitante de la dosis observada con DEBIO-025, se llevó a cabo un análisis in vitro
15 de inhibición de transportador tal como se describe en los Métodos generales.
Compuesto
OATP1B1 CI50 (µM) OATP1B3 CI50 (µM) MRP2 CI50 (µM) MRP3 CI50 (µM)
Ciclosporina A, 1
0,85 0,13 4,1 3,1
DEBIO-025, 2
0,45 0,19 16,0 >50
24
4,3 1,8 >50 >50
Tal como puede observarse, el compuesto de la invención, 24, muestra mucho menos inhibición de transportadores de bilirrubina conjugados y no conjugados en comparación con DEBIO-025 y ciclosporina A.
20 Ejemplo 14 – Datos biológicos -inhibición de transportadores xenobióticos
Para evaluar el potencial de las interacciones fármaco-fármaco (DDI) a través de la inhibición de transportadores xenobióticos, se llevó a cabo un análisis in vitro de la inhibición de glicoproteína P (Pgp/MDR1) y bomba de
25 exportación de sales biliares (BSEP) tal como se describe en los Métodos generales.
Compuesto
Pgp CI50 (µM) BSEP CI50 (µM)
Ciclosporina A, 1
0,73 0,46
DEBIO-025, 2
0,72 0,18
24
>50 12,3
Tal como puede observarse, el compuesto de la invención, 24, muestra mucho menos inhibición de transportadores xenobióticos, implicados potencialmente en las interacciones fármaco-fármaco, en comparación con DEBIO-025 y 30 ciclosporina A.
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Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Compuesto de fórmula (I):
    imagen1
    Fórmula (I)
    incluyendo cualquier tautómero del mismo; o un isómero del mismo en el que el enlace C=C en C26, 27 10 mostrado como trans es cis; e incluyendo un aducto de metanol del mismo en el que se forma un cetal mediante la combinación del grupo ceto en C-53 (si está presente) y el grupo hidroxilo en C-15 y metanol;
    o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
    15 2. Compuesto según la reivindicación 1 en forma cristalina sólida.
  2. 3.
    Compuesto según la reivindicación 2 en forma de su polimorfo cristalino de forma I que tiene los siguientes datos de XRPD:
  3. 4.
    Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso como producto farmacéutico.
  4. 5.
    Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, para su uso como producto farmacéutico
    N.º de pico
    Posición [º2 Theta] Intensidad relativa [%]
    1
    6,2097 6,86
    2
    6,5031 7,76
    3
    8,2581 27,43
    4
    8,4838 33,64
    5
    9,5994 23,88
    6
    10,0981 8,54
    7
    11,0546 29,76
    8
    12,5883 14,81
    9
    13,1703 7,1
    10
    13,9184 100
    11
    14,2891 13,04
    12
    14,9759 10,37
    13
    15,3159 5,81
    14
    16,8844 18,15
    15
    17,1816 9,72
    16
    17,7384 53,03
    17
    18,1703 9,02
    18
    18,5613 32,19
    19
    19,0241 52,81
    20
    19,4201 5,08
    21
    20,0954 13,7
    22
    20,449 63,25
    23
    20,8962 43,44
    24
    21,1871 15,02
    25
    21,6388 16,08
    71
    26
    23,0029 50,8
    27
    23,2869 17,19
    28
    23,6883 17,16
    29
    24,1071 13,7
    30
    24,2587 19,55
    31
    24,9948 13,34
    32
    25,209 26,16
    33
    25,9577 10,06
    34
    26,4298 9,38
    35
    27,3687 11,1
    36
    29,0171 7,95
    37
    29,5603 5,14
    38
    30,0609 7,35
    39
    30,5824 6,5
    40
    32,1814 4,39
    41
    32,6521 6,74
    42
    33,5957 6,6
    43
    34,7946 9,04
    5 para el tratamiento de infecciones virales tales como infección por VHC o VIH o como agente inmunosupresor o antiinflamatorio.
  5. 6. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a
    3, junto con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable. 10
  6. 7. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, junto con un diluyente o portador farmacéuticamente aceptable que comprende además un segundo principio activo o principio activo posterior.
    15 8. Procedimiento para preparar un compuesto según la reivindicación 1, que comprende hacer reaccionar un compuesto de fórmula (V)
    imagen2
    20 Fórmula (V) en la que cada R11 es independientemente alquilo C1-4 o bencilo; con un macrociclo aldehídico (compuesto de fórmula VI):
    25
    72
    imagen3
    Fórmula (VI).
  7. 9. Compuesto de fórmula (VI):
    imagen4
    Fórmula (VI).
  8. 10. Procedimiento para la preparación de un compuesto de fórmula (I) en forma de su polimorfo cristalino de forma I según la reivindicación 3, que comprende la etapa de cristalizar un compuesto de fórmula (I) en metil isobutil cetona.
    73
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